Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Farmacia y Bioquímica

E. A. P. Farmacia y Bioquímica
5to año - Noveno Semestre
Departamento Académico de Farmacología,
Bromatología y Toxicología
Cátedra de Toxicología y Química Legal

Práctica N°8:
Determinación de
Tóxicos Orgánicos Fijos
INTEGRANTES:
Benito Navarro, Aldo (12040001)
Práctica 8 Goya Shimabukuro, Eri (12040091)
Huaman Fiestas, Susan Andrea (12040093)
Machaca Victorio, Merritt Bryan (12040071)
Rodríguez Cervantes, Lilian (00988426)
PROFESOR DE LA PRÁCTICA:
Mg. José Alfonso Apesteguía
Q.F. José Llahuilla Quea
FECHA DE LA PRÁCTICA:
30/03/16 10 a.m.-3:00 pm
INTRODUCCIÓN
En consonancia con el desarrollo industrial y técnico crece el número de estas sustancias
químicas. Incluye este grupo los derivados de la destilación del petróleo y muchos
hidrocarburos saturados, no saturados y aromáticos; alcohol metílico y etílico, éter, formol,
hidrato de cloral y acetona; aminas aromáticas constituyentes de las anilinas; derivados
clorados de los hidrocarburos aromáticos utilizados como insecticidas y combinaciones
orgánicas del fósforo; salicilatos, aspirina y fenacetina, también derivados de hidrocarburos
aromáticos; disolventes de grasas, como el sulfuro y tetracloruro de carbono; cloroformo y los
cloruros y bromuros de metilo; barbitúricos; alcaloides obtenidos de plantas como morfina,
codeína, cocaína, atropina, papaverina, curare, estricnina, nicotina, quinina, aconitina,
ergotamina, etc.

Hoy en día las drogas de abuso han pasado a ser de un problema global que afecta a muchos
países, obligando a las naciones a intensificar sus esfuerzos por el control y regulación de
algunas drogas, es por ello que como futuros investigadores en el presente informe vamos a
identificar los principales metabolitos producto de la biotransformación de sustancias tóxicas
presentes en los fluidos y tejidos corporal. Para la identificación de estas sustancias
previamente es necesario realizar una extracción en un disolvente orgánico ya sea en medio
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8
ácido o alcalino de modo que nos permita extraer la mayor cantidad y pureza de estos tóxicos.
Dentro de estos compuestos vamos a poder encontrar sustancias como las benzodiacepinas,
carbamacepina, fenotiazinas, anfetaminas, antidepresivos tricíclicos, alcaloides, plaguicidas
organofosforados, barbitúricos, salicilatos y otros analgésicos antipiréticos que hayan sido
empleados como sustancias de abuso por el paciente.

Dentro de estos compuestos se encuentran: Benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas,

butirofenonas, cannabinoles, anfetaminas, antidepresivos tricíclicos, cocaína, estricnina,
opiáceos, otros alcaloides y los principales metabolitos de todos ellos. Plaguicidas
organofosforados, plaguicidas organoclorados y piretriodes. Cumarinas, plaguicidas
carbámicos, glutetimida, hidantoinas, meprobamato, barbitúricos, salicilatos y otros
analgésicos antipiréticos y los principales metabolitos de todos ellos.

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MARCO TEÓRICO

La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tiene por objeto el

aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como
en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación.[ CITATION Raq07 \l 10250
]

Todos los fármacos entran en esta categoría, así como las drogas de abuso, los plaguicidas y
una gran cantidad de sustancias utilizadas en síntesis químicas y en industria alimentaria. De
las intoxicaciones con fármacos, la que involucran a los psicofármacos son las más frecuentes,
aunque también son frecuentes las intoxicaciones con aspirina y paracetamol.

La mayoría de las veces, la investigación de la presencia de estos compuestos en casos de

sospecha de intoxicación, requiere de la aplicación de dos tipos de métodos:

a) Métodos de aislamiento que separan al compuesto del resto de los componentes de la

muestra.
b) Métodos de identificación (y, en algunos casos, de cuantificación).
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8
Desde el punto de vista analítico, los tóxicos se dividen en:

 Tóxicos volátiles
 Tóxicos gaseosos
 Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles
 Tóxicos inorgánicos o minerales

Analítica de los tóxicos no volátiles o Tóxicos Orgánicos Fijos[ CITATION Cam65 \l 10250 ]

Bajo la denominación de Tóxicos Orgánicos Fijos (TOF) o no volátiles se incluye una gran
variedad de sustancias orgánicas, de interés toxicológico, que no pueden aislarse por
destilación de las matrices que los contienen, sino que debe recurrirse a la acción de
disolventes orgánicos (en medio ácido o alcalino) para su separación y posterior identificación.
La mayoría de estos tóxicos sufren de profundos cambios metabólicos en el organismo y, en
consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su forma original o como productos
de biotransformación (metabolitos), libres o conjugados con diferentes compuestos (ácido
glucurónico, sulfatos, aminoácidos, etc.). Las propiedades fisicoquímicas del toxico y sus
metabolitos pueden ser muy distintas, a veces incluso entre los metabolitos de un mismo

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compuesto. Ello determina una excreción característica según los casos y la conveniencia de
realizar la investigación en una u otra matriz (orina, sangre, bilis, etc.) Frecuentemente la
especie que será analizada está presente en un tejido o un fluido biológico, unido a proteínas u
otros constituyentes celulares. En este caso, puede ser necesario separar el toxico (el
compuesto madre de sus metabolitos) del resto del componente de la matriz, de modo de
obtenerlo en cantidad y pureza suficientes para permitir su identificación y cuantificación. Solo
recientemente han surgido métodos disponibles que permiten la medida directa de algunos
analitos sin la separación previa de su matriz. El analista toxicológico ha experimentado un
crecimiento paulatino en el número de técnicas a su disposición. En la actualidad la clásica
metodología convencional ha sido reemplazada por la introducción de método instrumentales
más sofisticados, de gran sensibilidad y precisión, pero cuyo costo elevado limita su
disponibilidad en la mayoría de los laboratorios de nuestro medio.

Los TOF tienen en común el uso de metodología similares para su aislamiento, caracterización
y cuantificación.

INMUNOENSAYOS: Existen en el comercio numerosos tipos de inmunoensayos con

aplicaciones en Toxicología. En su mayoría están diseñados para el análisis de muestras
líquidas, como orina,
Determinación agua yOrgánicos
de Tóxicos suero debido
Fijos a que estas matrices presentan poca cantidad de Práctica N° 8
interferencias. Estas muestras se emplean en forma directa, evitando por lo tanto el paso
previo de extracción aislamiento de los analitos y logrando una reducción importantísima en el
tiempo de obtención de los resultados (10 minutos – 1 hora). Los inmunoensayos se basan en
la reacción especifica que se produce cuando un antígeno se enfrenta con un anticuerpo. La
técnica tradicional consiste en mezclar un volumen de muestra conteniendo la droga a
ensayar, con una cantidad fija de un anticuerpo específico (monoclonal o policlonal), y una
cantidad fija de la misma droga marcada sintéticamente con un radioisótopo, una enzima
activa o una sustancia fluorescente. De este modo se establece una competencia entre la
droga marcada (Droga*) y la presente en la muestra (Droga) por los sitios de unión del
anticuerpo. En forma simple se esquematiza esta competencia:

Droga* + Droga + Anticuerpo ----------------> Droga*-Anticuerpo + Droga-Anticuerpo

La probabilidad de que una molécula marcada o sin marcar se una al anticuerpo depende de su
concentración. Se requieren instrumentos capaces de evaluar el punto final de la reacción y
comparar la respuesta del test contra estándares conocidos. De acuerdo al tipo de marca es el
método analítico de medida empleado. En algunos casos no puede diferenciarse ña señal
producida por la droga marcada unida al anticuerpo y la droga marcada libre, siendo necesario

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separarlas antes de efectuar la medida. Estos ensayos se conocen como heterogéneos, e
involucran principalmente a los radioinmunoensayos. Cuando esta separación no es necesaria,
porque la señal producida por la droga marcada se diferencia si está libre o unida, el ensayo se
llama heterogéneo.

TÉCNICAS CROMATOGRAFÍAS: La búsqueda de TOF mediante técnicas cromatografías, como

TLC (Cromatografía en capa fina), HPTLC, HPLC, GC, etc. Se caracteriza porque antes de
aplicarles es necesario separar las drogas de la matriz en la que se encuentran inmersas
mediante alguna técnica de extracción. En la práctica esto se logra siguiendo una serie de
pasos, como los que se describen a continuación.

Preparación de la muestra: es un paso crucial en los análisis. Involucra la homogenización de la

muestra, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis (ácida, básica o enzimática),
precipitación, centrifugación, etc. De modo tal que se facilite el aislamiento de la sustancia de
interés.

Aislamiento del analito: se puede llevar a cabo mediante extracción líquido-liquido (en tubos,
en ampollas de decantación o en columnas de tierra de diatomeas) o extracción en fase sólida
(columnas de SPE) de acuerdo a las disponibilidades del laboratorio. En este paso se mueve el
Determinación
analito de original
de su matriz Tóxicos para
Orgánicos Fijosen la mayor concentración posible, estabilizarlo (ya
obtenerlo Práctica N° 8

que en su matriz original puede degradarse química o enzimáticamente) y eliminar

interferencias.

Concentración del extracto: el objetivo de este paso es colocar el analito en el menor volumen
posible para aumentar la sensibilidad del análisis. Se deben usar condiciones controladas,
idealmente una temperatura menor de 40ºC y corriente de nitrógeno. Durante las operaciones
antes mencionadas se debe tener sumo cuidado para evitar pérdidas por volatilización,
oxidación o absorción en los precipitados, ya que frecuentemente los productos a identificar
están presentes en cantidades menores del g/ ml. Las pérdidas por volatilización de sustancias
básicas como anfetaminas pueden prevenirse cuidando la temperatura y salificando el
extracto con ácido clorhídrico al 1 % en metanol.

Identificación del analito: existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las

técnicas que se utilicen para su identificación. Así existe un nivel primario que utiliza técnicas
como Cromatografía en Capa Delgada (TLC), Espectrofotometría UV, además de reacciones de
coloración para la orientación, etc. Un nivel secundario involucra técnicas tales como la
Cromatografía de Gases (GC) y la Líquida de Alta Resolución (HPLC) tanto para Screening como

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para la determinación de una droga en particular y un nivel terciario que utiliza la
Espectrometría de Masas acoplada a un a Cromatografía separativa como la de Gases o Líquida
de Alta Resolución (GC/MS o HPLC/MS).

Cuantificación del analito: una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se puede
realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para
análisis. Esta técnica directa generalmente es una técnica cromatográfica gas-líquido o líquido-
líquido y la espectrometría acoplada a estas dos anteriores. Cada uno de estos pasos merece
un capítulo aparte dentro de la Toxicología. Por ende, sólo se pretende citar sus características
principales haciendo hincapié en los detalles técnicos más relevantes.[ CITATION Mis01 \l
10250 ]

OBJETIVOS

 Separar los diferentes compuestos orgánicos que se encuentren en la muestra

problema utilizando el método de Curry.

MATERIALES Y REACTIVOS

 REACTIVOS
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8
 Cloroformo
 Hidróxido de Amonio
 Ácido Clorhídrico concentrado
 Hidróxido de Sodio 2,5 %
 NaHCO3 5%

 MATERIALES
 Pera de Decantación 250 mL
 Probetas graduadas 50 mL
 Papel indicador pH
 Beaker de 100 mL
 Pipetas graduadas 5 – 10 mL
 Embudo de Vidrio
 Pipetas pasteur

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METODOLOGÍA

FUNDAMENTO[ CITATION Tri54 \l 10250 ]

Como norma general, los tóxicos se extraen con disolventes orgánicos. Entre los más
frecuentes para una extracción general se encuentran: éter etílico, cloroformo, diclorometano,
etc.

En este proceso es fundamental el pH del medio en el que se realiza la extracción, ya que el

fundamento de la extracción liquido-liquido consiste en la diferente solubilidad que cada
sustancia tiene en agua y/o disolventes orgánicos en función del grado de disociación que
sufre en función del pH del medio (sin olvidar el efecto de la mayor o menor liposolubilidad de
acuerdo al coeficiente de partición).

Los tóxicos en medio acuoso (como es el caso de las muestras biológicas) se comportan como
ácidos, bases o sustancias neutras.

El equilibrio fundamental de que hacemos uso en la extracción con disolventes es el siguiente:

Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8

Las

formas no ionizadas son más solubles en disolventes orgánicos. Por tanto, en cada caso
tendremos que utilizar el pH idóneo para que el tóxico que buscamos se encuentre
mayoritariamente en forma no ionizada.

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En el caso de los tóxicos ácidos, si consideramos un medio ácido, implica una elevada
concentración de H+, por lo que según el principio de Le Chatelier, la reacción se desplazaría
para compensar dicho aumento hacia la izquierda, es decir, hacia la formación de AH,
aumentando así la cantidad de ácido que está en forma no ionizada. La forma no ionizada es
más soluble en disolventes orgánicos que la ionizada. Por lo que concluimos que los ácidos se
extraen con disolventes orgánicos en medio ácido.

En el caso de los tóxicos básicos, si consideramos un medio alcalino, implica una elevada
concentración de OH-, por lo que según el principio de Le Chatelier, la reacción se desplazaría
hacia la izquierda para compensar ese aumento, es decir, hacia la formación de BOH
Determinación decantidad
Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8
aumentando así la de base que está en forma no ionizada. La forma no ionizada es
más soluble en disolvente orgánico que la ionizada. Por lo que concluimos que las bases se
extraen con disolvente orgánicos en medio alcalino.

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 MÉTODO DE CURRY

5 mL 0 100 g (contenido: gástrico, orina, sangre)

6 mL de Tunsgtato de sodio al 10%

9mL de ácido sulfúrico 2/3 N
5mL de agua destilada
1mL de hidróxido de sodio al 10%

BM por 15 minutos

Filtrar en caliente Sol. Transparente

Extraer con 1/3 vol.Cloroformo

Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8

Agitar por 3
minutos

FASE ACUOSA
FASE ETÉREA

-Órgano: Agregar NH4OH 10% hasta pH 9,5

Evaporar a
sequedad 10 Fosforados
gts Clorados
Carbámicos
Cloroformo Extraer con 1/3 vol.Éter
-Salicilatos
-Barbitúricos
Cromatografía
-Benzodiacepinas FASE ETÉREA
Residuo
SS(MeOH: -Cumarinas
acuoso
Acetona) 1:1 -Sulfas
-Digitálicos -Alcaloides
Evaporar a
-Marihuana -Benzodiacepinas
sequedad 10 gts
-Tóxicos: -Fenotiacinas
Cloroformo
-Ácidos: Fuertes, -Tóxicos alcalinos
Débiles
-Tóxicos neutros
Evaporar a
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sequedad 10 gts
Cloroformo
 MÉTODO DE CURRY

Tox. Ác. Fuertes (TAF)

Tox. Alcalinos (TA) Tox. Ác. Débiles (TAD)
Tox. Neutros (TN)

Fase acuosa

+ 50 mL
+ NH4 pH 9,5 NaHCO3 5 %
+ Extraer 50 mL Agitar 3-5’
Cl3CH
Agitar 3-5’
+ 50 mL
+ agitar 4-5’
TAF
TAD
TN

Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos Práctica N° 8

+ gts HCl pH 3 + 5 mL NaOH 2,5%
Agitar con Cl3CH Agitar 3’
3’

Evaporar Cl3CH TAD

+ mL HCl pH 3
Extraer Cl3CH 3’
Evaporar Cl3CH
R4
TA Evaporar

Fenotiazínicos
Benzodiacepinas
Evaporar Cl3CH Insecticidas
R1
TAF
R2
R3
TAD
Salicilatos 1 TN
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Bibliografía
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1. Fernández R. Marcha Toxicológica de Urgencia. 1st ed. Mendoza : Laboratorio de

Toxicología del Cuerpo Médico Forense - Poder Judicial de Mendoza; 2007.

2. Campbell K. Phenothiazine Derivatives in Urine: False Negative Results with the Forrest
Color Test (FPN), and a Method for Their Elimination. Clin Chem. 1965 Oct; 11(10): p. 914-9.

3. Misiuk W, Kuzmicka L, Mielech K, Puzanowska-Tarasiewicz H. Examination of iron (III) and

hexacyanoferrate (III) ions as reagentsfor the spectrophotometric determination of
promazine and perazine. Acta Pol Pharm. 2001 Nov-Dec; 58(6): p. 421-5.

4. Trinder P. Rapid determination of salicylate in biological fluids. Biochem J. 1954 Jun; 57(2):
p. 301-303.

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