Cromatografía en Fase Reversa

CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA
Esta técnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un
carácter predominantemente alifático o aromático. En la RPC, los ligandos alquilo o
aromáticos se unen covalentemente a la fase estacionaria para proporcionar una
superficie hidrófoba. La fase móvil que pasa sobre la fase estacionaria hidrófoba
es un disolvente polar que contiene solutos.
En este escenario, los solutos hidrófobos en la fase móvil tienden a unirse a la
fase estacionaria a través de interacciones hidrófobas y, por lo tanto, forman la
base de la separación
La fase estacionaria para cromatografía de fase reversa consiste en una matriz porosa e
insoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos. Los soportes
para casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras
DISOLVENTES DE FASE REVERSA

El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye
con la introducción de disolventes más hidrofóbicos.
Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede
contener tampones, sales o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la
separación de los compuestos.
Disolventes:
Características de la fase estacionaria- fase móvil y del Analito

La fase estacionaria
La fase estacionaria para cromatografía de fase reversa consiste en una matriz porosa e
insoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos. Los soportes
para casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras.
La superficie de la sílica está constituida por grupos silanol (SiOH) químicamente
reactivos que abarcan una superficie cercana a los 8 μmol/m 2 .
La sílica presenta las ventajas de resistir la aplicación de altas presiones sin contraerse, y
de no expandirse al contacto con los solventes. Pero tiene la desventaja de ser
químicamente inestable; a un pH menor de 3 los ligandos unidos a la sílica pueden ser
removidos y a un pH mayor de 7.5, la sílica se solubiliza.
Puede considerarse que la RPC es un proceso de partición en donde los solutos están
distribuidos entre una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los solutos no
polares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema
más lentamente que los solutos polares. El mecanismo que se ha propuesto para
explicar el mecanismo por el cual estas superficies retienen a los solutos es el siguiente.
Cuando un soluto se disuelve en agua, las fuerzas de atracción entre las moléculas de
agua se distorsionan o se rompen. Únicamente los solutos altamente polares o iónicos
pueden interaccionar con la estructura del agua. Los solutos no polares casi no
interactúan con estas estructuras y como consecuencia “abandonan” la fase móvil para
adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la retención no es
la interacción favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de repulsión del
disolvente por el soluto.
La fase móvil
La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo
un disolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase
móvil, la distribución de los solutos se cambia hacia la fase móvil.
La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la concentración del
ligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a ser
adsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar sea
la fase móvil, menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria. Respecto a
las características químicas del ligando, es difícil predecir qué tipo de cadena
hidrocarbonada será mejor para determinada aplicación. En principio, entre menos polar
sea la molécula que se va a purificar, se requerirá una fase estacionaria más hidrofóbica.
Sin embargo, si la muestra resulta ser muy afín a la matriz, la elución se dificultaría. Así
que debe hacerse un análisis cuidadoso de la molécula de interés y determinar la
naturaleza química de los contaminantes asociados.
La porosidad de las partículas de la fase estacionaria también es un factor importante que
influye en la capacidad de unión. Los poros grandes facilitan la interacción del soluto con
el ligando. Cuando se requiera una capacidad de unión máxima, deberá escogerse una
matriz que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las
moléculas de interés.

Mas info de características:
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención.
En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención
mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes
pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El
tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente
proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más
rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden
afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un
aumento lineal en la tensión superficial, y como la entropía de la interfase compuesto-
disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a
aumentar el tiempo de retención.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto.
Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para
controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o
cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como
contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la
cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de
silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica
modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso
puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden
utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al
ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.
Cuales son las fases estacionarias y ejercicios de cómo optimizamos la separación

para este tipo de cromatografía (falta)
Fases estacionarias
información (se podrá usar?)
https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-
40422010000700024&script=sci_arttext&tlng=pt
fase estacionaria no polar como hidrocarburos de cadena larga unidos a un soporte de sílice o
híbrido. En los últimos años, se ha destinado una gran cantidad de trabajo en los campos de la
investigación y el desarrollo al área de las fases estacionarias con el fin de mejorar la eficacia de
las columnas y la estabilidad frente al pH y de proporcionar selectividades alternativas.
Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada
con RMe SiCl, donde la R es una cadena alquil tal como C H o C H . El tiempo de retención
2 18 37 8 17
es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter
polar eluyen más rápidamente.
En los últimos años se ha dedicado gran esfuerzo al desarrollo de nuevas fases estacionarias
para fase reversa con el fin de mejorar la eficacia de las columnas y su estabilidad frente al
pH, así como proporcionar selectividades distintas. Las columnas de fase reversa actualmente
en el mercado se pueden clasificar en tres categorías:
– Basadas en sílice, que pueden funcionar en un intervalo de pH 2,0-7,0. En este capítulo,
existen sílices de distinto grado de pureza, con o sin tratamiento de end-capping, y libres de
metales en mayor o menor medida.
– Híbridas, formadas por una combinación de polímero (estireno-divinilbenceno) y sílice.
Presentan un rango de pH más amplio (1,0-12,0).
– Específicas de la aplicación. Por ejemplo, para la separación de mezclas complejas en las
que están presentes compuestos muy polares y apolares, se han desarrollado columnas
(Synergi®, Atlantis®) en las que la sílice, además de cadenas hidrocarbonadas, incorpora
grupos polares, lo que provoca una mayor retención de moléculas polares y por tanto una
mejor separación de estas últimas.

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