CN102146412B - 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 - Google Patents
一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102146412B CN102146412B CN201110004598A CN201110004598A CN102146412B CN 102146412 B CN102146412 B CN 102146412B CN 201110004598 A CN201110004598 A CN 201110004598A CN 201110004598 A CN201110004598 A CN 201110004598A CN 102146412 B CN102146412 B CN 102146412B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- tumor
- coding rna
- tumour
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims abstract description 9
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 201000000014 lung giant cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims 3
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 54
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 abstract description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 15
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 abstract 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 37
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 37
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 34
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 22
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 21
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 19
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 18
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 16
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 10
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- OUGPQMKVHOPOBY-UHFFFAOYSA-N gem 132 Chemical compound COP(O)(=O)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(=O)(OC)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)CC1OP(O)(=O)OCC1OC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)CC1OP(O)(=O)OCC(C(C1)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(=O)(OC)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(=O)(OC)OCC2C(CC(O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OP(=O)(OC)OCC2C(CC(O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OP(=O)(OC)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)OC1N1C=CC(N)=NC1=O OUGPQMKVHOPOBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000721 basilar membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000011645 metastatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 229940080607 nexavar Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供一种小分子非编码RNA(该小分子非编码RNA命名为hsa-miR-29b)及其应用。本发明进行了体外管形成实验和裸鼠成瘤及免疫组化实验,体外管形成实验的结果表明体外恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞诱导的血管生成;裸鼠成瘤及免疫组化实验的结果表明体内恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力和肿瘤血管生成能力,从而抑制肿瘤血行转移。因此,hsa-miR-29b可用于制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物和抗肿瘤血行转移药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种RNA及其应用,尤其涉及一种小分子非编码RNA及其应用。
背景技术
癌症(恶性肿瘤)已成为一个全球性公共健康问题,在我国尤为突出。卫生部报道,中国城乡居民的癌症死亡率在过去30年中增长了八成以上。目前,癌症已经成为中国城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因。其中,原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发生率和死亡率均高居各种恶性肿瘤前列。中国是肝癌的高发区,占全世界HCC患者总数的55%。现今恶性肿瘤主要的治疗方法以根治性切除为主,癌症难以根治的主要原因是局部复发和远处转移,转移癌是肿瘤复发的主要原因。众所周知,血行转移是肿瘤转移的主要途径,所以以血管生成为治疗靶标可以有效抑制肿瘤转移,这也是目前肿瘤学研究亟待解决的问题。恶性肿瘤都是高度血管化的,血管生成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。新生的血管不仅为肿瘤细胞提供营养,也为肿瘤细胞的扩散和转移提供了渠道,故抗血管生成是一种有效的抗肿瘤方法。一些抑制血管生成的药物,如多吉美,已经广泛应用于抗肝癌。
小分子非编码RNA,也称微小RNA(microRNA),是广泛存在于各种生物体内的一类小分子非编码的核糖核酸,长度约为20-22个碱基。它通过碱基配对识别靶基因信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’UTR),促进靶基因降解或抑制其翻译来实现对基因表达的负调控,从而参与了细胞的多种生物学过程。多个证据表明,microRNA的异常表达和功能失调直接影响着恶性肿瘤的发生发展。
现有研究发现,一种命名为hsa-miR-29b的小分子非编码RNA的表达在肝细胞肝癌组织标本中普遍下调,并且hsa-miR-29b表达低的患者无瘤生存时间显著较短,提示其与肝癌复发相关。而现有的国内外文献中至今未见有关hsa-miR-29b与肿瘤血管生成的研究报道。进一步研究hsa-miR-29b在肿瘤血管生成中的作用,对于制备新型抗血管生成、抗血行转移和抗肿瘤药物意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子非编码RNA基因,该基因命名为hsa-miR-29b,其序列如序列表<400>1序列所示。
本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤血行转移中的应用。
本发明通过体外管形成实验研究hsa-miR-29b在体外恢复表达对肿瘤细胞促血管生成功能的作用。体外管形成实验是在体外模拟血管内皮细胞在体内形成管腔结构的实验,通过管状结构的节点数来评估人脐静脉内皮细胞HUVEC出芽能力并表征人脐静脉内皮细胞HUVEC的血管生成能力。
上述体外管形成实验设A、B、C、D、E五个实验,上述五个实验内均设置空白对照组、阴性对照组和实验组。
步骤一:利用目的RNA转染肿瘤细胞株,使目的RNA在肿瘤细胞株内恢复表达,空白对照组的肿瘤细胞株不转染任何RNA;
上述目的RNA为hsa-miR-29b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(也称为anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA(也称为NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(也称为anti-NC)其中的一种。
上述肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6)、肝细胞肝癌细胞株H2M(简称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D(简称95D)或结肠腺癌细胞株HCT116(简称HCT116)其中的一种。
上述NC序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT。
步骤二:收集步骤一的肿瘤细胞培养上清孵育人脐静脉内皮细胞HUVEC,孵育后在显微镜下观察人脐静脉内皮细胞HUVEC网状结构的生成情况。
实验A:
空白对照组:加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验B:
空白对照组:加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的H2M肿瘤细胞培养上清;
实验C:
空白对照组:加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入转染了anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染了anti-hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验D:
空白对照组:加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的95D肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的95D肿瘤细胞培养上清;
实验E:
空白对照组:加入未经转染的HCT116肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的HCT116肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的HCT116肿瘤细胞培养上清;
对实验结果进行对比分析及相关性统计表明:实验A中,相对于阴性对照组和空白对照组,实验组的肿瘤细胞培养上清明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形成;实验B、实验D和实验E的结果与实验A相同。而在实验C中,相对于阴性对照组和空白对照组,实验组中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的anti-hsa-miR-29b拈抗后,收集的肿瘤细胞培养上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形成。管状结构的节点数与hsa-miR-29b表达水平呈负相关。
体外管形成实验结果表明,hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力,且该抑制肿瘤细胞的促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。
本发明通过裸鼠成瘤及免疫组化实验研究hsa-miR-29b在体内表达对肿瘤细胞生长和促血管生成的影响。
具体实验步骤为:
(1)细胞转染:将目的RNA(NC或hsa-miR-29b)转染肿瘤细胞株,使目的RNA在肿瘤细胞株内恢复表达;
(2)裸鼠成瘤:收集步骤(1)中恢复表达的肿瘤细胞对BALB/c裸鼠进行皮下注射,选取5只BALB/c裸鼠,在每只BALB/c裸鼠的两只后腿分别注射实验组和阴性对照组的肿瘤细胞,连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。观察完毕后完整剥离肿瘤组织,制成石蜡切片4℃保存。
(3)免疫组化:将步骤(2)得到的裸鼠肿瘤组织切片和人肝癌组织切片分别进行免疫组化染色后在显微镜下观察肿瘤组织中血管生成情况。
上述步骤(2)裸鼠成瘤设置阴性对照组和实验组。阴性对照组的肿瘤细胞株中转染NC,实验组的肿瘤细胞株中转染hsa-miR-29b。
上述步骤(2)裸鼠成瘤所采用的肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6。
上述步骤(3)人肝癌组织切片中hsa-miR-29b的表达水平通过实时定量PCR(也称为realtime PCR)测定。
裸鼠成瘤及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果:相对于阴性对照组,实验组肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低,体积较小;且实验组肿瘤组织中形成的微血管密度明显较高,肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度呈显著负相关。
对人肝癌组织切片的免疫组化结果:hsa-miR-29b表达水平高的人肝癌组织切片血管管径明显较小且血管密度明显较低。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示,两者呈显著负相关。
裸鼠成瘤及免疫组化实验结果表明,体内恢复小分子非编码RNA基因hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力,而且显著抑制了肿瘤血管生成能力,从而抑制肿瘤的血行转移。
综上所述,本发明提供的hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物以及抑制肿瘤血行转移药物方面都有广泛应用。
附图说明
图1为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图1A、图1B、图1C分别对应实施例1中的实验A、B、C的实验结果。图1A、图1B和图1C从左至右依次为空白对照组、阴性对照组和实验组的显微镜成像图,最右侧为相对节点数统计图。
图2为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图2A采用的肿瘤细胞为肺巨细胞癌细胞株95D,图2B采用的肿瘤细胞为结肠腺癌细胞株HCT116。图2A和图2B从左至右依次为空白对照组、阴性对照组和实验组的显微镜成像图;最右侧为相对节点数统计图。
图3为裸鼠成瘤及裸鼠肿瘤组织免疫组化结果图。图3A为从裸鼠皮下分离出来的肿瘤成像图;图3B为肿瘤生长曲线图;图3C为CD34标记的裸鼠肿瘤组织切片血管内皮细胞
在显微镜下成像图,图3D为裸鼠肿瘤组织切片hsa-mir-29b表达水平与微血管密度相关 性分析图。
图4为人肝癌组织免疫组化示意图。图4A为CD34标记的人肝癌组织血管内皮细胞于100倍镜下成像图;图4B为人肝癌组织切片中has-mir-29b表达水平与微血管密度的相关性分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,来进一步说明本发明的技术方案。应理解,以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。
本发明所采用的hsa-miR-29b序列从Sanger microRNA序列数据库miRBase V15.0获得,由上海吉玛公司合成。阴性对照组的阴性对照RNA序列(简称NC)为上海吉玛公司合成的用于microRNA实验的标准阴性对照序列,NC序列从5’端到3’端为:5’UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3’。
实施例1:体外管形成实验
体外管形成实验是在体外模拟血管内皮细胞在体内形成管腔结构的实验。血管生成涉及血管基底膜的降解,血管内皮细胞增殖和迁移到细胞外基质和重组血管内皮细胞后成三维管状结构,形成新的基底膜。在体外管形成实验中,通过铺基质胶为人脐静脉内皮细胞HUVEC提供细胞外基质,模拟体内环境,人脐静脉内皮细胞HUVEC通过增殖,迁移和粘附等过程,形成二维管状结构。出芽是血管生成的必须步骤,因此,体外可通过计算上述二维管状结构的节点数来评估人脐静脉内皮细胞HUVEC出芽能力并表征人脐静脉内皮细胞HUVEC的血管生成能力。
1.1细胞转染
此步骤的目的是在肿瘤细胞株中恢复目的RNA的表达,将目的RNA导入肿瘤细胞并恢复表达的步骤是利用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX进行反转实现。以24孔板为例,具体实验步骤为:
(1)取胰蛋白酶消化细胞重悬于含有10%FBS的无双抗DMEM培养基(购自Invitrogen公司)中,使得细胞密度为3×104个细胞/ml;
(2)将30p mol目的RNA稀释于100μl opti-MEM(购自Invitrogen公司)中,轻敲管壁混匀;每管加入1ul Lipofectamine RNAi MAX,轻敲管壁混匀,室温放置15min;得到RNAi MAX/siRNA稀释液;
(3)每孔加入100μl RNAi MAX/siRNA稀释液,再加入500μl细胞稀释液,该细胞 稀释液可使细胞密度在转染24h后大约为30-50%汇合,混匀后培养箱中培养一定时间混匀后培养箱中培养36-48小时后进行上清收集。获得hsa-miR-29b的肿瘤细胞培养上清。上述实施例为24孔板,其他孔板可根据孔的大小按比例放大或者缩小试剂用量。
1.2管形成检测
按照步骤1.1在肿瘤细胞株中恢复目的RNA的表达,收集转染后恢复表达的肿瘤细胞培养上清,与人脐静脉内皮细胞HUVEC共培养。
上述目的RNA可为hsa-miR-29b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(简称anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA(简称NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(简称anti-NC)其中的一种。
本实施例中采用的肿瘤细胞株选自:肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6)、肝细胞肝癌细胞株H2M(简称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D(简称95D)或结肠腺癌细胞株HCT116(简称HCT116)其中的一种。
本实施例中LM6出自上海细胞所;H2M出自香港大学;95D从中科院细胞中心购得;HCT116出自Bert Vogelstein&Kenneth W.Kinzler实验室。本实施例中未标明具体来源的试剂与材料均为市售标样。
人脐静脉内皮细胞HUVEC为本实验室按本领域常规方法制备:以人脐带(出自中山大学附属第二医院)为原材料,将内皮细胞从脐静脉中用胰酶(购于广州展晨公司)消化出来后,贴于培养瓶培养。
本实施例共设A、B、C、D、E五个实验,每个实验中均设置空白对照组、阴性对照组和实验组。
实验A:
空白对照组:加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验B:
空白对照组:加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的H2M肿瘤细胞培养上清;
实验C:
空白对照组:加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入转染了anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染了anti-hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清;
实验D:
空白对照组:加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的95D肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的95D肿瘤细胞培养上清;
实验E:
空白对照组:加入未经转染的HCT116肿瘤细胞培养上清;
阴性对照组:加入NC的HCT116肿瘤细胞培养上清;
实验组:加入转染hsa-miR-29b的HCT116肿瘤细胞培养上清;
具体实验步骤为:
(1)取96孔板,以每孔1.2×104个人脐静脉内皮细胞HUVEC (细胞悬液∶肿瘤细胞培养上清=25%∶75%)贴于预包被Matrigel(R&D,MN,USA)的孔中;于37℃孵育10小时;
(2)显微镜下观察加入不同肿瘤细胞培养上清的各实验组内皮细胞的管形成情况。通过对管状结构节点的计数表征肿瘤细胞促血管生成能力的强弱。所有实验组都是计数复孔,以三次重复实验取平均值。
1.3结果分析
实验A、实验B和实验C的实验结果如图1所示。图1A为实验A的结果示意图,图1B为实验B的结果示意图,图1C为实验C的结果示意图;实验D和实验E的实验结果如图2所示,图2A为实验D的结果示意图,图2B为实验E的结果示意图。
实验A、实验B、实验D、实验E结果分析:实验A结果如图1A所示,显微镜下空白对照组和阴性对照组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大,而实验组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较低;人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构的节点数与hsa-miR-29b的表达浓度的相对性统计结果表明,肿瘤细胞上清中hsa-miR-29b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著负相关。实验B、实验D、实验E的实验结果,分别如图1B、图2A、图2B所示,与实验A的实验结果相同。说明肿瘤细胞上清中hsa-miR-29b的表达明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC的管状结构形成。
实验C的结果分析:如图1C所示,显微镜下空白对照组和阴性对照组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大,而实验组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较高;人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结 构的节点数与anti-hsa-miR-29b表达浓度的相对性统计结果表明,anti-hsa-miR-29b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著正相关。说明肿瘤细胞上清中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的anti-hsa-miR-29b拈抗后,收集的肿瘤细胞上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构形成。
结果显示,hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力,且该抑制肿瘤细胞的促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。
实施例2裸鼠成瘤及免疫组化实验
2.1细胞转染
利用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX转染目的RNA(hsa-miR-29b或NC)到肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6,出自上海细胞所),目的RNA终浓度为50nM,培养48h后用胰酶消化并计数后按1×107个/ml的浓度用PBS重悬。本实施例中未标明具体来源的试剂与材料均为市售标样。
2.2裸鼠成瘤
选用5只5周龄的BALB/c裸鼠,在其两只后腿分别皮下注射1×106恢复hsa-miR-29b或NC表达LM6肿瘤细胞。连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。完整剥离所有裸鼠的肿瘤组织,按本领域常规方法制成石蜡切片4℃保存。
2.3免疫组化
本实施例对步骤2.2中得到的裸鼠肿瘤组织切片进行免疫组化,利用特异性的CD34抗体标记血管内皮细胞,通过显色原理使被标记的血管内皮细胞显色并使用显微镜观察肿瘤组织切片中血管生成情况。同时按相同原理对人肝癌组织切片进行免疫组化,观察人肝癌组织切片中的血管生成情况。
上述人肝癌组织切片取自中山大学附属肿瘤医院标本库,人肝癌组织切片中hsa-miR-29b的表达水平事先通过实时定量PCR(也称为real time PCR)测定。
免疫组化步骤为:
(1)预处理:取出55℃烤片1h,放于二甲苯中脱蜡两次,每次10min;依次用100%、95%、90%、80%、70%的乙醇洗一次,每步3min,后用双蒸水洗3min;0.3%的双氧水处理10min,双蒸水再洗3次,每次3min;浸泡于修复液中,用微波炉进行热修复,室温冷却半小时;用1×PBS洗三次,每次3min;
(2)杂交染色:用人或鼠特异性的-CD34抗体进行孵育,4℃过夜;恢复室温,弃 去抗体液,用1×PBS洗三次,每次5min;加入二抗,37℃半小时;用1×PBS洗三次,每次5min;加入DAB显色液进行显色,然后用苏木精复染;
(3)计数:微血管密度(MVD)计数,先寻找血管最密集区,然后在100倍镜下观察染成棕色的单个细胞或连续细胞丛,并以此计为一个血管,以5个视野的均数表示该标本的微血管密度。
2.4结果分析
裸鼠成瘤以及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果如图3所示,恢复hsa-miR-29b表达的实验组肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低,体积较小(见图3A和图3B);且实验组肿瘤组织中形成的微血管密度相对于阴性对照组明显较高,肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示,两者呈显著负相关(图3C和图3D)。
类似地,对人肝癌组织切片的免疫组化结果如图4所示,通过免疫组化标记血管内皮细胞,可以发现hsa-miR-29b高表达的人肝癌组织切片的血管管径明显较小且血管密度明显较低(见图4A)。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示,两者呈显著负相关(见图4B)。
综上所述,恢复hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力,而且显著抑制了肿瘤血管生成能力,从而可抑制肿瘤细胞通过血行途径形成转移瘤。
Claims (8)
1.一种小分子非编码RNA在制备抑制实体肿瘤细胞促血管生成药物中的应用,其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。
3.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤血管生成药物中的应用,其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。
5.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤药物中的应用,其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。
7.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤血行转移药物中的应用,其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110004598A CN102146412B (zh) | 2011-01-11 | 2011-01-11 | 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110004598A CN102146412B (zh) | 2011-01-11 | 2011-01-11 | 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102146412A CN102146412A (zh) | 2011-08-10 |
CN102146412B true CN102146412B (zh) | 2012-10-03 |
Family
ID=44420883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110004598A Expired - Fee Related CN102146412B (zh) | 2011-01-11 | 2011-01-11 | 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102146412B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013090556A1 (en) * | 2011-12-13 | 2013-06-20 | The Ohio State University | Methods and compositions related to mir-21 and mir-29a, exosome inhibition, and cancer metastasis |
CN105567826A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-05-11 | 苏州大学附属第二医院 | has-miR-29b-3p的检测 |
CN105969846B (zh) * | 2016-05-06 | 2019-09-27 | 江苏省人民医院 | 一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用 |
CN108690846A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-10-23 | 上海大学 | 抑制MiR-29b基因表达的应用 |
CN108653315B (zh) * | 2018-05-08 | 2020-04-24 | 哈尔滨工业大学 | 长非编码RNA linc00637的应用 |
CN115969982A (zh) * | 2023-02-04 | 2023-04-18 | 哈尔滨医科大学 | Sting激动剂在制备用于抑制肿瘤血行转移的药物中的用途 |
CN116650513A (zh) * | 2023-07-25 | 2023-08-29 | 中国农业大学 | miR-29在制备调节细胞能量代谢和细胞干性的制剂中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101341259A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-01-07 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
CN101389770A (zh) * | 2006-01-05 | 2009-03-18 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于诊断和治疗实体癌的基于微小rna的方法和组合物 |
CN101842484A (zh) * | 2007-09-14 | 2010-09-22 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 人外周血微泡中的mirna表达和其用途 |
-
2011
- 2011-01-11 CN CN201110004598A patent/CN102146412B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101341259A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-01-07 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
CN101389770A (zh) * | 2006-01-05 | 2009-03-18 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于诊断和治疗实体癌的基于微小rna的方法和组合物 |
CN101842484A (zh) * | 2007-09-14 | 2010-09-22 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 人外周血微泡中的mirna表达和其用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
林钊宇等.涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA 的筛选.《中华口腔医学研究杂志》.2010,第4卷(第6期),563-569. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102146412A (zh) | 2011-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102146412B (zh) | 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用 | |
Ge et al. | Hepatocellular carcinoma-derived exosomes in organotropic metastasis, recurrence and early diagnosis application | |
Harouaka et al. | Diminished viral replication and compartmentalization of hepatitis C virus in hepatocellular carcinoma tissue | |
CN102115730A (zh) | 稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法 | |
CN108949768A (zh) | 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用 | |
CN108467891A (zh) | Snhg5在乳腺癌诊断及评估和疗效预测中的应用 | |
CN105695463A (zh) | Pik3r2在猪卵巢颗粒细胞中的应用 | |
CN104031884A (zh) | 蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用 | |
CN103966327A (zh) | 一种miR-27a的应用及其诊断试剂盒 | |
CN102732484A (zh) | 一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系建立方法 | |
CN105062973B (zh) | 一株携带tp53突变的hpv阴性阴茎鳞癌细胞系及其用途 | |
CN105886507B (zh) | 长链非编码rna fam83h-as1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用 | |
CN101445534A (zh) | 一种高效的siRNA在制备抑制肿瘤迁移药物中的用途 | |
CN101948859B (zh) | 特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用 | |
Zong et al. | RETRACTED ARTICLE: miR-30d Induced Apoptosis by Targeting Sox4 to Inhibit the Proliferation, Invasion and Migration of Nephroblastoma | |
CN104062432B (zh) | ang2在制备ECTC血管类型肝癌诊断试剂及治疗药物中的应用 | |
CN108034719A (zh) | Gins4基因或gins4蛋白作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用 | |
CN103146703B (zh) | 抑制上皮性卵巢癌肿瘤生长的siRNA及其重组载体与应用 | |
CN107541514A (zh) | 特异性抑制COL12A1基因表达的siRNA及其重组载体和应用 | |
CN101407810B (zh) | 中期因子基因为靶的小干扰rna、载体及其应用 | |
Liu et al. | METTL3 regulates the proliferation, metastasis and EMT progression of bladder cancer through P3H4 | |
CN107582525A (zh) | Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用 | |
CN105561339B (zh) | 一种miRNA的组合制备抗非小细胞肺癌药物中的应用 | |
CN110241085A (zh) | 一种npm1敲除的人膀胱癌t24/ddp细胞株 | |
CN107119125A (zh) | lncRNA‑D63785及其干扰物的应用和应用其的产品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121003 Termination date: 20150111 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |