I-Dosage multi-rsidu de pesticides

organochlors ,et les pyrethrinoides dans les

aliments dorigine animale comme (le lait entier
liquide , les ufs et les poissons ). Par GC/ECD
1-Avertissement et prcautions de scurit :
Les vapeurs de certains solvants volatils sont trs toxiques. Beaucoup de ces derniers
pntrent
par la peau. Utiliser un dispositif daspiration de fume efficace pour liminer les vapeurs
ds leur
dgagement.
La prparation des solutions de travail contenant des pesticides ncessite la manipulation
de
substances actives pures ou trs concentres. Eviter tout contact avec la peau et le
risque
dinhalation de particules par le port de blouse, de gants, de lunettes et/ou dun masque .

2-Objet et domaine dapplication :

Cette procdure dcrit lanalyse quantitative des organochlors , organophosphors et
pyrethrinoides dans les aliments dorigine animale comme( le lait entier liquide , les
ufs , les poissons , et autres denrs alimentaires grasses ). Par LC-MS/MS et GC/MS .

Les pesticides pour lesquels la mthode a t teste sont :

Tableau 1 : liste des pesticides entrant dans le champ dapplication de la mthode

Pesticides organochlors

Pyrthrinodes

HCB
HCH
HCH
HCH
Heptachlore
Dicofol op
Aldrine
Heptachlore-epoxy
Oxychlordane
Chlordane
DDE op
Endosulfan (1)
Chlordane
DDE pp
Dieldrine
Endrine
TDE op

Cyalothrine
Permethrine
Cyfluthrine
Cypermethrine
Fenvalerate
Deltamethrine

TDE PP
DDT pp
Dicofol

3-Principe de la mthode :
Cette mthode comprend des techniques dextraction de la matire grasse (extraction
par centrifugation cryognique) ,dextraction des pesticides et des pyrthrinoides ainsi
que des techniques de purification pour le lait liquide . cest une chromatographie solideliquide sur cartouche prte lemploi (SPE extraction par phase solide ) .deux types de
phases sont utiliss successivement : C18 puis Florisil

4-Ractifs et produits

Solutions dtalonnage
Solution standard de 24 pesticides de concetration 20 ppb
un mlange de six pyrthrinoides prpar partir de solutions concentres de
(delthamthrine, prmthrine , cypermthrine ,fervalrate, cyfluthrine ,
cyhalothrine.)
Etalon interne
Les solvants utiliss de qualit HPLC :
Actone
Dithyl ther
Ether de ptrole
n-hexane
Actonitrile
Mthanol
Dichloromthane
Dodcane comme rtenteur des rsidus lors des vaporation
Les cartouches apolaires dextraction en phase solide( C18 de 1g)
Les cartouches polaires dextraction en phase solide( Florisil de 1g)
Laine de verre
Sable marin
Sulfate de sodium anhydre
Filtres papier

5- Appareillage :
Matriel courant de laboratoire en particulier :
Pour lextraction de la matire grasse et des rsidus :
Centrifugeuse rfrigre pouvant tourner 3000 tours par minute.
Evaporateur rotatif avec dispositif de mise sous vide (pompe eau) et
condenseur rfrigr
(ventuellement).
Ampoules dcanter, ballons, et verrerie usuelle de laboratoire
Platine ou bain dvaporation sous azote.
Pour la purification SPE :
Cuve hermtique dextraction sous vide pour cartouche, munie dune fuite
dair. Pompe vide. Un automate peut tre utilis.
Pour le dosage par Chromatographie en Phase Gazeuse :
Chromatographe en phase gazeuse quip dun injecteur appropri (avec
ventuellement un systme dinjection automatique),

dun four et dun dtecteur capture dlectrons.

Les caractristiques de pr-colonne et de colonne sont prsentes titre dexemple dans
le
tableau 2.

Tableau 2 : Caractristiques de pr-colonne et de colonne de chromatographie

Pr-colonne

Colonne capillaire
Longueur en m
50
Diamtre interne en mm
0.32
Composition pr-colonne

1.5
0.32
Silice fondue dsactive

Composition du film
Dimthyle-polysiloxane
(100 %)
Epaisseur du film en m
0.25
polarit
100 % apolaire

Conditions chromatographiques utilises

Dtecteur
Gaz vecteur
Dbit en PSI
Gaz additionnel dtecteur
Colonne Cf
Volume dinjection en l
T C dtecteur
Programmation injecteur
T C initiale
Pente en C / min
T C seuil
Dure en min
Programmation du four
T C initiale
Plateau en min
Pente en C / min
T C seuil
Pente en C / min
T C seuil

ECD
Hlium
23
Azote
tableau 2
1
320
50
150
250
52

100
2
7
220, 10 min
3
285, 5 min

Les chromatogrammes sont enregistrs et traits par un logiciel dacquisition et de traitement

des donnes .

6-Echantillonnage :
Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie

7-Mode opratoire :

1iere mthode

Prlever 5 mL de chaque chantillon du lait

mlangs au mortier et homogniss avec 40 g de sulfate de sodium anhydre
(Na2SO4) jusqu lobtention dune poudre fluide.
Le mlange est extrait laide de la mthode dextraction liquide avec le
dichloromthane comme solvant dextrait.
L'exsudat est recueilli dans un ballon pralablement sch (105C ltuve
pendant 24h) et tar. Il est vapor sec sur le rotavapor Buchi et la teneur en
graisse est dtermine par gravimtrie.
Le produit obtenu a t purifi sur du florisil (active 3 %) avec un mlange de
dichloromthane/hexane (4/5 dhexane et 1/5 de dichloromthane) utilis comme
solution de migration.
Le conditionnement final a t fait dans lhexane. Le volume recueilli est rduit
2 mL puis ajust avec lhexane 5 mL.

2ime mthode( extraction et sparation)

1-Extraction de la matire grasse (extraction de la crme du lait)
Si lchantillon est congel, le dcongeler temprature ambiante pendant quelques heures.

Prlever 30 ml de lait dans un tube centrifuger. Centrifuger deux fois 10 minutes

3000tpm.
Rcuprer la crme aprs chaque centrifugation, y ajouter 10 g de sulfate de sodium
anhydre.(Na2SO4) .mlager avec le vortex jusqu lobtention dun mlange
dmulsion.
Extraire la crme avec 30 ml de n-hexane en mlangeant laide dune spatule.
Rcuprer la phase organique et la filtrer sur sulfate de sodium dans un ballon prpes.
Extraire nouveau la matire grasse avec 3 fois 10 ml de n-hexane, les filtrer sur le
sulfate de sodium puis rincer celuici avec 10 ml de n-hexane. Evaporer lextrait sous
vide 35 C environ, jusqu 1 ml et terminer sous azote. Peser lextrait. Prlever 500
mg de graisse pour ltape de centrifugation cryognique

7-2- Extraction cryognique

Procder la centrifugation cryognique dcrite en 6.4.1.2. de la norme NF EN 1528.
Aprs soi on continu ltape de purification ,ou on procde par la Techniques dextraction des
matrices semi-solides : de la MSPD aux Quechers

7-3-1- Purification
. Le choix entre les diffrents types de cartouches apolaires dpend de la quantit de l'extrait dpose
- une cartouche de silice greffe de type C18 de 1g a une capacit spcifique de 50 mg ;
- une cartouche polymre de 0.5g a une capacit spcifique de 100 mg.
Le protocole de purification est identique quel que soit le type de cartouche utilis.

Purification sur cartouche c18 :

Conditionnement : dposer successivement sans asscher la cartouche entre chaque solvant :

5 ml dther de ptrole, 5 ml dactone,2 fois 5 ml de mthanol, et laisser scouler le

mthanol sec
Reprendre lextrait par 2ml dactonitrile ,le dposer sur la cartouche et luer jusquau
mnisque
Laisser en contact 3min au moin
Rincer le tube avec 10ml dactonitrile et lesdposer sur la cartouche
Eluer lactonitrile un dbit de 1goutte/seconde environ
Evaporer lluat sous vide 35 C environ (en prsence de 100l de dodcane ) et reprendre
dans 1ml dhexane

Purification sur cartouche de FLORISIL R (1g) :

Conditionnement :

dposer 10 ml dhexane (luer jusquau mnisque , ne pas asscher la cartouche ).

Dposer lextrait obtenu aprs purification sur cartouche C18 (1 ml) et lluer jusquau
mnisque
Laisser en contact 3 min au moins et luer par 10 ml dether de ptrole/ther thylique EP/EE
98/2 ,dbit 1 goutte/seconde environ
Eluer ensuite par 12 ml EP/EE 85/15 ? dbit 1goutte/seconde (les 2 luats sont mlangs )
Evaporer les luats 35 C environ (en prsence de 100 l de dodcane ) et reprendre dans
1 ou 2 ml dhexane .
Conserver une partie de cet extrait pour des dilutions ventuelles

8- Analyse

par chromatographie en phase gazeuse

Injecter 1 2 l de lextrait obtenu prcdemment en chromatographie en phase gazeuse

quipe dun dtecteur ECD ,en prsence dun standard interne (par exemple le
transnonachlore)
9- EXPRESSION

DES RESULTATS

FORMULE DE CALCUL :
Rendement de purification :

[Ht*STr]
[-----------------] aprs C18
[Ht*SInt*STr]
Tx = --------------------------------------------- x 100
[Ht*STr]
[----------------------] avant.C18
[ Ht*Sit*STr]
Les rsultants des essaies sont calcules par le logiciel qui utilise la formule suivante

[Ht*Ech ]

----------------Ht*SInt*Ech ]
Q=

[ C*STr]

---------------------------- x -------------- x Vol(Masse)xFd

[Ht*STr]

[ M*Ech]

--------------[Ht*Sint*STr]

Ht : hauteur du pic
STr : solution de travail
SInt : standard interne
Tx : taux de rcupration
Ech : chantillon
C

: concentration en ng/ml (ou en ng/g)

Vol : volume final en ml (ou Masse en g)

Fd : facteur de dilution ventuel
Q : quantit de rsidu en ng/g

7-3-2 la Techniques dextraction des matrices semi-solides : de

la MSPD aux Quechers
Matrices semi solides : comme le Yaourts; crmes : mulsion; prsence de micelles !Huile Olive, Miel

Les tapes dextraction QuEChERS :

10 15 g matrice broye (parfois congele)

Tampon citrate (pH=5-5.5) : norme EN
Tampon actate(pH=4.8) : norme AOAC 2007-01
+ 10 ml ACN (voire actate thyle mais pas de solvants
qui solubilisent les sels, genre mthanol).
Agitation (manuelle,vortex) 1 min
Transfrer dans un tube contenant MgSO4
(4 g) et NaCl (1g)
(salting out matrice aqueuse vers actonitrile)
Ajout talon interne : tri-phenylphosphate

Agitation manuelle 1 min + Centrifugation 2 min

Purification : dispersive solid-phase extraction (d-SPE)
1 ml surnageant dans tube contenant un adsorbant qui pige les
impurets co-extraites
Vortex 30 s, Centrifugation
Prlvement surnageant (500 ml)
Injection : LC/MS-MS; GC/MS

QuEChERS : les adsorbants en d-SPE (retiennent les contaminants)

MgSO4 : pigeage deau rsiduelle
PSA (amine primaire et secondaire) : Pigeage acides organiques,
sucres
C18 : adsorption composs lipidiques (cholestrol) (le lait)
GCB : pigments (carotnodes; chlorophylle), strols, mais aussi
pesticides plan (HCB) Tolune comme extractant (Shrenck)

II-Dosage multi-rsidu de pesticides

organophosphors dans les aliments dorigine
animale ( le lait
entier liquide et la graisse ). Par GC/ECD
1- AVERTISSEMENT ET PRECAUTION DE SECURITE
Les vapeurs de certains solvants volatils sont trs toxiques. Beaucoup de ces derniers
pntrent par la peau. Utiliser un dispositif daspiration de fume efficace pour liminer les
vapeurs ds leur dgagement.
La prparation des solutions de travail contenant des pesticides ncessite la manipulation de
substances actives pures ou trs concentres. Eviter tout contact avec la peau et le risque
dinhalation de particules par le port de blouse, de gants, de lunettes et/ou dun masque.
2- INTRODUCTION
La mthode dcrite est destine extraire, purifier et doser des pesticides
organophosphors dans le lait entier et dans la graisse animale. Cette mthode propose une
technique de prparation nouvelle, base sur la chromatographie solide-liquide en
cartouches prtes lemploi (Solid Phase Extraction ou SPE).
3- OBJET ET DOMAINE DAPPLICATION
La mthode dcrite permet le dosage de pesticides organophosphors dans le lait entier cru
ou pasteuris, lhuile de beurre et dans la graisse danimaux de boucherie, et de certains
pesticides organochlors dont la polarit se rapproche de celle des pesticides
organophosphors. Les pesticides pour lesquels la mthode a t teste sont :
Tableau 1 : liste des pesticides entrant dans le champ dapplication de la mthode
Pesticides organophosphors
Phorate Chlorpyriphos ethyl
Phorate oxon Chlorpyriphos methyl

Phorate sulfone
Diazinon Pesticides organochlors
Disulfoton Chlorothalonil
Disulfoton sulfone Beta endosulfan
Pirimiphos methyl Endosulfan sulfate
Triazophos
Methidathion
5- PRINCIPE
Cette mthode comprend des techniques dextraction de la matire grasse, dextraction des
pesticides ainsi que des techniques de purification pour le lait entier, lhuile de beurre et la
graisse danimaux de boucherie.
Les techniques dextraction de la matire grasse sont extraction par centrifugation
cryognique . Pour le lait cru, le principe et la mise en oeuvre sont dcrits dans la prsente
mthode. En ce qui concerne la purification, la mthode dcrite utilise une mme technique
applicable pour les diffrentes matrices. Cest une chromatographie solide-liquide sur
cartouche prte lemploi (SPE ou Solid Phase Extraction), sur une phase apolaire, C18 ou
polymre.
6- REACTIFS ET PRODUITS
Les solutions dtalonnage ont t fabriques partir de solutions concentres de
pesticides.
Une solution standard contient 11 pesticides organophosphors aux concentrations
denviron 20 g/g.
Etalon interne, par exemple le malathion.
Les solvants utiliss sont de qualit analytique pour chromatographie :
Actone,
n-hexane,
actonitrile,
mthanol,
dichloromthane.
Le dodcane, est utilis comme rtenteur des rsidus lors des vaporations.
Les cartouches apolaires dextraction en phase solide sont des cartouches de silice
greffe de type C18 de 1g ou polymre de 500mg.
Autres produits ractifs :
laine de verre,
sulfate de sodium anhydre.
Filtres papier,
azote,
hlium.
7- APPAREILLAGE
Matriel courant de laboratoire en particulier :
Pour lextraction de la matire grasse et des rsidus :
Centrifugeuse rfrigre pouvant tourner 3000 tours par minute.
Evaporateur rotatif avec dispositif de mise sous vide (pompe eau) et condenseur
rfrigr (ventuellement)
Ballons, et verrerie usuelle de laboratoire

Platine ou bain dvaporation sous azote.

Pour la purification SPE :

Cuve hermtique dextraction sous vide pour cartouche, munie dune fuite dair.
Pompe vide.
Un automate peut tre utilis.
Pour le dosage par Chromatographie en Phase Gazeuse :
Chromatographe en phase gazeuse quip dun injecteur appropri (avec ventuellement un
systme dinjection automatique), dun four et dun dtecteur spcifique des molcules
doser.
Les caractristiques de pr-colonne et de colonne sont prsentes titre dexemple dans le
tableau 2.
Tableau 2 : Caractristiques de pr-colonne et de colonne de chromatographie.

Pr-colonne
Colonne analytique
Longueur en m
25
Diamtre interne en mm
0.22
Composition pr-colonne

2
0.32
Silice fondue dsactive

Composition du film
5% phnyl, 95% MM2THY
Mthyl
Epaisseur du film en m
0.25
polarit
100 % apolaire

Exemple de programmation de la chromatographie, tableau 3.

Tableau 3 : Conditions chromatographiques possibles
Dtecteur
NPD
Hlium
Gaz vecteur
23
Dbit en PSI
AIR
Gaz additionnel dtecteur
tableau 2
Colonne Cf
1
Volume dinjection en l
300
T C dtecteur

Programmation injecteur
T C initiale
Pente en C / min
T C seuil
Dure en min
Programmation du four
T C initiale
Plateau en min
Pente en C / min
T C seuil
Plateau en min
T C seuil

50
150
250
19.5

80
2
10
280 min
1
285, 5 min

- ECHANTILLONNAGE
Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie.
9- MODE OPERATOIRE
9.1- Extraction de la matire grasse
Lait entier. Extraction de la crme
Si lchantillon est congel, le dcongeler temprature ambiante pendant quelques heures.
Prlever 30 ml de lait dans un tube centrifuger.
Centrifuger deux fois 10 minutes 3000 tpm.
Rcuprer la crme aprs chaque centrifugation, y ajouter 10 g de sulfate de sodium
anhydre.
Extraire la crme avec 30 ml de n-hexane en mlangeant laide dune spatule.
Rcuprer la phase organique et la filtrer sur sulfate de sodium dans un ballon prpes.
Extraire nouveau la matire grasse avec 3 fois 10 ml de n-hexane, les filtrer sur le
sulfate de sodium puis rincer celuici avec 10 ml de n-hexane.
Evaporer lextrait sous vide 35 C environ, jusqu 1 ml et terminer sous azote.
Peser lextrait.
Prlever 500 mg de graisse pour ltape de centrifugation cryognique.
9.2- Extraction cryognique
Procder la centrifugation cryognique dcrite en 6.4.1.2. de la norme NF EN 1528.
9.3- Purification
La mthode de purification est commune toutes les matrices. Le choix entre les diffrents
types de cartouches apolaires dpend de la quantit de l'extrait dpose :
- une cartouche de silice greffe de type C18 de 1g a une capacit spcifique de 50 mg ;
- une cartouche polymre de 0.5g a une capacit spcifique de 100 mg.
Le protocole de purification est identique quel que soit le type de cartouche utilis.

Conditionnement : dposer successivement sur la cartouche et luer sans

asschement entre chaque solvant : 5 ml de mthanol, 5 ml dactone, 5 ml de
mlange actonitrile/dichloromthane (AN/DCM) 95/5 et luer jusquau mnisque.
Reprendre l'extrait obtenu aprs extraction cryognique dans 1 ml d'un mlange
AN/DCM 95/5.
Le dposer sur la cartouche, luer jusquau mnisque, laisser en contact de 3 5
min
Eluer par 10 ml de mthanol, sec 1 goutte/3 secondes environ.
Aspirer pour rcuprer le volume retenu par la cartouche.
Evaporer lluat 35 C environ sous un lger courant dazote en prsence de 100
l de dodcane puis reprendre dans 1 ou 2 ml dhexane.

9.4- Analyse par chromatographie en phase gazeuse

Injecter 1 2 l de lextrait obtenu prcdemment en chromatographie en phase gazeuse
quipe dun dtecteur spcifique du phosphore, PFPD, FPD ou NPD, en prsence dun
talon interne (par exemple le malathion).
9- EXPRESSION

DES RESULTATS

FORMULE DE CALCUL :
Rendement de purification :

[Ht*STr]
[-----------------] aprs C18
[Ht*SInt*STr]
Tx = --------------------------------------------- x 100
[Ht*STr]
[----------------------] avant.C18
[ Ht*Sit*STr]
Les rsultants des essaies sont calcules par le logiciel qui utilise la formule suivante

[Ht*Ech ]
----------------Ht*SInt*Ech ]
Q=

[ C*STr]

---------------------------- x -------------- x Vol(Masse)xFd

[Ht*STr]

[ M*Ech]

--------------[Ht*Sint*STr]

Ht : hauteur du pic
STr : solution de travail
SInt : standard interne
Tx : taux de rcupration
Ech : chantillon
C

: concentration en ng/ml (ou en ng/g)

Vol : volume final en ml (ou Masse en g)

Fd : facteur de dilution ventuel
Q : quantit de rsidu en ng/g