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CN104975089A - 人外周血微泡中的mirna表达和其用途 - Google Patents

人外周血微泡中的mirna表达和其用途 Download PDF

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M·G·皮珀
N·伊斯梅尔
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Abstract

本发明提供新的方法和组合物，其通过检查包含微泡的样品和其中的miR而用于病症的诊断、预后和治疗。

Description

人外周血微泡中的MIRNA表达和其用途
本申请是申请号为200880114286.9的中国专利申请的分案申请。
优先权要求和关于联邦政府赞助的研究的声明
本申请要求2007年9月14日提交的美国临时专利申请60/993,809和2008年5月22日提交的美国临时专利申请61/055,178的优先权，其通过引用完整地并入本文。本发明并非由任何政府做出并且政府在本发明中没有权利。
发明背景
微RNA(miRNA或miR)是动物和植物中表达的小的非编码RNA。它们调节细胞功能、细胞存活、细胞活化和发育期间的细胞分化。7；8
微RNA是19-25个核苷酸RNA的小的非编码家族，其通过以序列特异性方式靶向信使RNA(mRNA)，诱导翻译抑制或mRNA降解(取决于miRNA和它们的靶之间的互补程度)来调节基因表达(Bartel，D.P.(2004)Cell 116，281-297；Ambros.V.(2004)Nature 431,350-355)。许多miR在序列上在远缘生物体之间是保守的，表明这些分子参与重要过程。的确，miR参与发育期间基因表达的调节(Xu，P.等(2003)Curr.Biol.13,790-795),细胞增殖(Xu，P.等(2003)Curr.Biol.13,790-795),细胞凋亡(Cheng，A.M.等(2005)Nucl.AcidsRes.33,1290-1297)，葡萄糖代谢(Poy，M.N.等(2004)Nature 432，226-230)，压力抗性(Dresios，J.等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，1865-1870)和癌症(Calin，G.A等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，1554-15529；Calin，G.A.等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci USA101，11755-11760；He，L.等(2005)Nature 435，828-833；和Lu，J.等(2005)Nature 435:834-838)。
还有强有力的证据表明miR在哺乳动物造血中起作用。在小鼠中，miR-181、miR-223和miR-142在造血组织中差异表达，并且它们的表达在造血和谱系定向(lineage commitment)期间被调节(Chen，C.Z.等(2004)Science 303，83-86)。miR-181在鼠造血祖细胞中的异位表达导致B细胞区室中的增殖(Chen，C.Z.等(2004)Science 303，83-86)。鼠造血系统的细胞中的系统性miR基因特征谱分析显示与神经元组织相比造血系统中不同的miR表达模式，并且鉴定了在细胞分化期间发生的单独的miR表达变化(Monticelli，S.等(2005)GenomeBiology 6，R71)。最近的研究已经鉴定，miR-221和miR-222在CD34+脐血祖细胞的人红细胞生成培养物中下调(Felli，N.等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci USA.102，18081-18086)。已发现这些miR靶向癌基因c-Kit。进一步的功能研究表明这两种miR在红细胞生成培养物中的下降在翻译水平上开启了Kit蛋白产生，导致早期红系细胞的扩增(Felli，N.等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci USA.102，18081-18086)。与miR调控细胞分化的假说一致，发现miR-223是牵涉C/EBPa和NFI-A的调控回路(circuit)的关键成员，其在全反视黄酸处理的急性早幼粒细胞性白血病细胞系中控制粒细胞的分化(Fazi，F.等(2005)Cell 123，819-831)。
在B细胞慢性淋巴细胞性白血病中已鉴定到两种miR的频繁缺失和降低的表达9。这些发现促进了很多的论文，其证明miR在头颈癌，小细胞肺癌，胶质母细胞瘤，乳腺癌，慢性淋巴细胞性白血病和Burkitt淋巴瘤中异常表达9-12。最近，已经报道了巨噬细胞中炎症和miR之间的关系。13
为了检测此类病症，已获得组织样品以证实此类巨噬细胞的存在。另外，至今，一直没有报道证明在血液中循环的微泡(microvesicle)包含miR。
本发明的另外的优势，目的和特征将部分地在随后的说明书中阐明并且在检查下列内容后对本领域技术人员来说将部分地变得显然，或可以从本发明的实践中认识到。如附加的权利要求中特别指出的，可以实现和获得本发明的目的和优势。
发明概述
在一个方面中，提供了用于鉴定特定miR的方法，所述miR存在于微泡中，和/或在组织、液体和/或细胞中具有改变的特定miR的表达水平。
微泡促进细胞之间的联系。许多细胞(包括巨噬细胞、血小板、T-细胞和肿瘤)释放包含核酸和/或蛋白的小的微泡1-5。包含在微泡内的因子调节血管发生、细胞生长和细胞分化1；3。
在另一个方面中，确定了miR在液体例如患特定病症的患者的外周血中的存在。
在另一个方面中，确定了miR在患肺纤维化的患者的肺组织中的存在。
在另一个方面中，本文提供了诊断或预测受试者(例如，人)中的特定病症的方法。根据一种特定的方法，将来自受试者的受试样品中至少一种miR基因产物的水平与对照样品中相应的miR基因产物的水平进行比较。相对于对照样品中相应的miR基因产物的水平，受试样品中miR基因产物水平的变化(例如增加,减少)表示受试者患有急性炎性病症，或者处于发生急性炎性病症的风险中。
在一个实施方案中，来自受试者的受试样品中miR基因产物的水平大于对照的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自本文所示的miRNA。
在特定的实施方案中，被诊断或预测的病症是导致单核吞噬细胞和/或THP-1细胞释放微泡的病症。
在特定的实施方案中，被诊断或预测的病症是引起炎性应答的病症。
在另一个实施方案中，本发明是治疗受试者(例如，人)的癌症和/或炎性病症的方法。
在一个特定的方法中，将有效量的用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物施用给受试者，所述miR基因产物选自表I-VI中的一个或多个组。
在一个实施方案中，用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物抑制选自表I-VI中的一个或多个组的miR基因产物的表达。
本发明进一步提供了用于治疗癌症和/或炎性病症的药物组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，所述至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物是特异的，所述miR基因产物的表达，与正常相比，在来自患病的患者的血液中更高。
在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种抗炎剂。
在一个实施方案中，本发明是用于治疗与miR基因产物的过表达有关的癌症和/或与miR基因产物的过表达有关的肺部病症的药物组合物。此类药物组合物包括有效量的至少一种miR基因产物和药学上可接受的载体，其中所述至少一种miR基因产物结合并且减少所述miR基因产物的表达。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物包含与所述miR-基因产物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR或其变体或生物学活性片段。在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种抗癌剂。
根据下列优选实施方案的详细描述，当根据附图阅读时，本发明的各种目的和优势对本领域技术人员来说将变得显然。
附图简述
图1显示来自巨噬细胞的微泡的释放诱导的分化。外周血单核细胞(PBM)未经处理(浅色)或用GM-CSF处理(深色)24小时。收集无细胞上清液并且进行超速离心。将小泡重悬浮于PBS中并且通过流式细胞术分析大小。分析之前，用2μm标准珠校准FSS和SSC参数(未显示)。显示的是来自三个不同供体的代表性数据。
图2A-2C显示微泡介导巨噬细胞分化。从PMA处理的THPl细胞收集微泡，然后将其添加到未分化的THPl细胞(图2B)或单核细胞(图2C)中。作为对照，THPl细胞未进行处理(图2A)。每天对所述细胞拍照。显示的是第3天的细胞。
图3A-3C显示外周血微泡的分离。经告知同意后，从来自正常志愿者供体的20cc血液中获得血浆。来自0.5cc血浆的微泡和CD206-FITC或MHCII-FITC抗体一起温育并且在BD FACS Calibur上分析大小(利用前向角对侧向角散射(forward vs.side scatter))(图3A)和表面抗原表达(图3B)。针对图3A所示的门控区(gatedregion)，确定CD206或MHC II的百分比表达(与同种型对照相比)(图3C)。显示的是两个供体的平均值±SEM。
图4.外周血微泡的来源的分析。
通过流式细胞术分析来自健康供体(n＝10)的外周血微泡。为了确定细胞来源，针对CD3、CD202b(Tie-2)、CD66b、CD79a或CD41a对微泡进行染色以确定来源于T-细胞、内皮细胞、嗜中性粒细胞、B细胞或血小板的微泡。单核吞噬细胞衍生的微泡对于CD14、CD206、CCR3、CCR2或CCR5是阳性的。显示的是平均的总门控事件的最大值％±S.E.M。
图5A-5D.来自外周血微泡和PBMC的miRNA表达。(图5A)基于过滤标准显示微泡和PBMC的层次聚类(Hierarchal clustering)分析。产生显示微泡(图5B)和PBMC(图5C)的表达特征谱的热图。(图5D)显示各个样品组共有的和特异的数目。
图6：显示多种疾病和与其相关的上调和下调的miR的表I。列出了人类疾病(包括癌和非癌)组织中重要的微RNA。通过将来自我们的数据集(图7，表II)的血浆中未检测到的miRNA与已知在特定疾病组织中增加的miRNA相比较，现在发明人相信我们预测几种miRNA可以用作血浆中的生物标志物(参见图6，表I增加表达栏中粗体的miR)。
图7：显示在血浆中表达的miR和未检测到的miR的表II。
图8：表III列出了miR并且显示在来自所有个体的血浆微泡和PBMC中表达最高的十种miRNA。
图9：表IV显示参与代谢和获得性免疫系统的调控的经典途径(canonical pathway)受这些miRNA(仅使用Sanger miRBase(上部))或来自Sanger miRBase和TargetScan的共有的靶(底部)的表达的高度调控。
图10：表V显示20种miRNA在PBMC级分中具有三倍以上的表达增加(与微泡血浆样品相比)，并且显示血浆微泡中与PMBC相比的倍数变化(最后一栏)。
图11：表VI显示所有检测到的miR的标准化的表达数据：检测器名称，ave-MNC，std-MNC，检测器名称，ave-血清，std-血清。
优选实施方案的详细描述
本发明部分基于参与炎性应答和/或在血液中具有改变的表达水平的特定微RNA(miRNA)的鉴定。本发明还部分基于这些miRNA与特定的诊断、预后和治疗特征的关联。
如本文描述和举例说明的，特定的miRNA在组织损伤和/或炎症期间上调或下调。
如在本文中可互换使用的，“miR基因产物”、“微RNA”、“miR”、“miR”或“miRNA”是指来自miR基因的未加工或已加工的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白质，因此术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，其通常包括长度大约70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III(例如大肠杆菌RNA酶III))将其消化成具有活性的19至25个核苷酸的RNA分子来加工miR前体。该具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称为“已加工的”miR基因转录物或“成熟的”miRNA。
可通过天然加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如使用分离的加工酶，例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)，从miR前体获得具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。应理解，还可通过生物或化学合成(而不用从miR前体加工)，直接产生具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。当在本文中用名称提及微RNA时，该名称对应前体和成熟形式，除非另有说明。
本发明包括诊断或预测受试者是否患有释放微泡的病症或处于发展释放微泡的病症的风险中的方法。
该方法包括确定来自受试者的样品中至少一种miR基因产物的水平和将样品中的miR基因产物水平与对照相比较。如本文所使用的，“受试者”可以是患有或怀疑患有此类病症的任何哺乳动物。在一个优选的实施方案中，受试者是患有或怀疑患有此类病症的人。
可在从受试者获得的生物样品的细胞中，测量至少一种miR基因产物的水平。
在另一个实施方案中，可从受试者中取出样品，并且可通过标准技术提取和分离DNA。例如，在某些实施方案中，可以在开始放射疗法、化学疗法或其它疗法之前从受试者获得样品。可从受试者的未受影响的样品、从正常人个体或正常个体的群体或从相应于受试者的样品的大部分细胞的培养细胞获得相应的对照样品或对照参照样品(例如获自对照样品群体)。然后可将对照样品与来自受试者的样品一起进行处理，以便可将从来自受试者的样品的细胞中给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应的miR基因产物的水平进行比较。可选地，可以从受试样品分开地得到和加工参照样品(例如，在不同时间)，并且可以将从来自受试样品的细胞中的给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与来自参照样品的相应miR基因产物水平相对比。
在一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平高于对照样品中相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“上调”)。如本文中所使用的，当来自受试者的样品中miR基因产物的量大于对照(例如，参考标准，对照细胞样品，对照组织样品)中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达“上调”。
在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“下调”)。如本文中所使用的，当从来自受试者的样品中的该基因产生的miR基因产物的量低于从对照样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达“下调”。可根据一个或多个RNA表达标准确定对照和正常样品中相对miR基因表达。所述标准可包括例如0miR基因表达水平、标准细胞系中的miR基因表达水平、受试者的未受影响的样品中的miR基因表达水平或之前从正常人对照群体获得的miR基因表达的平均水平(例如对照参考标准)。
可以用本领域技术人员公知的各种技术(例如定量或半定量RT-PCR，Northern印迹分析，溶液杂交检测)测量至少一种miR基因产物的水平。在特定的实施方案中，通过下述测量至少一种miR基因产物的水平：逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA特异性探针寡核苷酸(例如包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供受试样品的杂交特征谱，和将受试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。相对于对照样品，受试样品中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有特定病症或处于发展特定病症的风险中。
还可从基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的miRNA序列产生)制备微阵列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而另一种探针特异于miRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格条件的对照的对照，例如与人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的tRNA和其它RNA(例如，rRNA，mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性选择序列。
可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5’-胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGridTM 100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化的载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件(例如在25℃下于6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下于0.75X TNT中清洗40分钟)下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用2.5μg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个)允许对数个物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分(优选整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征(signature)与已建立的疾病标志物关联或直接与疾病状态关联。
按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有特定病症的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。杂交特征谱包括来自靶寡脱氧核苷酸(其来自样品)与微阵列中的miRNA-特异性探针寡核苷酸的结合的信号。所述特征谱可记录为结合的存在或不存在(信号对0信号)。更优选地，记录的特征谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述特征谱与从正常的对照样品或参照样品产生的杂交特征谱相比较。信号的改变表示受试者中存在特定病症或发展特定病症的倾向。
用于测量miR基因表达的其它技术也在本领域技术人员的能力之内，其包括用于测量RNA转录和降解的速率的各种方法。
本发明还提供诊断受试者是否患有具有不利的预后的特定病症或处于发展具有不利的预后的特定病症的风险中的方法。在该方法中，测量与特定病症的不利的预后有关的至少一种miR基因产物的水平，通过逆转录来自从受试者获得的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸。然后使所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA特异性探针寡核苷酸(例如包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供受试样品的杂交特征谱，和将受试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。相对于对照样品，受试样品中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有具有不利的预后的特定病症或处于发展具有不利的预后的特定病症的风险中。
在某些情况下，可能期望同时测定样品中多种不同的miR基因产物的表达水平。在其他的情况下，可能期望测定与特定的病症相关的所有已知的miR基因的转录物的表达水平。评估数百种miR基因或基因产物的特定表达水平非常耗时并且需要大量的总RNA(例如，对于每一个Northern印迹至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡核苷酸文库，该文库包含一组特异于一组miR基因的寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，将它们与微阵列上的探针寡核苷酸杂交以产生杂交特征谱或表达特征谱，来测定生物样品中多个微RNA的表达水平。然后可将受试样品的杂交特征谱与对照样品的杂交特征谱比较，从而确定具有改变的表达水平的微RNA。如本文中所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如，通过杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“特异于miR的探针寡核苷酸”是指具有选择用于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
特定样品的"表达特征谱"或"杂交特征谱"本质上是样品状态的指纹图谱；虽然两种状态可能具有相似表达的任何特定基因，大量基因的同时评估允许产生对细胞状态来说是独特的基因表达特征谱。即正常样品可以区别于相应的展示病症的样品。在此类展示病症的样品中，可以确定不同的预后状态(例如良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同的状态中的展示病症的样品的表达特征谱，获得关于在每一种状态下哪些基因是重要的(包括基因的上调和下调)的信息。
在展示病症的样品中差异表达的序列的鉴定，以及导致不同预后结果的差异表达，允许以许多方式使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，以确定化疗药物是否改善特定受试者的长期预后)。类似地，可以通过比较来自受试者的样品与已知的表达特征谱来进行或确认诊断。此外，这些基因表达特征谱(或单独的基因)允许筛选药物候选物，所述药物候选物抑制特定病症的表达特征谱或将不良的预后特征谱转变为更好的预后特征谱。
细胞中一种或多种miR基因产物水平的改变可导致这些miR的一种或多种预期的靶失调，这可导致特定的病症。因此，改变miR基因产物水平(例如，通过减少在展示病症的细胞中上调的miR的水平，通过增加在展示病症的细胞中下调的miR的水平)可成功地治疗病症。
因此，本发明包括治疗受试者的病症的方法，其中至少一种miR基因产物在受试者的细胞中失调(例如，下调、上调)。在一个实施方案中，受试样品中的至少一种miR基因产物的水平大于对照或参照样品中相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，受试样品中的至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中相应的miR基因产物的水平。当至少一种分离的miR基因产物在受试样品中下调时，该方法包括施用有效量的该至少一种分离的miR基因产物或其分离的变体或生物学活性片段，从而抑制受试者中展示病症的细胞的增殖。
例如，当miR基因产物在受试者的癌细胞中下调时，对受试者施用有效量的分离的miR基因产物，可以抑制癌细胞的增殖。对受试者施用的分离的miR基因产物可以与在癌细胞中下调的内源野生型miR基因产物相同，或可以是其变体或生物学活性片段。
如本文定义的，miR基因产物的“变体”是指与对应的野生型miR基因产物具有小于100％的同一性且具有对应的野生型miR基因产物的一种或多种生物学活性的miRNA。这样的生物学活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达(例如，抑制靶RNA分子的翻译，调控靶RNA分子的稳定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制与癌症和/或骨髓增生病症有关的细胞过程(例如，细胞分化，细胞生长，细胞死亡)。这些变体包括物种变体和由于miR基因中的一个或多个突变(例如，置换，缺失，插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应的野生型miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的同一性。
如本文定义的，miR基因产物的“生物学活性片段”是指具有对应的野生型miR基因产物的一种或多种生物学活性的miR基因产物的RNA片段。如上所述，这样的生物学活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达和抑制与癌症和/或骨髓增生病症有关的细胞过程。在某些实施方案中，生物学活性片段的长度是至少约5，7，10，12，15或17个核苷酸。在一个具体实施方案中，可以将分离的miR基因产物与一种或多种其它的抗癌治疗组合地施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗，放疗和其组合(例如，放化疗(chemoradiation))。
当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中上调时，该方法包括给受试者施用有效量的抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制展示病症的细胞的增殖。这样的化合物在本文中称作miR基因表达抑制化合物。合适的miR基因表达抑制化合物的实例包括、但不限于，本文所述的那些(例如，双链RNA，反义核酸和酶促RNA分子)。
在一个特定实施方案中，可以将miR基因表达抑制化合物与一种或多种其它的抗癌治疗组合地施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗，放疗和其组合(例如，放化疗)。
如本文所述的，当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中上调时，所述方法包括将有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物表达的化合物施用给受试者，从而抑制癌细胞的增殖。
如本文中所使用的，术语“治疗”、“医治”和“疗法”是指改善与疾病或病况例如癌症和/或其他病况或病症相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病、病症或病况的症状的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人。
如本文中使用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改变或取出的miR基因产物。例如，合成的miR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的miR基因产物可以以大体上纯化的形式存在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据本发明，本文所述的分离的miR基因产物可以用于制备用于治疗受试者(例如，人)的药剂。
分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的提供商包括例如Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,U.S.A.)、Pierce Chemical(Perbio Science的一部分,Rockford,IL,U.S.A.)、Glen Research(Sterling,VA,U.S.A.)、ChemGenes(Ashland,MA,U.S.A.)和Cruachem(Glasgow,UK)。
或者，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包括用于在细胞(例如癌细胞，展示骨髓增生病症的细胞)中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至细胞并且在其中直接表达。
miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统(包括但不限于癌细胞中现有的加工系统)将该前体分子加工成功能性miR基因产物。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如,Zeng等人(2002),Molecular Cell 9:1327-1333；Tuschl(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp等人(2002),Science 296:550-553；Miyagishi等人(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee等人(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508，其全部公开内容通过引用合并入本文。例如，在某些实施方案中，表达miR基因产物的质粒可以包含在CMV立即早期启动子(intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的，“在启动子的控制下”是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3'端，以便启动子可起始miR基因产物编码序列的转录。
miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA可在细胞(例如癌细胞，展示骨髓增生病症的细胞)中直接表达。
在本发明的治疗方法的其它实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表达”是指治疗后miR基因产物的前体和/或活性成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如本文讨论的测定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工的水平上(例如，通过抑制miR前体至成熟的活性miR的加工)发生。
如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在患有癌症和/或骨髓增生病症的受试者中抑制细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的抑制miR表达的化合物的有效量。
本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用抑制miR表达的化合物的合适的给药方案，如本文所述。用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短的或小干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物中的每一种可被靶向给定的miR基因产物，并且干扰靶miR基因产物的表达(例如，通过抑制翻译，通过诱导切割和/或降解)。
例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导miR基因的RNA干扰来抑制，所述双链RNA分子与miR基因产物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性。在特定实施方案中，dsRNA分子是“短或小干扰RNA”或“siRNA”。
至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制miR表达的化合物的施用将在患有癌症和/或骨髓增生病症的受试者中抑制细胞(例如癌细胞，展示骨髓增生病症的细胞)的增殖。如本文中所使用的，“抑制癌细胞或展示骨髓增生病症的细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或减缓细胞的生长。如果受试者中所述细胞的数目在施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物后保持恒定或减少，那么可推断细胞增殖被抑制。如果所述细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞或展示骨髓增生病症的细胞增殖被抑制。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内给药(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(peri-tissue)和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其它安置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射入肿瘤。
可在对受试者施用前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物配制为药物组合物，有时称为“药剂”。因此，本发明包括用于治疗癌症和/或骨髓增生病症的药物组合物。
本药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸)(例如，按重量计算0.1至90％)或其生理上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的药物组合物另外包含一种或多种抗癌剂(例如，化疗剂)。本发明的药物制剂还可包含由脂质体封装的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸)和药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理上生物相容性缓冲剂(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合络合物(例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)的添加或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。本发明的药物组合物可以以液体形式包装使用或可以进行冻干。
对于本发明的固体药物组合物，可使用常规无毒性的固体的药学上可接受的载体：例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的任何载体和赋形剂以及10-95％，优选25％-75％的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可包含按重量计算0.01-20％，优选1％-10％的封装在上文所述的脂质体中的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸)和喷射剂。还可如所期望的包含载体例如卵磷脂以用于鼻内递送。
本发明的药物组合物还可以包含一种或多种抗癌剂。在一个特定实施方案中，所述组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸)和至少一种化疗剂。适用于本发明方法的化疗剂包括、但不限于，DNA-烷化剂,抗肿瘤抗生素,抗代谢剂,微管蛋白稳定剂,微管蛋白去稳定剂,激素拮抗剂,拓扑异构酶抑制剂,蛋白激酶抑制剂,HMG-CoA抑制剂,CDK抑制剂,细胞周期蛋白抑制剂,胱天蛋白酶抑制剂,金属蛋白酶抑制剂,反义核酸,三螺旋DNA,核酸适配体，和分子上修饰的病毒、细菌和外毒素剂。适用于本发明组合物的试剂的实例包括、但不限于，胞苷阿拉伯糖苷,甲氨蝶呤,长春新碱,依托泊苷(VP-16),多柔比星(阿霉素),顺铂(CDDP),地塞米松,arglabin,环磷酰胺,沙可来新,甲基亚硝脲,氟尿嘧啶,5-氟尿嘧啶(5FU),长春碱,喜树碱,放线菌素-D,丝裂霉素C,过氧化氢,奥沙利铂,伊立替康,托泊替康,亚叶酸,卡莫司汀,链佐星,CPT-11,紫杉酚,他莫昔芬,达卡巴嗪,利妥昔单抗,柔红霉素,1-β-D-阿糖呋喃糖胞嘧啶(1-β-D-arabinofuranosylcytosine),伊马替尼,氟达拉滨,多西他赛和FOLFOX4。
在一个实施方案中，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量与癌细胞中减少的表达水平关联的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照(例如，对照细胞中miR基因产物的水平)相比，细胞中miR基因产物水平的增加指示受试试剂为抗癌试剂。
合适的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。试剂可通过重组、合成产生，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于给细胞提供此类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，并且在上文中描述了几种此类方法。用于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如,Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达特征谱分析)在本领域内也是熟知的。本文也描述了几种此类方法。
实施例
通过参考下列非限制性实施例可以更好地理解本发明，所述实施例用于举例说明而非限制本发明。
本文的数据表明活化的人单核吞噬细胞和THP-1细胞释放诱导新鲜分离的单核细胞存活和分化的微泡。不希望受理论束缚，发明人认为，在特定的炎性疾病下，微泡的内容物可以发生改变以迅速诱导应答。数据还表明微泡在人外周血中循环。循环的微泡调控正常的细胞稳态，并且在组织损伤和炎症期间将指示传播至远端细胞。
微泡可以用作疾病病因学生物标志物和先天免疫应答的系统性介体。因此，能够通过分离外周血中的微泡(而非通过侵入性方法获得组织)来获得类似的信息是有利的。并且对外周血中微泡的正常特征的了解提供了了解急性炎性事件期间的事件的基础。
如本文所示，异常的巨噬细胞分化促成免疫稳态的破坏。因为GM-CSF或M-CSF诱导单核细胞成熟，因此本发明人开始研究以了解GM-CSF和M-CSF介导的分化之间的机制和差异。应答GM-CSF而非M-CSF的分化的定向(commitment)是快速和不可逆的(数据未显示)。连续的GM-CSF刺激并非是该效应所必需的，因为仅4个小时的处理即可诱导巨噬细胞分化。在用作巨噬细胞分化的模型的PMA处理的THPl细胞中获得相似的观察结果。
因此，发明人确定，在诱导分化后分泌至少一种因子，其保持信号或者活化其他细胞以进行分化。因此，将单核细胞或THPl细胞分别暴露于GM-CSF 4小时或暴露于PMA 1小时，然后清洗所述细胞并且将其置于不具有刺激物的基本培养基中。24小时后，收集培养上清液并且将其添加到未分化的单核细胞或THPl细胞中。特别地，来自PMA处理的THPl细胞或GM-CSF处理的单核细胞的上清液使单核细胞和THPl细胞分化(数据未显示)。
通过使用Bioplex悬浮液阵列系统检测培养上清液中多达27种的不同的细胞因子，发明人未能检测到负责的细胞因子。由于发明人用GM-CSF刺激的单核细胞的上清液使不依赖于生长因子的THPl细胞系分化，发明人推断细胞因子/生长因子不负责该效应。接着发明人研究微泡被分泌到培养上清液中以介导骨髓成熟的可能性。
如图1所示，与未经处理的单核细胞(浅色点)相比，用GM-CSF处理24小时的单核细胞在培养上清液中释放显著数目的微泡(深色点)。
类似地，PMA处理的THPl细胞也在分化期间分泌微泡(数据未显示)。特别地,图1显示来自巨噬细胞的微泡的释放诱导的分化。外周血单核细胞(PBM)未经处理(浅色)或用GM-CSF处理(深色)24小时。收集无细胞的上清液并且进行超速离心。在PBS中重悬小泡并且用流式细胞术分析大小。分析前，用2μm标准珠校准FSS和SSC参数(未显示)。显示的是来自三个不同的供体的代表性数据。
纯化来自PMA处理的THPl细胞的微泡并且将其添加到新鲜分离的单核细胞或者未分化的THPl细胞。单独的微泡在两个细胞种类中诱导巨噬细胞分化，如通过形态学(参见图2A-2C)和表面抗原的表达(数据未显示)所表明的。
已分析这些微泡的内容物。发明人检测到，来自PMA处理的THPl细胞的微泡中存在miRNA(数据未显示)。
发明人还评估正常志愿者的外周血中循环的微泡和miRNA。基于大小，发明人在循环中发现三个亚群的微泡(图3A)。用检测甘露糖受体(CD206)和MHC II的抗体检测到巨噬细胞衍生的微泡(图3B)。基于CD206或者MHCII的表达，血浆中大约40％的总微泡(门控区域)来源于巨噬细胞(图3C)。
发明人进一步确定外周血微泡中是否包含miRNA。我们检测到很多miRNA的表达。检测到的表达最高的miRNA在展示表III的图8中显示(n＝51)。
特别地，在外周血中未检测到miR-146，而miR-155的表达比表达最高的miRNA低80倍。因为miR-146和miR-155在我们的IPF患者样品中都升高，但在来自正常供体的外周血中低至不可检测，因此循环的miRNA的检查可以用作疾病的生物标志物。
本文现表明，循环的微泡包含miRNA而且循环的微泡可以提供miRNA途径以引发细胞间联系。微泡中的miRNA还可以提供对疾病的遗传基础的了解并且可以用作预测性生物标志物。
巨噬细胞分化期间释放的微泡还可以介导未成熟的细胞成熟。在巨噬细胞成熟期间收集的微泡介导人单核细胞的分化和存活并且包含RNA。miRNA和经加工的mRNA负责给予未成熟细胞的成熟信号。
实施例-血浆
从正常健康个体的血浆分离微泡。从微泡和匹配的单核细胞分离RNA并且通过实时PCR分析420个已知的成熟miRNA的特征谱。数据集的层次聚类分析表明外周血单核细胞(PBMC)和血浆微泡之间的miRNA表达的显著差异。
我们在微泡和PBMC中分别观察到显著表达的104和75种miRNA。特别地，与PBMC相比，33种miRNA在微泡中特异性表达。对miRNA进行计算机建模以确定受检测到的miRNA调控的生物学途径。预测在来自血液的微泡中表达的大多数微RNA调控血细胞的细胞分化和代谢途径。有趣地，预测选择的几个微RNA为免疫功能的重要调谐子。
该实施例首次鉴定和定义正常受试者的循环的血浆微泡中的miRNA表达。
最近的证据显示，可通过外来体(exosome)介导的转移实现细胞之间的mRNA和miRNA的遗传交换(PMID：17486113)。微泡是由正常健康的或损伤的细胞类型释放的内吞来源的小的外来体/小泡(PMID：17337785,PMID：17409393,PMID：16791265)。微泡从质膜排入细胞外环境中以促进细胞间的联系。尽管尺寸较小(50nm至lμm)，微泡富含生物活性分子并且推测包含核酸和/或蛋白；这些细胞颗粒在生长、分化和癌症进程中起作用(PMID：16453000)。在外周血中，三分之二的微泡来源于血小板。源于血小板的微泡在血管发生和癌症(例如肺癌)的转移性扩散中起作用(PMID：15499615)。当调控造血、内皮和单核细胞中的基因表达时，源于血小板的微泡诱导免疫应答(PMID：17378242，PMID：17127485)。
有趣地，最近已经确定微泡和miRNA之间的关系。最近，Valadi和同事报道，从人和鼠的肥大细胞系释放的小泡包含多于1200种的mRNA和大约121种miRNA分子(PMID：17486113)。相反，本发明涉及天然发生的包含微RNA的人血浆和血液微泡，其导致离体生物学作用。
图8-表I显示在人类疾病(包括癌症和非癌症)中重要的微RNA。与疾病组织中增加的表达相关但在人血浆微泡中通常表达低或不可检测的微RNA分子(表I，示于图6中)提供了确定健康和疾病中的变化的可能并且可能是有效的生物标志物(粗体，增加表达栏)。类似地，通常丰富的微RNA可能在人血浆微泡中减少，从而反映组织中观察到的减少(粗体，减少表达栏)。
相当多的证据证明作为人遗传系统的不可缺少的基石的miRNA的重要性。使用微泡来转移遗传物质将是人体内有效的转移方法。miRNA的微泡运输将使得能够远距离联系。
方法
血液收集和微泡分离。在告知同意后，在EDTA管中收集来自24个女性和27个男性健康的不吸烟的高加索人(Caucasian)供体的外周血(40cc)。在早晨和下午初期之间收集血液。女性供体的中值年龄是29岁，男性供体也是。如之前所述，用无菌的低内毒素的PBS 1:1稀释外周血，在ficoll-hypaque上分层(d＝1.077)，和进行离心(PMID：16931806)。在PBS中清洗单核细胞级分一次。从血浆中纯化微泡。简单来说，通过以160,000xg在4℃下离心1小时来浓缩微泡(PMID：10648405)。
RNA提取。通过Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取法分离总RNA。为了增加小RNA的得率，过夜沉淀RNA。通过在Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Inc Santa Clara,CA)上进行毛细管电泳来确定RNA浓度和RNA完整性。对于分离自单核细胞的RNA，仅使用RNA完整性指数(RNA integrity number，RIN)≥9。因为完整的18s和28s rRNA在微泡中是可变的，因此RIN不是对这些样品的限制。
通过定量PCR进行的miRNA特征谱分析。通过实时PCR分析420种成熟人miRNA的表达的特征谱。通过用420种已知的人成熟miRNA的环引物的混合物作为引物(Mega Plex试剂盒，Applied Biosystems，Foster City，CA)，用之前公开的逆转录条件将RNA(50ng)转变为cDNA(PMID：18158130)。因为微泡中没有已知的对照miRNA，检验几种内部对照。内部对照小核仁(sno)RNA U38B，snoRNA U43，小核(sn)RNA U6以及18S和5S rRNA的引物包含于引物的混合物中。
用配备有384孔反应板的Applied Biosystems 7900HT实时PCR仪分析表达的特征谱。液体操作自动仪(Liquid-handling robot)和Zymak Twister自动仪用于增加通量和减少误差。使用标准条件进行实时PCR。
流式细胞术。外周血微泡直接在血浆中进行免疫染色而不经过离心浓缩。为了确定细胞来源，每组抗体免疫染色0.5cc血浆。组I包含识别CD66b-FITC(嗜中性粒细胞)，CD202b(Tie2)-PE(内皮细胞)，CD206PE-Cy5(巨噬细胞/树突细胞)，CD79a-APC(B细胞)和CD14Pe-Cy7(单核细胞)的抗体。组II包含抗CD41a-PE-Cy5(血小板)，CCR2-APC(单核细胞)，CCR3-PE(树突细胞)，CCR5-PE-Cy7(巨噬细胞)和CD3-Alexa 610(T细胞)的抗体。组III包含同种型对照抗体。用BD Aria流式细胞仪(BD Biosciences San Jose，CA)分析样品。数据表达为门控细胞的百分比。
统计分析。为了减少背景噪声，在数据分析期间，其中80％的个体观察结果具有大于35的原始CT得分的miRNA不予考虑。在血浆微泡中，内部对照(18S、5S、snoRNA U38B、snoRNA U43和snRNA U6)是高度可变的，并且与外周血单核细胞(PBMC)相比，在血浆微泡中表达水平显著不同。
因此，为了减少由将特定miRNA用作标准化校正因子引起的偏差并且为了减少RT-PCR阵列间的样品变异，基于其相对表达(相对于各个阵列上的总体miRNA表达，使用中值标准化分析)比较血浆微泡和PBMC之间的miRNA(PMID：16854228)。通过控制供体的性别和年龄，线性混合模型用于评估血浆微泡和PBMC之间的特定miRNA的差异。基于评估的均值差异计算倍数变化。
用通过针对各个组织的过滤标准的miRNA产生热图并且基于miRNA的相对平均表达，对miRNA层次聚类。还基于血浆微泡和PBMC的miRNA的原始CT得分，对miRNA表达进行排列。进行另外的统计分析(例如ANOVA)以确定在两个处理组之间显著表达的miRNA。
途径分析和预测。用miRanda(microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/)确定预测的miRNA靶。基于miRanda算法，产生各个靶的得分，仅大于17的得分进一步用Ingenuity Pathway Analysis软件(Ingenuity Systems，Redwood City,CA)分析。使用该软件，基于miRNA的靶确定经典途径。检查数据集以基于miRNA的靶的基因本体(ontology)确定相关的途径。
结果
外周血微泡亚群
最初，我们检查正常健康个体的外周血内的微泡的细胞来源。使用流式细胞术，我们发现大多数外周血微泡源于血小板(图4)，如之前报道的(PMID：10648405)。
我们还观察到第二大的微泡群体，其来源于单核细胞吞噬细胞谱系。用检测单核吞噬细胞上的表面抗原的抗体对该群体免疫染色。特别地，仅小百分比的外周血微泡来源于T-细胞和嗜中性粒细胞。我们未能检测到来源于B细胞的微泡(数据未显示)。有趣的是，我们检测到表达来自内皮细胞的表面抗原的小的微泡亚群。
血浆微泡和PBMC中的miRNA表达
为了检测外周血内的微泡区室中是否包含miRNA以使得能够在体内的不同组织之间进行联系和影响遗传变化，我们对来自血浆的纯化的微泡进行miRNA特征谱分析。我们分析来自51个不吸烟的健康个体(包括27个男性和24个女性)的微泡的所有亚群。为了确定微泡和PBMC之间的miRNA表达是否存在差异，我们还从各个供体纯化了PBMC。进行实时PCR分析以检查420种miRNA的表达。对过滤的数据进行层次聚类分析，比较PBMC和血浆样品之间的miRNA表达特征谱(图5A)。
除了三种以外的所有PBMC样品与微泡样品分别聚类，表明两组之间的miRNA表达特征谱显著不同。基于减少背景噪声的过滤标准，我们发现微泡和PBMC样品中分别表达104种和75种miRNA(图5B和5C)。
在这些miRNA中，71种是各个样品组共有的(图5D)。特别地，仅两种miRNA，miR-031和29c仅在PBMC样品中表达，而四种miRNA(miR-127、-134、-485-5p和-432)仅在血浆级分中表达。显示了通常在血浆中表达的所有104种miRNA(表II，在图7中显示)。
年龄和性别的影响
我们在任一样品组的miRNA表达中没有观察到年龄和/或性别的影响。特别地，女性和男性供体的中值年龄都是29岁。最年长的个体是58岁，而最年轻的是21岁。因此，我们进一步对数据分层以检查差异。年龄匹配的样品之间的检查没有显示对PBMC和微泡样品之间的miRNA表达的任何显著的影响。当控制性别时，我们还将上四分位年龄与下四分位年龄相比，各个组的平均年龄分别为48.9±6.2和21.9±1.2。然而，我们未能检测到基于年龄的样品组之间的miRNA表达的显著差异(数据未显示)。
微泡和PBMC中的miRNA表达的比较
表III，图8中显示的是来自所有个体的血浆微泡和PBMC中表达前十的miRNA。对于血浆来说，表达前十的miRNA以递减的顺序为miR-223、-484、-191、-146a、-016、-026a、-222、-024、-126和-32。而PBMC中高表达的是miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146a、-191、-026a、-019b和-020a。微泡中表达前十的miRNA在100％的个体中被检测到。然而，在PBMC样品中，在100％的个体中观察到除miR-150(98％的供体)和miR-484(89％的供体)外的所有表达前十的miRNA。
我们还发现PBMC和微泡的表达前十的miR中共有六种miR(miR-223、miR-484、miR-191、miR-146a、miR-26a和miR-16)。特别地，在两个区室中最显著表达的miR都是miR-223。基于各个单独供体的排序分析，确定特定miRNA出现在表达前十的miRNA中的频率，miR-223在PBMC和微泡中的频率为100％。尽管miR-486的表达是血浆微泡中表达前十的miRNA，但发现该miRNA仅在20％的个体特征谱中是表达前十。有趣地，在血浆微泡中高表达的miRNA未被鉴定为组织特异性miR。
我们进一步检查微泡和PBMC中分别具有大于>66％和>88％的任意值的排序评分(数据集的天然截断值)的miR的集体功能(collectivefunction)。基于该标准，我们进一步检查来自微泡和PBMC样品的排在前9的miR。因此，我们分析血浆中发现的miR-223、-484、-191、-146a、-016、-026a、-222、-024、和-126的组合的功能。对于PBMC，我们检查下列miRNA的组合的功能，miR-223、-150、-146b、-016、-484、-146a、-191、-026a和-019b。使用Sanger miRBase Target版本5，我们发现血浆微泡的组合的miR的1578个预测的靶(数据未显示)。计算机分析这些组合的靶以确定它们集体调控的途径。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件，我们发现参与代谢和获得性免疫系统的调控的经典途径受这些显示的miRNA的表达高度调控(表IV，示于图9中，上部)。
在检查的来自PBMC级分的9种miRNA中，我们发现了1857个预测的mRNA靶(数据未显示)。最后，由这些miRNA调控的前五的经典途径特别地是多种氨基酸和脂质代谢途径(表IV，示于图9中，上部)。我们还从Sanger miRBase和TargetScan中发现了共有的预测的靶并且确定了它们的功能(表IV，示于图9中，下部)。
然后我们检查了在微泡和PBMC之间差异表达的miRNA。我们发现20种miRNA在PBMC级分中与微泡样品相比具有三倍以上的表达增加(表V，示于图10)。相比之下，与PBMC相比，15种miRNA在血浆微泡中显著表达。
图11：表VI显示在PBMC和血浆中表达的所有miRNA(检测器名称)的平均的标准化的数据及各自的标准差。
讨论
在这些实施例中，发明人现表明miR在正常稳态条件下在外周血的微泡中循环。此处，我们显示了104种在血浆微泡中表达的miR并且miR表达显著不同于PBMC。到目前为止，大量的研究显示了miR调节许多细胞功能的能力。然而，这些研究大多暗含，miR处于其宿主细胞内以引起作用(PMID：17923084)。我们的数据表明，微泡中包含的miRNA可能是至远端细胞的联系信号以调节细胞稳态。
微泡中的这些miRNA可循环至不同的组织靶。血浆微泡中表达最高的miRNA的进一步检查证实很多这些功能调控造血和细胞分化程序(表III，示于图8)。例如，miR-223的表达调控骨髓、粒细胞和破骨细胞的分化(PMID：18278031，PMID：17471500，PMID：16325577)。其还显示在造血干细胞增殖中起作用(PMID：18278031)。有趣地，miR-223在急性髓性白血病(AML)中丧失(PMID：18056805)。相反，miR-126的下调在巨核细胞分化期间发生(PMID：16549775)。特别地，miR-24的表达受TGF-β(其为造血的有效的正和负调节子)调控(PMID：16123808，PMID：18353861)。在微泡中表达的miR-24和miR-16都调控红细胞产生(PMID：17906079，PMID：17976518)，而miR-16还调节淋巴发育(PMID：16616063)。miR-16表达的丧失已在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中得到广泛验证(PMID：17327404，PMID：17351108)。
血浆微泡中表达的许多miR还调控细胞周期蛋白的进程(PMID：18365017，PMID：17914108)。MiR-222靶向p27Kipl(PMID：17914108)而miR-24抑制pl6(INK4a)(PMID：18365017)。miR-16的增加的表达导致细胞在细胞周期的G0/G1期积累(PMID：16123808)。相反，乳腺癌细胞中miR-126的表达增加细胞增殖和肿瘤生长但抑制转移(PMID：18185580)。这通过血管细胞粘附分子-1(VCAMl)的调控发生(PMID：18227515)。
与在血浆微泡中高表达的其他miR不同，miR-146a显示在不同的水平上发挥作用。虽然已表明miR-146a作为肿瘤抑制因子起作用并且该miR的丧失与前列腺癌的发展相关(PMID：18174313)，miR-146a还调节免疫功能(PMID：16885212，PMID：18057241)。可能该miR在血浆微泡中的表达定义免疫调节功能(表IV，示于图9)。
基于检查靶的基因本体的IPA分析，预测受miR-146a表达影响的最相关网络是细胞增殖，免疫和淋巴系统发育和功能。另外，预测该miR调控先天免疫应答。根据上述分析，我们发现LPS/IL-1和toll样受体信号传导是预测受mir-146a调控的前五的经典途径之一。
到目前为止，还不清楚miR-484或miR-486的功能。与miR-146a相似，miR-484和miR-486似乎作为免疫应答性的调节子起作用。特别地，基于相对表达，miR-484是微泡级分中第二高表达的miR。预测模型表明该miR具有多种功能。与微泡中表达的很多其他miR一样，预测miR-484调控造血作用。特别地，预测NK细胞信号传导和IL-4信号传导途径是miR-484的靶，而miR-486调控抗原呈递。此外，miR-486显示调控细胞分化、增殖和生长。
虽然我们在血浆微泡中检测到104种miR，但存在许多在总miR特征谱中检测不到的miR。血浆微泡中检测不到的miR也可用作疾病的生物标志物。最近，Lawrie等报道，在患有B细胞淋巴瘤的患者的血浆中检测到miR(PMID：18318758)。该研究表明miR-155、miR-210和miR-21在来自这些患者的血浆中升高并且miR-21与复发有关。基于该研究，我们在正常个体中检测到miR-155和miR-21，但没有发现miR-210。有趣地，我们发现75％的个体在血浆中表达miR-155而60％表达miR-21(数据未显示)。
因此，对于待用作疾病的预测标志物的这些miR，每个个体在疾病检测前将需要基线。因此，miR-210的表达可用作B细胞淋巴瘤的较好的标志物。可以存在另外的关系。例如，miR-203在血浆微泡中检测不到。该miR的升高的表达与膀胱癌和结肠腺癌有关并因此可以用作生物标志物(PMID：18230780，PMID：17826655)。
对于在正常情况下表达而在疾病情况下丧失的血浆miR来说，可存在相反的关系。例如，在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中，miR-223下调(PMID：18056805)。因为miR-223是血浆微泡中表达的最显著的miR，其减少的表达可用作ALL的诊断标志物。此外，miR-15a/16在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中丧失或下调(PMID：18362358)。然而我们发现miR-16在检查的所有健康个体中表达，miR-15a仅在44％的进行特征谱分析的个体中表达(数据未显示)。
有趣的是，我们在正常个体的血液中没有检测到组织特异性miRNA(PMID：18025253)。来自正常个体的大多数微泡来源于血细胞。我们的确检测到少量百分比的微泡来源于内皮细胞。内皮细胞损伤后，源于内皮细胞的微泡可能增加。同样地，在组织损伤时，在外周血中检测到组织特异性miR和微泡可能是频繁的事件。因为肿瘤产生微泡(PMID：16283305)，因此这些微泡可以在外周血中检测到。
虽然已报道在血浆中检测到miR(PMID：18318758)，但本文是表征来自血浆的所有已知miR的最早的研究。在该研究中，我们将种族作为因素进行控制。
检测外周体液和/或血液中miR水平的存在、缺失或变化可以用作生物标志物以检查多种疾病、鉴定独特的miRNA特征谱和预测疾病。包含在微泡中的循环的miR在调控血细胞的稳态生产以及代谢功能中具有重要功能。
未明确通过引用并入的本文引述的所有出版物的相关教导以其全文通过引用并入本文。尽管已通过优选实施方案详细地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将理解其中可进行形式和细节上的各种变化，而不背离所附权利要求包括的本发明的范围。
虽然已通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。因此，本发明不意欲限定于本文中公开的预期用于进行本发明的特定实施方案，而是意欲包括落在权利要求的范围内的所有实施方案。
目的miR在公共数据库中列出。在某些优选实施方案中，公共数据库可以是由Sanger Institute提供的重要储库www.http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/，将miR序列提交至该库以进行命名和系统命名分配(nomenclature assignment)，并且将所述序列置于数据库中以进行存档和用于经由万维网的联机检索。通常，由Sanger Institute收集的关于miR序列的数据包括物种，来源，相应的基因组序列和基因组位置(染色体坐标)，以及全长转录产物和成熟的完全加工的miRNA(具有5'末端磷酸基团的miRNA)的序列。另一个数据库可以是GenBank数据库，其可通过NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)网址访问，并且由National Institutes of Health和National Library of Medicine维护。这些数据库通过引用完全并入本文。
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Claims (9)

1.一种诊断或预测受试者中的结肠直肠癌的方法，其包括：
i)从来自受试者的样品分离微泡；
ii)测定分离的微泡中至少一种miR的水平，其中所述至少一种miR包括下列至少一种：miR-19a,miR-21,miR-127,miR-31,miR-96,miR-135b和miR-183；并且所述至少一种miR包括下列至少一种miR-30c,miR-133a,mir-143,miR-133b和miR-145；和
iii)将所述至少一种miR的水平与对照进行比较，其中与对照的水平相比，所述至少一种miR的水平的改变诊断或预测受试者中的结肠直肠癌。
2.权利要求1的方法，包括：
a)标记来自受试者的分离的微泡中的所述至少一种miR；
b)将经标记的至少一种miR与miR阵列杂交；
c)测定经标记的至少一种miR与miR阵列的杂交；和
d)鉴定所述分离的微泡中相对于对照差异表达的至少一种miR。
3.前述权利要求任一项的方法，其中所述对照选自：
i)参考标准；和
ii)来自不具有结肠直肠癌的受试者的至少一种miR的水平；和
iii)来自不显示结肠直肠癌的受试者的至少一种miR的水平。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述受试者是人。
5.分离的微泡，其用作结肠直肠癌的生物标志物，其中所述微泡分离自具有结肠直肠癌的受试者的外周血，并且其中：
所述分离的微泡中选自miR-19a,miR-21,miR-127,miR-31,miR-96,miR-135b和miR-183的至少一种microRNA相对于对照受试者上调，并且所述分离的微泡中选自miR-30c,miR-133a,mir-143,miR-133b和miR-145的至少一种microRNA相对于对照受试者下调。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中来自受试者的样品包括外周血或血浆。
7.权利要求1-4或6任一项的方法，其中通过RT-PCR、Northern印迹分析、溶液杂交检测和/或微阵列分析测定所述至少一种miR基因产物的水平。
8.权利要求1-4或6-7任一项的方法，其中分离微泡包括离心。
9.权利要求1-4或6-8任一项的方法，其中所述分离的微泡中选自miR-19a,miR-21,miR-127,miR-31,miR-96,miR-135b和miR-183的至少一种miRNA相对于对照受试者上调，并且所述分离的微泡中选自miR-30c,miR-133a,mir-143,miR-133b和miR-145的至少一种microRNA相对于对照受试者下调。
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