2 Cours Spectrophotometrie

L3 BIOCHIMIE Université Benyoucef Benkhedda Année universitaire 2020-2021
Module de TAB Faculté des sciences BENAHMED.D

Département SNV
Les méthodes spectrales

I. Introduction :
Les méthodes spectrales sont des méthodes qui étudient les interactions entre la lumière et la
matière.
La spectroscopie est l’étude des rayonnements électromagnétiques émis, absorbés ou diffusé par
la matière. Celle-ci effectue une transition d’un état quantique à un autre.
Le spectre électromagnétique est un nom collectif pour tout rayonnement électromagnétique :

lumière visible, rayonnement thermique, rayonnement ultraviolet, rayonnement infrarouge,
ondes radio, rayons X et rayonnement radioactif.
Cette science nous permet d’étudier le devenir de la lumière (le rayonnement visible) lorsqu’elle
est décomposée selon ses différentes longueurs d’ondes pour engendrer des spectres.
Le spectre électromagnétique de la lumière :

Toute lumière peut être décomposée en un spectre par un système dispersif (prisme ou réseau).
Chaque couleur est appelée radiation lumineuse. Chaque radiation est caractérisée par une
longueur d’onde.
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II. Propriétés du rayonnement électromagnétique :
Le rayonnement électromagnétique est un type d’énergie qui peut être, une lumière visible, une
chaleur rayonnante, des rayons y, des rayons X, le rayonnement ultraviolet, les micro-ondes et
les ondes radio.
Ce rayonnement électromagnétique peut être représenté par un champ électrique et un champ

magnétique qui oscillent perpendiculairement l’un par rapport à l’autre, selon une loi sinusoïdale.
Seule la composante électrique sera considérée. C’est le champ électrique qui est responsable de
la plupart des phénomènes : transmission, réflexion, réfraction, absorption.
Certains paramètres nous renseignent sur ces ondes :
La longueur d’onde λ est la distance entre deux maxima ou minima successifs d’une onde. Elle est
mesurée en mètre ou en l'un de ses sous-multiples.
La période P est le temps qui sépare les passages de deux maxima (ou minima) successifs. L’unité
est la seconde.
La fréquence (ν) : inverse de la période, elle traduit le nombre de cycles par unité de temps.
Elle s’exprime en Hertz (Hz) - un Hz équivaut à une oscillation par seconde - ou en multiples du
Hertz.
La fréquence ν de l’oscillation périodique des champs caractérise la nature de la radiation. Tout

rayonnement est porteur d’une énergie E dans la valeur dépend de la fréquence.
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Longueur d’onde et fréquence sont inversement proportionnelles et unies par la relation suivante
:
𝐜
λ=
𝝂
- λ: longueur d’onde de l’onde électromagnétique.

- c : vitesse de la lumière (3.108 m.s-1).
- ν : la fréquence de l’onde.
III. Nature corpusculaire de la lumière :

La lumière est constituée de photon. Chaque photon possède sa propre énergie E, et la relation
entre l’énergie et la fréquence est donnée par la relation suivante :
E = h.ν
Où : h est la constante de planck (h=6,626. 10−34 J. s.
𝐜 𝐜
Puisque λ= donc E = h.
𝝂 𝛌
Il apparait donc que l’énergie du photon est inversement proportionnelle à la longueur d’onde de
la radiation (les rayonnements ultraviolet sont plus énergétique que les infrarouge) et
proportionnelle au nombre d’onde.
IV. La spectrophotométrie
1) La loi de Beer-Lambert :
Lorsque la lumière traverse une substance, elle est en partie transmise et en partie absorbée.
Si une substance absorbe dans le domaine visible (400 nm < λ < 800 nm), alors elle est colorée.
a) Le flux lumineux :
Une solution éclairée par de la lumière blanche prendra la couleur des radiations qui parviennent à
traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées.
On peut utiliser le cercle chromatique qui permet de visualiser rapidement quelles sont les couleurs
complémentaires:
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b) Etude qualitative :
Elle consiste à tracer le spectre d’absorption de la substance par la mesure de la variation

d’absorbance en fonction de la longueur d’onde. C’est à une longueur d’onde correspondant au
maximum d’absorption que l’on mesure le coefficient d’absorption moléculaire de la substance
étudiée.
Il faut toujours définir le solvant, le pH, et la température car l’emplacement des longueurs d’onde
maximale peut varier avec les trois paramètres, ainsi que les coefficients d’absorption moléculaire
mesurés à ces longueurs d’onde.
c) Etude quantitative :
Elle s’effectue à la longueur d’onde du maximum d’absorption définie lors de l’étude qualitative.
Considérons une radiation monochromatique (de longueur d’onde λ) incidente, d’intensité I0.
Cette radiation traverse une épaisseur (l) de solution du composé X de concentration C qui
absorbe la lumière partiellement. L’intensité transmise est It, It < I0.
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La relation entre ces différents éléments est donnée par la loi de Beer-Lambert avec l’expression
mathématique suivante :
I = 𝐈𝟎 𝟏𝟎−𝛆𝐥𝐜
I0 = Intensité de la lumière incidente. L= Epaisseur du milieu absorbant.
I = Intensité de la lumière transmise. C= concentration de la solution analysée.
ε = Coefficient d’absorption moléculaire.
On peut alors définir deux grandeurs :
𝐈
La transmitance : 𝐓= = 𝟏𝟎−𝛆𝐥𝐜
𝐈𝟎
𝟏 𝐈𝟎
L’absorbance : A= log = 𝐥𝐨𝐠 = 𝛆𝐥𝐜
𝐓 𝐈
La densité optique qui correspond à l’absorbance est sans unité, elle varie de 0 à 2.
2) Conditions de validité de la loi de Beer-Lambert:
La loi de Beer-Lambert ne s’applique et n’est linéaire que sous certaines conditions que sont :
- L’utilisation de radiations monochromatiques.
- L’absence de diffusion et de fluorescence au niveau de la solution. Le flux lumineux doit être
continu pour éviter les mesures fragmentées de l’énergie lumineuse.
- L’utilisation de solutions diluées et limpides.
Les conditions d’une bonne méthode de dosage sont :

- La spécificité : la réaction colorée doit être spécifique de la substance à doser (elle doit être
seule à réagir avec les réactifs de coloration).
- La solubilité : le produit coloré obtenu doit être soluble et la solution doit être limpide.
- La stabilité : la coloration doit être stable pour permettre d’effectuer des lectures sans que la
coloration n’évolue ou change.
- Proportionnalité : l’intensité de la coloration obtenue doit être proportionnelle à la quantité
de la substance à doser.
- La sensibilité : la réaction doit sensible pour permettre de doser des solutions de faibles
concentrations.
3) Appareillage
Un spectrophotomètre est composé de cinq éléments fondamentaux :
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1- Une source lumineuse : de rayonnement d’émission constant et d’intensité stable.
2- Porte échantillon : C’est un compartiment échantillon dans lequel se trouve le porte cuve qui
peut contenir une ou plusieurs cuves. Celles-ci permettent de contenir l’échantillon et de le
maintenir lors du passage du faisceau lumineux.
3- Un monochromateur : permettant de sélectionner la longueur d’onde de mesure le plus

précisément possible. Il est constitué d’une fente d’entrée, d’un collimateur maintenant le
faisceau parallèle et d’un dispositif de sélection des longueurs d’ondes (prisme ou système
dispersif).
4- Un détecteur : C’est un récepteur sensible aux rayons reçus et transformant l’énergie
lumineuse en signal électrique. Exp : cellules photoélectriques - tubes photomultiplicateurs.
5- Un système de traitement du signal : celui-ci est composé d’un galvanomètre qui permet de
mesurer le courant fourni par le détecteur ; d’un enregistreur qui reçoit du détecteur un
certain potentiel électrique qui est transformé en déplacement d’un stylet inscripteur sur le
papier d’enregistrement.
Et d’un logiciel permettant le traitement informatique des données permettant l’affichage ou
l’enregistrement des résultats obtenus.
Figure : Schéma représentant les composants d’un spectrophotomètre.

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Le spectre électromagnétique de la lumière :

Ce rayonnement électromagnétique peut être représenté par un champ électrique et un champ

Certains paramètres nous renseignent sur ces ondes :

La fréquence ν de l’oscillation périodique des champs caractérise la nature de la radiation. Tout

- λ: longueur d’onde de l’onde électromagnétique.

III. Nature corpusculaire de la lumière :

Elle consiste à tracer le spectre d’absorption de la substance par la mesure de la variation

2) Conditions de validité de la loi de Beer-Lambert:

Les conditions d’une bonne méthode de dosage sont :

Un spectrophotomètre est composé de cinq éléments fondamentaux :

3- Un monochromateur : permettant de sélectionner la longueur d’onde de mesure le plus

Figure : Schéma représentant les composants d’un spectrophotomètre.

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