CN107412756A - 李斯特菌疫苗载体用于在寄生虫感染的个体中扭转免疫无应答的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用李斯特菌疫苗载体在具有持续Th2免疫应答谱的对象中诱导Th1免疫应答的方法。

Description

李斯特菌疫苗载体用于在寄生虫感染的个体中扭转免疫无应 答的用途

本申请为申请日为2011年10月3日、申请号为201180057899.5、发明名称为“李斯特菌疫苗载体用于在寄生虫感染的个体中扭转免疫无应答的用途”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

此申请要求提交于2010年10月1日的美国临时申请号61/388,822和提交于2010年11月3日的美国临时申请号61/409,730的优先权。这些申请通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及在由于持续的寄生虫感染而具有持续的Th2免疫应答谱的对象中使用李斯特菌(Listeria)疫苗载体诱导Th1免疫应答。

发明背景

在全世界许多人口中，疟疾、TB和HIV-1仍是巨大的疾病负担。尽管经过数十年的努力，仍然没有用于疟疾或HIV-1的疫苗。撒哈拉以南的人口将是从疟疾、TB和HIV-1疫苗中最受益的。在撒哈拉以南的国家中，大多数个体都感染有一或多种寄生虫(在非洲的许多地区超90％的流行度)，其压制免疫应答、令人或动物宿主的免疫系统倾向于(skew)T-辅助2型(Th2)，并且压制疫苗特异性应答。因此，寄生虫感染的人群存在对疫苗不产生所需免疫应答的潜在可能，所述疫苗设计为驱动Th1型和细胞毒性T细胞应答。之前的工作已显示，除非在疫苗接种前消除寄生虫感染，用于HIV-1的裸露DNA疫苗不能产生抗原特异性T细胞介导的免疫应答(Da'dara等人，Vaccine.2010Feb 3；28(5):1310-7.Epub 2009Nov 24，通过引用以其整体并入本文)。

HIV和其它流行性传染疾病的疫苗开发对发展中国家显然是重要的，所述疫苗开发是为了找到将在寄生虫感染的受体中驱动显著的疫苗特异性Th1免疫应答的疫苗。

发明概述

一方面，本发明涉及在具有持续Th2表型谱的对象中诱导Th1免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤。

另一方面，本发明涉及在具有持续Th2表型谱的对象中诱导针对传染病的Th1免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤，其中李斯特菌疫苗载体表达并分泌与另外的免疫原性多肽融合的传染病抗原，从而在所述对象中诱导Th1免疫应答。

一方面，本发明涉及治疗具有持续Th2表型谱的对象中的传染病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤，其中所述李斯特菌疫苗载体表达并分泌与另外的免疫原性多肽融合的传染病抗原，从而在所述对象中治疗所述传染疾病。

另一方面，本发明涉及治疗具有持续Th2表型谱的对象中的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，其中所述疫苗将Th2表型转变为Th1表型，其允许细胞介导的抗癌应答发生。

附图简述

说明书中特别指出并明确地主张了本发明所考虑的主题。然而，在阅读所附附图时通过参考下列详细描述可最好地理解本发明：

图1显示了实验概要，其中令6-8周龄雌性Balb/c小鼠保持天然(naive)或通过腹腔注射50尾蚴(cercariae)曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)感染。在10周时通过ELISA检测抗血吸虫可溶性卵抗原(SEA)的循环抗体证实感染。感染后12周，小鼠通过腹腔注射0.2(或0.1)LD50的李斯特菌-载体HIV-1疫苗(Lm-gag)或李斯特菌-载体HPV疫苗(Lm-E7)对照初免(prime)或保持未疫苗接种。初免后2周以相同的方式加强疫苗接种小鼠。如所示地，最终疫苗接种(wplv)后的2周或更多周评估疫苗反应。

图2显示了血吸虫感染并疫苗接种的小鼠中宿主Th2偏好性的验证。蠕虫感染的、李斯特菌HIV-1疫苗接种的小鼠为Th2偏好的并且为免疫压制的，如由IFN-γ产物降低以及IL-4和IL-10水平升高所表明的那样。感染后10-12周，疫苗接种小鼠。在最终疫苗接种后2周，收集脾细胞并按每孔1.5x 10⁶个细胞将其放置于含培养基、SEA或伴刀豆球蛋白A(作为阳性对照)的48孔平板中。孵育72小时后，收集上清并通过ELISA(BD)分析IFN-g(A)、IL-4(B)和IL-10(C)的水平。显示了来自2次重复实验的合并数据。

图3显示了在曼氏血吸虫感染的小鼠中IFN-γ产物减少。

图4显示了在慢性血吸虫病小鼠中IL-4水平增加。

图5显示了在曼氏血吸虫感染的小鼠中IL-10产物增加。

图6显示了血吸虫感染不改变针对免疫显性CTL和辅助表位的抗原特异性疫苗应答。

图7显示，向蠕虫寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠施用李斯特菌载体HIV-1gag疫苗可驱动显著的针对HIV-1gag CTL和T辅助表位的免疫应答。使用IFN-γELISPOT测定比较每百万个来自用李斯特菌载体HIV-1gag疫苗免疫的(曼氏血吸虫感染或未感染的)小鼠细胞与未接种的对照中的产IFN-γCD8+T细胞数目(平均值±标准误差)。在最终疫苗接种后2周收获来自小鼠个体(4个小鼠/组)的脾细胞，并用HIV-1IIIB gag的H2-d-限制性免疫显性CTL和辅助肽刺激20小时。在用RPMI刺激的细胞中没有检测到斑点。

图8表明，按初免-加强方案向蠕虫寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠口服以及腹腔注射施用李斯特菌载体HIV-1gag疫苗，将驱动显著的针对HIV-1gag CTL和T辅助表位的免疫应答。

图9的数据表明，向蠕虫寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠施用李斯特菌载体HIV-1gag疫苗，将驱动显著和特异的针对HIV-1gag CTL和T辅助表位但不针对无关抗原的免疫应答。所有的组显示出对conA显著的免疫应答，其起阳性对照的作用。

图10的数据表明，向蠕虫寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠施用李斯特菌载体HIV-1gag疫苗，将驱动显著和特异的针对HIV-1gag CTL和T辅助表位但不针对培养基(负对照)也不针对env-c肽的免疫应答。所有的组显示出对conA显著的免疫应答，其起阳性对照的作用。

图11显示了在慢性蠕虫感染期间可诱导针对免疫显性CTL和辅助表位的抗原特异性疫苗反应的李斯特菌载体HIV-1疫苗。在最终疫苗接种后2周，收获脾细胞并以每孔30万和15万个细胞将其放置于存在培养基、特异性CTL肽、无关肽、特异性辅助肽或con A(作为阳性对照)的IFN-γ ELISpot平板中。孵育20小时后，进行ELISpot(BD)，使用免疫斑点分析仪(C.T.L.)计数，并按每百万脾细胞的CTL(蓝色)或辅助(红色)免疫显性表位斑点数作图。对所有组，脾细胞对培养基和无关肽NP无应答，然而对阳性对照conA应答(数据未显示)。数据包括三个独立的实验。绘制了平均值±标准误差(A)或独立数据点(B)。每组动物的总数示于柱上方(左上)。当使用t检验分析比较Lm-gag±的血吸虫病时，没有观察到显著的差异(P<0.05)。

图12显示了不同疫苗剂量和治疗方案不改变对免疫显性表位的疫苗反应。实验细节与图1和3相似，此处描述了不同。对患有慢性血吸虫病的动物的接种，疫苗剂量可低至0.1LD50(标记为0.1)，或者可改变时间表取消加强，结果为仅初免的接种策略(标记为P，仅初免的)。按平均值±标准误差将针对CTL(A)和辅助(B)表位的应答作图。每组动物的总数示于CTL图的柱上方。在对CTL表位(A)的应答中，在响应组之间没有观察到显著差异。当使用t检验分析比较响应组时，*p<0.05，**p<0.01。

图13显示了细胞介导的免疫应答是持久的并不被预先存在的慢性寄生虫感染改变。在最终疫苗接种后的不同时间处死小鼠，并显示了未感染的(绿色)或血吸虫感染的(橙色)小鼠对免疫显性CTL(A)和辅助(B)表位的应答。在效应细胞对免疫显性CTL表位(A)的应答中，当用t检验分析比较每个时间点±血吸虫病时，没有发现显著的差异(p<0.05)，表明对疫苗的效应细胞应答在组间是不随时间变化的。当用t检验分析比较每个时间点±血吸虫病时，对辅助表位(B)的Th1应答，*p<0.05和**p<0.01。

图14在存在血吸虫感染的情况下产生了抗原特异性CD8+T细胞并以与未感染可比的水平持续数月。为了验证在得自抗原特异性CD8+T细胞的ELISpot结果中见到的IFN-γ应答，在最终疫苗接种后2(圆圈)和14(方框)周，通过流式细胞术分析脾细胞对疫苗表位的分子特异性。通过CD8和gag四聚体染色脾细胞，获得并分析CD8+群体中四聚体阳性染色的活细胞。显示了代表性的数据(A)并绘制了独立的数据点(B)。使用t检验分析在给定时间点组之间比较时没有发现显著的差异(p<0.05)，然而在疫苗接种组内比较时**p<0.01和***p<0.001。

图15显示，HIV-1疫苗诱导免疫记忆。中心记忆T细胞在接种后若干个月提高，在该时间血吸虫感染的组中存在差异。在最终疫苗接种后2(圆圈)和14(方框)周，通过流式细胞术分析脾细胞的免疫记忆。通过CD62L、CD197、CD8和gag四聚体染色脾细胞。获得并分析活细胞的中心记忆(CD62L+CD197+)、效应记忆(CD62L-CD197-)和分子特异性(CD8+四聚体+)。因为没有使用CD44，效应记忆空间(compartment)也包括效应细胞，并因此没有绘制于这些结果中。然而，在最终疫苗接种后14周，所有四聚体+细胞为中心记忆(数据未显示)。绘制了独立的数据点。当使用t检验分析在组间或组内比较时，#p<0.0001。

图16显示，HIV-1疫苗在Th2环境中诱导功能性效应细胞。为了分析效应细胞功能，进行了体内CTL测定。简言之，将1x 10⁶靶细胞(用特异或无关肽脉冲处理，分别染为绿色或紫色)静脉注射入疫苗接种的动物中。体内杀伤过夜后，通过流式细胞术收集并分析脾细胞的靶回收率。(A)体内CTL测定的图形表示。(B)通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和Bonferroni分析并绘制疫苗接种组的特异性杀伤。如果<100个靶回收，从分析中移除数据点。*p<0.05，***p＝0.001。在Lm-gag疫苗接种的患有或不患有慢性血吸虫病的组之间没有观察到显著的差异。

图17显示，所建立的HIV-1疫苗应答被随后的血吸虫感染改变。尽管对辅助肽的应答保持不变，早于血吸虫感染的疫苗接种引起CTL应答随着免疫系统转移至Th2偏好而减弱。实验设置的概要示于(A)。简言之，6-8周龄的雌性Balb/c小鼠用0.2LD50的李斯特菌载体HIV-1疫苗(Lm-gag)静脉注射初免或保持未疫苗接种。初免后2周以相同的方式加强疫苗接种小鼠。在最终疫苗接种后2周，通过腹腔注射50尾蚴曼氏血吸虫(橙色)感染小鼠或保持未感染(绿色)。在血吸虫感染后的不同的时间处死小鼠，并显示了对免疫显性CTL(B)和辅助(C)表位的应答。在CTL图(B)上对未感染的小鼠从每2个时间点移除一个过于阳性的离群值。使用t检验分析比较每个时间点±血吸虫，*p<0.05。

发明详述

关于Th1和Th2应答的起始，细胞因子被认为是关键因子[Paul,W.E.等人，Cell 76(1994)241-251]，而IL-4代表天然T辅助细胞分化为Th2细胞的决定性细胞因子信号。另一方面，Th1应答的起始基本上由树突细胞和其它附属细胞产生的IL-12和IFN-γ所控制。

IL-4或IL-12的早期产生和T细胞分化由外源和内源因子控制。外源因子中，病原体的性质是特别重要的。许多病原体优选刺激Th1，而其它的刺激Th2应答[Scott,P.等人，Immunol.Today 12(1991)346-348]。本领域众所周知的是，体内寄生虫压制免疫应答、使人和动物宿主的免疫系统倾向于T-辅助2型(Th2)，并且压制疫苗特异性应答。此外，免疫系统Th1臂(arm)的失败和过度活化的Th2臂涉及多种慢性疾病。这些包括AIDS、CFS、念珠菌病、多重过敏、多重化学物敏感症(MCS)、病毒性肝炎、海湾战争疾病、癌症和其它疾病。如果可通过刺激Th1和减弱Th2来平衡这两种免疫系统臂，然后许多与这些慢性疾病相关的症状将消除或消失，并且我们将发现免疫回复和平衡的答案或相当于治愈。因此，本发明的目的为提供方法，其在持续Th2谱个体中驱动疫苗特异性免疫应答，以使抗传染病的Th1型应答和细胞毒性T细胞应答成为可能。本发明另外的目的为提供方法，其在寄生虫感染的人群中驱动疫苗特异性免疫应答，以使抗HIV、抗肺结核和抗疟疾免疫应答成为可能。

在一个实施方案中，由本文提供的方法和组合物诱导的免疫应答为治疗性的免疫应答。在另一个实施方案中，其为预防性的免疫应答。在另一个实施方案中，其为与本领域可得的用于在感染(afflicted)本文提供的疾病的对象中诱导免疫应答的方法相比增强的免疫应答。在另一个实施方案中，免疫应答导致清除感染所述对象的传染病。

应理解本发明的方法可用于治疗任何传染病，其在一个实施方案中为细菌、病毒、微生物、微有机体、病原体或其组合的感染。在另一个实施方案中，本发明的方法用于在对象中抑制或压制细菌、病毒、微生物、微有机体、病原体感染或其组合。在另一个实施方案中，本发明提供了在对象中诱导针对细菌、病毒、微生物、微有机体、病原体感染或其组合的细胞毒性T细胞应答的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在无Th1应答的对象中诱导针对细菌、病毒、微生物、微有机体、病原体感染或其组合的Th1免疫应答的方法。在一个实施方案中，感染为病毒性的，其在一个实施方案中为HIV。在一个实施方案中，感染为细菌性的，其在一个实施方案中为分枝杆菌，在一个实施方案中为结核分枝杆菌。在一个实施方案中，感染为真核的，其在一个实施方案中为疟原虫、在一个实施方案中为疟疾。在一个实施方案中，本文提供的是在具有持续Th2表型谱的对象中诱导Th1免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤。在另一个实施方案中，李斯特菌疫苗载体表达并分泌与另外的免疫原性多肽融合的抗原，从而在对象中诱导Th1免疫应答。在一个实施方案中，本文还提供的是在具有持续Th2表型谱的对象中诱导针对传染病的Th1免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤，其中李斯特菌疫苗载体表达并分泌与另外的免疫原性多肽融合的传染病抗原，从而在对象中诱导Th1免疫应答。

在一个实施方案中，本文提供的是治疗具有持续Th2表型谱的对象中的传染病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体的步骤，其中李斯特菌疫苗载体表达并分泌了与另外的免疫原性多肽融合的传染病抗原，从而在对象中治疗所述传染病。

在一个实施方案中，本文还提供的是治疗具有持续Th2表型谱的对象中的癌症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的重组李斯特菌菌株的步骤，其中疫苗使Th2表型转变为Th1表型并且使细胞介导的抗癌应答发生。

在另一个实施方案中，李斯特菌菌株表达并分泌包含可操作地与另外的免疫原性多肽连接的来自癌症的抗原的融合蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还使癌症适于用另外的治疗方法治疗。在另一个实施方案中，另外的治疗方法为手术、化疗、放疗或其组合。

在一个实施方案中，本文提供的是在对象中治疗、压制或抑制至少一种肿瘤或癌症的方法，其包括向对象施用本文提供的重组李斯特菌菌株。在另一个实施方案中，肿瘤为前列腺肿瘤、脑肿瘤、肺肿瘤、胃肠肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、乳腺肿瘤或其组合。在另一个实施方案中，肿瘤为癌症，而在另一个实施方案中，癌症为转移性癌症。在另一个实施方案中，癌症为前列腺癌、脑癌、肺癌、胃肠癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、神经胶质瘤、结肠癌、乳腺癌或其组合，或本领域已知可在对象中产生Th2偏好的免疫应答的任何癌症。

在一个实施方案中，本文提供的癌症抗原可选自但不限于，前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)，其在一个实施方案中为FOLH1、HPV-E7、HPV-E6、SCCE、NY-ESO-1、PSMA、前列腺干细胞抗原(PSCA)、WT-1、HIV-1Gag、CEA、LMP-1、p53、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、Muc1EGFR-III、VEGF-R或任何其它癌症相关的抗原或任何其它与肿瘤免疫逃避或癌症抗性相关的抗原。在另一个实施方案中，抗原为HMW-MAA或其功能性片段。在另一个实施方案中，癌症抗原来自已知在患有癌症的对象中诱导Th2谱的癌症。

在一个实施方案中，引起Th2偏好应答的原因是蠕虫感染、寄生虫感染、传染病、激素治疗、慢性疲劳综合征(CFS)、过敏反应、海湾战争相关疾病、多重化学物敏感症(MCS)、给药方案、自身免疫疾病、化疗或其任何组合，或本领域已知的在对象中引起Th2偏好性免疫应答的疾病。

在一个实施方案中，本发明提供了在Th1不应答的具有伴随性寄生虫感染或蠕虫感染的对象中诱导Th1免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的本文提供的李斯特菌疫苗载体。

在另一个实施方案中，本发明提供了在Th1不应答的具有伴随性传染病和寄生虫感染的对象中诱导Th1免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体，其中李斯特菌疫苗载体表达并分泌传染病的抗原。

在另一个实施方案中，本发明提供了在Th1不应答的具有伴随传染病和寄生虫感染的对象中诱导Th1免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效剂量的李斯特菌疫苗载体，其中李斯特菌疫苗载体表达并分泌与另外的免疫原性多肽融合的传染病抗原。

在另一个实施方案中，本发明提供了在Th1不应答的具有寄生虫感染的对象中诱导针对传染病的Th1免疫应答，所述方法包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌了包含传染病抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在一个实施方案中，传染病由下述病原体的任何一种引起，包括但不限于：利什曼原虫、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)(其引起阿米巴病)、鞭虫、BCG/结核杆菌、疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头状瘤病毒、季节性流感、甲型H1N1流感病毒、麻疹和风疹、腮腺炎、A+C脑膜炎双球菌、口服脊髓灰质炎疫苗(单、双和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽杆菌(炭疽)、肉毒杆菌毒素(肉毒杆菌)、鼠疫杆菌(鼠疫)、重型天花(天花)和其他相关的痘病毒、土拉热弗朗西斯菌(兔热病)、病毒性出血发热、沙状病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳里托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒、裂谷热)、黄病毒(登革热)、丝状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、类鼻疽伯克氏菌、伯氏考克斯氏体(Q热)、布氏杆菌(布氏菌病)、鼻疽伯克氏菌(鼻疽)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、蓖麻毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、伤寒热(普氏立克次体)、其他立克次氏体、食物和水性病原体、细菌(病原性大肠杆菌、致病性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌BCG/、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎病毒、西尼罗河病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒、蜱出血热病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱媒脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头状瘤病毒(HPV))、原生动物(小球隐孢子虫、卡曼环孢子球虫、梨形鞭毛虫、溶组织内阿米巴、弓形虫)、真菌(微孢子虫)、黄热病毒、结核杆菌(包括耐药结核杆菌)、狂犬病毒、朊病毒、急性重症呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、posadasii球孢子菌、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病双球菌、梅毒螺旋体、阴道毛滴虫或本文未列出的任何本领域已知的其它传染病。

在一个实施方案中，病原性原生动物和蠕虫感染包括：阿米巴虫；疟原虫；利什曼原虫；锥虫；弓形虫；卡氏肺囊虫；巴贝斯虫；贾第虫；旋毛虫；丝虫；血吸虫；线虫；囊化幼虫吸虫或吸虫；和正绦虫(绦虫)感染。

在另一个实施方案中，传染病为家畜传染病。在另一个实施方案中，家畜疾病可转移至人并称为“人畜共患疾病”。在另一个实施方案中，这些疾病包括但不限于，手足口病、西尼罗河病毒病、狂犬病、犬细小病毒病、猫白血病毒、马流感病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)、伪狂犬病、猪瘟(CSF)、由牛感染I型牛疱疹病毒引起的IBR、和猪中的伪狂犬病(奥耶斯基氏病)、弓形虫病、炭疽病、水泡性口炎病毒、马红球菌病、兔热病、瘟疫(鼠疫杆菌)、滴虫病。

在一个实施方案中，本发明提供了在Th1不应答的患有寄生虫感染的对象中治疗传染病的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含传染病抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白质，从而在所述Th1不应答的对象中治疗传染病。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在一个实施方案中，“Th1不应答”或“持续Th2”的对象为其中Th1免疫应答缺陷、缺失或由于寄生虫感染被抑制的对象。在另一个实施方案中，所述术语指对象，其中Th2应答非排他性地存在于对象中，但比Th1应答在对象中占优势。在另一个实施方案中，所述术语指对象，其中Th2应答非排他地存在于对象中并且不存在Th1应答的指征(即细胞因子、趋化因子或其它已知标记物)。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有寄生虫感染的Th1无应答对象中的传染病的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而治疗所述Th1无应答对象中的传染病。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有寄生虫感染的Th1无应答对象中的人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而治疗所述Th1无应答的对象中的HIV感染。

在一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中压制传染病的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含传染病抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中压制传染病。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中压制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中压制HIV感染。

在一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中抑制传染病的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含传染病抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中抑制传染病。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中抑制HIV感染。

在一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中引起针对传染病的细胞毒性T细胞应答的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含传染病抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中抑制传染病。在另一个实施方案中，传染病为寄生虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的对象中引起针对人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的细胞毒性T细胞应答的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述对象中引起细胞毒性T细胞应答。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有寄生虫感染的Th1无应答对象中的病毒感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含病毒抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而治疗所述Th1无应答对象中的病毒感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中压制病毒感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含病毒抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中压制病毒感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的对象中抑制病毒感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含HIV抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述对象中抑制病毒感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中引起针对病毒感染的细胞毒性T细胞应答的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所属菌株表达并分泌包含病毒抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中引起细胞毒性T细胞应答。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有另外的寄生虫感染的Th1无应答对象中的疟原虫感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含疟原虫抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而治疗所述Th1无应答对象中疟原虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有另外的寄生虫感染的Th1无应答对象中压制疟原虫感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含疟原虫抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答对象中压制疟疾感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有另外的寄生虫感染的Th1无应答对象中抑制疟原虫感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含疟原虫抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答对象中抑制疟原虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有另外的寄生虫感染的Th1无应答对象中引起针对疟原虫感染的细胞毒性T细胞应答的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含疟原虫抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在所述Th1无应答的对象中引起细胞毒性T细胞应答。

在一个实施方案中，向患有寄生虫感染的Th1无应答对象施用重组李斯特菌使得可以产生记忆性免疫应答。在另一个实施方案中，所述应答为记忆性T细胞应答。在另一个实施方案中，所述应答为记忆性B细胞应答。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有寄生虫感染的Th1无应答对象中的结核(tuberculosis)感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的过程，所述菌株表达并分泌包含结核抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而治疗所述Th1无应答对象中的所述结核感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中压制结核感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的过程，所述菌株表达并分泌包含结核抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在Th1无应答对象中压制所述结核感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中抑制结核感染的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的过程，所述菌株表达并分泌包含结核抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在Th1无应答对象中抑制所述结核感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了在患有寄生虫感染的Th1无应答对象中引起针对结核感染的细胞毒性T细胞应答的方法，其包括向寄生虫感染的对象施用包含重组李斯特菌菌株的疫苗的步骤，所述菌株表达并分泌包含结核抗原和另外的免疫原性多肽的融合蛋白，从而在Th1无应答的对象中引起所述细胞毒性T细胞应答。

在一个实施方案中，单独地向对象施用本发明的疫苗或免疫原性组合物。在另一个实施方案中，本发明的疫苗或免疫原性组合物与另一种抗寄生虫治疗一起实施。每种可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，疫苗的施用方法是本领域众所周知的，包括但不限于口服施用、胃肠外施用、静脉注射(IV)施用、鼻腔施用或腹腔注射(IP)施用。

在另一个实施方案中，另外的免疫原性多肽为李斯特菌素O(LLO)多肽、ActA多肽或PEST序列。而在另一个实施方案中，LLO多肽包含来自野生型李斯特菌蛋白的信号序列。

在另一个实施方案中，重组李斯特菌菌株为单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)菌株。

在一个实施方案中，本发明的方法用于治疗HIV或其它微生物感染。在另一个实施方案中，所述其它微生物感染为结核病。在另一个实施方案中，其为疟疾。在另一个实施方案中，其为甲型、乙型或丙型肝炎，在另一个实施方案中，其为流感。

在一个实施方案中，术语“治疗”、“治疗性的”、“疗法”在本文中可互换使用并指治疗性治疗，而“抑制(inhibiting)”和“压制(suppressing)”指预防性或预防手段，其中目的是阻止或减轻所靶向的如上文描述的病原性疾病或紊乱。因此，在一个实施方案中，治疗可能包括直接影响或治愈疾病、紊乱或疾病和/或相关症状，而压制或抑制可能包括预防疾病、紊乱或疾病，减弱其严重程度，延迟其发作，减弱与其相关的症状，或其组合。因此，在一个实施方案中，“治疗”尤其指延迟发展、加速缓解、诱导缓解、放大缓解、加速恢复、提高替代治疗的效率或降低其耐受性，或其组合。在一个实施方案中，“预防(prophylaxis)”、“预防性”、“预防(preventing)”或“抑制”尤其指延迟症状发作、防止疾病复发、降低复发发病的数目或频率、提高症状发病之间的潜伏期，或其组合。在一个实施方案中，“压制”尤其指降低症状严重程度、降低急性发病的严重程度、降低症状的数量、降低与疾病相关的症状的发生率、降低症状的潜伏期、改善症状、减少继发症状、减少继发性感染、延长患者存活时间，或其组合。

在一个实施方案中，症状为原发的，而在另一个实施方案中，症状为继发的。在一个实施方案中，“原发”指症状为对象病毒感染的直接结果，而在一个实施方案中，“继发”指症状源自原发性原因或由其引起。在一个实施方案中，本发明所用的的组合物和菌株可治疗原发或继发症状，或与HIV或其它微生物感染相关的继发性并发症。

在另一个实施方案中，“症状”可为任何疾病或病理状况的表现，包括炎症、肿胀、咳痰、发热、疼痛、出血、瘙痒、流涕、咳嗽、头痛、偏头痛、呼吸困难、虚弱、乏力、嗜睡、消瘦、恶心、呕吐、便秘、腹泻、肢体麻木、头晕、视力模糊、肌肉抽搐、惊厥等等，或其组合。

在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为发烧。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为头痛。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为颈部僵硬。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为癫痫发作。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为局部瘫痪。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为麻痹。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为昏迷。在另一个实施方案中，所述疾病、紊乱或症状为本领域已知与病原体介导的脑炎相关的或其继发的任何其它疾病、紊乱或症状。

HIV诱导持续性和进行性感染，其在绝大多数病例中导致发展为获得性免疫缺乏综合征(“AIDS”)。至少存在2种不同的HIV类型：HIV-1和HIV-2。HIV感染导致免疫缺陷、机会性感染、神经系统功能障碍、肿瘤生长，和最终死亡。HIV的RNA基因组由至少7个结构标记物(LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS)和编码了19个蛋白质的9个基因(gag、pol、和env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu，和有时第10个tev，其为融合的tat、env和rev)组成。这些基因中的3个(gag、pol和env)包含制造新病毒颗粒结构蛋白质所需的信息。例如，env编码了叫做gp160的蛋白质，其被病毒酶打断形成gp120和gp41。剩下的6个基因，tat、rev、nef、vif、vpr和vpu(或在HIV-2中为vpx)是蛋白调控基因，其控制了HIV感染细胞、产生新病毒拷贝(复制)或致病的能力。2个Tat蛋白质(p16和p14)为LTR启动子的转录反式活化因子，其通过TARRNA元件的结合活化。TAR还可能被加工为调控凋亡基因ERCC1和IER3的microRNA。Rev蛋白(p19)涉及通过与RRE RNA元件结合而令RNA穿梭于细胞核和细胞质。Vif蛋白(p23)阻止APOBEC3G(令DNA:RNA杂交体脱氨基和/或干扰Pol蛋白的细胞蛋白质)作用。Vpr蛋白(p14)将细胞分裂捕获在G2/M期。Nef蛋白(p27)下调CD4(主要的病毒受体)，以及I类和II类MHC分子。

Nef还与SH3结构域相互作用。Vpu蛋白(p16)影响新病毒颗粒从感染的细胞的释放。每条HIV RNA链的末端包含叫做长末端重复(LTR)的RNA序列。LTR中的区域作为控制新病毒的产生的开关起作用，并可由来自HIV或宿主细胞的蛋白质触发。Psi元件涉及病毒基因组包装并可由Gag和Rev蛋白质识别。SLIP元件(TTTTTT)涉及制造功能性Pol所需要的Gag-Pol的读码框移位。http://en.wikipedia.org/wiki/HIV–cite note-compendia-50

HIV使用受体介导的通路感染宿主细胞。HIV要求与两个细胞表面受体相连以进入细胞并起始感染；CD4为主要的受体。CXCR4(“X4”)和CCR5(“R5”)，趋化因子受体蛋白家族的成员，是历来被分别称为嗜T细胞系或巨噬细胞的HIV株的次级共受体。CXCR4或CCR5，与CD4细胞一起形成了某些HIV株进入细胞的功能性细胞受体。

用于插入这些载体的HIV抗原编码DNA为任何已知防御逆转录病毒的有效抗原。这些可包括结构或非结构性蛋白质。包膜、聚合酶、gag和蛋白酶为优选的蛋白质或表位来源，但是也可采用其它蛋白质或表位，包括由非结构基因编码的那些蛋白质，例如rev、tat、nef、vif和vpr。对HIV，可插入到病毒载体的核酸包括但不限于，可编码下述至少一种的核酸：HIV1gag(+pro)(IIIB)、gp120(MN)(+跨膜)、nef(BRU)CTL、pol(IIIB)CTL、ELDKWA或LDKW表位、优选HIV1gag(+pro)(IIIB)、gp120(MN)(+跨膜)、两种(2)nef(BRU)CTL和三种pol(IIIB)CTL表位；或gp120V3中的两种ELDKWA或gp160中的另一个区域。两种nef(BRU)CTL和三种pol(IIIB)CTL表位优选CTL1、CTL2、pol1、pol2和pol3。在上文列表中，抗原所来源的病毒株在括号中标出。HIV和其抗原(包括HIV-gag)为本领域众所周知的(见例如，美国专利7,790,177和7,786,288，其通过引用以其整体并入本文)。本文所提供的方法预期所用的HIV-gag抗原包括本领域已知的可在Genbank和类似数据库中搜索的那些，例如包括但不限于，访问号ADG95996、CBI61237,CBI61236、CBI61235、CBI61234、CBI61233、CBI61232、CBI61231、CBI61230、CBI61229、CBI61228、CBI61227、CBI61226、CBI61225、CBI61224、CBI61223、CBI61222、CBI61221、CBI61220、CBI61219、CBI61218、CBI61217、CBI61216、CBI61215、CBI61214、CBI61213、CBI61212、CBI61211、CBI6121O、CBI61209、CBI61208、CBI61207、CBI61206、CBI61205、CBI61204、CBI61203、CBI61202、CBI61201、CBI61200、CBI61199、CBI61198、CBI61197、CBI61196、CBI61195、CBI61194、CBI61193、CBI61192、CBI61191、CBI61190、CBI61189、CBI61188、CBI61187、CBI61186、CBI61185、CBI61184、CBI61183、CBI61182。本文所提供的方法预期所用的HIV-pol抗原包括本领域已知的可在Genbank和类似数据库中搜索到的那些，例如包括但不限于，访问号AAF35355、BAF32553、BAF32544、BAF32535.1、BAF32526、BAF32517、BAF32508、BAF32499、BAF32490、BAF32481、BAF32472、BAF32463、BAF32454、BAF32445、BAF32436、BAF32427、BAF32418、BAF32409、BAF32400、BAF32391、BAF32382、BAF32373、BAF32364、BAF32355、BAF32346、BAF32337、BAF32328、BAF32319、BAF3231O、BAF32301。本文所提供的方法预期所用的HIV-env抗原包括本领域已知的可在Genbank和类似数据库中搜索到的那些，例如包括但不限于，访问号AAB09538,CAA00873、AAF35356、AAD42280、AAD42279、AAD42278、AAD42277、AAD42276、AAD42275、AAD42274、AAD42273、AAD42272、AAD42271、AAD42270、AAD42269、AAD42268、AAD42267、AAD42266、AAD42265、AAD42264、AAD42263、AAD42262、AAD42261、AAD42260、AAA53206、BAF32559、BAF32550、BAF32541、BAF32532、BAF32523。

确定HIV感染存在的方法为本领域众所周知的，其尤其包括在血清、唾液、尿液，或其组合中检测HIV抗体、抗原或核酸。确定HIV感染的严重程度的方法为本领域众所周知的，其尤其包括测量病毒载量或CD4下降。每种方法代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，本发明的方法包括治疗HIV感染继发性并发症。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗机会性感染、肿瘤、神经系统异常或进行性免疫系统恶化。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗获得性免疫缺乏综合征(AIDS)。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗CD4+T淋巴细胞数目下降。

在另一个实施方案中，方法包括治疗通过直接性接触(同性或异性的)；通过血液或血液制品；或从感染的母亲到婴儿(分娩、围产期或通过母乳)传播的HIV。

在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗HIV或通过人畜共患传播获得的相关感染。在一个实施方案中，治疗感染的方法包括治疗进化枝(Clade)A、B、C、D、A/E、F、G、H、J、或K。在另一个实施方案中，感染由HIV-1介导，而在另一个实施方案中，其为HIV-2介导的。在一个实施方案中，它由M组HIV-1所介导，在另一个实施方案中，其由O组HIV-1所介导，而在另一个实施方案中，其由N组HIV-1所介导。在一个实施方案中，其由M组HIV-1的A进化枝(或亚型)所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的B进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的C进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的D进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的A/E进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的F进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的G进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的H进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的J进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的K进化枝所介导，在另一个实施方案中，其由M组HIV-1的A/G/I进化枝所介导，而在另一个实施方案中，其由任何上述进化枝的循环重组形式(CRF)所介导。将HIV株分类为亚型和CRF是复杂的事，并且其定义随着完成新发现而改变。因此，本发明涵盖了本领域已发现或已知的任何HIV亚型。

在一个实施方案中，治疗感染的方法包括治疗嗜巨噬细胞的HIV株、嗜T细胞的HIV株，或其任何组合。在一个实施方案中，本发明的方法将治疗由嗜巨噬细胞HIV株介导的感染。在另一个实施方案中，所述化合物将治疗嗜T细胞HIV株所介导的感染。在另一个实施方案中，所述化合物将治疗由嗜巨噬细胞HIV株、嗜T细胞HIV株，或两者所介导的感染。在另一个实施方案中，基于HIV嗜性，本发明的方法作用的机制不同。在一个实施方案中，本发明的方法可用于在被诊断感染有HIV的对象中治疗、抑制或压制HIV。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在没有被诊断感染有HIV的对象中治疗、抑制或压制HIV。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在暴露于HIV的对象中治疗、抑制或压制HIV。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在窗口期对象中治疗、抑制或压制HIV，在一个实施方案中，其为暴露于HIV与产生足以使用标准HIV测试检测到HIV抗体免疫应答之间的时期。

在一个实施方案中，本发明的用于治疗HIV感染的方法可与本领域已知的其它治疗HIV感染的方法一起使用，并可提高其它治疗方法的功效。在一个实施方案中，治疗HIV感染的方法为施用抗逆转录病毒药物或抗逆转录病毒药物的组合。

在一个实施方案中，当前治疗、抑制或压制HIV的方法为高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)，在一个实施方案中，其为由属于至少两种类型或“类别”的抗逆转录病毒制剂的至少3种药物组成的组合物(或“鸡尾酒”)。

在一个实施方案中，当前治疗、抑制或压制HIV的方法为施用核苷酸类似物反转录酶抑制剂(NARTI或NRTI)、蛋白酶抑制剂、非核苷酸反转录酶抑制剂(NNRTI)或其组合。在另一个实施方案中，当前治疗、抑制或压制HIV的方法为施用进入抑制剂(entry inhibitor)。在另一个实施方案中，当前治疗、抑制或压制HIV的方法为施用HIV疫苗。

在一个实施方案中，传染病为利什曼病，由利什曼属的寄生虫引起的，并在非洲、亚洲和南美洲的许多地区是特有的。其由沙蝇或白蛉(Phlebotimus)物种传播。利士曼原虫引起3种类型的疾病，即内脏利什曼病(由杜氏利士曼原虫(L.d.donovani)、婴儿利士曼原虫(L.d.infantum)、恰加斯利士曼原虫(L.d chagasi)引起)、皮肤利什曼病(由热带利士曼原虫(L.tropica)、硕大利士曼原虫(L.major)、埃塞俄比亚利士曼原虫(L.aethiopica)、墨西哥利士曼原虫(L.Mexicana)引起)和皮肤黏膜利什曼病(巴西利士曼原虫L.braziliensis复合体)。若干利士曼原虫抗原已用于诊断感染，这些包括但不限于利士曼原虫抗原(rH2A、KMP11和“Q”蛋白)。用于诊断利士曼原虫的方法包括那些在本领域中描述的方法，例如在Eur J Clin Microbiol Infect Dis.2004 Dec；23(12)：899-904和在Clinical and Diagnostic Laboratory hnmunology，October 2005，1164-1167页，Vol.12，No.10中，其每篇都以其整体并入本文。

在一个实施方案中，传染病为阿米巴病。阿米巴病是由遍布世界各地的溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)，一种原生动物所引起的。阿米巴病在人类粪便和食物与水供应之间的屏障不足的发展中国家最流行。溶组织阿米巴通过摄入原虫的囊虫形式(传染期)而传播。囊虫在环境中可存活数周至数月，其可在局部污染的土壤、肥料或水或在污染的处理食物的手上发现。粪口传播还可发生在肛门性行为中或通过结肠灌洗装置直接直肠接种。然后脱囊发生在回肠末端或结肠，导致滋养体(侵入形式)。滋养体可渗透和侵入结肠粘膜屏障，导致组织破坏、分泌型血性腹泻和结肠炎类似的炎性肠道疾病。另外，滋养体可通过门静脉循环散布至肝脏或甚至更远的器官。诊断阿米巴病的方法包括显微镜、体外培养和同工酶分析、粪便样品抗原检测、血清学(例如在血清中检测Gal/GalNAc凝集素抗原)、使用PCR的分子诊断、阿米巴肝脓肿，进一步的结肠镜检或乙状结肠镜检可用于诊断阿米巴结肠炎。

在一个实施方案中，传染病或寄生虫感染为鞭虫病。鞭虫病是由鞭形鞭虫(Trichuris trichiura)或毛首线虫属(Trichocephalus trichiuris)引起的，其为当感染人大肠时可引起鞭虫病的圆虫。鞭虫通过粪口途径传播，其幼虫在小肠内孵化，在那里它们成长和蜕皮，最终居留在大肠。此疾病可通过在粪便检查中检测虫卵诊断。虫卵将呈现桶状、未胚化的，具有双极栓(bipolar plugs)和光滑外壳。直肠脱垂可使用排便造影(proctogram)容易地诊断，其为许多成像寄生虫感染的方法中的一种。另外，乙状结肠镜检显示在发炎的粘膜上特征性白色成熟挂体(椰子蛋糕直肠)。

在一个实施方案中，寄生虫感染或传染疾病为恶性疟原虫(Plasmodiumjalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、柯氏卵形疟原虫(Plasmodium ovalecurtisi)、wallikeri氏卵形疟原虫(Plasmodium ovale wallikeri)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、巴西疟原虫(Plasmodiumbrasilianum)、食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi)、食蟹猴疟原虫巴氏亚种(Plasmodium cynomolgi bastianellii)、猪尾猴疟原虫(Plasmodium inui)、rhodiani氏疟原虫(Plasmodium rhodiani)、许氏疟原虫(Plasmodium schwetzi)、半卵疟原虫(Plasmodium semiovale)、吼猴疟原虫(Plasmodium simium)。在一个实施方案中，寄生虫感染为任何已知感染人类的疟原虫。

在一个实施方案中，本发明的方法可用于在被诊断患有疟疾的对象中治疗、抑制或压制疟疾。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在没有被诊断患有疟疾的对象中治疗、抑制或压制疟疾。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在接触疟原虫的对象中治疗、抑制或压制疟疾。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在窗口期对象中治疗、抑制或压制疟疾，在一个实施方案中，其为暴露于疟原虫与产生足以使用标准疟原虫测试检测到疟原虫抗体免疫应答之间的时期。

在一个实施方案中，疟疾的症状为：发热并发抖；整体状况差、感觉不舒服并具有流感病毒感染样头痛、腹泻、恶心和呕吐、乏力或其组合。在另一个实施方案中，疟疾的症状为：增加的困意、导致昏迷并与所有主要器官系统障碍相关的血压低(低血压)、肾衰竭、可能的大出血(出血)、影响肝脏(例如传染性黄疸)、休克、昏迷或其组合。在一个实施方案中，疟疾为脑型疟疾。在一个实施方案中，疟疾为黑水热。

在一个实施方案中，通过症状诊断、血膜的显微镜检查、抗原测试(其在一个实施方案中为恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶或恶性疟原虫(P.jalciparum)乳酸脱氢酶)或基于PeR测定例如QT-NASBA诊断疟疾。在一个实施方案中，在本发明的方法前，或在另一个实施方案中作为本发明方法的第一步，在患有另外的寄生虫感染的对象中诊断疟疾。

在一个实施方案中，本发明的方法所用的疫苗与已知的疟疾治疗或预防组合物一起使用，其在一个实施方案中包括甲氟喹(在一个实施方案中盐酸甲氟喹(Lariam))、多西环素、阿托伐醌与盐酸氯胍的组合物(在一个实施方案中为马拉隆)，或其组合的给药。在另一个实施方案中，疟疾治疗/预防可包括奎宁、奎纳克林、氯喹、伯氨喹啉或其组合的给药。

在一个实施方案中，本发明的方法所用的重组单核细胞增生李斯特菌包含疟疾抗原，其在一个实施方案中为任何本领域已知的疟疾抗原。在一个实施方案中，疟疾抗原是恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)CSP和子孢子表面蛋白2(称为PfSSP)；肝期抗原1(LSA1)、裂殖子表面蛋白1(MSP-1)、丝氨酸重复抗原和AMA-1；Pfs25；裂殖体输出蛋白；19次重复的子孢子表面蛋白[NANP]；共价结合于免疫原性肽的CSP，其在一个实施方案中所述免疫原性肽为纯化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)毒素，或在一个实施方案中所述免疫原性肽为来自乙型肝炎的表面抗原，或其组合。在另一个实施方案中，疟疾抗原为来自下述疫苗的一或多种抗原：SPf66；与纯化的铜绿假单胞菌毒素共价结合的重组(Asn-Ala-Pro15Asn-Val-Asp-Pro)2-Leu-Arg(R32LR)蛋白质；NYVAC-Pf7；[NANP]19-5.1；RTS,S,RTS,S/AS01；或其组合。

在一个实施方案中，感染为细菌性感染，其在另一个实施方案中为分枝杆菌，在一个实施方案中为结核杆菌。

在一个实施方案中，本发明的方法可用于在被诊断患有结核病的对象中治疗、抑制或压制结核。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在没有被诊断患有结核病的对象中治疗、抑制或压制结核。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在暴露于结核杆菌的对象中治疗、抑制或压制结核。在另一个实施方案中，本发明的方法可用于在窗口期对象中治疗、抑制或压制结核，在一个实施方案中，其为接触结核杆菌与产生足以使用标准结核测试检测到结核抗体免疫应答之间的时期。

在一个实施方案中，本发明的方法与确定结核感染的方法联合使用或在完成结核诊断后使用。在一个实施方案中，结核诊断来自在临床样品(例如痰或脓液)中鉴定到致病微生物(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))。在一个实施方案中，使用图像(X-射线或扫描)；结核菌素试验(在一个实施方案中，曼托试验)；检测细菌DNA的PCR测定；干扰素释放测定(IGRAs)(在一个实施方案中，ESAT-6响应性的，或抗原85a或85b响应性的)或其组合诊断结核病。

在一个实施方案中，减毒的活牛结核杆菌与本发明所用的疫苗一起使用。在一个实施方案中，卡介苗(BCG)疫苗与本发明所用的疫苗一起使用。在一个实施方案中，最经常用于结核病(TB)的诊断工具为简单皮试。

在另一个实施方案中，另一种结核病诊断工具为曼托试验，其中小量的叫做PPD结核菌素的物质注射入对象的前臂皮肤正下方。48-72小时内，专业医务人员检查对象的手臂在注射部位的肿胀，其暗示了对注射物质的反应。在一个实施方案中，鼓起的硬红色肿块(硬结)表明对象已经具有TB感染。肿块的大小决定了测试的结果是否显著，基于对象感染TB的风险因子。

然而，曼托试验是不完美的，由于在事实并非如此时假阳性测试表明对象具有TB。如果对象感染有与引起结核病的不同类型的分枝杆菌，或如果对象最近接种了卡介苗(BCG)疫苗，这是最可能发生的，此TB疫苗在美国很少使用，但在具有高TB感染率的国家是广泛使用的。另一方面，一些感染了TB的人(包括儿童、成年人和患有AIDS的人)对曼托试验可具有延迟的反应或无反应。

血液测试可用于确认或排除潜在的或活性TB。这些测试使用精良的技术来测量免疫系统对结核分枝杆菌的反应。这些测试比传统的皮试更快并更准确。如果你具高TB感染风险但具有曼托试验阴性反应，或你接受过BCG疫苗，它们可能是有用的。

对曼托试验具有很小反应或无反应可意味着对象没有感染TB细菌。但某些情况下，尽管是阴性测试，仍可能具有TB感染。在一个实施方案中，假阴性测试的一个原因包括最近的TB感染，因为从对象感染到对象的身体对皮试起反应可经历8-10星期的时间。因此，对象可能需要在数月内重复测试。

在另一个实施方案中，假阴性的另一个原因是如果对象由疾病(例如AIDS)，或皮质固醇或化疗药物而免疫低下，使对象可能对曼托试验不响应，尽管你已感染TB。

在另一个实施方案中，假阴性结果的另一个原因包括接种含活病毒的疫苗，使该疫苗包含活病毒，例如麻疹或天花疫苗，可干扰TB皮试。

而在另一个实施方案中，另一个假阴性结果的原因包括强烈的TB疾病。如果对象的身体具强烈的TB菌，可能不能对皮试产生足够量的防御应答。

在另一个实施方案中，另一个假阴性结果的原因包括不正确的测试。有时PPD结核菌素可在对象的皮肤表面下注射太深。在该情况下，对象具有的任何反应可能不可见。

在一个实施方案中，如果TB测试的结果为阳性(称为“显著的”)，对象可进行另外的测试以帮助确定对象是否具有活性TB疾病以及其是否是药物耐受株。这些测试可包括胸部X-射线或CT扫描。在一些情况下，这可显示出你肺部的白色斑点，你的免疫系统将TB菌隔离在那里。在其它情况，其可在你的肺部显示由活性TB引起的结节或空腔。在一个实施方案中，使用横截面X-射线图像的电脑断层(CT)扫描可显示更细微的疾病迹象。

如果对象的胸部X-射线显示TB的信号，临床医生可收取对象胃液或痰样品。测试样品的TB菌，临床医生可在数小时内得到特定的涂片结果。

还可将样品送至实验室，在那里在显微镜下检查他们并将其放置于可刺激细菌生长的特定培养基中(培养)。然后测试所出现的细菌以观察他们是否响应通常用于治疗TB的药物。因为TB菌生长非常缓慢，常规的培养测试可花费4-8周。

在一个实施方案中，另一种用于诊断TB感染的测试包括核酸扩增(NAA)测试。此测试可检测结核分枝杆菌中与药物耐受相关的基因。然而，此测试一般仅在发达国家可用。

在一个实施方案中，在发展中国家主要使用的测试叫做显微观察药物敏感性(MODS)测定。其可在尽可能短的7天内的痰中检测TB菌的存在。另外，所述测试可鉴定TB菌的药物耐受株。

在儿童中诊断TB比在成人中更困难，由于儿童可能吞咽掉痰而不是把它咳出来，这使收取培养样品更难。而婴儿和小孩可能对皮试不反应。由于这些原因，对可能为感染的原因的成人的测试可用于帮助在儿童中诊断TB。

在一个实施方案中，使用不同的步骤中的任何一种制备结核分枝杆菌抗原和编码这些抗原的序列。例如，可溶性抗原可通过本领域普通技术人员已知的步骤分离自结核分枝杆菌培养物，包括阴离子交换和反向色谱。然后可评估纯化抗原所需的特征，例如与获得自结核分枝杆菌感染的个体的血清反应的能力。可使用本文描述的代表性的方法进行这样的筛选。然后可使用例如传统的埃德曼化学部分测序抗原。见Edman和Berg，Eur.J.Biochem.80：116-132，1967。

还可使用编码抗原的DNA序列重组生产抗原，所述序列插入到表达载体中并在适当的宿主中表达。可通过特异性针对可溶结核分枝杆菌抗原升高的抗血清(例如兔)筛选适当的结核分枝杆菌表达文库来分离编码可溶性抗原的DNA分子。可通过用获得自感染有结核分枝杆菌的患者的血清筛选适当的结核分枝杆菌基因组或cDNA表达文库来鉴定编码主要不溶性抗原的DNA序列。这样的筛选一般可使用本领域众所周知的技术进行，例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中所描述的方法。

还可通过在适当的结核分枝杆菌cDNA或基因组DNA文库中筛选与源自患者的分离的可溶性抗原氨基酸序列的简并核苷酸杂交的DNA序列而获得编码可溶性抗原的DNA序列。可设计并合成用于这样的筛选的简并核苷酸序列，而可如在Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，N.Y.(本文引用的参考文献)中描述的那样完成筛选。还可采用聚合酶链式反应(PCR)，其使用上述本领域众所周知的方法中的寡核苷酸，从cDNA或基因组文库中分离核酸探针。然后可使用分离的探针来完成文库筛选。

在一个实施方案中，结核分枝杆菌抗原包括但不限于本领域已知的任何抗原，ESAT-6、TB10.4、CFP10、RD1-ORF5、RD1-ORF2、Rv1036、MPB64、MPT64、Ag85A、Ag85B(MPT59)、Mtb39、MPB59、Ag85C、19kDa脂蛋白、MPT32和α-晶体蛋白、EsxG、Rv2430c、Rv2041c，或任何上述提及的抗原的至少一种T细胞表位(Skjot等人，2000；丹麦专利申请PA 2000 00666；丹麦专利申请PA 1999 01020；美国专利申请系列号0910505,739；Rosenkrands等人，1998；Nagai等人，1991)。

由于遗传多样性，不同个体对同样的多肽可能以不同强度的免疫应答反应。因此，本发明的疫苗可能包含若干不同的多肽以提高免疫应答。疫苗可包含2种或更多种多肽或免疫原性部分，其中所有的多肽为上述定义的，或部分但非全部肽可源自强毒分枝杆菌。

在本发明的一个实施方案中，“核酸”是指一串至少2个碱基-糖-磷酸的组合。在一个实施方案中，该术语包括DNA和RNA。在一个实施方案中，“核苷酸”是指核酸多聚物的单体单元。在一个实施方案中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核酶(ribozymes)的形式。已经描述了siRNA和miRNA的用途(Caudy AA等人，Genes&Devel 16：2491-96和其中引用的参考文献)。DNA可以为质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA，或这些组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可为单、双、三或四链的。在另一个实施方案中，所述术语还可包括含有其它形式的骨架但相同碱基的人工核酸。在一个实施方案中，所述人工核酸为PNA(肽核酸)。在一个实施方案中，PNA含有肽骨架和核苷酸碱基，并且能与DNA和RNA分子相结合。在另一个实施方案中，核苷酸为环氧丙烷修饰的。在另一个实施方案中，通过将一或多个磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯键来修改核苷酸。在另一个实施方案中，人工核酸含有本领域已知的天然核酸磷酸骨架的任何其它变体。硫代磷酸酯核酸和PNA的用途为本领域技术人员已知的，并且已在，例如，Neilsen PE，Curr Opin Struct Biol 9:353-57；和Raz NK等人，Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中描述。核酸的产生和用途为本领域技术人员已知的，并且已在，例如，Molecular Cloning，(2001)，Sambrook和Russell，eds.andMethods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中描述。每一核酸衍生物代表了本发明独立的实施方案。

无论哪种制备方法，本文描述的抗原均为“抗原性的”。更具体地，抗原具有与获得自结核分枝杆菌感染的个体的血清反应的能力。可使用例如本文描述的代表性ELISA测定评估反应性，其中将来自感染的个体的血清读取的光吸收高于来自未感染的个体的血清获得的光吸收标准差至少3倍考虑为阳性。

可使用众所周知的技术制备并鉴定结核分枝杆菌抗原的抗原性部分，例如在Paul，Fundamental Immunology，3d ed.，Raven Press，1993，pp.243-247和本文引用的参考文献中总结的那些。这样的技术包括筛选天然抗原多肽部分的抗原性特征。通常在这些筛选中可采用本文描述的代表性ELISA。在这样的代表性测定中，多肽的抗原性部分为在这样的测定中可产生基本上与由全长抗原所产生的相似的信号的部分。换言之，结核分枝杆菌抗原的抗原性部分在本文描述的典型ELISA中可产生全长抗原的至少约20％，并优选约100％的信号。结核分枝杆菌抗原的部分或其它变体可由合成或重组手段产生。可使用本领域众所周知的技术产生具有少于约100个氨基酸，并通常少于约50个氨基酸的合成性多肽。例如，可使用任何商业可得的固相技术合成这样的多肽，例如Merrifield固相合成法，其中依次将氨基酸添加到一个不断增长的氨基酸链上。见Merrifield，J Am.Chern.Soc.85：2149-2146，1963。用于自动合成多肽的装置是可由供应商处商业可得的，例如应用生物系统公司(Applied BioSystems,Inc)、Foster City,Calif.并根据制造商说明书为可操作的。通常可使用标准诱变技术制备天然抗原的变体，例如寡核苷酸定向的位点特异性诱变。还可使用标准技术移除DNA序列的片段以允许制备截短的多肽。

在一个实施方案中，本发明提供了在诊断传染病之前诊断寄生虫感染的方法。

在一个实施方案中寄生虫是蠕虫。在另一个实施方案中，蠕虫为扁形动物门，其在一个实施方案中为扁形虫。在另一个实施方案中，扁形动物为绦虫纲，其在一个实施方案中为绦虫。在另一个实施方案中，扁形动物为吸虫纲，其在一个实施方案中为吸虫。在另一个实施方案中，蠕虫为线虫纲，其在一个实施方案中为圆虫。

在一个实施方案中，吸虫为血吸虫，其在一个实施方案中为曼森氏/日本/湄公/埃及吸虫(血吸虫病)或毛毕血吸虫属(Trichobilharzia regenti)(游泳者搔痒)，在另一个实施方案中，吸虫为肝吸虫，其在一个实施方案中为华支睾吸虫(华支睾吸虫病)、大片/肝片吸虫(肝片吸虫病)或猫后睾吸虫病。在另一个实施方案中，吸虫为肺吸虫，其在一个实施方案中为卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)(肺吸虫病)。在另一个实施方案中，吸虫为肠吸虫，其在一个实施方案中为布氏姜片吸虫(Fasciolopsis buski)(肠吸虫病)。

在一个实施方案中，绦虫为圆叶目(Cyclophyllidea)，其在一个实施方案中为细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)/多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)(棘球蚴病)、牛肉绦虫(牛肉)/亚洲带绦虫(Taenia asiatica)/猪带绦虫(猪肉)(猪带绦虫病和囊虫病)，或短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)/长膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)(膜壳绦虫病)。在另一个实施方案中，绦虫为假叶目(Pseudophyllidea)，其在一个实施方案中为阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)(裂头绦虫病)、欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)(裂头蚴病)或类曼森氏裂头绦虫(Diphyllobothriummansonoides)(裂头蚴病)。在一个实施方案中，线虫为胞管肾纲，其在一个实施方案中为旋尾目、圆线虫目(钩虫)、正蛔目、小杆目、尖尾目、驼形亚目、旋尾亚目、丝虫总科(丝虫病)、吸吮总科或旋尾总科。在一个实施方案中，线虫为麦地那龙线虫(Dracunculusmedinensis)(龙线虫病)、盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)(盘尾丝虫病)、罗阿丝虫(Loaloa)(罗阿丝虫病)、曼森氏线虫(Mansonella)(曼氏丝虫病)、匐行恶丝虫(Dirofilariarepens)(恶丝虫病)、丝虫种(Filariad species)(吴策线虫和布氏丝虫属，例如班氏吴策丝虫(Wuchereria bancrofti)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、帝纹丝虫(Brugiatimori))、有棘颚口线虫(Gnathostoma spinigerum)/有刚棘颚口线虫(Gnathostomahispidum)(颚口线虫病)、吸吮属(Thelazia)(吸吮线虫病)、筒线虫(Gongylonema)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)/巴西钩口线虫(Ancylostoma braziliense)(钩虫病、皮肤幼虫移行病)、美洲钩虫(Necator americanus)(板口线虫病)、血管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)(血管圆线虫病)、脊形管圆线虫(Angiostrongyluscostaricensis)、后圆线虫属(Metastrongylus)(后圆线虫病)、似蚓蛔线虫(Ascarislumbricoides)(蛔虫病)、异尖线虫(Anisakis)(异尖线虫病)、犬蛔虫(Toxocara canis)/猫蛔虫(Toxocara cati)(内脏幼虫移行病/毒蛔虫病)、拜林蛔虫(Baylisascaris)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)(粪圆线虫病)、蠕形住肠线虫(Enterobiusvermicularis)(蛲虫病，蛲虫)、旋毛虫(Trichinella spiralis)(旋毛虫病)、毛首鞭形虫(Trichuris trichiura)(鞭虫病，鞭虫)、类圆线虫种、菲律宾毛线虫(Capillariaphilippinensis)(肠道毛细线虫病)或肝毛细线虫(Capillaria hepatica)。

在一个实施方案中，蠕虫为肥胖带吻绦虫(Taeniarhynchus saginatus)、混带吻绦虫(Taenirhynchus confusus)、姜片属种、棘口吸虫、长膜壳绦虫(Hymenolepisdiminuta)、矛形双腔吸虫(Dicrocoelium dendriticum)、异形吸虫(Heterophyes)、微小蝙蝠绦虫(Vampirolepis nana)。

在另一个实施方案中，寄生虫感染为本领域任何已知会影响本文提供的对象的寄生虫感染。

在一个实施方案中，寄生虫感染导致能够制造IL-10并抑制CD40激动剂起始的IL-12产生的2种CD4+细胞亚群发育。产生IL-10以抑制DC制造IL-12应答CD40配基化的能力在感染了血吸虫的小鼠中促使Th2极化。因此，在一个实施方案中，寄生虫感染将免疫系统驱动向Th2，很可能阻断HIV疫苗的效应，在临床试验中导致假阴性结果。在另一个实施方案中，寄生虫显著地抑制特异性IFN-γ生产水平。在另一个实施方案中，寄生虫在细菌、病毒、微生物、微有机体、病原菌或其组合感染期间显著地抑制特异性IFN-γ生产水平。

用于诊断寄生蠕虫感染的方法包括粪便样品的显微镜检，直接在粪便涂片中或在浓培养基中浮选浓缩虫卵和寄生虫后，还可在尿中。例如，血吸虫病确诊依赖于在大便和尿中检测到明确的血吸虫卵排出。这发生于感染后5-13周并由蠕虫负荷确定。推荐用于大便或尿的浓粪便涂片、尿核孔过滤和福尔马林-醚浓缩技术。通常推荐在中午和下午2点之间(当虫卵排出最大时)收集尿。

在轻微或慢性感染中可能需要多重检验。如果感染是活性的，血吸虫卵包含活的和成熟毛蚴。研究表明，成年人类免疫缺陷病毒(HIV)-1相关的免疫缺陷在埃及血吸虫、曼氏血吸虫或两者的低强度感染中不减弱虫卵排出，并且感染HIV-1可能对血吸虫病的诊断和监察没有严重影响。

应理解，测试包括但不限于，尿检、肝功能测试、成像检查，其进一步包括但不限于胸部放射成像，腹部超声成像和盆腔静脉肾盂造影，排尿期膀胱尿道造影，头、胸、腹部和脊椎CT扫描和/或MRI，并且本发明预期进行血清学试验寄生虫抗体用于诊断寄生虫感染。

其它的测试包括肝活检、膀胱镜镜检和腹腔镜检。

CDC使用了含纯化的成虫抗原的测试的组合。Falcon测定筛选测试酶联免疫吸附测定(FAST-ELISA)对所有物种为99％特异的，并对曼氏血吸虫感染具有99％，对埃及血吸虫95％和对日本血吸虫50％的灵敏度。由于FAST-ELISA的假阴性结果，在潜在接触埃及血吸虫和日本血吸虫感染的情况下进行使用物种特异性抗原的免疫沉淀。然而，血清学测试不能从过往感染区分活性的感染。

在一些地方性区域，日本血吸虫、曼氏血吸虫和病毒性肝炎是慢性肝疾病最常见的原因。已经注意到乙肝表面抗原携带状态在血吸虫病患者中高4倍，其显著性为不确定的。已对曼氏血吸虫与乙肝的相关性提出了不同的解释，包括(1)减弱的细胞介导的免疫力，其降低了宿主抗性；(2)低社会经济条件和教育水平，其增加接触风险；和(3)过往的静脉注射或肠外用药或输血重复治疗。

通过上文描述的调查的组合实现血吸虫疾病的严重程度和分期的鉴定。这包括血清学、腹部和肺门周区超声成像、全身CT扫描、胃镜、膀胱镜检、腹腔镜检和组织学。急性血吸虫疾病：急性血吸虫病(片山热)超声成像研究检测到的变化包括肝脏局灶性低回声，其可反映伴随细菌性二重感染、胸腔积液和心包积液的继发性脓肿形成。膨大的淋巴结可显示由极化回波环(echopolar halo)围绕的强回声中心。轻度血吸虫病：腹腔镜检显示肝表面大多光滑，尽管在更晚期疾病中观察到多个发白的标记和不规则宽槽。慢性血吸虫病：超声成像特点为特征性的，并包括门脉分支壁回声增强增厚和门静脉经常延伸至胆囊与韧带。中度血吸虫病：超声成像显示高回声增强区域，并且CT扫描显示网络模式和线型钙化点。重度血吸虫病：腹腔镜检显示由槽状凹陷隔开的不同大小的块样形式失真的肝表面，其产生龟壳样外观。超声成像显示高回声增强区域，并且CT扫描显示网络模式和线型钙化点。

在一个实施方案中，本发明提供了在寄生虫感染的对象中治疗感染的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在蠕虫感染的对象中治疗感染的方法。在一个实施方案中，对象被一种寄生虫和另外的寄生虫感染，形成2种寄生虫的总感染。在另一个实施方案中，一种寄生虫为蠕虫而另外的寄生虫为原虫性寄生虫。在另一个实施方案中，原虫寄生虫为疟原虫、利什曼原虫、弓形虫或本领域已知的任何其它原虫寄生虫。在一个实施方案中，非寄生虫感染为传染病。在另一个实施方案中，非寄生虫感染为细菌感染。在另一个实施方案中，非寄生虫感染为结核病。在另一个实施方案中，非寄生虫感染为病毒感染。在另一个实施方案中，病毒感染为HIV。

在另一个实施方案中，蠕虫感染为寄生虫感染。在另一个实施方案中，蠕虫感染为寄生原声动物感染。在另一个实施方案中，传蠕虫为寄生蠕虫。在一个实施方案中，蠕虫为曼氏血吸虫。

在一个实施方案中，本发明的方法中所用的疫苗包含重组的单核细胞增生李斯特菌(Literia monocytogene)，其为本文提供的任何形式或实施方案。在一个实施方案中，本发明中所用的疫苗由重组的单核细胞增生李斯特菌(Literia monocytogene)组成，其为本文提供的任何形式或实施方案。在另一个实施方案中，本发明的方法中所用的疫苗基本上由重组的单核细胞增生李斯特菌(Literia monocytogene)组成，其以本文提供的任何形式或实施方案。在一个实施方案中，术语“包括”指在疫苗中包含重组的单核细胞增生李斯特菌，以及包含本领域已知的其它疫苗或治疗。在另一个实施方案中，术语“基本上由……组成”指疫苗，其功能性组分为重组单核细胞增生李斯特菌，然而，可包括没有直接涉及疫苗的治疗性效果的疫苗其它成分，并例如可指有利于重组单核细胞增生李斯特菌的效果的组分(例如稳定剂、保护剂等)。在另一个实施方案中，术语“由……组成”指疫苗，其含重组的单核细胞增生李斯特菌。

在一个实施方案中，本文提供的疫苗包括抗原特异性疫苗，其对慢性蠕虫感染期间的免疫显性CTL和辅助表位反应(见本文下述的图11A和B，和实施例4)。在另一个实施方案中，改变疫苗剂量和治疗方案不改变疫苗对免疫显性表位的反应(见本文下述的图12、实施例4)。在另一个实施方案中，最后接种疫苗后若干个月，通过效应CTL细胞对免疫显性表位的反应与对慢性蠕虫感染的反应不变(见本文下述的图13A、实施例5)。在一个实施方案中，在存在血吸虫感染的情况下产生抗原特异性CD8+T细胞并在与未感染的可比的水平持续数月(见本文下述实施例5)。

在一个实施方案中，由事先存在的慢性蠕虫感染引起的效应细胞应答(部分细胞介导的免疫应答)是持久的和未改变的(见本文下述实施例6)。

在一个实施方案中，本文提供的疫苗诱导免疫学记忆(见本文下述实施例7)。

在一个实施方案中，本文提供的基于李斯特菌的疫苗在Th2环境中诱导功能性效应细胞。

在另一个实施方案中，如果蠕虫感染的对象的疫苗反应变化，疫苗反应在另一加强疫苗接种和/或吡喹酮治疗蠕虫感染后恢复。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括以任何如本文描述的形式或实施方案施用重组单核细胞增生李斯特菌的步骤。在一个实施方案中，本发明的方法由以任何如本文描述的形式或实施方案施用重组单核细胞增生李斯特菌的步骤组成。在另一个实施方案中，本发明的方法基本上由以任何如本文描述的形式或实施方案施用重组单核细胞增生李斯特菌的步骤组成。在一个实施方案中，术语“包括”指在方法中包含施用重组的单核细胞增生李斯特菌的步骤，以及包含本领域已知的其它方法或治疗。在另一个实施方案中，术语“基本上由……组成”指方法，其功能性组分施用为重组单核细胞增生李斯特菌，然而，可包括没有直接涉及方法的治疗性效果的其它方法步骤，并例如可指有利于重组单核细胞增生李斯特菌施用的效果的步骤。在一个实施方案中，术语“由……组成”指没有另外的重组单核细胞增生李斯特菌施用步骤的方法。

在一个实施方案中，本发明的方法中所用的单核细胞增生李斯特菌融合蛋白将包含微生物，或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列，其以本文描述的任何形式或实施方案。在另一个实施方案中，本发明的方法中所用的单核细胞增生李斯特菌融合蛋白将由微生物，或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列组成，其以本文描述的任何形式或实施方案。在一个实施方案中，本发明的方法中所用的单核细胞增生李斯特菌融合蛋白将基本上由微生物，或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列，其以本文描述的任何形式或实施方案。在另一个实施方案中，术语“包括”指重组单核细胞增生李斯特菌融合蛋白中包括微生物或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列，以及包括其它本领域已知的治疗性异源肽。在一个实施方案中，术语“基本上由……组成”指单核细胞增生李斯特菌融合蛋白，其功能性组分为微生物或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列，然而，也可包括其它可能不直接涉及单核细胞增生李斯特菌融合蛋白治疗性效果的异源序列，并可例如指有利于融合蛋白效果的组分。在另一个实施方案中，术语“由……组成”指单核细胞增生李斯特菌融合蛋白，其仅含有微生物或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原和LLO、ActA或PEST序列。

在一个实施方案中，除了其它的异源治疗性肽，本发明的方法所用的单核细胞增生李斯特菌将表达并分泌微生物或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原，其以本文描述的任何形式或实施方案。在一个实施方案中，除了其它的异源非治疗性肽，本发明所用的单核细胞增生李斯特菌将表达并分泌本发明的微生物或病毒或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原，其以本文描述的任何形式或实施方案。

在一个实施方案中，本发明的方法所用的单核细胞增生李斯特菌将表达并分泌本发明的微生物或病毒或传染病(细菌性、病毒性、真菌性、寄生性等)抗原，其以本文描述的任何形式或实施方案，但不表达或分泌其它异源肽。在一个实施方案中，本发明所用的重组单核细胞增生李斯特菌分泌异源肽。在另一个实施方案中，本发明所用的重组单核细胞增生李斯特菌表达异源肽。在另一个实施方案中，如本文所描述的，本发明所用的重组单核细胞增生李斯特菌表达并分泌异源肽。在另一个实施方案中，异源肽源自细菌、病毒、微生物、微有机体、病原菌或其组合感染。

在一个实施方案中，本发明使用减毒的李斯特菌菌株，例如LMδ-actA突变体(Brundage等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90:11890-11894)、单核细胞增生李斯特菌δ-pleA(Camilli et al.，1991，J.Exp.Med.，173：751-754)、或δ-ActA、δ-INL-b(Brockstedt et al.，2004，PNAS，101：13832-13837)。在另一个实施方案中，通过引入一或多个减毒突变构建减毒的李斯特菌菌株，本领域一名普通技术人员在了解了本文公开后将会理解它。这样的菌株的实例包括但不限于，芳香族氨基酸营养缺陷型(Alexander等人，1993，Infection and Immunity 10 61：2245-2248)和脂磷壁酸形成突变(Abachin等人，2002，Mol.Microbiol.43：1-14)李斯特菌菌株，和由缺少毒力基因减毒的菌株。在另一个实施方案中，本文提供的重组李斯特菌缺少ActA基因。

在一个实施方案中，本文提供的重组单核细胞增生李斯特菌疫苗克服了蠕虫诱导的对Th1介导的应答的抑制，从而诱导了传染病特异性细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，本文提供的重组单核细胞增生李斯特菌疫苗使蠕虫感染的对象的免疫应答从Th2倾向于Th1。在另一个实施方案中，向寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠施用所开发的李斯特菌载体HIV-1gag疫苗驱动显著的对HIV-1gag CTL和T辅助表位的免疫应答。在另一个实施方案中，李斯特菌疫苗载体能够在蠕虫感染的人群中驱动疫苗特异性的免疫应答。

在另一个实施方案中，与本发明的方法所用的疫苗联合使用驱虫药和/或抗生素。在一个实施方案中，驱虫药为阿苯达唑、苯并咪唑、酰亚胺噻唑(imidothiazole)/莫伦泰、大环内脂、伊维菌素、雷复尼特。在一个实施方案中，抗生素为利福平、异烟肼，或其组合。

本发明的疫苗组合物一般包括核酸疫苗，优选DNA。如本文所定义的核酸疫苗(一般为质粒表达载体)不必封装入病毒颗粒。直接将核酸疫苗引入接受疫苗治疗方案的个体的细胞中。例如，Wolff等人，Science 247：1465(1990)以及美国专利号5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647和WO 98/04720中描述了此方法。基于DNA输送的技术的实例包括“裸DNA”、易化输送(bupivicaine、多聚体、肽介导的)和阳离子脂复合物或脂质体。可使用例如在美国专利5,204,253描述的弹道输送或压力(见例如，美国专利号5,922,687)进行核酸给药。使用此技术，可施用仅包含DNA的颗粒，或在替代实施方案中，可将DNA附着于颗粒施用，例如金颗粒。

如本领域众所周知的，许多因素可影响抗原基因的表达效率和/或DNA疫苗的免疫原性。这样的因素的实例包括疫苗接种的可复制性、质粒载体的构建、用于驱动抗原基因表达的启动子的选择和质粒中插入基因的稳定性。

任何用于在真核细胞中表达的常规载体都可用于直接将DNA引入组织。包含来自真核细胞病毒的调节元件的表达载体一般用于真核表达载体，例如SV40CMB载体。其它示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5和任何在这样的启动子引导下允许表达蛋白质的载体，例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫因启动子、人巨细胞病毒启动子、鼠乳肿瘤病毒启动子、鲁氏肉瘤病毒启动子、多面体启动子或已显示在真核细胞中科有效表达的其它启动子。

例如，可通过在大肠杆菌中激活并随后纯化来生产治疗量的质粒DNA。来自工作细胞库的分装用于接种在生长培养基上，并根据众所周知的技术在振荡器烧瓶或生物反应器中生长至成熟。可使用标准生物分离技术，例如固相负离子交换树脂纯化质粒DNA。如果需要，可使用凝胶电泳或其它方法从开环和线性状态中分离超卷曲的DNA。

可使用本领域普通技术人员熟知的不同的技术从编码了多肽的DNA序列容易地制备包含天然抗原的部分和/或变体的重组多肽。例如，可首先使用商业可得的滤器浓缩来自适当的宿主/载体系统(其将重组蛋白质分泌至培养基中)的上清。浓缩后，可将浓缩液施用于适当的纯化基质，例如亲和基质或离子交换树脂。最后，可采用一或多个反相HPLC步骤以进一步纯化重组蛋白质。

在一个实施方案中，通过本领域已很好描述的方法确定本文中列出的任何氨基酸序列的蛋白质和/或肽同源性，该方法包括免疫印迹分析，或通过计算机算法分析氨基酸序列，其通过已建立的方法，利用许多可用的软件包中的任何一个。例如，一些这种包可能包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps包，以及可利用Smith和Waterman算法和/或全局/局部或BLOCKS算法用于分析的用途。每一确定同源性的方法代表了本发明独立的实施方案。

可采用本领域普通技术人员已知的任何表达载体的变体以如本文描述地表达重组多肽。可在任何合适的宿主细胞中实现表达，所述细胞被含有编码了重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选地，所采用的宿主为大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系，例如COS或CHO。以此方式表达的DNA序列可能编码了天然存在的抗原、天然存在的抗原的部分或其它变体。

总之，不考虑制备的方法，本文公开的多肽以基本上纯的方式制备。优选地，多肽为至少约80％纯度，更优选至少约90％纯度并最优选至少约99％纯度。然而，为了用于本文描述的方法，这样的基本上纯的多肽可被合并。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含佐剂，而在在另一个实施方案中，所述疫苗不包含佐剂。在另一个实施方案中，术语“佐剂”指当施用于个体或在体外测试时，可在抗原所施用的个体内或测试系统中提高免疫应答的化合物。在另一个实施方案中，免疫佐剂增强对单独施用时为弱免疫原性(即诱导无或弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答)的抗原的免疫应答。在另一个实施方案中，佐剂提高抗体对抗原的滴度。在另一个实施方案中，佐剂减少在个体中实现免疫应答的抗原有效剂量。

在另一个实施方案中，佐剂在本发明的方法和组合物中利用了含有CpG的核酸序列。在另一个实施方案中，佐剂为含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，佐剂为含有CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方案中，佐剂为ODN 1826。在另一个实施方案中，佐剂为铝盐佐剂。在另一个实施方案中，铝盐佐剂为明矾沉淀疫苗。在另一个实施方案中，铝盐佐剂为明矾吸附疫苗。铝盐佐剂为本领域众所周知的，并描述于，例如Harlow，E.和D.Lane(1988；Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)与Nicklas，W.(1992；Aluminum salts.Research in Immunology 143：489-493)中。

在另一个实施方案中，佐剂为Montanide ISA佐剂。在另一个实施方案中，佐剂为补体成分C3d的三聚体。在另一个实施方案中，三聚体共价连接至蛋白免疫原上。在另一个实施方案中，佐剂为MF59。在另一个实施方案中，佐剂为粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白质。在另一个实施方案中，佐剂为包含GM-CSF蛋白质的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为编码了GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施方案中，佐剂为包含编码了GM-CSF的核苷酸分子的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为皂苷QS21。在另一个实施方案中，佐剂为包含皂苷QS21的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为单磷酰脂质A(MPL)。在另一个实施方案中，佐剂为包含MPL的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为SBAS2。在另一个实施方案中，佐剂为包含SBAS2的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，佐剂为包含未甲基化的含有CpG的寡核苷酸的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施方案中，佐剂为包含免疫刺激性细胞因子的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为编码了免疫刺激性细胞因子的核酸分子。在另一个实施方案中，佐剂为包含编码了免疫刺激性细胞因子的核酸分子的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含羽管糖苷的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含细菌有丝分裂原的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含细菌毒素的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含本领域已知的任何其它佐剂的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含2种上述佐剂的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含3种上述佐剂的混合物。在另一个实施方案中，佐剂为包含多于3种上述佐剂的混合物。

在另一个实施方案中，本发明的方法还包括给对象施用加强疫苗接种的步骤。在一个实施方案中，加强疫苗接种在单次初次疫苗接种之后。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种后施用单次加强疫苗接种。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种后施用两次加强疫苗接种。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种后施用3次加强疫苗接种。在一个实施方案中，初次和加强疫苗接种之间的间隔由技术人员实验确定。在另一个实施方案中，初次疫苗接种和加强疫苗接种之间的间隔为1周，在另一个实施方案中，其为2周，在另一个实施方案中，其为3周，在另一个实施方案中，其为4周，在另一个实施方案中，其为5周，在另一个实施方案中，其为6-8周，而在另一个实施方案中，在初次疫苗接种后8-10周实施加强疫苗接种。

在另一个实施方案中，加强疫苗接种包括使用与初次疫苗接种的疫苗不同的替代形式的疫苗。在另一个实施方案中，不同的或替代形式的疫苗为编码了融合蛋白的DNA疫苗、包含所述融合蛋白的重组多肽的、病毒载体或活重组李斯特菌疫苗载体。在另一个实施方案中，病毒载体为腺病毒载体。

异源“初次疫苗接种”策略对增强对多种病原体的免疫应答和保护是有效的。Schneider等人，Immunol.Rev.170：29-38(1999)；Robinson，H.L.，Nat.Rev.Immunol.2：239-50(2002)；Gonzalo，R.M.et al.，Vaccine 20：1226-31(2002)；Tanghe,A.，Infect.Immun.69：3041-7(2001)。以不同的形式提供初次和加强感染似乎可以使对抗原的免疫应答最大化。DNA疫苗初次疫苗接种之后使用佐剂中的蛋白或通过病毒载体输送编码了抗原的DNA加强似乎是分别改善抗原特异性抗体和CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答最有效的方式。Shiver J.W.等人，Nature 415：331-5(2002)；Gilbert,S.C.et al.，Vaccine20：1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人，Vaccine 19：95-102(2000)；Sin，J.l.等人，DNA Cell BioI.18：771-9(1999)。最近来自猴子疫苗研究的数据表明，当用HIV gag DNA初免猴子随后用表达了HIV gag(Ad5-gag)的腺病毒载体加强时，向编码了HIV gag抗原的DNA加入CRL1005泊洛沙姆(12kDa，5％POE)可增强T细胞应答。对DNA/泊洛沙姆初次疫苗接种随后用Ad5-gag加强的细胞免疫应答比用DNA(不含泊洛沙姆)初免随后用Ad5-gag加强或仅用Ad5-gag的诱导的应答更强。Shiver，J.W.等人，Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请出版号US 2002/0165172 A1描述了编码了抗原的免疫原性部分的载体构建和包含抗原免疫原性部分的蛋白质的同时给药，从而产生免疫应答。所述文件限于乙肝抗原和HIV抗原。另外，美国专利号6,500,432导出了通过感兴趣的多核苷酸和多肽的同时给药增强核酸疫苗的免疫应答的方法。根据所述专利，同时施用意指多核苷酸和多肽在相同的免疫应答过程中施用，彼此优选在0-10或3-7天之内。专利所预期的抗原包括，肝炎病毒(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、寄生虫(例如来自疟原虫属)和病原性细菌(包括但不限于，结核分枝杆菌、麻风杆菌、衣原体、疟疾杆菌、莱姆病螺旋体、肠毒素大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、百日咳杆菌等)的抗原(在其它抗原之中)。上述所有参考文献以其整体通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的核酸分子可操作地连接于启动子/调控序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的第一开放读码框可操作地连接于启动子/调控序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的第二开放读码框可操作地连接于启动子/调控序列。在另一个实施方案中，每个开放读码框可操作地连接于启动子/调控序列。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在配备有本公开和本文提供的方法后，技术人员可容易地理解，不同的转录启动子、终止子、携带载体或特定基因序列(例如那些商业可得的克隆载体)可成功地用于本发明的方法和组合物。如本发明所预期的，这些功能体提供于，例如，商业可得的，称为pUC系列的载体中。在另一个实施方案中，去除非必须DNA序列(例如抗生素耐受基因)。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，可使用本领域众所周知的方法构建商业可得的质粒用于本发明。

另一个实施方案为质粒，例如pCR2.1(Invitrogen，La Jolla，CA)，其为原核表达载体，其具有原核复制起始子和启动子/调节元件以利于在原核生物体中表达。在另一个实施方案中，移除无关核酸序列以降低质粒的大小并提高可放置于其中的盒的大小。

这样的方法是本领域众所周知的，并描述于，例如，Sambrook等人(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)和Ausubei等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology，Green&Wiley，New York)中。

在一个实施方案中，抗生素耐受基因用于常规选择和克隆步骤，其通常在分子生物学和疫苗制备中采用。本发明预期的抗生素耐受基因包括但不限于，可赋予氨苄青霉素、青霉素、甲氧苯青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、庆大霉素和本领域众所周知的其它抗生素抗性的基因产物。每一基因代表了本发明独立的实施方案。

用于转化细菌的方法是本领域众所周知的，并包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔法、噬菌体介导的转导、化学和物理转化技术(de Boer等人，1989，Cell 56：641-649；Miller等人，1995，FASEB J.，9：190-199；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等人，1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York；Gerhardt等人，eds.，1994，Methods for General and Molecular Bacteriology，American Society forMicrobiology，Washington，DC；Miller，1992，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。在另一个实施方案中，本发明的李斯特菌载体菌株通过电穿孔法转化。每种方法代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，接合用于将遗传物质和/或质粒引入细菌。用于接合的方法是本领域众所周知的，并例如，描述于Nikodinovic J等人，(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that isgenerally transferable by conjugation.Plasmid.2006 Nov；56(3)：223-7)和AuchtungJM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element byintercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad SciUSA.2005Aug 30；102(35)：12554-9)中。每种方法代表了本发明独立的实施方案。

在一个实施方案中，“转化”与术语“转染”相等地使用，并指改造细菌细胞以携带质粒或其它异源DNA分子。在另一个实施方案中，“转化”指改造细菌细胞以表达质粒或其它异源DNA分子的基因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在本发明中有用的质粒和其它表达载体描述于本文其它部分，并可包括这样的特征，如启动子/调节序列、革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的复制起始子、分离的编码了融合蛋白质的核酸和分离的编码氨基酸代谢基因的核酸。另外，分离的编码了融合蛋白和氨基酸代谢基因的核酸将拥有适合于驱动这样的分离的核酸表达的启动子。对在细菌系统中驱动表达有用的启动子为本领域众所周知的，并包括噬菌体λ、pBR322的β内酰胺酶基因bla启动子和pBR325的氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的其它实例包括，5λ噬菌体的主要右侧和左侧启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp、recA、lacZ、lad和gal启动子，α-淀粉酶(Ulmanen等人，1985.J.Bacteriol.162：176-182)和枯草芽孢杆菌的S28特异性启动子(Gilman等人，1984Gene 32：11-20)，芽孢杆菌噬菌体的启动子(Gryczan，1982，In：TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press，Inc.，New York)，和链霉菌启动子(Ward等人，1986，Mol.Gen.Genet.203：468-478)。可在，例如，Glick(1987，J.Ind.Microbiol.1：277-282)；Cenatiempo，(1986，Biochimie，68：505-516)；和Gottesman(1984，Ann.Rev.Genet.18：415-442)中评估(review)本发明所预期的另外的原核启动子。本发明所预期的另外的启动子/调节元件的实例包括但不限于李斯特菌prfA启动子、李斯特菌hly启动子、李斯特菌p60启动子和李斯特菌ActA启动子(GenBank访问号NC_00321O)或其片段。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的质粒包含编码了融合蛋白的基因。在另一个实施方案中，克隆子序列并且使用适当的限制性酶剪切适当的子序列。然后，在另一个实施方案中，将片段连接以产生所需的DNA序列。在另一个实施方案中，使用DNA扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)生产编码抗原的DNA。首先，分别扩增新末端的每侧的天然DNA片段。一个扩增的序列的5'端编码了肽接头，而另一个扩增的序列的3'端也编码了肽接头。由于第一片段的5'端与第二片段的3'端互补，所述2个片段(在部分纯化，例如在LMP琼脂糖上)可在第3轮PCR反应中用作重叠模板。扩增的序列将包含密码子，碳端的开放位点(现在形成氨基序列)、接头，和氨基端的开放位点序列(现在形成羧基序列)。将抗原连接入质粒中。每种方法代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明还包含用于临床应用的基于染色体整合系统的噬菌体。在另一个实施方案中，为了避免“噬菌体自愈(curing)步骤”，使用了基于PSA的噬菌体整合系统(Lauer等人，2002 J Bacteriol，184：4177-4186)。在另一个实施方案中，这要求通过抗生素连续选择保持整合的基因。因此，在另一个实施方案中，本发明使得可以建立基于染色体整合系统的噬菌体，所述系统不要求抗生素选择。另外，互补营养缺陷型宿主菌株。

在另一个实施方案中，使用重组DNA方法合成本发明的重组蛋白质。在一个实施方案中，这涉及创建编码了融合蛋白的DNA序列，将所述DNA放置入在特定启动子/调控元件控制下的表达盒(例如本发明的质粒)，并表达所述蛋白。在另一个实施方案中，通过任何适当的方法制备本发明的编码了融合蛋白(例如非溶血LLO/抗原)的DNA，例如，包括克隆并限制性消化适当的序列或通过例如Narang等人(1979，Meth.Enzymol.68：90-99)的phosphodiester方法；Brown等人的phosphodiester方法(1979，Meth.Enzymo 168：109-151)；Beaucage等人的diethylphosphoramidite方法(1981，Tetra.Lett.，22：15 1859-1862)；和美国专利号4,458,066的固相支持方法直接化学合成。

在另一个实施方案中，化学合成用于生产单链寡核苷酸。在不同的实施方案中，通过与互补的序列杂交，或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶多聚化来将单链寡核苷酸转换为双链DNA。本领域技术人员将认识到，DNA化学合成受限于约1000碱基的序列，更长的序列可通过较短序列的连接获得。在另一个实施方案中，克隆子序列并且使用适当的限制性酶剪切适当的子序列。然后，将片段连接以产生所需的DNA序列。

在另一个实施方案中，使用DNA扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)，克隆编码了本发明的融合蛋白或重组蛋白的DNA。因此，使用包含适当的限制性位点的正向引物和包含另一个限制性位点的反向引物，例如有利于克隆的不相同的限制性微点，进行PCR扩增非溶血LLO基因。对分离编码了抗原的核酸重复相同的步骤。非溶血LLO和抗原序列的连接和插入到质粒或载体产生了编码连接入抗原末端的非溶血LLO的载体。所述2种分子可直接连接或通过限制性位点引入短间隔物连接。

在另一个实施方案中，通过由一或多个氨基酸组成的肽间隔物隔开所述分子，除了在它们之间保留加入蛋白或保留一些最小距离或其它空间关系，通常间隔物将不具有特定的生物活性。在另一个实施方案中，选择间隔物的氨基酸组成以影响分子的某些特性，例如折叠、净电荷或疏水性。在另一个实施方案中，将编码了融合或重组蛋白的核酸序列转化如不同宿主细胞中，包括大肠杆菌、其它细菌宿主，例如李斯特菌，酵母和不同的高等真核细胞，例如COS、CRO和ReLa细胞系和骨髓瘤细胞系。对每个宿主，重组融合蛋白基因将可操作地连接于适当的表达控制序列。本文其他部分详细描述了启动子/调节序列。在另一个实施方案中，质粒还包含另外的启动子调节元件，以及核糖体结合位点和转录终止信号。对真核细胞，控制序列将包括源自例如，免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等启动子和增强子，和多聚腺苷酸化序列。在另一个实施方案中，所述序列包括剪切供体和受体序列。在一个实施方案中，术语“可操作地连接”指并置(juxtapostion)，其中所描述的组分处于可使其以它们所需的方式发挥功能的关系。控制序列“可操作地连接于”编码序列是以这样的方式连接的，即在与控制序列兼容的条件下完成编码序列的表达。

在另一个实施方案中，为了选择含有质粒的营养缺陷型菌，转化后的营养缺陷型菌在选择氨基酸代谢基因表达的培养基上生长。在另一个实施方案中，用含有D-谷氨酸合成基因的质粒转化D-谷氨酸合成的营养缺陷型菌，并且所述营养缺陷型菌在缺乏D-谷氨酸下生长，其中没有转化入质粒的，或不表达编码D-谷氨酸合成蛋白的质粒的营养缺陷型菌不生长。在另一个实施方案中，如果质粒包含分离的编码D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的核酸，当转化入表达本发明的质粒时，D-丙氨酸合成的营养缺陷型菌在缺乏D-丙氨酸下生长。这样的制造适当的包含或缺乏必须生长因子、成分、氨基酸、维生素、抗生素等等的培养基的方法是本领域众所周知的，并且是商业可得的(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。每种方法代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，一旦在适当的培养基上筛选了包含本发明的质粒的营养缺陷型菌，所述菌在存在选择压力的情况下传代。这样的传代包括在没有营养缺陷型因子的培养基上生长细菌。在营养缺陷型菌中存在表达氨基酸代谢酶的质粒保证了所述质粒可与菌一起复制，因此持续地选择携带质粒的菌。当配备有本文的公开和方法时，技术人员将容易地能够通过调整含有质粒的营养缺陷型菌所生长的培养基的体积提高李斯特菌疫苗载体的生产。

在另一个实施方案中，技术人员应理解本发明可采用其它的营养缺陷株和互补系统。

在一个实施方案中，本文提供的李斯特菌疫苗载体为重组李斯特菌菌株，而在另一个实施方案中，其为重组单核细胞增生李斯特菌菌株。在另一个实施方案中，重组李斯特菌菌株为营养缺陷型李斯特菌菌株。在另一个实施方案中，重组李斯特菌菌株O为营养缺陷型李斯特菌菌株。在另一个实施方案中，包括附加型基因表达载体的重组李斯特菌菌株包含代谢酶，其互补所述营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷。在另一个实施方案中，重组李斯特菌菌株包含氨基酸代谢酶。在另一个实施方案中，代谢酶在所述重组李斯特菌菌株中催化参与细胞壁合成的氨基酸形成。在另一个实施方案中，代谢酶为丙氨酸消旋酶酶。在另一个实施方案中，代谢酶为D-氨基酸转移酶。

在一个实施方案中，本文提供的重组李斯特菌菌株已在动物宿主中传代。

在另一个实施方案中，在上文描述的任何方法中利用的疫苗和免疫原性组分具有本发明的疫苗和免疫原性组分的任何特征。每种特征代表了本发明独立的实施方案。

本发明考虑不同的剂量范围的实施方案。在一个实施方案中，在疫苗载体的情况下，剂量范围为0.4LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为约0.4LD₅₀/剂-4.9LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为约0.5LD₅₀/剂-0.59LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为约0.6LD₅₀/剂-0.69LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为约0.7LD₅₀/剂-0.79LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为约0.8LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，剂量为0.4LD₅₀/剂-0.8LD₅₀/剂。

在另一个实施方案中，剂量为10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1.5×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为2×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为3×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为4×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为6×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10⁷菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1.5×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为2×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为3×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为4×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为6×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10⁸菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1.5×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为2×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为3×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为5×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为6×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1.5×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为2×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为3×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为5×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为6×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10¹⁰菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10⁹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为1.5×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为2×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为3×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为5×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为6×10¹¹菌/剂。在另一个实施方案中，剂量为8×10¹¹菌/剂。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括用于实施本发明的方法的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括本发明的组合物、工具或仪器。

在另一个实施方案中，包含疫苗的药物组合物和本发明的组合物通过本领域技术人员已知的任何方法向对象施用，例如胃肠道、癌旁、穿粘膜、穿皮肤、肌肉注射、静脉注射、皮内、皮下、心室、脑内、阴道内或肿瘤内。

在本文提供的方法和组合物的另一个实施方案中，疫苗或组合物通过口服施用，并因此制成适于口服施用的形式，即作为固体或液体制备物。适当的固体口服制剂包括药片、胶囊、药丸、颗粒、丸剂等等。适当的液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散液、乳剂、油等等。在本发明的另一个实施方案中，活性成分制成胶囊。根据此实施方案，除了活性化合物和插入载体或稀释剂，本发明的组合物包括硬凝胶胶囊。

在另一个实施方案中，疫苗或组合物通过静脉注射、动脉注射或肌肉内注射液体制备物施用。适当的液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散液、乳剂、油等等。在一个实施方案中，药物组合物通过静脉注射施用，并因此制成适合用于静脉注射施用的形式。在另一个实施方案中，药物组合物通过动脉注射施用，并因此制成适合用于动脉注射施用的形式。在另一个实施方案中，药物组合物通过肌肉内注射施用，并因此制成适合用于肌肉内注射施用的形式。

术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”指对其施用对象可生产所需效果的剂量。对本领域技术人员，使用已知技术可确定确切剂量。

术语“对象”或“患者”意指具有患HIV、肺结核、疟疾或本文提供的任何其它疾病的风险或实际上患病的人。其还指患有或具有患寄生虫感染风险的人。术语“对象”不排除在所有方面正常的个体。另外，术语“对象”、“宿主”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，意指需要诊断或治疗的任何哺乳动物对象，尤其是人类。其它对象可能包括牛、狗、猫、家猪、兔、大鼠、小鼠、马等等。

如本文中所用，术语“约”指定量术语加或减5％，或在另一个实施方案中，加或减10％，或在另一个实施方案中加或减15％，或在另一个实施方案中加或减20％。

为了更完整地说明性本发明优选的实施方案，示出下述实施例。然而，它们不应以任何方式解释为限制本发明范围广度的。

实施例

材料与方法

寄生虫和小鼠

通过腹腔(i.p.)注射用35-50传染性曼氏血吸虫尾蚴感染雌性Balb/c小鼠(Harlan)。对血吸虫感染小鼠，通过ELISA在感染后10周收集的血清中检测抗-卵和/或抗-蠕虫抗体存在确认蠕虫感染。

细菌菌株

Lm-Gag指重组单核细胞增生李斯特菌菌株，其携带有稳定整合入李斯特菌染色体中的HIV-1菌株HXB gag基因拷贝，并且如Western印迹所确定的，其分泌gag基因产物。所述菌株生长于脑/心浸液(BHI)培养基(Difco，Detroit，MI)中。

小鼠的疫苗接种

雌性Balb/c小鼠用0.2(或如指出的0.1)LD₅₀李斯特菌载体HIV-1疫苗(Lm-gag，来自Y.Paterson，Pennsylvania大学)、对照李斯特菌载体HPV疫苗(Lm-E7，来自Y.Paterson，Pennsylvania大学)i.p.初免或保持未接种。初免后的小鼠以相同的方式刺激2周。

T细胞应答分析

最终免疫后2周，处死小鼠，从个体小鼠收集脾脏并使用标准方法制备脾细胞。简单的，在37℃，添加有10％FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM的L谷氨酰胺和50mM的2-ME的1ml的RPMI 1640的24-孔平板中培养脾细胞。3天后，收集重复培养物的上清并储存于22℃，直至用ELISA测试样品的细胞因子。

对细胞因子ELISA分析，收集脾细胞并按每孔1.5x 10⁶个细胞将其放置于存在培养基、SEA或伴刀豆球蛋白A(作为阳性对照)的48孔平板中。孵育72小时后，收集并上清并通过ELISA(BD)分析细胞因子水平。对抗原特异的IFN-γELISpot，收集脾细胞并按每孔30万和15万个细胞将其放置于存在培养基、特异性CTL肽、无关肽、特异性辅助肽或con A(作为阳性对照)的IFN-γ ELISpot平板中。孵育20小时后，进行ELISpots(BD)并通过免疫点分析器(C.T.L.)计数斑点。对每百万个脾细胞的斑点数目作图。

使用库尔特计数器Z1(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA，USA)计数脾细胞。使用标准的基于IFN-γ的ELISPOT测定确定用gag-CTL、gag-辅助细胞、培养基、无关抗原和伴刀豆球蛋白A(阳性对照)重刺激之后的产IFN-γ CD8+细胞的频率。

简言之，使用5mg/ml的mAb R46-A2检测IFN-γ，并且使用最优稀释度的多克隆兔抗-IFN-γ(由Phillip Scott博士馈赠，Pennsylvania大学，Philadelphia，PA)。通过与使用鼠rIFN-γ的标准曲线比较计算IFN-γ的水平。使用过氧化物酶-缀合的山羊抗兔IgG Ab(IFN-γ)开发平板。然后在405nm读取平板。此分析的检测下限为30pg/ml。

ELISA

最终免疫后(wplv)2周，收集脾细胞并在25μg/ml可溶性血吸虫卵抗原(SEA)或1μg/ml伴刀豆蛋白A(conA，作为阳性对照)培养基存在下，以1.5x 10⁶细胞每孔铺于48-孔平板中。孵育72小时后，收集上清并根据制造商说明书通过ELISA(Becton Dickinson)分析IFN-γ、IL-4和IL-10的水平。

ELISpot

2wplv时，收集脾细胞并以30万和15万细胞每孔放置于IFN-γELISpot平板(Becton Dickinson)。在20μM特异性CTL肽(H2-Kd-限制性的，AMQMLKETI，来自HIV-1IIIBgag蛋白)、20μM无关肽(H2-Kd-限制性的，TYQRTRALV，来自流感病毒核蛋白)、20μM特异性辅助肽(H2-d-限制性的，NPPIPVGEIYKRWIILGLNK，来自HIV-1 IIIB gag蛋白)或1μg/ml伴刀豆蛋白A(作为阳性对照)培养基存在的情况下重刺激脾细胞。通过Biosynthesis Inc以超过95％的纯度合成肽。孵育20小时后，根据制造商说明书进行ELISpot，使用免疫斑点分析仪(C.T.L.)计数，并按每百万脾细胞的CTL或辅助免疫显性表位斑点数作图，

流式细胞术

用gag-四聚体(H2-Kd+AMQMLKETI，Beckman Coulter)和抗-CD8、抗-CD62L和抗＝-CD197抗体染色脾细胞。获得活细胞(如指出地使用LIVE/DEAD固定染料，Invitrogen)并使用运行FACSDiva的LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。

体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定

根据制造商说明书，将靶细胞(来自天然、同系小鼠的脾细胞)荧光标记为绿色(Vybrant CFDA SE Cell Tracer试剂盒，Invitrogen)或紫色(CellTrace Violet CellProliferation试剂盒，Invitrogen)。洗涤细胞，然后用20μM特异性CTL或无关肽分别脉冲处理2小时。混合靶标并每只疫苗接种动物静脉注射1x 10⁶个细胞。体内杀伤过夜(20小时)后，通过流式细胞术收集并分析脾细胞的靶回收率。对具有回收>100靶标的样品作图。

统计学分析

对池化的数据，采用T检验(双尾，未配对，非等方差)确定原始疫苗接种(在健康小鼠中0.2Lm-gag P+B)是否与血吸虫感染的小鼠中的任何疫苗接种策略有不同。CTL和辅助表位的值相比较并且其p值列于表1。

实施例1

在慢性蠕虫感染模型中的疫苗接种效率

在用李斯特菌疫苗载体疫苗接种之前，在小鼠中建立慢性曼氏血吸虫感染作为慢性蠕虫感染模型(图1)。慢性蠕虫感染的特征是Th2倾向性的免疫系统，其在本研究整体所用的慢性血吸虫病模型中观察到(图2)。蠕虫感染的，李斯特菌HIV-1疫苗接种的小鼠为Th2偏向性的，并为免疫抑制的，如比较具有和不具有蠕虫感染的组时，由IFN-γ产物减少和IL-4和IL-10增加所显示。

实施例2

尽管蠕虫感染介导了Th1T细胞免疫应答抑制，李斯特菌载体能够驱动Th1T细胞免疫应答

如通过IFN-γ应答减弱(图3)和IL-4与IL-10产生(分别图4和5)所证明的，尽管系统性倾向Th2，抗原特异性产生的IFN-γ保持不变(图6)，表明此疫苗在Th2环境存在的情况下可产生功能性细胞介导的免疫应答。此观察结果表明，李斯特菌疫苗载体能够在蠕虫感染的人群中驱动疫苗特异性免疫应答。另外，李斯特菌载体应考虑为开发新一代HIV-1、肺结核或TB疫苗以施用于撒哈拉以南的非洲，在那里蠕虫感染是高度流行的。

实施例3

李斯特菌载体HIV-1 gag疫苗向曼氏血吸虫感染的小鼠的施用驱动了显著的针对HIV-1gag CTL和T辅助表位的免疫应答

单独以0.2LD₅₀的Lm-gag疫苗i.p.接种或以0.1LD₅₀的Lg-gag的免疫-加强方案接种疫苗可引起对HIV-1 gag CTL和T辅助表位的免疫应答，其与在非曼氏血吸虫感染的小鼠中按0.1 LD₅₀的Lm-gag(图7)接种的免疫-加强方案得到的免疫应答相似。

另外，按免疫-加强方案口服施用100LD₅₀但非10LD₅₀的Lm-gag可引起对gag-辅助()的免疫应答，其与i.p.Lm-gag-接种的小鼠和口服Lm-gag-接种的没有感染曼氏血吸虫的小鼠中所得到的免疫应答相似(图8)。所有组对conA(阳性对照)显示出强免疫应答，并且没有组对培养基或无关抗原显示出免疫应答(图8)。

另外，按免疫-加强方案以Lm-E7(包含人类乳头瘤病毒E7抗原替代HIV-gag)接种的小鼠在用gag-CTL或gag-辅助重刺激后不显示免疫应答，如所期望的(图9)。

因此，向寄生虫曼氏血吸虫慢性感染的小鼠施用李斯特菌载体HIV-1 gag疫苗驱动显著的对HIV-1gag CTL和T辅助表位的免疫应答，如在下文进一步显示的。此观察结果表明，李斯特菌疫苗载体能够在蠕虫感染的人群中驱动疫苗特异性免疫应答。这开启了使用李斯特菌载体开发新一代HIV-1、肺结核或TB疫苗的可能性，其向撒哈拉以南的非洲人群施用，在那里蠕虫感染是高度流行的。

表1统计学分析。在血吸虫感染的小鼠中的疫苗接种策略的P值

	gag-en	gag-helper
			0.2Lm-gag(P)	0.54	0.63
0.1Lm-gag(P+B)	0.48	0.12
			0.2Lm-gag(P+B)	0.75	0.32

实施例4

李斯特菌载体HIV疫苗在蠕虫感染的情况下发挥功能

如在图11中所示，李斯特菌载体HIV-1疫苗在慢性蠕虫感染期间诱导了针对免疫显性CTL(图11A)和辅助细胞(图11B)表位的抗原特异性疫苗应答。对所有组，脾细胞对培养基和无关肽(NP)无应答，然而，所有小鼠对阳性对照conA均应答。数据包括3个独立的实验并且示出了每组动物的总数目(5-19)(图11，左上部)。当比较2个应答组(Lm-gag±血吸虫病)时，没有观察到显著差异。

不同的疫苗剂量和治疗方案不改变对免疫显性表位的疫苗反应(图12)。对具有慢性血吸虫病的动物的疫苗接种，疫苗剂量低至0.1LD₅₀(标记为0.1)，或者可改变时间表取消加强，得到仅初免的疫苗接种策略(标记为P，仅初免的)。当在应答(非对照)组中比较对CTL表位的应答时，没有观察到显著差异。

实施例5

效应细胞应答，细胞介导的部分免疫应答在预先存在的慢性蠕虫感染中为持久的和不变的

最后接种疫苗后若干个月，通过效应CTL细胞对免疫显性表位的反应与对慢性蠕虫感染的反应不变(图13A)。在最后的疫苗接种后的不同的时期处死小鼠，分析了未感染的或血吸虫感染的小鼠对免疫显性CTL(图13A)和辅助(图13B)表位的应答。在效应细胞对免疫显性CTL表位(图13A)的应答中，当比较每个时间点±血吸虫病时，没有发现显著的差异，暗示了对疫苗的效应细胞应答在组间是不随时间变化的。对辅助细胞表位的Th1应答，当在每个时间点比较±血吸虫病时存在差异，但是这些差异与功能性的疫苗记忆应答不相关。

实施例6

在存在血吸虫感染的情况下产生抗原特异性CD8+T细胞并在与未感染的可比的水平持续数月

为了验证在ELISpot结果中见到的源于抗原特异性CD8+T细胞的IFN-γ应答，通过流式细胞术分析脾细胞对由MHC分子呈递的疫苗表位的TCR分子特异性。简言之，用抗CD8抗体和gag四聚体染色脾细胞，并在CD8+群体中采集并分析四聚体阳性染色的活细胞(图14)。当在给定时间点内组别之间比较时，没有发现显著差异，然而，当在2个不同的时间点比较相同组时，观察到差异。

实施例7

李斯特菌HIV-1疫苗诱导了免疫学记忆。

通过流式细胞术分析脾细胞的免疫学记忆(图15)。简言之，用gag-四聚体和抗CDS、抗CD62L和抗CD197抗体染色脾细胞。采集并分析活细胞的中心记忆(CD62L+CD197+)、效应记忆(CD62L-CD197-)和分子特异性(CD8+四聚体+)。因为没有使用CD44作为标记物，效应记忆空间(compartment)也包括效应细胞，因此没有绘制于这些结果中。然而，在14wplv所有四聚体+细胞为中心记忆。中心记忆T细胞在疫苗接种后若干个月提高，在所述时间血吸虫感染的组中存在差异。

实施例8

李斯特菌HIV-1疫苗在Th2环境中诱导功能性效应细胞

为了分析效应细胞功能，进行了体内CTL测定。

简言之，将1x 10⁶靶细胞(用特异或无关肽脉冲处理，分别染为绿色或紫色)静脉注射如疫苗接种的动物中(图16A)。体内杀伤过夜后，通过流式细胞术收集并分析脾细胞的靶回收率，并且计算gag-特异性杀伤(图16B)。在Lm-gag接种的患有和不患有慢性血吸虫病的组之间没有观察到显著差异，表明疫苗应答在蠕虫感染的未感染的小鼠中同样有效。

实施例9

通过随后的血吸虫感染改变所建立的李斯特菌HIV-1疫苗应答

已经显示了，预先存在的蠕虫感染不改变免疫应答，确定如果在接种后发生蠕虫感染是否会改变疫苗应答是重要的。为了解决此问题，改变实验的时间线以在慢性蠕虫感染之前接种疫苗(图17A)。在血吸虫感染后的不同的时间处死小鼠，并分析了对免疫显性CTL(图17B)和辅助(图17C)表位的应答。尽管对辅助肽的应答保持不变，早于血吸虫感染的疫苗接种引起CTL应答随着免疫系统转移至Th2偏好而减弱。然而，在第二次加强和/或吡喹酮处理蠕虫感染后，血吸虫感染的小鼠的疫苗应答将恢复。另外，李斯特菌疫苗载体产生记忆应答。

尽管本文已表明和描述了本发明的某些特征，对本领域普通技术人员现在可以实现许多修改、替代、变化和等效。因此，应理解所附权利要求是为了在本发明真实的精神内涵盖所有这样的修改和变化。

Claims (20)

1.治疗有效量的李斯特菌(Listeria)疫苗载体在制备用于在患有传染病的对象中诱导预防性Th1免疫应答的药物中的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体表达并分泌与非溶血性李斯特菌素O(LLO)或其信号序列融合的抗原，其中所述对象暴露于被寄生蠕虫感染。

2.治疗有效量的李斯特菌(Listeria)疫苗载体在制备用于在对象中预防传染病的药物中的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体表达并分泌与非溶血性李斯特菌素O(LLO)或其信号序列融合的抗原，其中所述对象暴露于被寄生蠕虫感染，其中所述预防包括诱导抗传染病Th1免疫应答。

3.治疗有效量的李斯特菌(Listeria)疫苗载体在制备用于在被寄生蠕虫感染的对象中诱导和维持针对传染病的Th1免疫应答的药物中的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体表达并分泌与非溶血性李斯特菌素O(LLO)或其信号序列融合的抗原。

4.权利要求1或3的用途，其中所述药物的用途是用于在所述对象中治疗所述传染病。

5.权利要求1-2或4的用途，其中在被寄生蠕虫感染之前给所述对象施用所述药物，且其中在所述对象中鉴别出寄生蠕虫感染之后施用所述药物的加强接种或所述疫苗的替代形式的加强接种。

6.权利要求5的用途，其中所述疫苗的所述替代形式包含用于治疗所述蠕虫感染的药剂。

7.权利要求6的用途，其中所述药剂是吡喹酮。

8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述用途在所述对象的所述寄生蠕虫感染之后恢复所述对象中的Th1免疫应答。

9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述Th1应答是细胞毒性T细胞应答或记忆性T细胞应答。

10.权利要求1-9中任一项的用途，其中所述Th1免疫应答包含在Th2环境中有功能的效应细胞应答。

11.权利要求9的用途，其中所述记忆性T细胞应答是包含中心记忆细胞(CD62L+CD197+)、效应记忆细胞(CD62L-CD197-)或两者的应答。

12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述对象是人。

13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体引发针对HIV抗原、疟疾抗原或结核抗原的免疫应答。

14.权利要求13的用途，其中所述HIV抗原为HIV-gag、Pol、Env、蛋白酶、Rev、Tat、Nef、Rif或Vpr。

15.权利要求13的用途，其中所述免疫应答针对HIV-1gag细胞毒性T淋巴细胞表位或针对HIV-1gag T辅助细胞表位或两者。

16.权利要求13的用途，其中所述疟疾抗原为环子孢子蛋白(CSP)、子孢子表面蛋白2(PfSSP)、肝期抗原1(LSA1)、裂殖子表面蛋白1(MSP-1)、丝氨酸重复抗原和AMA-1、Pfs25、裂殖体输出蛋白、19次重复的子孢子表面蛋白(NANP)、SPf66；与纯化的铜绿假单胞菌毒素共价结合的重组(Asn-Ala-Pro15Asn-Val-Asp-Pro)2-Leu-Arg(R32LR)蛋白；NYVAC-Pf7；(NANP)19-5；(RTS,S,RTS,S/AS01)或其组合。

17.权利要求1-16中任一项的用途，其中所述蠕虫是曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)。

18.权利要求1-17中任一项的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体是重组营养缺陷型dal/dat突变体李斯特菌菌株。

19.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述李斯特菌疫苗载体缺失actA基因。

20.权利要求1-19中任一项的用途，其中所述传染病为HIV感染、疟疾感染、或结核感染。