Practica 9. Separacion y Determinación de Proteinas 2021

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“Innovación y desarrollo integral en los agronegocios”
PRÁCTICA DE LABORATORIO 9
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Y DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Introducción
Las proteínas poseen propiedades y características que las diferencian unas

de otras y por medio de ellas pueden ser separadas y aisladas de sus
fuentes. Entre las propiedades más importantes que se mencionan se
encuentran la solubilidad, el punto isoeléctrico, la desnaturalización,
solvatación o hidratación, densidad y comportamiento en presencia de
sales.
La solubilidad de las proteínas depende del grado de hidratación y del

número o arreglo de cargas alrededor de la molécula, lo cual depende, a su
vez, de la composición de aminoácidos y de la presencia o ausencia de otros
residuos, tales como fosfatos, lípidos, carbohidratos y otros. Las moléculas
de proteínas cargadas se acercan lo suficiente como para formar agregados
o precipitados, cuando la constante dieléctrica es reducida por la adición de
acetona, alcohol u otros solventes. Esto también sucede cuando se consigue
la fortaleza iónica apropiada, mediante la adición de electrolitos. En
presencia de grandes concentraciones de sales, como el sulfato de amonio,
se disminuye el grado de hidratación, se reduce el número de cargas de
proteínas, y consecuentemente, estas se agregan y precipitan.
La separación selectiva de proteínas puede realizarse a bajas

concentraciones de los iones de algunos elementos pesados tales como
Hg2+, Zn2+ y Cu2+ . A pH inferiores al punto isoeléctrico de la proteína, ésta
se carga positivamente y se precipita con aniones, pH superiores, precipita
cationes.
Un procedimiento corriente para separar proteínas de sus disoluciones

consiste en ajustar el pH al punto isoeléctrico de la proteína de interés. La
solubilidad de la proteína tiene su valor mínimo, y luego se adiciona una sal
neutra, por ejemplo, sulfato de potasio o de sodio. Puesto que las distintas
proteínas de una mezcla se precipitan a diferentes concentraciones de una
sal, la separación es factible mediante el incremento controlado de la
concentración de esa sal.
En esta ocasión se utilizará el punto isoeléctrico para la separación de las

proteínas de la leche.
Con respecto a la determinación de proteínas, se realizará mediante el
método Kjeldahl, el cual determina el contenido de nitrógeno en muestras
orgánicas e inorgánica, en tres etapas: la digestión de la muestra en la
cual el nitrógeno orgánico se transforma en NH 4+, destilación en la que
NH3 es destilado y recogido en un recipiente receptor y luego se valora por
titulación para determinar el % nitrógeno.
El % de nitrógeno se determina mediante ecuaciones que depende del uso

de reactivos en el proceso, en el caso de la práctica se empleará ácido
bórico para como solución receptora, por lo que se emplea la fórmula:
Este % de nitrógeno es multiplicado por un factor que depende de la matriz

de la muestra. Se han desarrollado muchos factores de proteínas para usar
con varios tipos de muestras, en este caso se utilizará 6,25.
Objetivo General
Aplicar técnicas para la separación de proteínas presentes en los alimentos.
Determinar el porcentaje de proteína presente en muestras de alimentos.
Objetivos específicos
1. Ilustrar algunas operaciones de laboratorio comunes en la separación y

purificación de proteínas de diferentes matrices.
2. Separar y purificar caseína presente en la leche.
3. Manipular equipo específico para la determinación de proteínas.
4. Demostrar las etapas empleadas en la determinación de proteínas

mediante el método Kjeldahl.
Materiales, equipos y reactivos
Cuadro 1. Materiales y materias primas

Cantidad Material y materias primas
200 mL de leche semidescremada
7 Recipientes plásticos de mediano tamaño
6 Trozos de gasa o manta fina de 30 X 30 cm
6 Beakers de 600 mL
12 Cajas de Petri
2 Probetas de 50 mL
2 Bombas de vacío
4 Beakers de 100 mL
2 Embudos de filtración al vacío
3 Plantillas para calentamiento
4 Pliegos de papel de filtro
2 Tijeras
4 Cedazos de asbesto
200 mL de ácido acético glaciar
2 Balanzas digitales
5 Buretas de 100 mL
6 Soportes de hierro
6 Prensas para bureta
300 mL de alcohol etílico al 95%
100 mL de acetona
100 mL de éter etílico
25 g de harina de yuca
1 Equipo Kjeldahl (Digestor, Neutralizador, Destilador)
10 L de solución de NaOH al 50%
200 mL de ácido sulfúrico al 98%
200 mL de ácido bórico al 4%
2 Unidades de pastillas con catalizador Kjeldahl o sulfato
de potasio y sulfato de cobre pentahidratado
50 mL de indicador mixto
100 mL disolución de HCl (0, 1 N) o H2SO4 para valoración
Procedimiento.
A. Separación de la caseína de la leche.
1. Medir 50 mL de leche descremada y fresca en un vaso de precipitados de

500 mL y calentar a 40 °C.
2. Añadir ácido acético glaciar, por medio de una bureta y con agitación
constante, añada hasta que se observe la formación del precipitado.
3. Dejar que el precipitado se sedimente. Decantar el líquido sobrenadante

a través de un embudo de espiga, provisto de un papel filtro tipo
Whatman N° 40 u otro material filtrante disponible. Puede proceder a
centrifugar, en sustitución de la filtración (reservar ambas proporciones:
el precipitado y el líquido sobrenadante)
4. Lavar el precipitado dos veces, añadiendo 100 mL de agua destilada y

decantar o centrifugar de nuevo.
5. Mezclar el residuo de caseína con 75 mL de alcohol etílico al 95% y

agitar durante 5 minutos, filtrar o centrifugar. Repetir esta operación una
vez más.
6. Lavar la caseína con 25 mL de acetona; agitar durante 5 minutos. Filtrar

o centrifugar.
7. Lavar la caseína con 25 mL de éter etílico, agitar durante 5 minutos.
Filtrar o centrifugar. Mezclar el sólido obtenido con 25 mL de éter etílico y
transferir a una caja de Petri. Desecar en una estufa a 40°C.
8. Medir la masa de la caseína obtenida. Determinar el contenido (%m/v)

de caseína en la leche.
B. Determinación de proteínas por el método Kjeldahl.
En este caso se trabajará con dos productos: leche líquida y harina de yuca.
Se trabajará con cuatro muestras de cada producto.
Digestión
1. Agitar la leche con cuidado para que no forme espuma. En caso de la

harina se puede mezclar con agitador vidrio o espátula para eliminar
grupos o en términos generales homogenizar la masa.
2. Pesar en balanza analítica aproximadamente 1 g de la muestra

homogénea de harina de yuca.
3. En caso de la leche deben agregarse alrededor de 5 gramos de leche,

para ello deben medirse en balanza analítica.
4. Introducir cada una de las muestras en un matraz de digestión.
5. Añadir 2 tabletas Kjeldahl de 5 g de catalizador de Missouri. O

agregar el equivalente de los reactivos que se deben preparar en
laboratorio (3,58 g de K2SO4 y 0,41 g de CuSO4.5H2O)
6. Añadir 20 mL de Ácido Sulfúrico 98% en cada uno de los matraces de

digestión.
7. Con cuidado, suspender la muestra agitando el tubo suavemente.
8. Colocar los tubos o matraces de digestión con las muestras en la

unidad de digestión y en el bloque calefactor.
9. Calentar la mezcla (350 - 380 ºC) hasta la aparición de humos

blancos.
10. Continuar el calentamiento durante unos 180 minutos.
11. Los vapores de agua y ácido sulfúrico se burbujean a través de

una solución de hidróxido de sodio (lavador de gases o scrubber)
para ser neutralizados.
12. La digestión finaliza cuando la muestra pasa a ser totalmente

transparente con un ligero color azul debido al Cu del catalizador.
13. Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente y se

añaden con precaución 100 mL de agua.
14. A continuación, las muestras son transferidas a la unidad de
destilación.
Destilación
15. Se añaden 50 mL de solución hidróxido de sodio al 50 % para

neutralizar el pH de la muestra y convertir el NH4 + en NH3.
16. El NH3 se condensa en el equipo.
17. El NH3 se captura en 50 mL de ácido bórico al 4 %

conteniendo 6 – 7 gotas de indicador de Tashiro (azul de metileno-
rojo de metilo).
18. Cuando el NH3 reacciona con el ácido bórico, la solución vira

de rojo violeta a verde (pH 4,4-5,8) debido al cambio del indicador al
pasar de la forma ácida a la forma básica.
19. En la solución de ácido bórico se capturan alrededor de 150

mL del condensado. Esto puede llevar aprox. 5 minutos.
Valoración
20. Valorar con disolución de HCl (0,1 N) o H 2SO4 hasta que la

solución tenga un ligero color violeta.
21. Con la concentración y el volumen de HCl gastado en la

valoración, calcular el porcentaje de átomos de nitrógeno en la
muestra y luego el % de proteína en la muestra del alimento.
Para ampliar en la discusión de resultados
1. Investigue sobre los procedimientos utilizados para la precipitación de

las caseínas y su importancia en el desarrollo de productos lácteos.
2. Investigue sobre otros dos métodos para separación de proteínas
3. El gluten es una proteína de reserva que se encuentra en el trigo y

otros cereales como el centeno, la cebada y la avena, investigue ¿cómo
está constituido el gluten y sobre su importancia en el proceso de
elaboración de pan, además de su relación con la enfermedad celíaca?.
4. Explique las diferentes etapas en el proceso de determinación de

proteínas por el método Kjeldahl.
Bibliografía
Práctica de Separación de Caseína basada en:

Herrera, C.; Bolaños, N.; Lutz, G. (2008). Química de alimentos: Manual de
Laboratorio. 1era edición. Editorial UCR. San José, Costa Rica.
ta
Badui Dergal, S. (2006). Química de los alimentos. 4 Edición. Pearson
educación. México.

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Las proteínas poseen propiedades y características que las diferencian unas

La solubilidad de las proteínas depende del grado de hidratación y del

La separación selectiva de proteínas puede realizarse a bajas

Un procedimiento corriente para separar proteínas de sus disoluciones

En esta ocasión se utilizará el punto isoeléctrico para la separación de las

El % de nitrógeno se determina mediante ecuaciones que depende del uso

Este % de nitrógeno es multiplicado por un factor que depende de la matriz

Aplicar técnicas para la separación de proteínas presentes en los alimentos.

Determinar el porcentaje de proteína presente en muestras de alimentos.

1. Ilustrar algunas operaciones de laboratorio comunes en la separación y

2. Separar y purificar caseína presente en la leche.

3. Manipular equipo específico para la determinación de proteínas.

4. Demostrar las etapas empleadas en la determinación de proteínas

Materiales, equipos y reactivos

Cuadro 1. Materiales y materias primas

A. Separación de la caseína de la leche.

1. Medir 50 mL de leche descremada y fresca en un vaso de precipitados de

3. Dejar que el precipitado se sedimente. Decantar el líquido sobrenadante

4. Lavar el precipitado dos veces, añadiendo 100 mL de agua destilada y

5. Mezclar el residuo de caseína con 75 mL de alcohol etílico al 95% y

6. Lavar la caseína con 25 mL de acetona; agitar durante 5 minutos. Filtrar

8. Medir la masa de la caseína obtenida. Determinar el contenido (%m/v)

B. Determinación de proteínas por el método Kjeldahl.

1. Agitar la leche con cuidado para que no forme espuma. En caso de la

2. Pesar en balanza analítica aproximadamente 1 g de la muestra

3. En caso de la leche deben agregarse alrededor de 5 gramos de leche,

4. Introducir cada una de las muestras en un matraz de digestión.

5. Añadir 2 tabletas Kjeldahl de 5 g de catalizador de Missouri. O

6. Añadir 20 mL de Ácido Sulfúrico 98% en cada uno de los matraces de

7. Con cuidado, suspender la muestra agitando el tubo suavemente.

8. Colocar los tubos o matraces de digestión con las muestras en la

9. Calentar la mezcla (350 - 380 ºC) hasta la aparición de humos

10. Continuar el calentamiento durante unos 180 minutos.

11. Los vapores de agua y ácido sulfúrico se burbujean a través de

12. La digestión finaliza cuando la muestra pasa a ser totalmente

13. Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente y se

15. Se añaden 50 mL de solución hidróxido de sodio al 50 % para

16. El NH3 se condensa en el equipo.

17. El NH3 se captura en 50 mL de ácido bórico al 4 %

18. Cuando el NH3 reacciona con el ácido bórico, la solución vira

19. En la solución de ácido bórico se capturan alrededor de 150

20. Valorar con disolución de HCl (0,1 N) o H 2SO4 hasta que la

21. Con la concentración y el volumen de HCl gastado en la

Para ampliar en la discusión de resultados

1. Investigue sobre los procedimientos utilizados para la precipitación de

2. Investigue sobre otros dos métodos para separación de proteínas

3. El gluten es una proteína de reserva que se encuentra en el trigo y

4. Explique las diferentes etapas en el proceso de determinación de

Práctica de Separación de Caseína basada en:

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