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Practica 4 y 5
Practica 4 y 5
Practica 4 y 5
Microbiología
Integrantes:
Grupo:252
Primera Parte
1. Propósito de la Práctica
1. Introducción
PRUEBA DEL ÁCIDO SULFHÍDRICO. Esta prueba ayuda a diferenciar las especies de Proteus
mirabilis y P. vulgaris (+) de P. morganii y P. rettgeri (-), además permite diferenciar a
Pseudomonas putrefaciens (+) de otras Pseudomonas (-), también permite identificar algunas
enterobacterias como Arizona (+), Edwardsiella (+) y Salmonella (+).
PRODUCCIÓN DE INDOL. Sirve para diferenciar: Edwardsiella (+) de Salmonella (-), E. coli (+) de
Klebsiella y Enterobacter (-), Bacillus alvei (+) de otras especies de Bacillus (-), Proteus mirabilis (-
) de otros Proteus (+). Esta prueba consiste en determinar la capacidad de un organismo para
desdoblar el indol a partir de la molécula de triptófano (2).
Material biológico
- 2 placas con agar nutritivo, 2 Juegos de tubos con medio O-F, 4 tubos con medio TSI, y 3 tubos
con medio de SIM. El tamaño de los tubos puede ser 13x100 o 15x125 con torunda o tapón de
rosca.
Nota: parte de este material se guardará en refrigeración para trabajar en el PIA, se recomienda
preparar este material con tubos de tapón de rosca.
- Gradilla
- Asa bacteriológica
- Reactivos: Frasco con peróxido de hidrógeno al 30%, Solución acuosa al 1.0% de di o tetrametil-
parafenil-endiamina, reactivo de Kovac
- Mechero
- Alcohol al 70%
- Incubadora a 37ºC
Nota: Todos los medios de cultivo deberán incubarse a 37°C para prueba de esterilidad.
Posteriormente guardar en refrigeración debidamente etiquetado con el medio de cultivo, grupo
y equipo.
Nota: Tomar fotografías de todos los tubos antes de inocularlos, estos serán tomados como
control
a. Prueba de la CATALASA.
1. Inocule por estría la superficie del agar nutritivo en placa, la mitad con B. subtilis, otro
con E. faecalis
1. Agregue unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias de los cultivos de los
microorganismos y observe buscando la formación inmediata de burbujas y espuma en
la superficie del medio.
Nota: El peróxido de hidrógeno es muy inestable y debe pasar por un control de calidad antes de
emplearse.
a. Prueba de la OXIDASA.
1. Inocule por estría la superficie del agar nutritivo en placa, la mitad con E. coli y la otra
con P. aeruginosa.
1. Interprete y anote sus resultados, considerando que esta prueba es positiva si las
colonias toman un color púrpura o azul el cual después puede pasar a negro.
Nota: El reactivo para la oxidasa generalmente es muy sensible a ser oxidado en presencia de
luz, por lo que se debe mantener fuera del alcance de la luz y de preferencia preparar la solución
en el momento que se requiere.
1. Inocule por picadura milímetros antes del fondo del medio en los tubos, de la siguiente
manera:
Nota: Para la interpretación de resultados debe tomar en cuenta que en los microorganismos O-
F fermentativos ambos tubos tanto el abierto como el cubierto con aceite viran tomando un
color amarillo debido a la producción de ácido a partir de la glucosa, mientras que los O-F
oxidativos solo producen ácido en la superficie del medio del tubo abierto y los microorganismos
que no son ni fermentativos ni oxidativos (inertes) producen una ligera alcalinidad en el medio
del tubo sin aceite (color azul verdoso) y el tubo cubierto no presenta cambio de color (se
mantiene verde).
1. Inocule por picadura y estría cada uno de los medios de TSI utilizando los siguientes
cultivos puros: E. coli, Salmonella spp. Proteus spp. y Pseudomonas aeruginosa.
Nota. Para interpretar resultados compare y registre cambios de sus cultivos con el control
negativo. Los posibles resultados son:
1. Inocule por picadura casi hasta el fondo medio de SIM en tubos, con cultivos axénicos de
la bacterias Salmonella spp., E. coli y Proteus spp.
1. Observe sus medios de SIM, buscando la formación de un precipitado negro; esto indica
un resultado positivo para la prueba; mientras que la falta de ennegrecimiento nos
indica que el microorganismo es H2S negativo.
f) Producción de Indol
1. En el medio de SIM, primero determine H2S y movilidad, posteriormente añada unas gotas de
reactivo de Kovac para detectar el indol.
Nota: La formación de un anillo de color rojo nos indica que el microorganismo es indol positivo
(3,4).
1. Análisis de Resultados
Construya una matriz para registrar tus resultados en donde para cada microorganismo
evaluado y para cada prueba realizada, siguiendo el ejemplo a continuación.
Control negativo
PRUEBA Oxidasa Observación de resultado Interpretación de resultado
P.aeuriginasa Los tubos mostraron un color verde Al tener un color verde en nuestros
fuerte. medios quiere decir que la vía es
E.coli
oxidativa.
Proteus spp Uno de los tubos (Salmonella) no En el caso de proteus spp. El color
tuvo cambios, su color permaneció negro en el medio nos indica una
Salmonella spp
en rojo, en el caso del proteus el tubo producción de H2S.
cambió a color negro.
Salmonella spp El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un
Presenta un color amarillo con color color amarillo y en la superficie un
Proteus spp
rojo en la superficie. color rojo nos indica que hay una
desaminación.
En el tubo de la salmonella presenta
un color negro. El tubo de la salmonella color
negro nos indica una producción
de H2S
Discusión
Las pruebas bioquímicas según Emilia Cercenado (2014) “Las pruebas bioquímicas permiten
determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación”. Lo que
quiere decir que mediante estas pruebas se puede comprobar si hay o no hay presencia de
algunas enzimas.
En nuestra prueba de catalasa como se puede observar se utilizó un medio de agar nutritivo lo
interesante es cuando a la catalasa se le agrega peróxido de hidrogeno esto servirá en la prueba
porque “La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias.
Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno” (Ugr, 2013). La presencia de burbujas
demuestra que la prueba es positiva.
Conclusión
Cuestionario
No, ya que existe diferentes tipos de fermentación, algunas su producto final son lactato y en
otros su producto final es etanol.
1. ¿Todas las bacterias aeróbicas darán positivo para una prueba de catalasa? Justifique su
respuesta.
Si, ya que la catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno siendo que las
bacterias aeróbicas se encuentran en constante contacto con el oxígeno darán positivo
Salto de página
1. Instrumento de evaluación
Elemento Cumple/No
Aspectos Criterio Puntos
(puntos) cumple
Manual identificado en la
Manual de portada con nombre y grupo,
FORMA
Laboratorio (5) entregado a tiempo y contestado
a mano con letra legible.
El estudiante participa
activamente durante la
Trabajo en equipo
realización de la práctica. Se
(5)
integra con sus compañeros de
equipo.
Salto de página
1. Referencias
a) Citas en el texto
1. Abreviaturas
° C: grados Centígrados
h: horas
min: minutos
g: gramos
mL: mililitros
%: porciento
5.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA.
Segunda Parte
1. Propósito de la práctica
• Comprender los fundamentos de las reacciones enzimáticas en las que se basan las
pruebas bioquímicas y aplicarlas para la clasificación o identificación bacteriana.
• Que el estudiante :
• Evalúe la capacidad para mantener estables los productos terminales ácidos a partir de
la fermentación de la glucosa de algunas bacterias entéricas.
1. Introducción.
REACCIONES DEL IMViC. Las siglas del IMViC representan a cuatro pruebas que son indol, rojo de
metilo, Voges-proskauer y citratos. Estas pruebas son muy utilizadas en la diferenciación e
identificación de bacilos entéricos.
UTILIZACIÓN DE CITRATOS. Esta prueba permite diferenciar a Edwardsiella (-) de Salmonella (+),
Serratia liquefaciens (+) de Yersinia enterocolitica (-), Klebsiella-Enterobacter (+) de Escherichia
coli (-), aquí se determina la producción de la enzima citrato desmolasa la cual permite que el
microorganismo utilice el citrato como única fuente de carbono. Para realizar esta prueba se
utiliza el medio de citrato de Simmons que contiene citrato de sodio como única fuente de
carbono y sales de amonio como única fuente de nitrógeno y además un indicador de pH que es
el azul de bromotimol. Si el microorganismo tiene capacidad de utilizar estos sustratos, el
desdoblamiento de las sales de amonio provoca alcalinidad del medio que se detecta mediante
el azul de bromotimol (1,2).
Material Biológico
• 2 tubos con medio MIO, 3 tubos con medio LIA, 4 tubos con caldo MRVP, 2 tubos con
Agar Urea y 2 con Agar citrato de Simmons. El tamaño de los tubos puede ser 13x100 o
15x125 con torunda o tapón de rosca. Nota: parte de este material se guardara en
refrigeración para trabajar en el PIA, se recomienda preparar este material con tubos de
tapón de rosca.
• Mechero
• Gradilla
• Asa bacteriológica
• Alcohol al 70%
• Incubadora 37 °C
Nota: Tomar fotografías de todos los tubos antes de inocularlos, estos serán tomados como
control.
a. Descarboxilación de la Ornitina
1. Inocule por separado dos tubos con medio MIO por picadura hasta el fondo con las
bacterias P. mirabilis, y Klebsiella spp.
Nota: La prueba positiva se obtiene al observar un color púrpura en el fondo del medio. En este
medio (MIO) también se puede determinar movilidad y además indol, para la prueba de indol
añada unas gotas del reactivo Kovac después de haber determinado la descarboxilación de la
ornitina y motilidad.
a. Descarboxilación de la Lisina
1. Inocule el medios LIA por picadura y estría con los microorganismos P. mirabilis, E. coli, y
Salmonella spp
1. Tome nota de los cambios que mostraron cada uno de los medios inoculados,
comparándolos con el control.
Nota: En el medio LIA se pueden obtener varios resultados, algunos de los más representativos
se enlistan enseguida. Asegúrese de consultar la literatura correspondiente para interpretar sus
resultados debidamente en la sección de Discusiones.
a) Superficie púrpura y fondo amarillo, b) Superficie púrpura y fondo púrpura, c) Superficie roja y
fondo amarillo y d) Superficie púrpura y fondo negro
1. Inocule por estría toda la superficie del medio de agar urea, con los microorganismos:
Proteus spp. y E. coli.
1. Registre los cambios comparando sus medios inoculados con el control negativo.
Nota.- Esta prueba es positiva cuando el medio toma un color rojo que se extiende de la
superficie al resto del medio de cultivo.
1. Inocule dos tubos de medio MR- VP con el microorganismo: E. coli y dos más con
Klebsiella spp. o B. subtilis.
1. Separe sus tubos de medio MRVP en juegos de dos tubos donde un juego esté inoculado
por E. coli y el otro por Klebsiella spp.
1. Utilice un juego de tubos para realizar rojo de metilo, añada 5 unas gotas del reactivo
rojo de metilo a sus tubos y registre de inmediato sus resultados.
Nota.- Los microorganismos rojo de metilo positivo, muestran una coloración roja del medio al
reaccionar con el reactivo.
e) Prueba de Voges-Proskauer.
Nota: Los microorganismos positivos desarrollan un color rosa en la superficie del medio después
de 30 – 60 min., el cual se extiende hacia el fondo del medio en el tubo.
1. Compare sus medios inoculados, con el control. Registre y anote los cambios que se
observen (3,4).
Nota: Un cambio de verde a azul del medio, nos indica que ese microorganismo es positivo.
1. Análisis de resultados
Construya una matriz para registrar tus resultados en donde para cada microorganismo
evaluado, siguiendo el ejemplo a continuación.
Control negativo
PRUEBA Oxidasa Observación de resultado Interpretación de resultado
P.aeuriginasa Los tubos mostraron un color verde Al tener un color verde en nuestros
fuerte. medios quiere decir que la vía es
E.coli
oxidativa.
Proteus spp Uno de los tubos (Salmonella) no En el caso de proteus spp. El color
tuvo cambios, su color permaneció negro en el medio nos indica una
Salmonella spp
en rojo, en el caso del proteus el tubo producción de H2S.
cambió a color negro.
Salmonella spp El tubo donde se inoculó proteus spp. Al presentar el proteus spp un
Presenta un color amarillo con color color amarillo y en la superficie un
Proteus spp
rojo en la superficie. color rojo nos indica que hay una
desaminación.
En el tubo de la salmonella presenta
un color negro. El tubo de la salmonella color
negro nos indica una producción
de H2S
En esta práctica pudimos observar diferentes resultados para cada prueba bioquímica,
indagando en distintas fuentes de investigación pudimos observar algunas similitudes en
algunos resultados y diferencias en algunos otros.
En la prueba de la oxidasa como resultado se pudo observar una enorme mancha color azul,
según Cercenado (2014) dice que “En presencia de oxígeno atmosférico la enzima intracelular
citocromo oxidasa oxida el reactivo fenilendiamina y forma un compuesto color púrpura”
comparando nuestro resultado con otros compañeros el resultado es el mismo, no ocurre una
mancha color purpura sino color azul, característica del azul de indo fenol.
Conclusión
En esta práctica se logró comprender con éxito la preparación de distintas pruebas bioquímicas.
Aprendimos a preparar diferentes pruebas bioquímicas e interpretar los resultados de esta. En
lo personal esta práctica me gustó mucho ya que pudimos apreciar las diferentes pruebas y sus
resultados, fue sorprendente el cómo cambiaban de color algunas pruebas, esta practica sera de
suma importancia una vez esté en campo laboral ya que por ejemplo en la prueba de la ureasa
se verá mucho en el área clínica.
Cuestionario
1. Explique la reacción bioquímica de la ureasa y diga por qué es importante esta enzima en
microorganismos de interés clínico o sanitario.
la ureasa es la hidrólisis de urea hacia ácido carbámico; la cual se produce 10₁₄ veces más rápido
en presencia de dicha enzima, teniendo como productos el ácido carbónico y el amoníaco en la
prueba de la ureasa se utiliza el rojo fenol el cual indica la presencia de amonio el cual es el
resultado de la ureasa
Esta enzima es de gran importancia ya que aumenta el pH del lugar en que está presente y
favorece su proliferación.
Elemento Cumple/No
Aspectos Criterio Puntos
(puntos) cumple
Manual identificado en la
Manual de portada con nombre y grupo,
Laboratorio (5) entregado a tiempo y contestado
a mano con letra legible.
FORMA El estudiante participa
activamente durante la
Trabajo en equipo
realización de la práctica. Se
(5)
integra con sus compañeros de
equipo.
1. Instrumento de evaluación
1. Referencias
a) Citas en el texto
b) Literatura consultada
9. Abreviaturas
h: horas
° C: grados Centígrados
%: porciento