WO2019131947A1

WO2019131947A1 - 分光分析装置、分光分析方法、プログラム、記録媒体及び顕微鏡

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Publication number: WO2019131947A1
Application number: PCT/JP2018/048329
Authority: WO
Inventors: 雄一谷口; 雅恵城村
Original assignee: 国立研究開発法人理化学研究所
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-07-04
Also published as: JPWO2019131947A1; US20210010920A1; EP3757550A1; EP3757550A4

Abstract

分光分析装置（１）は、撮像部（７０）と、光走査部と、解析部（８０）とを備える。撮像部（７０）は、試料（２５）に含まれる複数の分子（２６）を一分子レベルでイメージングし得る。光走査部は、試料（２５）に対して撮像部（７０）の撮像面（７１）の共役面（７２）を相対的に走査させ得る。解析部（８０）は、撮像部（７０）で取得された複数の分子（２６）の画像を解析して、複数の分子（２６）の濃度を取得し得る。そのため、分光分析装置（１）を用いて、相対的に大きな体積を有する試料（２５）に希薄に分布する複数の分子（２６）の濃度を正確に測定し得る。

Description

分光分析装置、分光分析方法、プログラム、記録媒体及び顕微鏡

　本発明は、分光分析装置、分光分析方法、プログラム、記録媒体及び顕微鏡に関する。

　特開２００５－３０９５０号公報（特許文献１）は、カバーガラスに固定化された被測定物質（例えば、タンパク質またはＤＮＡ）の密度を定量化する方法を開示している。特許文献１に開示された方法では、被測定物質を含む試料がカバーガラスに固定化される。被測定物質が蛍光物質でラベルされる。カバーガラスと試料との境界面である測定面に対して、全反射角度でレーザ光が入射される。レーザ光は測定面で全反射されるが、レーザ光の一部は近接場光として試料にしみだす。近接場光がカバーガラスの近傍の試料中の蛍光物質を励起して、蛍光が放出される。蛍光は、検出部によって検出される。こうして、蛍光物質による蛍光が現れた画像が取得される。この画像中に現れている蛍光スポットを計数して、被測定物質の密度を推算する。

特開２００５－３０９５０号公報

　しかしながら、特許文献１に開示された方法によって推算することができる被測定物質の濃度は、近接場光がしみだす範囲（約２００ｎｍ以内）に存在する被測定物質の濃度に限られる。特許文献１に開示された方法では、相対的に大きな体積を有する試料に含まれる被測定物質の濃度を測定することが困難である。本発明の目的は、相対的に大きな体積を有する試料に希薄に分布する複数の分子の濃度を正確に測定し得るように構成されている分光分析装置及び分光分析方法を提供することである。本発明の別の目的は、相対的に大きな体積を有する試料に希薄に分布する複数の分子を正確に観察し得るように構成されている顕微鏡を提供することである。

　本発明の分光分析装置は、撮像部と、光走査部と、解析部とを備える。撮像部は、試料に含まれる複数の分子から放射される放射光を検出して、複数の分子を一分子レベルでイメージングし得るように構成されている。光走査部は、試料の少なくとも一部の領域に対して撮像部の撮像面の共役面を相対的に走査させ得るように構成されている。試料は、複数の分子を含む。解析部は、撮像部で取得された複数の分子の画像を解析して、複数の分子の濃度を取得し得るように構成されている。

　本発明の分光分析方法は、複数の分子を含む試料の少なくとも一部の領域に対して撮像部の撮像面の共役面を相対的に走査させながら、複数の分子を一分子レベルでイメージングして、複数の分子の画像を取得することを備える。本発明の分光分析方法は、複数の分子の画像を解析して、複数の分子の濃度を取得することをさらに備える。

　本発明の顕微鏡は、観察用対物レンズと、照射用対物レンズと、レンズホルダと、光走査部を備える。観察用対物レンズは、試料担持部に担持される試料に含まれる複数の分子から放射される放射光を透過させ得るように配置されている。照射用対物レンズは、試料に向けてシート光を透過させ得るように配置されている。光走査部は、試料担持部の試料担持面が延在しかつ互いに交差する第１の方向と第２の方向とに沿って、試料の少なくとも一部の領域に対して観察用対物レンズの観察面を相対的に走査させ得るように構成されている。観察用対物レンズと照射用対物レンズとは、試料担持部に対して試料とは反対側に配置されている。レンズホルダは、観察用対物レンズと照射用対物レンズとを保持し得るように構成されている。レンズホルダは、照射用対物レンズに対する観察用対物レンズの相対的な位置を固定している。レンズホルダは、液体保持部を含む。液体保持部は、観察用対物レンズと照射用対物レンズと試料担持部との間の空間を満たす屈折率整合液を保持し得るように構成されている。

　本発明の分光分析装置及び分光分析方法によれば、相対的に大きな体積を有する試料に希薄に分布する複数の分子の濃度を正確に測定し得る。本発明の顕微鏡によれば、相対的に大きな体積を有する試料に希薄に分布する複数の分子を正確に観察し得る。

実施の形態１に係る分光分析装置の概略図である。実施の形態１に係る分光分析装置の概略側面図である。実施の形態１に係る分光分析装置の概略部分拡大平面図である。実施の形態１に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１に係る分光分析装置の概略部分拡大斜視図である。実施の形態１に係る分光分析装置によって得られる画像の一例を示す図である。実施の形態１に係る分光分析装置によって測定される試料の一例を示す図である。実施の形態１の第１変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１の第２変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１の第２変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１の第３変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１の第３変形例に係る分光分析装置によって得られる画像の一例を示す図である。実施の形態１の第３変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大平面図である。実施の形態１の第３変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大斜視図である。実施の形態１の第４変形例に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１，５に係る分光分析装置によって測定される試料に含まれる分子の概略図である。実施の形態２，３に係る分光分析装置によって測定される試料に含まれる第１の分子の概略図である。実施の形態１から実施の形態５に係る分光分析方法のフローチャートを示す図である。実施の形態１から実施の形態５に係る分光分析装置の制御ブロック図である。実施の形態２に係る分光分析装置の概略図である。実施の形態２に係る分光分析装置によって測定される試料に含まれる第２の分子の概略図である。実施の形態３に係る分光分析装置の概略図である。実施の形態３に係る分光分析装置によって測定される試料に含まれる第２の分子の概略図である。実施の形態４に係る分光分析装置の概略図である。実施の形態４に係る分光分析装置によって測定される試料に含まれる分子の概略図である。実施の形態５に係る分光分析装置の概略部分拡大平面図である。実施の形態５に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態５に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態６に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態６に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態６に係る分光分析装置によって得られる画像の一例を示す図である。実施の形態７に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態８に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態９に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態９に係る分光分析装置によって得られる画像の一例を示す図である。実施の形態１０に係る分光分析装置の概略部分拡大断面図である。実施の形態１０に係る分光分析装置によって得られる画像の一例を示す図である。実施の形態１－１０に係る分光分析装置及び分光分析方法を、蛍光抗体法に応用した例を示す概略図である。実施の形態１－１０に係る分光分析装置及び分光分析方法を、蛍光酵素免疫測定法に応用した例を示す概略図である。実施の形態１の分光分析装置の応用例である、相関分光装置の概略図である。実施の形態３の分光分析装置の応用例である、相互相関分光装置の概略図である。実施の形態３の分光分析装置の応用例である、蛍光共鳴エネルギー移動測定装置の概略図である。

　以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、同一の構成には同一の参照番号を付し、その説明は繰り返さない。

　（実施の形態１）
　図１から図１５、図１７及び図１８を参照して、実施の形態１の分光分析装置１を説明する。分光分析装置１は、撮像部７０と、光走査部（１２，１４，１６，２２）と、解析部８０とを主に備える。分光分析装置１は、観察用対物レンズ３４と、光学ユニット５０と、レンズホルダ３０とをさらに備えてもよい。分光分析装置１は、ミラー５４ｆ（図２を参照）と、フィルタホイール６６と、集光レンズ５６ｃと、ミラー５４ｅと、画像処理部７３と、ローパスフィルタ７４とをさらに備えてもよい。

　試料２５は、試料担持部２１によって担持されている。試料担持部２１は、試料担持部２１の試料担持面である第１主面２１ｒと、第１主面２１ｒとは反対側の第２主面とを有する。第１主面２１ｒは、試料担持部２１の上面であってもよく、第２主面２１ｓは、試料担持部２１の下面であってもよい。試料担持部２１は、例えば、カバーガラスのような透明基板であってもよいし、シャーレであってもよいし、平らな透明膜であってもよいし、湾曲した透明膜であってもよい。試料担持部２１は、透明基板上に設けられた側壁２１ｗをさらに含んでもよい。試料２５は、透明基板と側壁２１ｗとによって囲まれている空間に収容されてもよい。第１主面２１ｒ及び第２主面２１ｓは、各々、平らな面であってもよいし、曲面であってもよい。試料担持部２１の上部は、開放されていてもよい。

　試料２５は、複数の分子２６を含む。複数の分子２６は、各々、例えば、０．１ｎｍ以上のサイズを有してもよく、１ｎｍ以上のサイズを有してもよく、１０ｎｍ以上のサイズを有してもよい。複数の分子２６は、各々、例えば、１μｍ以下のサイズを有してもよく、０．１μｍ以下のサイズを有してもよい。

　試料２５は、例えば、複数の分子２６と液体２８とを含む液体試料であってもよい。液体２８は、例えば、培養液または緩衝溶液等であってもよく、複数の分子２６は細胞（接着細胞、浮遊細胞等）内に存在してもよい。試料担持部２１は、液体２８の屈折率と実質的に同じ屈折率を有してもよい。本明細書において、試料担持部２１が液体２８の屈折率と実質的に同じ屈折率を有することは、液体２８の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差が０．１以下であることを意味する。特定的には、液体２８の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差は０．０５以下であってもよい。

　後述するように、本実施の形態では、照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａと観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとは、試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して傾いている。そのため、液体２８の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差に応じて、シート光３７の光路と放射光３８の光路とにおいて、非対称な収差が発生する。液体２８の屈折率と実質的に同じ屈折率を有する試料担持部２１は、非対称な収差を大幅に低減させて、複数の分子２６の明瞭な像を得ることを可能にする。例えば、液体２８が、１．３３の屈折率を有する水である場合、試料担持部２１は、１．２８以上１．３８以下の屈折率を有する材料（例えば、ＬＵＭＯＸ（登録商標））で構成されてもよい。液体２８が１．３８の屈折率を有する培養液である場合、試料担持部２１は１．３３以上１．４３以下の屈折率を有する材料で構成されてもよい。

　非対称な収差を低減するために、試料担持部２１は、１００μｍ以下の厚さを有してもよい。試料担持部２１は、５０μｍ以下の厚さを有してもよく、試料担持部２１は、２０μｍ以下の厚さを有してもよい。試料担持部２１の機械的強度を確保するために、試料担持部２１は、５μｍ以上の厚さを有してもよい。

　複数の分子２６は、試料２５中に希薄に分布してもよい。例えば、試料２５中の複数の分子２６の濃度は、１×１０^-21Ｍ（１ｚＭ）以上であってもよく、１×１０^-18Ｍ（１ａＭ）以上であってもよい。試料２５中の複数の分子２６の濃度は、特に制限されないが、１×１０^-9Ｍ（１ｎＭ）以下であってもよく、１×１０^-12Ｍ（１ｐＭ）以下であってもよい。試料２５に含まれる複数の分子２６の数は、１×１０^-24ｍｏｌ（１ｙｍｏｌ）以上であってもよく、１×１０^-21ｍｏｌ（１ｚｍｏｌ）以上であってもよい。試料２５に含まれる複数の分子２６の数は、特に制限されないが、１×１０^-15ｍｏｌ（１ｆｍｏｌ）以下であってもよく、１×１０^-18ｍｏｌ（１ａｍｏｌ）以下であってもよい。

　複数の分子２６は、例えば、生体分子であってもよいし、蛍光タンパク質または蛍光色素のような蛍光物質（図１６に示される第１蛍光物質９３）でラベルされた生体分子（図１６に示される第１生体分子９２）であってもよいし、発光物質でラベルされた生体分子であってもよい。生体分子は、例えば、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂肪酸、アミノ酸、その他の有機酸または糖のような低分子化合物であってもよい。生体分子は、例えば、多量体タンパク質の１サブユニットであってもよい。タンパク質は、例えば、数ｎｍの直径を有する球状タンパク質であってもよい。生体分子は、例えば、制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡフラグメントであってもよく、人工的に合成したオリゴヌクレオチドであってもよい。ヒトゲノムを構成するＤＮＡ二重らせん構造は、例えば、約２ｎｍの幅と約１ｍの長さとを有する紐の形状を有している。生体分子は、例えば、遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の一分子であってもよい。遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）は、例えば、約０．３ｎｍの幅と１０ｎｍ以上５０００ｎｍ以下の長さとを有する紐の形状を有している。

　撮像部７０は、試料２５に含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を検出して、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングし得るように構成されている。撮像部７０で取得された複数の分子２６の画像では、複数の分子２６が一分子レベルでイメージングされている。撮像部７０は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラであってもよい。撮像部７０は、撮像面７１を有する。複数の分子２６の画像は、例えば、複数の分子２６の数を数えるのに適した複数の分子２６のドットイメージ（複数の分子２６の輝点）を含んでもよい。一例として、図６に、分光分析装置１によって得られた、試料２５（培養液）のうち０．８μＬの体積を有する領域に含まれる多数のＵ２ＯＳ細胞の画像を示す。

　観察用対物レンズ３４は、複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部７０に向けて透過させ得るように配置されている。観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１に対して、試料２５とは反対側に配置されてもよい。具体的には、観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１の下方に配置されてもよい。観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１の第２主面２１ｓに面してもよい。観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａは、試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して傾いている。そのため、放射光３８は、側壁２１ｗまたは他の試料２５（図２５及び図２６を参照）に妨げられることなく、検出され得る。分光分析装置１によれば、側壁２１ｗまたは他の試料２５（図２５及び図２６を参照）に妨げられることなく、試料２５を観察することができる。

　観察用対物レンズ３４は、特に限定されないが、２倍以上の倍率を有してもよく、１０倍以上の倍率を有してもよく、２０倍以上の倍率を有してもよい。観察用対物レンズ３４は、特に限定されないが、１００倍以下の倍率を有してもよく、６０倍以下の倍率を有してもよい。複数の分子２６を高解像度でかつ一分子レベルでイメージングするために、観察用対物レンズ３４は、０．４以上の開口数を有してもよく、０．８以上の開口数を有してもよく、１．１以上の開口数を有してもよい。観察用対物レンズ３４は、０．１ｍｍ以上の作動距離を有してもよく、０．５ｍｍ以上の作動距離を有してもよく、２．０ｍｍ以上の作動距離を有してもよい。放射光３８は、観察用対物レンズ３４でコリメートされてもよい。

　放射光３８は、蛍光であってもよい。例えば、図１６に示されるように複数の分子２６が第１蛍光物質９３でラベルされた複数の第１生体分子９２である場合、シート光３７が第１蛍光物質９３に照射されることによって、蛍光が第１蛍光物質９３から生じてもよい。放射光３８は、ラマン散乱光のような散乱光であってもよい。放射光３８は、発光物質から放射される光であってもよい。例えば、試料２５は、例えば、複数の分子２６と液体２８とを含む液体試料であり、かつ、複数の分子２６は、発光物質でラベルされた複数の生体分子であってもよい。発光物質が液体２８中に含まれる物質と化学反応して基底状態から励起状態に励起される。発光物質が励起状態から基底状態に遷移する際に、発光物質から放射光３８が放射されてもよい。

　図２から図４に示されるように、光走査部（１２，１４，１６，２２）は、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させ得るように構成されている。本明細書において、撮像面７１の共役面７２は、試料２５と撮像面７１との間に存在する出射側光学系（本実施の形態では、観察用対物レンズ３４及び集光レンズ５６ｃ等を含む）において、撮像面７１に対して光学的に共役な面を意味する。

　撮像面７１の共役面７２は、観察用対物レンズ３４の観察面（焦点面）であってもよい。観察用対物レンズ３４に対して試料２５を移動させることによって、または、試料２５に対して観察用対物レンズ３４を移動させることによって、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面は相対的に走査され得る。光走査部（１２，１４，１６，２２）は、試料２５の少なくとも一部の領域に対してシート光３７を相対的に走査させ得るように構成されてもよい。

　光走査部（１２，１４，１６，２２）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域は、１０^-10ｍ³（０．１μＬ）以上の体積を有してもよいし、５×１０^-10ｍ³（０．５μＬ）以上の体積を有してもよいし、１０^-9ｍ³（１μＬ）以上の体積を有してもよいし、５×１０^-9ｍ³（５μＬ）以上の体積を有してもよいし、１０^-8ｍ³（１０μＬ）以上の体積を有してもよい。１０^-10ｍ³（０．１μＬ）以上の体積は、１×１０^-21Ｍ（１ｚＭ）または１×１０^-18Ｍ（１ａＭ）のような低い濃度で試料２５中に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定することを可能にする。１０^-10ｍ³（０．１μＬ）以上の体積は、マイクロピペットのような生化学用器具を用いて試料２５が容易に定量され得る体積である。試料２５が液体試料である場合には、１０^-10ｍ³（０．１μＬ）以上の体積は、試料２５からの液体２８の蒸発が複数の分子２６の濃度の測定に及ぼす影響を無視することを可能にし、複数の分子２６の濃度を正確に測定することを可能にする。

　光走査部（１２，１４，１６，２２）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域は、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から５００ｎｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよく、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から１μｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよく、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から５μｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよい。光走査部（１２，１４，１６，２２）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域は、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から１０μｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよく、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から５０μｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよく、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から１００μｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよい。試料２５の少なくとも一部の領域は、特に限定されないが、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から２０００μｍ以下の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよく、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から４００μｍ以下の距離ｄだけ離れた試料２５の領域を含んでもよい。

　光走査部（１２，１４，１６，２２）は、試料担持部２１が延在する第１の方向（ｘ方向）に沿って、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を相対的に走査させ得るように構成されてもよい。特定的には、光走査部（１２，１４，１６，２２）は、試料担持部２１が延在する第１の方向（ｘ方向）と、試料担持部２１が延在しかつ第１の方向に交差する第２の方向（ｙ方向）とに沿って、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を相対的に走査させ得るように構成されてもよい。特定的には、第２の方向は、第１の方向に垂直であってもよい。光走査部（１２，１４，１６，２２）は、第２の光軸３４ａにも沿って、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を相対的に走査させ得るように構成されてもよい。

　光走査部（１２，１４，１６，２２）は、試料担持部２１を第１の方向（ｘ方向）に移動させ得るように構成されている移動部（１２，１４，１６）を含んでもよい。特定的には、移動部（１２，１４，１６）は、試料担持部２１を第２の方向（ｙ方向）にも移動させ得るように構成されてもよい。具体的には、移動部（１２，１４，１６）は、ｘ－ｙステージ１２と、粗動ステージ１４とを含む。移動部（１２，１４，１６）は、微動ステージ１６をさらに含んでもよい。移動部（１２，１４，１６）は、基台１０上に設けられたガイドレール１１と、ブロック１３と、第１板部材１５と、第２板部材１７と、脚部材１８とをさらに含んでもよい。

　ガイドレール１１は、基台１０上に設けられている。ｘ－ｙステージ１２は、ガイドレール１１上に移動可能に設けられている。ｘ－ｙステージ１２は、試料台２２を、第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）とに移動させる。粗動ステージ１４は、ブロック１３を介して、ｘ－ｙステージ１２に接続されている。微動ステージ１６は、第１板部材１５を介して、粗動ステージ１４に接続されている。粗動ステージ１４と微動ステージ１６とは、試料台２２を、観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａに沿って移動させる。微動ステージ１６は、粗動ステージ１４よりも、第２の方向（ｙ方向）における試料台２２の位置を精密に制御することができる。

　第２板部材１７は、微動ステージ１６上に設けられている。第２板部材１７は、脚部材１８に接続されている。脚部材１８は、試料台２２に接続されて、試料台２２を支えている。試料２５を担持する試料担持部２１は、試料台２２上に載置されている。光走査部（１２，１４，１６，２２）または移動部（１２，１４，１６）は、試料２５を、第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）と第２の光軸３４ａに沿う方向とに、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面に対して移動させることができる。こうして、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面は、試料２５に対して相対的に走査され得る。

　光学ユニット５０は、試料２５に向けてシート光３７を出射し得るように構成されている。光学ユニット５０は、シート光３７を試料２５に向けて透過させ得るように配置されている照射用対物レンズ３３を含んでもよい。照射用対物レンズ３３は、特に限定されないが、２倍以上の倍率を有してもよく、１０倍以上の倍率を有してもよい。照射用対物レンズ３３は、特に限定されないが、３０倍以下の倍率を有してもよく、２０倍以下の倍率を有してもよい。

　光学ユニット５０（照射用対物レンズ３３）は、試料担持部２１に対して観察用対物レンズ３４の側に配置されてもよい。光学ユニット５０（照射用対物レンズ３３）は、試料担持部２１に対して、試料２５とは反対側に配置されてもよい。具体的には、光学ユニット５０（照射用対物レンズ３３）は、試料担持部２１の下方に配置されてもよい。光学ユニット５０（照射用対物レンズ３３）は、試料担持部２１の第２主面２１ｓに面してもよい。

　照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａは、シート光３７が入射し得る試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して傾いている。そのため、シート光３７は、側壁２１ｗまたは他の試料２５（図２５及び図２６を参照）に妨げられることなく、試料２５に照射され得る。試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して第１の光軸３３ａのなす角度θは、１度以上であってもよく、５度以上であってもよい。試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して第１の光軸３３ａのなす角度θは、６０度以下であってもよく、４０度以下であってもよい。

　シート光３７は、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面と実質的に平行な進行方向を有してもよい。そのため、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２内あるいは観察用対物レンズ３４の観察面内で不均一な焦点ぼけが発生することが抑制されて、複数の分子２６の明瞭な像を取得することができる。本明細書において、シート光３７の進行方向が撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面と実質的に平行であることは、シート光３７の進行方向と撮像部７０の撮像面７１の共役面７２との間の角度あるいはシート光３７の進行方向と観察用対物レンズ３４の観察面との間の角度が、１５度以下であることを意味する。シート光３７の進行方向と観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとの間の角度は、７５度以上１０５度以下である。シート光３７は、例えば、平行光、収束光またはベッセルビームであってもよい。

　シート光３７は、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面以外に存在する試料２５から放射光３８が発生することを抑制する。シート光３７は、複数の分子２６のイメージングにおいて、バックグラウンドノイズを減少させることができる。試料２５の全体を光で照射し続ける場合に比べて、シート光３７は、試料２５に含まれる複数の分子２６に光が長時間照射され続けることを防止することができる。シート光３７は、複数の分子２６の褪色及び光毒性を抑制することができる。シート光３７は、複数の分子２６の高速な一分子イメージングを可能にする。シート光３７は、例えば、２０μｍ以下の最小厚さを有してもよく、１５μｍ以下の最小厚さを有してもよく、１０μｍ以下の最小厚さを有してもよく、５μｍ以下の最小厚さを有してもよく、２μｍ以下の最小厚さを有してもよい。

　光学ユニット５０は、光源５１と、ビーム形状変換部６２とを含んでもよい。ビーム形状変換部６２は、光源５１から出射された入力光５３をシート光３７に変換する。本実施の形態では、ビーム形状変換部６２は、ガルバノミラーまたは微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）ミラーのような振動ミラーである。ビーム形状変換部６２は、シリンドリカルレンズ、音響光学偏向器または回折格子であってもよい。光学ユニット５０は、アキシコンレンズ６０を含んでもよい。アキシコンレンズ６０は、光源５１とビーム形状変換部６２との間に配置されてもよい。光学ユニット５０は、ミラー５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，５４ｄ、光合波器５５、集光レンズ５６ａ，５６ｂ、光ファイバ５７、コリメートレンズ５８ａ，５８ｂ，５８ｃ、輪帯位相素子５９及びアパーチャ６４をさらに含んでもよい。集光レンズ５６ａ，５６ｂとコリメートレンズ５８ａ，５８ｂ，５８ｃとは、アクロマティック（色消し）レンズであってもよい。光学ユニット５０は、輪帯位相素子５９を含んでいなくてもよい。光学ユニット５０は、アキシコンレンズ６０を含んでいなくてもよい。

　光源５１は、第１の光源要素５２ａと、第２の光源要素５２ｂとを含んでもよい。第１の光源要素５２ａ及び第２の光源要素５２ｂは、レーザ光源であってもよい。第１の光源要素５２ａは、第１の入力光３７ａを出射し得るように構成されている。第２の光源要素５２ｂは、第１の入力光３７ａと異なる波長を有する第２の入力光３７ｂを出射し得るように構成されている。光源５１は、第１の光源要素５２ａのみを含み、第２の光源要素５２ｂを含んでいなくてもよい。

　第２の光源要素５２ｂから出射された第２の入力光３７ｂは、ミラー５４ａで反射される。第１の光源要素５２ａから出射された第１の入力光３７ａと、ミラー５４ａで反射された第２の入力光３７ｂとは、光合波器５５で合波されて、入力光５３となる。入力光５３は、第１の入力光３７ａと、第２の入力光３７ｂとを含んでもよい。入力光５３は、集光レンズ５６ａで集光されて、光ファイバ５７に入射される。光ファイバ５７から出射された入力光５３は、コリメートレンズ５８ａでコリメートされる。

　コリメートレンズ５８ａを通過した入力光５３は、ミラー５４ｂで反射されて、輪帯位相素子５９に入射する。輪帯位相素子５９は、入力光５３のサイドローブのエネルギーを入力光５３のセントラルローブに分配し得るように構成されている。輪帯位相素子５９は、シート光３７のサイドローブの生成を抑制することができる。輪帯位相素子５９は、複数の分子２６のイメージングにおいて、バックグラウンドノイズを減少させることができる。輪帯位相素子５９は、例えば、国際公開第２０１７／１３８６２５号に開示されている輪帯位相素子が用いられてもよい。

　輪帯位相素子５９を通過した入力光５３は、アキシコンレンズ６０に入射する。アキシコンレンズ６０は、入力光５３を、光強度分布がより均一なベッセルビームに変換する。アキシコンレンズ６０を通過した入力光５３は、コリメートレンズ５８ｂを通過して、ビーム形状変換部６２に入射する。ビーム形状変換部６２は、入力光５３をシート光３７に変換する。シート光３７は、集光レンズ５６ｂを通過して、アパーチャ６４に入射される。アパーチャ６４を通過したシート光３７は、ミラー５４ｃで反射されて、コリメートレンズ５８ｃに入射する。コリメートレンズ５８ｃを通過したシート光３７はミラー５４ｄで反射されて、光学ユニット５０から出射される。光学ユニット５０から出射されたシート光３７は、照射用対物レンズ３３で集光されて、試料２５に照射される。

　図４及び図５に示されるように、レンズホルダ３０は、観察用対物レンズ３４と、照射用対物レンズ３３とを保持する。レンズホルダ３０は、照射用対物レンズ３３に対する観察用対物レンズ３４の相対的位置を固定する。レンズホルダ３０は、屈曲された筒体であってもよい。照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とは、筒体であるレンズホルダ３０の内部に収容されてもよい。照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａと観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとは、筒体であるレンズホルダ３０の内部に延在している。レンズホルダ３０は、試料担持部２１の第２主面２１ｓに対向する頂部３０ｔを含む。頂部３０ｔは、シート光３７と放射光３８とが透過し得るように構成されている開口３０ａを含む。

　図２に示されるように、分光分析装置１は、基台１０と、第１アーム３５とをさらに備えてもよい。レンズホルダ３０の第１端は、第１アーム３５に固定されている。第１アーム３５は、基台１０に固定されている。レンズホルダ３０の第２端は、可動ステージ（粗動ステージ１４、微動ステージ１６）に取り付けられている。具体的には、レンズホルダ３０の第２端は、第２板部材１７を介して、微動ステージ１６に固定されている。レンズホルダ３０の第２端は、第２板部材１７、微動ステージ１６及び第１板部材１５を介して、粗動ステージ１４に取り付けられている。

　レンズホルダ３０は、液体保持部３１を含んでもよい。液体保持部３１は、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４と試料担持部２１との間の空間に満たす屈折率整合液４０を保持し得るように構成されてもよい。本明細書において、屈折率整合液４０は、屈折率整合液４０と試料担持部２１との間の屈折率の差を、空気（屈折率ｎ_air＝１）と試料担持部２１との間の屈折率の差よりも小さくし得る液体を意味する。屈折率整合液４０は、試料担持部２１の第２主面２１ｓにおけるシート光３７及び放射光３８の屈折量を減少させる。照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａと観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとは、試料担持部２１の第２主面２１ｓに対して傾いている。そのため、屈折率整合液４０が無ければ、空気の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差に応じて、シート光３７の光路と放射光３８の光路とにおいて、非対称な収差が発生する。屈折率整合液４０は、非対称な収差を大幅に低減させて、複数の分子２６の明瞭な像を得ることを可能にする。

　特定的には、屈折率整合液４０は、試料担持部２１（透明基板）と実質的に同じ屈折率を有してもよい。本明細書において、屈折率整合液４０が、試料担持部２１と実質的に同じ屈折率を有することは、屈折率整合液４０の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差が０．１以下であることを意味する。特定的には、屈折率整合液４０の屈折率と試料担持部２１の屈折率との差が０．０５以下であってもよい。屈折率整合液４０は、例えば、水またはオイルであってもよい。例えば、試料担持部２１は、１．２８以上１．３８以下の屈折率を有する材料（例えば、ＬＵＭＯＸ（登録商標））で構成されている場合、屈折率整合液４０は、１．３３の屈折率を有する水であってもよい。

　屈折率整合液４０に接触している照射用対物レンズ３３は第１の液浸レンズとして機能し、屈折率整合液４０に接触している観察用対物レンズ３４は第２の液浸レンズとして機能する。そのため、第１の液浸レンズである照射用対物レンズ３３の開口数と、第２の液浸レンズである観察用対物レンズ３４の開口数とが増加し、分光分析装置１はより高い解像度を有する。

　図５に示されるように、レンズホルダ３０は、屈折率整合液４０が液体保持部３１に注入され得るように構成されている注入口３０ｈをさらに含んでもよい。注入口３０ｈは、液体保持部３１に連通している。チューブ４２は、液溜め４１と注入口３０ｈとに接続されている。液溜め４１中の屈折率整合液４０は、チューブ４２及び注入口３０ｈを通って、液体保持部３１に注入される。

　図１及び図２に示されるように、観察用対物レンズ３４を通過した放射光３８は、ミラー５４ｆで反射されて、フィルタホイール６６に入射する。フィルタホイール６６は、第１の入力光３７ａ及び第２の入力光３７ｂの一方を選択的に透過させ得るように構成されている。フィルタホイール６６は、回転可能に構成されている回転板６６ｐと、回転板６６ｐに設けられている複数のフィルタ６７，６７ｂとを含む。フィルタ６７は、第１の入力光３７ａによって試料２５から生じる放射光３８を透過させ、かつ、第２の入力光３７ｂによって試料２５から生じる放射光３８を遮断する。フィルタ６７ｂは、第２の入力光３７ｂによって試料２５から生じる放射光３８を透過させ、かつ、第１の入力光３７ａによって試料２５から生じる放射光３８を遮断する。

　複数の分子２６が、第１の出力光３８ａを放射し得る複数の第１の分子２７ａと、第２の出力光３８ｂを放射し得る複数の第２の分子２７ｂとを含む場合（図１９を参照）、フィルタホイール６６は、第１の出力光３８ａ及び第２の出力光３８ｂの一方を選択的に透過させ得る。例えば、フィルタ６７は、複数の第１の分子２７ａから放射される第１の出力光３８ａを透過させ、かつ、複数の第２の分子２７ｂから放射される第２の出力光３８ｂを遮断する。フィルタ６７ｂは、複数の第２の分子２７ｂから放射される第２の出力光３８ｂを透過させ、かつ、複数の第１の分子２７ａから放射される第１の出力光３８ａを遮断する。こうして、フィルタホイール６６は、解析部８０が、第１の分子画像と第２の分子画像とを個別に解析することを可能にする。

　画像処理部７３は、撮像部７０から出力された複数の分子２６の画像を二値化処理し得るように構成されてもよい。ローパスフィルタ７４は、撮像部７０から出力された複数の分子２６の画像に含まれる高周波成分を除去して、高周波成分が除去された複数の分子２６の画像を画像処理部７３に出力する。

　解析部８０は、撮像部７０で取得された複数の分子２６の画像を解析して、複数の分子２６の濃度を取得し得るように構成されている。本明細書において、複数の分子２６の濃度は、光走査部（１２，１４，１６，２２）によって相対的に走査される試料２５の体積中の複数の分子２６の数、または、複数の分子２６のモル数として定義される。解析部８０は、複数の分子２６の濃度の時間変動及び空間変動を取得し得るように構成されてもよい。特定的には、解析部８０は、計数部８２を含んでもよい。計数部８２は、撮像部７０で取得される複数の分子２６の画像に含まれる複数の分子２６の数を計数し得るように構成されている。

　図２に示されるように、分光分析装置１は、照明光源４５と、コンデンサレンズ４７と、第２アーム４８と、第３アーム４９とをさらに備えてもよい。照明光源４５は、コンデンサレンズ４７を介して、試料台２２上に載置された試料２５を照らし得るように構成されている。照明光源４５は、例えば、ハロゲンランプであってもよい。照明光源４５とコンデンサレンズ４７とは第２アーム４８に取り付けられている。第２アーム４８は、基台１０に固定されている第３アーム４９に取り付けられている。

　図７を参照して、分光分析装置１を用いて、試料２５に含まれる核酸配列９０（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出する例を説明する。一般的に、核酸配列９０を検出するために、次の工程が行われる。最初に、検出対象の核酸配列９０と、核酸配列９０に相補的な核酸配列を有する蛍光オリゴＤＮＡ（９１、９３）とをハイブリダイズさせる。または、検出対象の核酸配列９０を、核酸配列９０に特異的に結合する蛍光アプタマー等と結合させる。蛍光オリゴＤＮＡ（９１、９３）は、第１蛍光物質９３でラベルされたオリゴＤＮＡ９１である。それから、蛍光オリゴＤＮＡ（９１、９３）または蛍光アプタマー等から放射される蛍光を光検出器を用いて検出する。試料２５から放射される蛍光の強度が光検出器の感度未満であるほど微弱な場合には、ＰＣＲ法のような公知の核酸配列増幅法により検出対象の核酸配列９０を増幅させる必要がある。

　これに対し、分光分析装置１では、試料２５に含まれる複数の分子２６（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸配列９０）を一分子レベルでイメージングし得る。そのため、核酸配列９０の濃度が極めて低くても、核酸配列９０を増幅させることなく、核酸配列９０を検出することができる。例えば、分光分析装置１を用いて、試料２５のうち１．０μＬの体積を有する領域に含まれる核酸配列９０を検出するためには、試料２５における核酸配列９０の濃度は２ａＭ以上であれば十分である。

　図８に示されるように、本実施の形態の第１変形例では、光走査部（１９）は、本実施の形態の移動部（１２，１４，１６）に代えて、移動部１９を備えてもよい。移動部１９は、レンズホルダ３０を第１の方向（ｘ方向）に移動させ得るように構成されている。移動部１９は、レンズホルダ３０に結合されたボールねじ１９ｎと、ボールねじ１９ｎに連結されたモータ１９ｍとを含んでもよい。移動部１９は、レンズホルダ３０を第２の方向（ｙ方向）にも移動させ得るように構成されてもよい。光走査部（１９）または移動部１９は、観察用対物レンズ３４を試料２５に対して移動させることができる。こうして、光走査部（１９）または移動部１９は、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を試料２５に対して相対的に走査させ得る。第１変形例では、試料台２２は、基台１０に固定されてもよい。

　図９に示されるように、本実施の形態の第２変形例では、光走査部（１９ｐ）は、試料担持部２１に対して液体試料（試料２５）を流し得るように構成されている流れ生成部１９ｐを含む。流れ生成部１９ｐは、例えば、試料担持部２１ｃに対して試料２５を流し得るように構成されているポンプであってもよい。流れ生成部１９ｐは、例えば、試料担持部２１ｃが水平面（例えば、ｘｙ面）に対して傾くように試料担持部２１ｃを保持する保持部材であってもよい。流れ生成部１９ｐは、例えば、試料担持部２１ｃに対して試料２５が流れるように試料２５にガスを吹き付け得るように構成されているガス吹き付け部であってもよい。試料担持部２１ｃは、液体試料（試料２５）が流れる流路部であってもよい。

　流れ生成部１９ｐは、液体試料（試料２５）を試料担持部２１ｃの中に流す。液体試料（試料２５）は、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面に対して移動する。こうして、流れ生成部１９ｐは、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を液体試料（試料２５）に対して相対的に走査させ得る。本実施の形態の第２変形例は、フローサイトメータであってもよい。本実施の形態の第２変形例では、液体試料（試料２５）をフローさせながら、液体試料（試料２５）に含まれる複数の分子２６の濃度が効率的に測定され得る。第２変形例では、試料台２２とレンズホルダ３０とは、基台１０に固定されてもよい。分子２６が核酸配列である場合、分光分析装置１は、ターゲットとなる核酸配列の有無を指標として、希少細胞を検出することを可能にする。

　図１０を参照して、本実施の形態の第２変形例では、分光分析装置１をフローサイトメータとして用いる例を説明する。タンパク質（分子２６）は、複数の細胞１００のうちの少なくとも一つに含まれている。細胞１００は、核１０１を含む。細胞内のタンパク質（分子２６）は、細胞の脂質二重膜を透過し得る蛍光基質によってラベルされている。分光分析装置１は、複数の細胞１００毎に、タンパク質（分子２６）の発現状態を分析することを可能にする。分光分析装置１は、試料２５に含まれるタンパク質（分子２６）を一分子レベルでイメージングし得るため、細胞内に含まれる低濃度のタンパク質をin　situで検出することができる。

　管である試料担持部２１ｃに複数の細胞１００を一つずつ流し、分光分析装置１によって、細胞１００の内部に含まれるタンパク質（分子２６）を一分子レベルで検出する。例えば、複数の細胞１００の少なくとも一部がウイルスに感染した直後では、複数の細胞１００の一部の細胞１００内または細胞１００外の溶液に極低濃度のウイルス由来のタンパク質（分子２６）が含有される。分光分析装置１は、複数の細胞１００の一部の細胞１００内または細胞１００外の溶液に含まれるタンパク質（分子２６）を正確に検出することができる。複数の細胞１００の各々について、ウイルスの感染の有無及びその程度を正確にかつ効率的に分析することができる。

　本実施の形態の第２変形例の別の態様においては、分光分析装置１は、複数の細胞１００毎に、細胞１００内のタンパク質（分子２６）の濃度の値を得ることができる。管である試料担持部２１ｃに複数の細胞１００を一つずつ流し、分光分析装置１によって、複数の細胞１００の内部に含まれるタンパク質（分子２６）を一分子レベルで検出する。撮像部７０がタンパク質（分子２６）の画像を取得し、解析部８０の計数部８２が画像に含まれるタンパク質（分子２６）の数を計数する。細胞１００内のタンパク質（分子２６）の数を細胞１００の体積で除算することによって、細胞１００内のタンパク質（分子２６）の濃度を得ることができる。例えば、細胞の典型的な大きさを５０μｍ×５０μｍ×５０μｍとすると、検出感度は１／（５０μｍ×５０μｍ×５０μｍ×６×１０²³）＝約１３ｆＭとなる。

　本実施の形態の第２変形例において、分光分析装置１をフローサイトメータとして用いる場合の検出対象は、多量体タンパク質の１サブユニットであってもよく、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂肪酸、アミノ酸、その他の有機酸または糖のような低分子化合物であってもよい。

　図１１に示されるように、本実施の形態の第３変形例では、試料２５ｄは、ゲル２８ｄと、ゲル２８ｄ中に含まれる複数の分子２６（複数の分子９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄ）とを含むゲル試料であってもよい。ゲル２８ｄは、例えば、アガロースゲルまたはゲランガムゲルであってもよい。一例として、図１２に、分光分析装置１によって得られた、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）でラベルされた抗体（抗マウス　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体）がゲランガムゲルに封入された試料２５ｄの画像を示す。すなわち、分子２６は、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）でラベルされた抗体（抗マウス　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体）であってもよく、ゲル２８ｄはゲランガムゲルであってもよい。

　図１３及び図１４に示されるように、第３変形例の試料２５ｄは、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法によって準備されたゲル試料であってもよい。複数の分子２６の一分子イメージングの妨げとなるゲル試料の自家蛍光を軽減させるために、分光分析装置１を用いて複数の分子２６の濃度を測定する前に、試料２５ｄは紫外線に曝されてもよい。

　具体的には、第３変形例の試料２５ｄは、ゲル２８ｄと、試料載置部９６ａ，９６ｂ，９６ｃ，９６ｄと、マーカ載置部９６ｍと、分子量マーカ９７ａ，９７ｂ，９７ｃ，９７ｄとを含む。試料載置部９６ａ，９６ｂ，９６ｃ，９６ｄに、タンパク質のような複数の分子９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄがそれぞれ載置される。マーカ載置部９６ｍに、分子量マーカ９７ａ，９７ｂ，９７ｃ，９７ｄが載置される。ゲル２８ｄの第１端２９ｐと、第１端２９ｐとは反対側の第２端２９ｑとの間に電界が印加される。複数の分子９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄの分子量に応じて、複数の分子９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄがゲル２８ｄ内を電気泳動する距離が異なる。分子量マーカ９７ａ，９７ｂ，９７ｃ，９７ｄの分子量に応じて、分子量マーカ９７ａ，９７ｂ，９７ｃ，９７ｄがゲル２８ｄ内を電気泳動する距離が異なる。こうして、第３変形例の試料２５ｄが準備される。

　図１５に示されるように、本実施の形態の第４変形例では、試料２５ｅは、複数の分子２６を含む薄膜試料であってもよい。本明細書において、薄膜試料は、ゲル試料を含まない。本実施の形態の第４変形例の試料２５ｅは、ウェスタンブロッティング技術を用いて準備されてもよい。具体的には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって準備されたゲル試料内の複数の分子２６（例えば、タンパク質）が、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）のような有機材料からなるメンブレン２８ｅに転写される。メンブレン２８ｅが後述する一次抗体（複数の分子２６を特異的に認識する抗体）と標識二次抗体（蛍光物質等がラベルされていて、一次抗体を特異的に認識する抗体）とに非特異的に吸着することを防止するために、複数の分子２６が転写されたメンブレン２８ｅにウシ血清アルブミン等でブロッキング処理が施される。それから、複数の分子２６を一次抗体と反応させ、次いで、標識二次抗体を一次抗体と反応させる。こうして、第４変形例の試料２５ｅが準備される。

　本実施の形態の第５変形例では、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とは、互いに独立して、第１の方向（ｘ方向）に移動し得るように構成されてもよい。本実施の形態の第５変形例では、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とは、互いに独立して、第２の方向（ｙ方向）にも移動し得るように構成されてもよい。本実施の形態の第５変形例では、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とは、互いに独立して、第２の光軸３４ａに沿う方向にも移動し得るように構成されてもよい。

　図１７を参照して、本実施の形態の分光分析方法を説明する。本実施の形態の分光分析方法は、複数の分子２６を含む試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させながら、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングして、複数の分子２６の画像を取得すること（Ｓ１）を備える。具体的には、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）を用いて、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させながら、撮像部７０によって、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングして、複数の分子２６の画像が取得される。

　本実施の形態の分光分析方法は、複数の分子２６の画像を解析して、複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）をさらに備える。具体的には、解析部８０を用いて、撮像部７０で取得された複数の分子２６の画像を解析することにより、複数の分子２６の濃度が取得され得る。

　図１８を参照して、本実施の形態の分光分析装置１の制御を説明する。分光分析装置１は、制御部８７によって制御される。制御部８７は、分光分析装置１を制御し得るように構成されたコンピュータである。制御部８７は、演算部８７ｐを含む。演算部８７ｐは、入力部８５が受け付けた情報と記憶部８８に記憶された情報とに基づいて数値演算を実行し得るように構成されている。演算部８７ｐは、例えば、記憶部８８に格納されたプログラムを実行し得るように構成されているプロセッサであってもよい。制御部８７は、制御部８７の演算結果を出力部８６に出力してもよい。

　入力部８５は、ユーザによって操作される。入力部８５は、ユーザからの情報を受け付けて、その情報を制御部８７に送る。ユーザからの情報は、例えば、分光分析装置１を用いた複数の分子２６の濃度の測定に必要な各種のデータ、ユーザからの指令などを含んでもよい。

　出力部８６は、文字、記号及び画像等を表示し得るように構成されている表示装置であってもよい。出力部８６は、例えば、入力部８５が受け付けた情報と、制御部８７の演算結果（例えば、解析部８０によって取得された複数の分子２６の濃度（例えば、複数の分子２６の数と、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域の体積））とを表示してもよい。出力部８６は、撮像部７０で取得される複数の分子２６の画像をさらに表示してもよい。

　記憶部８８は、分光分析装置１を用いて試料２５を分光分析するためのプログラムを記憶し得るように構成されている。プログラムは、分光分析装置１を制御し得るように構成された制御部８７（コンピュータ）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。記憶部８８は、プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。プログラムは、通信回線を通じて提供されて、記憶部８８に記憶されてもよい。記憶部８８は、入力部８５が受け付けた情報をさらに記憶してもよい。記憶部８８は、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域の体積、または、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）による走査距離をさらに記憶し得るように構成されてもよい。記憶部８８は、特に限定されないが、書き換え可能な不揮発性の記憶装置によって構成されてもよい。

　分光分析装置１は、制御部８７を備えてもよい。分光分析装置１は、記憶部８８を備えてもよい。特定的には、分光分析装置１は、入力部８５、出力部８６、制御部８７及び記憶部８８を備えてもよい。分光分析装置１は、入力部８５、出力部８６、制御部８７及び記憶部８８を備えていなくてもよい。

　分光分析装置１は、顕微鏡を含んでもよい。本実施の形態の顕微鏡は、解析部８０を含んでいない。

　本実施の形態の顕微鏡は、観察用対物レンズ３４と、照射用対物レンズ３３と、レンズホルダ３０と、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）を備える。観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１に担持される試料２５，２５ｄ，２５ｅに含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を透過させ得るように配置されている。照射用対物レンズ３３は、試料２５，２５ｄ，２５ｅに向けてシート光３７を透過させ得るように配置されている。観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３とは、試料担持部２１に対して試料２５，２５ｄ，２５ｅとは反対側に配置されている。光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）は、試料担持部２１の試料担持面が延在しかつ互いに交差する第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）とに沿って、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して観察用対物レンズ３４の観察面を相対的に走査させ得るように構成されている。

　レンズホルダ３０は、観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３とを保持し得るように構成されている。レンズホルダ３０は、照射用対物レンズ３３に対する観察用対物レンズ３４の相対的な位置を固定している。レンズホルダ３０は、液体保持部３１を含む。液体保持部３１は、観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３と試料担持部２１との間の空間を満たす屈折率整合液４０を保持し得るように構成されている。

　本実施の形態の顕微鏡は、撮像部７０をさらに備えてもよい。本実施の形態の顕微鏡は、光学ユニット５０と、ミラー５４ｆ（図２を参照）と、フィルタホイール６６と、集光レンズ５６ｃと、ミラー５４ｅとをさらに備えてもよい。本実施の形態の顕微鏡は、入力部８５、出力部８６、制御部８７及び記憶部８８をさらに備えてもよい。

　本実施の形態の分光分析装置１、分光分析方法、プログラム及び記録媒体（記憶部８８）の効果を説明する。

　本実施の形態の分光分析装置１は、撮像部７０と、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）と、解析部８０とを備える。撮像部７０は、試料２５，２５ｄ，２５ｅに含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を検出して、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングし得るように構成されている。光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）は、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させ得るように構成されている。解析部８０は、撮像部７０で取得された複数の分子２６の画像を解析して、複数の分子２６の濃度を取得し得るように構成されている。

　本実施の形態の分光分析装置１では、撮像部７０は、試料２５，２５ｄ，２５ｅに含まれる複数の分子２６を一分子レベルでイメージングし得るように構成されている。そのため、試料２５，２５ｄ，２５ｅにおける複数の分子２６の濃度が例えばｚＭオーダーまたはａＭのオーダーのように低くても、複数の分子２６の濃度は正確に測定され得る。また、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）は、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させ得るように構成されている。そのため、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅにおける複数の分子２６の濃度が測定され得る。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１では、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域は、試料２５，２５ｄ，２５ｅを担持する試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）から５００ｎｍ以上の距離ｄだけ離れた試料２５，２５ｄ，２５ｅの領域を含んでもよい。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１では、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域は、０．１μＬ以上の体積を有してもよい。１０^-10ｍ³（１０^-1μＬ）以上の体積は、１×１０^-21Ｍ（１ｚＭ）または１×１０^-18Ｍ（１ａＭ）のような低い濃度で試料２５，２５ｄ，２５ｅ中に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定することを可能にする。１０^-10ｍ³（１０^-1μＬ）以上の体積は、マイクロピペットのような生化学用器具を用いて試料２５，２５ｄ，２５ｅが容易に定量され得る体積である。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確にかつ容易に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１は、放射光３８を撮像部７０に向けて透過させ得るように配置されている観察用対物レンズ３４をさらに備えてもよい。撮像面７１の共役面７２は、観察用対物レンズ３４の観察面であってもよい。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１は、試料２５，２５ｄ，２５ｅに向けてシート光３７を出射し得るように構成されている光学ユニット５０をさらに備えてもよい。シート光３７は、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２と実質的に平行な進行方向を有してもよい。シート光３７は、複数の分子２６のイメージングにおいて、バックグラウンドノイズを減少させることができるとともに、複数の分子２６の褪色及び光毒性を抑制することができる。また、シート光３７は撮像部７０の撮像面７１の共役面７２と実質的に平行な進行方向を有するため、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２内で不均一な焦点ぼけが発生することが抑制されて、複数の分子２６の明瞭な像を取得することができる。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度をより正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１では、光学ユニット５０は、アキシコンレンズ６０を含んでもよい。アキシコンレンズ６０は、シート光３７の光軸に沿って複数の焦点を分布させ得る。そのため、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２は、シート光３７によって、より広い面積にわたってかつより均一な光強度で照らされ得る。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１では、観察用対物レンズ３４と光学ユニット５０とは、試料２５，２５ｄ，２５ｅを担持する試料担持部２１に対して試料２５とは反対側に配置されてもよい。そのため、試料２５，２５ｄ，２５ｅの上方が開放され、試料２５，２５ｄ，２５ｅの大きさが観察用対物レンズ３４の作動距離の範囲内に限定されない。分光分析装置１を使用している間、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とが試料２５，２５ｄ，２５ｅに接触することが防止されるため、照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とを清浄に保つことができる。試料２５，２５ｄ，２５ｅの大きさ及び相（液相、固相）の制約を受けることなく、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに含まれる複数の分子２６の濃度を測定することができる。本実施の形態の分光分析装置１は、向上された使いやすさを有する。

　本実施の形態の分光分析装置１は、レンズホルダ３０をさらに備えてもよい。光学ユニット５０は、シート光３７を試料２５，２５ｄ，２５ｅに向けて透過させ得るように配置されている照射用対物レンズ３３を含む。レンズホルダ３０は、観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３とを保持して、照射用対物レンズ３３に対する観察用対物レンズ３４の相対的な位置を固定している。そのため、分光分析装置１を構成する複数の部材の熱膨張係数の差に起因して照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａと観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとの間の角度が経時変化することが抑制される。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確にかつ安定的に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１では、レンズホルダ３０は、液体保持部３１を含んでもよい。液体保持部３１は、観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３と試料担持部２１との間の空間を満たす屈折率整合液４０を保持し得るように構成されている。そのため、シート光３７の光路と放射光３８の光路とにおいて発生する非対称な収差が抑制される。液浸レンズである照射用対物レンズ３３の開口数と液浸レンズである観察用対物レンズ３４の開口数とが増加する。本実施の形態の分光分析装置１によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６の濃度をより正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析方法は、複数の分子２６を含む試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させながら、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングして、複数の分子２６の画像を取得すること（Ｓ１）を備える。本実施の形態の分光分析方法は、複数の分子２６の画像を解析して、複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）をさらに備える。本実施の形態の分光分析方法によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態のプログラムは、コンピュータ（制御部８７）によって実行されるプログラムであって、コンピュータ（制御部８７）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。本実施の形態のコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）には、本実施の形態のプログラムが記録されている。本実施の形態のプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６の濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の顕微鏡は、観察用対物レンズ３４と、照射用対物レンズ３３と、レンズホルダ３０と、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）とを備える。観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１に担持される試料２５，２５ｄ，２５ｅに含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を透過させ得るように配置されている。照射用対物レンズ３３は、試料２５，２５ｄ，２５ｅに向けてシート光３７を透過させ得るように配置されている。観察用対物レンズ３４と照射用対物レンズ３３とは、試料担持部２１に対して試料２５，２５ｄ，２５ｅとは反対側に配置されている。光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）は、試料担持部２１の試料担持面（第１主面２１ｒ）が延在しかつ互いに交差する第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）とに沿って、試料２５，２５ｄ，２５ｅの少なくとも一部の領域に対して観察用対物レンズ３４の観察面を相対的に走査させ得るように構成されている。

　本実施の形態の顕微鏡では、レンズホルダ３０は、照射用対物レンズ３３に対する観察用対物レンズ３４の相対的な位置を固定している。そのため、分光分析装置１を構成する複数の部材の熱膨張係数の差に起因して照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａと観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａとの間の角度が経時変化することが抑制される。また、レンズホルダ３０は、液体保持部３１を含み、液体保持部３１は、屈折率整合液４０を保持し得るように構成されている。そのため、シート光３７の光路と放射光３８の光路とにおいて発生する非対称な収差が抑制される。液浸レンズである照射用対物レンズ３３の開口数と液浸レンズである観察用対物レンズ３４の開口数とが増加する。本実施の形態の顕微鏡によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５，２５ｄ，２５ｅに希薄に分布する複数の分子２６を正確にかつ安定的に観察し得る。

　（実施の形態２）
　図１９を参照して、実施の形態２に係る分光分析装置１ｆを説明する。分光分析装置１ｆは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の構成を備えるが、主に以下の点で異なる。

　試料２５ｆは、複数の分子２６ｆを含む。複数の分子２６ｆは、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる複数の第２の分子２７ｂとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｂは、各々、第２の出力光３８ｂを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第１の出力光３８ａは、輝度または半減期（褪色時間）において第２の出力光３８ｂと異なっている。

　図１６に示されるように、複数の第１の分子２７ａは、第１蛍光物質９３でラベルされた第１生体分子９２であってもよい。図２０に示されるように、複数の第２の分子２７ｂは、第１蛍光物質９３でラベルされた第２生体分子９２ｂであってもよい。第２生体分子９２ｂにラベルされている第１蛍光物質９３の量は、第１生体分子９２にラベルされている第１蛍光物質９３の量と異なる。そのため、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｂとにシート光３７が照射されるとき、複数の第２の分子２７ｂから放射される第２の出力光３８ｂは、複数の第１の分子２７ａから放射される第１の出力光３８ａと輝度において異なる。

　複数の分子２６の画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｂが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。

　解析部８０は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の輝度の違いに基づいて、複数の第１の分子の第１濃度と複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得し得るように構成されている。複数の分子２６の各々から放射される放射光３８の輝度に応じて、複数の分子２６を複数の分子２６の種類（複数の第１の分子２７ａ、複数の第２の分子２７ｂ）毎に仕分けることによって、複数の分子２６の種類毎に複数の分子２６の濃度が取得されてもよい。解析部８０は、複数の分子２６の濃度の時間変動及び空間変動を、複数の分子２６の種類（複数の第１の分子２７ａ、複数の第２の分子２７ｂ）毎に取得し得るように構成されてもよい。出力部８６（図１８を参照）は、解析部８０よって取得された複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを表示してもよい。

　図１７及び図１９を参照して、本実施の形態の分光分析方法を説明する。本実施の形態の分光分析方法は、実施の形態１の分光分析方法と同様の工程を備えるが、主に以下の点で異なる。本実施の形態の分光分析方法では、複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の輝度の違いに基づいて、複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを個別に取得することを含む。

　本実施の形態のプログラムは、コンピュータ（制御部８７、図１８を参照）によって実行されるプログラムであって、コンピュータ（制御部８７）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。本実施の形態のコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８、図１８を参照）には、本実施の形態のプログラムが記録されている。本実施の形態のプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）によれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｂとを仕分けながら、試料２５ｆの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１ｆ及び分光分析方法の効果を説明する。本実施の形態の分光分析装置１ｆ及び分光分析方法は、実施の形態１の分光分析装置１及び分光分析方法の効果に加えて、以下の効果を奏する。

　本実施の形態の分光分析装置１ｆでは、複数の分子２６ｆは、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる複数の第２の分子２７ｂとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｂは、各々、第２の出力光３８ｂを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第１の出力光３８ａは、輝度において第２の出力光３８ｂと異なっている。複数の分子２６の画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｂが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。解析部８０は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の輝度の違いに基づいて、複数の第１の分子の第１濃度と複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得し得るように構成されている。

　本実施の形態の分光分析装置１ｆによれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｂとを仕分けながら、試料２５ｆの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析方法では、複数の分子２６は、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる種類の複数の第２の分子２７ｂとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｂは、各々、第２の出力光を放射し得る。画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｂが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の輝度の違いに基づいて、複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを個別に取得することを含む。

　本実施の形態の分光分析方法によれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｂとを仕分けながら、試料２５ｆの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｂの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　（実施の形態３）
　図２１を参照して、実施の形態３に係る分光分析装置１ｇを説明する。分光分析装置１ｇは、実施の形態２の分光分析装置１ｆと同様の構成を備えるが、主に以下の点で異なる。

　試料２５ｇは、複数の分子２６ｇを含む。複数の分子２６ｇは、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる複数の第２の分子２７ｃとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｃは、各々、第２の出力光３８ｂを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第１の出力光３８ａは、波長において第２の出力光３８ｂと異なっている。

　図１６に示されるように、複数の第１の分子２７ａは、第１蛍光物質９３でラベルされた第１生体分子９２であってもよい。図２２に示されるように、複数の第２の分子２７ｃは、第２蛍光物質９３ｂでラベルされた第２生体分子９２ｂであってもよい。第２蛍光物質９３ｂは、第１蛍光物質９３とは種類が異なる。第１の入力光３７ａが第１蛍光物質９３に照射されると、第１蛍光物質９３は第１の出力光３８ａを放射するが、第２蛍光物質９３ｂは光を放射しない。第２の入力光３７ｂが第２蛍光物質９３ｂに照射されると、第２蛍光物質９３ｂは第２の出力光３８ｂを放射するが、第１蛍光物質９３は光を放射しない。

　本実施の形態では、実施の形態１のフィルタホイール６６及びミラー５４ｅに代えて、色分離ミラー６８が配置されている。集光レンズ５６ｃから出射された放射光３８は、色分離ミラー６８に入射される。色分離ミラー６８は、放射光３８を、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとに分離する。色分離ミラー６８は、第１の出力光３８ａを反射してもよく、第２の出力光３８ｂを透過させてもよい。第１の出力光３８ａは、撮像部７０に入射される。第２の出力光３８ｂは、撮像部７０ｂに入射される。

　撮像部（撮像部７０，７０ｂ）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとを検出し、かつ、複数の分子２６の画像を出力し得るように構成されている。複数の分子２６の画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｃが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。

　具体的には、撮像部７０は、複数の第１の分子２７ａから放射される第１の出力光３８ａを検出し、かつ、第１の分子画像を出力し得るように構成されている。撮像部７０は、例えば、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラのようなカメラであってもよい。撮像部７０は、撮像面７１を有する。第１の分子画像は、例えば、複数の第１の分子２７ａの数を数えるのに適した複数の第１の分子２７ａのドットイメージ（複数の第１の分子２７ａの輝点）を含んでもよい。画像処理部７３は、第１の分子画像を二値化処理し得るように構成されてもよい。ローパスフィルタ７４は、第１の分子画像に含まれる高周波成分を除去して、高周波成分が除去された第１の分子画像を画像処理部７３に出力する。

　撮像部７０ｂは、複数の第２の分子２７ｃから放射される第２の出力光３８ｂを検出し、かつ、第２の分子画像を出力し得るように構成されている。撮像部７０ｂは、例えば、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラのようなカメラであってもよい。撮像部７０ｂは、撮像面７１ｂを有する。第２の分子画像は、例えば、複数の第２の分子２７ｃの数を数えるのに適した複数の第２の分子２７ｃのドットイメージ（複数の第２の分子２７ｃの輝点）を含んでもよい。本実施の形態の分光分析装置１ｇは、画像処理部７３ｂを含んでもよい。画像処理部７３ｂは、第２の分子画像を二値化処理し得るように構成されてもよい。本実施の形態の分光分析装置１ｇは、ローパスフィルタ７４ｂをさらに含んでもよい。ローパスフィルタ７４ｂは、第２の分子画像に含まれる高周波成分を除去して、高周波成分が除去された第２の分子画像を画像処理部７３ｂに出力する。

　光走査部（図２から図４を参照）は、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に対して撮像部７０，７０ｂの撮像面７１，７１ｂの共役面７２，７２ｂを相対的に走査させ得るように構成されている。本明細書において、撮像面７１ｂの共役面７２ｂは、試料２５ｇと撮像面７１ｂとの間に存在する出射側光学系（本実施の形態では、観察用対物レンズ３４及び集光レンズ５６ｃ等を含む）において、撮像面７１ｂに対して光学的に共役な面を意味する。撮像面７１ｂの共役面７２ｂは、観察用対物レンズ３４の観察面（焦点面）に一致してもよい。撮像面７１ｂの共役面７２ｂは、撮像面７１の共役面７２に一致してもよい。

　解析部８０は、撮像部（撮像部７０，７０ｂ）に接続されている。解析部８０は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の波長の違いに基づいて、複数の第１の分子の第１濃度と複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得し得るように構成されている。具体的には、解析部８０は、第１の分子画像から、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に含まれている複数の第１の分子２７ａの第１濃度を取得し得るように構成されている。解析部８０は、第２の分子画像から、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に含まれている複数の第２の分子２７ｃの第２濃度を取得し得るように構成されている。

　解析部８０は、複数の分子２６の各々から放射される放射光３８の波長に応じて、複数の分子２６を複数の分子２６の種類（複数の第１の分子２７ａ、複数の第２の分子２７ｃ）毎に仕分けることによって、複数の分子の種類毎に複数の分子２６の濃度が取得し得るように構成されてもよい。解析部８０は、複数の分子２６の濃度の時間変動及び空間変動を、複数の分子２６の種類（複数の第１の分子２７ａ、複数の第２の分子２７ｃ）毎に取得し得るように構成されてもよい。出力部８６（図１８を参照）は、解析部８０よって取得された複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを表示してもよい。

　本実施の形態の変形例では、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の偏光の違いに基づいて、複数の第１の分子の第１濃度と複数の第２の分子の第２濃度とが個別に取得されてもよい。本実施の形態の変形例では、色分離ミラー６８に代えて、偏光ブームスプリッタが用いられる。

　図１７及び図２１を参照して、本実施の形態の分光分析方法を説明する。本実施の形態の分光分析方法は、実施の形態２の分光分析方法と同様の工程を備えるが、主に以下の点で異なる。複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の波長及び偏光の少なくとも１つの違いに基づいて、複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを個別に取得することを含む。

　本実施の形態のプログラムは、コンピュータ（制御部８７、図１８を参照）によって実行されるプログラムであって、コンピュータ（制御部８７）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。本実施の形態のコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８、図１８を参照）には、本実施の形態のプログラムが記録されている。本実施の形態のプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）によれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとを仕分けながら、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１ｇ及び分光分析方法の効果を説明する。本実施の形態の分光分析装置１ｇ及び分光分析方法は、実施の形態２の分光分析装置１ｆ及び分光分析方法と同様の以下の効果を奏する。

　本実施の形態の分光分析装置１ｇでは、複数の分子２６ｆは、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる複数の第２の分子２７ｃとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｃは、各々、第２の出力光３８ｂを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第１の出力光３８ａは、波長及び偏光の少なくとも１つにおいて第２の出力光３８ｂと異なっている。複数の分子２６の画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｃが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。解析部８０は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の波長及び偏光の少なくとも１つの違いに基づいて、複数の第１の分子の第１濃度と複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得し得るように構成されている。

　本実施の形態の分光分析装置１ｇによれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとを仕分けながら、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析方法では、複数の分子２６は、複数の第１の分子２７ａと、複数の第１の分子２７ａとは異なる種類の複数の第２の分子２７ｃとを含む。複数の第１の分子２７ａは、各々、第１の出力光３８ａを放射し得る。複数の第２の分子２７ｃは、各々、第２の出力光を放射し得る。画像は、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｃが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含む。第１の分子画像は、第１の出力光３８ａによって形成される。第２の分子画像は、第２の出力光３８ｂによって形成される。複数の分子２６の濃度を取得すること（Ｓ２）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとの間の波長及び偏光の少なくとも１つの違いに基づいて、複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを個別に取得することを含む。

　本実施の形態の分光分析方法によれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとを仕分けながら、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の第１の分子２７ａの第１濃度と複数の第２の分子２７ｃの第２濃度とを個別にかつ効率的に測定し得る。

　（実施の形態４）
　図２３を参照して、実施の形態４に係る分光分析装置１ｈを説明する。分光分析装置１ｈは、実施の形態３の分光分析装置１ｇと同様の構成を備えるが、主に以下の点で異なる。

　試料２５ｈは、複数の分子２６ｈを含む。複数の分子２６ｈは、各々、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第２の出力光３８ｂは、第１の出力光３８ａと波長において異なっている。例えば、図２４に示されるように、複数の分子２６ｈは、第１蛍光物質９３と第２蛍光物質９３ｂとでラベルされた第１生体分子９２であってもよい。第２蛍光物質９３ｂは、第１蛍光物質９３とは種類が異なる。

　例えば、シート光３７が第１蛍光物質９３に照射されると、第１蛍光物質９３は第１の出力光３８ａを放射し、第２蛍光物質９３ｂは第２の出力光３８ｂを放射してもよい。特定的には、シート光３７は、第１の入力光３７ａと、第２の入力光３７ｂとを含む。第２の入力光３７ｂは、第１の入力光３７ａと波長において異なってもよい。第１の入力光３７ａが第１蛍光物質９３に照射されると、第１蛍光物質９３は第１の出力光３８ａを放射する。第２の入力光３７ｂが第２蛍光物質９３ｂに照射されると、第２蛍光物質９３ｂは第２の出力光３８ｂを放射する。

　撮像部（撮像部７０，７０ｂ）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとを検出し、かつ、複数の分子２６ｈの画像を出力し得るように構成されている。複数の分子２６ｈの画像は、第１の出力光と第２の出力光とによって形成される。撮像部７０は、第１の出力光３８ａによって形成される複数の分子２６ｈの画像を解析部８０に出力する。撮像部７０ｂは、第２の出力光３８ｂによって形成される複数の分子２６ｈの画像を解析部８０に出力する。解析部８０は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとによって形成される複数の分子２６ｈの画像から複数の分子２６ｈの濃度を取得し得るように構成されている。出力部８６（図１８を参照）は、解析部８０によって取得された複数の分子２６ｈの濃度（例えば、複数の分子２６ｈの数と、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；１９ｐ）によって相対的に走査される試料２５の少なくとも一部の領域の体積）を表示してもよい。

　図１７及び図２３を参照して、本実施の形態の分光分析方法を説明する。本実施の形態の分光分析方法は、実施の形態１の分光分析方法と同様の工程を備えるが、主に以下の点で異なる。本実施の形態の分光分析方法では、複数の分子２６ｈの濃度を取得すること（Ｓ２）は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとによって形成される複数の分子２６ｈの画像から複数の分子２６ｈの濃度を取得することを含む。

　本実施の形態のプログラムは、コンピュータ（制御部８７、図１８を参照）によって実行されるプログラムであって、コンピュータ（制御部８７）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。本実施の形態のコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８、図１８を参照）には、本実施の形態のプログラムが記録されている。本実施の形態のプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）によれば、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとを仕分けながら、試料２５ｇの少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６ｈの濃度を正確に測定し得る。

　本実施の形態の分光分析装置１ｈ及び分光分析方法の効果を説明する。本実施の形態の分光分析装置１ｈは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の以下の効果を奏する。

　本実施の形態の分光分析装置１ｈ及び分光分析方法では、複数の分子２６ｈは、各々、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとを放射し得る。放射光３８は、第１の出力光３８ａと、第２の出力光３８ｂとを含む。第１の出力光３８ａは、波長において第２の出力光３８ｂと異なっている。複数の分子２６ｈの画像は、第１の出力光３８ａと第２の出力光３８ｂとによって形成される。本実施の形態の分光分析装置１ｈ及び分光分析方法によれば、相対的に大きな体積を有する試料２５の少なくとも一部の領域に希薄に分布する複数の分子２６ｈの濃度を正確に測定し得る。

　（実施の形態５）
　図２５及び図２６を参照して、実施の形態５に係る分光分析装置１ｉを説明する。分光分析装置１ｉは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の構成を備えるが、主に以下の点で異なる。

　試料２５を担持する試料担持部（２１，２１ｗ，２３）は、複数のウェル２４を含むマルチウェルプレート（２１，２１ｗ，２３）である。複数のウェル２４は、互いに壁２３で分離されている。試料２５は、複数のウェル２４に収容されている。複数のウェル２４に収容されている複数の試料２５は、同じであってもよいし、互いに異なってもよい。

　光走査部（１２，１４，１６，２２；１９；図２、図３、図８及び図２５を参照）は、第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）に、試料２５に対してシート光３７を相対的に走査させ得るように構成されている。一例では、光走査部（１２，１４，１６，２２）は、実施の形態１のように、試料担持部（２１，２１ｗ，２３）を第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）とに移動させ得るように構成されている移動部（１２，１４，１６）を含んでもよい。別の例では、実施の形態１の第１変形例のように、光走査部（１９）は、レンズホルダ３０を第１の方向（ｘ方向）と第２の方向（ｙ方向）とに移動させ得るように構成されている移動部１９を含んでもよい。こうして、１つのウェル２４内において、試料２５の少なくとも一部の領域に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を、相対的に走査させ得る。複数のウェル２４間で、撮像部７０の撮像面７１の共役面７２あるいは観察用対物レンズ３４の観察面を移動させ得る。

　本実施の形態の分光分析方法を説明する。
　光走査部（１２，１４，１６，２２；１９）により、１つのウェル２４に収容されている試料２５に対して撮像部７０（図１を参照）の撮像面７１（図１を参照）の共役面７２を相対的に走査させながら、１つのウェル２４に含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部７０で検出する。特定的には、１つのウェル２４に収容されている試料２５に対してシート光３７を相対的に走査させながら、１つのウェル２４に含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部７０で検出する。撮像部７０は、放射光３８によって形成される複数の分子２６の画像を出力する。複数の分子２６の画像では、複数の分子２６が一分子レベルでイメージングされている。解析部８０（図１を参照）を用いて、１つのウェル２４内の試料２５に含まれる複数の分子２６の画像から、１つのウェル２４内の試料２５における複数の分子２６の濃度が取得される。

　それから、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９）は、シート光３７を別のウェル２４に収容されている試料２５に照射させる。一例では、実施の形態１のように、移動部（１２，１４，１６）を用いて、試料担持部（２１，２１ｗ，２３）を第１の方向（ｘ方向）及び第２の方向（ｙ方向）の少なくとも１つに移動させることにより、シート光３７を別のウェル２４に収容されている試料２５に照射させてもよい。別の例では、実施の形態１の第１変形例のように、移動部１９を用いて、レンズホルダ３０を第１の方向（ｘ方向）及び第２の方向（ｙ方向）の少なくとも１つに移動させることにより、シート光３７を別のウェル２４に収容されている試料２５に照射させてもよい。

　それから、光走査部（１２，１４，１６，２２；１９）により、別のウェル２４に収容されている試料２５に対して撮像部７０の撮像面７１の共役面７２を相対的に走査させながら、別のウェル２４に含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部７０で検出する。特定的には、別のウェル２４に収容されている試料２５に対してシート光３７を相対的に走査させながら、別のウェル２４に含まれる複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部７０で検出する。撮像部７０は、放射光３８によって形成される複数の分子２６の画像を出力する。複数の分子２６の画像では、複数の分子２６が一分子レベルでイメージングされている。解析部８０（図１を参照）を用いて、別のウェル２４内の試料２５に含まれる複数の分子２６の画像から、別のウェル２４内の試料２５における複数の分子２６の濃度が取得される。

　以上の工程を繰り返す。こうして、分光分析装置１ｉを用いて、複数のウェル２４の各々内の試料２５に含まれる複数の分子２６の濃度が個別に取得され得る。

　本実施の形態のプログラムは、コンピュータ（制御部８７、図１８を参照）によって実行されるプログラムであって、コンピュータ（制御部８７）に本実施の形態の分光分析方法を実行させるプログラムである。本実施の形態のコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８、図１８を参照）には、本実施の形態のプログラムが記録されている。本実施の形態のプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体（記憶部８８）によれば、複数のウェル２４の各々に収容されている試料２５に含まれる複数の分子２６の濃度を正確にかつ効率的に測定することができる。

　図２７に示されるように、本実施の形態の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法は、複数の細胞１００を個別に分析するためにも適用され得る。具体的には、複数のウェル２４の各々に、細胞１００が一つずつ収容されている。タンパク質である複数の分子２６は、複数の細胞１００のうちの少なくとも一つに含まれている。複数の細胞１００の各々について、前述した方法と同様の方法により、複数の分子２６の濃度を測定する。

　分光分析装置１ｉは、複数の細胞１００毎に、タンパク質（分子２６）の含有状態を分析することを可能にする。例えば、複数の細胞１００の少なくとも一部がウイルスに感染した直後では、複数の細胞１００の一部に極低濃度のウィルス由来のタンパク質（分子２６）が含有されている。分光分析装置１ｉは、複数の細胞１００が含有しているタンパク質（分子２６）の濃度を正確に測定することができる。複数の細胞１００の各々について、ウイルスの感染の有無及びその程度を正確にかつ効率的に分析することができる。

　本実施の形態の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法の効果を説明する。本実施の形態の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法は、実施の形態１の分光分析装置１及び分光分析方法の効果に加えて、以下の効果を奏する。本実施の形態の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法によれば、複数のウェル２４の各々に収容されている試料２５に含まれる複数の分子２６の濃度を正確にかつ効率的に測定することができる。なお、本実施の形態の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法の変形例では、壁２３が設けられていない試料担持部２１の複数の領域のそれぞれ上に、複数の試料２５が互いに離間して配置されてもよい。

　（実施の形態６）
　図２８及び図２９を参照して、実施の形態６に係る分光分析装置１ｋを説明する。分光分析装置１ｋは、実施の形態５の分光分析装置１ｉと同様の構成を備えるが、主に以下の点で異なる。

　分光分析装置１ｋでは、複数の分子２６は、ゲル２８ｄ中に含まれている。試料担持部２１、側壁２１ｗ及び壁２３は、容器（２１、２１ｗ、２３）を構成している。容器（２１、２１ｗ、２３）は、例えば、ゲルで形成されている。容器（２１、２１ｗ、２３）は、複数のウェル２４を含む。複数のウェル２４の各々は、複数の分子２６及びゲル２８ｄを収容している。容器（２１、２１ｗ、２３）は、試料台２２に保持されている。試料台２２は、第１の方向（ｘ方向）と第３の方向（ｚ方向）とに移動可能に構成されている。一例として、図３０に、分光分析装置１ｋによって得られた、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）でラベルされた抗体（抗マウス　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体）がゲランガムゲルに封入された試料２５ｄの画像を示す。分光分析装置１ｋでは、複数の分子２６は、ゲル２８ｄに代えて、液体２８中に含まれてもよい。

　本実施の形態の分光分析装置１ｋ及び分光分析方法は、実施の形態５の分光分析装置１ｉ及び分光分析方法の効果に加えて、以下の効果を奏する。本実施の形態の分光分析装置１ｋ及び分光分析方法では、試料担持部２１として、カバーガラス及びシャーレを用いる必要がない。

　（実施の形態７）
　図３１を参照して、実施の形態７に係る分光分析装置１ｍを説明する。分光分析装置１ｍは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の構成を備え、同様の効果を奏するが、主に以下の点で異なる。

　側壁２１ｗに透明窓２１ｍが設けられている。照射用対物レンズ３３は、容器（２１、２１ｗ）の外側に配置されている。照射用対物レンズ３３は、透明窓２１ｍに面してもよい。照射用対物レンズ３３は、試料担持部２１に対して、試料２５と同じ側に配置されてもよい。照射用対物レンズ３３は、試料担持部２１の上方に配置されてもよい。照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａは、試料担持部２１の第１主面２１ｒに沿って延在している。照射用対物レンズ３３の第１の光軸３３ａは、観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａに垂直であってもよい。観察用対物レンズ３４は、試料担持部２１の第２主面２１ｓに面している。観察用対物レンズ３４の第２の光軸３４ａは、第１主面２１ｒに垂直であってもよい。

　シート光３７は、試料担持部２１の第１主面２１ｒに沿って進む。シート光３７は、照射用対物レンズ３３及び透明窓２１ｍを通って、試料２５を照射する。観察用対物レンズ３４は、複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部（図示せず）に向けて透過させる。

　（実施の形態８）
　図３２を参照して、実施の形態８に係る分光分析装置１ｎを説明する。分光分析装置１ｎは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の構成を備え、同様の効果を奏するが、主に以下の点で異なる。

　照射用対物レンズ３３と観察用対物レンズ３４とは、試料担持部２１に対して、試料２５と同じ側に配置されている。照射用対物レンズ３３の一部と観察用対物レンズ３４の一部とは、液体２８に浸漬されている。屈折率整合液４０は、設けられていない。

　（実施の形態９）
　図３３を参照して、実施の形態９に係る分光分析装置１ｐを説明する。分光分析装置１ｐは、実施の形態１の分光分析装置１と同様の構成を備え、同様の効果を奏するが、主に以下の点で異なる。

　分光分析装置１ｐは、複数の分子２６を一分子レベルでイメージングすることを可能にする薄層斜光照明（ＨＩＬＯ）光学系を備えている。具体的には、分光分析装置１ｐは、実施の形態１の照射用対物レンズ３３及び観察用対物レンズ３４に代えて、レンズ１３３を備えている。レンズ１３３の光軸１３３ａは、試料担持部２１の第１主面２１ｒに垂直である。レンズ１３３は、実施の形態１の照射用対物レンズ３３の機能と観察用対物レンズ３４の機能とを有している。分光分析装置１ｐは、入力光５３をシート光３７に変換する光学系（例えば、ビーム形状変換部６２（図１））を備えていない。

　入力光５３は、レンズ１３３の縁部に入射する。入力光５３は、レンズ１３３で屈折する。入力光５３は、試料担持部２１の第１主面２１ｒで屈折する。入力光５３は、シート光３７に変換される。シート光３７は、レンズ１３３の光軸１３３ａに対して、例えば７５°以上９０°未満の角度で、試料２５ｄ中を進む。レンズ１３３は、複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部（図示せず）に向けて透過させる。一例として、図３４に、分光分析装置１ｐによって得られた、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）でラベルされた抗体（抗マウス　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体）がゲランガムゲルに封入された試料２５ｄの画像を示す。分光分析装置１ｐでは、複数の分子２６は、ゲル２８ｄに代えて、液体２８中に含まれてもよい。

　（実施の形態１０）
　図３５を参照して、実施の形態１０に係る分光分析装置１ｑを説明する。分光分析装置１ｑは、実施の形態９の分光分析装置１ｐと同様の構成を備え、同様の効果を奏するが、主に以下の点で異なる。

　分光分析装置１ｑは、薄層斜光照明（ＨＩＬＯ）光学系に代えて、広視野照明光学系を備えている。入力光５３は、レンズ１３３の光軸１３３ａに沿って進む。入力光５３は、レンズ１３３によってコリメートされる。入力光５３は、レンズ１３３の光軸１３３ａに沿って、試料２５ｄ中を進む。レンズ１３３は、複数の分子２６から放射される放射光３８を撮像部（図示せず）に向けて透過させる。一例として、図３６に、分光分析装置１ｑによって得られた、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７）でラベルされた抗体（抗マウス　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体）がゲランガムゲルに封入された試料２５ｄの画像を示す。分光分析装置１ｑでは、複数の分子２６は、ゲル２８ｄに代えて、液体２８中に含まれてもよい。

　（応用例１）
　本明細書に開示された分光分析装置１，１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑ及び分光分析方法は、蛍光抗体（ＦＡ）法（図３７を参照）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ、図３８を参照）または蛍光アプタマーを用いた、タンパク質の検出に応用され得る。タンパク質についてはＰＣＲ法のような指数的な増幅法が存在しない。微量なタンパク質にラベルされた蛍光物質から放射される蛍光の強度を増幅させることが困難である。これに対し、本明細書に開示された分光分析装置１，１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑ及び分光分析方法では、試料２５に含まれる複数の分子２６を一分子レベルでイメージングし得る。そのため、タンパク質の濃度が極めて低くても、タンパク質を増幅させることなく、タンパク質の濃度を正確に測定することができる。

　図３７に、蛍光抗体法の一例を示す。図３７では、ビーズ１０３は、抗体１０２で修飾されている。ビーズ１０３は、抗体１０２を介して、タンパク質９２ｔに結合する。蛍光抗体（９３，１０４）は、タンパク質９２ｔに結合する。蛍光抗体（９３，１０４）は、第１蛍光物質９３で修飾された抗体１０４である。本明細書に開示された分光分析装置１，１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑ及び分光分析方法を用いて、第１蛍光物質９３からの放射光（蛍光）を検出する。タンパク質９２ｔは、一分子レベルでイメージングされ得る。タンパク質９２ｔの濃度が正確に測定され得る。

　ビーズ１０３は、試料２５を遠心分離処理したときに、不純物を容易に取り除くことを可能にする。ビーズ１０３は、液体２８中におけるタンパク質９２ｔの拡散速度を減少させて、タンパク質９２ｔを一分子レベルで明瞭にイメージングすることを可能にする。蛍光抗体法は、直接蛍光抗体法だけでなく、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）法または間接免疫蛍光（ＩＩＦ）法も含む。また、蛍光抗体法では、ビーズ１０３及び抗体１０２は用いられなくてもよい。

　図３８に、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）の一例を示す。図３８では、抗体１０５が試料担持部２１に結合されている。タンパク質９２ｔは、抗体１０５に結合されている。酵素１０７で修飾された抗体１０６は、タンパク質９２ｔに結合する。液体２８は、基質１０８を含んでいる。基質１０８は、蛍光を放射しない。酵素１０７は、基質１０８を蛍光基質９３ｕに変換する。本明細書に開示された分光分析装置１，１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑ及び分光分析方法を用いて、蛍光基質９３ｕからの放射光（蛍光）を検出する。タンパク質９２ｔは、一分子レベルでイメージングされ得る。タンパク質９２ｔの濃度が正確に測定され得る。

　（応用例２）
　図３９に、実施の形態１の分光分析装置１を、蛍光相関分光（ＦＣＳ）装置またはラマン相関分光装置のような相関分光装置５に適用した例を示す。本明細書に開示された分光分析装置１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑもまた、相関分光装置に適用され得る。本明細書に開示された分光分析方法は、蛍光相関分光法またはラマン相関分光法のような相関分光法に適用され得る。蛍光相関分光法では、放射光３８は蛍光である。ラマン相関分光法では、放射光３８はラマン散乱光である。

　相関分光装置５では、解析部８０は、自己相関器８２ｂを含む。自己相関器８２ｂは、例えば、デジタル相関器であってもよい。自己相関器８２ｂは、試料２５の少なくとも一部の領域に含まれる複数の分子２６の数の時間的なゆらぎを算出し得るように構成されている。複数の分子２６の数の時間的なゆらぎから、複数の分子２６のサイズ（例えば、分子量）に関する情報、複数の分子２６の周りの環境（例えば、粘性）に関する情報、及び、複数の分子２６の数に関する情報の少なくとも１つを得ることができる。

　（応用例３）
　図４０に、実施の形態３の分光分析装置１ｇを、蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ）装置またはラマン相互相関分光装置のような相互相関分光装置６に適用した例を示す。実施の形態３の分光分析方法は、蛍光相互相関分光法またはラマン相互相関分光法のような相互相関分光法に適用され得る。蛍光相互相関分光法では、放射光３８は蛍光である。ラマン相互相関分光法では、放射光３８はラマン散乱光である。

　相互相関分光装置６では、解析部８０は、相互相関器８２ｃを含む。相互相関器８２ｃは、例えば、デジタル相関器であってもよい。相互相関器８２ｃは、試料２５の少なくとも一部の領域に含まれる第１の分子２７ａの数及び第２の分子２７ｂの数の時間的なゆらぎの同時性を算出し得るように構成されている。第１の分子２７ａの数及び第２の分子２７ｂの数の時間的なゆらぎの同時性から、第１の分子２７ａと第２の分子２７ｂとの間の相互作用を定量的に測定することができる。例えば、抗原抗体反応における解離定数等を算出することができる。

　（応用例４）
　図４１に、実施の形態３の分光分析装置１ｇを、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）測定装置７に適用した例を示す。実施の形態３の分光分析方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）測定法に適用され得る。

　試料２５ｇは、複数の分子２６ｇを含む。蛍光共鳴エネルギー移動測定装置７では、試料２５ｇに、第１の入力光３７ａだけが入射し、第２の入力光３７ｂは入射しない。複数の分子２６ｇは、複数の第１の分子２７ａと、複数の第２の分子２７ｃとを含む。複数の第１の分子２７ａは、シート光３７を吸収し得る。複数の第２の分子２７ｃは、蛍光共鳴エネルギー移動により、シート光３７を吸収した複数の第１の分子２７ａからエネルギーを受け取り得る。

　複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとの間の距離が小さい場合、複数の第１の分子２７ａから複数の第２の分子２７ｃへの蛍光共鳴エネルギー移動が生じて、複数の第２の分子２７ｃは複数の第１の分子２７ａからエネルギーを受け取る。複数の第２の分子２７ｃは、第２の出力光３８ｂを放射する。これに対し、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとの間の距離が大きい場合、複数の第１の分子２７ａから複数の第２の分子２７ｃへの蛍光共鳴エネルギー移動が生じず、複数の第２の分子２７ｃは複数の第１の分子２７ａからエネルギーを受け取ることができない。複数の第２の分子２７ｃは、第２の出力光３８ｂを放射しない。

　蛍光共鳴エネルギー移動測定装置７では、解析部８０は、相互作用指標算出部８２ｄを含む。相互作用指標算出部８２ｄは、複数の第１の分子２７ａが一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、複数の第２の分子２７ｃが一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とから、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとの間の相互作用を表す指標を算出するように構成されている。

　一例では、指標は、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとの間の結合の解離定数であってもよい。別の例では、指標は、複数の第１の分子２７ａの全体うち、複数の第２の分子２７ｃと結合している複数の第１の分子２７ａの割合であってもよい。こうして、蛍光共鳴エネルギー移動測定装置７は、複数の第１の分子２７ａと複数の第２の分子２７ｃとの間の相互作用（例えば、結合または解離）を定量的に測定することができる。

　今回開示された実施の形態１－１０及びそれらの変形例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。矛盾のない限り、実施の形態１－１０及びそれらの変形例の少なくとも２つを組み合わせてもよい。本発明の範囲は、上記した説明ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることを意図される。

　１，１ｆ，１ｇ，１ｈ，１ｉ，１ｋ，１ｍ，１ｎ，１ｐ，１ｑ　分光分析装置、５　相関分光装置、６　相互相関分光装置、７　蛍光共鳴エネルギー移動測定装置、１０　基台、１１　ガイドレール、１２　ｘ－ｙステージ、１３　ブロック、１４　粗動ステージ、１５　第１板部材、１６　微動ステージ、１７　第２板部材、１８　脚部材、１９　移動部、１９ｍ　モータ、１９ｎ　ボールねじ、１９ｐ　流れ生成部、２１，２１ｃ　試料担持部、２１ｍ　透明窓、２１ｒ　第１主面、２１ｓ　第２主面、２１ｗ　側壁、２２　試料台、２３　壁、２４　ウェル、２５，２５ｄ，２５ｅ，２５ｆ，２５ｇ，２５ｈ　試料、２６，２６ｆ，２６ｇ，２６ｈ，９８ａ，９８ｂ，９８ｃ，９８ｄ　分子、２７ａ　第１の分子、２７ｂ，２７ｃ　第２の分子、２８　液体、２８ｄ　ゲル、２８ｅ　メンブレン、２９ｐ　第１端、２９ｑ　第２端、３０　レンズホルダ、３０ａ　開口、３０ｈ　注入口、３０ｔ　頂部、３１　液体保持部、３３　照射用対物レンズ、３３ａ　第１の光軸、３４　観察用対物レンズ、３４ａ　第２の光軸、３５　第１アーム、３７　シート光、３７ａ　第１の入力光、３７ｂ　第２の入力光、３８　放射光、３８ａ　第１の出力光、３８ｂ　第２の出力光、４０　屈折率整合液、４２　チューブ、４５　照明光源、４７　コンデンサレンズ、４８　第２アーム、４９　第３アーム、５０　光学ユニット、５１　光源、５２ａ　第１の光源要素、５２ｂ　第２の光源要素、５３　入力光、５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，５４ｄ，５４ｅ，５４ｆ　ミラー、５５　光合波器、５６ａ，５６ｂ，５６ｃ　集光レンズ、５７　光ファイバ、５８ａ，５８ｂ，５８ｃ　コリメートレンズ、５９　輪帯位相素子、６０　アキシコンレンズ、６２　ビーム形状変換部、６４　アパーチャ、６６　フィルタホイール、６６ｐ　回転板、６７，６７ｂ　フィルタ、６８　色分離ミラー、７０，７０ｂ　撮像部、７１，７１ｂ　撮像面、７２，７２ｂ　共役面、７３，７３ｂ　画像処理部、７４，７４ｂ　ローパスフィルタ、８０　解析部、８２　計数部、８２ｂ　自己相関器、８２ｃ　相互相関器、８２ｄ　相互作用指標算出部、８５　入力部、８６　出力部、８７　制御部、８７ｐ　演算部、８８　記憶部、９０　核酸配列、９１　オリゴＤＮＡ、９２　第１生体分子、９２ｂ　第２生体分子、９２ｔ　タンパク質、９３　第１蛍光物質、９３ｂ　第２蛍光物質、９３ｕ　蛍光基質、９６ａ，９６ｂ，９６ｃ，９６ｄ　試料載置部、９６ｍ　マーカ載置部、９７ａ，９７ｂ，９７ｃ，９７ｄ　分子量マーカ、１００　細胞、１０１　核、１０２，１０４，１０５，１０６　抗体、１０３　ビーズ、１０７　酵素、１０８　基質、１３３　レンズ、１３３ａ　光軸

Claims

　試料に含まれる複数の分子から放射される放射光を検出して、前記複数の分子を一分子レベルでイメージングし得るように構成されている撮像部と、
　前記試料の少なくとも一部の領域に対して前記撮像部の撮像面の共役面を相対的に走査させ得るように構成されている光走査部と、
　前記撮像部で取得された前記複数の分子の画像を解析して、前記複数の分子の濃度を取得し得るように構成されている解析部とを備える、分光分析装置。
　前記試料の前記少なくとも一部の領域は、前記試料を担持する試料担持部の試料担持面から５００ｎｍ以上の距離だけ離れた前記試料の領域を含む、請求項１に記載の分光分析装置。
　前記試料の前記少なくとも一部の領域は、０．１μＬ以上の体積を有する、請求項１または請求項２に記載の分光分析装置。
　前記解析部は、前記画像に含まれる前記複数の分子の数を計数し得るように構成されている計数部を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の分光分析装置。
　前記放射光は、蛍光または散乱光である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の分光分析装置。
　前記試料を担持する試料担持部は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートであり、
　前記試料は、前記複数のウェルに収容されている、請求項１に記載の分光分析装置。
　前記放射光を前記撮像部に向けて透過させ得るように配置されている観察用対物レンズをさらに備え、
　前記撮像面の前記共役面は、前記観察用対物レンズの観察面である、請求項１に記載の分光分析装置。
　前記試料に向けてシート光を出射し得るように構成されている光学ユニットをさらに備え、
　前記シート光は、前記撮像面の前記共役面と実質的に平行な進行方向を有する、請求項７に記載の分光分析装置。
　前記光学ユニットは、アキシコンレンズを含む、請求項８に記載の分光分析装置。
　前記観察用対物レンズと前記光学ユニットとは、前記試料を担持する試料担持部に対して前記試料とは反対側に配置されている、請求項８または請求項９に記載の分光分析装置。
　レンズホルダをさらに備え、
　前記光学ユニットは、前記シート光を前記試料に向けて透過させ得るように配置されている照射用対物レンズを含み、
　前記レンズホルダは、前記観察用対物レンズと前記照射用対物レンズとを保持して、前記照射用対物レンズに対する前記観察用対物レンズの相対的な位置を固定している、請求項１０に記載の分光分析装置。
　前記レンズホルダは、液体保持部を含み、
　前記液体保持部は、前記観察用対物レンズと前記照射用対物レンズと前記試料担持部との間の空間を満たす屈折率整合液を保持し得るように構成されている、請求項１１に記載の分光分析装置。
　前記複数の分子は、複数の第１の分子と、前記複数の第１の分子とは異なる種類の複数の第２の分子とを含み、
　前記複数の第１の分子は、各々、第１の出力光を放射し得るものであり、
　前記複数の第２の分子は、各々、第２の出力光を放射し得るものであり、
　前記放射光は、前記第１の出力光と、前記第２の出力光とを含み、前記第１の出力光は、輝度、波長及び偏光の少なくとも１つにおいて前記第２の出力光と異なっており、
　前記画像は、前記複数の第１の分子が一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、前記複数の第２の分子が一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含み、
　前記第１の分子画像は、前記第１の出力光によって形成され、
　前記第２の分子画像は、前記第２の出力光によって形成され、
　前記解析部は、前記第１の出力光と前記第２の出力光との間の前記輝度、前記波長及び前記偏光の前記少なくとも１つの違いに基づいて、前記複数の第１の分子の第１濃度と前記複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得し得るように構成されている、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の分光分析装置。
　前記複数の分子は、各々、第１の出力光と第２の出力光とを放射し得るものであり、
　前記放射光は、前記第１の出力光と、前記第２の出力光とを含み、前記第１の出力光は、波長において前記第２の出力光と異なっており、
　前記画像は、前記第１の出力光と前記第２の出力光とによって形成される、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の分光分析装置。
　複数の分子を含む試料の少なくとも一部の領域に対して撮像部の撮像面の共役面を相対的に走査させながら、前記複数の分子を一分子レベルでイメージングして、前記複数の分子の画像を取得することと、
　前記複数の分子の前記画像を解析して、前記複数の分子の濃度を取得することとを備える、分光分析方法。
　前記複数の分子は、複数の第１の分子と、前記複数の第１の分子とは異なる種類の複数の第２の分子とを含み、
　前記複数の第１の分子は、各々、第１の出力光を放射し得るものであり、
　前記複数の第２の分子は、各々、第２の出力光を放射し得るものであり、
　前記画像は、前記複数の第１の分子が一分子レベルでイメージングされている第１の分子画像と、前記複数の第２の分子が一分子レベルでイメージングされている第２の分子画像とを含み、
　前記第１の分子画像は、前記第１の出力光によって形成され、
　前記第２の分子画像は、前記第２の出力光によって形成され、
　前記複数の分子の前記濃度を取得することは、前記第１の出力光と前記第２の出力光との間の輝度、波長及び偏光の少なくとも１つの違いに基づいて、前記複数の第１の分子の第１濃度と前記複数の第２の分子の第２濃度とを個別に取得することを含む、請求項１５に記載の分光分析方法。
　コンピュータによって実行されるプログラムであって、前記プログラムは、前記コンピュータに請求項１５または請求項１６に記載の前記分光分析方法を実行させる、プログラム。
　請求項１７に記載の前記プログラムが記録された、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
　試料担持部に担持される試料に含まれる複数の分子から放射される放射光を透過させ得るように配置されている観察用対物レンズと、
　前記試料に向けてシート光を透過させ得るように配置されている照射用対物レンズと、
　前記観察用対物レンズと前記照射用対物レンズとを保持し得るように構成されているレンズホルダとを備え、前記レンズホルダは、前記照射用対物レンズに対する前記観察用対物レンズの相対的な位置を固定しており、さらに、
　光走査部を備え、前記光走査部は、前記試料担持部の試料担持面が延在しかつ互いに交差する第１の方向と第２の方向とに沿って、前記試料の少なくとも一部の領域に対して前記観察用対物レンズの観察面を相対的に走査させ得るように構成されており、
　前記観察用対物レンズと前記照射用対物レンズとは、前記試料担持部に対して前記試料とは反対側に配置されており、
　前記レンズホルダは、液体保持部を含み、
　前記液体保持部は、前記観察用対物レンズと前記照射用対物レンズと前記試料担持部との間の空間を満たす屈折率整合液を保持し得るように構成されている、顕微鏡。