NO329999B1 - Fremgangsmate for a ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse i en membrankontaktormodul - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse i en membrankontaktormodul. Foreliggende oppfinnelse angår også en integrert fremgangsmåte som kombinerer biomassekonsentrering og/eller diafiltrering og fettsyreekstrahering i nevnte membrankontaktormodul. Videre angår oppfinnelsen også ulike anvendelser av de oppnådde fettsyrene.

Description

1. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse i en membrankontaktormodul. Foreliggende oppfinnelse angår også en integrert fremgansmåte som kombinerer biomassekonsentrering og/eller diafiltrering og fettsyreekstrahering i nevnte membrankontaktormodul.

Videre angår patentsøknaden ulike anvendelser av de frembragte fettsyrene.

2. Oppfinnelsens bakgrunn

Hos mennesker er langkjedede omega-3-polyumettede fettsyrer essensielle fettsyrer og må tilføres via kostholdet. Av disse har dokosaheksaensyre, C22:6 A4,7,10,13,16,19 (DHA) særlig gunstige helseeffekter og anvendes ikke bare som et kosttilskudd, men også som en farmasøytisk forbindelse for behandling av hjertesykdommer (Wynn et al, 2005).

DHA er en overlegen polyensyre, da denne lett kan konverteres til andre essensielle polyenfettsyrer som eikosapentaensyre (EPA). Konvertering av EPA til DHA er ikke mulig i menneskekroppen.

For anrikning av olje som skal anvendes i funksjonelle matvarer, og innen det farmasøytiske området, er det et behov for konsentrater av fettsyrer og deres alkylesterderivater. For tiden fremstilles sammensetninger inneholdende polyumettede fettsyrer fra fiskeoljer. Fiskeolje er imidlertid en begrenset resurs som det kan bli mangel på i fremtiden (Lewis et al, 1999). Videre rapporteres om mulig akkumulering av toksiske forurensninger, inkludert tungmetaller, dioksiner og polyklorerte bifenyler (PCB) fra det marine miljøet i fiskens fettvev, hvilket har medført behov for omfattende rensing av fiskeoljer for humant konsum og dyrefor (Ratledge, 2004).

Et alternativ til fiskeolje er olje fra mikrobiologiske kilder. Noen marine, heterotrofe mikroalger akkumulerer store mengder DHA, slik som Crypthecodinium cohnii (for eksempel US patent nr. 5407957) og thraustochytrider (for eksempel WO patent nr. 9408467; US patent nr. 6509178). Disse mikroorganismene akkumulerer ofte mer enn 50% av sin tørrvekt som lipider, der DHA ofte utgjør mer enn 25% av totallipidene (Lewis et al, 1999; Yokochi et al, 1998; Yaguchi et al, 1997). En ytterligere fordel ved mikrobiell produksjon av DHA, sammenlignet med fiskeoljer, er at DHA er den eneste, eller dominerende, langkjedede polyumettede fettsyren (PUFA), hvilket gjør rense-prosessen enklere.

Konvensjonelt isoleres marine og vegetabilske oljer fra biomassen ved termisk-mekaniske prosesser og/eller Løsningsmiddelekstraksjon. Når fettsyrealkylesterne er det ønskede produkt, transesterifiseres den ekstraherte olje, ofte i nærvær av en katalysator. Vanligvis inkluderer den konvensjonelle måten å oppnå fettsyrer fra mikroalger eller fisk flere trinn som kan være skadelig for fettsyrene, særlig de ustabile polyumettede fettsyrene. Fettsyrene er utsatt for omfattende og tøff behandling, og høy temperatur.

US 2006/286205 omhandler hydrolyse av biomasse som deretter blir emulgert. US 2005/170479 omhandler frigivelse av fettsyrer som DHA fra biomasse, blant annet ved hydrolyse med lipase. Ingen av disse fremgangsmåtene benytter ikke noen form for membranteknologi.

US 2003/143659 beskriver bruk av filtermembraner for å frigi ulike ingredienser fra biomassen, men omhandler ikke frigivelse av ingredienser fra vandig biomasse.

Det er derfor et behov for nye fremgangsmåter for ekstraksjon av fettsyrer, spesielt LC-PUFA for å imøtekomme det økende markedet og behovet for høykvalitets polyumettede fettsyrer, spesielt DHA.

3. Beskrivelse av oppfinnelsen

En hensikt ifølge oppfinnelsen er å frembringe en ny fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen er å frembringe en ny prosess der fettsyrene ekstraheres fra vandig biomasse.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny prosess der hydrolysen av biomasselipidene utføres i en vandig fase.

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny prosess for sekvensiell frigivelse av fettsyrer med ulike egenskaper.

En annen hensikt ifølge oppfinnelsen er å frembringe en ny fremgangsmåte for å ekstrahere polyumettede fettsyrer, spesielt DHA.

Disse og andre hensikter oppnås ved foreliggende oppfinnelse.

Et aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse i en membrankontaktormodul Ml, omfattende de følgende trinn: a) hydrolyse av lipider fra vandig biomasse for å frigi frie fettsyrer; b) tilførsel av den vandig hydrolyserte biomassen inneholdende de frie fettsyrene til det vandige kammer i nevnte membrankontaktormodul Ml; og c) ekstrahering av fettsyrene over en hydrofob membran til det organiske kammeret i nevnte membrankontaktormodul Ml inneholdende et organisk løsnings-middel/løsningsmiddelblanding.

Den nye og oppfmneriske fremgangsmåten representerer en forenklet fremgangsmåte for å frembringe fettsyrer, spesielt DHA eller dens alkylesterderivat, fra vandig biomasse, uten ekstraksjon av oljefasen fra cellemassen. Lipidene hydrolyseres i den vandige biomassen. Fettsyrene kan konverteres til sine fettsyreetylestere i den organiske fasen ved nærvær av en alkohol, en katalysator og/eller forestringsenzym i den organiske fasen.

Betegnelsen vandig biomasse betyr enhver biomasse suspendert, dispergert, homogenisert eller oppløst i et vandig medium. Den vandige biomassen er fortrinnsvis en fermenteringsløsning av mikroorganismer. Mikroorganismene dyrkes til en ønsket konsentrasjon i en fermentor, minst 45-50 g/L. Fortrinnsvis er kulturen er høytetthets kultur på omtrent 150 g/L eller mer. Imidlertid er biomasse, inkludert marin biomasse og deres biprodukter, spesielt fisk og fiskebiprodukter, og også vegetabilsk biomasse med et tilstrekkelig lipidinnhold, for eksempel høyere enn 10% omfattet av foreliggende oppfinnelse. Den vandige biomassen kan være rekonstituert fra tørket biomasse. Den vandige biomassen kan inneholde intakte celler og ødelagte celler. Vanninnholdet og egenskapene til den vandige biomassen bør muliggjøre tilfredsstillende sirkulasjon i systemet. Fremgangsmåten er særlig egnet for biomasse med høyt vanninnhold, for eksempel høyere enn 50%.

Betegnelsen lipider inkluderer både mono-, di- og triglycerider og fosfolipider.

Mikroorganismene kan være, men er ikke begrenset til, foto- eller heterotrofe mikroalger, fortrinnsvis thraustochytrider. Totalt fettsyreinnhold i lipidfraksjonen til den utvalgte biomasse er fortrinnsvis større enn 40%, helst større enn 60%, og aller helst større enn 80%, der DHA-innholdet ikke er lavere enn 20%.

Oljeholdige mikroorganismer er særlig egnede ifølge foreliggende oppfinnelse siden disse inneholder mer enn 20% lipider basert på tørrvekten.

En skjematisk fremstilling av membrankontaktormodulen er vist i fig. 1. Den vandige biomassen sirkuleres fra en biomassetank Tl fortrinnsvis utstyrt med en rører, til det vandige kammeret (1) i membrankontaktormodulen Ml og tilbake til biomassetanken Tl. Det organiske løsningsmiddel/løsningsmiddelblanding sirkuleres fra en produktgjenvinningstank T2 til det organiske kammeret (3) i membrankontaktormodulen og tilbake til produktgjenvinningstanken T2, mens de frie fettsyrene ekstraheres over den hydrofobe membranen (2) ved diffusjon til det organiske kammeret der produktene av interesse akkumuleres.

Den vandige, fettsyrerike biomassen strømmer ved en høyere strømningshastighet enn den organiske fasen. Fettsyrene ekstraheres fra den vandige fasen over i den organiske fasen via det organiske løsningsmidlet som fukter den hydrofobe membranen (i figur 1 indikerer påtegnet pil retningen på transporten av oppløste stoffer). Den hydrofobe membranen hindrer at vann bryter gjennom membranen og, følgelig, kontaminering av den organiske fasen som mottar de oppløste stoffer.

Den hydrofobe membranen kan lages av ethvert hydrofobt polymert materiale. Polyimidmembraner foretrekkes på grunn av sine sterkt hydrofobe egenskaper, som hindrer vann i å bryte gjennom membranen. Ulike polymerer kan anvendes, fortrinnsvis, men ikke begrenset til Lenzing P84 og Matrimid 5218. Membranene kan forsterkes ved et porøst støttelag laget av for eksempel "non-woven polyester baking paper".

Membraner anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse kan være porøse (lavt

ultrafiltrerings- eller nanofiltreringsområde) eller uporøse membraner. Den hydrofobe membran kan også fungere som en barriere mellom hydrolyserte og ikke-hydrolyserte lipider. Membranene kan fremvise en retensjon større enn 0% for diglyceridmolekyler inneholdende en eller to molekyler av DHA, helst større enn 50%, mer foretrukket større enn 70%, og enda mer foretrukket større enn 95%.

Membrankontaktormodulkonfigurasjonen tilpasses i samsvar med valgt membranutforming. Membranen som benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse kan konfigureres med hensyn på en hvilket som kjent utforming, slik som plate og ramme, spiralviklet, rørformet, og utforminger avledet fra disse. Tubulære, hulfiber og flate membraner kan anvendes.

Lipidhydrolysen utføres kjemisk eller enzymatisk, og utføres direkte på den vandige biomassen. Enzymatisk hydrolyse kan utføres ved å anvende én eller flere lipaser. Mono-, di- og triglycerider og fosfolipider hydrolyseres og frigir frie fettsyrer, og den vandige hydrolyserte biomassen tilføres til det vandige kammer i membrankontaktormodulen. I membrankontaktoren ekstraheres de frie fettsyrene ved konsentrasjons-gradientdiffusjon gjennom den hydrofobe membranen til det organiske kammeret i membrankontaktormodulen. Det organiske kammeret omfatter egnet organisk løsnings-middel eller løsningsmiddelblanding, eventuelt blandet med alkoholer og/eller katalysator, dersom alkylesterderivatene av fettsyrene er det foretrukne produkt.

Fettsyrene som kan ekstraheres ifølge foreliggende oppfinnelse er enhver fettsyre av interesse. Det kan være middels- til langkjedede fettsyrer med fjorten til atten karbonatomer, enten mettede eller umettede. Eksempler på slike syrer er palmitinsyre (C16:0) og oljesyre (C18:l).

Foretrukne fettsyrer for ekstraksjon ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid langkjedede polyumettede fettsyrer (LC-PUFA) med en karbonkjede lenger enn atten karbonatomer og med to eller flere dobbeltbindinger, spesielt EPA og DHA.

Ifølge én utførelsesform ifølge oppfinnelsen frigis fettsyrene sekvensielt ved enzymatisk hydrolyse. I det første trinnet frigis mettede og monoumettede medium til langkjedede fettsyrer, spesielt C16 og C18, ved en første lipase. Det siste stadiet frigir middels til langkjedede polyumettede fettsyrer, spesielt DHA. Dette kan oppnås ved å la den første lipasen virke i en lenger tidsperiode, eller ved å tilsette en annen lipase. Mellom det første og det siste stadiet kan ytterligere stadier forekomme, avhengig av fettsyrene av interesse. Rekkefølgen på fettsyrerfigivelsen kan endres avhengig av de eksperimentelle betingelsene. Fettsyrene frigitt i det første stadiet ekstraheres over membranen før det neste stadiet initieres. Lipasene anvendt ifølge oppfinnelsen kan være immobilisert på et fast bæremateriale eller oppløst i den vandige biomassen.

Enzymene som anvendes er lipaser, for eksempel, men ikke begrenset til, lipaser av mikrobiell opprinnelse slik som 1,3 posisjonsspesifikke og uspesifikke lipaser fra Candida rugosa, Candida cylindracea, Candida antarctica, Pseudomonas sp, Mucor javanicus, Mucor mihei, Thermomyces lanuginosus (Lipozyme TL 100L), og blandinger av dissse. Selektivitet med hensyn på fettsyrene og frigivelseshastighetene til de individuelle fettsyrer er kriterier for valg av de best egnede enzymer. Gruppen av enzymer som er listet er rapportert å være i stand til å fjerne mettede og monoumettede fettsyrer fra vegetabilske oljer og fiskeoljer (Okada et al, 2007). Henvisning til spesifikke enzymer for DHA-frigivelse er ikke kjent.

Prinsippet for denne hydrolyseprosessen er fjerning av de uønskede fettsyrene i triglyceridmolekylet, dvs. de mettede og monoumettede forbindelsene. Esterbindingen mellom slike fettsyrer og glycerol er lett tilgjengelig for enzymene pga. deres lineære konfigurasjon. Mettede og monoumettede fettsyrer frigis derfor tidligere i den enzymatiske reaksjonen og fjernes først. I en foretrukket utførelsesform er det første enzymet en 1,3 posisjonsspesifikk, siden DHA fortrinnsvis er lokalisert i posisjon 2 av triglyceridmolekylet i thraustochytrider. Følgelig frigis mettede og monoumettede fettsyrer og den gjenværende biomassehydrolysatblandingen anrikes med hensyn på DHA. Derfor tilsettes enten et annet enzyme for å frigi de middels- til langkjedede polyumettede fettsyrene, spesielt DHA, eller den første lipasen kan virke i en lenger tidsperiode.

Mer spesielt, i en foretrukket utførelsesform, fjernes i det første stadiet av den trinnvise enzymatiske hydrolysen fortrinnsvis mer enn 50%, mer foretrukket mer enn 70%, og enda mer foretrukket mer enn 90% av det initielle innholdet av lett tilgjengelige fettsyrer, som palmitin- (C16:0), stearin- (Cl8:0) og/eller olje- (Cl8:1) syre. DHA-frigivelsen i dette stadiet bør ikke være større enn 10%, mer foretrukket ikke større enn 5%. Den største fraksjonen av DHA, og eventuelt andre langkjedede polyumettede fettsyrer, frigis i det siste stadiet av den trinnvise enzymatiske hydrolysen, enten ved virkning av det første enzymet eller et annet enzym.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse utgjør de polyumettede fettsyrene minst 50 vekt%, fortrinnsvis 60 vekt%, helst 80 vekt% av de totale fettsyrene ekstrahert i det siste stadiet av den enzymatiske hydrolysen.

I en annen foretrukket utførelsesform utgjør DHA ca. 60%, fortrinnsvis ca. 70%, helst fortrinnsvis ca. 90% av de totale fettsyrene ekstrahert i det siste stadiet av den enzymatiske hydrolysen.

Den organiske fasen som sirkulerer fra produktgjenvinningstanken T2 til det organiske kammeret i membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstanken er initielt fylt med et egnet løsningsmiddel eller en egnet løsningsmiddelblanding. Fortrinnsvis er løsningsmidlet et upolart løsningsmiddel, fortrinnsvis, men ikke begrenset til, heksan, cykloheksan, heptan, pentan, toluen, dikloretan, diklormetan, dietyleter, etylacetat, aceton eller en hvilken som helst blanding av disse.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen konverteres fettsyrene som ekstraheres gjennom membranen til det organiske kammeret til sine alkylesterderivater ved forestring. Følgelig kan løsningsmidlet eller løsningsmiddelblandingen som sirkulerer fra produktgjenvinningstanken ytterligere omfatte en alkohol utvalgt fra gruppen bestående av lavere alkylalkoholer, fortrinnsvis metanol eller etanol. Således er produktene av interesse som akkumulerer i T2 esterderivater av fettsyrene. For å lette forestringen kan en katalysator i form av en syre, en base, et enzym (lipase) eller blandinger av disse være tilstede i den organiske fasen som sirkulerer fra T2 til det organiske kammeret i membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstanken T2.

For ytterligere å øke den initielle frigivelseshastigheten av fettsyrene fra den vandige biomassen, kan biomassen utsettes for proteasebehandling før eller samtidig med lipidhydrolysen. Enhver protease kan anvendes, for eksempel proteaser fra Streptomyces grisens, alkalaser og blandinger av disse, slik det anbefales av leverandøren.

Salter og andre lavmolekylære forbindelser som kontaminerer den vandige biomassen kan fjernes ved diafiltrering. Videre kan suboptimale cellekonsentrasjoner oppnås under fermenteringsprosessen. Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse videre en fremgangsmåte omfattende en tverrstrøms filtreringsmodul M2 for awanning av biomassen og/eller diafiltrering.

Et annet aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse angår således en integrert fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse omfattende følgende trinn: a) awanning og/eller diafiltrering av nevnte vandige biomasse i en tverrstrøms filtreringsmodul M2, hvilket genererer et retentat for videre prosessering i en membrankontaktormodul Ml; b) hydrolyse av lipidene i retentatet for å frigi frie fettsyrer; c) tilførsel av det hydrolyserte retentat inneholdende frie fettsyrer til det vandige

kammeret i nevnte membrankontaktormodul Ml; og

d) ekstrahering av frie fettsyrer over en hydrofob membran til det organiske kammeret i nevnte membrankontaktormodul Ml inneholdende et organisk

løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding.

En skjematisk fremstilling av den integrerte prosessen er vist i fig. 2. Den fettsyrerike vandige fasen sirkuleres til tverrstrømsmembranmodulen M2, og tilbake til biomassetanken Tl. Vann og lavmolekylære forbindelser strømmer gjennom membranen (4) og danner et avfallspermeat (6). Ved en ønsket cellekonsentrasjon stoppes sirkulering gjennom M2, og det vandige retentatet (5) inneholdende de frie fettsyrene begynner å sirkulere inn i membrankontaktoren som i det første aspektet av foreliggende oppfinnelse.

I tverrstrømsfiltreringsmodulen M2 dannes en konsentrert biomasse for tilførsel til membrankontaktoren Ml. Konsentreringen av cellemassen fra for eksempel en fermenteringsløsning ved tverrstrøms filtrering, tilpasses enkelt den etterfølgende prosesseringen i Ml og gjennomføres fortrinnsvis som en integrert prosess. Konsentrering av cellemassen ved for eksempel sentrifugering er ikke like lett å tilpasse til den etterfølgende prosesseringen i Ml.

I én utførelsesform sirkuleres den vandige biomassen først fra en biomassetank Tl gjennom tverrstrømsmembranmodulen M2, hvoretter retentatet (5) sirkuleres til det vandige kammeret (1) i membrankontaktormodulen Ml, mens fettsyrene ekstraheres til det organiske løsningsmidlet/løsningsmiddelblandingen som sirkulerer det organiske kammeret (3) i membrankontaktoren og akkumulerer i en produktgjenvinningstank T2.

Permeatet som dannes gjennom tverrstrømsmembranen inneholder vann og lavmolekylære forbindelser som kastes.

Trinn d) ovenfor kan også omfatte forestring som et ytterligere trinn. Følgelig oppnås fettsyre esterderivat.

Både mikrofiltrerings- (MF) og ultrafiltrerings- (UF) teknikker er egnede for konsentrering av vandig biomasse. Valget gjøres normalt i forhold til cellemediets egenskaper. Keramiske membraner foretrekkes ofte fremfor organiske membraner i noen industrielle prosesser, på grunn av sin høyere kjemiske og termiske stabilitet. Tverrstrøms filtreringsmoduler som er egnet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer uorganiske tubulære membraner, for eksempel en membran laget av titan eller zirkonium. En egnet uorganisk tubulær membran har en cut-off i mikro- (0,1-10 um) eller ultrafiltreirngsområdet (10<3->10<6>Da).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen betjenes normalt som batch eller semi-kontinuerlig prosess.

Etter avslutning av fremgangsmåten eller den integrerte fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan løsningsmidlet/løsningsmiddelblandingen gjenvinnes. Løsningsmiddel-gjenvinning oppnås fortrinnsvis ved organisk løsningsmiddel nanofiltrering (OSN) heller enn destillering i det foreslåtte systemet. Den organiske fasen konsentreres mens det organiske løsningsmidlet gjenvinnes ved nanofiltrering (eksisterende MET-patent). Imidlertid kan enhver egnet fremgangsmåte for gjenvinning av Løsningsmiddelblanding anvendes.

De frie fettsyrene eller esterderivatene av disse oppnådd i produktgjenvinningstanken T2 kan videre renses ved fremgangsmåter kjente for fagpersoner innen teknikken, slik som molekylær destillering eller kromatografi, men særlig ved høyytelses motstrøms-kromatografi (HPCCC).

Fettsyrene ekstrahert ifølge oppfinnelsen kan anvendes i flere applikasjoner slik som mattilskudd, i matvarer, helsekost og i farmasøytiske produkter. Følgelig er et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen anvendelse av fettsyrene ekstrahert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i enhver av de ovennevnte applikasjoner.

Når renset DHA gjenvinnes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan denne også anvendes ved mange applikasjoner slik som mattilskudd, matvarer (for eksempel anrikning i melkepulver), helseskost og i farmasøytiske produkter.

DHA kan også anvendes i spesialiserte matformuleringer for spebarn, gravide kvinner og nyfødte. Den kan også være anvendelig som en ingrediens i dyrefor.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en kostnadseffektiv fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer og deres alkylesterderivater. Fremgangsmåten reduserer også behovet for fiskeolje. Fremgangsmåten er enkel å oppskalere. Fettsyrene er høykvalitets fettsyrer egnede for både matvarer og farmasøytisk industri.

4. Figurer

Fig. 1 viser en skjematisk fremstilling av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Den fettsyrerike vandige fasen sirkuleres fra en biomassetank Tl til det vandige kammeret (1) i membrankontaktormodulen og tilbake til biomassetanken Tl. Løsningsmidlet/- løsningsmiddelblandingen sirkuleres fra en produktgjenvinningstank T2 til det organiske kammeret (3) i membrankontaktormodulen Ml og tilbake til produktgjenvinningstanken T2. Fettsyrene ekstraheres over den hydrofobe membranen (2) ved diffusjon til det organiske kammeret der produktet av interesse akkumulerer. Fig. 2 viser en skjematisk fremstilling av den integrerte fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Den fettsyrerike vandige fasen sirkuleres til tverrstrømsmembranmodulen M2, og tilbake til biomassetanken Tl. Vann og lavmolekylære forbindelser trenger gjennom membranen (4) og danner et avfallspermeat (6). Ved en ønsket cellekonsentrasjon stoppes sirkuleringen gjennom M2, og det vandige retentat (5) inneholdende de frie fettsyrene begynner å sirkulere inn i membrankontaktoren som forklart i fig. 1.

5. Eksempler

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1 - kjemisk versus enzymatisk hydrolyse av vandig biomasse

Dette eksempelet viser at:

Ved den reaksjonstid og de betingelser som anvendes, frigis ved enzymatisk hydrolyse av lipidene i den vandige biomassen ca. 70% av den mengde fettsyrer som frigis ved kjemisk hydrolyse (sammenlign resultater vist i del A og B, se verdiene i tabell 1 og 2).

Forbehandling av biomassen med protease før enzymatisk lipidhydrolyse kan være fordelaktig for å lette kontakten mellom lipasen og lipidene.

A) Kjemisk hydrolyse av vandig biomasse

1,33 ml vann ble tilsatt flere rør inneholdende~200 mg tørr biomasse for å danne en biomassekonsentrasjon på 150 g/L tørrvekt. 5 ml 0,5M KOH-løsning i etanol ble tilsatt og løsningen ble blandet i 30 sekunder (Ultraturrax - UT - 9500 rpm). Rørene ble inkubert ved 60°C i et vannbad i 2 timer. 2 ml vann ble tilsatt etter inkuberingsperioden og den dannede løsningen surgjort til pH 1. Frie fettsyrer ble ekstrahert ved å vaske den hydrolyserte løsningen med tre alikvoter hver bestående av 2 ml heksan. Et eksakt volum av heksanfasen (2 ml), inneholdende de frie fettsyrene, ble tatt ut i et på forhånd

innveid rør og heksanet ble deretter fordampet under nitrogen. De frie fettsyrene ble deretter oppløst i etanol for analyse.

B) Enzymatisk hydrolyse av vandig biomasse

Bl) Konsentrert vandig biomasse ( 150 g/ L tørrvekt) uten proteasebehandling

300 mg frysetørket biomasse ble suspendert i 2 ml fosfatbuffer (0,1M, pH 7,0 ved 37°C) for å rekonstituere til en biomassekonsentrasjon på 150 g/L. 3000U av lipase LPZ (Lipozyme TL 100L, Novozymes, Danmark) per gram biomasse ble tilsatt etter koking av den våte biomassen (10 minutter i et vannbad ved 98°C) og nedkjøling til romtemperatur.

B2) Vandig biomasse ( 50 g/ L tørrvekt) uten proteasebehandling

2 ml fosfatbuffer (pH 7 ved 37°C) ble tilsatt 100 mg frysetørket biomasse, for å gi en biomassekonsentrasjon på 50 g/L tørrvekt. Cellemassesuspensjonen ble deretter kokt i 10 minutter (ved 98°C) og umiddelbart nedkjølt til romtemperatur. To enzymkonsentra-sjoner ble testet for lipase LPZ, nemlig 1000 og 2000 enheter per gram biomasse.

B3) Vandig biomasse ( 50 g/ L tørrvekt) forbehandlet med protease

100 mg frysetørket biomasse ble suspendert i 2 ml fosfatbuffer (pH 7 ved 37°C), for å gi en biomassekonsentrasjon på 50 g/L tørrvekt. Cellemassesuspensjonen ble deretter kokt i 10 minutter (ved 98°C) og umiddelbart nedkjølt til romtemperatur. Enzymatisk forbehandling ble utført ved tilsetning av 20 mg alkalase (Novozymes, Danmark) per ml løsning. Reaksjon med proteasen pågikk i 30 minutter i et vannbad ved 60°C. Etter denne perioden ble rørene nedkjølt igjen til lavere enn 30°C før tilsetning av lipase. Lipasemengde tilsvarende 1000 U lipase LPZ per gram biomasse ble tilsatt.

Alle rørene ble gjennomstrømmet med nitrogen og godt forseglet før de ble plassert på en flerpunkts magnetrører i en inkubator ved 37°C i den ønskede reaksjonsperioden. Bl og B3 ble inkubert i 36 timer og B2 i 12 timer. Etter inkubering ble 2 ml deionisert vann tilsatt alle rørene. Deretter ble tre alikvoter av 2 ml heksan tilsatt til den resulterende vandige/hydrolyserte løsning, omrøring mellom tilsetningene. Den resulterende emulsjonen dannet av hydrolysert løsning og heksan ble separert ved sentrifugering (10 min, 4000 rpm). Et eksakt volum av heksanfasen inneholdende de frie fettsyrene ble tatt ut i et på forhånd innveid rør og løsningsmidlet fordampet under nitrogen. Hydrolyserte olje/frie fettsyrer ble deretter løst i etanol for analyse. Tabell 1 viser mengdene av av de dominerende fettsyrene frigitt ved de ulike betingelsene beskrevet ovenfor.

Sammenligning av B2 og B3 viser at proteaseforbehandling ikke hadde noen effekt på sluttutbyttet av frigitte fettsyrer, imidlertid (data ikke vist) forbedres kontakten mellom lipase og lipidene og de initielle hastigheter øker, dermed reduseres den totale reaksjonstiden. Resultater fra enzymatisk hydrolyse ble sammenlignet med kjemisk hydrolyse, spesielt for den konsentrerte vandige biomassen (Bl). 70% av de totale fettsyrene ble gjenvunnet, nemlig 81% palmitinsyre (C16:0), 77% oljesyre (C18:l) og 46% DHA (C22:6).

Eksempel 2 - Sekvensiell frigivelse av fettsyrer ved enzymatisk hydrolyse

Dette eksempelet viser hydrolyseeffektiviteten til fire kommersielt tilgjengelige mikrobielle lipaser: Candida rugosa (CR), Mucor javanicus (MJ), Pseudomonas sp (PS), alle fra Sigma Aldrich (Tyskland), og Lipozyme (LPZ) fra Novozymes (Danmark).

200 mg frysetørket biomasse ble suspendert i 4 ml fosfatbuffer (0,1M, pH 7 for CR, PS og LPZ, og pH8 for MJ, ved 37°C) til en biomassekonsentrasjon på 50 g/L tørrvekt. Rørene ble plassert i et vannbad ved 98°C og kokt i 10 minutter. Etter denne perioden ble rørene umiddelbart fjernet fra vannbadet og nedkjølt til romtemperatur. Enzym-mengder ekvivalent til 2000U per gram biomasse ble tilsatt rørene. Etter gjennom-strømning med nitrogen og grundig forsegling, ble rørene plassert på en flerpunkts magnetrører (350 rpm) i en inkubator ved 37°C. Etter 24 timer inkubering ble 4 ml deionisert vann tilsatt hvert rør. Deretter ble fem alikvoter av 2 ml heksan tilsatt til den resulterende vandige/hydrolyserte løsningen, omrøring mellom tilsetningene. Den resulterende emulsjon dannet av hydrolysert løsning og heksan ble separert ved sentrifugering (10 min, 4000 rpm). Et eksakt volum av heksanfasen inneholdende de frie fettsyrene ble tatt ut til et på forhånd innveid rør og løsningsmidlet inndampet under

nitrogen. Heksan ble deretter inndampet under nitrogen og de frie fettsyrene oppløst i etanol for analyse. Tabell 2 viser total mengde av de dominerende fettsyrene frigitt i hvert tilfelle.

Tabell 2: Mengder av hovedfettsyrer frigitt ved enzymatisk hydrolyse av vandig biomass (24 timers reaksjon) for de fire enzymene i studien { Candida rugosa - CR, Lipozyme - LPZ, Mucor javanicus - MJ og Pseudomonas sp - PS) og en enzymkonsentrasjon på 2000 U per gram biomasse. Analyse ved LC-MS

Resultatene viser at LPZ friga de største mengdene av fettsyrer i løpet av reaksjonsperioden. Imidlertid var CR og MJ mer selektive, dvs. de fjernet fortrinnsvis Cl6:0 og Cl8:1, med en fullstendig gjenvinning av Cl6:0 ved anvendelse av MJ. Derfor kan MJ anvendes i det første stadiet av den ønskede trinnvise hydrolysen ifølge oppfinnelsen, og PS i et annet stadium. I et mulig scenario vil tilgangen for lipasen PS til esterbindingen mellom DHA (C22:6) og glyceridmolekylet bli enklere etter fjerning av Cl6:0 og Cl8:1 ved lipase MJ.

Eksempel 3 - Fettsyreseparering ved bruk av en membrankontaktor Eksperimentene beskrevet nedenfor ble utført for å vise effektiviteten til membrankontaktoren og polyimidmembraner for fettsyreekstrahering uten direkte kontakt mellom det organiske løsningsmidlet og den vandige løsningen. Ut i fra disse foreløpige eksperimenter ble det overraskende funnet at de hydrofobe polyimidmembraner fungerte perfekt som en barriere mellom vandig (fettsyrerik fase) og organisk (ekstraksjonsløsningsmiddel) fase. Vanngjennomstrømning ble ikke observert og fettsyrene ble på en vellykket måte ekstrahert fra den vandige til den organiske fasen.

For foreløpig undersøkelse av massetransport i membrankontaktoren, ble løsningen rik på fettsyrer tilberedt ved direkte kjemisk hydrolyse av mikroalgebiomasse. 10 g frysetørket biomasse ble suspendert i 300 ml 0,5M KOH i etanol, homogenisert (9500 rpm, Ultraturrax) og hensatt over natten med kontinuerlig omrøring ved romtemperatur. Deretter ble kolben inkubert i et vannbad ved 60°C i 30 minutter. Etter nedkjøling til romtemperatur ble 150 ml deionisert vann tilsatt. Vandig løsning tilsatt salter av fettsyrene ble deretter surgjort til pH 1 ved hjelp av en 6M HC1 løsning, for å oppnå de frie fettsyrene.

Den anvendte hydrofobe membranen var en polyimidmembran. Matrimid 5218 ble valgt på grunn av de velkjente hydrofobe egenskapene til denne polymeren. Flat plate-matrimidmembran fremstilt i 7V-metylpyrrolidinon (NMP), hadde et filtreringsareal på 41 cm<2>, en molekylvektsgrense (MWCO) på~5 kDa.

Som beskrevet tidligere, var de to væskekretsene adskilt ved den hydrofobe membranen, ved at den fettsyrerike fasen og den organiske fasen sikrulerte kontinuerlig (tannhjulspumpe), én på hver side av membranenkontaktoren. Den fettsyrerike fasen ble sirkulert ved en høyere strømningshastighet (90 L/t) enn den for den organiske fasen (20 L/t), for å unngå vanngjennomstrømning og også for å lette fukting av membranen med løsningsmidlet. Initielle volumer av fettsyrerik fase og organisk fase var henholdsvis 500 ml og 100 ml. Eksperimenter ble utført ved romtemperatur og atmosfærisk trykk. På grunn av visse begrensninger i kapasiteten til det eksperimentelle oppsettet, ble forsøk kjørt i maksimalt 22 timer. Prøver ble innsamlet periodisk frem til 22 timer. Innsamlede prøver ble metylert og analysert ved GC.

Ekstraksjonsutbytter oppnådd på dette stadiet var ca. 30-32%, dvs. ca. 30-32% av hovedfettsyrene i mikroalgebiomassen ble gjenvunnet fra emulsjonen dannet etter kjemisk hydrolyse.

Total massetransportkoeffisient, OMTC - Kaq, ble beregnet basert på variasjonen i DHA-(C22:6) konsentrasjonen i den organiske fasen i løpet av de 22 timene. Den estimerte verdien for var 16.9*IO"<7>m.s"\

Eksempel 4

Cellehøsting/diafiltrering ved anvendelse av tverrstrøms mikrofiltrering - CFMF Fermenteringsløsningen ble konsentrert fra 45-50 g/L til 180 g/L ved tverrstrøms mikrofiltrering.

CFMF-system og tubulære membraner anvendt i de foreliggende tester ble skaffet fra Orelis (Novasep, Applexion, Frankrike). Mikrofiltrering Kerasep™ keramiske membraner som ble benyttet, nemlig KERMBMM1 og KERMBMM2, hadde en grenseverdi på henholdsvis 100 nm og 200 nm, og et filtreringsareal på 0,008 m<2>(oppgitt av leverandøren).

Fersk fermenteringsLøsning med en initiell cellekonsentrasjon på ca. 45-50 g/L (basert på tørrvekt) ble kontinuerlig resirkulert til og fra karet Tl gjennom den tubulære membranen i membranfiltreringsmodulen (M2) ved hjelp av en enkeltskruepumpe, med en konstant hastighet på 5 m/s (som angitt fra leverandøren). Filtreringsfluks ble beregnet basert på permeatvekten og konsentrasjonsfaktoren basert på forskjellen mellom tørrvekt i den opprinnelige fermenteringsløsning og retentatløsningen på slutten av eksperimentet.

Forskjellige transmembrantrykk (TMP) ble sammenlignet ved bruk av membranen KERMBMM1. Filtreringsfluks oppnådd etter 30 minutters drift ved hver TMP er vist i tabell 4.

En TMP på 0,7 bar (Pinn=0,8 bar; Put=0,6 bar) ble funnet som det ideelle for dette system. Ytelser til to membraner i studien ble evaluert med hensyn på permeat fluks og endelig cellekonsentrasjon oppnådd ved drift ved samme TMP (tabell 5).

Det er tydelig at for samme cellekonsentrasjon og driftsbetingelser, ga membranen KERMBMM2 (200 nm) den beste ytelsen. En endelig cellekonsentrasjon på 180 g/L ble oppnådd.

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for å ekstrahere fettsyrer fra vandig biomasse i en membrankontaktormodul Ml,karakterisert vedat den omfatter følgende trinn: a) hydrolyse av lipidene i den vandige biomassen for å frigi frie fettsyrer; b) tilførsel av den vandige hydrolyserte biomassen inneholdende frie fettsyrer til det vandige kammeret (1) i nevnte membrankontaktormodul Ml; og c) ekstrahering av fettsyrene over en hydrofob membran (2) til det organiske kammeret (3) i nevnte membrankontaktormodul Ml inneholdende et organisk løsningsmiddel/løsningsmiddelblanding.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den vandige biomassen sirkuleres fra en biomassetank (Tl) til det vandige kammer (1) i membrankontaktormodulen Ml og tilbake til biomassetanken (Tl, det organiske løsningsmidlet/løsningsmiddelblandingen filtreres fra en produktgjenvinningstank (T2) til det organiske kammeret (3) i membrankontaktormodulen og tilbake til produktgjenvinningstanken (T2), mens de frie fettsyrene ekstraheres over den hydrofobe membranen (2).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat oppsettet er som vist i fig. 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat lipidhydrolysen er enzymatisk ved anvendelse av én eller flere lipaser.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-4,karakterisert vedat fettsyrene frigis sekvensielt, de mettede og monoumettede middels- til langkjedede fettsyrer frigis i et første stadium og de flerumettede fettsyrene frigis i et siste stadium.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat fettsyrene frigitt i det første stadium ekstraheres over membranen før neste stadium initieres.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den sekvensielle frigivelsen oppnås ved å la en første lipase virke over en lengere tidsperiode, eller ved tilsetning av en forskjellig lipase.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat de flerumettede fettsyrene utgjør minst 50%, fortrinnsvis 60%, helst 80% i forhold til vekt av de totale fettsyrene som er ekstrahert i det siste stadium.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat DHA utgjør 60%, helst 70%, og aller helst 90% av de totale fettsyrene ekstrahert i det siste stadium.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det ytterligere omfatter et forestringstrinn der fettsyrene forestres til deres alkylesterderivater i det organiske kammeret.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den vandige biomassen utsettes for proteasebehandling før lipidhydrolysen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den vandige biomassen er en fermenteringsløsning fra en oljeholdig mikroorganisme.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat den oljeholdige mikroorganismen er en heterotrof mikroalge, fortrinnsvis thraustochytrider.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte løsningsmiddel er utvalgt fra gruppen bestående av upolare løsningsmidler, fortrinnsvis heksan, cykloheksan, heptan, pentan, toluen, dikloretan, diklormetan, dietyleter, etylacetat, aceton og blandinger av disse.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding ytterligere omfatter en alkohol utvalgt fra gruppen bestående av lavere alkylalkoholer, fortrinnsvis metanol eller etanol.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding ytterligere omfatter en katalysator i form av en syre, en base, et enzym eller blandinger av disse.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en tverrstrøms filtreringsmodul M2 for awanning av biomassen og/eller diafiltrering.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17karakterisert vedat nevnte tverrstrøms filtreringsmodul inneholder en uorganisk membran.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat nevnte uorganiske tubulære membran har en cut-off i mikro- (0,1-10 um) eller ultrafiltreirngsområde (IO<3>-IO<6>Da).

20. Integrert fremgangsmåte for ekstrahering av fettsyrer fra vandig biomasse,karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: a) awanning og/eller diafiltrering av nevnte vandige biomasse i en tverrstrøms filtreringsmodul M2, generering av et retentat (5) for videre prosessering i en membrankontaktormodul Ml; b) hydrolyse av lipidene i retentatet (5) for å frigi frie fettsyrer; c) tilføring av det hydrolyserte retentat inneholdende de frie fettsyrene til det vandige kammeret (1) i nevnte membrankontaktormodul Ml; og d) ekstrahering av fettsyrene over en hydrofob membran (2) til det organiske kammeret i nevnte membrankontaktormodul Ml inneholdende et organisk løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat den vandige biomassen først sirkuleres fra en biomassetank Tl gjennom tverrstrøms-membranmodulen M2, der vann og lavmolekylære forbindelser trenger gjennom membranen (4) og genererer et avfallspermeat (6), hvoretter retentatet (5) sirkuleres til det vandige kammeret (1) i membrankontaktormodulen Ml, ekstrahering av fettsyrene til det organiske løsningsmiddel/løsningsmiddelblanding som sirkulerer i det organiske kammeret (3) i membrankontaktoren og akkumulerer i en produktgjenvinningstank T2.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat oppsettet er som vist i figur 2.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat fremgangsmåten driftes som en batch-prosess eller som en semi-kontinuerlig prosess.

24. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter løsningsmiddelgjen-vinningstrinn, fortrinnsvis ved organisk løsningsnanofiltrering (OSN).

25. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter rensetrinn, fortrinnsvis ved høyytelses motstrømskromatografi (HPCCC).