MXPA01005515A - Anticuerpos humanizados para gamma-interferon. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona inmunoglobulinas humanizadas que se unen a y neutralizan y-interferón. Los anticuerpos sonútiles para el tratamiento de enfermedades del sistema inmune, particularmente enfermedades autoinmun

Description

ANTICUERPOS HUMANIZADOS PARA GAMMA-INTERFERON CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general a la combinación de tecnologías de DNA recombinante y anticuerpo monoclonal para desarrollar biologías novedosas y, más particularmente, por ejemplo, para la producción de inmunoglobulinas no-inmunogénicas (en humanos) específicas para gamma-interferón (?-IFN) y sus usos in vitro y in vivo. La presente invención se refiere también más específicamente a anticuerpos monoclonales humanizados contra ?-IFN, secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos, un método para producir los anticuerpos, composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos como un ingrediente activo, y agentes terapéuticos para suprimir respuestas inmunes indeseables que comprenden los anticuerpos como un ingrediente activo.

ANTECEDENTES La respuesta inmune de mamíferos es mediatizada por varios tipos de células que interactúan específicamente con material extraño, es decir, antígenos. Uno de estos tipos de células, células B, es responsable de la producción de anticuerpos. Otro tipo de células, células T, incluye una amplia variedad de subconjuntos celulares que destruyen células infectadas con virus o controlan la función in vivo de ambas células B y otras células hematopoyéticas, incluyendo células T. Un tercer tipo de células, macrófagos, procesan y presentan antígenos en conjunto proteínas complejas de mayor histocompatibilidad (MHC) con células T. La comunicación entre estos tipos de células es mediatizada en una manera compleja por linfocinas, tales como interleucinas 1-6 y ?-IFN (ver, de manera general, Paul, W. E., Fundamental Immunology, 3a ed., Raven Press, New York (1993), lo cual se incorpora a la presente en la parte relevante por referencia). Una linfocina importante es la ?-IFN, la cual es secretada por algunas células T. Además de su actividad antiviral, la ?-IFN estimula las células aniquiladoras (NK) naturales y las células T ayudadoras 1 (Th1), activa los macrófagos, y estimula la expresión de moléculas MHC en la superficie de las células (Paul, op. cit., pp. 764-766). De aquí que la ?-IFN sirve para aumentar muchos aspectos de la función inmune, y es un candidato lógico para una droga terapéutica en casos donde se desea tal incremento, v. g., en el tratamiento de cáncer. Inversamente, en estados de enfermedad donde el sistema inmune es sobreactivo, v. g., enfermedades autoinmunes y rechazo de transplante de órgano, los antagonistas de la ?-IFN pueden ser útiles para tratar la enfermedad neutralizando los efectos estimulantes de la ?-IFN. Se han reportado anticuerpos monoclonales de ratón que se unen a y neutralizan la ?-IFN (ver v. g., Van der Meide et al., J. Gen. Virol, 67, 1059 (1986)). Tales anticuerpos anti-y-IFN han sido reportados que retrasan o evitan el rechazo en modelos de trasplantes de ratón in vitro e in vivo, (Landolfo et al., Science 229, 176 (1985) y Rosenberg et al., J. Immunol. 144, 4648 (1990)), ambas de las cuales se incorporan a la presente por referencia. Se reportó que el tratamiento de ratones predispone al desarrollo de un síndrome como el lupus eritematosus sistémico (SLE) con un anticuerpo monoclonal para ?-IFN que retrasa el comienzo de la enfermedad (Jacob et al., J. Exp. Med. 166, 798 (1987)). También ha sido reportado que un anticuerpo de anti-y-IFN alivia la artritis adyuvante en ratas (Jacob et al., J. Immunol. 142, 1500 (1989)) y colitis en ratones (Powrie et al., Immunity 1, 553-562 (1994)). Queen et al., WO 92/11018 discute el anticuerpo AF2 de ratón para ?-IFN, ciertas inmunoglobulinas humanizadas, y el uso de las mismas para tratar enfermedades inflamatorias. El uso de anticuerpos monoclonales no humanos tales como el AF2 tiene ciertas desventajas en tratamiento de humanos, particularmente en regímenes terapéuticos repetidos como se explica más adelante. Los anticuerpos monoclonales de ratón, por ejemplo, tienen una vida media de circulación relativamente corta en humanos, y carecen de otras características importantes funcionales de la inmunoglobulina cuando se usan en humanos. Quizás de manera más importante, los anticuerpos monoclonales de murino contienen secuencias substanciales de aminoácidos que serán inmunogénicas cuando se inyectan a un paciente humano. Numerosos estudios han mostrado que, después de la inyección de un anticuerpo extraño, la respuesta inmune provocada por un paciente compra el anticuerpo inyectado puede ser muy fuerte, eliminando esencialmente la utilidad terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Además, si se usan anticuerpos monoclonales de ratón u otro antigénico (para humanos) para tratar varias enfermedades humanas, pueden ser inefectivos o aún peligrosos por sí mismos tratamientos subsecuentes con anticuerpos de ratón no relacionados, debido a la reactividad cruzada. Así, existe una necesidad para formas mejoradas de inmunoglobuiinas humanizadas específicas para antígeno ?-IFN que son substancialmente no inmunogénicas en humanos, producidas ya fácil y económicamente en una manera adecuada para formulación terapéutica y otros usos. La presente invención llena éstas y otras necesidades.

OBJETIVOS Y BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales humanizados contra ?-IFN; secuencias polinucleótidas que codifican los anticuerpos; un método para producir los anticuerpos; una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos como un ingrediente activo; un agente terapéutico para tratar enfermedades, particularmente enfermedades autoinmunes, y para supresión de sistema inmune que comprende el anticuerpo como un ingrediente activo; y un método para tratar tales enfermedades.

La invención proporciona inmunoglobulinas humanizadas que son versiones humanizadas de la inmunoglobulina de ratón AF2. La inmunoglobulina de ratón AF2 está caracterizada por una región variable de cadena ligera designada SEQ ID No:2 y una región variable de cadena pesada designada SEQ I D No: 4. Las inmunoglobulinas humanizadas de la invención comprenden cadenas pesadas y ligeras. La posición 1 1 del marco de la región variable de cadena pesada humanizada está ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la región variable de cadena pesada de ratón AF2. Una inmunoglobulina humanizada preferida de la invención comprende una región variable de cadena ligera humanizada designada SEQ I D No: 6 y una región variable de cadena pesada humanizada designada SEQ I D No: 8. Las inmunog lobulinas humanizadas se pegan específicamente al antígeno ?-I F N y neutralizan la ?-I F N. Las inmunoglobulinas humanizadas son capaces también de bloquear la unión del anticuerpo monoclonal de ratón donador de CD para la ?-I FN. Las inmunoglobulinas humanizadas preferidas tienen dos pares de complejos de cadena ligera/cadena pesada, por lo menos una cadena que comprende una o más regiones determinantes de complementaridad (C DRs) de ratón unidas funcionalmente a segmentos de regiones de marco de trabajo. Por ejemplo , las C DRs de ratón, con o sin residuos adicionales de aminoácido de ratón a sociados na turalmente , pueden ser introducidas a regiones de marco humano para producir ihmunoglobulinas humanizadas capaces de unirse al antígeno en niveles de afinidad más fuertes que aproximadamente 107 M" . Las inmunoglobulinas, incluyendo fragmentos de unión y otros derivados de las mismas, de la presente invención pueden ser producidos rápidamente mediante una variedad de técnicas de DNA recombinantes, con expresión final en células transfectadas, de preferencia células eucarióticas inmortalizadas, tales como células de mieloma o hibridoma. Se pueden producir polinücleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica para regiones de marco de trabajo de inmunoglobulina humanizada y una segunda secuencia que codifica para las CDRs de inmunoglobulina deseada sintéticamente o combinando segmentos apropiados de cDNA y DNA genómico. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser utilizadas en forma substancialmente pura y pueden ser preparadas en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptada, la cual varía dependiendo del modo de administración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A y 1B. Secuencias del cDNA y secuencias de aminoácidos transladados de las regiones variables de cadena ligera (A) (SEQ ID Nos:1 y 2) y cadena pesada (B) (SEQ ID Nos:3 y 4) del anticuerpo AF2 de ratón. Las secuencias de CDR de Kabat están subrayadas.

Figuras 2A y 2B: secuencias de cDNA (SEQ ID Nos:5 y 7) y aminoácido (SEQ ID No:6 y 8) de las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo HuZAF humanizado. Las CDRs de Kabat están subrayadas. Figura 3: comparación de la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de AF2 de ratón, inmunoglobulina HuZAF humanizada e inmunoglobulinas haf25, y HuXAF humanizadas. Figura 4: actividad de neutralización de AF2 de ratón, y anticuerpos haf25, HuXAF y HuZAF humanizados para ?-IFN.

DEFINICIONES La frase "substancialmente idéntica", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (v. g., DNAs que codifican una inmunoglobulina humanizada o la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina humanizada) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos aproximadamente 80%, lo más preferible 90-95% o más de identidad de residuo de nucleótido o aminoácido, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima, según medición usando el siguiente método de comparación de secuencia y/o mediante inspección visual. Tales secuencias "substancialmente idénticas" se consideran típicamente que son homologas. De preferencia, la "identidad substancial" existe en una región de las secuencias que es por lo menos de aproximadamente 50 residuos de longitud, más preferiblemente en una región de por lo menos aproximadamente 1 00 residuos, y lo más preferible las secuencias son substancialmente idénticas en por lo menos aproximadamente 1 50 residuos, o en la longitud completa de las dos secuencias que se van a comparar. Como se describe más adelante, cualesqu iera dos secuencias de anticuerpo pueden ser alineadas solamente en un modo, usando el esquema de numeración en Kabat. Por lo tanto, para anticuerpos, el por ciento de identidad tiene un significado único y bien definido. Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas ligeras maduras de inmunoglobulinas están designadas Hx y Lx respectivamente, donde x es un nú mero que designa la posición de un aminoácido de acuerdo con el esquema de Kabat, Secuencias de Proteínas de I nterés Inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, M D, 1 987 y 1 991 ). Kabat lista muchas secuencias de aminoácidos para anticuerpos para cada subg rupo, y lista el aminoácido que ocu rre más comúnmente para cada posición de residuo en ese subgrupo para generar una secuencia de consenso. Kabat usa un método para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia listada, y este método para asignar números de residuo se ha vuelto normal en el campo. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio para alinear el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat por referencia a aminoácidos conservados. El uso del sistema de n umeración de Kabat identifica rápid amente aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido en la posición L50 de un anticuerpo humano ocupa una posición equivalente a u na posición L50 de aminoácido de un anticuerpo de ratón . Se sabe que la unidad básica estructu ral de anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par teniendo una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (a proximadamente 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 1 00 a 1 1 0 o más aminoácidos responsables principalmente para reconocimiento de antígenos. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente para la función effector y (N . del traductor: una estructura especializada en la periferia de un nervio motor, como un músculo o glándula, que sirve para transformar impulsos de nervio eferentes en acción fís ica, o para inervarlos). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesad a forman el sitio de unión del anticuerpo . As í, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión . Las cadenas ligeras están clasificadas como kappa o lambda.

Las cadenas pesadas están clasificadas como gamma, mu , alfa, delta o epsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como Ig G, Ig , IgA, I g D e I g E, respectivamente . Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas mediante una región "J" de aproximadamente doce o más a minoácidos , con la cadena pesada que incluye también una región "D" de aproximadamente 1 0 o más aminoácidos. (Ver de manera general, Fundamental I mmunology, Paul, W. , ed. , 3a ed . Raven Press, NY, 1 993, SH . 9 incorporada por referencia en su totalidad para todos propósitos)). De la terminal N a la terminal C, ambas regiones variables de cadenas ligeras y pesadas comprenden regiones determinantes de marco de trabajo y complementaridad alternantes (CD Rs): FR, CDR. FR, CDR. FR , CDR y FR. La asignación de aminoácidos para cada región está de acuerdo con las definiciones de Kabat (1987) y (1 991 ), supra, y/o Chothia & Lesk, J. Mol. ß/?/. 1 96:901 -91 7 (1 987); Chothia et al. , Nature 342: 878-883 (1989). De preferencia, los análogos de inmunoglobulinas humanizadas ejemplificadas difieren de las inmunoglobulinas ejemplificadas por substituciones conservadoras de aminoácidos. Para propósitos de clasificación las substituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos pueden ser agrupados como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): met, ala , val, leu , ile; Grupo I I (cadenas laterales neutras hidrofílicas) . cis, ser, tr; Grupo I I I (cadenas laterales ácidas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lis, arg ; Grupo V (residuos que influencian la orientación de cadena): gli, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp , tir, fe . Las substituciones conservadoras involucran substituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las substitucion es no conservadoras constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra. El término epitope incluye cualquier determinante proteínico capaz de pegarse específicamente a una inmunoglobulina. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de agrupamientos de moléculas químicamente tensoactivos tales como cadenas laterales de aminoácidos o de azúcar y tienen usualmente características estructurales específicas de tres dimensiones, así como características específicas de carga. Como se usa en la presente, el término "inmunoglobulina" se refiere a anticuerpos tetraméricos así como a una variedad de formas además de anticuerpos; incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab')2 así como anticuerpos híbridos bifuncionales (v. g., Lanzavecchia et al; Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) y cadenas sencillas (v. g., Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 85, 5879-5883 (1988) y Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), los cuales se incorporan a la presente por referencia), (ver, de manera general, Hood et al., Immunology, Benjamín, NY, 2a ed. (1984), Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Hunkapiller y Hood, Nature, 323, 15-16 ( 986), los cuales se incorporan a la presente por referencia). Como se usa en la presente, el término "región de marco" se refiere a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que se conservan relativamente (es decir, otras diferentes a las CDRs) entre diferentes inmuno-globulinas en una sola especie, como se define por Kabat, et al. , op. cit. Como se usa en la presente, una "región de marco de trabajo humano" es una región de marco de trabajo que es substancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más) a la región de marco de trabajo de un anticu erpo humano que ocurre naturalmente. Como se usa en la presente, el término "inmunog lobulina humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende un marco de tra bajo humano, por lo menos una C D R de un anticuerpo no humano, y en el cual cualquier región constante presente es substancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, por lo menos aproximadamente 85-90% , de preferencia por lo menos 95% idéntica . De aqu í q ue, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CD Rs, son substancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencia de región constante s de inmu noglobulina humana nativa. Por ejemplo, una inmunog lobulina humanizada podría no abarcar un anticuerpo quimérico de región variable de ratón/región constante humana. El término "paciente" incluye sujetos humanos y de veterinaria. El término "substancialmente puro" o "aislado" significa que una especie de objeto es la especie predomin ante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualqu ier otra especie individu al en la composición) , y de preferencia una fracción substancialmente purificada es una composición en donde la especie de objeto comprende por lo menos aproximadamente 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición substancialmente pura comprende más de aproximadamente 80, 90, 95 o 99% en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. De la manera más preferible, la especie del objeto se purifica a una homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición mediante métodos convencionales de detección) en donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona inmunoglobulinas humanizadas que se unen específicamente a la ?-IFN, y métodos para usar las mismas para suprimir respuestas inmunes indeseables.

I. Anticuerpos Humanizados Específicos para v- FN Las inmunoglobulinas humanizadas de la invención tienen regiones de marco variables substancialmente de una inmunoglobulina humana (llamada una inmunoglobulina receptora), de preferencia el anticuerpo EU receptor humano, y CORs substancialmente de una inmunoglobulina de ratón llamada AF2 (aludida como la inmunoglobulina donadora). La(s) región(es) constante(s), si está presente, son también substancialmente de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados exhiben una afinidad de unión específica para ?-IFN de por lo menos 107, 108, 109, ó 1010 M"1. Usualmente el límite superior de la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados para ?-IFN humano está dentro de un factor de 3,4,5 ó 10 del de AF2. Con frecuencia el límite inferior de la afinidad de unión está también dentro de un factor de 3, 4, 5 ó 10 del de AF2. Las inmunoglobulinas humanizadas preferidas compiten con AF2 para unirse a ?-IFN y evitar que la ?-IFN se una a y por lo cual transduzca una respuesta a través de un receptor de ?-IFN. Los anticuerpos humanizados de preferencia neutralizan el 80, 90, 95 ó 99% de la actividad de ?-interferón en 1, 2, 5, 10, 20, 50 ó 100 veces el exceso molar. El anticuerpo AF2 de ratón se describe por Queen et al., WO 92/11018, y tiene regiones variables de cadenas pesadas y ligeras designadas SEQ ID Nos:2 y 4. El anticuerpo de ratón tiene isotipo lgG2b y una cadena ligera kappa. Las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo EU receptor humano preferido, y aquellas de otro anticuerpo receptor humano posible se describen por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991). El anticuerpo receptor humano se selecciona de manera que sus regiones variables exhiban un alto grado de identidad de secuencia con aquellas del anticuerpo AF2 de ratón. Las regiones de marco variables de cadenas pesada y ligera se pueden derivar a partir de las mis mas o diferentes secuencias de anticuerpo humano. Las secuencias de anticuerpo humano pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos que ocurren naturalmente o pueden ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos. El diseño de inmu noglobulinas humanizadas se puede llevar a cabo como sigue. Cuando un aminoácido cae bajo la siguiente categoría, el aminoácido del marco de trabajo de una inmunoglobulina humana que se va a usar (ínmunoglobulina receptora) se reemplaza por un aminoácido de marco de trabajo de una inmunoglobulina no humana que proporcione CD R (inmunoglobulina donadora): (a ) El aminoácido en la región de marco de trabajo humano de la inmonoglobulina receptora es inusual para inmonoglobulinas humanas en esa posición , mientras q ue el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es típico para inmunoglobulinas humanas en esa posición ; (b ) La posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CD Rs; o (c) EI aminoácido es capaz de interactuar co n las C D Rs (ver, Queen et al. , op. cit. , y Co et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1 991 ), respectivamente, ambas de las cuales se incorporan a la presente por referencia. Para una descripción d etallada de la producción de inmunoglobulinas humanizadas ver Queen et al . , op. cit. , y Co et al. , y op. cit. Q ueen et al. , WO 92/1 1 01 8 reporta ciertas formas humanizadas de AF2, que comprenden regiones de CDR de AF2 y marcos de trabajo de región variable de EU en las cuales ciertas posiciones están substituidas. Las presente inmunoglobulinas humanizadas contienen de preferencia las mismas substituciones como describe Queen et al. , supra. Sin embargo, también están presentes substituciones adicionales. Específicamente, la posición H 1 1 está substituida con el aminoácido que ocupa la posición equivalente de la cadena pesada de AF2 de ratón. La posición H 1 1 no cumple con los criterios para substitución antes dados, pero sin embargo hace una contribución sign ificativa para la actividad neutralizante en inmunoglobulinas hu manizadas que incorporan esta substitución. Lo deseable de substituir en esta posición se determinó mediante substitución de varias posiciones en un anticuerpo AF2 quimérico (es decir, que tiene dominios variables de ratón y regiones constantes de humano) con aminoácidos de posiciones equivalentes en el anticuerpo EU humano. La substitución de la posición H 1 1 causó una reducción significativa en la actividad de neutralización del anticuerpo quimérico para ?-I F N. Usualmente las regiones CDR en anticuerpos humanizados son substancialmente idénticas , y de manera más usual , idénticas a las reg iones C D R correspondientes en el anticuerpo de ratón a partir del cua l fueron derivadas . A unque no se desea usualmente, es posible algunas veces hacer una o más substituciones conservadoras de aminoácidos de residuos de CDR sin afectar de manera apreciable la afinidad de unión de la inmunoglobulina humanizada resultante. Ocasionalmente, las substituciones de regiones de CD R pueden a umentar la afinidad de unión. Otras regiones de marco diferentes de las substituciones de aminoácidos específicos discutidas anteriormente, las regiones de marco de inmunoglobulinas humanizadas son de manera usual substancialmente idéntica s, y más usualmente , idénticas a las regiones de marco de los anticuerpos humanos a partir de los cuales fueron derivadas. Por supuesto, muchos de los aminoácidos en la región de marco tienen poca o ninguna contribución directa para la especificidad o afin idad de un anticuerpo. As í, muchas substituciones conservadoras individuales de residuos de marco pueden ser toneladas sin cambio apreciable de la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina humanizada resultante. Los análogos de HuZAF muestran identidad de secuencia de aminoácidos substancial con HuZAF. Las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de análogos están codificadas mediante secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan con los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadenas pesadas o ligeras de HuZA F, o formas degeneradas de las mismas, bajo condiciones rigurosas. La tecnolog ía de exhibición de fagos ofrece técnicas poderosas para seleccionar tales análogos de HuZAF con retención de afinidad y especificid ad de unión (ver, v . g . , Dower et al. , WO 91 /1 7271 ; cCafferty et al. , WO 92/01 047; y H use, WO 92/06204 (cada una de las cuales se incorpora por referencia en sus totalidades para todos los propósitos). Los segmentos variables de anticuerpos hu manizados producidos como se describió supra están unidos típicamente a por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Las secuencias de DNA de región constante h umana pueden ser aisladas de acuerdo con procedimientos bien conocidos a partir de una variedad de células humanas, pero de preferencia células B inmortalizadas (ver, Kabat et al . , supra, y WO 87/02671 ) . De manera ordinaria, el anticuerpo contiene ambas reg iones constantes de cadena ligera y de cadena pesada. La región constante de cadena pesada incluye usualmente regiones CH 1 , bisagra , CH2 , C H3 y algunas veces C H4. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes , incluyendo ig M , IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG 1 , l gG2, lgG3 e lgG4. Cuando se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, el dominio constante es usualmente un dominio constante de fijación de complemento y la clase es típicamente Igd . Cuando tal actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase l gG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Habiendo seleccionado conceptualmente los componentes de C D R y marco de trabajo de inmunoglobulinas humanizadas, está disponible una variedad de métodos para producir tales inmu noglobulinas. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codifica cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias deseadas de ácidos nucleicos pueden ser producidas mediante la síntesis de D NA de fase sólida de nobo o por mutagenésis de PC R de una variante preparada con anterioridad del polinucleótido deseado. Todos los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en esta solicitud están incluidos expresamente en la invención . U na vez expresados, los anticuerpos globales, sus dímeros, cadenas individuales ligeras y pesadas, u otras formas de inmu noglobulina de la presente invención pueden ser purificadas de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de a monio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis de gel y los similares (ver, de manera general, Scopes, R. , Protein Purification, Springer-Verlag , N . Y. (1 982), el cual es incorporada a la presente por referencia) . Se prefieren las inmunoglobulinas substancialmente puras de por lo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad , y 98 a 99% o más de homogeneidad son los más preferido , para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcia lmente o para homogeneidad como se desee , se pueden usar entonces terapéuticamente lo s polipéptidos (incluyendo extra- corporalmente) o para el desa rrollo y realización de procedimientos de ensayo, coloración inmuno-fluorescente, y los similares. (Ver, de manera general, I mmunological Methods, Vols. I y I I , Lefkovits y Pernis, eds. , Academic Press, New York, NY ( 1 979 y 1 981 ) .

I I . Métodos Terapéuticos Las composiciones farmacéuticas que comprenden inmunoglobulinas de la presente invención son útiles para administración parenteral, es decir, subcutáneamente intramuscularmente y particularmente intravenosamente. Las composiciones para ad ministración parenteral comprenden comúnmente una solución del anticuerpo o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, v. g . , agua, agua amortiguada , salina al 0.4%, glicina al 0.3% y los similares . Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia en partículas. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar condiciones fisiológicas tales como ajuste de pH y agentes de amortiguación, agentes para ajuste de toxicidad y los similares, por ejemplo acetato de sodio , cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, histidina y arginina. La concentración de las inmunoglobulin as en estas formulaciones puede variar a mpliamente, es decir, desde menos de aproximad amente 0.01 % , usualmente por lo menos aproximadamente 0. 1 % hasta tanto como 5% en peso y se seleccionan con base principalmente en volúmenes de fluido, y solubilidades de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. As í, una composición farmacéutica típica para inyección podría hacerse contener hasta 250 mi de solución estéril de Ringer, y 1 0 mg de inmunoglobulina. Los métodos actuales para preparar composiciones para administración parenteral son conocidos o aparentes para aquellos expertos en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (1 5a Ed . , ack Publishing Company, Easton, Pennsylvania , 1 980), la cual se incorpora a la presente por referencia. Las inmunoglobulinas de esta invención pueden ser congeladas o liofilizadas para almacenaje y reconstituidas en un portador adecuado antes de usarse. Esta técnica ha mostrado que es efectiva con inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. La liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad de la inmunoglobulina (v. g. , con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos Ig M tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y que los niveles de uso es posible que tengan que ser ajustados para compensación. Las composiciones pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya sufre de una respuesta inmune indeseable en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente la condición y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "dosis efectiva terapéuticamente". Las cantidades efectivas para este uso dependen de la severidad de la condición y el estado general del sistema inmune del propio paciente, pero generalmente fluctúan desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 00 mg de anticuerpo por dosis , siendo las dosificaciones más comúnmente usadas desde 0. 1 hasta 50 mg y 1 a 1 0 mg por paciente. Las administraciones sencillas o múltiples en un programa diario, semanal o mensual se pueden llevar a cabo con niveles y patrones de dosis que se seleccionan por el facultativo que da el tratamiento. Debe mantenerse en mente que los materiales de esta invención pueden ser empleados generalmente en estados de enfermedad serios, es decir situacion es que amenazan la vida o que amenazan la vida potencialmente. En tales casos, en vista de la minimización de substancias extrañas y la menor p robabilidad de rechazos de "substancia extraña" que se logran mediante las inmunoglobulinas humanizadas presentes de esta invención , es posible y p uede ser deseable por el fa cultativo que da eJ tratamiento administrar un exceso substancial de estas inmunoglobulinas. E n apl icaciones p rofilácticas , las composiciones se administran a un paciente que está en riesgo de desarrollar una respuesta inmune inapropiada en una cantidad s uficiente para suprimir la respuesta. Tal cantidad se define como que es una "dosis profilácticamente efectiva" . En este uso, las cantidades precisas dependen otra vez del estado de salud del paciente y el nivel general de inmunidad , pero generalmente fluctúa desde 0. 1 hasta 1 00 mg por dosis, específicamente 1 a 10 mg por paciente. Los métodos son efectivos en una variedad de estados enfermedad asociados con respuesta inmune asociada indeseable mediatizada por ant ígenos H LA clase I I y/o células Th 1 . Tales estados de enfermedad incluyen graft versus enfermedad de huésped y rechazo de transplante en pacientes que sufren un transplante de órgano, tal como corazón , pulmón , riñon e h ígado, y enfermedades auto-inmu nes, tales diabetes tipo I , esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematosus sistémico, tiroiditis de Hash imoto, cirrosis biliar psoriasis primaria, y enfermedad de intestino inflamado, v. g. , enfermedad de Croh n . Las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser utilizadas solas en forma substancialmente pura, o junto con un agente quimioterapéutico tal como una droga anti-inflamatoria no esferoidal, un corticosteroide, o un inmuno-supresor. Los ag entes puede n incluir agentes anti-inflamatorios no esferoidales (v . g . , aspirina, ibuprofen), esferoides (v. g. , prednisona) e inmuno-supresores (v. g . , ciclosporina A , citoxan metotrexato). Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención se pueden usar también en combinación con otros anticue rpos, particularmente anticuerpos humanizados reactivos con otras linfocinas o receptores de linfocina. Por ejemplo, antígenos adecuados con los cuales puede reaccionar un cóctel de inmunoglobulinas humanizadas incluyen interleucinas 1 a 18 y las cadenas p55 y p75 del receptor IL-2 (ver, Waldmann, Annu. Rev. Biochem. 58, 875 (1989) y Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci.10029 (1989), ambas se incorporan a la presente por referencia). Otros antígenos incluyen aquellas células responsables de la enfermedad, v. g., los llamados "Racimos de Diferenciación" (Leucocyte Typing III, ed. By A. J. McMichael, Oxfor University Press 1987), la cual se incorpora a la presente por referencia.

Método de Diagnóstico En anticuerpo anti-y-IFN humanizado es útil también en métodos de diagnóstico. El anticuerpo anti-y-IFN humanizado es útil para medir la expresión de ?-IFN, y desarrollo consecuente de una respuesta inmune. Se pueden realizar métodos de diagnosis in vitro usando una muestra celular (v. g., muestra de sangre, biopsia o tejido de nodulo linfático) de un paciente o puede ser realizado mediante imagen in vivo. El anticuerpo anti-y-IFN humanizado es útil también para purificar ?-IFN humano. En modalidades particulares, las composiciones que comprenden la inmunoglobulina humanizada de la presente invención pueden ser usadas para detectar ?-lFN, por ejemplo, mediante radio-inmuno-ensayo o ELISA. Así, una inmunoglobulina humanizada de la presente invención, tal como una inmunoglobulina humanizada que se une al antígeno determinante identificado por el anticuerpo AF2 puede ser marcada y usada para identificar sitios anatómicos que contienen concentraciones significativas de ?-IFN. Por ejemplo, pero sin limitación, una o más porciones de etiquetado pueden ser unidas a la inmunoglobulina humanizada. Porciones de etiquetado de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, colorantes radioopacos, agentes de radiocontraste, moléculas fluorescentes, moléculas de giro etiquetadas, enzimas u otras porciones de etiquetado de valor de diagnóstico, particularmente en técnicas radiológicas o de creación de imagen por resonancia magnética. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, no de limitación. Será entendido que aunque los ejemplos pertenecen al anticuerpo AF2 humanizado, también se contempla la producción de anticuerpos humanizados con alta afinidad de unión para el antígeno ?-IFN usando CDRs de otros anticuerpos monoclonales que se unen a un epitope de ?-IFN. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan a la presente por referencia para el propósito de describir y revelar, por ejemplo, los constructos, y metodologías que se describen en las publicaciones que pudieran ser usadas en relación con la invención descrita actualmente. Las publicaciones discutidas anteriormente y todo el texto se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente de solicitud. Nada en la presente debe ser construido como una aceptación de que los inventores no tienen el derecho de anteceder tal descripción en virtud de invención anterior.

Ejemplos 1. Producción de Inmunoqlobulinas Humanizadas Clonación y secuenciado de cDNAs de regiones variables AF2 de ratón La clonación de secuencias de cDNA que codifican las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo AF2 de ratón se describe por Queen et al., WO 92/11018. Las secuencias de estos cDNAs se muestran en la Figura 1. Se prepararon dos vectores plásmidos para construcción y expresión de un anticuerpo quimérico que comprende los dominios variables del anticuerpo AF2 de ratón vinculados a regiones humanas constantes. El plásmido pVgl-dhfr (Queen et al., supra) contiene un promotor y aumentador de citomegalovirus IE1 humano (M. Boshart ey al., Cell 41, 521 (1985)), el segmento genómico Cg1 humano que incluye parte del intron precedente, y un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) (Simonsen et al., Proc.Natl. Acad. Sci USA 80, 2495 (1984), el cual se incorpora a la presente por referencia) para selección. El plásmido pVk (Queen et al., supra) es similar al pVgl-dhfr, pero contiene el segmento genómico Ck humano y el gen gpt. Se prepararon derivados de las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de AF2 a partir de los cDNAs mediante reaccionen cadena de polimerasa. Los primarios 5' hibridizados en las regiones V comenzaron en los codones ATG y contenían sitios Xbal; los primarios 3' hibridizados con los últimos 15 nucleótidos de las regiones J y contenían señales de donador dividas y sitios Xbal (ver, Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86,10029 (1989), la cual se incorpora a la presente por referencia). Las regiones V modificadas fueron clonadas en los sitios Xbal de los vectores de plásmidos respectivos entre el promotor de CMV y los intrones parciales de las regiones constantes. Para expresión del anticuerpo quimérico, los plásmidos de cadena pesada y cadena kappa fueron transfectados en células de mieloma de ratón Sp2/0 mediante electroporación y células seleccionadas para expresión de gpt. Se detectaron mediante ELISA clones que secretan una cantidad máxima de anticuerpo completo. Se demostró que el anticuerpo AF2 quimérico se une al ?-IFN humano mediante ELISA.

Diseño de Regiones Variables AF2 Humanizadas Para retener la afinidad de unión del anticuerpo de ratón en el anticuerpo humanizado, se siguieron los procedimientos generales de Queen et al., (Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) y Patentes de E. U. Nos. 5, 585, 089 y 5, 693, 762). La selección de residuos de marcos de trabajo puede ser crítica para retener alta afinidad de unión. En principio, una secuencia de marco de trabajo de cualquier anticuerpo humano puede servir como la plantilla para injertado de CDR; sin embargo, se ha demostrado que el reemplazo de CDR recta en tal marco de trabajo puede conducir a pérdida significativa de afinidad de unión con el antígeno (Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992); Shalaby et al., J. Exp. ed. 17: 217 (1992)). Mientras más homologo es un anticuerpo humano con el anticuerpo de murino original, menor probabilidad de que el marco de trabajo humano introduzca distorsiones en las CDRs de ratón que pudieran reducir la afinidad. Con base en una búsqueda de homología de secuencia contra una base de datos de secuencias de anticuerpo, el anticuerpo EU humano se seleccionó como proveedor de buena homología de marco de trabajo con el anticuerpo AF2 de ratón. También serían adecuadas otras cadenas de anticuerpo humano homologas para proporcionar el marco de trabajo de anticuerpo humanizado, especialmente cadenas ligeras kappa del subgrupo I humano y cadenas pesadas del subgrupo I humano (como se define por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., U. S. Department of Health and Human Services, 1991). Se usaron los programas ABMOD y ENCAD de computadora (Levitt et al., J. Mol. Biol. 168: 595 (1983)) para construir un modelo molecular del dominio variable AF2, el cual se usó para localizar los aminoácidos en el marco de trabajo AF2 que están suficientemente cercanos a las CDRs para interactuar potencialmente con ellos. Para diseñar las regiones variables de cadenas pesada y ligera HuZAF humanizadas, las CDRs del anticuerpo AF2 de ratón se injertaron en las regiones del marco de trabajo del anticuerpo EU humano. En posiciones de marco de trabajo donde el modelo de computadora sugirió contacto significativo con las CDRs, los aminoácidos del anticuerpo de ratón fu eron substituidos por los aminoácidos del marco de trabajo humano original. Para la forma humanizada de AP2 designada HuZAF , esto se hizo en residuos 27 , 28 (dentro de Chothia C HR H 1 ), 30, 38, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 98 y 107 de la cadena pesada y en los residuos 48, 63 y 70 de la cadena ligera. Además, los residuos de marco que ocurrieron solamente de manera rara en sus posiciones en la base de datos de anticuerpos humanos fueron reemplazados por un aminoácido de consenso humano en aquellas posiciones o por los aminoácidos del anticuerpo de ratón correspondiente. Para HuZAF esto se hizo en los residuos 93, 95, 98, 107, 1 08, 1 09 y 1 1 1 de la cadena pesada y en los residuos 48, 63 y 70 de la cadena ligera. Además, en H uZA F , posición H 1 1 se substituyó con el aminoácido que ocupa la posición equivalente de la cadena pesada del anticuerpo AF2 de ratón. H 1 1 se identificó como s iendo un candidato para substitución mediante substitución de varias posiciones en un anticuerpo AF2 quimérico (es decir, que tiene dominios variables de ratón excepto en posiciones substituidas) con aminoácidos de posiciones equivalentes en el anticuerpo EU humano y probando cada variante para actividad de neutralización reducida . Las secuencias finales de los dominios v a riables de cadenas ligera y pesada de HuZAF que incorporan todas las substituciones anteriores se muestran en las Figuras 2A y 2B. Se designaron también otras inmunoglobulinas humanizadas que contienen regiones CDR AF2 de ratón y regiones variables EU humanas, pero conteniendo varios subconjuntos de las substituciones anteriores (ver Figura 3). Haf25 es lo mismo que HuZAF excepto que el anticuerpo carece de substituciones en las posiciones H11 y H38. HuXAF es el mismo que HuZAF excepto que el anticuerpo anterior carece de una substitución en la posición H38. Sin embargo, hay muchos residuos de contacto-CDR potencial que son también manejables para substitución y que pueden permitir aún que el anticuerpo retenga afinidad substancial con el antígeno. Por ejemplo, los primeros cuatro residuos de aminoácido N-terminal en la cadena ligera AF2 humanizada pueden ser substituidos alternativamente con la secuencia del anticuerpo de murino debido a sus contactos con las CDRs. De manera similar, muchos de los residuos del marco de trabajo que no están en contacto con las CDRs en las cadenas pesada y ligera de anti-y-IFN humanizadas pueden acomodar substituciones de aminoácidos de las posiciones correspondientes del anticuerpo EU humano, de otros anticuerpos humanos, del anticuerpo AF2 de ratón, o de otros anticuerpos de ratón, sin pérdida significativa de la afinidad o no inmunogenicidad del anticuerpo humanizado.

Se pueden seleccionar varios aminoácidos a lternativos para producir versiones de anti-y-I F N humanizado que tienen combinaciones variables de afinidad, especificidad, no inmunogenecidad, facilidad de fabricación y otras propiedades deseables. As í, se ofrecen los ejemplos a manera d e ilustración , no de limitación . Para la construcción de ge nes para los anticuerpos humanizados, se seleccionaron secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de prote ínas de las cadenas pesada y ligera humanizadas, más secuencias de señal de inmunog lobulina típicas, utilizando generalmente codones encontrad os en las secuencia de ratón. SeN cambiaron varios codones degenerados para crear sitios de restricción o para remover los indeseables. Las secuencias de nucleótidos incluyeron también las mismas señales de donador dividido usadas en los genes quiméricos y un sitio Xba l en cada extremo. Se construyeron ciertos genes a partir de cuatro oligonucleótidos sintéticos traslapantes. Para cada gen de dominio variable, se sintetizaron dos pares de oligonucleótidos traslapantes en hebras alternantes que abarcaron las secuencias de codificación enteras así como el péptido de señal y la señal de donador dividido. Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador Applied Biosystems 380B DNA . Cada oligo fue de aproximadamente 1 10-1 40 ba ses de longitud con aproximadamen te un traslape de 1 5 bases . Se sintetizaron fragmentos de D NA de d oble hebra con polimerasa Klenow de cada par de oligonucleótidos, digeridos con enzimas de restricción, ligados al vector pUC18 y secuenciados. Los fragmentos con las medias secuencias correctas respectivamente se ligaron entonces a los sitios Xbal de los vectores de expresión pVg -dhfr o pVk en las orientaciones apropiadas para producir los genes completos de cadenas pesadas y ligeras. Ciertos de los genes para las variantes de AF2 humanizado fueron generados mediante mutagenesis de PCR de genes previos. Los plásmidos de cadena pesada y cadena ligera fueron transfectados en células de mieloma de ratón Sp2/0 mediante electroporación y las células seleccionadas para expresión de gpt. Los clones fueron revisados ensayando la producción de anticuerpos humanos en el sobrenadante de cultivo mediante ELISA, y el anticuerpo se purificó a partir de los clones de mejor producción. El anticuerpo se purificó pasando el sobrenadante de cultivo en tejido sobre una columna de proteína estafilococcal A-Sepharose CL-4B (Farmacia). El anticuerpo pegado se eluyó con 0.2 M de glicina-HCI, pH 3.0 y se neutralizó con Tris 1 M pH 8.0. el amortiguador se intercambió a PBS pasando sobre una columna de PD10 (Farmacia) o por diálisis. 2. Ensayo para Actividad de Neutralización Contra y-IFN La ?-IFN incrementa el nivel de expresión de moléculas de MHC en líneas de células responsables. La Hs294T es una línea de células de melanoma humano que regula la cantidad de moléculas clase II de MHC expresadas en la superficie cuando se incuban con ?-IFN durante 48-72 horas. (Zarniecki et al., J. Immunology, 140, 4217-4223 (1988)). Este incremento puede ser detectado usando un anticuerpo monoclonal específico para la molécula regulada e inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo subsecuente. Un anticuerpo puede ser ensayado para actividad de neutralización de ?-IFN midiendo si el anticuerpo inhibe la regulación de moléculas de clase II de MHC en esta línea de células. La ?-IFN para uso en el ensayo se compró de R&D Systems, 614 McKinley Place, N. E., Minneapolis, MN 55413. Se agregaron concentraciones crecientes de anticuerpo a una cantidad fija de ?-IFN que habían sido mostradas previamente para regular el nivel de moléculas de clase II de MHC en células HS294T. Las células fueron incubadas durante 48-72 horas con la mezcla de anticuerpo-y-IFN y se examinaron para el nivel moléculas de clase II de MHC mediante inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo monoclonal de ratón específico para moléculas de clase II de MHC humanas. El análisis por citometría de flujo permitió la determinación de la intensidad media de fluorescencia de la población de células, el cual se gráfico después contra la concentración de anticuerpos para mostrar la capacidad neutralizante del anticuerpo. Como se ve en la Figura 4, HuZAF tiene actividad neutralizante significativamente mejor que haf25, es decir substituciones en posiciones H 1 1 y H38 mejoraron la actividad de neutralización. HuXAF tuvo también mejor actividad neutralizante que haf25, lo que indica que las substituciones en h 1 1 solas hicieron una importante contribución para la actividad neutralizante.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Una inmunoglobulina humanizada, la cual es una versión humanizada de la inmunoglobulina AF2 de ratón que tiene una región variable de cadena ligera designada SEQ ID No:2 y una región variable de cadena pesada designada SEQ ID No:4, la inmunoglobulina humanizada que comprende cadenas pesadas y ligeras humanizadas, siempre que la posición 11 del marco de región variable de cadena pesada humanizada sea ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la región variable de cadena pesada AF2 de ratón.
2. 2. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1, que comprende CDRs de la inmunoglobulina AF2 de ratón y marcos de región variable de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina EU humana.
3. 3. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 2, además siempre que la posición H38 sea ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena pesada AF2 de ratón.
4. 4. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 2, además siempre que las posiciones H11, H27, H28, H30, H38, H48, H67, H68, H70, H72, H74, H93, H95, H98, H107, H1Q8, H109, H111 sean ocupadas por el aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena pesada de AF2 de ratón, posiciones L48 y L70 sean ocupadas por el aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena ligera de AF2 de ratón, y la posición L63 sea ocupada por el aminoácido presente en la posición equivalente de una secuencia de consenso de cadenas ligeras de inmunoglobulinas humanas.
5. 5. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1, que se une específicamente a ?-IFN humano con una afinidad constante en cuatro veces de la afinidad del anticuerpo AF2 de ratón.
6. 6. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1, que se pega específicamente a ?-IFN que comprende una cadena ligera madura humanizada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la cadena ligera madura de SEQ ID No:6, y una cadena pesada madura humanizada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la cadena pesada madura de SEQ ID No:8.
7. 7. La inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende dos dímeros de cadena ligera/cadena pesada.
8. 8. La inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1, que es de isotipo lgG1.
9. 9. La inmunoglobulina humanizada de acuerdo con la reivindicación 1, la cual se purifica hasta por lo menos 95% de homogeneidad.
10. 10. Una inmunoglobulina humanizada que comprende una región variable de cadena pesada madura designada SEQ ID No:6 y una región variable de cadena ligera madura designada SEQ ID No:8
11. 11. Una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1 ó 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Un método para tratar un paciente que sufre de una respuesta inmune perjudicial, que comprende administrar una dosificación terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 1 ó 10.
13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde el paciente está sufriendo de una enfermedad autoinmune.