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C 81
C 81
C 81
MARINHA DO BRASIL
INSTITUTO DE ESTUDOS DO MAR ALMIRANTE PAULO MOREIRA
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA ASSOCIADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
MARINHA
ARRAIAL DO CABO / RJ
2019
1
ARRAIAL DO CABO / RJ
2019
2
COMISSÃO JULGADORA:
AGRADECIMENTOS
A minha mãe Berenice, por sempre está presente em todos os momentos da minha
vida. Por todo o seu amor, carinho, educação, respeito, força, dedicação, fidelidade,
confiança, loucura, desentendimento e principalmente por todo o seu apoio, sem ela
eu não seria a metade da mulher que sou.
A minha vózinha Benedita e as minhas tias-avós Rita e Marli, por serem as mulheres
mais extraordinariamente incríveis que conheci na minha vida. E principalmente por
me fornecerem todo o mimo que uma pessoa é capaz de receber em uma vida.
A meu pai por todo o amor e orgulho que sente por mim.
Ao meu avô Paulo, por ter plantado o amor pela leitura na minha vida.
A minha tia Lêda e sua família por ter sido meu suporte durante esse meu período no
mestrado.
A todos os meus tios e primos por todas as vezes que me acolheram, ajudaram e
torceram por mim.
À minha orientadora Profa. Dra. Cristiane Thompson, pela paciência, pelo incentivo,
pelo ensinamento, e por todos os lanches e conversas antes das aulas.
Pacheco, não poderiam ter escolhido pessoas melhores para entrar nessa jornada
comigo.
Aos membros da Banca, agradeço a presença e por terem aceitado participar deste
momento único da minha carreira.
RESUMO
O Banco dos Abrolhos cobre uma área de aproximadamente 48,000 km². Contém um
dos maiores e mais ricos complexos de recifes de coral do Atlântico Sul Ocidental. O
banco de rodolitos compõe o maior megahabitat presente no Banco de Abrolhos, com
extensão de aproximadamente 21.000 km. Rodolitos são estruturas calcárias
composto em sua maioria (> 50%) de algas vermelhas coralinas não-geniculadas. Os
rodolitos associam-se a um diverso consórcio microbiano, que desempenham um
papel fundamental no seu funcionamento. Tendo em vista a importância de
compreender melhor a microbiota e sua interação com os rodolitos, este trabalho teve
o objetivo de analisar genômicamente a diversidade das bactérias (vibrios) isoladas
dessas estruturas calcárias e entender sua atuação nesse holobionte. Estirpes de
vibrio foram isoladas de rodolitos coletados de Buracas, a 43m de profundidade em
Abrolhos. Uma coleção de 99 isolados bacterianos puros (G1 – G99) foi estabelecida,
cuja a prévia posição taxonômica destes foram determinadas pelo gene pyrH. Duas
bactérias dessa coleção (G62T e G98T) apresentaram potencial de serem espécies
novas. Seus genomas foram sequenciados, onde passaram por análises de
taxonomia genômica e caracterização fenotípica in silico para serem classificadas
taxonomicamente. Suas cepas passaram por análises comparativas utilizando
plataformas de bioinformática como o RAST e o antiSMASH, em buca de genes e
metabolismos de interesse biotecnológicos. Com base nos resultados apresentados
neste estudo, conclui-se que as linhagens G62T e G98T são novas espécies do gênero
Vibrio: Vibrio maerlii sp. nov. e Vibrio rhodolitus sp. nov. foram propostos,
respectivamente. A caracterização fenotípica in silico mostrou que sacarose,
celobiose, D-manitol e D-manose diferenciam G62T e G98T das espécies mais
próximas. Ambos apresentam cluster gênicos para bacteriocina, biotina e auxina.
G98T também apresenta metabolismo secundário para a produção de ectoína. G62T
apresentou cluster gênicos referentes a degradação de ureia, um dos metabolismos
mais estudados nas bactérias para o processo de biomineralização. Induzindo que
esta bactéria pode participar no processo de precipitação do carbonato de cálcio
presente nos rodolitos.
ABSTRACT
The Abrolhos’ Bank covers an area of approximately 48,000 km². Contains one of the
largest and richest coral reef complexes in the Western South Atlantic. The bank of
rhodoliths composes the largest megahabitat present in Abrolhos’ Bank, with an
extension of approximately 21,000 km. Rhodoliths are limestone structures composed
mostly (> 50%) of non-geniculate red coral algae. Rhodoliths associated with a diverse
microbial consortium, which play a key role in its functioning. Considering the
importance of a better understanding of the microbiota and its interaction with
rhodoliths, this work had the objective of genomic analysis of the diversity of the
bacteria (vibrios) isolated from these limestone structures and to understand their
performance in this holobionte. Vibrio strains were isolated from rhodoliths collected
from Buracas, 43m deep in Abrolhos. A collection of 99 pure bacterial isolates (G1 -
G99) was established, whose prior taxonomic position were determined by the pyrH
gene. Two bacteria of this collection (G62T and G98T), presented potential to be new
species. Their genomes were sequenced, where they underwent analyzes of genomic
taxonomy and phenotypic characterization in silico to be classified taxonomically. Their
strains have undergone comparative analysis using bioinformatics platforms such as
RAST and antiSMASH, in genes and metabolisms of biotechnological interest. Based
on the results presented in this study, we conclude that the G62T and G98T strains are
new species of the genus Vibrio: Vibrio maerlii sp. nov. and Vibrio rhodolitus sp. nov.
were proposed, respectively. The in silico phenotypic characterization showed that
sucrose, cellobiose, D-mannitol and D-mannose differentiate G62T and G98T from the
closest species. Both present clusters for bacteriocin, biotin and auxin. G98T also has
secondary metabolism for the production of ectoin. G62 T presented clusters of genes
related to the degradation of urea, one of the most studied metabolisms in bacteria for
the biomineralization process. Inducing that this bacterium can participate in the
process of precipitation of the calcium carbonate present in the rhodoliths.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11
1.1.2. Buracas 16
2. OBJETIVOS 24
3. MATERIAIS E MÉTODOS 25
3.7.1. IN SILICO 30
3.7.2. IN VITRO 30
4. RESULTADOS 31
5. DISCUSSÃO 45
6. CONCLUÕSES FINAIS 51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
1. INTRODUÇÃO
1.1. BANCO DOS ABROLHOS
O Banco dos Abrolhos fica localizado ao Sudoeste do Estado da Bahia e se
estende por toda a plataforma continental do leste do Brasil, cobrindo uma área de
aproximadamente 48,000 km² (17º20-18º10’S e 38º35’-39º20’O), a uma distância de
aproximadamente 70 km da costa (Figura 1) (Leão, 1999; Knoppers et al., 1999;
Remac, 1979). Contém um dos maiores e mais ricos complexos de recifes de coral de
todo o Atlântico Sul Ocidental, conhecido por seu conjuto de corais tomado por
espécies endêmicas brasileiras (Leão & Ginsburg, 1997). Abrigando diversas
espécies de mamíferos, tartarugas, peixes e invertebrados marinhos ameaçados de
extinção. Representa a principal área de reprodução de baleias-jubarte (Megaptera
novaeangliae) no Atlântico Sul, abrigando também um conjunto significativo de
espécies ameaçadas e de distribuição restrita, tais como o coral-cérebro (Mussismilia
braziliensis) (Hilton-Taylor, 2000; Moura e Lopes, 2009). Compreende um mosaico de
megahabitats (Figura 2) com alto nível de biodiversidade que se distribui desde a
região costeira até a quebra da plataforma. Composta por manguezais, recifes rasos
costeiros e externos, recifes mesofóticos externos, sedimentos inconsolidados, um
dos maiores bancos de rodolitos do mundo, estruturas parecidas como sumidouro
denominada de Buracas e o Talude (Secchin, 2011; Amado Filho et al., 2012; Moura
et al., 2013; Bastos et al., 2013). Esse mosaico de megahabitats interconectados
ecologicamente suporta uma alta diversidade, com um arranjo dinâmico
desempenhando um papel fundamental na manutenção de muitas comunidades
biológicas associadas, provendo vários bens e serviços naturais que são vitais para o
bem-estar e sobrevivência humana. Portanto, influenciando na dinâmica econômica e
social da costa leste brasileira, especialmente na pesca, uma das principais atividades
produtivas dessa região (Paiva e Fonteles-Filho, 1997; Costa et al., 2003; Bottécchia
et al., 1997; Roberts & Ormond, 1987; Myers, 1997; Jones & Syms, 1998 Moberg &
Folke, 1999; Moberg & Rönnbäck, 2003). Mais de 40.000 pessoas dependem do uso
direto dos recursos pesqueiros de Abrolhos, principalmente dos peixes recifais,
lagostas e camarões, cujos estoques já apresentam sinais claros de declínio (Moura
e Lopes, 2009).
Figura 3 - Ponto do estudo. (A) Banco de Abrolhos, ocupando um pouco mais 48.000
km2 da plataforma continental do leste do Brasil, onde o se localiza o maior banco de
rodolito do mundo, cobrindo uma área de aproximadamente 21.000 km 2. (B)
Fisionomia do banco de rodolitos de Abrolhos. (C) Rodolitos monoespecíficos
individuais.
1.1.2. Buracas
Buracas são estruturas em forma de taça encontradas no assoalho marinho
onde se acumula uma grande quantidade de matéria orgânica, assim servindo como
uma agregação de biomassa (Rede Abrolhos, 2016).
As numerosas estruturas semelhantes a sumidouros localizadas na costa
leste do Brasil foram inicialmente descobertas por pescadores locais, sendo uma das
principais áreas de pesca. As razões subjacentes para tais rendimentos crescentes
de pesca eram inicialmente incertos, já que os pescadores também relataram
diferentes corer e odores da água, um cheiro característico de “mangue” nestes
pontos muito específicos. Embora as Buracas agreguem peixes (recifes e pelágicos)
e lagostas, que são alvos importantes para a pesca comercial, essas estruturas se
encontram fora da rede existente de Áreas Marinhas Protegidas no Parque de
Abrolhos (Cavalcanti et al., 2013a).
Estudos recentes, sobre o levantamento geográfico da região do Banco de
Abrolhos, apontaram para um total de 36 estruturas de Buracas entre 41 e 161 km da
costa, entre 24 e 65 m de profundidade (algumas chegando até alcançar 93 m de
profundidade na sua parte inferior). Tendo sua parede composta praticamente por
algas calcárias e seu fundo com macroalgas em decomposição e rodolitos mortos
(Bastos et al. 2013).
No geral, as Buracas são divididas entre quatro zonas distintas (1 - Margem
Convexa; 2 - Zona de Declive Suave; 3 - Zona Mais Profunda e a 4 - Zona Inferior): 1)
gradualmente entremeada com o banco de rodolitos adjacente, algumas vezes com
afloramentos calcários emergentes de até dois metros; 2) composta principalmente
de calcário exposto incrustado por algas coralinas (~ 30º, 55 - 60 m de profundidade)
com alguma cobertura esparsa de rodolitos, manchas arenosas, corais e macroalgas;
3) com uma inclinação mais acentuada do calcário exposto (declive > 45º, 60-70 m)
e, 4) com uma camada de matéria orgânica em decomposição abundante
(principalmente macroalgas) sobre lama arenosa calcária e rodolitos mortos (Bastos
et al. 2013) (Figura 4).
(Thompson et al. 2009; Ivanova et al. 2014; Appolinario et al. 2016; Walter et al. 2017;
Nóbrega et al. 2018).
Como é claro, há uma grande variedade de usos para o Vibrio spp., Suas
proteínas ou produtos, ou o aproveitamento de suas propriedades metabólicas
específicas. Claramente, à medida que mais e mais espécies de vibrio são
descobertas a partir de ambientes extremos e os mecanismos de sua biologia são
elucidados, então o número e a complexidade de seus usos e aplicações também
devem seguramente ser aumentados.
2. OBJETIVOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
As Buracas onde os rodolitos foram coletados (Figura 5), tem sua parte mais
rasa à 27m de profundidade, e sua parte mais profunda à 43m de profundidade com
diâmetro de aproximadamente 40m (Cavalcanti at al. 2013a). Ao total foram coletados
cinco rodolitos, sendo dois na região mais rasa (S17.81330°/W38.23744°) e os outros
três na região mais profunda (S17.81399°/W38.24306°) das Buracas.
Tabela 2 - Lista dos iniciadores (primers) utilizados para amplificar o gene RNAr 16S
completo (1500 pb).
REGIÃO DO
PRIMERS SEQUÊNCIA REFERÊNCIA
RNAr 16S
LANE, 1991
Primeiro
26F 5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’ apud (BOURNE
terço direto
e MUNN, 2005)
28
Primeiro
(THOMPSON
519R terço 5’ GTATTACCGCGGCTGCTG 3’
et al., 2001)
reverso
Terço
(THOMPSON
536F central 5’ CAGCAGCCGCGGTAATAC 3’
et al., 2001)
direto
Terço final (THOMPSON
926F 5’ AACTCAAAGGAATTGACGG 3’
direto et al., 2001)
Terço
(THOMPSON
1093R central 5’ GTTGCGCTCGTTGCGGGACT 3’
et al., 2001)
reverso
LANE, 1991
Terço final 5’ TACGGYTACCTTGTTACGACTT
1492R apud (BOURNE
reverso 3’
e MUNN, 2005)
Fonte: Silva, 2012.
4. RESULTADOS
completo foi montado com um total de 62 contigs, com uma cobertura média de 94-
fold. O genoma do Vibrio rhodolitus tem o tamanho de 4.559.723 pb com uma
porcentagem de 45.2% de conteúdo G+C e comprimento de N50 de 161.850 pb. Sua
anotação do genoma identificou 4.085 CDS, 143 sequencias de RNA, onde 108 são
tRNAs e 24 são rRNAs (Tabela 3). Para ambos os genomas, identificamos a presença
de 106 de 111 genes essenciais. O CheckM estimava a completude do genoma em
99,07% (1,81% de contaminação) para G62T, e em 99,93% (0,58% de contaminação)
para G98T. Estes valores de genomas de alta qualidade foram verificados novamente
usando a coleção enveomics (Rodriguez-R & Konstantinidis, 2016).
Nº de
Nº de Nº de Nº de
Genoma Tamanho %GC N50 L50 Sequencias
Contigs Subsistemas RNAs
Codificantes
G62T 4,758,035 44.5 382658 4 49 523 4233 143
G98T 4,559,723 45.2 161850 9 62 515 4085 143
Figure 7. Árvore filogenética das sequências do gene RNAr 16S pelo método de
máxima verossimilhança baseado no modelo Tajima-Nei, e 1.000 réplicas bootstrap.
Valores de bootstrap são mostrados. Enterovibrio coralii LMG22228T e Aliivibrio
finisterresnsis CECT7228 foram utilizados como grupo externo.
35
Figura 8. Árvore filogenética das sequências do gene pyrH pelo método de máxima
verossimilhança baseado no modelo de tempo geral reversível (GTR), e 1.000 réplicas
de bootstrap. Valores de bootstrap são mostrados. Enterovibrio coralii CAIM912 e
Aliivibrio finisterresnsis CMJ11.1 foram utilizados como grupo externo.
36
G98T também revelaram baixa identidade: menos de 90% dos valores de identidade
AAI / ANI foram revelados pelo G62T e seus vizinhos mais próximos, assim como pelo
G98T e seus vizinhos mais próximos; e para as análises de GGD, G62 e G98
apresentaram valores menores que 42% com seus parentes mais próximos (Tabela
4). Estes resultados apoiam a conclusão de que os isolados G62 T e G98T são novas
espécies representantes do gênero Vibrio, designados por V. maerlii G62T sp. nov. e
V. rhodolitus G98T sp. nov.
Tabela 4 - Caracterização genômica do Vibrio maerlii G62T sp. nov. e Vibrio rhodolitus
G98T sp. nov. Valores de (%) da identidade média de aminoácidos (AAI), identidade
média de nucleotídeos (ANI), Hibridização de DNA – DNA (GGD) in silico, sequências
do gene RNAr 16S e sequências do gene pyrH entre G62T e G98T e seus parentes
mais próximos. Não há sequência do genoma disponível para Vibrio atypicus HHS02T.
na: (no apply).
V. maerlii G62T
Closest strain ANI (%) AAI (%) GGD (%) pyrH (%) 16S (%)
V. atypicus HHS02T na na na 89.0 99.0
V. tubiashii ATCC 19109T 82.15 72.41 29.8 88.0 99.0
V. hepatarius LMG 20362 80.7 72.13 27.9 na 98.0
V. antiquarius EX25 81.07 72.26 27.8 na 98.0
V. parahaemolyticus ATCC 81.01 72.07 28.1 88.0 na
17802T
V. brasiliensis LMG 20546 81.64 72.94 28.9 88.0 na
V. splendidus ATCC 33125T 80.68 71.9 27.3 88.0 na
V. xuii LMG 21346 T 82.12 73.13 29.8 na 99.0
V. rhodolitus G98T
Closest strain ANI (%) AAI (%) GGD (%) pyrH (%) 16S (%)
V. ponticus CECT 5869T 88.84 89.61 41.2 92.0 99.0
V. furnissii ATCC 19109T 78.76 72.19 25.3 na 98.0
V. hyugaensis 090810T 81.85 73.47 29.8 90.0 97.0
V. fluvialis ATCC 33809T 78.93 72.65 26.0 92.0 98.0
V. harveyi ATCC 14126 82.06 73.27 29.3 90.0 na
V. rotiferianus CAIM 577T 82.4 73.75 29.8 90.0 na
V. natriegens CCUG 16371 81.65 73.31 29.5 na 98.0
V. maerlii G62T
ANI (%) AAI (%) GGD (%) pyrH (%) 16S (%)
V. rhodolitus G98T 80.74 71.88 26.9 86.7 97.7
39
Figura 10 – Teste de motilidade das estirpes G62T e G98T por inoculação por picada
em tubos em meio semissólido Marine Ágar. Resultados são positivos por apresentar
crescimento difuso que se estende da linha de facada em comparação a negativo
onde não há crescimento fora da linha traçada anteriormente.
100% de veracidade, apenas 3 clusters presentes nas amostras, nas quais ambas
deram positivas para bacteriocina e a amostra G98T apresentou um cluster
identificado para ectoína.
62 98
transporter). Das oitos funções citadas, apenas duas (UC e AH) possuem informações
sobre suas reações nesse processo. A sequência dos genes relacionados à
decomposição da ureia presente na cepa G62T encontra-se no Apêndice B.
Papel
UC AH AMT UCTsb UCTp UCTa UreJ
Funcional
Código de
anotação no
665 666 663 664 660 661 662 535
RAST de cada
cluster
5. DISCUSSÃO
suas linhagens mais próximas, como o AAI e o ANI. O ANI foi utilizado por fornecer
um meio confiável para discriminar populações estreitamente relacionadas,
oferecendo uma maior resolução do que o gene 16S rRNA ou análise de sequência
multilocus (Rodriguez-R & Konstantinidis, 2014). Enquanto o AAI que calcula as
proteínas conservadas entre os genomas apresenta uma das análises de maior
resolução taxonômica para descriminar espécies de vibrios (Thompson, 2009). G62T
apresentou maior identidade de ANI com Vibrio tubiashii ATCC 19109T (82.15%) e
maior similaridade de AAI com Vibrio xuii LMG 21346T (73.13%), enquanto G98T, tanto
ANI como AAI, apresentou maior identidade com Vibrio ponticus CECT 5869T (88.84%
e 89.61%), respectivamente. Tipicamente, os valores de ANI e AAI, quando
apresentam valores maiores de 95% de similaridade entre os genomas analisados,
são classificados como da mesma espécie. Portanto, esses valores representaram
mais um tipo de validação para a hipótese das espécies novas.
Para obter uma melhor compreensão da interação ecologica dessas novas
cepas, análises voltadas para suas características fenotípicas foram investigadas.
Uma dessas análises foi através da comparação do genomas das estirpes G62 e G98,
no qual as características fenotípicas diagnósticadas analisadas, neste trabalho,
foram um reflexo da informação do seu genoma, observando uma correlação clara
entre a presença dos genes e os seus respectivos fenótipos (Amaral et al., 2014).
Utilizado características-chave de espécies tipos de vibrios mais próximas como base
de diagnóstico fenotípicos dessas novas cepas descritas.
5.2. BUSCA POR GENES E ATIVIDADES METABÓLICAS COM POTENCIAL
BIOTECNOLOGICO
As diferentes análises comparativas voltadas ao conhecimento dos genomas
das cepas G62 e G98, mostraram que cada uma delas possuem características
próprias e distintas.
Diferentes metabolismos podem se combinar para produzir a precipitação de
minerais em ambientes naturais complexos. O papel principal das bactérias no
processo de bioprecipitação tem sido associado à sua habilidade em criar ambientes
alcalinos e incrementar a concentração e dissolução do carbono inorgânico por meio
de várias atividades fisiológicas (Hammes, 2003).
Por serem bactérias isoladas de rodolitos, questionamos se essas novas
espécies de vibrio (V. maerlii e V. rhodolithus) apresentavam algum metabólito que
auxiliava na bioprecipitação do carbonato de cálcio (CaCO3) presente na estrutura dos
49
Apesar de apresentar enzimas que são capazes de degradar ureia, não tem
como afimar a partir dessas características que o Vibrio maerlii G62T colabora com o
processo de biomineralização de carbonato de cálcio presente nos rodolitos, pois além
das enzimas apresentadas não terem suas funções e estruturas bem conhecidas;
sabe-se que para que ocorra o processo químico da biomineralização os MICP
precisam de quatro fatores principais: concentração de Ca2+; concentração de
carbono inorgânico dissolvido; pH e a disponibilidade de sítios de nucleação (Hammes
e Verstraete, 2002). Portanto, há necessidade de realizar mais análises voltadas para
o teor químico dessa bactéria. Assim, essa pesquisa servindo como sinal para um
possível potencial dessa espécie, pois qualquer progresso biotecnológico inicia-se a
partir da procura e da descoberta de algum fenômeno biológico que possa ser
explorado. Portanto, um planejamento eficiente e uma otimização dos programas de
pesquisa visando à busca e à descoberta desses potenciais biotecnológicos são tão
cruciais quanto qualquer outra etapa nesse processo (BULL et al., 1992).
51
6. CONCLUÕSES FINAIS
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61
MEIO DE IDENTIDADE
ISOLADOS PROFUNDIDADE
CULTIVO pyrH
G1 27m Marine V. owensii
G2 27m Marine V. harveyi
G3 27m Marine V. owensii
G4 27m Marine V. owensii
G5 27m Marine V. harveyi
G6 43m Marine x
G7 43m Marine V. harvey
G8 43m Marine V. harvey
AAAGTAGTACTGATTGTGATAGGCGTGTGTCCGATCATCATTCGAGACATTCAGCTGAGG
GTGCAGAGCCTACCGGATGAGCAGCTTATTAAGGCGCAAACACTGGGCGCAAACAGCTGG
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