Livro Métodos Cromatográficos
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Métodos Cromatográficos
12
História
Educação
Física
1a Edição
Fortaleza Geografia
12
2019
História
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Física
Ciências Artes
Química Biológicas Plásticas Computação Física Matemática Pedagogia
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Projeto Gráfico e Capa
Roberto Santos Romeu Gomes (FIOCRUZ)
Diagramador Túlio Batista Franco (UFF)
Francisco Oliveira
Revisora
Ana Cristina Callada Magno
Capítulo 3 – Chromatotron..................................................................31
Apresentação...................................................................................................33
Sobre a autora....................................................................................84
Apresentação
A cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo físico-
químico de separação, o qual é baseado principalmente nos fenômenos de
adsorção e partição.
O objetivo desta publicação é registrar de forma concisa a grande
varie- dade de combinações entre a fase móvel e fase estacionária que
proporciona um grande número de aplicações da cromatografia.
A forma como está organizado o livro evidencia os conceitos básicos,
as técnicas cromatográficas mais simples e por fim faz-se uma introdução
ás técnicas mais sofisticadas, de forma a contribuir para o seu
aprendizado.
Ao longo de algumas unidades, foram selecionadas algumas aplicações
práticas da cromatografia para um melhor entendimento e fixação dos
conteúdos.
Finalizando gostaria de agradecer a todos os que de forma direta
ou indireta contribuíram para este trabalho.
A autora
Capítulo 1
Introdução a métodos
cromatográficos
9
Métodos Cromatográ
Introdução
A cromatografia pode ser definida como um método físico-químico de sepa-
ração, fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma
mis- tura. Esta migração diferencial se deve a diferentes interações entre
a fase móvel e a fase estacionária.
Os componentes de uma mistura se distribuem entre a fase1 móvel e 1
A grande variedade de
a fase estacionária de tal forma que cada um dos componentes é retido combinações entre a fase
seletiva- mente na fase estacionária, resultando em migrações móvel e a fase estacionária
proporciona um grande
diferenciadas. número de aplicações
A Figura 1 a seguir ilustra a separação de misturas por interação dife- cromatográficas.
rencial dos seus componentes com uma fase estacionária (líquido ou
sólido) e uma fase móvel (líquido ou gás).
1. Histórico
Em 1906, o botânico russo Mikael S. Tswett usou o termo cromatografia
para apresentar suas experiências com extratos de folhas. Neste
experimento, Tswett usou colunas de vidro contendo carbonato de cálcio
(fase estacioná- ria) e adicionou o extrato no topo desta coluna como se
quisesse fazer uma filtração, em seguida acrescentou éter de petróleo
(fase móvel).
Desta forma, observou várias faixas coloridas ao longo da coluna.
Pos- sivelmente este é motivo pelo qual a técnica foi denominada de
cromatografia. Os termos derivam das palavras gregas chrom (cor) e
grahie (escrita), entre- tanto o processo não depende da cor.
10 AMORIM, A.F.V. DE
2. Tipos de cromatografia
Em relação à forma física do
sistema, a cromatografia pode ser
dividida em cromatografia em
coluna e cromato- grafia planar.
Enquanto a cromatografia planar
divide-se em cromatografia em papel
(CP), cromatografia em camada
delgada (CCD) e cromatografia
chro- matotron, a cromatografia em
coluna divide-se em cromatografia
líquida, cro- matografia supercrítica e
Figura 3 – Representação esquemática dos diferentes tipos de
cromatografia. cromatografia gasosa, que se
subdividem de acordo com critérios
de separação que serão estudados mais
detalhadamente.
11
Métodos Cromatográ
3.1. Adsorção
Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um
só- lido (adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou
um gás, por meio de interações como as “forças de Van
Der Waals”. Temos, como exemplo, a adsorção de gases e
vapores em car- vão ativo, bastante utilizado em residências
para remoção de odores em exaustores de fogão. A sílica
gel ou sílica e a alumi- na são bastante utilizadas como
adsorventes em cromatografia.
Nas separações por adsorção, as substâncias são
forte- mente adsorvidas e, em alguns casos, poderão ocorrer
dificul- dades no processo de dessorção dessas substâncias. Figura 5 – Mecanismo de adsorção
A subs- tância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente
arrastada pela fase móvel.
3.2. Partição
O mecanismo de separação neste tipo de cromatografia, ou mecanismo
de distribuição, como também é chamado, baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e
na fase estacio-
12 AMORIM, A.F.V. DE
4. Fases estacionárias
Diversos materiais foram estudados e estão sendo empregados como
fases estacionárias em cromatografia. A fase estacionária é um sólido
(Cromato- grafia de Adsorção) altamente poroso, ou, mais comumente, um
líquido (Cro- matografia de Partição). No segundo caso, o líquido é
depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais adiante.
Os principais fatores em uma fase estacionária que determinam a
se- paração cromatográfica de uma mistura são: Interações entre dipolos,
polari- dade e pontes de hidrogênio. As figuras 10 (a) e 10 (b) a seguir
esclarecerem a influência da polaridade e da ponte de hidrogênio sobre a
separação. Em ambos, são usadas fases estacionárias polares, os picos
aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no
Cromatograma b, como a fase estacionária (diglicerol) interage com o
etanol fazendo ponte de hidro- gênio, o tempo de retenção deste aumenta
consideravelmente. Esses fatores também são dependentes da
temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa variável.
Figura 10 – Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre Fase Estacionária
(FE) e etanol
Fonte - Alexandre Schuler – Cromatografia, p. 17. 3ª ed. UFPE - 2007.
(ou siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra fase também bastante
utili- zada é o polietilenoglicol (Ex.: Carbowax 20M).
Sílica
A sílica é formada por unidades – SiO4 possui um caráter fracamente ácido,
pode ser usada na separação de compostos, como aldeídos, cetonas,
fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides e esteroides. A
técnica cromatográfica que utiliza a sílica é principalmente a CCD e
Cromatografia em coluna.
Celulose
A celulose é um biopolímero de glicose que apresenta ligações cruzadas de
ponte de hidrogênio e grupos hidroxilas que podem ser quimicamente
modifi- cados, podendo ser ligada covalentemente a grupos com cargas
positivas ou negativas.
Tipos:
Trocador aniônico: dietilaminoetil - celulose (DEAE - celulose).
Trocador catiônico: carboximetil - celulose (CM - celulose).
19
Métodos Cromatográ
Gel de dextrana
É um polissacarídeo com unidades de glicose, obtido por fermentação de
sa- carose, sendo conhecido comercialmente por Sephadex. Apresenta
diferen- tes diâmetros de partícula e separa substâncias de acordo com o
tamanho e formas moleculares.
Sílica modificada
Utiliza-se de grupos clorodimetilalquisilanos ou cloroalcóxisilanos para
trans- formar a fase estacionária polar (Si-OH) em apolar (Si-O-Si(CH3)2-
R).
Adsorventes quirais
Utilizam moléculas quirais ligadas à matriz, geralmente sílica. São
utilizados na separação de enantiômeros através de diversos mecanismos.
4.4 Suporte
O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É
ne- cessário que o suporte seja quimicamente e também cataliticamente
inerte. O material a ser usado também não pode apresentar área
superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem grande poder de
adsorção. Centros ativos (ácidos ou básicos) podem provocar modificações
estruturais na amostra, de- vendo ser removidos.
20 AMORIM, A.F.V. DE
1. Classificações
Em se tratando de fase móvel, têm-se três tipos de cromatografia: a
croma- tografia líquida, a cromatografia gasosa e a cromatografia
supercrítica, usan- do-se na última um vapor pressurizado, acima de sua
temperatura crítica. A cromatografia líquida apresenta uma importante
divisão: a cromatografia líqui- da clássica (CLC), na fase móvel é
arrastada através da coluna apenas por força da gravidade, enquanto
que, na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utiliza-se fases
estacionárias de partículas menores, sendo necessá- rio o uso de uma
bomba de alta pressão para eluição da fase móvel.
Na cromatografia gasosa, as separações podem ser obtidas por
croma- tografia gasosa simples (CG) e por cromatografia gasosa de alta
resolução (CGAR). A diferença entre as duas reside nos tipos de colunas
utilizadas. Na CGAR, são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase
estacionária é um filme depositado na coluna.
2. Cromatografia planar 2
Na cromatografia em
2.1. Cromatografia em papel papel a fase estacionária é
a celulose. É uma técnica
A cromatografia em papel2 (CP) é uma técnica de partição líquido– simples e precisa de
líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. O suporte é saturado poucos instrumentos para
realização.
em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel
de filtro). Este método, embora menos eficiente que a CCD, é muito útil
para a separação de compostos polares.
Utiliza-se pequenas quantidades de amostras (microgramas a
miligra- mas) retiradas com pequenos capilares de vidro que são
depositadas sobre faixas de papel de filtro e em seguida colocadas em
cubas de vidro contendo a fase móvel, como pode-se observar na Figura
15. Após o deslocamento por capilaridade da fase móvel pela fase
estacionária, o papel é retirado da cuba (as manchas podem ser reveladas
por meio de luz UV, vapores de iodo, solu- ções de cloreto férrico e
tiocianoferrato de potássio, etc).
24 AMORIM, A.F.V. DE
3. Atividades de avaliação
Objetivos
Demonstrar, por meio de materiais simples, a técnica da cromatografia
em papel.
Verificar as cores que compõem as canetas esferográficas.
Utilizar a cromatografia como processo de separação.
Materiais necessários
canetas esferográficas (Bic – preta, roxa, rosa, verde e azul)
Proveta de 10 mL
Proveta de 100 mL
fita adesiva (50 cm)
frasco de vidro (de café solúvel; pelo menos 14 cm de altura) e um
becker de 250 mL
2 palitos usados na manicure ou 2 lápis
papel-alumínio (30 cm)
papel de filtro (em branco)
porta-filtro e filtro de papel
régua
tesoura
álcool etílico 96° GL (100 mL)
bicarbonato de amônio – NH4HCO3 – (10 g).
Procedimento
a) Cortar, do papel de filtro, uma tira de 5 cm de largura e 21 cm de
compri- mento. Enrolar a extremidade superior no lápis ou caneta de
modo que a parte posterior não ultrapasse 3 cm e fixá-la com um
pedaço de fita ade- siva. Cortar o papel em um comprimento tal que
sua extremidade inferior fique a aproximadamente 0,5 cm do fundo do
frasco de vidro a ser utilizado.
25
Métodos Cromatográ
Tabela 1
Solventes para cromatografia em ordem crescente de polaridade*
Solvente
Éter de petróleo
Ciclohexano
Tetracloreto de carbono
Benzeno
Cloreto de metileno
Clorofórmio
Éter etílico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
Álcool n-propílico
Etanol
Metanol
Água
Ácido acético
*Polaridade, neste contexto, só tem sentido para a cromatografia e não coincide, necessariamente, com a
polaridade medida, por exemplo, pela constante dielétrica.
28 AMORIM, A.F.V. DE
Aplicações da CCD
Separação de corantes
Este experimento mostra uma técnica adequada para a separação de
subs- tâncias misturas por CCD.
Materiais necessários
Placas de sílica gel
cuba cromatográfica
Micropipetas ou microcapilares
Soluções de indicadores (~0,1% aquoso): azul de bromofenol, vermelho
do congo e vermelho de fenol
Mistura (M) de soluções dos três indicadores
Solvente de desenvolvimento: 1-butanol: etanol: amônia 0.2 M (60 : 20 :
20:) por volume.
Procedimento
Coloque o solvente de desenvolvimento na cuba cromatográfica até
cerca de 0,5 de cm de altura e feche-a com a tampa. Pegue uma placa
com sílica gel e aplique cuidadosamente cada um dos indicadores, com
auxílio de uma micropipeta, em pontos na linha de origem. Espere secar e
coloque a placa na cuba. Deixe o cromatograma se desenvolver por cerca
de uma hora usando a técnica ascendente. Remova a placa, marque a
frente do solvente e seque a placa em uma estufa a 60 °C por
aproximadamente 15 minutos. Meça o valor de Rf de cada um dos
indicadores.
Pegue uma segunda placa e aplique, com uma micropipeta, 5 µl
da mistura M em três pontos separados da linha de origem. Coloque a
placa seca na cuba cromatográfica, tampe e deixe o cromatograma se
desenvolver por aproximadamente uma hora. Remova a placa e coloque
na estufa para secar por 15 minutos. Identifique os compostos separados
usando seus valores de Rf. (VOGEL, 2002, p. 141-142.).
Separação de carboidratos
Os carboidratos usados neste experimento produzem manchas bem
defini- das com boa separação entre elas.
Materiais necessários
Placas de terra diatomácea (Kieselgel G ou Kieselguhr G)
Cuba cromatográfica
Micropipetas ou microcapilares
29
Métodos Cromatográ
Materiais necessários
Placas para CCD com cobertura de sílica gel 20 cm x 20 cm
Cuba cromatográfica
Micropipetas ou microcapilares
Bécheres de vidro de 100 mL
Um conjunto padrão com oito corantes em solução 1% em água e
uma mistura apropriada.
Solvente de desenvolvimento: propanol: amônia (4 : 1).
Procedimento
Coloque 5 g de cada confeito colorido em um becher separado contendo 10
mL de água deionizada. Deixe por 5 minutos agitando levemente, tome
cuidado para não desintegrar os confeitos. Decante a solução para outros
bécheres e deixe de- positar o pó suspenso até a solução clarear. Se
necessário, decante novamente. Concentre as soluções em um banho de
água até o volume de 1 mL.
Aplique 20 µl de cada extrato na placa de CCD juntamente com os
padrões de corante ou com a mistura de corantes. Desenvolva o
cromato-
30 AMORIM, A.F.V. DE
Atividades de avaliação
Objetivo
Demonstrar experimentalmente a preparação artesanal de placas para uso na
cromatografia em camada delgada.
Procedimento
1. As placas limpas e secas não devem ser tocadas com os dedos. Segure-
-as pelas bordas.
2. Misture num béquer 30 g de sílica gel com 60 mL de água destilada
até obter uma suspensão homogênea.
3. Mantendo-se as placas em posição horizontal, transferir uma porção
ade- quada da suspensão para a superfície das placas, espalhando-a
uniforme- mente com o auxílio de um bastão de vidro.
4. Para facilitar a distribuição homogênea da suspensão, manter a placa
apoiada sobre a bancada, erguendo-se alternadamente as
extremidades até que visualmente toda a superfície esteja uniforme. A
espessura do re- cobrimento deve ser aproximadamente 0,3 mm.
5. Repousa-se a placa em uma superfície plana horizontal e deixa-se secar
ao ar durante 15 a 30 minutos, quando o adsorvente adquire uma
aparência opaca.
6. Para serem utilizadas, as placas devem ser ativadas por aquecimento
em uma estufa a 110 oC durante 30 minutos. Este processo visa
eliminar toda a água adsorvida no suporte.
As placas assim preparadas estão prontas para uso e podem ser
guar- dadas em lugar protegido, tomando-se o cuidado para não tocar,
contaminar ou ferir a camada de adsorvente.
Capítulo 3
Chromatotron
33
Métodos Cromatográ
Apresentação
Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada
cen- trifugamente. Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic
Syn- thetic Methods. Substitui as CCD preparativas, pequenas colunas e
CLAE.
6
Deve-se evitar deixar
a coluna secar durante Durante o enchimento, o ar pode ficar retido entre as partículas.
o enchimento ou a Para evitar que isso ocorra, deve-se agitar o adsorvente num frasco, com a
eluição, porque aparecem fase mó- vel, até a constituição de uma pasta, a qual será colocada dentro
rachaduras na coluna,
o que prejudicará a da coluna6, já contendo 1/3 da fase móvel.
separação cromatográfica.
Atividades de avaliação
Objetivo: Separação da mistura de o- e p-nitrofenol por cromatografia
em coluna clássica.
Procedimento
1. Preparação da coluna
a) Colocar um pequeno chumaço de algodão na base inferior da coluna
com a ajuda de um bastão de tamanho adequado. Encher a coluna até
cerca de 1/4 com hexano. Testar se a torneira não apresenta
vazamentos.
b) Pesar aproximadamente 20 g de sílica-gel em béquer de 100 mL;
adicionar hexano em quantidade bastante para formar uma papa
homogênea;
c) Abrir a coluna de modo a gotejar o solvente em um frasco Erlenmeyer
du- rante o processo de empacotamento.
40 AMORIM, A.F.V. DE
Reorganizando os conceitos
1. Baseado em argumentos estruturais, comente sobre a separação
croma- tográfica do o-nitrofenol e p-nitrofenol. Que outras diferenças
nas proprie- dades físicas desses dois isômeros podem ser explicadas
usando-se os mesmos argumentos? (Pesquisar dados sobre PE e PF
do o-nitrofenol e p-nitrofenol no Índice Merck,).
Capítulo 5
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
43
Métodos Cromatográ
b) Sistema de desgaseificação
8
A não degasagem A Fase Móvel deve ser desgaseificada8 para evitar a formação de bolhas, as
do solvente pode criar quais podem provocar cavitação (com consequente dano à bomba) ou
perturbações durante a
análise no nível da bomba e gerar picos falsos, ao passarem pela célula do detector. São conhecidas
no nível do detector várias téc- nicas de desgaseificação:
aquecimento com agitação
borbulhamento de gás hélio
ultra-som
vácuo
c) Bomba
O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada
por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção
(para evitar vaporização de fase móvel mais volátil) e a vazão (importante
quando a análi- se é realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso
há necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante).
d) Válvula de injeção
A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto a
pres- são de trabalho raramente é menor que 20 atmosferas.
e) Coluna
As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento
ra- ramente ultrapassa 30 cm, ocupando, portanto, muito pouco espaço no
equi- pamento. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas
com su- portes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração
após cada separação.
47
Métodos Cromatográ
f) Detector
O detector9 mais utilizado para separações por CLAE é o detector de 9
Detectores são
ultra- violeta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de dispositivos que examinam
continuamente o material
índice de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de eluído, gerando sinal
polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam quando da passagem de
substâncias que não são o
compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente luz gás de arraste.
plano-polarizada.
Figura 28 – Registro de
separa- ção de substâncias
por CLAE variando a
concentração de metanol e
ácido acético.
2.1. Reservatório da fase móvel
O reservatório pode ser um frasco de solvente bem limpo (Figura 29).
Para análise de íons não se utiliza reservatório de vidro comum, para
evitar que a solução tenha íons provenientes da parede do reservatório.
Utiliza-se frasco de frasco de polietileno quando se trabalha com soluções
tampão, soluções contendo íons F- ou soluções levemente alcalinas.
Não se deve lavar o reservatório com solução sulfocrômica, nem
muito alcalina, pois estas corroem as paredes internas, favorecendo a
transferência de íons para a solução.
O volume desses frascos varia de 1 a 3 litros de capacidade, o
que normalmente é suficiente para um dia de trabalho. A captação da fase
móvel é feita através de filtro, para remover partículas que possam obstruir
e estragar o sistema de bombeamento e a coluna. Este filtro deve ter a
capacidade de reter partículas sem produzir queda excessiva de pressão.
As fases móveis polares têm tendência a dissolver oxigênio e
outros gases. Se esses gases são liberados dentro do equipamento, formam
bolhas e podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da
coluna. Por esse motivo é necessário remover os gases dissolvidos na
fase móvel. Em muitos equipamentos, o próprio reservatório está
condicionado a efetuar a remoção, por exemplo, pela aplicação de vácuo
no reservatório e agitação da fase móvel sob ação de ultra-som e/ou
aquecimento. O problema da forma- ção de bolhas tem sido reduzido pela
adição de um filtro na saída do detector, o que restringe um pouco a vazão
e produz uma pequena pressão na cela do detector, impedindo a
formação de bolhas.
49
Métodos Cromatográ
10
Analito é a parte da 3. Detectores usados em CLAE
amostra que é o foco da
análise química.
Os detectores têm a função de monitorar o efluente da coluna e fornecer
a medida detectada do soluto. O seu funcionamento é de acordo com
diferentes princípios, mas todos geram um sinal elétrico que é
proporcional a alguma propriedade do analito10. A resposta do detector
pode ser relacionada com a quantidade de analito, portanto o detector deve
ser calibrado com cada espé- cie de interesse, portanto a escolha do
11
De uma forma ideal,
cada substância separada detector é de acordo com as caracte- rísticas dos analitos.
aparece como um pico no Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE,
cromatograma.
um detector ideal seria aquele com as seguintes características11:
Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
Boa estabilidade e reprodutibilidade.
Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
Tempo de resposta curto e independente da vazão.
Alta confiabilidade e facilidade de uso.
Similaridade de resposta para todos os solutos.
Não destrutivo.
Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Desvantagens
Sensibilidade menor que UV.
Sensível a diferenças de T, vazão e pressão da FM.
Não permite fazer gradiente.
b) Detector Amperométrico
Um potencial conhecido é aplicado através de um eletrodo (Ex: carbono
ví- treo), e a ocorrência de redução ou oxidação de uma espécie pode ser
medi- da. O potencial do eletrodo de trabalho e auxiliar é mantido
constante. Geral- mente, o trabalho é limitado a uma classe específica em
cada análise.
c) Detector de Condutividade
Adequado para a detecção de íons em solução. Baseia-se na medida da
con- dutância (G) das soluções eletrolíticas dos efluentes da coluna ou
supressora. A Lei de Ohm [I = (V-Ed)/R] é obedecida e a corrente medida
(I) dependerá do potencial aplicado entre os dois eletrodos.
Aplicações da CLAE
Atividades de avaliação
Objetivo
Buscar artigos científicos que mostrem a determinação de cafeína por CLAE.
A cafeína é um alcaloide encontrado em bebidas como café, chás,
refrigeran- tes, etc. Quando ingerida, atua como diurético e como
estimulante do sistema nervoso central e cardiovascular.
Reorganizando os conceitos
Com base no artigo científico, responda as seguintes perguntas:
1. Qual o tipo de equipamento utilizado na determinação da cafeína?
2. Qual o detector escolhido?
3. Qual o tipo de coluna utilizada?
4. Qual a fase móvel empregada?
5. Discuta a metodologia citada no artigo.
Capítulo
Cromatografia Gasosa (CG)
61
Métodos Cromatográ
1. Ponta da agulha da
microseringa é
intro- duzida no
início da coluna.
2. Amostra injetada e
vaporizada instanta-
neamente no início
da coluna.
3. "Plug" de vapor de
amostra forçado
pelo gás de arraste
a fluir pela coluna.
b) Controles Pneumáticos
Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora
de pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. A vazão é medida
com o auxílio de um fluxímetro de bolha (Figura 41), ou bolhômetro. A “pêra”
(parte infe- rior) contém uma solução de sabão líquido. Comprimindo-se a
“pêra”, o nível do líquido sobe e o gás forma uma bolha que ascende pelo
tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente marcar com um cronômetro
o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na atualidade,
existem no mercado alguns equipa- mentos totalmente microprocessados,
c) Coletor de Frações
O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia
preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de
fluxo de modo que uma parte é desviada para o coletor, onde cada
componente, isolada- mente, é condensado. Colunas de maiores
dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade de amostra,
permitindo assim a produção de pequenas quantidades de um material
com alta pureza (maior que 99,9999%), que po- derá ser empregado
como padrão.
66 AMORIM, A.F.V. DE
d) Detectores
Nos primórdios da Cromatografia, a visualização dos diversos
componentes da amostra era possível porque eles eram coloridos (daí o
nome da técnica). Os primeiros pesquisadores que trabalharam com
substâncias incolores de- senvolveram vários procedimentos para torná-las
coloridas.
Surgiram então os reveladores. Reagentes, como o iodo, o ácido
sul- fúrico, a 2,4-dinitrofenil-hidrazina, entre vários outros, que borrifados
sobre a placa desenvolvida, geram manchas coloridas (spots), permitindo
assim a vi- sualização do cromatograma. Tanto na placa quanto na
coluna, iluminação com luz ultravioleta (UV) também permite a
visualização das zonas ocupadas pelos componentes (evidentemente,
apenas aqueles que absorvem luz UV).
Para a quantificação, Tswett e seus seguidores empregavam técnicas de
degradação química, que consiste em transformar o analito desconhecido em
al- guma substância já conhecida e, em seguida, desenhar a reação (ou as
reações) realizada(s), do fim para o começo, para chegar à estrutura do
desconhecido.
A ideia de colocar um feixe de luz UV na saída da coluna e
aproveitar a relação matemática associada à absorção da luz pelo analito
(lei de Beer) é um exemplo do desenvolvimento de detectores (dispositivos
que em contato com o analito geram um sinal que é registrado e
quantificado).
O momento da detecção também é registrado (tempo de retenção),
de modo que os detectores modernos fazem simultaneamente a
identificação e a quantificação da amostra. As figuras 42, 43 e 44 mostram
exemplos de cromatogramas obtidos por três diferentes tipos de
detectores.
Desvantagens
14
Os FID, AFD e FPD A desvantagem do FPD14 é a resposta não linear. A resposta é aproximada-
podem operar temperaturas mente quadrática e depende da natureza exata do composto que está
até 400° C, logo, podem
ser usados com colunas sendo analisado. Alguns cromatógrafos têm a função de linearização em
de alta temperatura. Isto sua pro- gramação que pode ser controlada pelo usuário dentro de certos
reduz a contaminação por
limites (1,2 a 2,5). Apesar destas desvantagens, este tipo de detector é
condensação.
muito útil, parti- cularmente, na análise de enxofre em baixa
concentração podendo ser de interesse para resolver problemas
ambientais.
Desvantagens
Alto custo
Difícil manutenção.
Detectores de CG acoplados
A cromatografia com fase gasosa pode ser acoplada com vários tipos de
es- pectrômetros, compondo sistemas capazes de combinar a
capacidade de separação da cromatografia com a capacidade de
identificação da espec- troscopia.
Capítulo 7
Cromatografia a Gás associada a
Espectrometria de Massas (CG-MS)
e Cromatografia com Fluido
Supercrítico-Espectrometria de
Massas (SFC-MS)
75
Métodos Cromatográ
Tabela 2
Características gerais de várias resinas trocadoras de íons.
Tipo Grupo pH Capacidade de troca
trocador
Troca Ácido forte -SO3H 1,0 - 14 4mmol H+ g-1
catiônica
Troca Ácido fraco -CO2H 5,0 - 14 9-10 mmol H+ g-1
catiônica
Troca Base forte -CH2+-R3 1,0 -14 4 mmol -OH g-1
aniônica
Troca Base fraca -CH2-NR2 1,0 - 9,0 4 mmol -OH g-1
aniônica
Tabela 3
Resinas comerciais
Nome Tipo Capacidade de troca por g-1 (resina seca)
Zeo-Karb 225 Ácido forte 4,5-5,0 mmol H+
Amberlite CG 120 Ácido forte 5,0 mmol H+
Zeo-Karb 226 Ácido fraco 9,0-10 mmol H+
Amberlite CG 50 Ácido fraco 10,0 mmol H+
Deacidite FFIP Base forte 4,0 mmol -OH
Amberlite CG 400 Base forte 3.8 mmol -OH
Amberlite CG 45 Base fraca 5,0 mmol -OH
5. Seletividade
A seletividade18 de um trocador aumenta com o incremento do grau das liga-
ções cruzadas da matriz. Íons com carga elevada são trocadores mais
fortes que íons de baixa carga nas mesmas concentrações. Íons com a
mesma carga, porém com diferentes tamanhos em solução, têm
diferentes graus de afinidade. Este efeito se relaciona melhor com o poder
de polarização do íon e seu grau de hidratação, sendo que a afinidade
diminui com o aumento do raio do íon hidratado.
18
Seletividade é a
capacidade que tem um 6. Fase móvel
trocador de reter íons
A fase móvel pode ser constituída por soluções ácidas, básicas ou ainda por
soluções tampões. Quando a fase móvel é uma solução tampão, sua
escolha é em função do valor em que se pretende manter o pH. Na
literatura, encontram-
-se vários tampões utilizados, como o fosfato, o citrato, o acetato, dentre outros.
7. Aplicações
A desionização da água e de muitos licores açucarados de frutos bem como
a despigmentação destes são as aplicações mais rotineiras.
Em Química Analítica, é usada na separação de elementos geralmente
com- plexados, como também na eliminação de íons que interferem na análise
de uma determinada substância e na separação de misturas de compostos
carregados.
Na Bioquímica, tem sido aplicada frequentemente, tanto com fins
pre- parativos como analíticos. Na preparação e purificação de enzimas
como de outras macromoléculas, usada também na separação de drogas
e seus me- tabólitos, utilizadas em autoanalisadores de aminoácidos.
83
Métodos Cromatográ
Referências
BARCIA, M. T.; JACQUES, A. C.; PERTUZATTI, P. B.; ZAMBIAZI, R. C., De-
terminação de ácido ascórbico e tocoferóis em frutas por CLAE,
Ciências Agrárias, Londrina, v. 31, n. 2, p. 381-390, abr./jun. 2010.
CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia Líquida de Alto
Desempe- nho, São Paulo, Ed. Edgard Blücher Ltda., 1998.
COLLINS, C. H. & GUIMARÃES, L. F. L., Cromatografia Líquida de Alta
Efici- ência. In: COLLINS, C. H. & BRAGA, G. L.; Introdução a Métodos
Cromato- gráficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, São Paulo, 1988, p 179 - 243.
MARZOCCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica Básica. 3° ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2007.
Vogel: Análise Inorgânica Quantitativa, Rio de Janeiro, Editora Livros
Técni- cos e Científicos, 2002.
Análise Instrumental Cromatografia Líquida de Alta Resolução, CEFET-
-Química Unidade Rio de Janeiro.
Análise de drogas vegetais por cromatografia em camada delgada
(CCD), MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DO PA-
RANÁ. Departamento de Farmácia, Laboratório de Farmacognosia.
SCHULER, A., Cromatografia a Gás e a Líquido. 10° ed., UFPE, Recife,
2007.
84 AMORIM, A.F.V. DE
Sobre a autora
F
iel a sua missão de interiorizar o ensino superior no estado Ceará, a
UECE, como uma instituição que participa do Sistema Universidade
Aberta do Brasil, vem ampliando a oferta de cursos de graduação e pós-
graduação
na modalidade de educação a distância, e gerando experiências e possibili-
dades inovadoras com uso das novas plataformas tecnológicas decorren-
tes da popularização da internet, funcionamento do cinturão digital e
massificação dos computadores pessoais.
Comprometida com a formação de professores em todos os níveis
e a qualificação dos servidores públicos para bem servir ao
Estado, os cursos da UAB/UECE atendem aos padrões de
qualidade estabelecidos pelos normativos legais do Governo
Fede-
ral e se articulam com as demandas de desenvolvi-
mento das regiões do Ceará.