Metodos Cualitativos y Cuantitativos Microorganismos Coliformesu4

ELEARNING TOTAL Curso de Control microbiológico del agua– Unidad 4
Métodos de detección de organismos indicadores de contaminación

Se dispone de procedimientos básicos para la detección y enumeración de
microorganismos indicadores en el agua. Estos métodos son:
 Método de tubos múltiples

 Método de membrana filtrante
Debe destacarse que los resultados obtenidos con un método o medio en particular
pueden no ser estrictamente comparables con otro método o medio para el mismo
grupo de organismos. Por lo tanto, el método que se elija deberá utilizarse siempre
de manera consistente con el fin de asegurarse que la comparación de resultados es
válida.
Detección de coliformes
Debido a que las bacterias del grupo de coliformes están presentes en grandes
cantidades en los excrementos y pueden detectarse en concentraciones de hasta 1
ufc por 100 ml, constituyen un indicador de una gran sensibilidad para comprobar la
contaminación fecal.
Definición de los microorganismos del grupo coliformes
El término microorganismos coliformes o coliformes totales se aplica a todo bacilo

gramnegativo, capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares u otros agentes
tensioactivos e propiedades similares, y sea capaces de fermentar la lactosa
temperaturas entre 35°-37°C, con producción de ácido, gas, y aldehído, en un lapso
de 24 a 48 horas también son oxidasa negativas y no forman esporas. Aquellas que
poseen las mismas propiedades a una temperatura de 44° o 44,5°C se conocen como
bacterias fecales termotolerantes. Estas últimas cuando fermentan tanto la lactosa
como otros sustratos o como el manitol, a temperaturas e 44° o 44,5°C, con
producción de ácido, gas y que también forman indol a partir de triptófano, se
consideran como presuntas E. coli. Esta se puede confirmar si se trata de una E. coli
mediante la prueba bioquímica positiva de rojo de metilo al no producir
acetilmetilcarbinol y no utilizar citrato como única fuente de carbono.
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1
La selección de pruebas para detectar y confirmar la existencia de este grupo de

microorganismos se considera como parte del juicio profesional basado
principalmente en el tipo ce agua, en el propósito del examen y en la capacidad del
laboratorio.
Técnicas para la detección de coliformes totales
 Método de tubos múltiples
Se considera que la prueba inicial es presuntiva debido a que la reacción de ácido y

gas que se observa a menudo puede deberse a otro microorganismo o combinación
de otros microorganismos. Esta presunción se confirmara luego mediante las pruebas
adicionales capaces de alcanzar mayor nivel de confirmación y diferenciación. Con las
pruebas bioquímicas correspondientes para el caso.
Se puede obtener un estimado del número de coliformes totales presuntivos

presentes en un determinado volumen de agua mediante la inoculación de
volúmenes apropiados en un número de tubos de ensayo conteniendo un medio de
cultivo. Al inocularse se supone que cada tubo que recibió bacterias viables en la
inoculación mostrara desarrollo de microorganismos y reacciones positivas acordes
con el medio empleado. Teniendo en cuenta que siempre se producirán algunos
resultados negativos, se puede calcular el número más probable (NMP) de
microorganismos en la muestra original a partir de un número de tubos que dieron
una reacción positiva. Para esto se emplean tabas de probabilidad estadísticas.
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Este procedimiento puede aplicarse a cualquier tipo de agua, en especial en aquellas

que presentan mucha turbidez. El equipo es relativamente barato y sencillo y resulta
fácil leer las reacciones positivas. Sin embargo, se trata de una técnica que solo
proporciona un cálculo del número de bacterias en una muestra, y por lo tanto puede
estar sujeto a errores inherentes considerables. Deben realizarse subcultivos en
medios confirmatorios y también en medios sólidos a fin de asegurarse la pureza
antes de proceder a mayores diferenciaciones.
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Procedimiento:
Para este método se prepara una batería de tubos con los medios según su elección.
Si bien la técnica se puede realizar con 3 o con 5 tubos. En este apartado se detallara
la técnica con 3 tubos.
Técnica: Se inoculan 9 tubos de diferentes concentraciones.
 Tres tubos se realizan en tubos con 10 m de caldo en doble concentración y se

añaden 10 ,0 ml de muestra.
 Tres tubos de 9,0 ml de caldo simple concentración se añade 1 ml de muestra.
 Tres tubos de 9,9 ml de caldo simple concentración se añade 0,1 ml de muestra.
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Elección de medios de cultivo
Para esta prueba podemos utilizar cuatro medios de cultivo diferentes; el medio de
caldo Lauril sulfato, caldo MacConkey y caldo lactosado.
Luego de la inoculación con el medio seleccionado se incuban los tubos a

temperaturas de 35-37°C, y se inspeccionan a las 24 ± 2 horas y 48 ± 3 horas para la
observación de las reacciones.
Lectura e interpretación de resultados
Para la lectura e interpretación de resultados utilizamos las tablas de probabilidad

estadística ya mencionadas. Dependiendo la cantidad de tubos utilizados será la tabla
a tener en cuenta (según 3 o 5 tubos).
Para esto tenemos que tener en cuenta la cantidad de positivos y negativos que
tenemos en cada batería de tubos (según 3 o 5). Según estos resultados buscamos en
la tabla y determinamos el valor de NMP/100 ml según corresponda.
Caldo Mac Conkey:
Negativo: tubo purpura sin formación de gas
Positivo: tubo amarillo con formación de gas
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Caldo Lauril sulfato y Caldo lactosado:
Negativo: tubo sin turbidez y sin producción de gas.
Positivo: tubo con turbidez y producción de gas.
Pruebas confirmatorias: la presencia de coliformes presuntiva positiva deberá

confirmarse. Puesto que la muestra original puede contener una mezcla de
microorganismos es preciso utilizar un medio selectivo
Los tubos que muestran reacciones positivas a las 24 y 48 horas se subcultivan

directamente en tubos con medios selectivos que contengan lactosa, incubándose 48
± 3 horas a las mismas temperaturas que se incubaron las pruebas presuntivas. Para
el caso confirmatorio utilizamos un medio selectivo; caldo verde brillante (CVB). La
presencia de gas confirmara la presencia de bacterias coliformes en la prueba
presuntiva original. De esta manera, tomando en cuenta los tubos positivos y dos
negativos, se busca el valor del resultado en las tablas de NMP antes mencionados.
Para la confirmación de presencia de coliformes fecales, deberán realizarse

subcultivos a partir de los tubos con reacciones presuntivas positivas empleando
medios como CVB o caldo EC, que contienen sales biliares e incubar a 44°C ± 0,25 °C
por un periodo de 24 ± 2 horas. La producción de gas confirmara la presencia de
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bacterias coliformes fecales en los tubos originales. De esta manera buscamos el

resultado obtenido en las tablas de NMP. Por otro lado, puede confirmar el numero
presuntivo de E. coli inoculando tubos de agua de triptona y verificando la formación
de indol luego de transcurridas 24 ± 2 horas a 44 ó 44,5°C de incubación. Si el
resultado es positivo entonces la presencia de E. coli debe ser confirmada a través de
pruebas bioquímicas.
Técnica de membrana filtrante
El número de coliformes totales presentes en el agua puede determinarse también

mediante filtración de volúmenes específicos de muestra a través de filtros de
membrana (ejemplo de filtro). En su mayoría están compuestos de esteres de
celulosa, típicamente con poros de 0,45 µm de diámetro, que retienen las bacterias.
Después estas membranas se incuban hacia arriba en un medio de cultivo selectivo.
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Membrana de nitrocelulosa
1
1
En la membrana se desarrollan colonias características que producen acido o

aldehído y son las que se contaran ya sea como organismos coliformes presuntivos o
bacterias coliformes fecales según la temperatura de incubación. Puesto que la
producción de gas no puede ser detectada en las membranas, se asume que todas las
colonias con crecimiento característico (productoras de ácido y aldehído) producen
gas. Sin embargo la formación de gas podrá demostrarse más adelante a través de la
técnica de confirmación que se apliquen subsecuentemente. En este caso los
resultados se expresan por número de microorganismos por 100 ml demuestra
original.
En la práctica, el método de membrana filtrante ofrece resultados comparables a los

que se obtienen con la técnica de tubos múltiples.
Una de las ventajas del método de membrana filtrante es el menor tiempo en el que
se pueden obtener resultados. El recuento en las mismas se hace de manera directa,
contando las colonias individualmente, pero todavía estará sujeto a errores de tipo
estadístico. Además del recuento, se puede también analizar la morfología de las
colonias y efectuar subculturas directas, reduciéndose así la probabilidad de
reacciones falsas y positivas a partir de cultivos mezclados.
1
Este método no es recomendable para aguas excesivamente turbias, debido a que

podría obstruirse la membrana y por otro lado, si el recuento es muy alto no se
distinguen las colonias por unidad imposibilitando el recuento de las mismas.
Equipos y técnicas de filtración
Equipo de filtración para una sola muestra
Vaso de vidrio
Soporte para el filtro
Junta del vaso con el equipo de vacío
Goma para conexión con la bomba de vacío
Conexión de vidrio con la bomba de vacío
Base
Frasco para la recolección de los líquidos
1
Equipo de filtración para varias muestras
Frasco para la recolección Monitores Bomba de vacío

de los líquidos
Distintos tipos de monitores
Equipo de filtración
múltiple
1
Método de filtración
Volumen del agua analizada
Los recuentos de colonias se hacen normalmente en 100 ml. Y se informan de esa

manera UFC/100 ml.
Medio de cultivos de elección
Los medios que se utilizan para este caso son Violeta Rojo y Bilis Agar (VRBA) para
coliformes totales, Violeta Rojo y Bilis Glucosa agar (VRBG) para coliformes fecales o
medios deshidratados en Pad listos para usar.
1
Pruebas confirmatorias
La decisión de que colonias serán para confirmación depende de las características

culturales de las mismas según el medio de cultivo elegido.
Las pruebas de confirmación deben hacerse con cultivos puros o no que hayan sido
aislados mediante técnicas de subcultivo en placas de medios seleccionados. Se
usaran luego las colonias características para las pruebas de;
 Indol
Negativo
Positivo
 Rojo de metilo
1
 Citrato
 Vorges- Proskauer
Estos resultados se utilizan para identificar E. coli
Indol (+)
Rojo de Metilo (+)
Vores-Proskauer (-)
Citrato (-)

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Métodos de detección de organismos indicadores de contaminación

 Método de tubos múltiples

Definición de los microorganismos del grupo coliformes

El término microorganismos coliformes o coliformes totales se aplica a todo bacilo

La selección de pruebas para detectar y confirmar la existencia de este grupo de

Técnicas para la detección de coliformes totales

 Método de tubos múltiples

Se considera que la prueba inicial es presuntiva debido a que la reacción de ácido y

Se puede obtener un estimado del número de coliformes totales presuntivos

Este procedimiento puede aplicarse a cualquier tipo de agua, en especial en aquellas

Técnica: Se inoculan 9 tubos de diferentes concentraciones.

 Tres tubos se realizan en tubos con 10 m de caldo en doble concentración y se

Elección de medios de cultivo

Luego de la inoculación con el medio seleccionado se incuban los tubos a

Lectura e interpretación de resultados

Para la lectura e interpretación de resultados utilizamos las tablas de probabilidad

Caldo Mac Conkey:

Negativo: tubo purpura sin formación de gas

Positivo: tubo amarillo con formación de gas

Caldo Lauril sulfato y Caldo lactosado:

Negativo: tubo sin turbidez y sin producción de gas.

Positivo: tubo con turbidez y producción de gas.

Pruebas confirmatorias: la presencia de coliformes presuntiva positiva deberá

Los tubos que muestran reacciones positivas a las 24 y 48 horas se subcultivan

Para la confirmación de presencia de coliformes fecales, deberán realizarse

bacterias coliformes fecales en los tubos originales. De esta manera buscamos el

Técnica de membrana filtrante

El número de coliformes totales presentes en el agua puede determinarse también

En la membrana se desarrollan colonias características que producen acido o

En la práctica, el método de membrana filtrante ofrece resultados comparables a los

Este método no es recomendable para aguas excesivamente turbias, debido a que

Equipos y técnicas de filtración

Equipo de filtración para una sola muestra

Soporte para el filtro

Junta del vaso con el equipo de vacío

Goma para conexión con la bomba de vacío

Conexión de vidrio con la bomba de vacío

Frasco para la recolección de los líquidos

Equipo de filtración para varias muestras

Frasco para la recolección Monitores Bomba de vacío

Distintos tipos de monitores

Volumen del agua analizada

Los recuentos de colonias se hacen normalmente en 100 ml. Y se informan de esa

Medio de cultivos de elección

La decisión de que colonias serán para confirmación depende de las características

Estos resultados se utilizan para identificar E. coli

Rojo de Metilo (+)

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