Informe 7

Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia
Informe de Prácticas de Laboratorio de Microbiología I
PRACTICA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
#7
NOMBRE Laura Sanely Rivera Campoverde
GRUPO 3
Objetivo de Práctica
 Aprender la utilidad de las pruebas bioquímicas, estudiando los diferentes conceptos
 Diferenciar los usos y aplicaciones de las diversas pruebas bioquímicas
 Aplicar técnicamente los conceptos aprendidos y verificar los resultados.
Marco Teórico
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Las pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de
tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un
grupo bacteriano, además simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico,
porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.
Son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada
característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo
de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en
presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes
microorganismos.
En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica, cultivar el microorganismo en un medio

que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la
degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador
de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación. Cultivar el microorganismo en un
medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación
demostrar la actividad enzimática.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el
microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura
adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse
a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra
negativa para dicha prueba.
Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se
enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de
ensayo y se denominan según su nombre corriente.
 Enzimas vinculadas con la respiración: oxidasa y catalasa.

 Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros
 Requerimientos de oxígeno: Prueba de oxido fermentación (OF), crecimiento en caldo
tioglicolato.
 Producción de ácido, o ácido y gas: Fermentación de carbohidratos
 Detección de enzimas y vías metabólicas: Prueba del gluconato, ONPG (orto nitro B-D
galactopiranósido, esculína, hipuráto rojo de metilo voges proskauer.
 Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros: Prueba del indol, fenialanina, lisina,
arginina, ornitina, urea.
 Ensayos combinados: TSI (Triple azúcar hierro), bilis esculina.
 Detección de exoenzimas: lecitinasa, proteasa, coagulasa, amilasa, celulasa, desoxirribonucleasa
[CITATION Mar07 \l 12298 ]
Materiales Medios de Reactivos y Equipos

cultivo/cepas colorantes
Algodón Agua de Peptona Alcohol Mechero
Fósforos Agar Urea Kovacs Refrigeradora
Lápiz graso Agar Citrato Agua oxigenada Incubadora
Gradilla Agar hierro triple azúcar
Tubos Agar Lisina
Cajas de Petri Agar Mio
Pipetas
Asa de
Inoculación
Hilo de
Inoculación
Elaborado por: QF. Mariana Rendón M. MSc
Procedimiento
Vamos a estudiar diversas enzimas que pueden tener los distintos microorganismos, los que nos permitirán
clasificarlos e identificarlos.
1. PRUEBA DEL CITRATO

Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse en este medio, al utilizar los
fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos) que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará que el
medio se vuelva muy alcalino, lo que se demuestra con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.
Fundamento:
Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como única
fuente de carbono. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato.
Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y azul de
bromotimol como como indicador de pH.

Técnica:
A partir de un cultivo
puro y reciente del Sembrar en
Incubar a 37oC
microorganismo picadura y estría en
problema se tomará durante 18-24
un tubo con citrato
una muestra con un horas.
de Simmons.
hilo.
Interpretación de los resultados:
Prueba positiva. Citrato positivo (+): si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a
la producción de amoniaco que lo alcaliniza y cambia el color del indicador), el microorganismo es citrato positivo.
Prueba negativa. Citrato negativo (-): no vira el indicador. No hay cambio del color del medio.
2. PRUEBA DEL INDOL
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen
la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoníaco.
La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de

microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona
con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófanoy puede ser suministrado por una peptona
adecuada
La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en presencia de
agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de Kovacs que produce una coloración al reaccionar
con él.
Fundamento:
Esta prueba se basa en que ciertos microorganismos poseen una enzima llamada triptofanasa que puede
degradar el triptófano a indol.
Técnica:
A partir de un
se les añade 1 ml
cultivo puro se Sembrar en un Incubar a 37oC
de reactivo de
tomará una tubo con agua de durante 18-24
Kovacs o de Erlich
muestra con asa peptona. horas.
y se deja reposar.
de siembra
Prueba positiva. Indol positivo (+): si aparece un anillo rojo en la capa etérea, indica que la prueba es positiva, el
microorganismo produce indol.
Prueba negativa. Indol negativo (-): no hay cambio de color del medio.
3. PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

Se aplica para averiguar la capacidad degradativa de un microorganismo de un cierto hidrato de carbono. Se
puede realizar sobre distintos hidratos de carbono, esta prueba orienta para posteriormente realizar otras más
selectivas, como la de rojo o metilo o Voges Proskauer.
Fundamento:
Se basa en el viraje de color de un indicador de pH al producirse ácidos. La formación de gas se observa en una
campana de campana de Durham
Técnica:
Tomar la cepa
Rotular cada tubo Agregar 0.5 ml de
bacteriana con el
con el nombre del los diferentes Incubar a 37oC
asa de cultivo puro
azúcar azúcares en el tubo durante 24 horas.
del microorganismo
correspondiente correspondiente.
problema.
La formación de ácido se verá por el viraje de incoloro a fucsia. Si se formará gas, éste se verá en el interior de la
campana de Durham.
4. PRUEBA DE HIERRO TRIPLE AZUCAR

Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos entéricos Gram negativos. Se emplea para
detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también para detectar
producción de ácido sulfhídrico.
Procedimiento
Realice una estría en la
Observar a las 18-24 horas,
superficie y una punción en Incube a 37°C
ni menos ni más
la profundidad del medio

1. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada.
Superficie ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.
2. Profundidad ácido (amarillo): Glucosa fermentada.
Superficie alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.
3. Profundidad alcalino (rojo)
Superficie alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado
4. La aparición de burbujas en la profundidad del medio indica que la fermentación se ha efectuado con
producción de gas.
5. Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico.
5. PRUEBA DE LA CATALASA
Esta prueba permite diferenciar a los Staphilococcus y Micrococcus de los Streptococcus y Enterococcus.
Fundamento
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en agua y oxígeno (H2O2 → H2O +
O2). Cuando se agrega una pequeña cantidad de microorganismos se produce la catalasa a una gota de H 2O2, se
produce la formación de burbujas de oxígeno que es el producto gaseoso de la actividad enzimática
Técnica
Realizar una suspensión en una
placa portaobjeto del Agregar 3 gotas de Agua oxigenada
microorganismos problema

La presencia de burbujas indica que la prueba es catalasa positiva, sino se presentan las burbujas la prueba es
catalasa negativa
Resultados obtenidos
Muestra No 1
Pruebas Características del Resultados Imágenes
medio
T.S.I El medio contiene 0.1% de A) Pico alcalino/fondo alcalino (pico A)
glucosa y 1% de lactosa y rojo/fondo rojo): el microorganismo
sacarosa respectivamente. es no fermentador de azúcares.
-Si sólo fermenta la
B) Anaranjado/anaranjado (control,
glucosa, el ácido producido
sin inocular).
en el fondo lo acidifica y
se torna de color amarillo C) Pico alcalino/fondo ácido (pico
-Cuando fermenta la rojo/fondo amarillo): el
lactosa y la sacarosa, el microorganismo solamente fermenta
ácido producido torna el la glucosa.
medio a amarillo. D) Pico ácido/fondo ácido (pico
-El medio se mantiene rojo
amarillo/fondo amarillo): el
cuando no se produce
microorganismo fermenta glucosa,
fermentación-
lactosa y/o sacarosa.
E) El ennegrecimiento del medio K/K
indica que el microorganismo B) –
produce ácido sulfhídrico (H2S). C) K/A
D) La presencia de burbujas, o D) A/A
ruptura del medio de cultivo, indica E) K/A con H2S
que el microorganismo produce gas.
Citrato El medio contiene citrato, A) Positivo (+): cuando
iones de amonio, y otros
iones inorgánicos
sucede un viraje de color de
necesarios para el verde a azul que indica que la
crecimiento. También
reacción es positiva
contiene azul de
bromotimol, un indicador B) Negativo (-): cuando el
de pH. El azul de medio permanece verde
bromotimol es verde a un
pH por debajo de 6,9 y
luego se vuelve azul a un
pH de 7,6 o mayor
Urea Los dos medios A) Ausencia de hidrólisis de

utilizados con mayor urea: el medio mantiene su
frecuencia son el color amarillo original
caldo urea de Stuart
B) Degradadores rápidos de
y el agar urea de
la urea:
Christensen.
color rojo/ fucsia en todo el
medio.
Indol Se basa en la formación A) Positivo: Anillo rojo en la
de un complejo de color
rojo cuando el indol
superficie del medio
reacciona con el grupo B) Negativo: No se produce
aldehído del
color /Color naranja en la
pdimetilaminobenzaldehido
En la practica se utilizan superficie del medio indica
medios combinados, como desarrollo de escatol, un
el medio de sulfuro indol
para motilidad (SIM), el
compuesto metilado que
medio para motilidad indol puede ser precursor de la
omitina (MIO) o el medio
formación de indol.
indol nitrato.
Lactosa Para la identificación de aucares se utiliza la
Glucosa prueba de hierro triple azúcar (TSI) especificada
Sucrosa y con los respectivos resultados mas arriba
Catalas esta prueba es que la A) Negativo: ausencia de

a enzima catalasa oxigeno
reacciona con B) Positivo: formación de
peróxido de
burbujas que indica la
hidrógeno para
presencia de oxigeno
formar agua y
oxígeno - las
burbujas observadas
son oxígeno
Conclusiones
1. Mediante videos explicativos e investigaciones adquirimos conocimientos necesarios sobre las pruebas
bioquímicas, sus usos y aplicaciones para diferentes identificaciones según se requiera, así mismo pudimos
evidencias mediante las fotografías y aprender a diferenciar los resultados de acuerdo al viraje de color, textura,
reacción que este tome.
Recomendaciones
- Seguir las normas de bioseguridad
- Observar meticulosamente para no evidenciar falsos positivos
- Seguir los tiempos estipulados de incubación para no alterar resultados
Bibliografía
Martines Benavidez, H. (2007). PROPUESTA DE GUÍA DE APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA (BACTERIAS Y
HONGOS) PARA SER UTILIZADO EN MICROBIOLOGÍA GENERAL. Obtenido de
http://ri.ues.edu.sv/id/eprint/4768/1/16100029.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=6pNF8nrQMvQ
https://www.youtube.com/watch?v=L8Tfvzs0KjI
https://www.youtube.com/watch?v=lVxb0naewkU
https://www.youtube.com/watch?v=Pox0KgESIGs

Informe 7

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Informe 7

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Informe 7

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica, cultivar el microorganismo en un medio

 Enzimas vinculadas con la respiración: oxidasa y catalasa.

Materiales Medios de Reactivos y Equipos

1. PRUEBA DEL CITRATO

2. PRUEBA DEL INDOL

La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de

3. PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS

4. PRUEBA DE HIERRO TRIPLE AZUCAR

Interpretación de los resultados:

Interpretación de los resultados:

Urea Los dos medios A) Ausencia de hidrólisis de

Catalas esta prueba es que la A) Negativo: ausencia de

También podría gustarte