Introducción

Para que una especie bacteriana subsista debe mantener estable su ADN. La estabilidad del ADN se
puede ver afectada por errores en la replicación o, ya que el ADN es un químico, por reacciones químicas
(calor, UV, etc.)
El ADN dañado puede ser deletéreo para las células porque su ADN no puede ser capaz de
replicarse sobre el área dañada y por lo tanto las células no pueden multiplicarse. Aun si el daño no bloquea
la replicación, replicar sobre el daño puede producir mutaciones, las cuales pueden ser deletéreas o incluso
letales. Obviamente, las células necesitan de mecanismos de reparación del ADN.
Para describir el daño del ADN y su reparación, se deben definir algunos términos. El daño químico
en el ADN se denomina ​lesión​. Los compuestos químicos o los tratamientos químicos que producen
lesiones en el ADN pueden matar a la célula o pueden aumentar la frecuencia de mutaciones en el ADN.
Tales tratamientos que generan mutaciones se denominan ​tratamientos mutagénicos ​o ​mutágenos​.
Algunos mutágenos pueden ser ​mutágenos in vitro ​porque se usan para dañar el ADN en el tubo de
ensayo y luego producir mutaciones cuando el ADN se introduce en las células. Otros mutágenos pueden
ser ​mutágenos in vivo ​porque dañan el ADN dentro de la célula, por ejemplo interfiriendo con el
apareamiento de bases durante la replicación.
En este capítulo vamos a ver los tipos de daños del ADN, cómo cada tipo de daño podría producir
mutaciones, y cómo las bacterias reparan estos daños. Muchos de estos mecanismos parecen ser
universales, y parecen ser compartidos por organismos superiores, incluso en humanos.
EVIDENCIA DE LA REPARACIÓN DEL ADN
¿Cómo sabemos que las células reparan el daño del ADN? Una manera es medir la muerte celular a
través de un químico o por irradiación. Los agentes químicos y la radiación que dañan el ADN normalmente
también lo hacen sobre otros componentes celulares: ARN, proteínas. Sin embargo, el daño en el ADN es
más perjudicial porque normalmente las células tienen varias copias de un ARN o de una proteína por lo que
las moléculas que no son dañadas pueden reemplazar a las dañadas.
Para medir la muerte celular podemos comparar las células que sobreviven al ser expuestas de
manera intermitente a pequeñas dosis del agente que daña el ADN con las células que sobreviven al ser
expuestas de manera continua al agente que daña el ADN.
1. Si las células tienen sistemas de reparación del ADN, una mayor cantidad de células van a sobrevivir
durante el tratamiento intermitente porque entre cada tratamiento pueden reparar el daño
2. Si las células no tienen sistemas de reparación, no habría diferencia entre los tratamientos
Una representación gráfica de este experimento es construir una curva de muerte. Esta curva se obtiene
al graficar el número de células que sobreviven en función del tiempo de tratamiento con un agente que
daña el ADN. Las dos curvas que se obtienen se muestran en la Figura 1.11.

Ya sabemos a través del experimento anterior que las células reparar el daño del ADN. Para ello, tienen
ciertos mecanismos que le permiten hacerlo. Pero… ​¿Cómo reconocen el daño estos mecanismos?​:
1. Algunos mecanismos reconoces daños específicos. Por lo tanto se denominan mecanismos
 específicos de reparación.
2. Otros mecanismos reconocen alteraciones en la estructura del ADN. Por lo tanto se denominan
mecanismos generales de reparación
Ahora bien, existen distintos mecanismos de reparación. Pero… ​¿Cómo reparan el daño del ADN?​:
1. Algunos mecanismos ​revierten el daño​. Ejemplos:
a. Fotoliasa
b. Metiltransferasas
2. Otros mecanismos ​remueven el daño ​y colocan la(s) base(s) adecuadas en el lugar del daño.
Ejemplos:
a. B.E.R
b. N.E.R
c. Sistema de reparación metil-dirigido
MECANISMOS DE REPARACIÓN ESPECÍFICOS
DESAMINACIÓN DE BASES
Uno de los tipos más comunes de daño del ADN es la ​desaminación de bases​. Algunos de los
grupos amino en adenina (A), citosina (C) y guanina (G) son vulnerables y pueden ser removidos
espontáneamente o por muchos agentes químicos (Figura 11.2). Cuando la adenina se desamina, se
convierte en ​hipoxantina​. Cuando la guanina se desamina, se convierte en ​xantina​. Cuando la citosina se
desamina, se convierte en ​uracilo​.
La desaminación de bases es mutagénica porque da lugar a ​mispairing d ​ e bases. Como se muestra
en la Figura 11.2, la hipoxantina derivada de la desaminación de la adenina se aparea con citosina en vez
de timina, y el uracilo derivado de la desaminación de la citosina se aparea con adenina en lugar de guanina.
El tipo de mutación provocada por la desaminación depende de qué base se altere. Por ejemplo, la
hipoxantina se aparea con citosina durante la replicación, incorporando C en lugar de T en esa posición. En
la siguiente replicación, la C se va a aparear con la G, provocando una transición AT-a-GC en el ADN. De
manera similar, un uracilo que resulta de la desaminación de citosina se aparea con una adenina durante la
replicación, provocando una transición GC-a-AT.
Agentes desaminantes
Aunque la desaminación frecuentemente ocurre de manera espontánea, especialmente a altar
temperaturas, algunos tipos de químicos reaccionan con el ADN y remueven grupos amino de las bases. El
tratamiento del ADN con estos químicos, llamados ​agentes desaminantes​, puede aumentar la tasa de
mutaciones.
1. Hidroxilamina​: Específicamente remueve el grupo amino de la citosina y como consecuencia
produce sólo transiciones GC-a-AT en el ADN. Sin embargo, la hidroxilamina es un mutágeno in
vitro, por lo que no puede ingresar a la célula y sólo puede ser usado para mutagenizar ADN
purificado o virus. La mutagénesis a través de hidroxilamina es particularmente eficiente cuando el
ADN tratado se introduce en células que son deficientes en la reparación del ADN a través de
enzima uracil-​N​-glicosilasa (se discute a continuación)
2. Bisulfito​: Al igual que la hidroxilamina, desamina sólo citosina pero estas citosinas deben estar en
un ADN simple hebra. Esta propiedad del bisulfito lo hizo útil en la ​mutagénesis sitio-dirigida
3. Ácido nitroso​: No solo desamina citosinas sino que también remueve los grupos amino de
adenina y guanina (Figura 11.2). Ya que es menos específico, produce tanto transiciones GC-a-AT
como AT-a-GC así como también deleciones. El ácido nitroso es capaz de ingresar en algunas
células pero no en otras, por lo que puede ser usado como un mutágeno in vivo e in vitro
 Reparación de las bases desaminadas. Reparación
por escisión de base
Las ​ADN glicosilasas ​rompen el enlace glucosídico
entre la base dañada (base desaminada) y el azúcar. Existe
una única ADN glicosilasa para cada tipo de base
desaminada y remueve sólo esa base en particular.
Cuando una base sufre desaminación, la ADN
glicosilasa reconoce la base dañada y rompe el enlace
glucosídico. En este momento se genera un ​sitio AP ​(sitio
apirimidínico o apurínico, dependiendo de qué base sea).
Una ​5’-AP endonucleasa ​rompe el enlace fosfodiéster del
lado 5’-P​i de la base dañada, dejando un grupo 3’-OH. La
ADN desoxirribosa fosfodiesterasa ​(​dRPasa​) remueve la
5’-desoxirribosa fosfato que perdió la base dañada. Luego, la
ADN polimerasa ​(ADN polimerasa I en ​E. coli​) y la ​ADN
ligasa ​rellenan el hueco.

Very-short-patch repair de 5-metilcitosina desaminada

La mayoría de los organismos tienen algunas bases llamadas 5-metilcitosina en lugar de citosinas en
sitios específicos de su ADN. Estas bases son citosinas con un grupo metilo en la posición 5 sobre el anillo
de pirimidina en lugar del hidrógeno (Figura 11.2B). Enzimas específicas llamadas ​metiltransferasas
transfieren el grupo metilo hacia esta posición después de que el ADN se sintetizó. La función de la
5-metilcitosina no se sabe con exactitud, pero se sabe que a veces ayuda a proteger el ADN de las enzimas
de restricción y pueden ayudar a regular la expresión génica.
Los sitios donde hay 5-metilcitosina en el ADN son frecuentemente “​hot spots”​ para la mutagénesis,
porque la desaminación de la 5-metilcitosina produce timina en lugar de uracilo (a diferencia de la citosina
que produce uracilo cuando se desamina). Esta timina en el ADN no es reconocida por la uracil-​N​-glicosilasa
ya que es una base normal en el ADN. Estas timinas están apareadas con G y pueden ser reparadas por el
sistema de reparación de mismatch metil-dirigido​. Sin embargo, en un mismatch GT creado por un error
en la replicación, la base incorporada por error puede ser identificada porque está en la hebra recientemente
replicada, mientras que los mismatch GT creados por la desaminación de la 5-metilcitosina no se encuentran
generalmente en la hebra recientemente sintetizada. Reparar la hebra equivocada produce transiciones
GC-a-AT en el ADN.
En ​E. coli l​ a mayoría de las 5-metilcitosina en el ADN se forma por metilación de la segunda citosina
de la siguiente secuencia: ​5u​​ 𝐶𝐶𝑊𝐺𝐺3​u​/3​u​𝐺𝐺𝑊𝐶𝐶5′ ​donde el par de base del medio (​𝑊​) generalmente es
AT o TA. Como dijimos, la segunda citosina de esta secuencia se metila por la enzima ​ADN citosina
metilasa ​(​Dcm metilasa​). Debido a la potencial mutación que puede ocurrir, ​E. coli ​tiene un mecanismo de
reparación especial para las 5-metilcitosina desaminadas en esta secuencia. Este sistema remueve
específicamente la timina que aparezca en un mismatch TG en esta secuencia. Debido a que una pequeña
región, o un “parche”, de la hebra de ADN que contiene la T se remueve y se re-sintetiza durante el proceso
de reparación, el mecanismo se denomina ​reparación de un parche muy corto ​(​very-short-patch repair)​ .
En este mecanismo, la ​Vsr endonucleasa​, el producto del gen ​vsr​, se une al mismatch TG en la secuencia
C​m​CWGG/GGWTC y hace un corte al lado de la T. Luego se remueve la T y la hebra es re-sintetizada por
una ADN polimerasa de reparación, la cual inserta la C correcta.
El sistema de reparación Vsr es muy específico y normalmente sólo repara los mismatches TG en la
secuencia que se mostró arriba. El gen ​vsr ​se encuentra inmediatamente corriente abajo del gen de la Dcm
metilasa, asegurando que las células que heredan el gen para metilar la C en la secuencia que vimos arriba
también hereden la habilidad de reparar el mismatch si la C-metilada (5-metilcitosina) es desaminada.
DAÑO DEBIDO A ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO
Aunque el oxígeno molecular (O​2​) no es muy dañino para el ADN y las demás macromoléculas, las
especies reactivas del oxígeno en las que el oxígeno adquirió un electrón extra, son muy dañinas. Estas
especies reactivas incluyen el ​radical superóxido​, ​peróxido de hidrógeno ​y ​radical hidroxilo​, los cuales
se producen por reacciones celulares normales. También pueden formarse como resultado de factores
ambientales, incluyendo la radiación UV y químicos como el herbicida paraquat.
Por lo tanto, los organismos desarrollaron sistemas que eliminan las especies reactivas del oxígeno.
En bacterias, algunos de estos sistemas se inducen por la presencia de las especies reactivas del oxígeno, y
estos genes codifican enzimas como la superóxido dismutasa, catalasa, peróxido reductasa, entre otras, que
destruyen las especies reactivas del oxígeno. Estos sistemas también incluyen genes que codifican
enzimas de reparación que ayudan a reparar el daño oxidativo del ADN producido por las formas reactivas
del oxígeno. La acumulación de este tipo de daño puede ser responsable de aumentar la tasa de cáncer con
la edad y muchas enfermedades degenerativas asociadas a la edad.
8-oxoG
Una de las lesiones más mutagénicas en el ADN producidas por las especies reactivas del oxígeno
es la base oxidada ​7,8-dihidro-8-oxoguanina ​(​8-oxoG ​o ​GO​) (Figura 11.4). Esta base aparece
frecuentemente en el ADN debido al daño producido por las especies reactivas del oxígeno que se producen
internamente, y, a menos que los sistemas de reparación actúen sobre el daño, la ADN polimerasa III
mal-aparea esta base con
adenina, provocando mutaciones espontáneas. Debido al potencial mutagénico que tiene la 8-oxoguanina,
E. coli ​desarrolló muchos mecanismos para evitar estas mutaciones.
MutM, MutY y MutT
Los productos de los genes ​mut ​de un organismo reducen las tasas normales de mutaciones
espontáneas; por lo tanto, los organismos con una mutación que inactive un gen ​mut s​ ufrirán tasas de
mutaciones más altas que las normales (más adelante se discute el aislamiento de mutaciones ​mut)​ . Los
genes ​mut ​de ​E. coli ​que incluyen ​mutM​, ​mutY y​ ​mutT,​ son genes exclusivos para prevenir las mutaciones
debido a 8-oxoG. Las funciones de estos tres genes ​mut ​son aditivas a reducir las mutaciones espontáneas,
ya que la tasa de mutaciones espontáneas es más alta si dos o los tres genes ​mut ​se mutan que si sólo uno
de ellos se muta.
 MutM
La enzima MutM es una ​N​-glicosilasa que específicamente remueve la base 8-oxoG del azúcar
desoxirribosa en el ADN (Figura 11.4). La ruta de reparación funciona como cualquiera otra ruta de
reparación que involucre ​N-​ glicosilasa excepto que la hebra depurada se corta a través de la actividad AP
endonucleasa de la propia MutM, degradada por la exonucleasa y re-sintetizada por la ADN polimerasa I
(Figura 11.3). El gen ​mutM ​es parte de un regulón inducido en respuesta a estrés oxidativo (ver apunte de
Regulación transcripcional).
MutY
La enzima MutY también es una ​N​-glicosilasa específica que en vez de remover 8-oxoG
directamente, remueve las bases adenina que se aparearon con 8-oxoG erróneamente (Figura 11.4). La
ADN polimerasa de reparación introduce la C en lugar de la A para prevenir la mutación. Esta enzima
​ n donde una A se apareó con una G y remueve la A.
también aparentemente reconoce ​mismatch e
MutT
La enzima MutT funciona por un mecanismo diferente (Figura 11.4): previene que entre 8- oxoG al
ADN. Las especies reactivas del oxígeno no sólo pueden oxidar guanina en el ADN sino que también la
base en el dGTP para formar 8-oxodGTP. Sin la enzima MutT, el 8-oxodGTP se incorpora en el ADN a
través de la ADN polimerasa III, la cual no puede distinguir entre 8-oxodGTP y dGTP. La enzima MutT es
una fosfatasa específica que degrada el 8-oxodGTP a 8-oxodGMP para que no pueda ser usado en la
síntesis de ADN.

Genética de la mutagénesis de
8-oxoG
La evidencia que se obtiene con las
mutantes en ​mutM,​ ​mutY y​ ​mutT e ​ s
consistente con los productos de estos
genes. Primero, se explicó por qué los
efectos de las mutaciones en estos genes
son aditivos. Si ​mutT ​se muta, más cantidad
de 8-oxodGTP se incorpora al ADN,
aumentando la tasa de mutaciones
espontáneas. Si MutM no remueve 8-oxoG
del ADN, la tasa de mutaciones espontáneas aumenta aun más. Si MutY no remueve algunas de las A’s que
se aparearon por error con 8-oxoG, la tasa de mutaciones espontáneas será más alta aún. Las mutaciones
en los genes ​mutM,​ ​mutY y​ ​mutT ​también aumentan la frecuencia de sólo algunos tipos de mutaciones. Por
ejemplo, en las mutantes en ​mutM ​y ​mutY ​aumenta la frecuencia de mutaciones por transversión GC-a-TA.
El hecho de que estas mutaciones aumenten la frecuencia del mismo tipo de mutación sugirió que ambos
genes (​mutM y​ ​mutY​) funcionan en la misma ruta. Si MutM no remueve 8-oxoG del ADN, el apareamiento
erróneo de 8-oxoG con A puede conducir a transversiones GC-a-TA. Además, las transversiones GC-a-TA
ocurren si MutY no remueve las A’s mal apareadas con 8-oxoG en el ADN. Por contraste, mientras las
mutaciones en ​mutT ​pueden aumentar la frecuencia de mutaciones por transversión GC-a-TA, también
aumentan la frecuencia de transversiones TA-a-GC. Esto es posible porque una molécula de 8-oxodGTP
puede producir mutaciones de dos maneras: puede incorporarse en el ADN al aparearse con una A y luego,
una vez en el ADN, se aparea correctamente con una C resultando en una transversión de AT-a-CG; o
puede entrar en el ADN correctamente como una G apareándose con una C y luego, una vez en el ADN,
aparearse incorrectamente con una A dando como resultado transversiones GC-a-TA.
 DAÑO DEBIDO A AGENTES ALQUILANTES
La ​alquilación ​es otro tipo de daño del ADN. Tanto las bases como los fosfatos en el ADN pueden
ser alquilados. Los químicos responsables, conocidos como ​agentes alquilantes​, usualmente adicionan
grupos alquilo (CH​3​, CH​3​CH​2​, etc.) a las bases o fosfatos en el ADN. Ejemplos de agentes alquilantes: etil
metanosulfonato (​EMS​), metil metanosulfonato (​MMS​) y el ​N​-metil-​N’-​ nitro-​N-​ nitrosoguanidina (​NTG​).
Algunos de estos agentes alquilantes actúan directamente sobre el ADN, mientras que otros reaccionan con
constituyentes celulares que se supone deben inactivarlos pero en su lugar los convierten en agentes
alquilantes. Las células necesitan sistemas de reparación para evitar el daño del ADN por alquilación.
Muchos grupos reactivos de las bases pueden ser atacados por los agentes alquilantes. Los más
reactivos son el N​7 ​de la guanina y el N​3 ​de la adenina. Estos nitrógenos pueden ser atacados por EMS o
MMS para producir bases metiladas o etiladas tales como N​7​- metilguanina y N​3​-metiladenina,
respectivamente. La alquilación de las bases en estas posiciones altera el apareamiento con otras bases,
provocando principalmente distorsiones en la hélice.
Otros agentes alquilantes, como la nitrosoguanidina (NTG), pueden atacar otros átomos en los
anillos, incluyendo el O​6 ​de la guanina y el O​4 ​de la timina. La adición de un grupo metilo a estos átomos
produce O​6​-metilguanina (Figura 11.5) y O​4​-metilguanina, respectivamente. Las bases alteradas con un
grupo alquilo en estas posiciones son mutagénicas porque la hélice no se distorsiona significativamente por
lo que no puede ser reparada por los sistemas de reparación más
generales.

N​-glicosilasas específicas
Algunos tipos de bases alquiladas pueden ser removidas por
N​-glicosilasas específicas. La ruta es similar a como actúan otras
N​-glicosilasas. Primero se remueve la base alquilada por la ​N​-glicosilasa
específica y luego la hebra de ADN apurínico o apurimidínico se corta por
una AP endonucleasa. Las exonucleasas degradan la hebra cortada que
luego es re-sintetizada por la ADN polimerasa I. En ​E. coli s​ e identificaron
dos ​N​- glicosilasas que remueven bases metiladas y etiladas del ADN. Una
de ellas, ​TagA ​remueve la base 3-metiladenina y algunas bases metiladas y etiladas relacionadas. La otra,
AlkA​, es menos específica. No sólo remueve 3-metiladenina sino que también remueve otras bases
incluyendo 3-metilguanina y 7-metilguanina.
Metiltransferasas
Otro sistema de reparación para bases alquiladas repara la base dañada en lugar de removerla y
re-sintetizar el ADN. Estas proteínas, llamadas ​metiltransferasas​, directamente remueven el grupo alquilo
desde la base alterada en el ADN hacia ellas mismas. Cuando transfieren el grupo alquilo a ellas mismas se
inactivan y eventualmente son degradadas. Las dos principales metiltransferasas en ​E. coli s​ on ​Ada ​y ​Ogt​, a
veces llamadas alquil-transfersas I y II, respectivamente. Ambas proteínas reparan bases dañadas por
alquilación del carbono O​6 ​de la guanina y el carbono O​4 ​de la timina. Ogt cumple el rol principal cuando las
células están creciendo activamente, pero cuando las células llegan a la fase estacionaria se induce Ada
como parte de la respuesta adaptativa y se convierte en la principal metiltransferasa (ver a continuación). El
hecho de que la célula sacrifique proteínas para reparar este tipo de lesiones se debe al potencial
mutagénico de estas lesiones.
La respuesta adaptativa
Muchos de los genes que codifican ​N-​ glicosilasas y metiltransferasas que reparan el daño por
alquilación en ​E. coli ​son parte de la ​respuesta adaptativa​. Los productos de estos genes se sintetizan
normalmente en pequeñas cantidades, pero se producen en cantidades mucho más grandes si las células
se exponen a un agente alquilante. El nombre “respuesta adaptativa” viene de la evidencia de que ​E. coli s​ e
“adaptaba” al daño producido por los agentes alquilantes. Si las células de ​E. coli s​ e tratan brevemente con
un agente alquilante como la NTG, serán más capaces de sobrevivir siguientes tratamientos con este agente
alquilante y otros agentes alquilantes.
Regulación de la respuesta adaptativa
El tratamiento de células de ​E. coli ​con un agente alquilante produce el aumento en
la concentración de algunas de las proteínas involucradas en la reparación del daño por
alquilación. Los genes inducidos como parte de la respuesta adaptativa incluyen ​ada,​ ​aidB​,
alkA ​y ​alkB.​ La regulación se logra a través del estado de metilación de una de estas
proteínas, la proteína Ada (Figura 11.6). El gen ​ada e ​ s parte de un operón junto con ​alkB​,
mientras que ​aidB y​ ​alkA s​ e transcriben de forma separada. La proteína Ada puede regular
su propia transcripción porque además de actuar como reparadora del daño por alquilación
es un activador transcripcional. Sin embargo, la proteína Ada actúa como activador
transcripcional sólo si el daño por alquilación es bastante extenso. Esta proteína puede
detectar el nivel de daño en el ADN porque tiene dos aminoácidos que reciben los grupos
metilo: Cys​321 ​(el aminoácido 321 desde el N-terminal) y Cys​38 ​(el aminoácido 38 desde el
N-terminal). Después de que haya ocurrido un daño leve por alquilación, la mayoría de la
metilación se encuentra en las bases; estos grupos metilos pueden ser transferidos hacia el
O​6​-metilguanina o el O​4​-metiltimina de la Cys​321​, cercano al C- terminal. Este proceso
remueve los grupos metilo de las bases dañadas pero inactiva la proteína Ada. A niveles de
agente alquilante más altos, algunos de los fosfatos del esqueleto de ADN se pueden
metilar. Estos grupos metilo se transfieren a la Cys​38​, cercana al N-terminal. La presencia de
un grupo metilo en la Cys​38 ​convierte a la proteína Ada en un
activador transcripcional que activa su propia transcripción así
como también la de otros genes bajo su control.
Algunos de los genes de la respuesta adaptativa también se
prenden durante la fase estacionaria. La transcripción de genes
durante la fase estacionaria requiere de σ​8 ​en lugar de σ​70​, y la
proteína Ada metilada puede también activar la transcripción a
través de una ARN polimerasa que contiene σ​8 ​en estos
promotores. Sin embargo, sólo la transcripción del operón
ada-​ ​alkB ​y del gen ​aidB s​ e activa por metilación en la fase
​ o se activa sino que
estacionaria; la transcripción del gen ​alkA n
en realidad es reprimida por la proteína Ada metilada en este
estadio. Es posible que estos genes se induzcan en la fase
estacionaria para prevenir el daño del ADN debido a la
acumulación natural de nitrosaminas, las cuales se acumulan
cuando las células se quedan sin oxígeno. Lo siguiente también
puede explicar por qué el gen ​alkA s​ e reprime en fase
estacionaria: la
proteína AlkA es una ​N​-glicosilasa específica que corta el ADN
que está alquilado pero después requiere de la replicación del
ADN para terminar el trabajo. Muy poca replicación ocurre en
células en fase estacionaria.

DAÑO DEBIDO A RADIACIÓN UV

Una de las principales fuentes de daño natural del ADN es la
radiación UV debido a la exposición al sol. La estructura de anillo
conjugado de las bases en el ADN produce que absorban luz UV. Los
fotones absorbidos energizan las bases, provocando que sus dobles
enlaces reaccionen con átomos cercanos y por lo tanto formar enlaces
químicos adicionales. Estos enlaces químicos adicionales se unen de
forma anormal a bases del ADN o entre los azúcares y las bases de los nucleótidos.
 Un daño común de la radiación UV es la formación de
dímeros de timina​, en donde dos anillos adyacentes de pirimidina
se fusionan (Figura 11.7). En uno de los dos posibles dímeros, los
átomos de carbono en posición 5 y 6 de dos pirimidinas adyacentes
se unen para formar un ​anillo de ciclobutano​. En el otro tipo de
dímero, el carbono en posición 6 de una pirimidina se une al carbono
en posición 4 de una pirimidina adyacente para formar una ​lesión
6-4​.

Fotorreactivación
Ya que es muy común el dímero de pirimidina de tipo ciclobutano
debido a radiación UV, existe un tipo especial de sistema de reparación
denominado ​fotorreactivación​. Se llama fotorreactivación porque sólo
ocurre en presencia de luz. Este sistema separa las bases fusionadas del
dímero de pirimidina de tipo ciclobutano.
La fotorreactivación fue el primer sistema de reparación del ADN que
se descubrió. En 1940s, se observó que la bacteria ​Streptomyces griseus
sobrevivía más cuando era irradiada con UV en presencia de luz que
cuando era irradiada de noche. La fotorreactivación existe en la mayoría de
los organismos sobre la Tierra, con la excepción de los animales
placentarios como los humanos. Es un error pensar que cuando tomamos
sol los efectos se están reparando porque en realidad no tenemos este
mecanismo de reparación.
El mecanismo de acción de la fotorreactivación se muestra en la
Figura 11.8. La enzima responsable de la reparación es la ​fotoliasa​. Esta
enzima contiene el grupo FAD reducido (FADH​2​) en su sitio activo, el cual
absorbe luz UV. La absorción de luz le da la energía suficiente para separar
las bases fusionadas. Una enzima diferente pero relacionada actúa en la
reparación de lesiones 6-4 en eucariotas.

N​-glicosilasas específicas para los dímeros de pirimidina

También hay ​N​-glicosilasas específicas que reconocen y remueven dímeros de pirimidina. Este
sistema de reparación es similar al que la célula usa para las bases desaminadas y alquiladas, como
discutimos anteriormente. Involucra AP endonucleasas y la remoción y re-síntesis de las hebras del ADN
que contienen los dímeros.
MECANISMOS DE REPARACIÓN GENERALES
En las células, no todos los mecanismos de reparación son específicos para un cierto tipo de daño
del ADN. Algunos tipos de sistemas de reparación pueden reparar muchos tipos diferentes de daños. Estos
sistemas reconocen distorsiones en la estructura del ADN producidas por el apareamiento inadecuado de
bases y las reparan, independientemente del tipo de daño que causó la mutación.
 EL SISTEMA DE REPARACIÓN DE MISMATCH METIL-DIRIGIDO
Este sistema de reparación no es específico y puede reparar cualquier daño que provoque una
ligera distorsión en la hélice del ADN, incluyendo mismatches, cambios en el marco, incorporación de
análogos de bases, 8-oxoG, algunos tipos de alquilación que provoquen distorsiones menores en la hélice
de ADN. Los tipos de alquilación que provoquen distorsiones mayores son reparados por otros sistemas,
incluyendo el sistema de reparación por escisión de nucleótido (ver a continuación). ​En general, el ADN
dañado que produce sólo distorsiones menores en la hélice se repara con el sistema de reparación
de mismatch metil-dirigido, mientras que el ADN dañado que produce distorsiones mayores se
repara por otras vías​.
Análogos de base
Los análogos de base son químicos que se parecen a las bases
normales en el ADN. Por lo tanto, estos análogos pueden convertirse en
desoxinucleósidos trifosfato y entrar en el ADN. La incorporación de un
análogo de base puede ser mutagénico porque frecuentemente el
análogo se aparea incorrectamente, conduciendo a cambios en los pares
de bases en el ADN. La Figura 11.9 muestra dos análogos de base:
2-aminopurina ​(​2-AP​) y ​5-bromouracilo ​(​5-BU​). La 2-AP se parece a la
adenina, mientras que el 5-BU se parece a la timina.
La Figura 11.10 muestra cómo el mispairing por un análogo de base
podría producir una mutación. En la figura, el análogo de base 2-AP entra
en la célula y se convierte en el nucleósido trifosfato. Luego, la
desoxirribosa 2-aminopurina trifosfato se incorpora durante la síntesis del
ADN apareándose incorrectamente con una citosina. El tipo de mutación
que ocurre depende de cuando la 2-AP se aparea incorrectamente con
citosina.
1. Cuando la 2-AP entra en el ADN por error y se aparea con
C en lugar de T, en las siguientes replicaciones
usualmente se aparea correctamente con T. Esto produce
mutaciones por transiciones GC-a-AT (Figura 11.10A).
2. Sin embargo, si la 2-AP se incorpora apropiadamente por
apareamiento con T pero se aparea incorrectamente con C
durante las siguientes replicaciones, ocurre una mutación por
transición AT-a-GC (Figura 11.10B) Lo mismo ocurre con 5-BU
nada más que a veces se aparea incorrectamente con C en
lugar de A.

Mutágenos que cambian el marco

Otro tipo de daño que repara el sistema de reparación por mismatch
metil-dirigido es la incorporación de mutágenos que cambian el marco.
Estos químicos son moléculas planas que actúan como mutagénicos porque
se intercalan entre las bases en la misma hebra del ADN, aumentando la
distancia entre las mismas y por lo tanto previniendo que se puedan alinear
correctamente con las bases en la otra hebra. Estos mutágenos incluyen los
colorantes de acridina tales como 9-aminoacridina, proflavina, bromuro de
etidio, etc.
La Figura 11.11 muestra un modelo de mutagénesis debido a este tipo de mutágenos.

Mecanismo de reparación de mismatch metil-dirigido

Este mecanismo de reparación requiere los productos de los genes
mutS,​ ​mutL y​ ​mutH​. Al igual que los genes ​mut i​ nvolucrados en evitar la
mutagénesis debido a 8-oxoG, estos genes ​mut ​se encontraron en
investigaciones de mutaciones que aumentaban la tasa de mutaciones
espontáneas. Otro gen que participa en este mecanismo es el producto del
gen ​dam.​ Este gen codifica para la ​Dam metilasa​, una enzima que metila
la adenina en la secuencia GATC/CTAG. Esta enzima metila al ADN en
esta secuencia sólo después que el ADN se sintetizó, por lo que la hebra
nueva de ADN temporariamente está des- metilada. Al tener genes ​mut q ​ ue
reparen sólo la hebra recién sintetizada, la célula evita las mutaciones
porque la mayoría se producen durante la síntesis de las hebras nuevas. Si
se degradara la hebra vieja y se usaría la hebra nueva como templado, el
daño se fijaría como una mutación y pasará a generaciones futuras.
¿Cómo puede el sistema de reparación por mismatch usar el estado
de metilación de la secuencia GATC/CTAG para dirigirse hacia la hebra
recién sintetizada aunque la secuencia GATC/CTAG más cerca esté algo
alejada de la alteración? La Figura 11.12 muestra un modelo. Primero, un
dímero de la proteína MutS se une a la alteración en el ADN que produce
una distorsión menor en la hélice (se marca con una X en la figura). Una
secuencia GATC cercana sigue sin estar metilada sobre la hebra recién
sintetizada. Luego, dos copias de la proteína MutL y una copia de la
proteína MutH se unen al dímero de MutS. Esta unión activa la nucleasa
MutH que corta la secuencia GATC hemi-metilada más cercana en la hebra
no metilada recién sintetizada y las exonucleasas degradan el ADN
pasando el sitio del mismatch original. Luego, la ADN polimerasa III rellena
el hueco y liga los extremos. ​Este modelo es apoyado por experimentos
que muestran que el sistema de reparación por mismatch
metil-dirigido repara los mismatches sobre la hebra hemi-metilada al
corregir la secuencia sobre la hebra no metilada del ADN​. En qué
dirección (3’-5’ o 5’-3’) se degrada el ADN, va a depender del lado de la
secuencia GATC más cercana donde ocurrió el mismatch. De acuerdo a
este modelo, ​E. coli r​ esuelve este problema al usar cuatro exonucleasas
diferentes: ​ExoVII ​y ​RecJ ​que degradan sólo en dirección 5’-3’; ​ExoI
y ​ExoX ​que degradan sólo en dirección 3’-5’. Además, estas
exonucleasas pueden degradar sólo ADN simple hebra y requieren
una helicasa que separe las hebras. Este es el trabajo de la ​helicasa
UvrD ​que también se usa en el sistema de reparación por escisión de
nucleótido (ver más adelante).

Reparación VSP
Además de su rol en el sistema de reparación por mismatch, las proteínas MutS y MutL participan en
la reparación a través de un parche muy corto (​very-short-patch repair)​ que ocurre en sitios donde hay
5-metilcitosina. La proteína MutS puede unirse a la T en el mismatch T-G creado por desaminación de la C
metilada en esta posición, y por lo tanto atraer la atención de la endonucleasa Vsr hacia el mismatch. La
proteína MutL puede luego reclutar a la helicasa UvrD y las exonucleasas para degradar la hebra que
produce el mismatch.
Evidencia genética para el sistema de reparación de mismatch metil-dirigido
El resultado de los experimentos que se plantean a continuación apoya la conclusión de que el
estado de metilación de las secuencias GATC del ADN ayuda a direccionar el sistema de reparación de
mismatch hacia la hebra recién sintetizada del ADN.
Aislamiento de mutantes ​mut
Los genes ​mut ​fueron encontrados en ​E. coli p
​ orque las mutaciones en
estos genes aumentaban la tasa de mutaciones espontáneas. Nos referimos al
fenotipo mutante como “fenotipo mutador”.
Un método común para detectar mutantes con altas tasas de mutaciones
espontáneas es la ​papilación de colonias​. Este método se basa en que todos
los descendientes de una bacteria con una mutación particular son mutantes del
mismo tipo (clones). Por lo tanto, si ocurre una mutación en una colonia en
crecimiento, las bacterias mutantes de la mutante original se mantienen juntas y
forman una ​papila ​a medida que se forma la colonia. Una colonia en crecimiento
puede contener muchas papilas compuestas por mutantes de diferentes tipos.
Una mutación ​mut a ​ umenta la frecuencia de papilación para
muchos tipos de mutantes​.
Las revertantes Lac​+ ​de mutaciones ​lac e
​ n ​E. coli s​ on una opción
para los ensayos de papilación, porque las revertantes forman papilas
azules en placas que contienen X-Gal. La Figura 11.13 muestra un
ensayo de papilación que usa la reversión de una mutación ​lac ​como
indicador. Si las bacterias que forman una colonia son mutantes ​mut ​con alta tasa de mutaciones
espontáneas que lo normal, la colonia va a tener más papilas que lo normal. Así es como se detectaron los
genes ​mut​.
Una vez que se detectaron los genes ​mut​, se clasificaron dentro de grupos de complementación y se
nombraron arbitrariamente. Por ejemplo, se predijo que los productos de tres genes ​mut (​ ​mutS,​ ​mutL ​y
mutH)​ participan en la misma ruta de reparación debido a la observación de que las doble mutantes no
exhibían tasas de mutación espontánea más grande que las células con mutaciones en uno de los genes.
En otras palabras, inactivar dos de estos genes no tiene un efecto aditivo.
Otros experimentos establecieron el rol de la Dam metilasa en el sistema de reparación de
mismatch. En estos experimentos usaron heterodúplex’s del ADN λ. Se prepararon heterodúplex’s de ADN’s
λ en donde las dos hebras vienen de fagos con diferentes mutaciones. Los llamamos ​fago mutante 1 ​(o
fago a​) y ​fago mutante 2 ​(o ​fago b​). El ADN del fago mutante 2 estaba desmetilado porque se propagó
sobre ​E. coli c​ on una mutación ​dam.​ Después de que el ADN de ambos fagos se purificó, las hebras de ADN
se separaron por calor y se purificaron las hebras complementarias. Las hebras complementarias purificadas
de cada uno de los fagos se mezclaron y rehibridizaron para crear mismatch en el sitio de la mutación, con
una hebra no metilada en sus secuencias GATC y la otra hebra metilada. Luego, estos ADN’s heteroduplex
se transfectaron dentro de las células, se plaqueó la progenie fágica y se ensayaron sus genotipos para ver
qué mutación habían heredado y cuál de las dos hebras había sido preferencialmente reparada. La progenie
del fago exhibió predominantemente el genotipo mutante 1. En el experimento reverso, el fago mutante 1 se
propagó sobre una mutante ​dam ​por lo que tendría ADN no-metilado. En este caso, la progenie del fago que
dio lugar a los ADN heteroduplex tenía el genotipo de la mutante 2; por lo tanto, una vez más, la secuencia
de ADN metilado se preservó preferencialmente. Estos resultados indican que la secuencia de la hebra
no-metilada es la que se repara para coincidir con la secuencia de la hebra metilada.
SISTEMA DE REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDO
Uno de los sistemas de reparación generales más importantes es el ​sistema de reparación por
escisión de nucleótido​, llamado así porque los nucleótidos dañados se quitan del ADN y se reemplazan.
Este sistema es relativamente poco específico porque, al igual que el sistema de reparación de
mismatch, reconoce distorsiones en la hélice del ADN que resultan del daño y no de la estructura química
del daño en sí. Esto lo hace capaz de reconocer y reparar daños como la alquilación, daños causados por la
radiación UV (dímeros de ciclobutano, lesiones 6-4, etc.), etc.
Sin embargo, este sistema reconoce ​distorsiones mayores en la hélice del ADN ​y no puede
reconocer distorsiones menores como los mismatch de bases.
Además, este sistema de reparación se diferencia de la mayoría de los otros porque el ADN que
contiene el daño se escinde y termina fuera de la célula. Por ejemplo, después que las células son irradiadas
con luz UV, aparecen en el medio celular pequeñas piezas de ADN que contienen dímeros de pirimidina y
otros tipos de daños inducidos por UV, debido al sistema de reparación por escisión de nucleótido.
Mecanismo de reparación por escisión de nucleótido
La Tabla 11.1 enumera los genes de ​E. coli ​requeridos para la reparación por escisión de
nucleótidos. Los productos de algunos de estos genes, tales como ​uvrA,​ ​uvrB ​y ​uvrC ​están involucrados
sólo en la reparación por escisión, mientras que los productos de los otros, incluyendo ​polA ​y ​uvrD​, también
son requeridos por otros tipos de reparaciones.
En la Figura 11.14 se muestra cómo
participan estos genes en la reparación por
escisión. Los productos de los genes ​uvrA​, ​uvrB
y ​uvrC ​interaccionan para formar la
endonucleasa UvrABC​. Dos copias de la
proteína UvrA y una copia de la proteína UvrB
forman un complejo que se une de manera no
específica al ADN, aún si no está dañado. Luego,
este complejo migra a través del ADN hasta que encuentre un lugar donde la hélice está distorsionada
debido al daño del ADN. El complejo se frena, la proteína UvrB se une al daño, y la proteína UvrA se va,
siendo reemplazada por UvrC. La unión de UvrC a UvrB produce que UvrB corte el ADN aproximadamente a
4 nucleótidos en dirección 3’ del daño. Luego, corta a 7 nucleótidos en dirección 5’ del daño. Una vez que se
corta el ADN, la helicasa UvrD remueve el oligonucleótido que contiene el daño y la ADN polimerasa I
re-sintetiza la hebra que se removió, usando la hebra complementaria como templado.

Inducción de la reparación por escisión de nucleótido

Aunque los genes de este sistema casi siempre se expresan en bajos niveles, ​uvrA​, ​uvrB ​y ​uvrD ​se
expresan en niveles mucho más altos después de que el ADN fue dañado. Debido a que son genes
inducibles por el daño del ADN, los genes ​uvr ​caen dentro de la clasificación de ​genes ​din (​ por “​damage
inducible​”), los cuales incluyen ​recA​, ​umuC y​ ​umuD.​ Muchos genes ​din​, incluyendo ​uvrA​, ​uvrB ​y ​uvrD​, se
inducen porque son parte de la respuesta SOS (ver más abajo).
El daño en algunas regiones del ADN presenta un problema más inmediato para la célula que el
daño en otras regiones. Por ejemplo, los dímeros de pirimidina en regiones de transcripción del ADN no sólo
bloquean la replicación sino también la transcripción del ARN, cuando la ARN polimerasa alcanza el daño.
Esto hace que la célula repare primero el daño que ocurre en genes que se transcriben para que puedan ser
transcriptos y traducidos a proteína.
MECANISMOS DE TOLERANCIA AL DAÑO DEL ADN
En todos los sistemas de reparación que se discutieron anteriormente, la célula remueve el daño del
daño, normalmente usando la información de la hebra complementaria para recuperar la secuencia de ADN
correcta. Con mucha suerte, el daño se repara antes de que el aparato de la replicación llegue al sitio e
intente replicar sobre el daño. Las células tienen mecanismos para retrasar la replicación y prevenir que esto
ocurra. Pero… ¿Qué pasa si el daño no se repara antes de que la horquilla de replicación llegue? La célula
no tiene otra opción que tolerar el daño y continuar con la replicación. Los mecanismos que le permiten a la
célula tolerar el daño del ADN sin repararlo se denominan ​mecanismos de tolerancia al daño del ADN​.
REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN DE HORQUILLAS DE REPLICACIÓN DAÑADAS
Este tipo de reparación usa la recombinación para permitir que la horquilla de replicación sobrepase
el daño del ADN en lugar de repararlo. Después de que la horquilla de replicación se movió, el daño sigue
estando; puede ser reparado por otros sistemas o seguir siendo un problema para otras horquillas que
lleguen más tarde.
Ese daño puede involucrar cortes simple o doble hebra en el ADN o bases dañadas que no pueden
aparearse correctamente. También puede involucrar la ARN polimerasa frenada en el ADN. Cuando la
horquilla de replicación llega y se encuentra con esta situación, se frena. La recombinación le permite a las
hebras adelantada y retrasada intercambiar información para que el aparato de la replicación pueda
re-ensamblarse en otra región del ADN no dañada y continuar con la replicación.
Cuando se descubrió la recombinación en bacterias, se asumió que su único propósito era
intercambiar genes entre las bacterias y aumentar la diversidad. Ahora, se asume que el principal rol de la
recombinación es reiniciar las horquillas de replicación después que se hayan frenado. Se demostró que las
mutaciones en los genes ​rec d​ e ​E. coli ​(vía RecBCD o vía RecFOR) vuelven a las células más sensibles a
los agentes que dañan el ADN​.
Hebra retrasada dañada
La hebra retrasada es la hebra que se sintetiza en dirección contraria a la horquilla de replicación. Si
el daño se encuentra en la hebra retrasada, la horquilla de replicación podría ser capaz de pasar sobre el
daño, siempre que la ADN helicasa (DnaB), la cual rodea la hebra retrasada, pueda proceder sobre el daño.
Ya que la hebra retrasada se replica discontinuamente, lo peor que podría pasar es que quede un hueco en
oposición al daño. Este hueco puede ser movido hacia una hebra buena del ADN por la ruta RecFOR, y el
hueco puede ser rellenado, después de que la horquilla de replicación se movió.
Hebra adelantada dañada
Las consecuencias de encontrar un daño durante la síntesis de la hebra adelantada pueden ser
mucho más severas. Por ejemplo, en la Figura 11.15, la polimerasa se frena porque encuentra un dímero de
timina. La polimerasa se frena pero la helicasa continúa, separando las hebras durante una distancia corta, y
la polimerasa de la hebra retrasada continúa replicando la hebra retrasada. Esto deja a la hebra adelantada
de ADN simple hebra que contiene el daño. Las proteínas RecFOR pueden cargar el ADN simple hebra con
la proteína RecA y el filamento que se forma puede invadir la hebra retrasada de ADN doble hebra. Ahora el
dímero de timina está en oposición a una hebra retrasada buena y el hueco está en oposición a una hebra
adelantada buena, por lo que puede ser reparado (el dímero de timina) por las funciones de reparación.
 Otro modelo plantea que la horquilla de replicación puede retroceder (Figura 11.16). El modelo
comienza de manera similar al planteado anteriormente, en donde se forma ADN simple hebra cuando la
replicación de la hebra adelantada se frena en el daño.

Reparación de uniones entre hebras del ADN

Muchos compuestos químicos (mitomicina, cisplatina, EMS, etc.) pueden formar enlaces entre las hebras del
ADN, en donde dos bases en hebras opuestas del ADN se unen covalentemente. Este tipo de uniones no
pueden ser reparadas ni por el sistema de reparación por escisión ni por recombinación.
Sin embargo, a pesar de que estos enlaces no pueden ser separados ni por escisión de nucleótido ni por
recombinación por separado, se pueden reparar a través de una combinación de ambos mecanismos
(Figura 11.17). En el primer paso, la UvrABC endonucleasa hace cortes en una hebra a ambos lados del
enlace entre hebras. Esto deja un hueco en oposición al ADN dañado. En el segundo paso, el hueco se
ensancha a través de la actividad 5’-exonucleasa de la ADN polimerasa I. En el tercer paso, la reparación
por recombinación reemplaza el hueco con una hebra nueva a partir de otra molécula de ADN hija en la
célula. Ahora, el ADN dañado está confinado solo a una hebra y es opuesta a una hebra buena; por lo tanto,
puede ser reparada por la ruta de reparación por escisión de nucleótido.

RESPUESTA SOS
La primera prueba de que los sistemas de reparación se inducen debido al daño por UV vino del
trabajo de Jean Weigle al estudiar la reactivación de los fagos λ irradiados con UV. En el experimento,
Weigle irradió el fago λ y su hospedador y ensayó la sobrevida del fago por su capacidad de formar placas
cuando se plaquea sobre ​E. coli.​ Observó que sobrevivían más fagos irradiados cuando se plaqueaban
sobre células de ​E. coli ​que habían sido irradiadas que cuando se plaqueaban sobre células de ​E. coli q
​ ue
no habían sido irradiadas. Ya que los fagos recuperaron su viabilidad, o se reactivaron, este fenómeno se
denominó ​W-reactivación​. Aparentemente, esto ocurrió porque un sistema de reparación se indujo en las
células irradiadas y pudo reparar también el daño en el ADN del fago λ cuando este ADN entró en la célula.
La respuesta SOS
Muchos genes ​din ​son regulados por la ​respuesta SOS​, llamada de esta
manera porque este mecanismo rescata a las células que sufrieron un daño
severo en el ADN. Los genes involucrados en este mecanismo se denominan
genes SOS​.
La Figura 11.18 muestra cómo se inducen los genes SOS. Los genes
SOS normalmente están reprimidos por una proteína denominada ​LexA ​que
actúa como un represor. Este represor se une a secuencias llamadas ​cajas
SOS ​que se encuentran corriente arriba de los genes SOS y previene su
transcripción. El represor permanece unido a estas cajas hasta que el ADN sea
dañado extensivamente por radiación UV u otros agentes que dañan el ADN.
Esto produce que LexA se autoclive y por lo tanto se inactiva. De esta manera
comienza la transcripción de los genes SOS.
La razón por la cual el represor LexA no se une más al ADN después de
que se autoclivó se conoce muy bien. Cada polipéptido LexA tiene dos
dominios separables. Uno, el ​dominio de dimerización​, se une a otro
polipéptido de LexA para formar un dímero, y el otro, el ​dominio de unión al
ADN​, se une a las regiones operadoras del ADN corriente arriba de los
genes SOS (en las cajas SOS) y bloquea la transcripción de estos genes. La
proteína LexA se une al ADN sólo si está en su forma de dímero. El
autoclivaje produce que se separen los dos dominios del polipéptido y LexA
se inactiva.
Pero… ¿Por qué el represor LexA se autocliva sólo después dañarse
el ADN? Después de dañarse el ADN, aparece ADN simple hebra en la
célula, probablemente debido al bloqueo de la horquilla de replicación en el
ADN dañado. Este ADN simple hebra se une a la ​proteína RecA ​para
formar los filamentos del núcleo-proteína de RecA, que luego se unen a
LexA y producen su autoclivaje. Esta característica del modelo (que LexA
se autoclive en respuesta a la unión de RecA en lugar de que RecA clive a
LexA) es apoyada por evidencia experimental. Cuando calentamos bajo
ciertas circunstancias, aun en ausencia de RecA, LexA se autocliva. Este resultado indica que RecA actúa
como ​coproteasa ​para facilitar el autoclivaje de LexA.

La regulación de la respuesta SOS a través del clivaje del represor LexA es similar a la inducción del
fago λ a través del autoclivaje del represor CI. El autoclivaje del represor λ, estimulado por los filamentos de
núcleo-proteínas de RecA, también separa el dominio de dimerización del dominio de unión al ADN,
evitando que la unión del represor λ las regiones operadores y permitir la transcripción de los genes líticos
de λ.
Genética de la mutagénesis SOS inducible
Muchos tipos de daños del ADN, incluyendo la radiación UV, son mutagénicos e incrementan el
número de mutaciones en la célula. Esto implica el uso de uno o más mecanismos de reparación. Cierta
evidencia propone que al menos uno de los sistemas de reparación codificado por los genes SOS, la
síntesis translesión ​(​TLS​), permite que la horquilla de replicación avance sobre el ADN dañado para que la
molécula de ADN pueda ser replicada y la célula pueda sobrevivir.
Existen evidencias de que este mecanismo propenso a errores para la reparación del daño por UV es
inducible en ​E. coli.​ Además de medir la sobrevida de fagos λ irradiados con UV plaqueados sobre ​E. coli
irradiados con UV, Weigle contó el número de mutantes placas claras entre los fagos que sobrevivieron.
(Recordar que los lisógenos se forman en el centro de las placas de un fago λ WT, haciendo que las placas
sean turbias, pero las mutantes que no pueden lisogenizar forman placas claras). Observaron que había
más mutantes de placas claras entre los fagos que sobrevivieron si las bacterias habían sido irradiadas con
UV antes de ser infectadas que si no habían sido irradiadas con UV. Por lo tanto, el incremento en la
mutagénesis se debía a la inducción de un sistema de reparación mutagénico después del daño del ADN. La
mutagénesis inducible se denominó ​W-mutagénesis​. (Tabla 11.1). Estudios más tarde demostraron que la
mutagénesis inducible resulta de la inducción de uno o más genes SOS; esto no ocurre sin RecA y sin el
clivaje del represor LexA.

Determinación de qué ruta de reparación es mutagénica

Aunque los experimentos de Weigle mostraron que uno de los sistemas de reparación por daño UV
​ s propenso a error y produce mutaciones, no indicador cuál era el sistema. Para
inducible en ​E. coli e
detectar mutaciones inducidas por UV, los investigadores usaron la reversión de la mutación ​his.​ Su enfoque
fue construir dobles mutantes tanto con una mutación en ​his c​ omo en uno o más de los genes de cada una
de las rutas de reparación. Luego, las mutantes deficientes en la reparación se irradiaron con luz UV y se
plaquearon en un medio sin histidina, por lo que sólo las revertantes His​+ ​podían formar colonias. Bajo estas
condiciones, cada reversión a ​his​+ ​resulta en sólo una colonia, por lo que es posible medir directamente el
número de reversiones ​his​+ ​que ocurrieron. Este número, dividido por el total de bacterias que sobrevivieron,
da una estimación de la susceptibilidad de las células a la mutagénesis debido a luz UV.
Los resultados de estos experimentos condujeron a la conclusión de que la reparación por
recombinación de las horquillas de replicación frenadas no parece ser propensa a error. Mientras que las
mutaciones en ​recB ​y ​recF ​redujeron la sobrevida de células expuestas a luz UV, el número de reversiones
his​+ ​por célula que sobrevivió no fue diferente de aquel en donde las células no tenían las mutaciones en los
genes ​rec.​ Entonces, la reparación por escisión de nucleótido no parece ser propensa a error. La adición de
una mutación ​uvrB ​a las mutaciones ​recB ​y ​recF ​volvió a las células aún más susceptibles a la luz UV pero
no redujo el número de reversiones ​his+​ ​por célula sobreviviente.
​ ostraron prevenir la mutagénesis por UV (Tabla 11.1) Aunque
Sin embargo, las mutaciones en ​recA m
estas mutaciones vuelven a las células extremadamente sensibles a la luz UV, las pocas sobrevivientes no
contienen mutaciones adicionales. Ahora sabemos que dos genes, ​umuC y​ ​umuD​, deben ser inducidos
para la reparación mutagénica y que las mutaciones en ​recA p ​ revienen su inducción. Por lo tanto, las
proteínas UmuC y UmuD, en lugar de reparar el daño producen los errores ellas mismas.
 ​ ​umuD
Aislamiento de mutantes ​umuC y
Una vez que se estableció que en su mayoría la mutagénesis después de la irradiación UV se puede
atribuir a los productos de los genes SOS inducibles, el siguiente paso fue determinar cuáles eran esos
genes. Es importante notar que los productos de estos genes trabajan de manera opuesta a la mayoría de
los genes de las rutas de reparación:
1. Las mutaciones que inactivan un gen ​mut ​u otro gen de una ruta de reparación aumenta la tasa de
mutaciones espontáneas porque normalmente los productos de estos genes reparan el daño antes
que produzca errores en la replicación.
2. Las mutaciones que inactivan un gen de una ruta de reparación mutagénica o una ruta de reparación
propensa a error, tienen un efecto opuesto: disminuyen la tasa de algunas mutaciones. Ya que la ruta
de reparación es mutagénica en sí, las mutaciones deberían ser menos frecuentes si esta ruta no
existe.
Las mutaciones que reducen la frecuencia de mutantes después de la irradiación UV cayeron dentro
de dos genes, llamados ​umuC ​y ​umuD (​ por “mutaciones C y D inducidas por UV”). Las primeras mutantes
en estos genes se aislaron con el mismo método: reversión de una mutación ​his q ​ ue hace que las células
requieran histidina para poder medir tasas de mutaciones. La estrategia básica fue tratar la mutante ​his ​con
un mutágeno que induce daño en el ADN similar al que produce la radiación UV e identificar bacterias
mutantes que sean revertantes ​his​+​. Estas mutantes tendrán una segunda mutación que inactivó la ruta de
reparación mutagénica y redujo la tasa de reversión de la mutación ​his.​
​ e ​E. coli ​se mutagenizó,
La Figura 11.19 muestra la selección en mayor detalle. La mutante en ​his d
por lo que algunas de las bacterias tendrán mutaciones en los genes de reparación mutagénicos. Las
colonias se replicaron en una placa que contenía histidina. Luego, cada colonia formada en esta placa se
replicó en otra placa que tenia 4NQO (produce daño en el ADN similar al que produce la radiación UV) e
histidina. Luego de incubar esta placa (Placa 2), se replicaron las colonias en una tercera placa (Placa 3)
que no contenía histidina. La mayoría de las colonias que tenían regiones con revertantes His​+​, indicando
que fueron mutagenizadas por 4NQO.
El siguiente paso fue mapear las mutaciones en algunas de las
mutantes. Algunas de las mutaciones mapeadas que prevenían la
mutagénesis por radiación UV fueron mutaciones en ​recA ​o ​lexA​. Las
mutaciones en ​recA ​probablemente inactivan la actividad coproteasa de
la proteína RecA, evitando que provoque el autoclivaje del represor LexA
y por lo tanto prevenir la inducción de los genes SOS. Las mutaciones en
lexA ​probablemente cambian el represor por lo que no puede clivarse,
seguramente porque fue alterado algún aminoácido cercano al sitio de
clivaje. Este tipo de mutación ​lexA ​se denominó mutación Ind​- ​(​lexA
(Ind​-​)).
Algunas de las mutaciones que prevenían la mutagénesis por UV
se mapearon en un locus distinto de donde estaban ​recA y​ ​lexA​. Los
ensayos de complementación entre mutaciones en estos locus revelaron
dos genes que se denominaron ​umuC ​y ​umuD​. Experimentos más tarde
mostraron que estos genes son parte de un operón (​umuDC)​ y que por lo
tanto se transcriben ambos genes en un único ARNm y que además
umuD ​se transcribe primero. Los experimentos con fusiones ​lacZ
demostraron que el operón ​umuDC s​ e induce por luz UV y es un operón
SOS porque está bajo el control de LexA.
​
Experimentos que muestran que sólo los genes ​umuC y
​ eben ser inducidos para la mutagénesis SOS
umuD d
El hecho de que ​umuC ​y ​umuD ​son inducibles por el daño del
ADN y se requieren para la mutagénesis SOS no significa que eran los
únicos genes requeridos para esta vía. En los experimentos que
realizaron para poder determinar esto usaron mutantes ​lexA (​ Ind​-​) que,
como mencionamos, deberían permanentemente reprimir todos los genes SOS. También mutaron el sitio
operador del operón ​umuDC ​para que estos genes se expresen constitutivamente y no estén más bajo el
control del represor LexA. Bajo estas condiciones, los únicos productos de los genes SOS que deberían
estar presentes son los de los genes ​umuD ​y ​umuC​, ya que todos los otros están reprimidos por el represor
LexA (Ind​-​). Además, se usó una forma más corta del gen ​umuD​. Este gen alterado sintetiza sólo el carboxilo
terminal de la proteína UmuD (fragmento UmuD’) que es la forma activa para la mutagénesis SOS (ver a
continuación).
Los experimentos mostraron que la radiación UV es mutagénica si UmuC y UmuD’ se expresan
constitutivamente, aún si las células son mutantes ​lexA ​(Ind​-​), indicando que los genes ​umuC ​y ​umuD s​ on
los únicos genes que necesitan ser inducidos por la radiación UV para la mutagénesis SOS. Sin embargo,
este resultado no elimina en su totalidad la posibilidad de que otros genes SOS estén involucrados. Como
discutiremos a continuación, la proteína RecA se requiere para la mutagénesis por UV. Las proteínas GroEL
y GroES también son requeridas para la mutagénesis por UV probablemente porque ayudan a plegar las
proteínas de la reparación mutagénica, pero los genes ​groEL ​y ​groES n ​ o están bajo el control del represor
LexA.
Experimentos que muestran que RecA tiene un rol en la mutagénesis por UV además de su rol
como coproteasa
Experimentos similares mostraron que RecA se requiere en la mutagénesis por UV además de su rol
como coproteasa en el autoclivaje de LexA y UmuD (a UmuD’) (ver a continuación). Las mutantes que
expresan UmuC y UmuD’ constitutivamente podrían responder esta cuestión. Si sólo se requiere la actividad
coproteasa de RecA en el TLS, las mutaciones en ​recA n ​ o deberían afectar la mutagénesis por UV. Sin
embargo, se encontró que las mutaciones ​recA ​previenen la mutagénesis por UV. Esto inspiró el modelo de
que la polimerasa mutagénica UmuD’​2​C sólo puede replicar sobre el ADN que estaba en un filamento de
núcleo-proteína de RecA (ver a continuación y Figura 11.21).
MECANISMO DE INDUCCIÓN DE LA MUTAGÉNESIS SOS
Como vimos, las proteínas UmuC y UmuD promueven la mutagénesis y le permiten a ​E. coli t​ olerar
el daño en su ADN. La proteína UmuC es una ADN polimerasa que, en contraste con la ADN polimerasa
normal, puede replicar sobre algunos tipos de daño del ADN, incluyendo los dímeros de timina y los dímeros
6-4 citosina-timina provocados por radiación UV. También puede replicar sobre sitios en donde la/s base/s
han sido removidas por una glicosilasa (ver a continuación); por lo tanto, no requiere un apareamiento
correcto de bases antes de moverse. Es por eso que recibe el nombre de ​ADN polimerasa V ​y es capaz de
replicar sobre el ADN dañado o lesiones. Esto responde la pregunta de por qué UmuC es tan mutagénica:
ya que los dímeros de timina y otros tipos de bases dañadas no se aparean apropiadamente, la ADN
polimerasa V debe incorporar bases al azar en oposición a las bases dañadas, provocando mutaciones.
La Figura 11.20 muestra por qué la mutagénesis SOS ocurre sólo después de un daño muy extenso del
ADN. Después de que el ADN ha sido muy dañado y el represor LexA se autoclivó y el operón ​umuDC ​se
indujo, junto con los otros genes SOS, las proteínas UmuC y UmuD se juntan para formar un complejo
heterotrimérico con dos copias de la proteína UmuD y una copia de la proteína UmuC (UmuD​2​C).
Al mismo tiempo, se acumulan filamentos de núcleo-proteínas de RecA unidos a ADN simple hebra y
producen el clivaje de UmuD (para formar UmuD’). Una vez que se formó UmuD’, la proteína UmuC en el
complejo UmuD’​2​C es activa como una ADN polimerasa translesión y replica por sobre el daño en el ADN.
Esto permite que la replicación avance por sobre el daño y que la célula sobreviva, pero con el precio de que
se aumente la frecuencia de mutaciones entre las células sobrevivientes.
El complejo UmuD​2​C que contiene la proteína UmuD no clivada, también cumple un rol antes de que UmuD
sea clivada. La superproducción de estas proteínas inhibe la replicación a bajas temperaturas, aun en
ausencia de ADN dañado. Esto ha sido interpretado como que las proteínas UmuC y UmuD podrían inhibir
la replicación después de que se induzcan, creando un punto de chequeo (​checkpoint)​ y darle más tiempo a
los otros sistemas de reparación para que funcionen antes de que la replicación continúe.

MECANISMO DE SÍNTESIS TRANSLESIÓN A TRAVES DEL COMPLEJO UmuD’​2​C

 Rol de la reparación mutagénica
Durante toda la explicación de la respuesta SOS asumimos que este mecanismo de reparación
mutagénico era el último intento de la célula para poder sobrevivir a un daño en el ADN muy importante. Sin
embargo, la función real de este mecanismo sigue siendo un misterio. Si esta explicación fuese correcta, las
mutantes en ​umuC ​y ​umuD ​que carecen de la reparación mutagénica deberían ser mucho más sensibles
que las bacterias WT frente a los agentes que dañan extensivamente el ADN. Sin embargo, las mutaciones
que inactivan estos genes vuelven a ​E. coli s​ ólo ligeramente más sensibles a ser eliminadas por radiación
UV y otros agentes que dañan el ADN.
Una manera de explicar esto es que
UmuC y UmuD protegen contra tipos de
agentes que dañan el ADN distintos de
los que se probaron. Otra posibilidad es
que UmuC y UmuD ofrecen mayor
protección contra el daño del ADN bajo
condiciones distintas de las que existen
en el laboratorio.
RESUMEN DE LAS RUTAS DE
REPARACIÓN EN ​E. coli
La Tabla 11.2 muestra las rutas de
reparación que se discutieron y algunos
de los genes que participan en cada ruta.