CN106282360B - 一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及应用。miRNA组合包括以下miRNA：miR‑190、miR‑422a、miR‑592、miR‑639。探针组合物包括上述的miRNA组合的TaqMan探针。探针组合物在制备结肠癌预测转移试剂或工具中的应用。试剂盒包括上述的TaqMan探针组合物。血浆外泌体较易获得，性质稳定，无需其他组织，属于无创型检查。将血浆miRNA作为预测转移标志物，可提高检测的准确性；所述试剂盒可简化TaqMan探针库，提高检测的特异性和灵敏度，更具针对性和实用性，降低了制作成本和生产时间；可高效便捷的应用于结肠癌的预测转移。

Description

一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及应用。

背景技术

结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率均很高。结肠癌在男性癌症发病率中位居第三位，仅次于肺癌和前列腺癌，在女性癌症发病率仅次于肺癌和乳腺癌。其易远处转移、术后复发率高是一直困扰临床的重要问题。近年来，结肠癌的发病率呈不断上升趋势，结肠癌的发生是一个涉及遗传学和表观遗传学异常的复杂过程，结肠癌的发展和转移与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远隔转移等因素密切相关，至今仍未能充分阐明结肠癌的癌变机制并建立易于推广的预测转移及有效诊断手段。早期结肠癌是可以治愈的，但进展期的结肠癌则预后较差。因而，早期发现、早期预测是治疗和改善结肠癌预后的关键。当前对结肠癌患者的预后情况进行预测，主要依赖于当前的分期系统，这是远远不够的，因为具有同样临床特征的结肠癌患者的预后情况可能存在很大的差异。因而，我们亟需开发更加明确而有效的生物标志物，对不同特征的结肠癌患者，进行更加科学的个体化治疗，尤其是早期患者的预测转移和风险评估。这将有助于改善患者的生存质量以及延长患者生存时间。

微小核糖核酸，英文名micRNAs(即miRNAs)，是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点。成熟miRNA通常的长度为18～25nt，是广泛存在于真核生物中，不具有蛋白质编码基因和开放阅读框架的单链小分子RNA，它与其靶mRNA分子的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)互补结合，可通过诱导mRNA的切割、降解等机制抑制靶基因的表达。MiRNA的特点主要表现为它的保守性、基因族集现象、时序性和特异性表达。现在的许多研究表明，miRNAs在细胞发育、变异、增殖和凋亡等细胞发展的过程中起着重要的作用，可调控约60％的基因表达，在疾病的各个发展阶段起着非常重要的作用。此外，越来越多的证据表明miRNAs在肿瘤的致癌作用和肿瘤的发展中起着十分重要的作用，在各种肿瘤中(如肺癌、乳腺癌、食管癌等)，多种miRNA被发现是上调或者下调的，表达上调的miRNA可能发挥与癌基因相似的作用，而表达下调的miRNA可能与抑癌基因有相似的作用，这对肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有指导意义。因而，miRNA作为一种新型的肿瘤生物标志物，备受关注。

组织标本取材属创伤性检出，且无法实现肿瘤的预测和早期诊断，因此，研究人员力图寻找一种非创伤性检查的检测手段，用于结肠癌的预测转移，但是，目前没有报道称得到了结肠癌预测转移的非创伤性检查的检测手段。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合、其探针组合物及应用。本发明通过对患者的血液样本中血浆的miRNA进行检测和对比，分析miRNA表达水平与肿瘤转移的关系，筛选出一组与结肠癌转移相关的血浆miRNA，并利用这些miRNA的TaqMan探针，制备适应于临床诊断用途的试剂盒，为结肠癌患者提供特异性且快速、无创伤的检测手段。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合，所述miRNA组合包括以下miRNA中一种或者其中至少两种的组合：miR-190、miR-422a、miR-592、miR-639。

优选采用其中任意两种、三种或者四种的组合。

优选地，所述miRNA组合为miR-190、miR-422a和miR-639的组合。

优选地，所述miRNA组合为miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的组合。

本发明的一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物，所述TaqMan探针组合物包括以下miRNA的TaqMan探针中的一种或者其中至少两种的组合：miR-190的TaqMan探针、miR-422a的TaqMan探针、miR-592的TaqMan探针、miR-639的TaqMan探针。

优选采用其中任意两种、三种或者四种TaqMan探针的组合物。

进一步地，所述miR-190的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：1所示；

所述miR-422a的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：2所示；

所述miR-592的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：3所示；

所述miR-639的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述血浆miRNA的TaqMan探针组合物为miR-190、miR-422a和miR-639的TaqMan探针组合物。

优选地，所述血浆miRNA的TaqMan探针组合物为miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的TaqMan探针组合物。

本发明还提供了如上述用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物在制备结肠癌预测转移试剂或工具中的应用。

本发明还提供了用于结肠癌预测转移的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物。

进一步地，所述用于结肠癌预测转移的试剂盒还包括：Taqman Universal PCRMaster Mix、cDNA和H₂O。

本发明基于血清/血浆中存在上百种miRNAs，其性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性的研究发现，在开展miRNAs作为癌症标志物方面的研究时，发现多种miRNAs(如miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639等)与结肠癌相关，因此，本发明以血浆作为检测样本，筛选出与结肠癌转移相关的特异或异常表达的miRNAs，并研制相应的诊断试剂盒，为结肠癌患者提供特异性且快速、无创伤的检测手段。

本发明中，存在于血浆中的与结肠癌相关的多种miRNA必然也存在于结肠癌细胞的外泌体中。细胞外泌体(外泌体)是细胞经过“内吞—融合—外排”等一系列调控过程形成并可分泌的分子直径为40～100nm的亚细胞双层膜囊泡，是一类细胞间信号传递的关键媒介。而且外泌体不含DNA片段，但含与其来源细胞相类似的细胞因子、生长因子等蛋白质，以及脂质、编码或非编码RNA(如miRNA)等生物活性物质，在调控细胞生理功能方面具有重要作用。因而，本发明用于结肠癌预测转移的血浆miRNA及其TaqMan探针组合物制备的结肠癌预测转移试剂或工具(如，试剂盒)，也适用于以血浆外泌体作为检测样本，从而为结肠癌患者提供特异性且快速、无创伤的检测手段。

本发明中，血浆较易获得，性质稳定，无需其他组织，属于无创型检查；血浆miRNA反映的是机体整体病理以及生理情况，将其作为预测转移标志物，可提高检测的准确性；所述试剂盒可简化TaqMan探针库，提高检测的特异性和灵敏度，更具针对性和实用性，降低了制作成本和生产时间；所述组合、方法、试剂盒可高效便捷的应用于结肠癌的预测转移。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639分别在高转移组和低转移组之间的表达差异图；

图2是本发明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639各自的ROC曲线图；

图3为本发明的miR-190、miR-422a和miR-639组合的ROC曲线图；

图4为本发明的miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639组合的ROC曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例1的一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合，所述miRNA组合包括以下miRNA中一种或者其中至少两种的组合：miR-190、miR-422a、miR-592、miR-639。

优选的血浆miRNA组合样品1为：miR-190、miR-422a和miR-639的组合。

优选的血浆miRNA组合样品2为：miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的组合。

本实施例1的血浆miRNA组合的筛选过程如下：

(1)分别收集结肠癌患者同源性高转移细胞株和低转移细胞株所分泌的外泌体，提取总RNA；

(2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的Affymetrix全转录本芯片技术进行miRNAs检测，筛选出与转移相关的差异表达的一组miRNAs；该组miRNAs包括9种miRNAs中筛选出在高转移组和低转移组患者中表达差异显著的miRNAs；如表1中所示；

(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组标本进行逐个检测，从Affymetrix全转录本芯片技术初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著的miRNAs；

(4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNAs，如表2和图1所示。

表1为采用Affymetrix全转录本芯片技术初筛出的高转移组和低转移组血浆中差异表达的miRNAs。

表1

表2为定量PCR方法复筛出的miRNAs。

表2

由表2可知，初筛出的9种miRNAs中有4种miRNAs在2组样本间存在差异(绝对含量表示方法为均值±标准差，p<0.001)。

本实施例1中，对筛选出的miRNA的进行临床价值评估。从miRNA的表达调节癌细胞转移的角度，对结肠癌患者在高转移组和低转移组中miRNAs表达水平进行分析。分析发现，miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639四种miRNAs在两组人群中的表达存在显著差异，并进一步对筛选出的miRNA运用统计学方法进行临床价值分析。结果显示miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639中的任意两种或三种或四种组合的诊断准确性远高于其中任一种单独作用，选取比较有代表性的列出，如图2，图3，图4。

实施例2

本实施例2的一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物，所述TaqMan探针组合物包括以下miRNA的TaqMan探针中的一种或者其中至少两种的组合：miR-190的TaqMan探针、miR-422a的TaqMan探针、miR-592的TaqMan探针、miR-639的TaqMan探针。

上述的四种miRNAs的TaqMan探针的具体内容如下表3所示。

表3

优选的所述血浆miRNA的TaqMan探针组合物为miR-190、miR-422a和miR-639的TaqMan探针组合物。

优选的所述血浆miRNA的TaqMan探针组合物为miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的TaqMan探针组合物。

实施例3

本实施例3为用于结肠癌预测转移的试剂盒，所述试剂盒包括上述实施例2中的用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物；还包括：Taqman Universal PCRMaster Mix、cDNA和H₂O。

具体地，本实施例3给出了一种具体的试剂盒组成：10μl Taqman Universal PCRMaster Mix，1μl TaqMan探针溶液，9μl cDNA和H₂O的混合溶液。

所制备试剂盒的具体操作流程如下：

(1)收集受试者的血浆外泌体样本，提取RNA后逆转录制备cDNA样品；

(2)按照上述配方加样；

(3)进行PCR反应，条件为95℃、30s进行一个循环；95℃、3s，60℃、30s进行40个循环。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合为miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的组合。

2.一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物，其特征在于，所述血浆miRNA的TaqMan探针组合物为miR-190、miR-422a、miR-592和miR-639的TaqMan探针组合物。

3.根据权利要求2所述的一种用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物，其特征在于，

所述miR-190的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：1所示；

所述miR-422a的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：2所示；

所述miR-592的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：3所示；

所述miR-639的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：4所示。

4.如权利要求2或者3所述的用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物在制备结肠癌预测转移试剂或工具中的应用。

5.用于结肠癌预测转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2或3所述的用于结肠癌预测转移的血浆miRNA的TaqMan探针组合物。

6.根据权利要求5所述的用于结肠癌预测转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Taqman Universal PCR Master Mix、cDNA和H₂O。