MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL DNA

¿Qué tiene que ver el ADN con el cáncer? El cáncer se produce cuando las células se
dividen de forma descontrolada, ignorando las señales normales de "alto" hasta producir
un tumor. Este mal comportamiento es causado por mutaciones acumuladas, cambios
permanentes en la secuencia del ADN de las células.
Todo el tiempo ocurren errores de replicación y daños al ADN en las células de nuestro
cuerpo. Sin embargo, en la mayoría de los casos no causan cáncer, ni siquiera
mutaciones. Eso es porque suelen detectarse y repararse por mecanismos de corrección
y reparación del ADN. Si por el contrario, el daño no se puede reparar, la célula
experimentará muerte celular programada (apoptosis) para evitar heredar el ADN
defectuoso.
Las mutaciones ocurren y se heredan a células hijas solo cuando estos mecanismos
fallan. A su vez, el cáncer solo se desarrolla al acumularse multiples mutaciones en genes
relacionados con la división en una misma célula.
mecanismos que utilizan las células para corregir los errores de la replicación y reparar
daños al ADN, como:
 La revisión, que corrige errores durante la replicación del ADN.
 La reparación de mal apareamiento, que arregla bases mal emparejadas justo
después de la replicación del ADN.
 Las vías de reparación de daño al ADN, que detectan y corrigen daños durante
todo el ciclo celular.
REVISIÓN
Las ADN polimerasas son las enzimas que forman el ADN en las células. Durante la
replicación (copiado) del ADN, la mayoría de las ADN polimerasas pueden "revisar su
trabajo" con cada base que añaden. Este proceso se llama revisión. Si la polimerasa
detecta que ha agregado un nucleótido equivocado (apareado incorrectamente), lo quita y
reemplaza enseguida, antes de continuar con la síntesis de ADN.

REPARACIÓN DE MAL APAREAMIENTO

Muchos errores se corrigen con la revisión, pero algunos se escapan. La reparación de
mal apareamiento sucede justo después de que se ha hecho ADN nuevo, y su función es
eliminar y reemplazar las bases mal apareadas (las que no se arreglaron durante la
revisión). La reparación de mal apareamiento también puede detectar y corregir pequeñas
inserciones y deleciones que suceden cuando las polimerasas "se resbalan" y pierden su
lugar sobre el molde.
¿Cómo funciona la reparación de mal apareamiento? Primero, un complejo proteico
(grupo de proteínas) reconoce y se une a la base mal apareada. Un segundo complejo
corta el ADN cerca de la pareja errónea y otras enzimas cortan el nucleótido incorrecto
junto con un segmento de ADN circundante. Luego, una ADN polimerasa reemplaza la
sección faltante con los nucleótidos correctos y una enzima llamada ADN ligasa sella el
espacio.

Quizás te preguntes cómo es que las proteínas que participan en la reparación del ADN
saben "qué está bien" durante la reparación de mal apareamiento. Es decir, cuando dos
bases están mal apareadas (como G y T en el dibujo anterior), cuál de las dos se debe
eliminar y reemplazar?
En bacterias, las cadenas de ADN originales y recién hechas se pueden diferenciar por
una característica llamada estado de metilación. Una cadena de ADN antigua tiene
grupos metilo (-CH3) en algunas de sus bases, mientras que una cadena de ADN recién
hecha todavía no habrá recibido su grupo metilo.
En eucariontes, los procesos que permiten identificar la cadena original en la reparación
de mal apareamiento usan el reconocimiento de mellas (rupturas en las cadenas
sencillas) presentes solo en el ADN recién sintetizado.
MECANISMOS DE REPARACIÓN DE DAÑOS AL ADN
En casi cualquier punto en la vida de una célula le pueden ocurrir cosas malas al ADN, no
solo durante la replicación. De hecho, tu ADN se daña todo el tiempo por factores
externos como la luz UV, productos químicos y los rayos X, ¡sin mencionar las reacciones
químicas espontáneas que suceden incluso sin ofensas ambientales.
Afortunadamente, tus células tienen mecanismos de reparación para detectar y corregir
muchos tipos de daño al ADN. Los procesos de reparación que ayudan a arreglar el ADN
dañado incluyen:
Reversión directa: algunas reacciones químicas que dañan el ADN pueden ser
"deshechas" directamente por enzimas de la célula.
Reparación por escisión: el daño a una o unas cuantas bases de ADN se suele arreglar al
eliminar (escindir) y reemplazar la región dañada. En la reparación por escisión de bases,
solo se quita la base dañada. En la reparación por escisión de nucleótidos, como en la
reparación de mal apareamiento que vimos antes, se elimina una sección de nucleótidos.
Reparación de ruptura de la doble cadena: se utilizan dos vías principales, la unión de
extremos no homólogos y la recombinación homóloga, para reparar rupturas en la doble
cadena del ADN (es decir, cuando un cromosoma entero se divide en dos pedazos).
REVERSIÓN DEL DAÑO
En algunos casos, una célula puede reparar daños en el ADN al simplemente revertir la
reacción química que los causó. Para entender esto, necesitamos darnos cuenta que el
"daño al ADN" suele implicar solo un grupo extra de átomos que se unen al ADN
mediante una reacción química.
Por ejemplo, la guanina (G) puede sufrir una reacción que añade un grupo metilo (CH3) a
un átomo de oxígeno de la base. Si no se corrige, la guanina que contiene metilo formará
pareja con timina (T) en lugar de citosina (C) durante la replicación del ADN.
Afortunadamente, los seres humanos y muchos otros organismos tienen una enzima que
puede quitar el grupo metilo, y revertir la reacción para regresar la base a su estado
normal.

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASE

La reparación por escisión de base es un mecanismo que se usa para detectar y eliminar
ciertos tipos de bases dañadas. Un grupo de enzimas llamadas glicosilasas tiene un papel
clave en la reparación por escisión de bases. Cada glicosilasa detecta y elimina un tipo
específico de base dañada.
Por ejemplo, una reacción química llamada desaminación puede convertir una base
citosina en uracilo, una base que suele encontrarse solo en el ARN. Durante la replicación
del ADN, el uracilo formará pareja con adenina en lugar de guanina (como lo haría si la
base todavía fuera citosina), por lo que un intercambio de citosina por uracilo sin corregir
puede causar una mutación.
Para evitar tales mutaciones, una glicosilasa de la vía de reparación por escisión de base
detecta y elimina específicamente citosinas desaminadas. Una vez que se elimina la
base, también se elimina la pieza "vacía" del esqueleto de ADN y otras enzimas llenan y
sellan la brecha.

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS

La reparación por escisión de nucleótidos es otra vía que se usa para eliminar y
reemplazar bases dañadas. La reparación por escisión de nucleótidos detecta y corrige
tipos de daño que distorsionan la doble hélice del ADN. Por ejemplo, esta vía detecta
bases que han sido modificadas con grupos químicos voluminosos, como los que se unen
a tu ADN cuando se expone a las sustancias químicas del humo de cigarrillos.
La reparación por escisión de nucleótidos también se utiliza para reparar algún tipo de
daño que causa la radiación UV, como cuando te quemas con el sol. La radiación UV
puede causar que la citosina y la timina reaccionen con bases vecinas que también sean
C y T, y se forman enlaces que distorsionan la doble hélice y causan errores en la
replicación del ADN. El tipo más común de unión, el dímero de timina, se compone de dos
bases de timina que reaccionan entre sí y se unen químicamente.
En la reparación por escisión de nucleótidos se elimina el nucleótido (o nucleótidos) con
daño junto con un segmento circundante de ADN. En este proceso una helicasa (enzima
que abre el ADN) abre el ADN para formar una burbuja y enzimas que cortan el ADN
quitan el segmento dañado de la burbuja. Una ADN polimerasa reemplaza el ADN que
falta y una ADN ligasa sella la brecha en el esqueleto de la cadena.
REPARACIÓN DE ROTURA DE LA DOBLE CADENA
Algunos factores ambientales, como la radiación de alta energía, pueden causar roturas
en la doble cadena del ADN (rompen un cromosoma en dos). Este es el tipo de daño al
ADN que se relaciona con las historias del origen de los superhéroes en los cómics y con
desastres como Chernobyl en la vida real.
Las roturas de la doble cadena son peligrosas porque pueden perderse grandes
segmentos de cromosomas y los cientos de genes que contienen si la fragmentación no
se repara. Dos vías que participan en la reparación de rotura del ADN de doble cadena
son la vía de unión de extremos no homólogos y la de recombinación homóloga.
En la unión de extremos no homólogos, los dos extremos rotos de un cromosoma
simplemente se vuelven a pegar. Este mecanismo de reparación es "desordenado" y por
lo general resulta en la pérdida, o a veces adición, de unos cuantos nucleótidos en el sitio
de corte. Por lo tanto, la unión de extremos no homólogos tiende a producir una mutación,
pero eso es mejor que la alternativa (la pérdida de un brazo entero del cromosoma).

En la recombinación homóloga, se utiliza la información del cromosoma homólogo que

coincide con la del dañado (o de una cromátida hermana si el ADN se ha copiado) para
reparar la fragmentación. En este proceso se acercan los dos cromosomas homólogos y
se utiliza la región sin daños del homólogo o la cromátida como molde para sustituir la
región dañada del cromosoma roto. La recombinación homóloga es "más limpia" que la
unión de extremos no homólogos y no suele causar mutaciones.
REVISIÓN DEL ADN Y REPARACIÓN EN ENFERMEDADES HUMANAS
La evidencia de la importancia de los mecanismos de corrección y reparación proviene de
trastornos genéticos humanos. En muchos casos, las mutaciones en genes que codifican
las proteínas de revisión y reparación se asocian a tipos de cáncer hereditarios (cáncer
que viene de familia). Por ejemplo:
 El cáncer colorrectal hereditario no polipósico (también llamado síndrome de Lynch)
es causado por mutaciones en genes que codifican ciertas proteínas que reparan el
mal apareamiento. Ya que las bases emparejadas erróneamente no se reparan en las
células de las personas con este síndrome, las mutaciones se acumulan con mucha
mayor velocidad que en las células de una persona no afectada. Esto puede conducir
al desarrollo de tumores en el colon.
 Las personas con xerodermia pigmentosa son extremadamente sensibles a la luz UV.
Este padecimiento lo causan mutaciones que afectan la vía de reparación por escisión
de nucleótidos. Cuando la vía no funciona, los dímeros de timina y otras formas de
daño por luz UV no pueden repararse. Las personas con xerodermia pigmentosa
desarrollan quemaduras graves con solo unos pocos minutos en el sol y cerca de la
mitad desarrollará cáncer de piel a la edad de 101010 años a menos que eviten el sol.

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y LA ADN LIGASA

 Las enzimas de restricción son enzimas que cortan ADN. Cada enzima reconoce
una o un número pequeño de secuencias blanco y corta el ADN en o cerca de
esas secuencias.
 Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados que producen extremos
sobresalientes de ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos producen
extremos romos.
 La ADN ligasa es una enzima que une ADN. Si dos fragmentos de ADN tienen
extremos complementarios, la ligasa puede unirlos para formar una molécula única
e intacta de ADN.
 En la clonación de ADN, se utilizan enzimas de restricción y ADN ligasa para
insertar genes y otros fragmentos de ADN en plásmidos.
¿CÓMO SE CORTA Y PEGA EL ADN?
En la clonación de ADN de ADN, los investigadores hacen muchas copias de un
fragmento de ADN específico, como un gen. En muchos casos, la clonación consiste en
introducir el gen en un fragmento de ADN circular llamado plásmido que puede copiarse
en bacterias.
¿Cómo se pueden unir fragmentos de ADN de diferentes fuentes (como un gen humano y
un plásmido bacteriano) para hacer una sola molécula de ADN? Un método común utiliza
enzimas de restricción y ADN ligasa.
Una enzima de restricción es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios específicos
en él. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en o cerca de su sitio de
reconocimiento y producen extremos sobresalientes de cadena sencilla.
Si dos moléculas de ADN tienen extremos complementarios, la enzima ADN ligasa puede
unirlos. La ADN ligasa sella el espacio entre las moléculas para formar un solo fragmento
de ADN.
Las enzimas de restricción y la ADN ligasa se suelen usar para insertar genes y otros
fragmentos de ADN en plásmidos durante la clonación de ADN.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen
secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada
enzima de restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando
encuentra su secuencia blanco, la enzima de restricción cortará las dos cadenas de una
molécula de ADN. Por lo general, el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en
un patrón ordenado y predecible. [¿Por qué las bacterias tienen enzimas de restricción?]
Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia
de ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio.
EcoRI corta en el siguiente sitio:

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico
que produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:

Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque

también se cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por
complementariedad de bases. Por esta razón se dice que las enzimas que dejan
extremos de cadena sencilla producen extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son
útiles en la clonación porque mantienen dos fragmentos de ADN juntos para que la ADN
ligasa los pueda unir.
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen
"extremos romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de
cadena sencilla. La enzima de restricción SmaI es un ejemplo de enzima que corta así:

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar
fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle)
porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las
moléculas de ADN en su posición.
LA ADN LIGASA
Si ya conoces la replicación del ADN, tal vez ya te hayas encontrado con la ADN ligasa.
En la replicación del ADN, el trabajo de la ADN ligasa es unir fragmentos de ADN recién
sintetizados para formar una cadena continua. Las ligasas utilizadas en la clonación de
ADN hacen básicamente lo mismo. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos
complementarios, la ADN ligasa puede unirlos para formar una molécula sin
interrupciones.

¿Cómo logra esto la ADN ligasa? Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la
ligasa cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de
ADN se une al grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción produce un
esqueleto de azúcar-fosfato intacto.
EJEMPLO: CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO RECOMBINANTE
Vamos a ver cómo la digestión con enzimas de restricción y la ligación pueden utilizarse
para insertar un gen en un plásmido. Supongamos que tenemos un gen blanco,
flanqueado por los sitios que reconoce EcoRI, y un plásmido que contiene un solo sitio de
EcoRI:
Nuestro objetivo es utilizar la enzima EcoRI para insertar el gen en el plásmido. Primero,
digerimos (cortamos) por separado con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este
paso produce fragmentos con extremos cohesivos:

A continuación, tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los

combinamos con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por
apareamiento complementario de bases:

Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN
sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y tenemos un
plásmido recombinante.

EN LA DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y LA LIGACIÓN PARTICIPAN

MUCHAS MOLÉCULAS DE ADN
En el ejemplo anterior, vimos un resultado de la ligación entre un gen y un plásmido con
EcoRI. Sin embargo, en esta misma reacción de ligación podrían ocurrir otros resultados.
Por ejemplo, el plásmido cortado podría recircularizarse (cerrarse en su estado original)
sin incorporar el gen. Asimismo, el gen podría entrar al plásmido, pero en dirección
contraria (puesto que sus dos extremos cohesivos de EcoRI son idénticos).

La digestión con enzimas de restricción y la ligación como esta se realiza con muchas
copias de ADN del plásmido y del gen. De hecho, en una sola ligación se utilizan ¡miles
de millones de moléculas de ADN! Todas estas moléculas están chocando entre sí y con
la ADN ligasa al azar y de diferentes maneras. Por lo tanto, si es posible formar varios
productos, todos se producirán con cierta frecuencia, incluyendo los que no queremos.
¿Cómo podemos evitar plásmidos "malos"? Cuando transformamos bacterias con el ADN
de una ligación, cada una toma un fragmento diferente de ADN. Después de la
transformación, podemos revisar las bacterias y usar solo aquellas que tengan el
plásmido correcto. En muchos casos, el plásmido de las bacterias transformadas se
analiza mediante otra digestión con enzimas de restricción para ver si contienen el inserto
correcto en la orientación correcta.