Cour - 1

Module de biophysique pharmaceutique
2020/2021
Spectrophotométrie UV-Visible
Plan du cours :
-Introduction
-Spectrophotométrie UV-Visible
1/Domaine UV-Visible
2/Rappel
3/Lois
4/Spectre d’absorption
5/Appareillage
6/Applications : -Analyse qualitative
-Analyse quantitative
Présenté par : Dr.Zemmouri

Maitre assistant
en biophysique pharmaceutique
1
2020/2021
Introduction :
En physique, les notions de photon et de spectre sont en effet liées à

la nature corpusculaire de toute onde électromagnétique et à la
décomposition de la lumière blanche par un milieu dispersif.
La spectroscopie est l’analyse du rayonnement électromagnétique

émis, absorbé ou diffusé par les atomes ou les molécules. Elle fournit
des informations sur l’identité, la structure, la quantité et les niveaux
énergétiques des atomes et des molécules du fait de l’interaction des
rayonnements électromagnétiques avec la matière.
Spectroscopie d’absorption dans l’UV-Visible
La spectroscopie d’absorption dans l’UV et le visible est une méthode

très commune dans les laboratoires.
Elle est basée sur la propriété des molécules d’absorber des

radiations lumineuses de longueur d’onde déterminée.
1/ Domaine UV-Visible :
Dans une molécule, les transitions électroniques ont lieu dans la
région de l’ultraviolet et du visible.
Le domaine UV-visible s'étend environ de 10 à 800 nm.
- Visible : 400 nm -800 nm .

- Proche-UV : 200 nm -400 nm
- UV-lointain : 10 nm- 200 nm .
Le domaine du spectre ultraviolet utilisable en analyse s’étend

environ de 200 à 400 nm.
Le domaine du spectre visible s’étend environ de 400 à 800 nm.
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2020/2021
2/ Rappel :
INTERACTION RAYONNEMENT-MATIERE
Rayonnement
- Nature ondulatoire : Un rayonnement électromagnétique (ou
radiation électromagnétique) est une onde constituée par deux
champs oscillants : un champ électrique E et un champ magnétique H
à la fois perpendiculaires entre eux et perpendiculaires à la direction
de propagation
On caractérise un rayonnement électromagnétique par sa fréquence,

sa longueur d'onde ou son nombre d’onde
λ =C.T
λ: Longueur d’onde en : m, μm, nm.
C: Célérité de la lumière dans le vide soit 3* 108 m/s
T: Période; temps au bout duquel le phénomène se reproduit
identique à lui même
v= 1/T=C/ λ
v : fréquence ( s-1 ou Hertz « Hz »)
-Nature corpusculaire : La nature ondulatoire de la lumière ne

permet pas à elle seule d’interpréter les phénomènes d’interaction
entre lumière et matière. Planck puis Einstein proposèrent la théorie
suivante :
La lumière est composée de grains d’énergie : les photons.
Le photon est une particule qui se propage à la vitesse de la lumière
et possède un quantum d’énergie :
E = h v = h C/ λ
E : Energie du photon en Joules (J)
h : constante de Planck = 6.62 . 10-34 J.s
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2020/2021
Une onde électromagnétique réelle est généralement constituée
d'une superposition d'ondes de fréquences différentes. La répartition
quantitative de la puissance propagée selon la fréquence est appelée
le « spectre » de l'onde.
Une transition UV-visible correspond à un saut d’un électron d’une
orbitale moléculaire fondamentale occupée à une orbitale
moléculaire excitée vacante.
• En mécanique quantique, l’énergie électronique n’est pas continue.

Elle ne peut prendre que certaines valeurs :
E0 , E1 , E2 ……. On dit alors que l’énergie est discontinue
3/ Lois :
LOI D’ABSORPTION DE LA LUMIERE - LOI DE BEER-LAMBERT

Lorsque la lumière arrive sur un milieu homogène de longueur l
(trajet optique), une partie de cette lumière incidente notée I0 est
absorbée par le milieu et le reste, noté I, est transmis. La fraction de
la lumière incidente absorbée par une substance de
concentration C contenue dans une cuve de longueur l est donnée par
la loi de Beer-Lambert :
L'absorbance d'une solution colorée A est égale à :
A=DO=ε(λ).L.C = log(I0/I)
ε(λ) : coefficient d'absorption molaire qui dépend du solvant de la

température et de la longueur d'onde
Unité légale: cm-1. mol-1.L
L(cm): épaisseur de solution traversée
C (mol.L-1) : concentration de la solution.
A est sans unité.
ε(λ): coefficient d'extinction. C’est une grandeur caractéristique du
composé.
Si la concentration est exprimée en g/100 ml, ε(λ) est appelé

coefficient d'extinction spécifique E1% .
Si la concentration est exprimée en mole /l, ε(λ) est appelé coefficient

d'extinction molaire.
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2020/2021
Remarque :
On définit également la transmission T comme le rapport de
l'intensité transmise à l'intensité incidente : T = I /I0
A = log (1/T)
Validité de la loi de Beer-Lambert
- Lumière monochromatique
- Faibles concentrations.
- La solution ne doit être ni fluorescente, ni hétérogène (bulles,
précipité…)
Additivité des absorbances

Dans le cas où la solution à étudier contient plusieurs espèces
absorbantes, l’absorbance mesurée à une longueur d’onde donnée est
la somme des absorbances des espèces prises séparément, à
condition que ces dernières n’interagissent pas l’une sur l’autre.
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2020/2021
4/ Spectre d’absorption :
L'enregistrement graphique - réalisé par un appareil appelé
spectrophotomètre - de la quantité de lumière absorbée ou transmise
par une substance en fonction de la longueur d'onde donne le
spectre d'absorption de la substance.
La position du maximum d'absorption d’une bande correspond à la

longueur d'onde de la radiation qui a provoqué la transition.
5/Appareillage :
Un spectrophotomètre UV-visible est constitué de:

- Une source de lumière blanche
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- Un monochromateur :
Permettant de sélectionner une radiation monochromatique de

longueur d'onde précise, peut être un filtre (d’absorption ou
interférentiel), un prisme ou un réseau de diffraction.
-Cuve :
Elle contient de 1 à 3 ml de solution. Les cuves en plastique

sont utilisées pour les mesures dans le visible et en milieu
aqueux.
Cuves en verre : pour les mesures dans le visible et en

milieu aqueux ou organique.
Cuves en quartz : pour les mesures dans le domaine de

l’ultraviolet.
-Détecteur :
Le détecteur photoélectrique convertit le signal

lumineux en signal électrique.
- la courbe qui représente l'absorbance en fonction de la longueur

d'onde est appelée le spectre de l'échantillon. )
6/Applications :
Analyse qualitative :
Il s’agit de réaliser les spectres d’absorption de la molécule connue

dite de référence et de la molécule X inconnue, et qu’on veut
déterminer s’il s’agit de la molécule de référence ou non.
On obtient deux spectres d’absorption : Si les deux spectres sont

homothétiques on conclue qu’il peut s’agir de la même molécule, et si
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2020/2021
les deux spectres ne sont pas homothétiques on conclue que les deux
molécules ne sont pas les mêmes.
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2020/2021
Analyse quantitative :
La spectrophotométrie est une méthode utilisée

fréquemment en analyse quantitative. C’est une méthode
relative, elle implique la réalisation d’une courbe
d’étalonnage A = f (C), à partir de solutions de concentration
connues. Le dosage se fait à la longueur d’onde d’absorption
maximale.
A l’aide d’une méthode statistique (régression linéaire par la

méthode des moindres carrés), on obtient l’équation d’une
droite de la forme : y = a x + b
On mesure après l’absorbance de la solution de

concentration inconnue, et on calcule la valeur de sa
concentration à partir de l’équation de la courbe.
Parmi les nombreuses applications de le spectrophotométrie UV-

Visible:
9
2020/2021
• L’environnement : polluants de l’eau, atmosphère.
• Pharmacie : identification et dosage des matières premières et

des produits finis.
• Biologie clinique : glycémie, urée, créatinine, cholestérol…
10

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6/Applications : -Analyse qualitative

Présenté par : Dr.Zemmouri

En physique, les notions de photon et de spectre sont en effet liées à

La spectroscopie est l’analyse du rayonnement électromagnétique

Spectroscopie d’absorption dans l’UV-Visible

La spectroscopie d’absorption dans l’UV et le visible est une méthode

Elle est basée sur la propriété des molécules d’absorber des

- Visible : 400 nm -800 nm .

Le domaine du spectre ultraviolet utilisable en analyse s’étend

On caractérise un rayonnement électromagnétique par sa fréquence,

-Nature corpusculaire : La nature ondulatoire de la lumière ne

• En mécanique quantique, l’énergie électronique n’est pas continue.

E0 , E1 , E2 ……. On dit alors que l’énergie est discontinue

LOI D’ABSORPTION DE LA LUMIERE - LOI DE BEER-LAMBERT

ε(λ) : coefficient d'absorption molaire qui dépend du solvant de la

Si la concentration est exprimée en g/100 ml, ε(λ) est appelé

Si la concentration est exprimée en mole /l, ε(λ) est appelé coefficient

Validité de la loi de Beer-Lambert

Additivité des absorbances

La position du maximum d'absorption d’une bande correspond à la

Un spectrophotomètre UV-visible est constitué de:

Permettant de sélectionner une radiation monochromatique de

Elle contient de 1 à 3 ml de solution. Les cuves en plastique

Cuves en verre : pour les mesures dans le visible et en

Cuves en quartz : pour les mesures dans le domaine de

Le détecteur photoélectrique convertit le signal

- la courbe qui représente l'absorbance en fonction de la longueur

Il s’agit de réaliser les spectres d’absorption de la molécule connue

On obtient deux spectres d’absorption : Si les deux spectres sont

La spectrophotométrie est une méthode utilisée

A l’aide d’une méthode statistique (régression linéaire par la

On mesure après l’absorbance de la solution de

Parmi les nombreuses applications de le spectrophotométrie UV-

• Pharmacie : identification et dosage des matières premières et

• Biologie clinique : glycémie, urée, créatinine, cholestérol…

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