Uc3facMedPharm année universitaire 2023/24

4eme année Pharm.

ALLAG H.
ANTIBIOTIQUES III
ROLE DU LABORATOIRE DANS LA SURVEILLANCE ET SUIVI DU TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE.

ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES

I/ INTRODUCTION :
Le but de la réalisation d’un antibiogramme est de prédire la sensibilité d’un germe à un ou plusieurs
antibiotiques dans une optique essentiellement thérapeutique. Il sert également :
- A la surveillance épidémiologique de la résistance bactérienne ;
- A l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles.
Le laboratoire de bactériologie dispose de nombreux tests de sensibilité des bactéries vis-à-vis des molécules
d'antibiotiques, en particulier celles inscrites dans la nomenclature nationale.
Ces tests permettent de détecter des résistances bactériennes et d'aider ainsi le médecin praticien dans sa
prescription.
Leur réalisation dépend, bien entendu, de données cliniques et épidémiologiques.
Selon les circonstances, sont effectués les tests suivants :
• Antibiogramme ou test de diffusion de disque en gélose,
• Dosage de la concentration minima inhibitrice (pour les bactéries isolées d'hémoculture, de liquides
biologiques ou de suppurations profondes),
• Recherche de la Bêtalactamase : enzyme produite par certaines bactéries : Haemophilus, Neisseria.,
• Recherche de la résistance à l'oxacilline (ou méthicilinorésistance) des Staphylocoques aureus et
Staphylocoques coagulase négative si pathogènes).
•Dosage des antibiotiques pour la surveillance des traitements.
•Etude des associations bactéricides d’antibiotiques.

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 Interaction bactérie-antibiotique ; bactériostase,: determination de la cmi

II/ BACTERIOSTASE

Définition :
Arrêt de la croissance bactérienne
Un antibiotique bactériostatique provoque l’arrêt de la croissance bactérienne à des concentrations
thérapeutiques.
1) CMI :
La plus faible concentration en antibiotique capable d’inhiber toute culture visible après 18 h d’incubation...
Valeur indicatrice du pouvoir bactériostatique d’un antibiotique.
2) Méthodes de détermination de la CMI :
a) La méthode de dilution en milieu liquide :
Consiste à préparer une série de tubes à hémolyse avec le même milieu de culture liquide (deux ml) puis
constituer une gamme de concentrations de l'antibiotique à tester, par exemple 0,5 mg/l 1, 2, 4, 8, 16 (raison
géométrique de base 2).
Il reste un tube (contrôle) ou témoin de croissance de la souche à tester.
Enfin on ajoute la même quantité de germes dans chacun des tubes (inoculum).
La galerie ainsi préparée sera incubée à 37°C pendant 18 heures. Enfin elle sera examinée à l'œil nu.
Le principal inconvénient de cette méthode est la quantité de tubes à manipuler, soit 100 tubes pour une
dizaine d'antibiotiques à examiner.

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La CMI sera la concentration en antibiotique la plus faible pour laquelle il n’y a pas de croissance visible.
Une variante de cette méthode consiste à utiliser des microcupules en plaque au lieu de tubes. Il s'agit
d'une microméthode en milieu liquide.

b) La méthode de dilution en milieu solide :

Consiste à incorporer l'antibiotique à une concentration donnée dans la gélose, maintenue liquide à 42°C.
Une série de boites de Pétri est préparée avec des concentrations d'antibiotique variant selon une progression
géométrique de base de 2, comme précédemment.
Puis sont préparées les suspensions des différentes bactéries à examiner qui sont alors distribuées sous forme
de spots grâce à des distributeurs spécifiques ou en utilisant des écouvillons.
Après avoir ensemencé la série de boîtes, celles-ci sont incubées dans une étuve jusqu'au lendemain. La
lecture est alors effectuée: il est facile de repérer l'emplacement de chaque souche et de noter croissance ou
absence de croissance.
Cette méthode permet d'examiner des séries de 20 souches en même temps.
c) La méthode de diffusion ou des disques en milieu solide : ou ANTIBIOGRAMME
STANDARD : technique la plus simple

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• Définition :
C'est la détermination de la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques.
• Principe :
Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs
concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques
s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture => compétition entre la
diffusion de l’antibiotique et la croissance bactérienne.
A la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d'antibiotiques égales aux CMI.
• Technique : la technique standardisée par l’OMS est la suivante( normes CLSI) :
Milieu :
-Gélose Mueller Hinton (HM), coulé en boites de Pétri sur une épaisseur de 4mm.
-Les géloses sont séchées avant l’emploi.
Inoculum :
-A partir d’une culture pure de 18H sur milieu d’isolement, racler à l’aide d’une anse de platine quelques
colonies bien isolées et parfaitement identiques.
-Décharger l’anse dans 5 à 10 ml d’eau physiologie stérile à 0,9%.
-Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland ou à
une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm.
-L’inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s’il est trop faible, ou bien de l’eau
physiologique stérile s’il est trop fort.
-L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l’inoculum.
NB : L’inoculum est dilué au 1/100 pour les molécules suivantes : cefalexine, pristinamycine, acide
fusidique.
Ensemencement :
-Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne.
-L’essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au
maximum.
-Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées.
-Répéter L’opération deux fois, en tournant la boite de 60° à chaque fois sans oublier de faire pivoter
l’écouvillon sur lui-même. Finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la périphérie de la gélose.
-Dans le cas ou l’on ensemence plusieurs boites de Pétri, il faut recharger l’écouvillon à chaque fois.
Application des disques d’antibiotiques :
-Il ne faut pas mettre plus de 6 disques d’antibiotiques sur une boite de 90mm de diamètre.
-Les disques d’antibiotiques doivent être espacés de 24 mm, centre à centre.

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 -La liste des antibiotiques à tester, selon la bactérie isolée est pré-listée.
Incubation :
-20 à 24 Heures, à 35°C.
-L’incubation se fait en atmosphère enrichie en CO (5%).
-La durée D’incubation peut être prolongée pour la lecture des macrolides.
Lecture :
-Mesurer avec précision, le diamètre de la zone d’inhibition de la croissance bactérienne et non pas celle
de l’hémolyse, à l’aide d’un pied à coulisse métallique, boite ouverte et bien éclairée.
- La zone d'inhibition circulaire est mesurée par le diamètre en mm, puis il sera possible de calculer la
CMI de l'antibiotique pour la souche examinée en reportant ce diamètre sur une courbe de concordance
- Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans des tables de lecture.
- Classer la bactérie dans l’une des catégories : Sensible, Intermédiaire, ou Résistante.
Interprétation des catégories S,I,R :
• la souche est dite RESISTANTE : la CMI ne peut être atteinte par un traitement réalisé à l’aide de cet
antibiotique sans être toxique.
• la souche est dite SENSIBLE : la CMI peut être atteinte par un traitement usuel réalisé à l’aide de cet
antibiotique.
• La souche est dite INTERMEDIARE : la CMI ne peut être atteinte qu’en augmentant les doses.
• NB/L’objectif de l’antibiogramme est de catégoriser cliniquement la sensibilité des bactéries aux
antibiotiques afin de prédire une efficacité chez le malade.
L’ancienne catégorisation clinique (S pour sensible, I pour intermédiaire et R pour résistant) a été
redéfinie par l’EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – organisme
européen d’uniformisation des pratiques de l’antibiogramme) en 2018 en lien avec les comités
nationaux européens (comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie ou CA-SFM
pour la France). Cette catégorisation clinique est directement reliée au niveau d’exposition de la
bactérie à l’antibiotique sur le site infectieux. Cette exposition dépend du mode d’administration, de la
posologie, des intervalles entre plusieurs administrations, mais aussi des caractéristiques
pharmacocinétiques de l’antibiotique.
La catégorisation clinique « I » intermédiaire disparaît. Les lettres « S », « SFP » et « R » prennent
désormais les significations suivantes :

« S » pour « sensible à posologie standard » ou plus simplement sensible. Une bactérie est
catégorisée sensible à posologie standard lorsqu’il y a une probabilité élevée de succès thérapeutique à
posologie standard de l’antibiotique ;

« SFP » pour « sensible à forte posologie ». Une bactérie sera catégorisée sensible à forte
posologie lorsqu’il y a une forte probabilité de succès thérapeutique due au fait que l’exposition de la
bactérie à l’antibiotique est augmentée par l’utilisation de posologies élevées ou si l’antibiotique est
fortement concentré au site de l’infection ;

« R » pour « résistant ». Une bactérie est catégorisée résistante lorsqu’il y a une forte probabilité
d’échec thérapeutique même en cas de forte exposition de la bactérie à l’antibiotique.

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 Le CLSI (OMS) commence à appliquer cette actualisation depuis 2019 de façon restreinte intéressant
certains genres bactériens comme les entérobactéries et les C4G cefepime.

Parmi les principales recommandations : on peut citer les points suivants :

- Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas
contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est
celui de Mueller-Hinton.
La gélose de Mueller-Hinton + 5% de sang de mouton pour les streptocoques et les campylobactéries, de
10% de sang de cheval pour Helicobacter pylori .
- Les teneurs en calcium et en magnésium doivent être contrôlées, car des
concentrations trop élevées inhibent l'action des aminosides, tétracyclines et polymyxines.
- La teneur en thymidine doit être fixe, car elle nuit à l'activité des sulfamides.
- Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques, il doit être compris entre 7,2 et 7,4.
- Pour les méthodes de diffusion, la source d'antibiotique est en fait constituée par le
disque et le cylindre de gélose sous-jacente. L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration
de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm.
- Les antibiotiques, ainsi que les disques doivent être standardisés et le laboratoire a
pour responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques
périmés.
Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être
utilisée dans les cinq jours.
- La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un
photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).
- Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus
importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée.
- La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation
est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale.
- La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence.
Les souches les plus couramment utilisées sont la souche ATCC 25922 de Escherichia coli, la souche
ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa et la souche ATCC 25923 de Staphylococcus aureus.
d) E-test :
Est caractérisé par sa facilité et sa rapidité de réalisation mais surtout par sa précision dans la détermination
de la CMI. Son principal inconvénient est son coût élevé.
Un gradient de concentrations d'antibiotique est obtenu dans une bandelette plastifiée. Il suffit de déposer
l'une de celle-ci (une bandelette par antibiotique) à la surface d'une boite de Pétri ensemencée par la
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suspension de la bactérie à tester puis après un nuit d'incubation à 37°C dans une étuve, de lire directement
la valeur de la CMI au niveau de la zone d’inhibition sous forme d’éclipse dont les points d'intersection avec
la bandelette définissent la CMI.
e) Antibiogrammes automatisés

Lecture interprétative de l’antibiogramme

Certains mécanismes de résistance s’expriment faiblement in vitro, alors qu’ils sont inscrits dans l’ADN
bactérien. Cette lecture permet une bonne connaissance des phénotypes de résistance : systèmes automatisés
dits ‘experts’.
III/ BACTERICIDIE :

Détermination de la CMB par dilution,

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 1) Définition :
Mort des bactéries d’un inoculum
Un antibiotique bactéricide tue les bactéries à des concentrations thérapeutiques.
2) CMB :
La plus faible concentration en agent capable d’entrainer la mort d’au moins 99,99% des bactéries d’un
inoculum (< 0,01% de survivants).
Valeur indicatrice du pouvoir bactéricide.
3) Méthodes de détermination de la CMB:
La CMB est déterminée après une recherche de CMI en milieu liquide (technique de macrodilution ou de
microdilution).
La technique consiste à ensemencer sur un milieu gélosé dépourvu d'antibiotique, une quantité définie de
tous les tubes ne présentant pas de croissance visible et à dénombrer les bactéries survivantes. Ce nombre est
comparé au nombre de bactéries initialement présentes dans l'inoculum.
N.B :
L’activité intrinsèque d’un antibiotique est définie par le rapport: CMB / CMI

CMB / CMI = 4 Antibiotique bactéricide

CMB / CMI = 8-16 Antibiotique bactériostatique

CMB / CMI = 32 Bactérie tolérante à l’antibiotique

V/ ETUDE DES ASSOCIATIONS BACTERICIDES DES ANTIBIOTIQUES :

L'interaction de deux antibiotiques peut produire quatre effets principaux :
• Indifférence : l'activité d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activité de l'autre ;
• Addition : l'effet de l'association est égal à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris
isolément ;
• Synergie : l'effet de l'association est supérieur à la somme des effets produits par chacun des
antibiotiques pris isolément ;
• Antagonisme : l'effet de l'association est inférieur à la somme des effets produits par chacun des
antibiotiques pris isolément.
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Il existe de nombreuses méthodes pour étudier les effets d'une association, mais aucune d'elles n'est
standardisée et elles sont généralement de mise en œuvre complexe. Le choix d'une méthode dépend donc
des possibilités du laboratoire.
Technique utilisant une méthode de dilution en milieu liquide :
Détermination des CMB de chaque antibiotique seul et des associations à étudier.
Technique par diffusion :
Deux techniques qualitatives permettent une évaluation, théoriquement simple, des effets bactériostatiques
des associations :
• Le placement rapproché de deux disques, à la surface d'un milieu gélosé, permet de détecter les
synergies ou les antagonismes les plus nets.
Avant d'effectuer le test d'association, on mesure le rayon de chacune des zones d'inhibition.
Dans le test proprement dit, la distance entre les disques sera égale ou légèrement supérieure à la somme de
ces rayons.
• La disposition à angle droit de deux bandes de papier filtre imprégnées des solutions d'antibiotique
permet, après observation de l'angle formé par la rencontre des deux zones d'inhibition, de déterminer
l'effet de l'association.
V/ AUTRES TESTS :
1) Etude du pouvoir bactériostatique et bactéricide du sérum :
Ces examens ont pour but de vérifier que le sérum (ou éventuellement tout autre liquide organique) d'un
malade recevant une antibiothérapie a un pouvoir bactériostatique ou bactéricide sur la souche responsable
de l'infection.
L'un des meilleurs examens de laboratoire permettant d'affirmer que le traitement administré est correct.
2) Dosage des antibiotiques dans les liquides biologiques :
Effectué pour les traitements
VI/ recherches complémentaires :TECHNIQUES PARTICULIERES :
1) Recherche de la résistance hétérogène du staphylocoque : méticilino-résistance : SARM :
Dans les conditions standard de l’antibiogramme, seule une fraction de la population exprime la résistance
aux pénicillines M. seules des conditions plus drastiques (incubation à 30°C ; milieu MH hyper salé)
permettent une meilleure expression de la résistance. On dépose un disque d’oxacilline à la surface du
milieu. La lecture se fait à 24 puis 48H. Une résistance hétérogène se manifeste par la présence de colonies
de taille variable autour du disque.
La forte présence de SARM en milieu hospitalier rend leur recherche indispensable.
2) Techniques rapides de mise en évidence de la penicillinase :
Les enzymes inactivant les Bêta-lactamines peuvent être détectées par une méthode chromogénique :

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Le principe repose sur l'utilisation d'une céphalosporine changeant de coloration après hydrolyse. La
molécule la plus utilisée est la nitrocéfine qui, après action d'une bêta-lactamase, vire du jaune au rouge. Des
disques de papier imprégnés de nitrocéfine sont commercialisés : Test Céfinase”.
3) Recherche de la bétalactamase à spectre etendu « BLSE » :
La technique par diffusion est également utilisée dans le cadre de la recherche de Bêtalactamase à Spectre
Etendu (BLSE). Pour cela on dépose sur la surface d'une gélose des disques de C3G (cefotaxime par
exemple), et d'amoxicilline + acide clavulanique à 3cm (on peut les rapprocher à 2 cm) l'un de l'autre.
Les BLSE sont des Bétalactamases et sont donc inhibées par l'acide clavulanique.
On observe alors une synergie d'action entre les deux antibiotiques, appelée "bouchon de champagne".

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Tableau .1 Bactéries pouvant produire des bêta-lactamases.

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 Réalisation de l’antibiogramme a partir de ces colonies isolées

1/100pour la méthode par inondation ou pour certains antibiotiques (écouvillonnage)

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 Protocole de l’antibiogramme

Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide

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Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé

Principe du Etest.

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Principe de la lecture d'un antibiogramme

Technique
Diffusion

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Mesure du diamètre de la zone d’inhibition à l’aide d’un pied à
coulisse ou d’une règle selon les recommandations.

Fin.

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