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Inmunodetección en Estado Sólido
Inmunodetección en Estado Sólido
Inmunodetección en Estado Sólido
Objetivos
General
Específicos
Introducción
El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra ella. [1]
Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología
molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria
especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de
miles de proteínas diferentes. [2]
Objetivos
General
Específicos
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al
estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Protocolo de extracción de proteínas
Adicionar 200 𝜇𝑙 de cloroformo Centrifugar por 15 minutos a (En frio) desechar la fase acuosa
e incubar cinco minutos. 12000 RPM. y conservar la fase orgánica.
Agregar 1 ml de Hidrocloruro de
Descartar el sobrenadante,
Conservar a 4ºC Guanidina 0.3M en 95% de
conservar la pastilla.
etanol.
Separación de proteínas.
Proceso de purificación.
Resuspender en buffer de lisis Colocar 30 𝜇𝑙 de muestra en
Centrifugar 10 minutos a
(50𝜇𝑙) azul
máximas revoluciones.
Western Blot
Una vez finalizada transferir a Colocar en pozos de gel de
Hervir por 5 minutos
membrana PVDF. bisacrilamida al 7%
Cortar la membrana por Hacer dos lavados rápidos con Bloquear membrana con 10 ml
carriles. PBS-Twin 0.1% PBS-T leche 5% 30minutos
10 𝜇𝑙 de muestra Blanco
Cuantificación de proteínas
200 𝜇𝑙 de Bradford 200 𝜇𝑙 de Bradford
por Bradford
790 𝜇𝑙 de Agua. 800 𝜇𝑙 de agua
Leer a 580 nm
Usar Diaminobenzidin +
Hacer lavados rápidos previos al
Peróxido de Hidrogeno. Y dejar
revelado.
15 minutos la reacción.
RESULTADOS PARA LA PRUEBA DE BRADFORD.
Western Blot es una técnica que permite identificar una proteína en una muestra, para ello
tras preparar la muestra por medio de una electroforesis en gel de poliacrilamida las
proteínas se separan en función de su peso molecular pues pierden su estructura
secundaria y terciaria, para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos
se transfieren esas proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, esta
membrana se caracteriza por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es
decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad). Puesto que la membrana
escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los
lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia para ello se incuba la
membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o ASB;
leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20. Las
proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no
estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá
unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos. En
la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para
ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su
sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta forma, se hace patente
la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
Y como anticuerpo secundario empleamos el anticuerpo cabra alfa ratón HRP. Este anti-
ratón IgG HRP de cabra es usado como anticuerpo secundario para Western Blot o ELISA
donde el anticuerpo primario fue generado en ratón. La peroxidasa conjugada en el
anticuerpo secundario es útil para Western Blot cuando se emplea detección por sustratos
quimioluminiscentes disponibles comercialmente. Este anticuerpo permite la asociación
entre el anticuerpo primario del ratón luego de que su región V se una al antígeno y el
anticuerpo secundario se asocia al vástago de la región C del anticuerpo primario.
Anexos
Marcador de referencia para interpretar
los resultados de la membrana por
identificación de peso molecular en
proteínas.
Conclusiones
Referencias
[3] Cultek. (2006). Fundamentos y tipos de ELISA. diciembre 9, 2017, de Cultek Sitio web:
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf