Aula 1 Histórico e Fundamentos
Aula 1 Histórico e Fundamentos
Aula 1 Histórico e Fundamentos
CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL
Conceitos Fundamentais
Cromatografia
1900: Tswett, botânico polonês, trabalhando com colunas de
adsorção conseguiu separar pigmentos de plantas.
Para que serve?
• Técnica empregada na separação e identificação de
substâncias.
HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA
HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA
Cromatografia
Etapas do Processo
Cromatografia
Etapas do Processo
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Técnicas cromatográficas
Os métodos de identificação por cromatografia podem ser
classificados de diferentes formas.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel: a mais simples de todas, em que se
emprega o princípio da partição, empregando dois diferentes
líquidos:
• o primeiro ficará impregnado (fixado)na fase sólida (papel);
• o segundo será a fase móvel.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel: necessária a correta escolha do
solvente para fase móvel, garantindo uma melhor separação dos
componentes da mistura.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel : os compostos são separados entre a
fase aquosa estacionária e o solvente em movimento no papel.
• Ascendente;
•Descendente;
•Radial.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel – CUIDADOS
Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD): empregada em
análises qualitativas rápidas, é eficiente no isolamento de
pequenas quantidades de misturas complexas.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Aplicação da amostra:
Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Determinação da substância:
Cálculo do fator de retenção ou
retardamento (Rf).
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia Planar
Cromatografia em Coluna
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
De acordo com a classificação da fase móvel vimos que as
técnicas cromatográficas podem ser divididas em: líquida,
gasosa e fluido supercrítico. Estudemo-nas separadamente.
1)Cromatografia Líquida:
Na cromatografia líquida clássica o recheio da coluna é
utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra
é adsorvida irreversivelmente.
Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
utiliza-se uma coluna fechada, é portanto, reaproveitável
podendo ser usada centenas de vezes.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
1)Cromatografia Líquida
CLAE:
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
1)Cromatografia Líquida
Fase móvel para CLAE
oSolventes com alto grau de pureza, ou misturas de solventes,
observando a polaridade requerida na separação.
oTipos de eluição: isocrática (único solvente); com gradiente
(mais de um solvente é empregado e diferem entre si pela
polaridade).
oNormal ou reversa.
2) Cromatografia Gasosa (CG): é necessário verificar se a
substâncias a serem separadas são possíveis de ser arrastadas
pelo gás.
Precisam ser voláteis e termicamente estáveis,.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Cuidados Importantes:
• Escolha correta da coluna;
• Temperatura da coluna;
• Injeção;
• Tipo de detector;
• Temperatura do detector, da injeção;
• Determinação do tempo de retenção dos compostos.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Emprego:
Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico
Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico
Fluido
Supercrítico
Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico
Fase estacionária
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Técnicas Cromatográficas
CROMATOGRAFIA 1. Gás-Líquido
GASOSA 2. Gás-sólido
1. Líquido-líquido ou partição
CROMATOGRAFIA
2. Líquido-sólido ou adsorção
LÍQUIDA
3. Troca Iônica
4. Exclusão por tamanho
5. Afinidade
CROMATOGRAFIA
COM FLUIDO
SUPERCRÍTICO
Técnicas Cromatográficas
Cromatogramas
Quando um detector responde à concentração de um soluto,
ele responde no final da coluna registrando em função do tempo,
originando-se assim uma série de picos, conhecidos como
cromatogramas.
Técnicas Cromatográficas
Tempo de Retenção
A constante de distribuição não é facilmente medida, no lugar
dela é comumente utilizado o tempo de retenção.
ALARGAMENTO DA BANDA
A eficiência de uma coluna cromatográfica é afetada quando
ocorre um alargamento da banda, isto ocorre durante o tempo
que o composto passa na coluna.
ALARGAMENTO DA BANDA
O movimento da molécula através da coluna só ocorre
quando a molécula está em contato com a fase móvel. Desse
modo cada molécula percorrerá com uma velocidade específica.
VAZÃO DA
FASE MÓVEL
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
N = L /H (1)
CROMATOGRAFIA GASOSA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
GRADIENTE DE TEMPERTAURA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Fase Estacionária
Classificação das Técnicas Cromatográficas
Fase Estacionária
Classificação das Técnicas Cromatográficas
FASE ESTACIONÁRIA
Necessária correta escolha para uma melhor separação e picos
bem definidos.
Classificação das Técnicas Cromatográficas
FASE ESTACIONÁRIA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
FASE ESTACIONÁRIA
• Polaridade;
• Presença de aromaticidade;
• Pureza;
• Solubilidade.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
FASE ESTACIONÁRIA
FASE ESTACIONÁRIA
FASE ESTACIONÁRIA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Extração em
Soxhlet
Extração
com
cartuchos
Implantação do Método Cromatográfico
• Exatidão
• Precisão
• Linearidade
• Limites de Quantificação e de Detecção
• Especificidade / Seletividade
• Estabilidade
• Robustez
• Intervalo de trabalho / aplicação
Validação de Métodos Analíticos
PREPARAÇÃO DO PADRÃO
• Pesagem (se for o caso) em balanças de precisão;
• Vidrarias calibradas;
• Solventes de qualidade com grau de pureza para análise
cromatográfica.
LINEARIDADE: resposta obtida a partir de dados do analito,
que deve ter uma faixa de concentração bem determinada. Seu
estudo é realizado com base no cálculo do o coeficiente de
regressão linear (R2) para cada uma das curvas.
Deve-se observar a quantidade de pontos e o intervalo entre
eles.
A equação da reta terá a fora: y = ax + b, em que:
y é a variável dependente, x a variável independente, a o
coeficiente angular e b o coeficiente linear.
Validação de Métodos Analíticos
LINEARIDADE
EXATIDÃO
Exatidão =
EXATIDÃO
Teste t.
Em que:
X = é a média aritmética das n determinações;
s = desvio-padrão;
n = número de repetições;
μ = valor real.
EXATIDÃO
Teste t.
Sendo:
S = Valor da inclinação da curva analítica, s = desvio-padrão
Validação de Métodos Analíticos
SELETIVIDADE
Segundo Lanças, “a seletividade corresponde à capacidade de
um método em determinar de maneira inequívoca na presença
de outras substâncias de interferirem na determinação”.
Este parâmetro é de extrema importância quando se trata de
amostras complexas.
Alguns autores usam o termo especificidade, cabendo aqui
uma análise sobre os termos:
• Específico: método capaz de produzir a resposta para um
único analito;
• Seletivo: método capaz de fornecer uma resposta para um
grupo de entidades químicas que podem ser distinguíveis umas
das outras.
Validação de Métodos Analíticos
ROBUSTEZ
Este parâmetro trata da medida da capacidade de um método de
não sofrer alterações em decorrência de possíveis variações que
possam ocorrer durante a aplicação de um método.
Nem todos os procedimentos de validação exigem a
determinação deste parâmetro.
Por que incluí-lo? Este parâmetro permite medir a
confiabilidade do método em condições normais de operação
auxiliando quando:
ROBUSTEZ
o Temperatura da coluna;
o Fluxo da fase móvel;
o Composição da fase móvel.
Colunas e Suportes
DEQ/UFPE
A fase estacionária possui conceitos previamente estabelecidos,
ou seja, se essa fase for mais polar que a fase móvel ela é
chamada de fase normal. Se a fase estacionária for mais apolar
que a fase móvel é chamada de fase reversa (fase estacionária
quimicamente ligada).
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA
CLÁSSICA
DEQ/UFPE
FASE ESTACIONÁRIA
DEQ/UFPE
FASE ESTACIONÁRIA
DEQ/UFPE
FASE ESTACIONÁRIA
Importante:
O uso de suportes modificados, os quais foram
desenvolvidos como consequência do problema
acima, possibilita a produção de uma imensa
variedade de colunas. As fases assim obtidas são
chamadas de quimicamente ligadas.
DEQ/UFPE
FASE FASE
ESTACIONÁRIA ESTACIONÁRIA
SÓLIDA LÍQUIDA
ADSORÇÃO PARTIÇÃO
DEQ/UFPE
DEQ/UFPE
Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas
DEQ/UFPE
Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas
DEQ/UFPE
Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Gasosa: gás de
arraste)
Fatores importantes:
- Disponibilidade/custo.
- Eficiência na separação.
- Efeito sobre o tempo de análise.
- Segurança.
-Efeito sobre o sistema
de detecção
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida
DIAGNÓSTICO LENTO!
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida
FILTRAÇÃO
DEQ/UFPE
Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida
DEQ/UFPE
Fase móvel - CUIDADOS
O QUE FAZER?
•Vácuo
•Ultra-som
•Vácuo + ultra-som
•Purga com gás Hélio
•Escolha correta da velocidade do fluxo e da pressão de
operação
DEQ/UFPE
Constituição da coluna: aço inox 316, alumínio, níquel, vidro ou
teflon. Quando não se conhece bem o material o ideal é empregar
colunas de vidro.
DEQ/UFPE
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
DEQ/UFPE
IMPORTANTE: As colunas em cromatografia líquida
são sempre retas!
DEQ/UFPE
COLUNAS PARA CLAE
DEQ/UFPE
COLUNAS PARA CLAE
DEQ/UFPE
COLUNAS PARA CLAE
1. Há contaminação da coluna?
2. Onde ocorre? Entrada do leito.
DEQ/UFPE
O QUE A CONTAMINAÇÃO PODE CAUSAR?
• Perda da eficiência,
• Aumento de pressão,
• Cauda nos picos
Pontos negativos:
– Precipitação dos contaminantes / tampões
– Desnaturação de proteínas
– Remoção parcial da fase química ligada (hidrólise)
DEQ/UFPE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência –CLAE
DEQ/UFPE
COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA
DEQ/UFPE
COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA
As primeiras colunas TAPR foram construídas com aço
inoxidável, alumínio, cobre ou plástico, verificava-se
entretanto, um processo de corrosão no vidro de borossilicato
em presença de ácido clorídrico gasoso.
DEQ/UFPE
CUIDADO IMPORTANTE COM COLUNAS CAPILARES
CUIDADOS EM GERAL
DEQ/UFPE
CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES EM TORNOS DE COLUNAS
CROMATOGRÁFICAS
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa
Parâmetros de Injeção
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa
Parâmetros de Injeção
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
Cromatografia Líquida
CUIDADO: Sempre que possível dissolver a amostra na Fase Móvel ou em
solventes mais fraco.
DEQ/UFPE
Processo de injeção da amostra
QUESTIONAMENTOS NECESSÁRIOS
DEQ/UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química
Sistemas de Detecção: teoria,
características e aplicações.
DEQ/UFPE
DEFINIÇÃO DE DETECTOR: é um dispositivo conectado
na saída da coluna que percebe a presença de
componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na
forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade
do componente analisado.
São classificados em 3 tipos:
Universais – geram um sinal para qualquer composto.
Seletivos – geram um sinal apenas para compostos com
determinadas características.
Específicos – geram um sinal para compostos que tenham
um determinado elemento na sua estrutura.
DEQ/UFPE
DEQ/UFPE
Vários detectores têm sido estudados para aplicação em vários
modos cromatográficos:
•Espectrometria de massas(MS),
•Espectrometria de infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR),
•Detecção de absorção (UV),
•Detecção de ionização de chama (FID),
•Detector termoiônico (TID),
•Detector fotométrico de chama (FPD),
entre outros.
DEQ/UFPE
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Características de um Detector Ideal:
a)Alta sensibilidade e baixo limite de detecção;
b) Resposta rápida a todos os solutos;
c) Insensibilidade a mudanças nas temperatura e na vazão da fase
móvel;
d) Resposta independente da fase móvel;
e) Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra
da cela do detector;
f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto;
g) Não destruição do soluto;
h) Segurança e conveniência de uso;
i) Informação qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, não existe um detector que apresente todas
estas propriedades, a não ser que ele seja desenvolvido.
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
MAIS SENSÍVEL
E MAIS SELETIVO
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS)
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência
•Exemplo de um cromatograma
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores Eletroquímicos
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Ruídos provenientes do Detector
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector de Ionização de Chama (FID): Apresenta grande
aplicabilidade, alta sensibilidade, estabilidade e uma excepcional resposta
linear. Os íons são gerados pela combustão de compostos orgânicos na
chama. Não é uma queima que gere dióxido de carbono e água, mas uma
ionização propiciada pela alta temperatura da chama de hidrogênio.
TIPOS DE DETECTORES
Detector de Condutividade Térmica (TCD) : Nesse detector o gás a ser
analisado passa através do filamento, o qual é aquecido por uma corrente
elétrica constante. A velocidade das moléculas que batem no filamento é
função do peso molecular e, como resultado, quanto menor a molécula,
maior a sua velocidade e mais alta será sua condutividade térmica.
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector de Captura Eletrônica (ECD) : Trata-se de um dos detectores
mais populares devido a sua alta sensibilidade e utilidade para análise de
uma grande quantidade de compostos com atividade tóxica e biológica. É
muito utilizado para análise de traços de pesticidas, herbicidas, poluentes
gerados por processos químicos industriais, drogas e outros compostos
biologicamente ativos em fluídos biológicos. O princípio de detecção
usado é o decaimento de isótopos radioativos que produzem partículas
beta. Tais partículas colidem com as moléculas do gás de arraste
produzindo elétrons que formam uma corrente chamada de corrente de
fundo.
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector de Captura Eletrônica (ECD)
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector Fotométrico de Chama (FPD) : Este detector é usado para
compostos fosforados e sulfurados, e atua através da medida do espectro
de emissão de luz, emitida por estes compostos quando queimados em
chama rica de hidrogênio. Essas espécies quemiluminescentes emitam luz
a comprimentos de onda característicos para cada elemento. Quando
espécies contendo fósforo ou enxofre entram na chama, a emissão ocorre
e a luz é transmitida através de um filtro (que seleciona o espectro de
emissão a ser medido) para um fotomultiplicador.
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD): O TSD é um detector de ionização onde,
pela adição de um sal de metal alcalino (o rubídio) na chama, observa-se
um incremento na resposta do detector para certos elementos, tais como
fósforo, nitrogênio, enxofre, boro, como também para alguns metais, por
exemplo, estanho, antimônio, arsênio e chumbo. A seletividade da
resposta do detector é dependente da chama, da temperatura e da
composição do sal. Medidas precisas dos gases da chama são essenciais
para a sensibilidade do detector. Esse detector é muito utilizado em
análises ambientais e biomédicas para detecção de resíduos de pesticidas
e drogas, onde alta sensibilidade e seletividade são parâmetros
necessários.
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD)
DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA
TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD): é uma técnica utilizada para analisar uma
grande variedade de hidrocarbonetos aromáticos e outros compostos
orgânicos. Uma aplicação típica é a análise de contaminação da água por
hidrocarbonetos. O PID utiliza luz ultravioleta para ionizar os
componentes que saem da coluna. Os íons são coletados por eletrodos e a
corrente gerada mede a concentração.
DEQ/UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química
Espectometria de massas em
cromatografia
Modos de Injeção em cromatografia
gasosa
Prof. Daniella Carla Napoleão
DEQ/UFPE
Cromatógrafo a Gás acoplado a um
Espectrômetro de Massa
GC
MS
DEQ/UFPE
Cromatógrafo a Gás acoplado a um
Espectrômetro de Massa
Identificação Separação
DEQ/UFPE
Construção do GC-MS
Sistema de Vácuo
Forno
(Helio)
Controle do Instrumento
Aquisição de dados
Processamento de dados
Armazenamento de dados
Analista DEQ/UFPE
GC-MS
- Íon
negativo
DEQ/UFPE
GC-MS
Como se dá o processo de ionização no MS?
DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação
Metano:
CH4+
CH3+
CH2+
CH+
DEQ/UFPE
Exemplo de Ionização e fragmentação
Ionização e fragmentação de acetona
e-
(CH3)2CO [(CH3)2CO]+ [(CH3)CO]+ CH3
MW = 58 m/z = 58 m/z = 43 m = 15
Molécula Neutra Íon Molecular
Íon de Fragmento
m= massa do íon fragmento Neutro
z= carga do ion
DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação
Ionização Química Positiva
DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação
Ionização Química Negativa
Analitos
Elétrons de Captura de
baixa energia - Ressonância
e -
CH4
MX MX Associativa
Elétron
e -
MX
CH4 MX
de alta CH4
energia CH4
H - Captura de
Gás reagente CH4+ CH3+ M + X ressonância
Dissociativa
DEQ/UFPE
Sinal ou Ruído?
Ruído
Sinal
DEQ/UFPE
Precaução Geral para Manutenção em GC/MS
DEQ/UFPE
Condicionamento da Coluna: cuidados gerais
DEQ/UFPE
GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel
DEQ/UFPE
GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel
DEQ/UFPE
GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel
DEQ/UFPE
Cromatogramas
DEQ/UFPE
Cromatogramas
DEQ/UFPE
Cromatogramas
DEQ/UFPE
Cromatogramas em Massa
Recebe o nome de cromatograma em massa, aquele que é constituído
de todos os íons produzidos pelo espectrômetro de massas ou apenas
pelos íons de interesse produzidos por este. Comumente chamado de
“cromatograma de íons totais”.
Cromatograma e espectro
EM-EM de uma amostra
real de pimenta
contendo 0,05 mg kg-1 de
metalaxil e o espectro EM-
EM de referência do
metalaxil.
(Chiaradia et al., 2008)
DEQ/UFPE
Cromatogramas em Massa
DEQ/UFPE
Tipos de Analisadores de Massa
Quadrupolo
Em um valor
específico de
voltagem, íons de
uma determinada
razão m/z
DEQ/UFPE
Tipos de Analisadores de Massa
Analisador de tempo de vôo (“Time-of-Flight Analiser”) -
ATV.
“Baseiam-se no princípio de que, como os íons são gerados na
mesma fonte de ionização do espectrômetro de massas, eles
possuem a mesma energia cinética, de maneira que as suas
velocidades serão apenas diferenciadas pelas suas massas”.
(Chiaradia et al., 2008)
DEQ/UFPE
Tipos de Analisadores de Massa
Ion-trap
“ O ion-trap é um quadrupolo tridimensional que “captura” todos
os íons que são introduzidos em seu interior e os mantêm
“aprisionados” até que uma determinada radiofrequência seja
aplicada e torna os íons de certa razão m/z instáveis, de forma que
são libertados do trap”. (Chiaradia et al., 2008)
DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA
Injetor Split/Splitless
Fonte: SINC
DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA
Injeção Split
Fonte: SINC
DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA
Injeção Splitless
Fonte: SINC
DEQ/UFPE
LC/MS
Considerações Gerais:
•Apresenta vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois
os compostos não precisam ser vaporizados para a análise,
necessita-se menos pré-tratamento da amostra e tem maior grau de
seletividade;
•A limitação está na ausência de um detector universal como o
detector por ionização com chama na CG;
•A EM gera especificidade, seletividade e sensibilidade e
informação estrutural na análise de compostos orgânicos;
•A faixa de técnicas de ionização e a faixa de massa analisável,
permite a análise de um grande número de compostos orgânicos,
permitindo análise quali e quantitativa.
DEQ/UFPE
LC/MS
Fluxo
contínuo
Nebulizador
Feixe de partícula aquecido
Acoplamento Acoplamento com
via correia (“particle beam”) nebulizador aquecido Acoplamento e
ionização por
móvel
nebulização em um
campo elétrico
DEQ/UFPE
LC/MS
TIPOS DE INTERFACE
DEQ/UFPE
LC/MS
DEQ/UFPE
LC-MS- IT/TOF
HPLC
LC/MS-MS IT-TOF
DEQ/UFPE
LC-MS- IT/TOF
Exemplo de uma descrição de metodologia para detecção de fármacos
Empregou-se uma coluna do tipo ODS apresentando 50 mm
(comprimento) x 2 mm (diâmetro interno) x 3µm (espessura da fase
estacionária). A fase móvel utilizada foi composta de metanol e acetato de
amônio 2 mol.L-1, com fluxo de 0,2 mL.min-1. A temperatura do forno foi
mantida entre 40ºC e 85ºC; a fonte de ionização usada foi de Electrospray
e o intervalo de massas analisado foi de 100 a 400.
DEQ/UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
O QUE É ESSENCIAL PARA QUE UM MÉTODO ANALÍTICO FUNCIONE
BEM?
•Boa amostragem,
•Preparação,
•Solubilização da amostra para análise.
DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
QUE TIPO DE CROMATOGRAFIA SERÁ EMPREGADA?
DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Filtragem: procedimento simples em que deve ser observada o tipo de
filtração realizada e a capacidade de retenção do filtro.
TIPOS DE EXTRAÇÃO
A Extração Líquido-Líquido é simples de ser realizada no que diz respeito
aos procedimentos, porém de baixa recuperação e com demanda alta de
tempo para que possa ser realizada.
A Extração em Fase Sólida (EFS) é uma técnica de extração simples e
rápida que necessita de pequenas quantidades de solventes e uso de
cartuchos ou discos de extração e adsorventes, tais como C18, resina de
copolímero poliestireno, sílica, alumina B.
A Micro-extração em fase sólida (SPME) em cartuchos é muito utilizada, já
que necessita de pequenas quantidades de solventes e apresenta altos
valores de recuperação.
DEQ/UFPE
Análise Qualitativa e Análise Quantitativa
DEQ/UFPE
Análise Qualitativa
DEQ/UFPE
Análise Quantitativa
DEQ/UFPE
Medição Qualitativa – Cromatografia em Camada Delgada
DEQ/UFPE
Medição Quantitativa – Cromatografia em Camada
Delgada
•Extração Líquido-Líquido;
•Extração Sólido-líquido;
•Micro extração;
•Extração a frio;
•Extração a quente.
DEQ/UFPE
Técnicas de Isolamento
Recristalização
DEQ/UFPE
Técnicas de Isolamento
DEQ/UFPE
Técnicas de Isolamento
Para o isolamento de complexos ativos é comum empregar
técnicas como: sublimação, destilação fracionada, destilação pelo
vapor de água sobreaquecido, filtração por géis, eletrodiálise, e
eletroforese. Além de técnicas de cristalização e recristalização.
Estudemos um pouco mais sobre eletroforese: técnica de
separação de partículas carregadas eletricamente (+ ou -), quando
submetidas a um campo elétrico externo.
Os cátions migram para o catodo e os ânions para o anodo, a
velocidade de migração das partículas dependerá do equilíbrio
existente entre a força eletromotriz (FEM) existente entre o campo
elétrico e a força retardante.
Esta técnica é semelhante à cromatografia em papel, embora os
princípios sejam diferentes.
DEQ/UFPE
Técnicas de Isolamento
Eletroforese
DEQ/UFPE
Vimos em aulas anteriores que para identificar uma dada
substância é imprescindível realizar algumas determinações
previamente:
•Escolher corretamente o tipo de cromatografia a ser
empregada;
•Empregar uma coluna adequada, bem como a fase móvel a ser
utilizada;
•Dispor de solventes com alto grau de pureza;
•Verificar o volume e a técnica de injeção da amostra;
•Analisar e ajustar a temperatura do equipamento;
•Identificar a faixa de trabalho da curva analítica;
•Decidir sobre a necessidade de etapa prévia para a preparação
da amostra e qual técnica empregar;
•Escolher o padrão a ser analisado.
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Cromatografia Gasosa
DEQ/UFPE
Cromatografia Gasosa
DEQ/UFPE
No que diz respeito a escolha do padrão é preciso observar
os seguintes pontos:
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Determinação da concentração dos compostos de interesse
Método de cálculo empregado
Valor da área do pico cromatográfico
Equação da curva analítica (calibração).
Método validado.
Número mínimo de análises a ser realizada.
Reprodutibilidade.
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Testes Estatísticos
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Testes Estatísticos
Exercício: De posse dos dados apresentados na Tabela abaixo,
determine os valores de G<, G>. Verifique se estão em
concordância com o valor de referência.
Lembre que:
σ =
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Como calcular a área do pico cromatográfico?
A = (dT x Wb)/ 2
A = d x Wh
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Como calcular a área do pico cromatográfico?
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Exercício: Calcule o valor da área do pico para o paracetamol
e a cafeína, identificados segundo o cromatograma abaixo.
OBS: Utilize os 2 métodos das áreas segundo as retas
tangentes e o do peso do papel.
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