Reacción en cadena de la

polimerasa
PCR
 Recursos didácticos
https://youtu.be/mslMRgxbdOA
 Recursos didácticos
https://youtu.be/mpRy8CSAISs

PCR Khan academy

https://youtu.be/tPtM78RVLM8
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
 PCR
Karry Mullis
1985 Concibió la técnica
1993 Premio Nobel de Química – Michael Smith

El conocimiento de la Replicación del ADN 1944 – 2019

Americano
llevo a implementar la técnica PCR

Recuerda cómo se sucede la replicación del ADN?

Cuál es la importancia de la ADN Polimerasa?
 PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una
técnica de laboratorio común utilizada para amplificar o
copiar millones de veces una misma secuencia especifica
de ADN, a un nivel tal que permite ser analizada sobre
un gel de agarosa y visible cuando se tiñe con un agente
intercalante (bromuro de etidio, GelRed, GelGreen).

Todo el proceso es in vitro

Identifica las palabras resaltadas

Defina el concepto de PCR
Qué significan las siglas?
 Reactivos
• Cuatro (4) desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTPs) para polimerizar
la nueva cadena ADN.
• Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos, son
complementarios a una de las dos hebras del ADN (foward, reverse).
Deben estar enfrentados. Delimitan la zona de ADN a amplificar,.
• Iones divalentes: magnesio (Mg2+), agregado como cloruro de
magnesio (MgCl2), y manganeso (Mn2+), actúan como cofactores de la
polimerasa.
• Iones monovalentes, como el potasio K+.
• Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
• ADN polimerasa la más común es la polimerasa Taq (Thermus
aquaticus). Enzima termoestable – mayor actividad cerca a los 70 0C
• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

• Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en

cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Identifique el vocabulario que esta con rojo

Identifique el vocabulario que esta subrayado
 Procedimiento de PCR
Extracción del ADN a analizar

Cuáles son los pasos básicos para la extracción del ADN?

 EXTRAÇAO DE DNA VEGETAL (Tampao Doyle & Doyle)

1. Cortar um disco foliar (tampa do tubo). (Pode ser armazenado por 2-3 dias a -
Procedimiento de PCR
Extracción del ADN a analizar
80 °C, até o momento da extração)
2. Macerar o tecido fresco em presença de 400 µL de Tampão de extração (Doyle
& Doyle) aquecido em banho Maria a 65 °C
3. Agitar em vortex por 5 segundos
4. Incubar a 30 minutos a 65 °C
5. Esperar esfriar e adicionar 400 µL de cloroformio (ou clorofórmio:álcool
isoamilico 24:1) e agitar por suaves inversões durante 5 minutos (se usar
clorofórmio: álcool isoamilico pipetar a fase inferior, fase superior é Tris).
6. Centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos
7. Retirar 200 µL da fase aquosa e transferir para outro tubo
8. Adicionar 200 µL de isopropanol (2-propanol) gelado e homogeneizar com
suaves inversões por 1 minuto
9. Incubar a -20 °C por no mínimo 30 minutos (neste instante pode ficar mais
tempo: 1 hora ou mais)
10. Centrifugar a 14.000 rpm por 5 minutos
11. Descartar o sobrenadante (isopropanol), tendo o cuidado de não perder o pellet
formado
12. Adicionar 200 µL de etanol 70% gelado
13. Centrifugar a 14.000 rpm por 5 minutos
14. Descartar o sobrenadante (etanol), tendo o cuidado de não perder o pellet
formado. Manter de boca para baixo sobre papel absorvente para secar por
aproximadamente 20 minutos. (Se após esse tempo não secar o suficiente, dar
umas batidinhas no tubo).
15. Ressuspender em 100 µL de TE+RNAse na concentração final de 40 µg/mL
(99,2 µL de TE + 0,8 µL de RNAse a 5 mg/mL)
16. Incubar a 37 °C por 30 minutos
17. Armazenar a 4 °C (geladeira)
18. Usar 5 µL DNA + 2 µL Tampão de amostra para verificar a qualidade da
extração
Análisis de la calidad
Tampao de extração de DNA vegetal (Doyle & Doyle)
Reagentes [Final] Preparo de 500 mL del ADN:
CTAB 2% 10 g
PVPP (ou PVP) 2% 10 g Electroforesis -
Tris-HCl 1M pH 8,0
EDTA 0,5 M pH 8,0
100 mM
25 mM
50 mL
25 mL
Nanodrop
NaCl 5M 2M 200 mL
Agua destilada - Suficiente para 500 mL
Cuáles son los pasos básicos para la extracción del ADN?
 Pasos de la PCR
• Inicio Calentar la reacción para que la enzima ADN
polimeraza se active

• Desnaturalización (96 °C ). ADN separar la doble hebra

de ADN.
• Hibridización o templado disminuir enseguida la t° a 55
°C para permitir la alineación o unión de los iniciadores
o primers.
• Extensión subir la t° a 72°C para que la Taq polimerasa
extienda los cebadores y sintetice las nuevas cadenas de
ADN.

• Elongación final asegurar la amplificación de cualquier

ADN simple restante sea totalmente amplificado

Qué tienen en común los pasos de la PCR?

1 2

3 4
Describa las fotografías
1. Desnaturación del ADN
2. Hibridación CICLO

3. Extensión ó polimerización

Para la visualización de una secuencia

especifica se necesitan 25 a 40 ciclos

2n n= número de ciclos
Qué es un ciclo de PCR?
Qué etapas se discriminan en un ciclo de PCR?
Ambos cebadores, apuntan "hacia adentro" al unirse, es
decir, en dirección 5' a 3' hacia la región a copiar. Al igual
que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede
sintetizar ADN en dirección 5' a 3'. Al extenderse los
cebadores, la región que se encuentra entre ellos se copia.
 Observación resultado PCR (punto final)
Electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.

Muestras se cargan en pozos en un extremo del gel

Los fragmentos tienen carga negativa, por

lo que se mueven hacia el electrodo
positivo. Misma carga por masa –
pequeños atraviesan el gel más rápidos.
Visualización resultado - Electroforesis
Agente intercalante ADN
Visualización del resultado mediante Electroforesis

Describa el procedimiento de visualizar los fragmentos de ADN ?

La cuantificación de
la PCR clásica y de la
PCR en tiempo real
miden el ADN sólo en
el principio de la fase
ascendiente, en las
reacciones cuyo
rendimiento es
próximo del 100 %.
Qué es un ciclo de PCR?
Cuál es el reactivo para teñir el ADN?
Recuerda los pasos para hacer un gel de agarosa
Recuerda el nombre del equipo para realizar la PCR
Qué explica la fotografía?
 Diseño de iniciadores y obtención de ADN
• Para estandarizar la técnica de PCR se necesita conocer la
secuencia de nucleótidos del gen con el objetivo de diseñar los
iniciadores
• Iniciadores son oligonucleótidos de 18 a 30 pares de bases con
una secuencia complementaria a la región de cada extremo de
la secuencia de ADN a amplificar

Qué significa la palabra Primer, iniciador o cebador?

Ambos cebadores, apuntan "hacia adentro" al unirse, es decir, en dirección 5' a 3' hacia la región a copiar.
Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede sintetizar ADN en dirección 5' a 3'. Al
extenderse los cebadores, la región que se encuentra entre ellos se copia.
Diseño de primers

1. Buscar en la base de datos del NCBI la secuencia del gen de interés

GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)
 2. Descargar archivo fasta con la secuencia

3. Diseñar par de primers (foward – reverse). Tener en cuenta

recomendaciones de la derecha.

Tambien se pueden utilizar softwares como Pick Primers del NCBI,

Primer3

Práctica en Clase de bioinformática….

Selecciono los parámetros
• La magnitud de los
productos amplificados en
la PCR son variados van de
200 a 500pb
• En la actualidad la enzima
más utilizada es la Taq
polimerasa aislada de la
bactería Thermus aquaticus
que actúa en condiciones
optimas a 70 a 74°C

Identifique la palabra gen, genoma, cromosoma

 Conceptos asociado a PCR
• Sensibilidad: Cantidad mínima de ADN para que se produzca la
amplificación.
• Especificidad: Los oligos se unen una vez en el segmento de
ADN
• Eficiencia: La amplificación máxima que se puede obtener en
un número determinado de ciclos.
• Fidelidad: Los errores que comete la ADN polimerasa durante
la amplificación.
 Falsos Positivos/negativos
• Insuficiencia de ADN (no sea que
haya poco ADN y por eso no se
amplificó, y se concluya que la
muestra es negativa)
• Inespecificidad de los oligos (se unen
por fuera de del fragmento de
interés, se amplifica otra zona)
• SIEMPRE CONTROLES!: Se carga
muestra control positiva y muestra
control negativa, blanco
Para qué sirve los control positivo y negativo?
Qué es un control + y un control –?
Recuerda para que sirve el marcador de peso molecular
Recuerda lo que es una cámara de electroforesis y su funcionamiento
PCR – Begomovirus

M (+)
M (+) 11 22 BB (-)
(-)
 PCR en muestras de ARN

• La identificación de secuencias especificas de ARN se lleva a

cabo con una RT-PCR transcripción inversa.
• Se requiere copiar la secuencia especifica de ARN a una
secuencia de ADN complementario ADNc y se usa la polimerasa
transcriptasa inversa RT y después de la obtención se sigue el
proceso normal de la PCR

Recuerda el concepto de código genético

Qué es una enzima
Que es la ADNpolimerasa
ARN polimerasa
Transcriptasa inversa
 Limitaciones de la PCR
• Se requiere espacio para separar el área de extracción de ADN
del área de los equipos.
• Uso de material estéril y desechable
• Cuidados extremos evitar contaminación

Recuerda como se hace la extracción del ADN

Identifica algunos implementos en ambas fotografías
 Reacción en cadena de
la Polimerasa (PCR)
• Ventajas:
– Elevada sensibilidad
– Reproducibilidad (buenas condiciones de
laboratorio)

• Variaciones: RT-PCR, PCR con inmunocaptura, Nested-

PCR, PCR en tiempo real (cuantificación en tiempo real,
costo elevado para empleo masivo), PCR Digital, LAMP,
RCA.
 Aplicación de la PCR
• Diagnóstico Molecular: Detección de patógenos

• Identificación de especies: Identificar, virus, bacterias causantes de

enfermedades – diversidad genética poblaciones
• Identificar personas (forense)
• Hacer investigación científica sobre ADN amplificado
Identifica el concepto de individuo
Identifica el concepto de banda monomórfica?
Identifica el concepto de muestra positiva , muestra negativa
 Polimorfismo: Presencia de dos o más
formas variantes de una secuencia
específica de ADN que puede producirse
entre diferentes personas o
poblaciones.

Identifica el concepto de banda polimórfica?

Identifica la importancia del primer en una PCR
 PCR multiplex

Maisa Ciampi Guillardi PhD. ESALQ/USP.

PCR Multiplex
https://youtu.be/iu4s3Hbc_bw?si=RpQt1IGLo9wZ0bHl
 PCR cuantitativa (qPCR)
• Amplificar de forma simultánea de múltiples DNA objetivo en la misma reacción – varios patógenos en un
único hospedero
• Permite cuantificar el patógeno y monitorear la reacción en curso (tiempo real).
• Mayor rapidez, especificidad y confianza
• Sistema cerrado, menor riesgo de contaminación
• Resultado en 1,5 hr – Elimina electroforesis
 Taqman
SYBR Green technique
 SYBR Green vs Taqman

SYBR Green is based on DNA binding dye. Taqman depend on hybridization probes and 5’ to 3’
exonuclease activity of Taq polymerase.

Fluorescently Labeled Probes

No fluorescently labeled probes are not required. Dual-labeled probes are required.

Multiplex Gene Analysis

It can not be used for multiplex gene targets. It can be used for multiplex gene targets.

Cost
This is less expensive. This is more expensive.
Specificity
This is less specific and binds with any double strand These are highly specific since probes detect the
DNA specific amplification products.

Effectiveness
This is less effective. This is highly effective.
Application
This is used in real-time PCR, agarose gel visualization, This is used in real time PCR, quantification of gene
DNA labeling etc. expression, detection of genetic polymorphisms, etc.
qPCR
 ¿Cómo se utiliza la PCR para identificar variación en la secuencia
del ADN?
• Empleando cebadores que se unen a secuencias específicas
• Basta que haya una mutación del sitio de unión estos cebadores y
se observa un patrón de bandas diferentes en cada individuo
 RAPDs
• Se emplea un cebador de secuencia corta = 10 pb se une
aleatoriamente en el ADN de la muestra
 RAPDs
¿a causa de que se debe el polimorfismo?

Ventajas únicas sobre el uso de los RFLPs: requieren muy poca cantidad de ADN y no utilizan para su
detección la radioactividad. Los marcadores de este tipo son usualmente dominantes porque los polimorfismos
se detectan como presencia o ausencia de bandas.
 Estudio de diversidad en una población

• Coincidencia de
presencias
• Coincidencias de
ausencias

¿Cuántos pasos observa antes de visualizar el

dendograma ?
 Microsatélites
Los microsatélites son marcadores codominantes que consisten en secuencias cortas (de 1 a 6 bases nucleotídicas) repetidas en
tándem un alto número de veces, con una tasa de variación en el número de copias entre individuos; que gracias a la técnica de PCR
son fácilmente automatizables.

El polimorfismo de estas regiones está

dado por los diferentes números de
repeticiones, dando fragmentos
amplificados por PCR de distinto
tamaño.
Alelos con mayor número de
repeticiones, tendrán tamaño mayor y
correrán más retrasados en una
corrida electroforética.
Para amplificar el
microsatélite pueden
emplearse primers que
hibridan en las regiones que
flanquean el microsatélite.
Microsatélites
Porqué son variables en longitud estas secuencias?
¿Cuál es la causa de polimorfismo en un
microsatélite?

Ventajas
Codominancia
Multialélicos
Altamente reproducibles

Desventaja
Complejidad de la técnica
(conocimiento de secuencia –
disminuye la limitación)

Análisis solo de un locus

(multiplex – fluoróforos
solución)
https://youtu.be/PeAPeNZpmGs
 Amplié su conocimiento leyendo este
artículo
• http://www.faba.org.ar/fabainforma/417/ABCL.htm

El veredicto de la genética
La identificación genética de especies y su uso en el control de
alimentos, conservación de la biodiversidad y detección de fraudes.
Revista CIENCIA HOY, Volumen 17 Nº 98 – 2007
Diego M. Posik, María Verónica Ripoli, Pilar Peral García y Guillermo
Giovambattista