Practica 15

Material y equipo Reactivos
Tubos Vacutainer® con EDTA (tapón lila)

Isopropanol
Soporte de aguja
Micropipetas p1000 y p5000 μL Etanol al 70%
Aguja para toma múltiple 21G x 38mm
Puntas nuevas para las micropipetas Reactivos del Kit Wizard® Genomic DNA
Torundas
Recipiente para baño de agua Solución de lisis celular (Cell Lysis Solution).
Ligadura
Termómetro Solución de lisis de núcleos (Nuclei Lysis
Guantes de latex
Centrífuga Solution).
Microtubos de 1.5mL
Vortex Solución de precipitación de proteínas (Protein
Tubos de 15 mL
Parrilla de calentamiento Precipitation
Equipo de reactivos “ Wizard® Genomic DNA
Solution).
Purification”
Solución RNasa (RNase Solution)
Solución de rehidratación de ADN(DNA
Rehydration Solution)
SEPARACIÓN DE
PROTEÍNAS
PLASMÁTICAS
1. Realizar una extracción sanguínea 1. Agitar el tubo vigorosamente en el vortex

en un tubo que contenga hasta que las células blancas de la sangre se 11.Centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos a
anticoagulante EDTA (tapón color vuelven a suspender (10-15 segundos).
temperatura ambiente. Deberá observarse un
lila). 2. Agregar 3ml de solución de lisis de núcleos
2. Añadir 3 mL de sangre a un tubo de
color marrón oscuro del botón de proteínas
al tubo que contiene las células
15 mL que contiene 9 mL de resuspendidas. Pipetear la solución 5-6 veces (Fig.6).
para lisar las células blancas. La solución se 15.Aspirar cuidadosamente el etanol
solución de lisis celular. *Mezclar
observará muy viscosa 12.Transferir el sobrenadante a un tubo de utilizando una pipeta Pasteur. NOTA: El
de 5 a 6 veces.
3. Incubar durante 10 minutos a centrífuga de 15 mL que contiene 3 mL de sedimento de ADN no es compacto en este
Nota: Si algunos grumos de células son visibles Isopropanol a temperatura ambiente.Mezclar punto por lo que se debe tener cuidado para
temperatura ambiente (invertir de
después de la mezcla, se debe de incubar la solución suavemente la solución por inversión hasta evitar la aspiración del botón con la pipeta.
2-3 veces durante la incubación) a 37 °C hasta que se rompan los grumos. Si éstos
para lisar las células rojas de la observar las hebras de color blanco que Invertir el tubo sobre un pedazo de papel
todavía son visibles después de 1 hora, añadir 1 mL corresponden al ADN adsorbente y dejar secar al aire durante 10
sangre. de solución de lisis de núcleos y repetir la
4. centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos
incubación.
13.Centrifugar a 3500 rpm durante 1 minuto a
minutos OPCIONAL. Agregar 15 μL solución RNasa,
alisado nuclear, y mezclarla muestra invirtiendo el temperatura ambiente. El ADN será visible como 16.Aspirar cuidadosamente el etanol
5. Desechar el sobrenadante sin
tubo 2-5 veces. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 un pequeño precipitado blanco utilizando una pipeta Pasteur. NOTA: El
perturbar el sedimento blanco. Si
minutos, y después enfriar a temperatura ambiente. sedimento de ADN no es compacto en este
la pastilla parece contener sólo
3. Añadir 1mL de la solución de precipitación de 14.Decantar el sobrenadante, y añadir 3 mL de punto por lo que se debe tener cuidado para
células rojas de la sangre, añadir
proteína al lisado nuclear y agitar vigorosamente etanol al 70% a evitar la aspiración del botón con la pipeta.
una alícuota adicional (1mL) de durante 10 a 20 segundos. Pequeños grupos de la Invertir el tubo sobre un pedazo de papel
solución de lisis celular después de proteína pueden ser visibles después de agitación temperatura ambiente. Invertir suavemente el adsorbente y dejar secar al aire durante 10
retirar el sobrenadante por encima tubo varias veces para lavar el sedimento de minutos (Fig.9).
del sedimento de células, y luego NOTA: Si se adicionó un exceso de solución de ADN y los lados del tubo en donde está el ADN.
repetir los pasos 3 y 4. lisis de núcleos en el paso 6, deberá adicionar
Centrifugar como en el paso 11.
1.3 mL de solución de precipitación de
Nota: para obtener la lisis celular eficiente, proteínas.
resuspender completamente las células
blancas de la sangre.

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