Cromatografía Líquida de Alta Eficacia PDF
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Principio
HPLC Cromatografa lquida de alta resolucin' En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos. Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.
Cromatografa lquida de alta eficacia La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.
Cromatografa lquida de alta eficacia en la doble hlice de ADN. Dichas estructuras son los denominados heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos heterodplex migran de forma diferente a los homodplex en la columna de cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen en un gel de agarosa o acrilamida). La separacin se realiza en condiciones desnaturalizantes variables, detectndose las molculas de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm. Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico. A medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodplex migran por delante de los homodplex, apareciendo los picos correspondientes a heterodplex antes en el grfico resultante, el cromatograma. De esta manera, como los heterodplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homodplex, ambas molculas dan lugar a picos de elucin distintos. Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una PCR para la amplificacin del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb. Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base, inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida (aproximadamente 16 minutos).[1]
Parmetros
Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.
Tamao de poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.
Cromatografa lquida de alta eficacia Corporation aunque a veces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).
Enlaces externos
Silica hielos for liquid chromatography [25] HPLC Find [26] LC Resources ChromFAQ [27] Chromatography Forum [28] marketoverview//search.php?language=e&market=lc&showtree=yes Overview ofoff HPLC Suppliers [29] Novasep [30] HPLC Resources [31] HPLC Primero [32]
Referencias
[1] Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost detection of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of Neuroscience Methods, 139:263-269 [2] http:/ / www. konik-group. com [3] http:/ / www. chem. agilent. como/ cag/ cabu/ whatisgc. htm [4] http:/ / www. beckman. como [5] http:/ / www. dionex. como [6] http:/ / www. eksigent. como [7] http:/ / www. gilson. inc [8] http:/ / www. microlc. como [9] http:/ / www. perkinelmer. como/ [10] http:/ / www. proxeon. como/ [11] http:/ / ssi. shimadzu. como [12] http:/ / www. thermo. como [13] http:/ / www. waters. como [14] http:/ / www. sugelabor. com [15] http:/ / www. jascoinc. com [16] http:/ / www. younglin. com/ eng/ index. html [17] http:/ / www. mn-net. com [18] http:/ / www. gilson. como [19] http:/ / www. hitachi-hta. com [20] http:/ / www. iso-tech. como [21] http:/ / www. phenomenex. como [22] http:/ / www. teknokroma. es/ es [23] http:/ / www. tosohbioscience. como/ separation/ os [24] http:/ / www. kromasil. como [25] http:/ / zeochem. ch/ artculos/ 41 [26] http:/ / lchromatography. com/ hplcfind/ index. html [27] http:/ / www. lcresources. com/ wiki/ index. php?title=Main_#Page#Questionsabout_#Liquid_#Chromatography [28] http:/ / www. chromforum. com [29] http:/ / www. chemie. de [30] http:/ / www. novasep. com/ technologies/ chromatography. asp [31] http:/ / www. forumsci. co. il/ HPLC/ lcmspage. html [32] http:/ / www. waters. com/ WatersDivision/ ContentD. asp?watersit=JDRS-6VRHBW
Oscar Jurado
Licencia
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