MXPA01011279A - Tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas que se unene a los marcadores de superficie, de celulas b. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas los cuales se une a los marcadores de la superficie de las celulas B, tal como CD19 o CD20.

Description

TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES CON ANTAGONISTAS QUE SE UNEN A LOS MARCADORES DE SUPERFICIE DE CÉLULAS B Campo de la Invención La presente invención se refiere a un tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas los cuales se unen a marcadores de la superficie de las células B, tales como CD19 o CD20.

Antecedentes de la Invención Los linfocitos son uno de muchos tipos de glóbulos blancos producidos en la médula ósea durante el proceso de hematopoyesis. Existen dos poblaciones principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) . Los linfocitos de interés particular en la presente son las células B. Las células B maduran dentro de la médula ósea y dejan la médula expresando un anticuerpo que se une a antígenos en su superficie celular. Cuando una célula B naive o natural primero encuentra el antígeno para el cual es específico su anticuerpo unido a la membrana, la célula comienza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en las células B con memoria y células efectoras Ref : 133811 • < -c*-*?»» j¡¿> ?~~?*?ÜL *A. ~iA J??+.' a¿l*l I • llamadas "células plasmáticas". Las células B con memoria tienen un periodo de vida más largo y continúan expresando el anticuerpo unido a la membrana con la misma especificidad como la célula madre original. Las células 5 plasmáticas no producen el anticuerpo unido a la membrana pero en cambio producen el anticuerpo en la forma que puede ser secretado. Los anticuerpos secretados son la molécula efectora principal de la inmunidad humoral . El antígeno CD20 (también llamado antígeno de 10 diferenciación restringido por los linfocitos B de humano, Bp35) es una proteína transmembrana, hidrofóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada en los linfocitos pre-B y B maduros (Valentine y colaboradores , J. Bi ol . Chem . 26 ( 19) : 11282-11287 (1989); y Einfeld y 15 colaboradores EMBO J. 7 (3) : 711-717 (1988)). El antígeno también es expresado en más de 90% de linfomas no Hodgkianos de células B (NHL) (Anderson y colaboradores , Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células germinal hematopoyéticas, células pro-B, células 20 plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder y colaboradores , J. Immunol . 135 (2) : 973-979 (1985)). El CD20 regula un (algunos) primero (s) paso(s) en el proceso de activación para la iniciación y diferenciación del ciclo celular (Tedder y colaboradores , supra ) y posiblemente i . -Li Mftl^ittllMiMtaÉIMii^MUlM^ funciona como un canal de iones de calcio (Tedder y colaboradores, J. Cell . Biochem . 14D:195 (1990)). Dada la expresión de CD20 en linfomas de células B, este antígeno puede servir como un candidato para la "elección de objetivos" de estos linfomas. En esencia, esta elección de objetivos puede ser generalizada como sigue: los anticuerpos específicos para el antígeno de la superficie CD20 de las células B son administrados a un paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen específicamente al antígeno CD20 de las células B (aparentemente) tanto normales como malignas; el anticuerpo unido al antígeno de la superficie CD20 puede conducir a la destrucción y supresión de las células B neoplásticas.

Adicionalmente, los agentes químicos o etiquetas radioactivas que tienen el potencial para destruir el tumor pueden ser conjugadas al anticuerpo anti-CD20 tal que el agente es "suministrado" específicamente a las células B neoplásicas. Sin tener en cuenta el planteamiento, un objetivo primario es destruir el tumor; el planteamiento específico se puede determinar por el anticuerpo anti-CD20 particular el cual se utiliza y, de esta manera, los planteamientos disponibles para fijar como objetivo el antígeno CD20 pueden variar considerablemente. El CD19 es otro antígeno que es expresado en la superficie de las células del linaje B. Al igual que el lAüfcli CD20, el CD19 se encuentra en las células por toda la diferenciación del linaje de la etapa de células germinales hasta un punto justo antes de la diferenciación terminal dentro de las células plasmáticas (Nadler, L. Lymphocyte Typing II 2:3-37 y Appendix, Renling y colaboradores eds. (1986) por Springer Verlag). Sin embargo, distinto al CD20, el anticuerpo que se une al CD19 causa la internalización del antígeno CD19. El antígeno CD19 es identificado por el anticuerpo HD237-CD19 (también llamado el anticuerpo "B4") (Kiesel y colaboradores , Leukemia Research II, 12:1119 (1987), entre otros. El antígeno CD19 está presente en 4-8% de las células mononucleares de la sangre periférica y en más del 90% de las células B aisladas de la sangre periférica, el bazo, el nodo linfático o la amígdala. El CD19 no es detectado en las células T, monocitos o granulocitos de la sangre periférica. Virtualmente todas las leucemias linfoblásticas agudas sin células T (ALL) , leucemias linfocíticas crónicas de células B (CLL) y linfomas de células B expresan el CD19 detectable por el anticuerpo B4 (Nadler y colaboradores J. Immunol . 131:244 (1983); y Nádler y colaboradores, en progress in Hema tol ogy Vol. XII páginas 187-206. Brown, E. ed. (1981) por Gruñe & Stratton, Inc . ) . Se han identificado anticuerpos adicionales los cuales reconocen los antígenos específicos de la etapa de diferenciación expresados por las células del linaje de células B. Entre estos están el anticuerpo B2 dirigido contra el antígeno CD21; el anticuerpo B3 dirigido contra el antígeno CD22; y el anticuerpo J5 dirigido contra el antígeno CD10 (también llamado CALLA) . Ver la patente norteamericana No. 5,595,721 expedida el 21 de Enero de 1997 (Kaminski y colaboradores) . El anticuerpo rituximab (RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal de murino/humano quimérico, diseñado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20. El Rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la patente norteamericana No. 5,736,137 expedida el 7 de Abril de 1998 (Anderson y colaboradores) . El RITUXAN® es indicado para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkiano de células B, CD20 positivo, de grado bajo o folicular, _con_, El mecanismo in vi tro de estudios de acción ha demostrado que el RITUXAN® se une al complemento de humano y produce la lisis de líneas células B linfoides a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Reff y colaboradores , Blood 83 (2) : 35-445 (1994). Adicionalmente, este tiene actividad significante en ensayos para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . Más recientemente, se ha mostrado que el RITUXAN® tiene efectos anti-proliferativos en ensayos de incorporación de timidina tritiada e induce la apoptosis directamente, mientras que otros anticuerpos anti-CD19 y CD20 no lo hacen (Maloney y colaboradores, Blood 88 (10) :637a (1996)). También se ha observado experimentalmente la sinergia entre el RITUXAN® y las quimioterapias y toxinas. En particular, el RITUXAN® sensibiliza las líneas de células del linfoma de células B de humano, resistentes al fármaco a los efectos citotóxicos de la doxorrubina, CDDP, VP-16, toxina de difteria y ricina (Demidem y colaboradores, Cáncer Chemotherapy & Radiopha rma ceut icals 12 (3) : 177-186 (1997)). Los estudios preclínicos in vivo han mostrado que el RITUXAN® produce la depleción de las células B de la sangre periférica, nodos linfáticos y médula ósea de monos cynomolgus, presumiblemente a través de los procesos mediados por el complemento y las células (Reff y colaboradores , Blood 83(2) :435-445 (1994)).

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona, en un primer aspecto, un método para tratar una enfermedad autoinmune en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista el cual se une a un marcador de la superficie de células B. En un aspecto adicional, la presente invención pertenece a un artículo de elaboración que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un antagonista el cual se une al marcador de la superficie de las células B, y además comprende un suplemento del paquete que instruye al usuario de la composición para tratar a un paciente que tiene o está predispuesto a una enfermedad autoinmune.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I . Definiciones Un "marcador de la superficie de las células B" en la presente es un antígeno expresado en la superficie de una célula B el cual puede ser fijado como objetivo con un antagonista el cual se une al mismo. Los marcadores de la superficie de las células B ejemplares incluyen los marcadores de la superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86. El marcador de la superficie de las células B de particular interés es expresado preferentemente en las células B comparado con los otros tejidos diferentes de células B de un mamífero y puede ser expresado en tanto las células B precursoras como células B maduras. En una modalidad, el marcador es uno, similar a CD20 o CD19, el cual es encuentra en las células B por toda la diferenciación del linaje de la etapa de células germinales hasta un punto justo antes de la diferenciación terminal en las células plasmáticas. Los marcadores de la superficie de las células B preferidos en la presente son CD19 y CD20. El antígeno "CD20" es una fosfoproteína no glicosilada ~35 kDa encontrada en la superficie de más de 90% de células B de la sangre periférica u órganos linfoides. El CD20 es expresado durante las primeras etapas del desarrollo de células pre-B y permanece hasta la diferenciación de las células plasmáticas. El CD20 está presente en tanto células B normales así como también células B malignas. Otros nombres para el CD20 en la bibliografía incluyen "antígeno restringido de linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 se describe en Clark y colaboradores , PNAS (EUA) 82:1766 (1985), por ejemplo. El antígeno "CD19" se refiere a un antígeno ~90kDa identificado, por ejemplo, por el anticuerpo HD237-CD19 o B4 (Kiesel y colaboradores , Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)). Al igual que el CD20, el CD19 se encuentra en las células por toda la diferenciación del linaje desde la etapa de las células germinales hasta un punto justo antes de la diferenciación terminal en las células plasmáticas. La unión de un antagonista al CD19 puede causar la internalización del antígeno CD19. Una "enfermedad autoinmune" en la presente es una enfermedad o trastorno no maligno que surge de y se dirige contra tejidos propios del individuo. Las enfermedades autoinmunes en la presente excluyen específicamente las enfermedades o condiciones malignas o cancerosas, especialmente excluyendo el linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia de células pilosas y leucemia mieloblástica crónica. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no están limitados a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel que incluye psoriasis y dermatitis (por ejemplo dermatitis atópica) ; esclerodermia sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (tal como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) ; síndrome de angustia respiratoria (que incluye el síndrome de angustia respiratoria de adulto; ARDS) ; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE) ; diabetes mellitus (por ejemplo diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitus dependiente de la insulina) ; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T típicamente encontrados en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos; desorden inflamatorio del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de lesión múltiple de órganos; anemia hemolítica (que incluye, pero no se limita a crioglobulinemia o anemia positiva de Coombs) ; miastenia grave; enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal anti-glomerular; síndrome anti-fosfolípidos; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico Lambert-Eaton; bulas o ampollas penfigoides; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de stiff-man; enfermedad Behcet; arteristis de células gigantes; nefritis compleja inmune; nefropatía de IgA; polineuropatías de IgM; púrpura tromobocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenía autoinmune, etcétera. Un "antagonista" es una molécula la cual, con la unión a un marcador de la superficie de las células B, destruye o produce la depleción de las células B en un mamífero y/o interfiere con una o más funciones de las células B, por ejemplo, al reducir o prevenir una respuesta humoral producida por la célula B. El antagonista es capaz preferiblemente de producir la depleción de las células B ( es decir reduce los niveles de células B circulantes) en un mamífero tratado con el mismo. Tal depleción se puede lograr por medio de diversos mecanismos tales como citotoxicidad mediada por las células, dependiente de los anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , inhibición de la proliferación de células B y/o inducción de la muerte de las células B (por ejemplo, por medio de la apoptosis) . Los antagonistas incluidos dentro del alcance de la presente invención incluyen anticuerpos, péptidos de secuencia sintética o nativa y pequeños antagonistas molecular los cuales se unen al marcador de las células B, opcionalmente conjugados con o fusionados a un agente citotóxico. El agonista preferido comprende un anticuerpo. La "citotoxicidad mediada por las células, dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por las células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células Exterminadoras Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y subsecuentemente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc?RIII únicamente, mientras que los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y FC?RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetche y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad de la ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vi tro, tal como aquel descrito en la patente norteamericana No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y células Exterminadoras Naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser valorada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes y colaboradores , PNAS (EUA) 95:652-656 (1998). Las "células efectoras de humano" son leucocitos los cuales expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos el Fc?RIII y llevan a cabo la función efectora de la ADCC. Ejemplos de leucocitos de humano los cuales median la ADCC incluye las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), las células exterminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferidas las células PBMCs y NK. Los términos "receptor Fc" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR de humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno de los cuales se une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII inclusive variantes alélicas y alternativamente formas 5 unidas de estos receptores. Los receptores Fc?RII incluyen Fc?RIIA (un "receptor de activación") y Fc?RIIB ("un receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. El receptor de 10 activación Fc?RIIA contiene una configuración de activación en base a tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc?RIIB contiene una configuración de inhibición en base a tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico. (ver 15 Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcRs son revisaron en Ravetche y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y colaboradores, Immunomethods 4:25- 34 (1994); y de Haas y colaboradores, J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, inclusive aquellos que serán 20 identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable por la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer y colaboradores , J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim y 25 colaboradores, J. Immunol . 24:249 (1994)).

SÜí yilyt.?.1 .^^^MjSyy^y±yj yyy^^^ La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para producir la lisis de un objetivo en la presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inició por la unión del primer complemento del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) hecho complejo con un antígeno cognado. Para valorar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano- Santoro y colaboradores, J. Immunol . Methods 202:163 (1996) . Los antagonistas "inhibidores del crecimiento" son aquellos los cuales previenen o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se une el antagonista. Por ejemplo, el antagonista puede prevenir o reducir la proliferación de las células B in vitro y/o in vivo. Los antagonistas los cuales "inducen la apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada, por ejemplo, de una célula B, como se determinó por los ensayos de apoptosis normales, tales como la unión de anexina V, fragmentación del ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplasmático, fragmentación celular, y/o formación de vesículas de la membrana (llamados cuerpos apoptóticos) .

El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, los anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que éstos exhiban la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente que comprenden la región de unión al antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena individual; y anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpos. Los "anticuerpos nativos" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por una unión de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadena, regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está 5 alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una zona interfacial entre los dominios variables de cadena 10 ligera y de cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo 15 particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no es distribuida uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadenas ligeras y de cadenas pesadas. 20 Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada una comprende cuatro FRs, adoptando grandemente una configuración de capas-ß, conectadas por tres regiones 25 hipervariables, las cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de capas-ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas juntas en proximidad estrecha por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígenos de los anticuerpos (ver Kabat y colaboradores , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión de antígenos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión de antígenos individual, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión de antígenos y es aun capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígenos y de unión de antígenos completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en asociación no covalente, estrecha. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antígenos en la superficie del dímero VH-VL.. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren la especificidad de unión de antígenos al anticuerpo. Sin embargo, aun un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difiere de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la terminación carboxilo del dominio de cadena pesada CH1 que incluye una o más cisteínas de la región de rótula del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para el Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes lleva (n) al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen cisteínas de rótula entre éstos. También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a diferentes clases de anticuerpos son llamados a, ß, e, ? y µ, respectivamente. Son bien conocidas las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas. Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena individual" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptidos individual. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL los cuales hacen posible que el scFv forme la estructura deseada para la unión de antígenos. Para una revisión del scFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, ^ ^^^ é^i ^M MíJ?^?^^t¿y&!!!yyi^L^,.^^.-...L^i^L.ai ^^ vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión de antígenos, los fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareo entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, patente europea No. 404,097; patente WO 93/11161; y Hollinger y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 90:6444-6448 (1993) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) las cuales incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que éstos son sintetizados por el cultivo de hibridomas, no contanimados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya que es obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se debe construir como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan de acuerdo con la presente invención se pueden hacer por el método de hibridomas descrito primero por Kohler y colaboradores , Na ture, 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las colecciones de anticuerpos de bacteriófagos utilizando las técnicas descritas en Clackson y colaboradores , Na ture, 352: 624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particulares, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con u homologa a las secuencias correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de estos anticuerpos, siempre que éstos exhiban la actividad biológica deseada (patente norteamericana No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen los anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión de antígenos de dominios variables derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, tal como un mono babuino, rhesus o cynomolgus) y secuencias de regiones constantes de humano (patente norteamericana No. 5,693,780) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una jfaiiOA»- . lr . á: íá^i?íL¡ái?¿ú íetÁM É .-r. región hipervariable del receptor son remplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina de humano son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en un anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para depurar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver Jones y colaboradores , Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Na ture 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992) .

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables por la unión de antígenos. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación complementaria" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y colaboradores , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mod. Biol . 196:901-917 (1987)). Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominios variables diferentes de los residuos de regiones hipervariables definidos en la presente. Un antagonista "el cual se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, un marcador de la superficie de las células B, es uno capaz de unirse a ese antígeno con suficiente afinidad y/o avidez tal que el antagonista es útil como un agente terapéutico para fijar como objetivo una célula que expresa el antígeno. Los ejemplos de anticuerpos los cuales se unen al antígeno CD20 incluyen: "C2B8" el cual ahora es llamado "rituximab" ("RITUXAN®") (patente norteamericana No. 5,736,137, incorporada expresamente en la presente por referencia) ; el anticuerpo de murino 2B8 etiquetado con itrio- [90] designado "Y2B8" (patente norteamericana No. 5,736,137, incorporada expresamente en la presente por referencia) ; el IgG2a de murino "Bl" etiquetado opcionalmente con 131I para generar el "131I-B1" (BEXXARMR) (patente norteamericana No. 5,595,721, incorporada expresamente por referencia en la presente) ; el anticuerpo monoclonal de murino "1F5" (Press y colaboradores, Blood 69(2) : 584-591 (1987)); el anticuerpo "quimérico 2H7" (patente norteamericana No. 5,677,180, incorporado expresamente en la presente por referencia) ; y los anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de la International Leukocyte Typing Workshop (Valentine y colaboradores, In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., página 440, Oxford University Press (1987) ) . Ejemplos de anticuerpos que se unen al antígeno CD19 incluyen los anticuerpos anti-CD19 en Hekman y colaboradores, Cáncer Immunol . Immunother. 32:364-372 (1991) y Vlasveld y colaboradores , Cáncer Inmuno 1 . Immunother, 40:37-47 (1995); y el anticuerpo B4 en Kiesel y colaboradores, Leukemia Research II, 12:1119 (1987). Los términos "rituximab" o "RITUXAN®" en la presente se refieren al anticuerpo monoclonal de murino/humano quimérico, genéticamente diseñado dirigido contra el antígeno CD20 y designado "C2B8" en la patente norteamericana No. 5,736,137, incorporado expresamente en la presente por referencia. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgGi kappa que contiene secuencias de región variable de cadena ligera y cadena pesada de murino y secuencias de región constante de humano. El rituximab tiene una afinidad de unión para el antígeno CD20 de aproximadamente 8.0 nM. Un antagonista "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el antagonista, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las modalidades preferidas, el antagonista será purificado (1) a más de 95% en peso del antagonista determinado por el método de Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a una homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul Coomassie o, preferentemente, colorante de plata. El antagonista aislado incluye el antagonista in si tu dentro de las células recombinantes puesto que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del antagonista. Ordinariamente, sin embargo, el antagonista aislado será preparado mediante al menos un paso de purificación. El "mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, inclusive humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etcétera. Preferiblemente, el mamífero es humano. El "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad del tratamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad o trastorno así como también aquellos en los cuales la enfermedad o trastorno se debe prevenir. Por lo tanto, el mamífero puede haber sido diagnosticado como que tiene la enfermedad o trastorno o puede estar predispuesto o susceptible a la enfermedad.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se' refiere a una cantidad del antagonista la cual es efectiva para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad autoinmune en cuestión. 5 El término "agente inmunosupresor" utilizado en la presente para la terapia adjunta se refiere a sustancias que actúan para suprimir u ocultar el sistema inmune del mamífero que es tratado en la presente. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citosina, sub- 10 regulan o suprimen la expresión de auto-antígenos, u ocultan los antígenos MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (ver la patente norteamericana No. 4,665,077, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia) ; 15 azatioprina; ciclofosfamida; bromocriptina, danazol; dapsona; glutaraldehído (el cual oculta el antígeno MHC, como se describe en la patente norteamericana No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteroides tales como 20 glucocorticosteroides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona y dexametasona; citosina o antagonistas del receptor de citosina que incluyen anticuerpos anti- interferón-?, -ß, o -a, anticuerpos del factor-a de necrosis anti-tumorígena, anticuerpos del factor-ß de necrosis anti- 25 tumorígena, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos del receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, que incluyen los anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocitos heteróloga; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión de LFA-3 (patente WO 90/08187 publicada el 7/26/90) ; estreptocinasa; TGF-ß; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedante; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina, receptor de células T (Cohén y colaboradores, patente norteamericana No. 5,114,721); fragmentos del receptor de células T (Offner y colaboradores, Science, 251:430-432 (1991); patente WO 90/11294; Ianeway, Na ture, 341:482 (1989); y la patente WO 91/01133); y anticuerpos del receptor de células T (EP 340,109) tal como T10B9. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de células. Se propone que el término incluya los isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos. íH f íy. iAkmtt yJi^ Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CITOXANMR) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicma, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, -•w*3 zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; abastecedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona, glicosido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2', 2''- triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE , Rhóne-Poulenc Rorer, Anthony, Francia) ; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona, teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitrina (DMFO) ; ácido retinoico, esperamicinas, capecitabina, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También están incluidos en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos que incluyen por ejemplo tamoxifen, raloxifen, 4 (5) -imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelin; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. El término "citosina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular las cuales actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas están las hormonas del crecimiento tales como hormona del crecimiento de humano, hormona del crecimiento de humano de N-metionilo y hormona del crecimiento de bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona de estimulación de folículos (FSH) , hormona de estimulación de la tiroides (TSH) , y hormona de luteinización (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogen placental; factor-a y -ß de la necrosis tumoral; sustancia inhibitoria mulleriano; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina, trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tal como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TFG-a, y TGF-ß; factor-I y -II de crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-a, -ß, y -?; factores de estimulación de colonias (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (lis) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y lingando kit (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencias nativas. El término "profármaco" como se utiliza en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para las células tumorales comparado con el fármaco de origen y es capaz de ser enzimáticamente activado o convertido en la forma de origen más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y colaboradores, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y colaboradores (ed. ) , páginas 247-267 , Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5- fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina los cuales se pueden convertir en el fármaco libre, citotóxico, más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar dentro de una forma de profármaco para el uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente . Un "liposoma" es un vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante la cual es útil para el suministro de un fármaco (tal como los antagonistas descritos en la presente y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma son comúnmente ordenados en una formación de dos capas, similar al ordenamiento de lípidos de las membranas biológicas. El término "suplemento del paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones comúnmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes al uso de estos productos terapéuticos .

II . Producción de Antagonistas Los métodos y los artículos de elaboración de la presente invención utilizan, o incorporan, un antagonista el cual se une a un marcador de la superficie de las células B. Por consiguiente, los métodos para generar tales antagonistas serán descritos en la presente. El marcador de la superficie de las células B que se utiliza para la producción de, o selección de, antagonista (s) puede ser, por ejemplo, una forma soluble del antígeno o una porción del mismo, que contiene el epítope deseado. Alternativamente, o adicionalmente, las células que expresan el marcador de la superficie de las células B en su superficie de la célula se pueden utilizar para generar, o seleccionar, el (los) antagonista (s) . Otras formas del marcador de la superficie de las células B útiles para generar los antagonistas serán aparente para aquellas personas expertas en la técnica. Preferiblemente, el marcador de la superficie de las células B es el antígeno CD19 o CD20. Mientras que el antagonista preferido es un anticuerpo, los antagonistas diferentes de los anticuerpos están contemplados en la presente. Por ejemplo, el antagonista puede comprender un antagonista de molécula pequeña opcionalmente fusionado a, o conjugado con, un agente citotóxico (tal como aquellos descritos en la - Kinfjrf Ü?i??JL** Áí Uf ~ - ' ***•* presente) . La colecciones de moléculas pequeñas se pueden proteger contra el marcador de la superficie de las células B de interés en la presente, a fin de identificar una molécula pequeña la cual se une a ese antígeno. La molécula pequeña se puede seleccionar además por sus propiedades antagonísticas y/o se puede conjugar con un agente citotóxico. El antagonista también puede ser un péptido generado por el diseño racional o por la exhibición de bacteriófagos (ver, por ejemplo, la patente WO98/35036 publicada el 13 de Agosto de 1998) . En una modalidad, la molécula de la selección puede ser un análogo "imitador de la CDR" o del anticuerpo, diseñado en base a las CDRs de un anticuerpo. Mientras que tales péptidos pueden ser antagonistas por sí mismos, el péptido se puede fusionar opcionalmente a un agente citotóxico para adicionar o aumentar las propiedades antagonísticas del péptido. A continuación se presenta una descripción para las técnicas ejemplares para la producción de los antagonistas de anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales son producidos preferiblemente en animales por múltiples inyecciones ^^^¡^^¿^¡¿ifc»^^ subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies a ser inmunizadas, por ejemplo, hemocianina de lapa de forma de ojo de cerradura, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N- hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, donde R y R1 son diferentes grupos alquilo. Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 µg a 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección de la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después, los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante la inyección subcutánea en sitios múltiples. De siete a 14 días después, los animales son sangrados y el suero se somete a ensayo para el título del anticuerpo. Los animales son reforzados hasta la meseta del título. Preferiblemente, el animal es reforzado con el •k conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden hacer en un cultivo de células recombinantes como la proteína funciona. 5 También, los agentes de agregación tales como alumbre se utilizan adecuadamente para aumentar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una 0 población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador 5 "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer utilizando el método de hibridomas descrito primero por Kohler y colaboradores, Na ture, 256:495 (1975), 0 o se pueden hacer por los métodos de ADN recombinante (patente norteamericana No. 4,816,567). En el método de hibridomas, un ratón u otro animal hospedante apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe anteriormente para producir 5 linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos son fusionados enseguida con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma o híbrida (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células hibridoma o híbridas de esta manera preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirán típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes de la HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel, estable de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estos, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas de células de mieloma de humano y heteromieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York 1987)). El medio de cultivo en el cual las células hibridoma son cultivadas se somete a un ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vi tro, tal como el radioinmunoensayo (RÍA) o el ensayo de sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada por el análisis Scatchard de Munson y colaboradores, Anal . Biochem, 107:220 (1980) .

Después de que se identifica que las células hibridoma producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar al limitar los procedimientos de dilución y el crecimiento por métodos normales (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados del medio de cultivo, el fluido de ascitis, o suero mediante los procedimientos de purificación de inmunoglobulina, convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía por afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se ordena en secuencias utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de murino) . Las células hibridoma sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar dentro de los vectores de expresión, los cuales luego son transfectados en células hospedantes tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otra manera la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedantes recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y colaboradores , Curr. Opinión in Immunol, 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992). En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las colecciones de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty y colaboradores , Na ture, 348:552-554 (1990). Clackson y colaboradores, Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describe el aislamiento de anticuerpos de murino y de humano, respectivamente, utilizando colecciones de fagos. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos de humano de alta afinidad (rango de nM) al entremezclar las cadenas (Marks y colaboradores, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como también la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouse y ^j^^^g|?^ Ajli^t^ima^Í^?^aaaifefe. M átA. ^i-J, ... colaboradores , Nuc. Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadena pesada y ligera de humano en lugar de las secuencias de murino homologas (patente norteamericana No. 4,816,567; Morrison y colaboradores , Proc. Na ti Acad. Sci . EUA, 81:6851 (1984)), o por la unión covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido diferente de inmunoglobulina. Típicamente, estos polipéptidos diferentes de inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o éstos son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente, quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad por un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados Los métodos para humanizar los anticuerpos no humanos han sido descritos en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en éste de una fuente la cual no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son frecuentemente referidos como residuos de "importación", los cuales son tomados típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo del método de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores, Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores , Science 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo de humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente norteamericana No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable de humano, intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algún residuo de región hipervariable y posiblemente algún residuo de FR es sustituido por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor.

La selección de los dominios variables de humano, tanto ligeros como pesados, para ser utilizados en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método comúnmente llamado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se protege contra la colección completa de secuencias de dominio variable de humano conocidas. La secuencia de humano la cual es más cercana a aquella del roedor entonces es aceptada como la región de estructura de humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, J. Immunol , 151:2296 (1993); Chothia y colaboradores, J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia consensual de todos los anticuerpos de humano de un subgrupo particular de cadenas ligeras y pesadas. La misma estructura puede ser utilizada para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 89:4285 (1992); Presta y colaboradores, J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Además, es importante que los anticuerpos sean humanizados con la retención de la alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados, conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina 5 tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellas personas con experiencia en la técnica. Están disponibles programas de computadora los cuales ilustran y exhiben las probables estructuras conformacionales en tres dimensiones de las secuencias de 10 inmunoglobulina candidatas, seleccionadas. La inspección de estas representaciones visuales permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la 15 inmunoglobulina candidata para unir su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar del receptor y las secuencias importantes de modo que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el (los) antígeno (s) objetivo. En 20 general, los residuos de región hipervariable están involucrados directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno. 25 S$%f ' *! ?- r, .ni yr Mürn ?£i .A.it"? (iv) Anticuerpos de Humano Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos de humano. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, 5 ratones) que son capaces, con la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos de humano en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo 0 (JH) en ratones mutantes quiméricos y de líneas germinales da por resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del ordenamiento de genes de inmunoglobulina de líneas germinales de humano en tales ratones mutantes de líneas germinales dará por 5 resultado la producción de anticuerpos de humano en la prueba del antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y colaboradores , Proc. Na ti . Acad. Sci , EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits y colaboradores , Na ture, 362:255-258 (1993); Bruggermann y colaboradores, Year in Immuno, 7:33 (1993); y 0 las patentes norteamericanas Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de representación visual de bacteriófagos (McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-553 (1990)) se puede utilizar para producir 5 anticuerpos de humano y fragmentos de anticuerpos in vi tro, de repertorios de genes de dominios variables (V) de inmunoglobulina provenientes de donadores inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de los anticuerpos se clonaron en la estructura en ya sea un gen de proteína de capa mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhibidos como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de bacteriófago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena individual del genoma del bacteriófago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo también dan por resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. De esta manera, el bacteriófago imita alguna de las propiedades de la célula B. La representación visual del bacteriófago se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar diversas fuentes de segmentos de genes V para la representación visual del bacteriófago. Clackson y colaboradores, Na ture, 352:624-628 (1991) aisló un ordenamiento variado de anticuerpos anti-oxazolona de una colección combinatoria, aleatoria, pequeña de los genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de los genes V de donadores ^ ggÉ ¡¡£ jtjjaa* jip¿ ?U*Lüi¿SÉfer^lfefarfát-^^.^-rf <^»¿¿6a!»ti£ _j» JL í ¡ humanos, inmunizados y los anticuerpos para un ordenamiento variado de antígenos (inclusive auto-antígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks y colaboradores, J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith y colaboradores, EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, también, las patentes norteamericanas Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Los anticuerpos de humano también pueden ser generados por las células B activadas in vi tro (ver las patentes norteamericanas Nos. 5,567,610 y 5,229,275). (v) Fragmentos de anticuerpos Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y colaboradores , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y colaboradores, Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por las células hospedantes, recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las colecciones de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y se pueden « áii, i ^-i . f T.-. rr-[iitffir?if •--*-•*— ™^**««- ± . *?* .«*~» * ,¿¿^.¿.4^ acoplar químicamente para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter y colaboradores, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con el otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de un cultivo de células hospedantes, recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de la selección es un fragmento Fv de cadena individual (scFv) . Ver la patente WO 93/16185; patente norteamericana No 5,571,894; y la patente norteamericana No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente norteamericana No. 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopes diferentes del marcador de la superficie de las células B. Otros de estos anticuerpos pueden unirse a un primer marcador de las células B y además unirse a un segundo marcador de la superficie de las células B. Alternativamente, un brazo de unión del marcador de anti-células B se puede combinar con un brazo el cual se une a una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula receptora de las células B (por ejemplo CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (Fc?R) , tal como Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula B. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar los agentes citotóxicos a la célula B. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión del marcador de las células B y un brazo el cual une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloide de "vinca", cadena de ricina A, metotrexato o el isótopo radioactivo hapteno) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos F(ab')2) . Los métodos para elaborar los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basan en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y colaboradores, Na ture, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual es hecha usualmente mediante los pasos de cromatografía de afinidad, es preferiblemente difícil de manejar, y los rendimientos del producto son bajos. Los procedimientos similares se describen en la patente WO 93/08829, y en Traunecker y colaboradores, EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un planteamiento diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) son fusionados a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la rótula, regiones CH2, y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y son co-transfectados en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las modalidades cuando fciitA<Aj^^i*Í-Íi.&íiÍ?lM»AiitifaL«a«fcLa^JL..^^. ----A .i, í. Í?Í?Í..?.. i^?- y^i ímt<i.¿>~ las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales da por resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son de importancia particular. En una modalidad preferida de este planteamiento, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmonoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este planteamiento es descrito en la patente WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh y colaboradores , Methods in Enzymology, 121:210 (1986) De acuerdo con otro planteamiento descrito en la patente norteamericana No. 5,731,168, la zona interfacial entre un par de moléculas de anticuerpos se pueden diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales son recuperados del cultivo de células recombinantes. La zona interfacial preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la zona interfacial de la primera molécula del anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grandes son secretadas en la zona interfacial de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con unas más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a la avidina, el otro a la biotina. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a las células no deseadas (patente norteamericana No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección de VIH (patente WO 91/00360, patente WO 92/200373 y patente europea No. 03089) . Los anticuerpos heterocon ugados se pueden hacer utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente norteamericana No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de los fragmentos de anticuerpos también han sido descritas en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando un enlace químico. Brennan y colaboradores , Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de complejo de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces son convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB entonces es reconvertido en el Fab' -tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli , los cuales se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente de E. coli y fue sujetado al acoplamiento químico dirigido in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico de esta manera formado fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T de humano normales, así como también de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos de humano contra objetivos de tumores de pecho de humano . También se han descrito diversas técnicas para hacer y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando una cremallera o "zipper" de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera o "zipper" de leucina de proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante la fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de rótula para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer los fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador el cual es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando debido a eso dos sitios de unión de antígenos. También se ha reportado otra estrategia para hacer los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de cadena individual Fv (sFv) . Ver Gruber y colaboradores , J. Immunol , 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tutt y colaboradores, J. Immunol . 147: 60 (1991).

III . Conjugados y Otras Modificaciones del Antagonista El antagonista utilizado en los métodos o incluido en los artículos de preparación en la presente es conjugado opcionalmente a un agente citotóxico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados de antagonista-agente citotóxico ha sido descritos anteriormente. Los conjugados de un antagonista y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como un caliqueamicina, un maitansina (patente norteamericana No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 también están contemplados en la presente. En una modalidad de la invención, el antagonista es conjugado a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de antagonista) . La maitansina puede ser convertida, por ejemplo, a May-SS-Me que puede ser reducida a May-SH3 y hecha reaccionar con el antagonista modificado (Cari y colaboradores, Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un conjugado de maitansinoide-antagonista . Alternativamente, el antagonista es conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de los antibióticos son capaces de producir rupturas del ADN de doble cadena en concentraciones sub- picomolares. Los análogos estructurales de caliqueamicina los cuales se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, ?i1, a-21, a.31, N-acetil-?i1, PSAG y ?1! (Hinman y colaboradores , Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode y colaboradores, Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden ser utilizadas incluyen una cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, patente WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. La presente invención además contempla un antagonista conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como una desoxirribonucleasa; DNasa) . Una variedad de isótopos radioactivos son disponibles para la producción de antagonistas ^-**?**&&ti¡B** maltauii» radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re166, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Los conjugados del antagonista y el agente citotóxico se pueden hacer utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCL de dimetil adipimidato) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo, aldehidos (tales como glutareldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2, 6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro- 2, -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describe en Vitetta y colaboradores , Science 238:1098 (1987). El ácido 1- isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar por la conjunción del radionucleótido al antagonista. Ver patente WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador divisible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari y colaboradores, Cáncer Research 52: 127-131 (1992)). Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el antagonista y el agente citotóxico se puede hacer, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o la síntesis de péptidos. En aun otra modalidad, el antagonista puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la pre-fijación de objetivos tumorales en donde el conjugado de antagonista-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción de un conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de aclaramiento y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) el cual es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . Los antagonistas de la presente invención también se pueden conjugar con una enzima de activación de profármacos la cual convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver la patente WO81/01145) a un fármaco anti-cancerígeno activo. Ver, por ejemplo, la patente WO88/07378 y la patente norteamericana No. 4,975,278. El componente enzimático de tales conjugados incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de una manera tal para convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citisina desaminasa útil para convertir la 5- fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cancerígeno, 5- fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen sustituyentes de aminoácido D; enzimas se escisión de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; ß- lactamasa útil para convertir los fármacos derivados con ß- lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir los fármacos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzy as", se pueden utilizar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos, libres (ver, por ejemplo, Massey, Na ture 328:457- 458 (1987)). Los conjugados de antagonista-abzyma se pueden preparar como se describe en la presente para el suministro de la abzyma a una población de células tumorales. Las enzimas de esta invención pueden ser unidas convalentemente al antagonista mediante técnicas bien conocidas en el arte tal como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión de antígenos de un antagonista de la invención enlazada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir utilizando las técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Neuberger y colaboradores , Na ture, 312: 604-608 (1984)). Otras modificaciones del antagonista son contempladas en la presente. Por ejemplo, el antagonista puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilen glicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol. Los antagonistas descritos en la presente también se pueden formular como liposomas. Los liposomas que íiia¿ ¡s * * 1 —.i ¿ L ^^^^^^^^^^^M^^^án ^^^^^^ contienen el antagonista se preparan por métodos conocidos en- la técnica, tal como se describe en Epstein y colaboradores, Proc. Nati . Acad. EUA, 82:3688 (1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci . EUA, 77:4030 (1980); 5 las patentes norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y la patente W097/38731 publicada el 23 de Octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la patente norteamericana No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden 10 generar por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG- PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el 15 diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin y colaboradores J. Biol . Chem . 257:286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico es contenido 20 opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon y colaboradores J. Na tional Cáncer Inst . 81(19)1484 (1989). Se contempla (n) la(s) modificación (es) de las secuencias de aminoácidos de los antagonistas de proteína o péptido descritos en la presente. Por ejemplo, puede ser 25 deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del antagonista. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del antagonista se preparan al introducir cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del antagonista o mediante la síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del antagonista. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos pos-traducción del antagonista, tal como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del antagonista que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis es llamado "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells Sicence, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutral o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones l Áú? i teVÁÁ , g^g ^ jst^^^^^^^^& ^j^ gjj^??^^ga*^^^ entonces son depuradas mediante la introducción de variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria o de exploración de ala es conducida en el codon o región objetivo y las variantes expresadas del antagonista son seleccionadas por la actividad deseada. Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de la terminal amino y/o carboxilo que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen un ciento de o más residuos, así como también inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un antagonista con un residuo de metionilo N-terminal o el antagonista fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del antagonista incluyen la fusión a la terminación N o C del antagonista de una enzima, o un polipéptido el cual incrementa el período promedio de vida del suero del antagonista. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula del antagonista reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución de los antagonistas del anticuerpo incluyen regiones hipervariables, pero las alteraciones de FR también están contempladas. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan por resultado en un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente después con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden ser protegidos.

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del antagonista se realizan al seleccionar las sustituciones que difieren significantemente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de capa o hélica, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral. (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acídico: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservativas darán por resultado el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Ningún residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del antagonista también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, el (los) enlace (s) de cisteína se puede (n) adicionar al antagonista para mejorar su estabilidad (particularmente donde el antagonista es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución involucra la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo madre.

Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo madre del cual éstas se generan. Una forma conveniente para generar tales variantes de sustitución es la maduración por afinidad utilizando una exhibición de bacteriófagos. En resumen, los diversos sitios de región hipervariable (por ejemplo, los sitios 6-7) son mutados para generar todas las sustituciones de amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos de esta manera generadas son exhibidas en una forma monovalente de las partículas de bacteriófagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes que exhibieron bacteriófagos entonces son seleccionadas por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de región hipervariable, candidatos para la modificación, se puede realizar la mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significantemente a la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes se sujeta a la selección como se describe en la presente y los anticuerpos con las propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para el desarrollo adicional. Otro tipo de variante de aminoácido del antagonista altera el patrón de glicosilación original del antagonista. Mediante la alteración se da a entender la supresión de una o más porciones de carbohidratos encontradas en el antagonista, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el antagonista . La glicosilación de polipéptidos es típicamente ya sea N-enlazada o O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N- aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido de hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar la 5-hidroxiprolina o 5- hidroxilisina. La adición de los sitios de glicosilación al antagonista se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos tal que ésta contenga una o más de las secuencias tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-enlazada) . La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del antagonista original (para los sitios de glicosilación O-enlazada) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del antagonista se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , la mutagénesis de PCR y mutagénesis del caset de una primera variante preparada o una versión no variante del antagonista.

Puede ser deseable modificar el antagonista de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para aumentar la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del antagonista. Esto se puede lograr al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc de un antagonista del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el (los) residuo (s) de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo debido a eso la formación de enlaces de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico de esta manera generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminación de células mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) incrementadas. Ver Carón y colaboradores, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral aumentada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncional como se describe en Wolff y colaboradores, Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo el cual tiene regiones Fc dobles y debido a eso puede tener una lisis del complemento aumentada y capacidades de ADCC. Ver Stevenson y colaboradores , Anti -Cancer Drug Design 3:219- 230 (1989). Para incrementar el periodo de vida promedio del suero del antagonista, uno puede incorporar un epítope de unión del receptor de salvamento en el antagonista (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente norteamericana No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítope de unión del receptor de salvamento" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG) que es responsable por el incremento del periodo de vida promedio del suero in vivo de la molécula de IgG.

IV. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de los antagonistas utilizados de acuerdo con la presente invención son preparados para el almacenamiento al mezclar un antagonista que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Science 16th edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bencílico; parabenos alquílicos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agente de quelación tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones de formación de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilen glicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpos anti-CD20 ejemplares se describen en la patente W098/56418, incorporada expresamente en la presente por referencia. Esta publicación describe una formulación líquida de múltiples dosis que comprende 40 mg/mL de rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bencílico 0.9%, polisorbato 20 0.02% a pH 5.0 que tiene un periodo de vida promedio mínimo de dos años almacenada a 2-8 °C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/mL de rituximab en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 7.35 mg/mL de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/mL de polisorbato 80 y Agua Estéril para Inyección, pH 6.5. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administración subcutánea se describen en la patente WO97/04801. Tales formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente adecuado a una concentración de proteínas alta y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a ser tratado en la presente. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una citosina o un agente inmunosupresor (por ejemplo uno de los cuales actúa sobre las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que se une a las células T, por ejemplo uno que se une a LFA-1) . La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad del antagonista presente en la formulación, el tipo de enfermedad o trastorno o el tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las rutas de administración utilizadas anteriormente en la presente o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nano-cápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las preparaciones de liberación prolongada se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, matrices que están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de las matrices de liberación prolongada incluyen .é¿ &ji¿ gíi á¿ ^^w«^^^^&*^^j**i .-fc, .«i ? poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico)), polilactidas (patente norteamericana No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico desagradables tales como el LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones que son utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

V. Tratamiento con el Antagonista La composición que comprende un antagonista el cual se une al antígeno de la superficie de las células B será formulada, dosificada y administrada en una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores para la consideración en este contexto incluyen la enfermedad particular o el trastorno a ser tratado, el mamífero particular a ser tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o el trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros ffftfi i fi? i^ factores conocidos para los practicantes médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista a ser administrado será gobernada por estas consideraciones. Como un propósito general, la cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista administrado parenteralmente por dosis estará en la gama de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg del pero corporal del paciente por día, con la gama inicial típica del antagonista utilizado que está en la gama de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. El antagonista preferido es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo tal como RITUXAN®, el cual no está conjugado a un agente citotóxico. Las dosificaciones adecuadas para un anticuerpo no conjugado están, por ejemplo, en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. En una modalidad, la dosificación del anticuerpo difiere de aquel recomendado actualmente para el RITUXAN®. Por ejemplo, uno puede administrar al paciente una o más dosis de sustancialmente menos que 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo, donde la dosis está en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo de aproximadamente 50 mg/m2 a aproximadamente 200 mg/m2. Además, uno puede administrar una o más dosis iniciales del anticuerpo seguidas por una o más dosis subsecuentes, en donde la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la(s) dosis subsiguiente (s) excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la(s) dosis inicial (es). Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo de aproximadamente 50 mg/m2 a aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis subsiguiente puede estar en la gama de aproximadamente 250 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, estas cantidades sugeridas del antagonista están sujetas a mucha discreción terapéutica. El factor clave en la selección de una dosis apropiada y la programación es el resultado obtenido, como se indicó anteriormente. Por ejemplo, las dosis relativamente más altas pueden ser necesarias inicialmente para el tratamiento las enfermedades actuales y agudas. Para obtener los resultados más eficaces, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista es administrado tan cerca como sea posible del primer signo, diagnosis, aparición u ocurrencia de la enfermedad o trastorno o durante las remisiones de la enfermedad o trastorno. El antagonista es administrado por cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el antagonista se puede administrar adecuadamente mediante la infusión en el pulso, por ejemplo, con dosis declinantes del antagonista. Preferiblemente, la dosificación es dada por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica. Uno puede administrar otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citocinas con los antagonistas en la presente. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica individual y una administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente existe un período de tiempo mientras que ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas . Además de la administración de los antagonistas de proteína al paciente, la presente solicitud contempla la administración de antagonistas mediante la terapia de genes. Tal administración de ácido nucleico que codifica el antagonista es incluida por la expresión "administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista".

Ver, por ejemplo, patente WO96/07321 publicada el 14 de Marzo de 1996 concerniente al uso de la terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos planteamientos principales para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo el ácido nucleico es inyectado directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde se requiere el antagonista. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico es introducido en estas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas las cuales son implantadas en el paciente (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir los ácidos nucleicos dentro de las células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido en las células cultivadas in vi tro, o in vivo en las células del hospedante propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de l Üt.ft ÍJ ^ 'I :i trfli - " -^" -^^^^ - *- ^ *a^ - - ^^^^i^s^ - t-f"*-- - — -^ * - »- fosfato de calcio, etcétera. Un vector comúnmente utilizado para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus. Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo, actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (tal como adenovirus, virus de Herpes simple I, o virus adeno-asociado) y los sistemas en base a lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que selecciona como objetivo las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana superficial de las células o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etcétera. Donde se emplean los liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana superficial de las células asociadas con la endocitosis se pueden utilizar para fijar como objetivo y/o facilitar la captación, por ejemplo, las proteínas de al cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, los anticuerpos para proteínas que se someten a la internalización en el ciclado, y las proteínas que fijan como objetivo la ubicación intracelular y aumentan el período de vida promedio intracelular. La técnica de endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por Wu y colaboradores, J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987); y Wagner y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . EUA 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de la marcación de genes y terapia de genes actualmente conocidos ver Anderson y colaboradores , Science 256:808-813 (1992). Ver también la patente WO 93/25673 y las referencias citadas en la presente.

VI . Articules de Elaboración En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de elaboración que contiene materiales útiles para el tratamiento de las enfermedades o trastornos descritos anteriormente. El artículo de elaboración comprende un recipiente y una etiqueta o un suplemento del paquete en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frasquitos, jeringas, etcétera. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene o contiene una composición la cual es efectiva para el tratamiento de la enfermedad o trastorno de la selección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasquito que tiene un obturador perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es el antagonista el cual se une a un marcador de la superficie de las ..^toi^feakÉi t células B. La etiqueta o suplemento del paquete indica que la composición se utiliza para tratar a un paciente que tiene o está predispuesto a una enfermedad autoinmune, tal como aquellas listadas en la presente. El artículo de elaboración puede comprenden adicionalmente un segundo recipiente que comprende un amortiguador diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacterioestática por inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Los detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citaciones en la especificación se incorporan expresamente en la presente por referencia.

Ejemplo 1 Los pacientes con diagnosis clínica de artritis reumatoide (RA) son tratados con el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) . El paciente tratado no tendrá una malignidad de células B. Además, el paciente es tratado además opcionalmente con cualquiera de uno o más agentes empleados para tratar la RA tal como salicilato; fármacos anti- inflamatorios no esteroidales tales como indometacina, fenilbutazona, derivados de ácido fenilacético (por ejemplo ibuprofeno y fenoprofeno) , ácidos naftalen-acéticos (naproxeno) , ácido pirrolalcanoico (tometina) , ácidos indolacético (sulindac) , ácido antranílico halogenado (meclofenamato sodio), piroxicam, zomepirac y diflunisal; antimaláricos tales como cloroquina; sales de oro; penicilamina; o agentes inmunosupresores tales como metotrexato o corticosteroides en dosificaciones conocidas para tales fármacos o dosificaciones reducidas. Preferiblemente, sin embargo, el paciente es tratado únicamente con RITUXAN®. El RITUXAN® es administrado intravenosamente (IV) al paciente con RA de acuerdo con cualquiera de los siguientes programas de dosificación: (A) 50 mg/m2 IV día 1 150 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (B) 150 mg/m2 IV día 1 375 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (C) 375 mg/m2 IV días 1, 8, 15 y 22 La respuesta primaria se determina por el índice Paulus (Paulus y colaboradores, Athri tis Rheum . 33:477-484 (1990)), es decir un mejoramiento en la rigidez matutina, número de articulaciones dolorosas e inflamadas, sedimentación de eritrocitos (ESR) , y al menos un mejoramiento de 2 puntos en una escala de 5 puntos de la gravedad de la enfermedad valorada por un paciente y por un médico o facultativo. La de RITUXAN® aliviará uno o más de los síntomas de la RA en el paciente tratado como se describe anteriormente.

Ejemplo 2 Los pacientes diagnosticados con anemia hemolítica autoinmune (AIHA) , por ej empl o, crioglobinemia o anemia positiva de Coombs, son tratados con el anticuerpo RITUXAN®. La AIHA es una anemia hemolítica adquirida debido a los auto-anticuerpos que reaccionan con los glóbulos rojos de la sangre del paciente. El paciente tratado no tendrá una malignidad de células B. El RITUXAN® se administra intravenosamente (IV) al paciente de acuerdo con cualquiera de los siguientes programas de dosificación: (A) 50 mg/m2 IV día 1 150 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (B) 150 mg/m2 IV día 1 375 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (C) 375 mg/m2 IV días 1, 8, 15 y 22 Las terapias adjuntas, adicionales (tales como glucocorticoides, prednisona, azatioprina, ciclofosfamida, plaquetas cargadas de "vinca" o Danazol) se pueden combinar con la terapia de RITUXAN®, pero preferiblemente el paciente es tratado con RITUXAN® como un agente individual por todo el curso de la terapia. La velocidad de respuesta total se determina en base a un mejoramiento en los conteos sanguíneos, un requerimiento disminuido por transfusiones, niveles de hemoglobina mejorados y/o disminución de la evidencia de hemolisis determinados por los parámetros químicos estándar. La administración de RITUXAN® mejorará cualquiera de uno o más de los síntomas de la anemia hemolítica en el paciente tratado como se describe anteriormente. Por ejemplo, el paciente tratado como se describe anteriormente mostrará un incremento en la hemoglobulina por al menos 1 g/dl y un mejoramiento en los parámetros químicos de la hemolisis por 50% o un regreso a normal medido por la deshidrogenasa láctica del suero, bilirrubina.

Ejemplo 3 La púrpura trombocitopénica inmune de adulto (ITP) es un trastorno hematológico relativamente raro que constituye la más común de las citopenias mediadas por la inmunidad. La enfermedad se presenta típicamente con trombocitopenia grave que puede estar asociada con una hemorragia aguda en la presencia de megacariocitos normales a incrementados en la médula ósea. La mayoría de los pacientes con ITP tienen un anticuerpo de IgG dirigido i~ .? ^£^*^g^ák£^^g^^^£ft^&* contra los antígenos objetivo en la superficie exterior de la membrana de las plaquetas, lo que da por resultado el secuestro de plaquetas en el bazo y la destrucción reticuloendotelial acelerada de las plaquetas (Bussell, J.B. Hema tol . Oncol . Clin . North Am . (4):179 (1990)). Se han mostrado un gran número de intervenciones terapéuticas que son efectivas en el tratamiento de la ITP. Los esteroides son considerados generalmente una terapia de primera línea, después de la cual la mayoría de los pacientes son candidatos para la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) , esplenectomía u otras terapias médicas que incluyen vincristina o agentes inmunosupresores/citotóxicos. Hasta 80% de pacientes con ITP respondieron inicialmente a un curso de esteroides, pero solo algunos tienen remisiones completas o duraderas. La esplenectomía ha sido recomendada como una terapia de segunda línea, estándar para las fallas esteroidales, y conduce a la remisión prolongada en casi 60% de los casos que aun pueden dar por resultado la inmunidad reducida a la infección. La esplenectomía es un procedimiento quirúrgico mayor que se puede asociar con la morbididad sustancial (15%) y la mortalidad (2%) . La IVIG también ha sido utilizada como una terapia médica de segunda línea, aunque únicamente una proporción pequeña de pacientes adultos con ITP logran la remisión.

Las opciones terapéuticas que interferirían con la" producción de anticuerpos por las células B activadas sin las morbididades asociadas que ocurren con los corticosteroides y/o la esplenectomía proporcionarían un planteamiento de tratamiento importante para una proporción de pacientes con ITP. Los pacientes con diagnosis clínica de ITP (por ej emplo con un conteo de plaquetas <50,000/µL) son tratados con el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) , opcionalmente en combinación con la terapia de esteroides. El paciente tratado no tendrá una malignidad de células B. El RITUXAN® es administrado intravenosamente (IV) al paciente con ITP de acuerdo con cualquiera de los siguientes programas de dosificación: (A) 50 mg/m2 IV día 1 150 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (B) 150 mg/m2 IV día 1 375 mg/m2 IV en los días 8, 15 y 22 (C) 375 mg/m2 IV días 1, 8, 15 y 22 Los pacientes se pre-medicinaron con una dosis cada uno de difenhidramina de 25-50 mg intravenosamente y acetaminofen de 650 mg oralmente antes de la infusión del RITUXAN®. Utilizando una jeringa estéril y una aguja de calibre 21 o más grande, la cantidad necesaria de RITUXAN® es transferida del frasquito en una bolsa IV que contiene solución estéril, Cloruro de Sodio 0.9% libre de pirógenos, USP (solución salina) . La concentración final de RITUXAN® es aproximadamente 1 mg/mL. La velocidad de infusión de la dosis inicial comienza a 25 mg/hora durante la primera media hora luego se incrementa en intervalos de 30 minutos por incrementos de 50 g/hr a una velocidad máxima de 200 mg/hora. Si el primer curso de RITUXAN® es bien tolerado, las velocidades de infusión de loe cursos subsecuentes inician en 50 mg/hora y escalan en intervalos de 30 minutos por incrementos de 100 mg/hora a una velocidad máxima que no excede 300 mg/hr. Los signos vitales (presión sanguínea, pulso, respiración, temperatura) se monitorean cada 15 minutos x 4 o hasta que esté estable, y luego cada hora hasta que se completa la infusión. La velocidad de respuesta total es determinada en base a un conteo de plaquetas determinado en dos ocasiones consecutivas con dos semanas de diferencia después de los cuatro tratamientos semanales de RITUXAN®. Los pacientes tratados con RITUXAN® mostrarán conteos de plaquetas mejorados en comparación a los pacientes tratados con un placebo. Por ejemplo, en acue.1 les pacientes con un conteo de plaquetas <20,000/µl, un incremento en el conteo de plaquetas a >20,000/µl serla considerado una respuesca; y para aquellos pacientes con conteos de plaquetas >20,00C/µl y evidencia clínica de sangrado, ?n incremento total en el •^***¿A *£^g^ i^rt^a&fa^^i^^^^^^^^^^^ ^^- conteo de plaquetas por 10,000/µl o más y la resolución de los síntomas sería considerado una respuesta. Ver, George y colaboradores, "Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: A Practice Guideline Developed by Explicit Methods for The American Society of Hematology" Blood 88:3-40 (1996), expresamente incorporado en la presente por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para tratar una enfermedad autoinmune en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista el cual se une a un marcador de la superficie de las células B.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador de la superficie de las células B se selecciona del grupo que consiste de CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista comprende un anticuerpo.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo se une al CD20.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo se une al CD19. ^.s
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de psoriasis y dermatitis; esclerodermia sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino; enfermedad de Crohn; colitis ulcerativa; síndrome de dificultad respiratoria; síndrome de dificultad respiratoria de adulto; (ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas; eczema; asma; condiciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE) ; diabetes mellitus; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T; tuberculosis; sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis; vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos; desorden inflamatorio del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de lesión múltiple de órganos; anemia hemolítica; miastenia grave; enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal anti-glo erular; síndrome anti-fosfolípidos; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico Lambert-Eaton; bulas o ampollas penfigoides; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de stiff-man; enfermedad Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis compleja inmune; nefropatía de IgA; polineuropatías de IgM; púrpura tromobocitopénica idiopática (ITP) o tro bocitopenía autoinmune.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mamífero es humano .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo no está conjugado con un agente citotóxico.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo comprende el rituximab (RITUXAN®) .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es conjugado con un agente citotóxico.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente citotóxico es un compuesto radioactivo. ,,.„_ »» »^i£Aa^^ itw*¿ü¡^^^^^&¡ ¡!&2 ^^
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo comprende Y2B8 o 131I-B1 (BEXXARMR) .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende administrar el antagonista intravenosamente.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende administrar el antagonista subcutáneamente.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende administrar una dosis de sustancialmente menor que 375 mg/m2 del anticuerpo al mamífero.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la dosis está en la gama de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la dosis está en la gama de aproximadamente 50 mg/m2 a aproximadamente 200 mg/m2.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende administrar una dosis inicial del anticuerpo seguido por una dosis subsiguiente, en donde la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis subsiguiente excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis inicial.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la enfermedad 5 autoinmune es púrpura trombocitopénica inmune (ITP) .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
21. 21. El método de conformidad con la 10 reivindicación 6, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es anemia hemolítica.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la anemia hemolítica es crioglobinemia o anemia positiva de Coombs. 15
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es vasculitis.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste 20 esencialmente de la administración del antagonista al mamífero.
25. 25. Un artículo de elaboración, caracterizado porque comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un 25 antagonista el cual se une a un marcador de la superficie * %^ *»*.* ÉJu tM i &tfc ji _J . de las células B y además comprende un suplemento del paquete que instruye al usuario de la composición para tratar un paciente que tiene o está predispuesto a una enfermedad autoinmune .
26. 26. El artículo de elaboración de la reivindicación 25, caracterizado porque la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de psoriasis; dermatitis; escleroder ia sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino; enfermedad de Crohn; colitis ulcerativa; síndrome de dificultad respiratoria; síndrome de dificultad respiratoria de adulto (ARDS) ; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas; eczema; asma; condiciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE) ; diabetes mellitus; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T; tuberculosis; sarcoidosis; polimiositis; granulomatosis; vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos; desorden inflamatorio del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de lesión múltiple de órganos; anemia hemolítica; miastenia grave; enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal anti-glomerular; síndrome anti- fosfolípidos; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico Lambert-Eaton; bulas o ampollas penfigoides; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de stiff-man; enfermedad Behcet; arteristis de células gigantes; nefritis compleja inmune; nefropatía de IgA; polineuropatías de IgM; púrpura tromobocitopénica idiopática (ITP) o trombocitopenia autoinmune.