La prolil endopeptidasa de Aspergillus

niger inmovilizada en un vehículo de

calidad alimentaria para la producción de
cerveza con gluten reducido
Los enlaces de autor abren el panel de superposiciónIlaria Benucci aMaria
Chiara Caso aTeodora Bávaro bStefania Masci aMilda Keršienė cMarco Esti a
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•
La prolil endopeptidasa de A. niger (AN-PEP) se ha inmovilizado en
perlas de quitosano.
•
Se usó AN-PEP inmovilizado en un reactor continuo para la reducción de
gluten en cerveza.
•
El tratamiento se realizó con 10 g de biocatalizador a una velocidad de
flujo de 728 ml / min.
•
Después de 10 h de tratamiento, el contenido de gluten se redujo de 65 mg
/ kg a 15 mg / kg.

Resumen
La creciente demanda de cerveza con gluten reducida recientemente está
conduciendo al desarrollo de diversos enfoques que se aplicarán en la
elaboración de cerveza. El trabajo actual se centra en el desarrollo de una
herramienta biocatalítica innovadora y sostenible para la producción continua de
cerveza con gluten reducido, basada en la aplicación de prolil endopeptidasa
inmovilizada de Aspergillus niger (AN-PEP). Esta proteasa de grado alimenticio
se ha inmovilizado en perlas de quitosano de A. niger y se ha aplicado, por
primera vez, para la reducción de gluten en una cerveza comercial de malta de
cebada. El procedimiento de inmovilización se optimizó para maximizar la
actividad específica del biocatalizador (0.016 UI / mg BSAeq) y se alcanzó el mejor
rendimiento utilizando una solución de inmovilización a una concentración de
proteína inicial de 0.3 mg de BSAeq / mL.
La inmovilización aumentó la estabilidad térmica de la proteasa, que mostró
propiedades catalíticas similares en la cerveza sintética (hacia el sustrato sintético
Z-Gly-Pro-pNA) cuando se aplicó a 20 ° C oa 50 ° C. El tratamiento continuo en
reactor de lecho fluidizado (FBR), que contenía 10 g de AN-PEP inmovilizado
(correspondiente a 0,0036 g de BSAeq ), se optimizó variando el caudal (Q v ). Las
condiciones adecuadas para lograr la reducción del gluten intacto de la cerveza
auténtica fueron Q v de 728 ml / min. El tratamiento continuo en FBR nos
permitió reducir el contenido inicial de gluten (65 mg / kg) en la cerveza
comercial de malta de cebada, alcanzando la concentración de 19 mg / kg
después de 9 hy 15 mg / kg después de 10 h de tratamiento.
Palabras clave
Prolyl endopeptidase
Inmovilización covalente
Tratamiento continuo
Reducción de gluten
Cerveza

1. Introducción
La cerveza es una bebida alcohólica que se consume en todo el mundo,
con un consumo anual promedio de alrededor de 74 kg / cápita en Europa
y 86 kg / cápita en América del Norte (Colen y Swinnen, 2016). Como se
informó por Barth-Haas (2013), el mercado europeo de la cerveza es el
segundo mercado de cerveza estadounidense, con un volumen de
producción de 545 millones de hectolitros. Las personas afectadas por la
enfermedad celíaca y la sensibilidad al gluten no celíaca representan
alrededor del 6% de la población mundial (Carroccio et al., 2012; Genetics
Home Reference, 2015). Las personas con enfermedad celíaca deben
adherirse a una dieta sin gluten (GF). Por lo tanto, pueden beber cerveza
de manera segura sustitutos que difieren significativamente de la cerveza
auténtica (a base de cebada) en cuanto a aroma y sabor. La Norma del
Codex Alimentarius y el La regulación de la UE 828/2014 estableció una
concentración de gluten por debajo 20 mg / kg para alimentos GF (Knorr,
Wieser y Koehler, 2016; Shan, 2002), mientras que el rango de contenido
de gluten en cervezas de malta de cebada elaboradas puede varían de <10
mg / kg en algunas cervezas industriales a 4000 mg / kg en Weissbier
(Fanari et al., 2017, 2018; Guerdrum & Bamforth, 2011; Hager, Taylor,
Waters y Arendt, 2014; Van Landschoot, 2011; Watson Decloedt,
Vanderputten y Van Landschoot, 2018).
En la última década, la demanda de alimentos GF de alta calidad, incluidos
Cerveza GF, ha aumentado fuertemente y su producción se ha ido
convirtiendo en una cuestión socioeconómica importante. A pesar de que la
cerveza no es un parte esencial de la nutrición humana, la disponibilidad de
alimentos seguros, saludables y la sabrosa cerveza GF mejoraría
notablemente el bienestar y la percepción de las personas de una vida
social normal (Hager et al., 2014). En este escenario, el Se espera que el
mercado global de cerveza GF crezca en un Compuesto Anual Tasa de
crecimiento (CAGR) superior al 40% durante el período 2017–2023.
Las principales estrategias para producir cerveza GF son: i) el uso natural de Granos GF (es
decir, arroz, maíz, sorgo, mijo) o pseudocereales (es decir, quinua, trigo sarraceno,
amaranto) como materias primas (Wiedemair, Ramoner y Huck, 2019), obteniendo así
sustitutos de la cerveza; ii) la precipitación de proteínas utilizando taninos, gel de sílice o
PVPP (Benìtez, Acquisgrana, Peruchena, Sosa y Lozano, 2016; Dostalek, Hochel, Méndez,
Hernando y Gabrovska, 2006; Hager et al., 2014; Watson, Vanderputten, Van Landschoot y
Decloedt, 2019); iii) la degradación del gluten durante el proceso de elaboración por
tratamientos enzimáticos (Arendt y Zannini, 2013; Dostalek et al., 2006; Guerdrum y
Bamforth, 2012; Hager et al., 2014; Watson et al., 2019). Recientemente, una
hidrocavitación controlada asistida La técnica de preparación se ha aplicado para reducir
el gluten en la cerveza (Albanese, Ciriminna, Meneguzzo y Pagliaro, 2017), así como el uso
de gel de sílice durante varias etapas de elaboración de cerveza (Benìtez et al., 2016).
Prolil endopeptidasa de Aspergillus niger (AN-PEP), actualmente utilizada en La industria
cervecera para la prevención de la neblina, desglosa los ricos en prolina fracción de
prolamina de gluten. Esta enzima exógena ha sido exitosa aplicado, en forma libre, para la
 producción de cerveza GF a partir de convencional maltas (Akeroyd et al., 2016; Watson et
al., 2019) sin Impacto negativo en la estabilidad de la espuma (Di Ghionno, Marconi,
Sileoni, De Francesco y Perretti, 2017; Guerdrum y Bamforth, 2012).

Se reconoce que las enzimas libres generalmente tienen poca estabilidad bajo condiciones
del proceso (es decir, pH, temperatura e inhibidores naturales en los alimentos matriz) y
no se pueden recuperar / reutilizar. Como se informa en la literatura, inmovilización
enzimática, obtenida fijando la enzima en un portador, se cree que proporciona una base
excelente para mejorar el medio ambiente tolerancia y la estabilidad operativa del
biocatalizador en matriz alimentaria (Tang, Peng, Li, Meng y Liu, 2018). Además, enzima la
inmovilización en soportes sólidos podría permitir su reutilización durante muchos ciclos,
también en procesos continuos, evitando la contaminación proteica de producto (Gardossi
et al., 2008).

Recientemente, Zhao et al. (2017) covalentemente inmovilizado AN-PEP en nanopartículas

de sílice no porosas funcionalizadas con grupos amino, demostrando su eficacia en la
prevención de la formación de neblina en la cerveza. A pesar de estos resultados, todavía
no se han realizado estudios aplicando inmovilizados AN-PEP en un biorreactor continuo
para la reducción del contenido de gluten en cerveza Entre los biorreactores continuos, el
reactor de lecho fluidizado (FBR), es especialmente recomendado cuando los sustratos son
viscosos o contienen partículas suspendidas (Gòmez et al., 2007). En este reactor, el flujo
de el sustrato mantiene las partículas de enzima inmovilizadas en un estado fluidizado,
obteniendo así una alta área de superficie catalítica. Las RBA se han extendido aplicación
en la industria alimentaria [i.e. para clarificar el jugo de manzana (Diano et al., 2008), para
la producción de fructo-oligosacáridos e invertidos azúcares (Lorenzoni et al., 2015), para
la hidrólisis de lactosa (Roy y Gupta, 2003), para la mejora del sabor de las bebidas
(Gueguen, Chemardin, Pien, Arnaud y Galzy, 1997) y para controlar la fermentación
maloláctica en vino (Cappannella et al., 2016)].

Por lo tanto, en este estudio, AN-PEP se ha inmovilizado covalentemente en un portador

de calidad alimentaria y su tolerancia medioambiental (temperatura y pH), así como sus
propiedades catalíticas han sido investigadas hacia sustrato peptídico sintético en cerveza
sintética. Luego, el biocatalizador se utilizó por primera vez en un FBR continuo para la
producción de GF cerveza de malta de cebada convencional.

2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
Brewers Clarex® (lote no 817786501, DSM, Delft, Países Bajos), una preparación
comercial de peptidasa específica de prolina de Aspergillus Níger (AN-PEP), fue
amablemente dada por IMCD Italia SpA (Milán, Italia). Los Se adquirió el péptido
cromogénico para-nitroanilida (pNA) Z-Gly-Pro-pNA de Bachem (Bubendorf, Suiza) y
usado como sintético sustrato para la actividad proteasa. Cuentas como portadores
para la inmovilización de AN-PEP fueron producidos usando polvo de quitosano de
Aspergillus Níger (lote no 12121611L4, KitoZyme S.A., Herstal, Bélgica). Almidón de
polidialdehído (dialdehído polimérico), utilizado como agente de reticulación, fue
comprado de Carbosynth Limited (Reino Unido). Una cerveza tipo Pilsner, con Free
 Lions Brewery suministró amablemente un nivel de alcohol del 5% v / v (Viterbo, Italia)
y el kit competitivo de RIDASCREEN Gliadin ELISA (Art. No. R7021), utilizado para la
cuantificación del contenido de gluten en cerveza, fue comprado de R-Biopharm
(Milán, Italia). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico y eran de
Sigma-Aldrich (Milán, Italia).

2.2. Preparación de perlas de quitosano

Los portadores para la inmovilización de AN-PEP se prepararon de acuerdo con el

método de precipitación (Birò, Nemeth, Sisak, Feczko y Gyenis, 2008) Con alguna
modificación. El polvo de quitosano (15% p / v) se disolvió en una solución acuosa de
ácido acético (5 v / v%) y se mantuvo, bajo agitación condiciones, hasta que se logró la
solubilización completa. La solución Luego se agregó gota a gota, a través de una
bomba peristáltica (Minipuls 3 Gilson, Italia), en un líquido de coagulación suavemente
agitado (hidróxido de sodio 2 M y 26 v / v% de etanol). Las perlas obtenidas se
filtraron y lavado con agua destilada.
2.3. Procedimiento de inmovilización
La funcionalización de las perlas de quitosano con almidón de polidialdehído el
entrecruzante se realizó según lo descrito por otros autores (Benucci, Mazzocchi,
Lombardelli, Cacciotti y Esti, 2019; Chen et al., 2010). Las perlas activadas se
recogieron y se lavaron con agua destilada.

Posteriormente, el enlace covalente de la AN-PEP se logró mediante sumergir las

perlas funcionalizadas (1 g) en la solución de inmovilización (10 ml), que consistía en
un tampón de fosfato de sodio 0,2 M que contenía pH 7 diferentes concentraciones
iniciales de proteína AN-PEP (0.1–4.6 mgBSAeq / mL). Después de agitar a 150 rpm
durante la noche a 20 ° C, el desatado la proteína se eliminó de los portadores lavando
extensamente con sulfato de amonio (2 M) y cerveza sintética (acetato de sodio 0.1M
tampón pH 4,5, que contiene etanol al 5% v / v).

El rendimiento de inmovilización (IY,%) se determinó indirectamente por el cambio de

concentración de proteína de la solución de inmovilización antes y después de cargar
en portadores de quitosano. La concentración de proteína fue medido por el método
de Bradford (Bradford, 1976), utilizando BSA como estándar proteína.

2.4. Separación electroforética (SDS-PAGE)

Para demostrar la estabilidad del enlace entre el cuentas de quitosano funcionalizadas
y AN-PEP, la presencia de enzimas SDS-PAGE investigó las proteínas en la última
solución de lavado (Laemmli, 1970). Se realizó en geles comerciales prefabricados de
4–15% (Bio-Rad, Richmond, California, EE. UU.), Utilizando una electroforesis vertical
Aparato (Mini-Protean Tetra cell, Bio-Rad, Richmond, California, ESTADOS UNIDOS);
peso molecular estándar (Precision Plus Protein Standards, Kaleidoscope, Bio-Rad,
Richmond, California, EE. UU.) Eran de 10 a 250 kDa. Todas las muestras se prepararon
agregando 20 μL de la última solución de lavado a 20 μl de tampón de carga (4 ×
muestra de Laemmli Tampón), y luego hirviendo a 90 ° C durante 5 min. Para cada
 muestra, 20 μL fueron cargado en cada pozo y la ejecución se realizó hasta el frente
del tinte alcanzó la línea de referencia (aproximadamente 1 ha 150 V). El gel fue
reparado y teñido con coloide Coomassie Brilliant Blue G-250, y luego teñido
en ácido acético: metanol: solución de agua (9:10:81).

2.5. Ensayo de actividad de AN-PEP

Las actividades proteolíticas de AN-PEP libre e inmovilizada fueron evaluado en
cerveza sintética (0.1M acetato de sodio buffer pH 4.5, que contiene 5% v / v etanol)
hacia el dipéptido sintético cromogénico sustrato Z-Gly-Pro-pNA [previamente
disuelto en 1,4-dioxano (40%, v / v en agua) a 60 ° C (Lopez y Edens, 2005; Zhao et al.,
2017)]. el producto de reacción se controló espectrofotométricamente a 410 nm,
medir el cambio en la absorbancia frente al tiempo (2 min para AN-PEP libre y 10 min
para AN-PEP inmovilizado) con un espectrofotómetro UV-visible (Shimadzu UV 2450,
Milán, Italia). Se realizó una corrección en blanco. usando una muestra sin enzima.
Todos los análisis se tomaron por triplicado.

Cuando el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad proteolítica de Se

estudió AN-PEP libre e inmovilizada, los resultados se expresaron como actividad
relativa (%), tomando como referencia (100%) la mayor actividad de cada enzima en
sus condiciones óptimas.

Para la caracterización cinética, la actividad específica de AN-PEP fue calculado en I.U.

de pNA producido *εmmol = 8.480mM − 1 cm − 1 para pNA, según lo informado por
Hale, Greer, Trinh y James (2005)], y fue indicado como I.U./mg de proteína libre o
inmovilizada, expresada como BSAeq, (I.U./mgBSAeq). La comparación de la actividad
de los libres e inmovilizados. AN-PEP se llevó a cabo a pH 4,5 a su temperatura óptima
y a 20 ° C.

2.6. PH y temperatura óptimos

Los efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad proteolítica del libre e
inmovilizó AN-PEP hacia Z-Gly-Pro-pNA enriquecido en sintético Se investigó cerveza a
una concentración de 1 mM bajo el mismo ensayo condiciones descritas en el
apartado 2.4. Se realizó un ensayo de actividad de AN-PEP fuera a diferentes
temperaturas, que van desde 10 ° C a 80 ° C, y el intervalo elegido para pH estuvo
entre 3 y 6.

2.7. Caracterización cinética de AN-PEP libre e inmovilizada.

Un estudio cinético de AN-PEP libre e inmovilizado en perlas de quitosano se realizó a

sus temperaturas óptimas en cerveza sintética fortificada con Z-Gly-Pro-pNA (0–1.5
mM) tanto a 20 ° C como a su nivel óptimo temperatura. Los parámetros cinéticos se
determinaron de acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten usando un
procedimiento de regresión no lineal (GraphPad Prism 5.01, GraphPad Software, Inc.).
 El valor KM (constante de Michaelis-Menten) refleja la enzima formación de complejo
de sustrato, mientras que kcat (número de rotación) mide el número de moléculas de
sustrato entregadas por enzima por minuto. Además, kcat es indicativo de la velocidad
de liberación del producto, representando la cantidad máxima de moles de sustrato
convertidos en el producto por número de moles de catalizador por unidad de tiempo.
Además, como Ka (afinidad constante) es la relación kcat / KM y refleja la afinidad de
la enzima hacia el sustrato, es indicativo de ambos pasos de reacción y expresa
La eficiencia catalítica general. La bondad de ajuste para cada dato conjunto (a sus
mejores curvas cinéticas teóricas) se evaluó como el cuadrado de los coeficientes de
correlación (R2).

2.8. Optimización del tratamiento enzimático en el reactor de lecho fluidizado.

El FBR consistió en una columna cilíndrica de vidrio (volumen total de 300 ml),
equipado con una camisa de agua externa para control de temperatura y conectado a
un termostato (MPM INSTRUMENT TYPE M 900- TI). El uso de una bomba peristáltica
(Pumpdrive 5206 Heidolph), y el Insuflación simultánea de gas nitrógeno (N2) (flujo de
1 bar) desde parte inferior de la columna, permitió la suspensión del inmovilizado
biocatalizadores, así como la recirculación de la auténtica cerveza. Los parámetros del
proceso se optimizaron a 20 ° C, variando el caudal. La concentración de liberación del
producto (CP, dada por la relación entre los ΔAbs / Se detectó el coeficiente de
extinción mínimo y molar de pNA libre).
Además, la velocidad espacial (Sv dada por la relación entre Qv y FBR volumen), el
tiempo de residencia (τ, correspondiente a 1 / Sv) y la formación del producto se
calculó la tasa [(Rp) correspondiente a CP x Qv].

Para evaluar la actividad proteolítica de AN-PEP inmovilizada, Se realizaron ensayos

preliminares en FBR a 20 ° C. Cerveza auténtica elaborada con malta de cebada (300
ml), fortificada con Z-Gly-Pro-pNA (0,12 mM), se trató con 10 g (peso húmedo,
correspondiente a 0,0036 gBSAeq) de AN-PEP inmovilizada a diferentes velocidades de
flujo (Qv, 112-1064 ml / min).

2.9. Reducción de gluten en el reactor de lecho fluidizado

Una cerveza tipo Pilsner, con un contenido inicial de gluten de 65 mg / kg.
[(determinado por un ELISA competitivo basado en el anticuerpo R5 (RIDASCREEN ®
Gliadin competitivo))], se trató en el FBR que contenía 10 g (peso húmedo) de AN-PEP
inmovilizada, a la velocidad de flujo adecuada (Qv = 728 ml / min).

El proceso continuo se realizó a 20 ° C durante 10 h, y Se evaluó la eficiencia en la

reducción de gluten recolectando 1 mL de tratamiento cerveza a intervalos de tiempo
regulares (cada hora) para la cuantificación a través de ELISA competitivo.

2.10. Cuantificación de gluten por ELISA competitivo

 Un ELISA competitivo basado en el anticuerpo R5 (RIDASCREEN® Gliadina competitiva)
se utilizó para la cuantificación del contenido de gluten en cerveza antes, durante y
después del tratamiento en FBR.

Se mezcló una muestra de cerveza (1 ml) con 9 ml de la solución de extracción. [60% (v

/ v) de etanol en agua que contiene 10% (m / v) de gelatina de pescado] y analizado de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El recomendado Se usó dilución (1: 500)
para cada muestra, lo que significa que solo se pudieron determinar contenidos de
gluten entre 10 y 270 mg / kg. Las absorbancias a 450 nm se midieron usando una
microplaca Asys Expert 96 lector (Biochrom, Cambridge, Reino Unido) y
concentraciones de prolamina se obtuvieron utilizando el software RIDA®SOFT Win (R-
Biopharm). Las concentraciones de prolamina se convirtieron en contenido de gluten
por multiplicación por factor 2, según lo dispuesto por la Comisión del Codex
Alimentarius (Comisión, C. A., 2008). Todas las muestras se analizaron por triplicado.

2.11. análisis estadístico

Los datos, obtenidos del promedio de tres análisis repetidos, se analizaron mediante
un análisis unidireccional completamente al azar de Varianza (ANOVA). Cuando se
reveló la importancia, un Tukey's (HSD) La prueba post-hoc (p <0.05) se realizó
utilizando la macro de complemento EXCEL®Programa DSAASTAT para comparaciones
múltiples de muestras (Onofri, 2006).

3. Resultados y discusión

3.1. Inmovilización de AN-PEP

Se realizó un primer experimento para determinar el efecto de La concentración de
proteínas en la solución de inmovilización (que va desde 0.1 a 4.6 mgBSAeq / mL) en la
proteína cargada, así como en el específico actividad de AN-PEP inmovilizada.

Los datos de la Fig. 1 muestran que la carga de proteínas aumentó significativamente

cuando se usaron concentraciones de proteína iniciales más altas, hasta alcanzar el
valor máximo (aproximadamente 7 mgBSAeq / gchitosan usando una inmovilización
solución a 3 mgBSAeq / mL). El aumento adicional de la concentración de proteínas.
en la solución de inmovilización no afectó significativamente la cantidad de proteína
inmovilizada.

La actividad específica de AN-PEP aumentó a medida que la concentración de

la solución inmovilizada aumentó, alcanzando un máximo (0.016 I.U./ mgBSAeq) valor
cuando el procedimiento se llevó a cabo utilizando una inicial concentración de
proteína de 0.3 mgBSAeq / mL. Aunque un aumento adicional en las concentraciones
iniciales de proteína resultaron en una mayor cantidad de proteína cargado, la
actividad específica de AN-PEP disminuyó notablemente. Como se informó en
literatura, la cantidad de proteína inmovilizada en portadores tiene obvia influencia en
el rendimiento de la enzima inmovilizada (Zhang,
 Yuwen y Peng, 2013). La carga excesiva de enzimas causa proteína-proteína
interacción e inhibe el estiramiento flexible de la conformación enzimática, lo que
resulta en el impedimento estérico responsable de la inactivación enzimática (Tischer
y Wedekind, 1999; Zhang et al., 2013).

La SDS-PAGE (en la última solución de lavado después de la inmovilización) demostró

que independientemente de la concentración inicial de proteínas en el solución de
inmovilización, bandas de peso molecular similares a las de no se observó AN-PEP libre
(utilizado como estándar de referencia) (datos no mostrado). Esto puede ser una
indicación de la estabilidad del vínculo entre los portadores funcionalizados, basados
en quitosano de A. niger y AN-PEP enzima.

3.2. Temperatura y pH óptimos de AN-PEP libre e inmovilizada

La influencia de la temperatura y el pH en la actividad de los productos libres y AN-PEP
inmovilizado (Fig. 2), investigado en cerveza sintética, demostró que todas las curvas
exhibían la típica tendencia en forma de campana (Bisswanger, 2014). Se encontró
que la temperatura óptima para el AN-PEP libre fue de 60 ° C, correspondiente a una
actividad específica de 0.163 ± 0.006 I.U./ mgBSAeq (Fig. 2a). Después de inmovilizar la
proteasa en perlas de quitosano, la temperatura óptima se amplió a un rango de 50-
60 ° C, y la actividad relativa más alta fue a 50 ° C (correspondiente a un actividad de
0.0085 ± 0.0002 UI / mgBSAeq, Fig. 2a). AN-PEP tenía el misma temperatura óptima
(50 ° C) cuando se inmovilizó en no poroso nanopartículas de sílice (Zhao et al., 2017).
El efecto de diferentes Los valores de pH se investigaron tanto a 20 ° C (temperatura
convencionalmente aplicado en la elaboración de la cerveza durante el paso posterior
a la fermentación) y en el óptimo temperatura libre (60 ° C) y enzima inmovilizada (50
° C). Independientemente de la temperatura, la AN-PEP inmovilizada mantuvo una
temperatura adecuada. actividad proteolítica en el rango típico de pH de cerveza, que
muestra la pH óptimo a 4.2–4.5 (con una actividad específica de aproximadamente
0.017 ± 0.002 I.U./mgBSAeq a 20 ° C, y una actividad específica de aproximadamente
0,021 ± 0,001 UI / mgBSAeq a 60 ° C) (Fig. 2b yc).

3.3. Caracterización cinética de AN-PEP libre e inmovilizada.

El estudio cinético, realizado en cerveza sintética tanto a 20 ° C como a la temperatura
óptima (60 ° C gratis y 50 ° C para ANPEP inmovilizado), demostró que ambos
biocatalizadores siguieron el comportamiento hiperbólico de la ecuación de Michaelis-
Menten (Fig. 1S). Independientemente de la temperatura, la inmovilización redujo
considerablemente las propiedades catalíticas de biocatalizador, con una disminución
significativa de todos los parámetros cinéticos (Tabla 1). Esta reducción, después de la
inmovilización covalente, es común fenómeno y podría ser atribuible a impedimento
estérico, difusión problemas, así como a la baja cantidad de enzima inmovilizada en
quitosano apoyos (Jiang, Long, Huang, Xiao y Zhou, 2005).

No se revelaron diferencias significativas comparando la cinética parámetros de AN-

PEP inmovilizados aplicados a 20 ° C o en su punto óptimo valor (50 ° C), lo que sugiere
 que la inmovilización aumenta la temperatura estabilidad de la proteasa, como ya se
determinó para otras enzimas (Datta, Christena y Rajaram, 2013). Estos resultados
demuestran que el catalizador Las propiedades del AN-PEP inmovilizado no se vieron
afectadas por la temperatura de funcionamiento. De lo contrario, las propiedades
catalíticas de la enzima libre fueron influenciados significativamente por la
temperatura de operación, con la mayor eficiencia catalítica observada cuando se
utilizó AN-PEP libre a Su temperatura óptima (60 ° C). A 20 ° C todas las propiedades
catalíticas de libre enzima fueron significativamente mejores que las de la enzima
inmovilizada, con la única excepción de KM.

3.4. Optimización del tratamiento en reactor de lecho fluidizado

La velocidad de flujo (Qv) que cambia en FBR resultó en un correspondiente variación
de los otros parámetros del proceso, como Sv y τ (Tabla 2). Como esperado, se reveló
una relación lineal positiva entre Qv y Sv, mientras que se observó una relación
inversa entre Qv y τ, por lo tanto indicando que a velocidades de flujo más altas el
tiempo de contacto entre los inmovilizados enzima y el sustrato disminuyeron
profundamente. Por otra parte, los datos en la Tabla 2 muestran que la relación entre
Qv y Rp estuvo representada por una curva en forma de campana (Fig. 3), según lo
descrito por otros autores (Laudani, Habulin, Knez, Della Porta y Reverchon, 2007;
Saponjid et al., 2010).

La AN-PEP inmovilizada mostró una actividad proteolítica satisfactoria en cerveza

auténtica fortificada con el sustrato peptídico sintético. Los se reveló la tasa más alta
de formación del producto (Rp = 0.073 μM / mgBSAeq) a un Qv de 728 ml / min
(correspondiente a un τ de 0,32 min) (Fig. 3). Los El aumento adicional de Qv, a valores
superiores a 728 ml / min, dio como resultado un reducción evidente de la tasa de
formación del producto, probablemente debido a la mayor turbulencia a altos
caudales, así como a la reducción de tiempo de contacto entre la proteasa
inmovilizada y el sustrato, conduciendo a la disminución de la Rp (Saponjid et al., 2010;
Zhou, Chen, & Yan, 2014). Por lo tanto, el Qv adecuado para lograr la reducción de
gluten en la cerveza auténtica a través del tratamiento en FBR fue de 728 ml / min.

3.5. Efecto del tratamiento continuo en reactor de lecho fluidizado sobre gluten de
cerveza contenido
Como se describe en la literatura, se lleva a cabo una reducción natural del gluten.
durante todo el proceso de elaboración (Di Ghionno et al., 2017; Watson et al.,
2018) En primer lugar, una disminución significativa generalmente ocurre durante el
malteado y macerado, cuando se activan las proteinasas endógenas de cebada
hidrolizar el gluten parcialmente a péptidos o completamente a aminoácidos
(Colgrave, Goswami, Howitt y Tanner, 2011; Hager et al., 2014; Tanner, Colgrave y
Howitt, 2014; Van Landschoot, 2011). Además,
Durante la etapa de filtración, la reducción del gluten se debe principalmente a
precipitación de proteínas (Steiner, Gastl y Becker, 2011). Una disminución adicional
tiene lugar durante la fermentación primaria del mosto, cuando mucho
 de este material proteináceo en el mosto se elimina con los granos gastados y la
ruptura en caliente (Kunze, 2004) o es levantado por la levadura durante la
fermentación para el metabolismo del nitrógeno (Lekkas, Hill, Taidi, Hodgson y
Stewart, 2009; Mo, Zhao, Lei y Zhao, 2013; Van Landschoot, 2011). Después de eso,
es probable que se reduzca el contenido de gluten durante la fase de maduración
debido a las bajas temperaturas que promueven la proteína-polifenol adicional
Complejos de sedimentación.

Por esta razón el tratamiento de cerveza en FBR, que contiene inmovilizado AN-PEP,
se realizó en una cerveza comercial tipo Pilsner siguiendo El paso de maduración. El
contenido inicial de gluten (65 mg / kg) se redujo lentamente, hasta alcanzar el nivel
de 19 mg / kg después de 9 hy 15 mg / kg después 10 h de tratamiento (Fig. 4). AN-PEP
inmovilizada, aplicada en continuo FBR, fue capaz de degradar el contenido de gluten
a una concentración inferior a 20 mg / kg, que corresponde a la cantidad establecida
por la Norma del Codex Alimentarius y el reglamento de la UE 828/2014 para GF food
(Shan, 2002).

A pesar de estos resultados alentadores, la presencia de inmunogénicos fragmentos

de gluten en la cerveza tratada (con un contenido final de gluten de 15 mg / kg) no
pudieron ser excluidos. Fiedler y col. (2019) recientemente probado que los péptidos
de gluten, que contienen posibles secuencias inmunopatógenas, han sido identificados
en cervezas tratadas usando AN-PEP en forma gratuita forma, seguido de filtración. En
este contexto, el uso de la espectrometría de masas técnicas para detectar péptido de
gluten en cervezas con gluten reducido, como sugerido por otros autores (Colgrave et
al., 2014, 2017; Tanner, Colgrave, Blundell, Goswami y Howitt, 2013), podrían
suministrar valiosos información sobre la naturaleza y la concentración relativa de
gluten y péptidos derivados del gluten.

4. Conclusiones

La producción de cerveza de alta calidad reducida en gluten sigue siendo una

problema desafiante, que es digno de una exploración seria para encuentre mejores
enfoques útiles para aplicar en la elaboración de la cerveza.
En este estudio, hemos demostrado que la enzima prolil endopeptidasa de Aspergillus
niger (AN-PEP), actualmente utilizado en el industria cervecera, podría aplicarse para
la producción industrial de GF cerveza también en forma inmovilizada. El tratamiento
continuo de la cerveza en un reactor de lecho fluidizado (FBR), que contiene el nuevo
inmovilizado de calidad alimentaria biocatalizador, permitió la reducción del
contenido de gluten en la cerveza comercial de malta de cebada, alcanzando el nivel
bajo mínimo (<20 mg / kg) solicitado para alimentos GF. De un industrial punto de
vista, este estudio preliminar abre un potencial nuevo biocatalítico enfoque para la
producción continua de cerveza GF.