CN116324569A - 对生物样本进行光显微镜多尺度记录的方法和设备 - Google Patents

Abstract

提出了对用多种染料(90)染色的样本(7)进行成像的方法(41、42、43、44、45)和设备(1)。这些方法(41、42、43、44、45)使得高达分子分辨率的纳米成像能够置于显微镜成像的空间环境中或者在显微镜成像的空间环境中能够执行单个分子的纳米跟踪。这些方法(41、42、43、44、45)以特别有效的方式组合了不同的光学显微术方法。分子分辨率可以通过定位显微镜方法实现，特别是通过根据MINFLUX方法或STED‑MINFLUX方法实现。这些方法(41、42、43、44、45)的特征在于，一方面在以分子分辨率成像之前的步骤中，这些方法对样本(7)特别温和，而在定位过程中，这些方法对荧光光子进行最佳的利用或使得荧光光子能够被最佳地利用。

Description

对生物样本进行光显微镜多尺度记录的方法和设备

发明的技术领域

本发明涉及光学显微术(lichtoptische Mikroskopie)的方法，特别是对生物样本的超分辨率、无衍射限制的光学荧光显微术的方法。本发明还涉及组合方法，其中无衍射限制的光学荧光显微术方法构成组成部分。此外，本发明还涉及具有光技术的但非荧光显微镜的工艺部件的工艺组合，以及具有非光学的工艺部件的工艺组合。此外，本发明涉及相应的设备。

现有技术

从德国专利文献DE 10 2018 126 232 B3中已知一种具有多个光源的扫描显微镜。光源可以是窄带激光器或白光激光器。光源借助于二向色镜分别被单独或共同地耦合到一个共同的照射光路中。耦合发生在探测光在相反方向照射透过的区段中。不同光源的集合可设置用于不同的目的，例如，集合中的各个光源可以为共焦显微镜记录、借助于MINFLUX纳米显微镜的记录或借助于STED显微术对不同染料的记录提供激发光。光源也可以用作荧光阻抑光的光源，特别是用作STED光的光源。在这种情况下，显微镜还必须具有光束整形装置，该装置调节照射光的波前，以便在物镜的焦点处形成荧光阻抑光的、由强度极大值包围的强度零点。MINFLUX纳米显微镜中也必须有相应的光束整形装置。该专利涉及一种更换设备，借助于该更换设备，当有关光源不需要用于照射时，将与光源相关联的二向色镜替换为平面平行板，该平面平行板对光路施加与二向色镜相同的平行偏移。这一方面保证了在不需要的光源的波长下从样本发射的光也可以被探测到，另一方面也保证了光路的相互对准保持不变。扫描显微镜还具有：物镜，通过该物镜将照射光聚焦到样本上；以及扫描仪，该扫描仪使照射光的光强分布相对于样本移动，并对探测光进行反扫描(entscannen)。此外，扫描显微镜在探测光路中具有由可调节的短通滤波器和可调节的长通滤波器组成的可调节的波长选择带通滤波器。通过滤波器的光通过探测光输出端被送入探测器，而反射光则被送入另一输出端。随后，该反射光可被送入另一可调节的波长选择带通滤波器，也就是说，该滤波器可以级联。在滤波器的帮助下，可以通过不断调谐滤波器来分析探测光的光谱。

从德国公开文献DE 10 2010 015 915 A1中已知一种借助于显微镜实施的测定样本中荧光染料的激发光谱和发射光谱的方法。显微镜配备有多个探测器，其中探测器交替地探测不同波段的光。所有波段都可以发生光谱位移，但即使在位移之后，探测器也会交替地探测到不同波段的光。此外，显微镜具有激光器，该激光器的发射波长可以发生光谱位移。为了测定激发光谱，用第一波长对样本进行第一激发，并用相对于光谱探测波段处于第一设置的多个探测器来测量荧光，然后进行激发波长的位移，用处于第一设置的多个探测器再次测量产生的荧光；必要时多次反复；在具体示出的实施方式中，用总共五个激发波长依次进行激发，并用五个探测器进行探测。这个序列构成激发步骤的第一运行。在该运行中，通过确定每个激发波长的单个探测器信号之和来获得激发光谱的(五个)第一支持点(Stützstelle)。同时，对于(五个)激发波长中的每一个都获得了具有多个(五个)支撑点的发射光谱；根据公开文献，将获得可用于测定发射光谱的信息。根据激发波长和探测波段之间关系的图形表示，在第一运行中，第一探测器的探测波段刚好在第一激发波长以上开始，第二探测器的探测波段刚好在第二激发波长以上开始，以此类推。随后，相应地进行第二运行，一方面，所有探测器的探测波段被位移一定量，另一方面激发波长被位移相同的量。在此，根据图形表示，长波探测器的波段变得更窄，因为探测范围的下临界波长改变了，但上临界波长没有改变。在第二运行中，将获得激发光谱的(五个)另外的支持点。现在可以用进一步位移的激发波长和探测波段进行相应的进一步运行。这种位移正好持续直到随着进一步的位移，下一运行的第一激发波长对应于第一运行的第二激发波长。这意味着，每个单独的激发波长都正好用于探测器的光谱波段一次设置。运行可以并且最好在样本的扫描成像过程中进行。优选地，样本的扫描和样本的检测以如下方式进行，即在完全检测导光谱的情况下就可以得到样本的完整图像。在该文献中进一步指出，对于每个激发波长，从各个探测器的信号获得发射光谱，在上述实施例中是有五个支撑点。可以通过增加单个探测器的数量来增加支持点的数量。此外，还声称具有相同发射光谱的染料可以基于不同的激发光谱来区分，这使得在多种染色的样本中能够对染料单独成像。然而，仔细观察就会发现，作为唯一实施例而特别给出的方法是有缺陷的，并且关于应用于多重染色的样本的说法并不适用。这是因为探测范围的下临界波长随着激发波长从一个运行到另一运行的位移而位移，而使检测的波长范围从一个运行到另一个运行发生变化，该波长范围变得更小，因此与在第一运行中获得的值相比，在第二运行中获得的值将系统性和不按比例地变得过小。如果样本中存在多种染料，则无论上述问题如何，都根本不可能确定染料中单一染料的激发光谱。这是因为在激发过程中，总是多种染料被激发，因此探测器总是探测到总和信号。只有当单一染料的激发光谱是已知的，才有可能将总和信号分解成其各个加数。如果是这种情况，则可以确定染料在激发范围内的比例。但实际上，首先应根据方法确定激发光谱。

在现有技术中多次提及显微镜，特别是具有光谱灵敏度范围可调节的探测单元的共焦激光扫描显微镜。德国公开文献DE 10 2006 034 908 A1就是一个示例。探测波长根据各样本中存在的荧光团来定期调节。滤波器的可调性用于在开始对样本进行图像采集之前，只需对部件进行调节，而不需要进行更换。

MINFLUX纳米显微术仍是一种新的显微显微术方法。MINFLUX纳米显微术是一种定位显微显微术的方法。荧光团的定位是借助于结构化的激发光分布来进行的。MINFLUX纳米显微术的基本特征在于，荧光团被激发的方式是，待定位的荧光团始终被置于靠近或处于激发光分布的最小值，该最小值理想情况下是零点，其中激发光分布在最小值附近具有强度上升区域。由此，在获得有关各发射荧光团位置的信息方面可以更好地利用荧光光子。这也适用于跟踪荧光团随时间运动的应用。利用激发最小值观察样本是MINFLUX纳米显微术的基础，从专利DE 10 2011 055 367 B4(这里最初仅用于跟踪样本中单个分子的运动)和DE 10 2013 114 860 B3中已知。在DE 10 2011 055 367 B4中，还提到了同时跟踪两种不同荧光团的可能性。为此，将使用两种不同的光源，在这两种光源之间快速切换。

在此基础上，出现了一系列用于信息获取的改进措施使荧光团定位的不确定性能够在2nm以下的范围内。该不确定性的大小对应于荧光团的扩展范围。关于MINFLUX纳米显微术的详细介绍参见Francisco Balzarotti等人的“Nanometer resolution imaging andtracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”，arXiv：1611.03401[physics.optics](2016)。原则上，为了能够借助于MINFLUX纳米显微术定位荧光团，必须将强度最小值或者强度零点置于相对于荧光团位置的多个位置处。为此，必须在准备步骤中以较低的第一精度估计荧光团的位置。例如，这可以借助于常规的定位显微(PALM，STORM)或其他已知的方法来完成。在上述公开文件中，描述了一种方法，其中用高斯强度分布来扫描样本，直到在一扫描位置探测到以一定概率来自单个分子的荧光。然后停止扫描，并随后将强度分布定位在扫描位置周围的距离扫描位置小于光的波长的多个位置(具体是四个位置)处。根据公开文件中描述的方法，从各个位置处测量的光子数量来估计单个发射体的位置。该估计实质上相当于光子数量的比率评估。然后，将具有中心最小值的激发光的强度分布，例如从STED显微术中已知的圆环(Donut)形式的强度分布，置于已知的位置，选择该位置的方式是使荧光团接近强度分布的最小值。测量荧光团的荧光响应。对强度分布的一个或更多个另外的位置重复相同的操作。借助于对强度比的比率评估，以更高的精度确定荧光团的位置。原则上，荧光团离激发最小值越远，或者荧光团越往强度上升区域位移，发射率就越高。这个更精确确定的位置现在可以用作重复上述步骤序列的起始位置，其中多个位置可以更接近估计的荧光团位置。特别是在跟踪荧光团的运动方面，当荧光团移向强度上升区域或最小值时，发射率的变化也可以用来高精度地估计荧光团的移动。强度分布的最小位置越接近荧光团的实际位置，在给定不确定性或者精确度下，定位所需的荧光光子就越少。例如，MINFLUX方法也可以例如使用所谓的局域空心光束进行激发来用于三维定位。

特别地，与MINFLUX纳米显微术有关的专利公开文件是WO2018/069 283 A1、US2019/0235220 A1、US 2019/0234882 A1和US 2019/0234879 A1，其中上述美国专利申请是前述临时国际专利申请的所有后续申请，其中还公开了随后参照美国公开文件提到的所有概念。在所有的文献中都指出，可以使用STED显微镜来执行MINFLUX方法，其中当用作STED显微镜时作为荧光阻抑光的光被用作激发光。

US2019/0235220 A1涉及一种具有少量或最小数量的位置的方法，在这些位置处设置强度最小值以确定荧光团的位置，该强度最小值在要确定荧光团位置的每个空间方向上在强度上升区域的任一侧附近。

US 2019/0234882 A1涉及以上进一步描述的方法，其中根据第一MINFLUX步骤获得的位置信息被用于在后续步骤中将强度光分布的最小值分别置于更靠近荧光团，并由此导出更精确的位置信息。

US2019/0234879 A1涉及一种方法，其中强度最小值被非常迅速地、几乎同时地置于荧光团的估计位置周围的多个位置处。然后，如果在一单个位置确定了发射率增加，则将该位置移向更靠近假定最小值的位置。

Klaus C.Gwosch等人的公开文件“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolornanometer resolution in cells”,Nat Methods 17,217-224(2020)，https://doi.org/10.1038/s41592-019-0688-0，涉及使用多种不同的荧光团的三维纳米显微术。在该公开文件中还记录了这样的证明：与具有固定的最小值位置的比率定位相比，通过迭代地将最小值位置接近到相关荧光团的实际位置，可以实现定位不确定性的降低。进一步表明了以这种方式实现了三维上的各向同性分辨率。对于使用不同荧光团进行成像，分别使用光谱吸收曲线有很大相互重叠并且因此可以用同一激发波长激发的染料。具体地，三维纳米显微术是用两个不同的荧光团呈现的，其中总共使用了两个不同的对(A：CF660C和Alexa Fluor647；B：CF680C和Alexa Fluor 647)，两对中每对中的一个成员是染料Alexa Fluor 647。在MINFLUX采集中，使用同一激光器来分别激发一对中的两种染料。每对中的两种染料的发射特性是不同的。借助于二向色分束器将所应用的纳米级排列的探测路径划分为用于波长大于685nm的光的光谱探测通道和用于波长小于685nm的光的光谱探测通道。在进行测量时，由于所有使用的荧光团的光谱发射在临界波长以上和以下都明显不等于0(零)，因此在所有使用的荧光团的两个光谱通道中都探测到光。总和信号用于荧光团的定位。由于除了背景荧光外在定位区域中通常只有一个荧光团发出荧光，而且由于一对中不同的荧光团的光谱发射不同，因此可以从不同探测通道中的信号比推断出染料对的哪个荧光团类型引起了信号。因此，可以将特定的染料分配到每个定位。在数据分析的过程中，借助于对所有MINFLUX迭代的光谱成分进行主成分分析，将可能的错误分配最小化。由于定位是基于仅对激发光的强度分布最小值的位置的了解，因此不同荧光团的定位之间不存在与颜色相关的偏移，因为这些定位是用同一激发波长激发的。实验装置有两种不同的激光器用于用激发圆环(Anregungsdonut)进行激发，一个波长为642nm，一个波长为560nm，用于对激发环状物的激发。实验表明，MINFLUX纳米显微术也可以利用可光活化的荧光蛋白(特别是mMaple)进行，特别是也可以在活细胞上进行；在相应的单色MINFLUX采集中，激发荧光蛋白mMaple明显需要波长为560nm的激发激光。

在Jasmin Pape等人的公开文件“Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy ofmitochondrial MICOS proteins”，PNAS，117(34)20607-20614，(2020)，https://doi.org/10.1073/pnas.2009364117中，讨论了与上述公开文件基本相同的用于检查其他样本的方法。为了能够对密集的结构进行成像，使用了一种特殊的算法来形成定位集群或者将定位分配给单个荧光团。为了选择要用MINFLUX检查的区域，首先采集宽视场图像。为此目的，使用了相机和单独的激光器。

借助于MINFLUX纳米显微术，可以通过实验在两个空间方向上确定荧光团的位置，其不确定性仅为1nm，也就是说，位置确定的精度与荧光团本身的扩展范围相当。如果要以给定的测量不确定性确定单个荧光团的位置，则为此需要比借助于传统定位显微确定单个荧光团的位置更短的时间，特别是更少数量的荧光光子。

在欧洲公开文献EP 3 372 990 A1中，除了其他MINFLUX方法之外，还描述了在一方面类似于MINFLUX方法的方法。与MINFLUX方法一样，以聚焦的方式将强度分布施加于单个分子，该强度分布具有中心最小值(优选为零点)以及在该中心最小值周围的上升区域；与MINFLUX一样，将该最小值也被置于单个分子的假定位置周围的多个扫描点处，并探测每个扫描点的荧光发射；根据获得的强度值或光子数量，可以高精度地估计出实际位置。与MINFLUX不同的是，强度分布是荧光阻抑光的分布，特别是STED光的分布。该荧光阻抑光的分布与激发光一起应用，其中激发光的强度分布没有中心局部最小值。在MINFLUX中，当单个分子离强度分布的中心最小值更远时，荧光发射较高，而在这种方法中则相反。

Lothar Schermelleh等人的公开文献“Super-resolution microscopydemystified”,Nature Cell Biology,VOL 21,72-84(2019),https://doi.org/10.1038/s41556-018-0251-8，提供了超分辨率显微术的最新概述，其中作者还包括了那些不传输超过共焦显微镜最大空间频率的空间频率成分，而只给出在衍射限制给出的频谱内高空间频率的改进传输的方法。例如，这些方法包括结构化照明显微术(SIM)和图像扫描显微术。作者指出，没有一种已知的超分辨率方法适于所有成像目的，因此应使用互补的方法来处理具体问题。超分辨率显微术为科学家提供了测试和完善生物模型演示的机会；因此，如果要理解(病理)生物学过程，除了假设驱动的研究之外，描述性研究也变得越来越重要。在该公开文献中还提到了相关方法，其中不同成像方法的图像(例如，光学采集的超分辨率图像)与电子显微镜图像相关联。

关于超分辨显微术和纳米显微术的当前方法的进一步概述，包括组合的方法，例如STED显微术和原子力显微术(Rasterkraftmikroskopie)的组合，可以在A.Diaspro和P.Bianchini的评论文章“Optical nanoscopy”Riv.Nuovo Cim.(2020)https://doi.org/10.1007/s40766-020-00008-1中找到。

在H.Schneckenburger等人的公开文献“High-resolution deep viewmicroscopy of cells and tissues”,Quantum Electron.50 2(2020),https://doi.org/10.1070/QEL17204中，提出了对厚生物样本进行成像的各种方法和设备。据介绍，通常只有在使用具有高数值孔径的物镜时才能实现高分辨率。这些物镜的工作距离很小，因此不可能用它们对较厚的样本进行高分辨率成像。在该公开文献中，现在提出了借助于多个分布式孔径来照射样本。通过这种方式，可以在样本的任何深度产生一种焦点。现在可以探测到来自聚焦区域的光，并可以生成高分辨率图像。这可以用STED型照射和MINFLUX型照射来实现。

例如，从Cheng Guo等人的公开文献“Lensfree on-chip microscopy based ondual-plane phase retrieval”，Opt.Express 27,35216-35229(2019),https://doi.org/10.1364/OE.27.035216中，已知一种方法，其中通过样本传输并受其影响的激光被直接捕获在有空间分辨能力的探测器上，而无需用光学成像元件。从信号可以计算出样本的图像。使用该方法实现了约1μm的图像分辨率。原则上，该方法不适于对荧光样本进行成像。

从专利公开文件DE 10 2006 047 816 A1中已知一种用于对用多种染料染色的样本进行高分辨率光学扫描的方法和设备。在该方法中，借助于STED方法对样本进行成像。根据公开内容，多种染料的成像可以另外通过以下方式按顺序进行：首先通过对待检查的样本区域的完全扫描来进行染料的STED采集，并且在随后的完全扫描中对另一种染料进行成像。在一实施方式中，可以为两种染料的激发选择共同的波长。两种染料的荧光可以通过波长敏感元件(滤波器)分离，并且两种染料的荧光可以分别用一个探测器记录。所描述的设备可以具有包括多个探测器的探测装置，这些探测器可以单独和/或成组地关闭。被设计为扫描显微镜的设备可适用于具有特定光谱特性的染料。

在DE 10 2006 011 556 A1中描述了一种用于对用至少两种染料染色的样本进行高分辨率光学扫描的类似方法。该方法的特征在于两种物质的激发光谱和抑制波长彼此不同。

发明任务

本发明的任务在于提出用于对用多种染料染色的样本进行显微镜或纳米显微镜成像的改进方法。特别地，这些方法应能够将具有高达分子分辨率的纳米图像置于显微镜成像的空间环境中，或者能够在显微镜成像的空间环境中执行对单个分子的纳米显微镜跟踪。这在活的生物对象上也应该是可能的。

解决方案

本发明的任务通过具有独立权利要求1、16、23和25的特征的方法以及具有权利要求33的特征的显微镜来解决。从属权利要求2至15涉及根据权利要求1的方法的优选实施方式。从属权利要求17至19涉及根据权利要求16的方法的优选实施方式，从属权利要求20至22涉及根据权利要求1的方法和根据权利要求16的方法的优选实施方式，从属权利要求24涉及根据权利要求23的方法的优选设计方案，从属权利要求26和30至32涉及根据权利要求25的方法的优选实施方式，以及从属权利要求27至29涉及根据独立权利要求1、16、23和25的方法的优选设计方案；最后，从属权利要求34至39涉及根据权利要求33的显微镜的优选设计方案。

发明描述

提出问题

对于显微术，理解为允许以高分辨率对对象进行成像的方法。在此，高分辨率最初只意味着应分辨被成像对象的细节，而这些细节在用肉眼观察时是无法分辨的。如果不用眼睛观察，而是采集数据，从数据中可以产生供观察的图像表示，那么显微镜的光学部件对图像的放大就对于生成图像失去了意义；只有光学分辨率和样本中数据点之间的距离是重要的。除了显微镜的分辨率外，显微镜是否适用于检查特定的对象，或者换句话说，是否适用于特定的检查任务，关键因素是像场的大小，或者更普遍地说是可成像体积的大小。如果要检查随时间变化的对象(例如，活细胞或活细胞中的对象)，则采集所需的持续时间就变得至关重要。因此，对显微镜的要求在许多方面取决于检查任务。因此，有许多不同的显微镜和显微术方法。

对于多种显微术方法，分辨率是有衍射限制的。在荧光显微术领域，通常给出瑞利准则来定量描述衍射极限，结合对散射光的观察，通常提出阿贝衍射极限。虽然分辨率极限取决于观测条件的细节，但分辨率极限总是与所使用光的波长成比例，并且在实际相关的应用情况中，大约是所使用光的波长的一半。对显微镜的分辨率的描述也可以通过指定光学传递函数(OTF)或调制传递函数(MTF)来描述，该调制传递函数是OTF的绝对值。MTF具有截止频率，超过该截止频率，MTF具有恒定值0。对于用宽视场照射的荧光显微术来说，这个截止频率是f_n＝2NA/λ，其中NA是成像光学器件的数值孔径，以及λ是荧光的波长；在结构化照射(原则上也包括共焦照射)的情况下，截止频率是两倍大，即f_h＝4NA/λ。后者适用于激发波长和发射波长没有显著差异的假设。该截止频率对于衍射限制的方法是绝对的，并且不能被特殊的照射结构、特殊的成像模式或反卷积方法所超越，除非反卷积是基于在其他地方获得的先验知识。在简单的共焦荧光显微术的情况下，需要注意的是，这个截止频率只能在无限小的针孔光阑(Lochblende)中才能实现，也就是说，在实践中无法实现。在实际应用中，经常使用针孔光阑，其直径对应于孔径光阑的衍射盘的直径，直到第一零点。然后，在共焦荧光显微术中，MTF的截止频率正好对应于宽视场荧光显微术中的截止频率。这些陈述是指横向分辨率。在轴向分辨率方面，情况类似，其中轴向上的分辨率经常较差，即可分离细节的最小距离较大，调制传递函数的截止频率较低。

借助于各种已知的超分辨率方法可以实现比该分辨率极限更低。其中包括STED显微术、如PALM或STORM的定位显微镜方法以及使用结构化照射和荧光饱和的方法。然而，这些方法的分辨率仍然取决于波长，并且受到可用光子预算的限制。在实践中，用这些方法可以实现从30nm到在更特殊的情况下低至20nm的分辨率。

如在部分现有技术中所述，MINFLUX纳米术现在实现了低于2nm的分辨率的成像。在本申请中，这样的分辨率被称为分子分辨率，因为2nm的尺寸大约相当于单个荧光染料分子的扩展范围；许多染料的分子甚至延伸得更远。可以预计，分子分辨率也可以通过使用具有中心局部最小值的荧光阻抑光分布进行类似MINFLUX扫描和定位的方法来实现，例如在上述文献EP 3 372 990 A1中描述的方法。该方法随后在本申请中称为STED-MINFLUX。然而，这两种方法都不太适合对典型的生物样本整体进行成像，主要是因为对时间的要求很高，但通常情况下，只能借助于MINFLUX或STED-MINFLUX来检查这种检查的片段。如果使用传统的定位显微术方法(如PALM或STORM)，并且有可以在褪色之前发射大量光子的荧光团，那么理论上可以设想，用这些方法也可以实现分子分辨率。然而，这些方法也不太适合对典型的生物样本整体进行成像，特别也是因为对时间的要求很高。然而，为了能够对生物样本整体进行成像，并且同时至少能够以分子分辨率对特别感兴趣的片段进行成像，因此有必要将其他成像方法或者显微术方法与实现分子分辨率的方法相结合，特别是例如与MINFLUX相结合。

然而，这样的组合中会出现各种问题。因此，考虑到检查样本的目的，最好是在某些情况下可以将用其他方法获得的图像信息与分子分辨率的图像信息放在一个空间环境中，而且非常精确。但为此目的，有必要在以分子分辨率成像之前用其他方法对样本进行高质量成像。在此，产生的问题是，当用其他方法成像时，样本被加载(belasten)，即所包含的荧光团被漂白了。通常情况下，漂白的程度和使用其他方法达到的分辨率之间存在关联，因为即使在这种基本上受衍射限制的方法中，实际上达到的分辨率也取决于所使用的光子预算，因为在只使用较少的光子时，成像质量会受到噪声的影响而降低。在此，噪声一方面来自发射过程本身，该发射过程导致被测光子数量的泊松分布噪声，另一方面也来自探测器本身的噪声，待测或被测的光子数量或强度越低，该噪声对图像质量的影响就越大。同时，由于对分子分辨率的成像来说，用于这种成像的荧光染料必须不被漂白或只被轻微漂白，因此出现了目标冲突。

为了对生物样本或者其中所包含的结构进行成像，通常需要用多种不同的染料分别对待检查的样本进行染色，以便能够在荧光显微镜成像中表现出彼此之间有一定界限的、但同时相互之间又有空间关系的不同结构。现在，为了能够以一种方式(该方式使与不同染料相关联的不同生物结构能够彼此区分开)以分子分辨率对这种多重染色的样本进行成像，有必要能够对不同染料发出的荧光信号进行区分。由于能够很好地区分两种特定染料的设备和方法可能不适于分离其它染料，因此以简单的方式对多种不同的样本实现这一点变得困难。另一个问题是，即使原则上是已知对样本染色的染料的光谱性质，但染料的光谱性质也会因样本不同(例如，样本的pH值不同)而发生相关的偏差，因此具有预定性质的设备和方法的分离并不是最成功的。

目前，结合互补方法的可能性通常留给了专业实验室。根据上述文章“Super-resolution microscopy demystified”(Lothar Schermelleh等人)，用超分辨率显微术方法对样本进行的检查通常必须用在不同平台上进行的检查进行验证。

目前为止，还不知道这样一种单一平台，该平台一方面适于以商业方式提供给更多的用户群体，另一方面能够以大约400nm至250nm的衍射限制分辨率和大约50nm至30nm的超分辨率以及还以分子分辨率对生物样本(必要时根据样本的片段)进行成像，其中可以整体采集横向扩展范围为数毫米的像场。同样，也没有已知的方法适于提供上述可能性，同时可以以这样的方式实现，即它们可以在显微镜中作为上述的单一平台实施。这意味着目前还没有已知的方法可以很容易地实现单一平台。

解决问题

这就是本发明的意义所在，并且本发明提供的这种方法特别适用于在普通的单一平台(即显微镜)中应用。此外，本发明还提供了作为这种单一平台的显微镜。在此，上述目标冲突尽可能得到解决。

这些方法虽然在细节上有所不同，但都是基于一个共同的发明概念。所有方法的共同目的是，特别容易提供一个单一平台(即显微镜)，用该平台可以执行所有方法。在所有方法中，对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，并基于该图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，在所有方法中，都在至少两个不同的波长范围内对从样本发射的荧光光子进行检测，其中优选地在每种情况下检测都是在连续的波长范围内进行的，并且是针对每个波长范围以非光谱分辨的方式进行的。

在本说明书的上下文(即第一方法至第六方法和显微镜)中，术语“非光谱分辨(nicht spektral

)”是指在各个连续的或者可调节波长范围内探测到的荧光是独立于探测到的光子的波长来评估的。因此，在可调节波长范围内不收集和使用光谱信息，即不采集光谱。在此，可以探测到的荧光合并为总荧光值(例如，单位时间内的荧光强度或通过光子计数得到的计数率)。在此，可以根据波长以外的参数(例如，根据荧光寿命)来分开探测到的荧光。

此外，所有方法都涉及至少为成像方式之一提供优化方案，即为图像数据的第一采集或定位显微镜方法提供优化方案。总体而言，所有方法都旨在最优地利用样本中存在的染料进行样本的成像或使样本中存在的染料可最佳地用于样本的成像，其中成像既包括在几十微米到几毫米大小范围内对结构进行成像，也包括以分子分辨率对子区域进行成像。在这里，跟踪样本的微粒被认为是一种特殊的成像形式。

具体地，所提出的任务通过第一方法来解决，该第一方法用于定位显微镜检查或用于对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查，该方法包括以下步骤：

对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，

基于该图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，

用第一激发波长的激发光激发在所选择的感兴趣的样本区域内的第一子区域中荧光团，特别是多种染料中的至少一种染料的荧光团，并使用第一探测单元在第一波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行第一探测；以及

使用一个探测单元或该第一探测单元(换句话说，使用第一探测单元或另外的探测单元)在不同于第一波长范围的第二波长范围内对由用第一激发波长的激发光激发的荧光团发射的荧光光子进行第二探测。

这种方法在从现有技术中是已知的，例如在现有技术部分中提到的公开文件“Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins”(Jasmin Pape等人)中或者相关的补充信息中已知。在该公开文件中，第一采集仅在借助于EMCCD相机进行的宽视场过程中进行。

在根据本发明的第一方法中，虽然第一采集原则上可以以相同的方式进行，但是第一采集优选地包括图像数据的扫描式采集。

在本说明书的上下文(即第一方法至第六方法和显微镜)中，术语“多种染料的荧光团”是指几种不同种类的荧光分子，例如这些荧光分子的分子结构不同，因此特别地具有不同的激发光谱或发射光谱或者不同的荧光寿命。

与现有技术相比，根据本发明的第一方法的特征在于：

第一探测单元被设计成，探测到(即，第一探测单元探测到)荧光光子的波长范围(特别是第一波长范围)是可调节的，并且该方法还包括：

(特别是随后)在多个光谱探测通道中对样本进行定位显微镜图像采集时，确定用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围(特别是进一步的波长范围)。

在本说明书的上下文(即第一方法至第六方法和显微镜)中，染料的“比率法分离(ratiometrischen Trennung)”特别地被理解为一种方法，在该方法中通过确定在两个不同的波长范围内探测到的荧光光子的数量或荧光强度的比率，可以将荧光团(或者由该荧光团发射的荧光)与多种染料中的一种染料相关联。在本说明书的上下文中，术语“比率法分离”还包括在其中一个波长范围内未探测到荧光信号的情况。那么，相应的比率将等于零或“等于无穷大”，这取决于该比率是被定义为在第一波长范围内探测到的数量或强度与在第二波长范围内探测到的数量或强度之间的商，还是被定义为所述商的倒数。当然，在这种情况下，也可以基于比率将荧光团与特定的染料相关联。此外，为了实现本说明书意义上的比率法分离，不一定非要形成上述比率。相反，在两个不同的波长范围内测量的信号也可以以其他方式进行评估，以便将荧光团分配给多种染料中的一种。

根据实施方式，基于所确定的(进一步的)波长范围，调节或者调整用于染料的优化的比率法分离的第一波长范围和/或第二波长范围。

根据该方法确定的用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围随后可用于定位显微镜采集，特别是用于MINFLUX采集，或者可替代地或附加地，这些波长范围与关于样本的信息一起例如存储在数据库中。

特别地，在感兴趣的样本区域中，根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法执行单个荧光团(多种染料中的至少一个)的定位或跟踪，其中荧光光子的探测分别在针对多种染料的优化的比率法分离所确定的波长范围内进行。

在本说明书的上下文(即关于第一方法至第六方法和显微镜)中，术语“MINFLUX方法”是指一种方法，在该方法中，将光分布(特别是激发光分布)的局部强度最小值(特别是强度零点)置于相对于单个荧光团位置的多个位置处，其中从各个位置处测量的光子数量来估计荧光团的位置。

在本说明书的上下文(即关于第一方法至第六方法和显微镜)中，STED-MINFLUX方法被理解为一种方法，在该方法中将STED(受激发射损失)光分布的局部强度最小值置于相对于用激发光照射的单个荧光团的位置的多个位置处，其中从各个位置处测量的光子数量来估计荧光团的位置。

在本说明书的范围内，单个荧光团的定位是指一种方法，在该方法中发出荧光(即，处于活性状态)的荧光团(其荧光光子可以在所使用的激发波长范围和发射波长范围内探测到)彼此之间的距离至少对应于所使用波长下的光学衍射极限。这一条件可以通过在标记样本时选择适合的染料浓度来满足，或者在可光活化或闪烁的染料的情况下，通过选择活化光参数(例如，功率或脉冲速率)和/或缓冲条件来满足。样本中荧光团的总密度可以以这样一种方式选择，使得某些荧光团的距离低于衍射极限，只要这些荧光团不是同时处于活性状态或者在不同的波长范围内被激发和/或被探测。

根据样本的性质，这种方法可以在第一扩展方案中以如下方式实施，即基于图像数据选择感兴趣的样本区域内的第一子区域，使得在该第一子区域中只包含或基本上只包含第一染料的荧光团，并且在第一子区域中用第一激发波长的激发光激发多个荧光团，并且从第一探测和第二探测获得表征第一染料的光谱发射的第一值和第二值。如果在首次采集的图像数据中映射出结构，用户知道只有唯一类型的染料预计存在于这些结构中，则对第一子区域的这种选择是可能的且有意义的。然后，可以在特定的样本环境中非常迅速地确定有关染料的光谱性质，因为这种确定随后可以在有关染料的多个荧光团的集合上进行。由此，提供了大的并且因此低噪声的信号，而不会使有关染料的单个染料分子暴露在大量激发光下。已经可以根据在两个不同的波长范围内探测到的荧光光子的数量或荧光强度的比率来获得信息，该信息使得能够对不同染料进行优化的比率法分离。这既适用于强度的比率对应于先前已知的强度的比率的情况，也适用于强度的比率明显偏离先前已知的强度的比率的情况。还可以从在两个波长范围内获得的测量值推断出背景信号，这些背景信号对为优化的比率法分离而设定的波长范围具有影响。

现在，根据第一扩展方案的这种方法可以通过以下方式在一个设计方案中有利地执行，即基于图像数据在感兴趣的样本区域内选择第二子区域和可选的另外的子区域，使得在该第二子区域或每个可选的另外的子区域中只包含或基本上只包含第二染料或另外的染料的荧光团，并且在该第二子区域或每个另外的子区域中用第一激发波长的激发光(31)激发多个荧光团，并且在第一波长范围和第二波长范围内对由各激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，并且分别获得表征第二染料或各另外的染料的光谱发射的第一值和第二值。换句话说：有利地，与第一染料一样，也为样本中存在的第二染料和必要时为另外的染料或所有另外的染料选择一区域，在该区域中只存在或几乎只存在第二染料或有关的另外的染料的染料分子。仅根据为此目的获得的新信息，就可以得出与第一染料相同的类型的结论。然而，通过比较针对不同染料获得的比值，现在可以更好地推断出为优化的比率法分离设定的波长范围。这种设计方案也可以修改为使用两个新的波长范围来代替第一波长范围和第二波长范围。优选地，以如下方式在每个子区域内进行激发，即用聚焦的激发光扫描子区域或子区域的一部分。聚焦的激发光的使用使得仅在子区域内选择性地进行激发更容易。扫描降低了样本的局部加载。

优选地，第一扩展方案及其设计方案现在可以如下方式进一步发展，即在一个或更多个另外的波长范围内对分别用第一激发波长的激发光激发的相应选择的染料(即，第一染料、第二染料或另外的染料中的一种染料)的荧光团发射的该荧光光子进行进一步的探测，从而从对用多种染料染色的样本的测量中获得表征第一染料、第二染料或另外的染料中的一种染料的光谱发射的多个值，该一个或更多个另外的波长范围彼此不同并且不同于第一波长范围和第二波长范围。换句话说：有利地，特别是如果基于从先前的测量中获得的值，为优化的比率法分离设定的波长范围仍然存在太大的不确定性，则对每种染料在至少一个另外的波长范围内执行荧光测量。由此，改善了关于有关染料的发射光谱的信息，因此原则上可以更好地确定为优化的比率法分离设定的波长范围。然而，应注意的是，借助于激发和探测进行的每一次测量都对样本进行了加载，即可能使样本漂白，并且因此降低了可用于后续测量的光子预算或者可用荧光团的密度。后者可以接受的情况是，假设为了确定为优化的比率法分离设定的波长范围，可以使用样本内的不同区域，甚至是与最终要用定位显微镜检查的区域不同的样本。也可以使用已经令人满意地成像的样本来确定为优化的比率法分离设定的波长范围，以便由此获得的值可以用于其他可比较的样本。

在第一方法的第二扩展方案中，基于图像数据选择感兴趣的样本区域内的第一子区域，使得在第一子区域中包含多种染料的荧光团，并且在第一子区域中反复激发单个荧光团，其中所有多种染料的荧光团被整体激发。在第一子区域内的激发可以如下方式进行，即用聚焦的激发光扫描子区域或子区域的一部分。聚焦的激发光的使用使得更容易只在子区域内选择性地激发。扫描使得更容易发现在相关时间段内处于可被激发发出荧光的状态的单个分子。可替代地或附加地，特别地也可以使用活化光，将活化光施加于也被施加以激发光的(例如，聚焦)区域，以便在该区域内将荧光团从不可激发发出荧光的状态切换到可激发发出荧光的状态。然后，只要能从单个的分子探测到荧光，就不进行活化。如果该分子从可激发发出荧光的状态变为不可激发发出荧光的状态，则可以重复活化，直到可以从单个分子再次探测到荧光。由于在子区域中存在多种染料，因此在以这种方式多次重复时会探测到多种染料的荧光。

原则上，即使在该第二扩展方案中，也可以使用同一探测单元在第一波长范围和第二波长范围内进行探测。然而，这似乎很难做到，并会导致样本的加载增加。因此，特别是在第一方法的这种扩展方案中，特别优选地，在同时激活的单独的(或者借助于单独的)探测装置或者探测单元上在第一波长范围和第二波长范围内对荧光光子进行探测。这在第一扩展方案中也是优选的。与只使用一个探测装置或者探测单元(该探测装置或者探测单元一次调节到第一波长范围，一次调节到第二波长范围)相比，其优点是一方面更快地检测光谱信息，另一方面也伴随着样本的较少加载。

第一方法的第二扩展方案现在可以优选地被设计成，用第一激发波长的激发光对荧光团进行另外的激发，并在另外的两个波长范围内进行另外的探测，其中另外的两个波长范围中的至少一个波长范围既不是第一波长范围也不是第二波长范围。通过这种方式，原则上改善了可用于确定优化的比率法分离的波长范围的信息。然而，与第一扩展方案的相应设计方案类似，这里也应例如注意，每次激发都会导致样本的加载，该加载会降低可用于以分子分辨率成像的光子预算或者可用荧光团的密度。

在第一扩展方案和第二扩展方案中，优选地，第一波长范围和第二波长范围可以在第一临界波长处彼此相邻。然后，进一步优选地，在另外的探测中使用的另外的波长范围也在一个临界波长或另外的临界波长处彼此相邻，并且还优选地，可以进行多次另外的激发和探测，其中每次都选择不同的另外的临界波长。

这两种扩展方案也可以有利地被设计成，第一波长范围和/或另外的波长范围中的一个波长范围包括小于第一激发波长的波长；优选地，这两种扩展方案可以被设计成，第一波长范围和/或另外的波长范围中的一个波长范围仅包括小于第一激发波长的波长。特别是在这种优选的设计方案中，在有关的波长范围内可能探测到相对较少的荧光。但优点是，特别是在激发波长以下的波长范围内，不同染料的荧光发射彼此之间可以有非常大的差异，因此染料的比率法分离可以是特别良好的。对于随后的以分子分辨率的定位，基本上使用另一波长范围，而低于激发波长的波长范围仅用于将定位与染料相关联。在这种设计方案中，如果第一波长范围仅包括小于第一激发波长的波长，则该第一波长范围最好不与第二波长范围相邻。这同样适用于用于对另外的波长范围的另外的探测。在这里，仅包括小于第一激发波长的波长的波长范围不与其他另外的波长范围相邻。相反，激发波长优选地不包含在任何波长范围内。这样的优点通常在于，散射的激发光不可能使荧光探测失真。此外，这使得激发光能够借助于分色器耦合到用于激发和探测的共同的光束路径中，该分色器优选地可以被设计成带宽为几纳米(例如，小于15nm、10nm或5nm)的窄带分色器。

优选地，第二扩展方案可以被设计成，在两个波长范围内、在第一波长范围和第二波长范围内和/或在另外的两个波长范围的一个波长范围和另一个波长范围内进行探测期间，分别将探测到的荧光光子与单个荧光团的突发相关联，并且分别为突发确定在一个波长范围和另一个波长范围内探测到的荧光光子的数量。因此形成了直方图。优选地，然后根据这些直方图确定用于优化的比率法分离的波长范围。从现有技术中，已知如何从这些直方图中评判染料分离的质量。如果有几个直方图可用，则现在可以评判哪个直方图以及因此选择哪个波长范围会导致最佳的比率法分离。

有利地，在上述所有方法中，交替不同的波长范围不重叠。这意味着第一波长范围和第二波长范围不重叠，并且如果在多个波长范围内重复进行测量，则在重复步骤中使用的波长范围也不重叠。该方法的优点是，可以很容易地在设备上实现，例如，使用具有两个或更多个单独的探测单元的探测设备，这一点从关于现有技术一节开篇提及的专利文献DE10 2018126 232B3中可知。

优选地，在第一方法及其两个扩展方案中，通过借助于位于激发光的光学路径中的第一偏转单元用激发光扫描样本或样本的片段，对图像数据进行第一采集的采集步骤。在对图像数据的第一采集中使用的激发光可以是第一激发波长的激发光，但也可以是不同波长的激发光，或具有第一激发波长但来自与第一波长的激发光不同的光源。借助于位于激发光的光束路径中的第一偏转单元进行扫描的优点在于，在第一采集期间用于扫描的激发光和第一波长的激发光的光束路径可以更容易地相互调整，或者可以保持在调整状态。这也有利于在图像数据的第一采集期间获得的图像中所选择的子区域实际上被施加以第一激发光。

在优选的实施方式中(这明确地适用于根据本发明的所有方法，但如有必要，可以作为强制性特征)，第一采集包括用聚焦的激发光和荧光阻抑光(优选是STED光)进行的共焦扫描或共同扫描。共焦扫描这里是指荧光发射是以共焦去扫描(entscannen)的方式探测的。在此，如果在探测的焦平面中布置有探测单元，该探测单元具有分配给单个探测器元件或探测器的多个孔径，这些孔径被扩展和排列成使得以空间分辨的方式检测到点光源的衍射图像，则也存在共焦探测。这样的探测单元也可以与荧光阻抑光的应用结合使用。进一步优选地，在用聚焦的激发光和荧光阻抑光进行共焦扫描或共同扫描中，探测在连续的波长范围内并且以非光谱分辨的方式进行。这样做的优点在于，通过选择连续的波长范围并免去在该波长范围内的光谱分辨率，恰好用一个探测器检测所选择的波段的全部光量，因此在测量过程中获得的信号也仅包含来自唯一探测器的噪声。这使得在低辐射强度下能获得高的成像质量。另一个优点在于，在开始扫描时，样本几乎是未知的。那么就不可能使用多个探测波长来选择已经与样本结构最佳匹配的成像方法。然而，通过选择连续的波长范围进行探测，可以确保检测到在该波长范围内发射的所有荧光。虽然不可能区分不同的染料，但在大多数情况下，仍然获得适合用于选择感兴趣的区域和感兴趣的区域内的子区域的图像数据集。

在进一步的设计方案中(这明确地适用于根据本发明的所有方法)，第一方法中对图像数据的第一采集包括根据微分干涉对比方法、优选地根据扫描式微分干涉对比方法的采集步骤。微分干涉对比方法的优点在于，样本中所含的荧光团在成像时不会或至少极低的被加载，即被漂白。选择扫描式微分干涉对比方法的优点在于，第一偏转单元可用于扫描过程。这反过来例如又实现了图像数据的第一采集可以包括借助于扫描式微分干涉对比方法的采集，然后选择样本的一区域，该区域随后可以作为第一采集的一部分，用聚焦的激发光和荧光阻抑光借助于共焦扫描或借助于共同扫描、优选地借助于STED光，进行成像。然后，在最后获得的图像中，选择感兴趣的区域和子区域，其中可以考虑微分干涉对比图像。由于在第一采集期间采用的两种方法都使用同一偏转单元，因此图像相对彼此很好调整。

通常，在根据STED方法进行成像时，也会以去扫描的方式进行探测，通常使用共焦探测来进行。对于共焦探测或扫描式探测附加地或可替代地，还可以进行宽视场探测。如果该宽视场探测是附加进行的，则在宽视场探测中获得的图像可以与在以去扫描方式进行的探测中获得的图像对齐。

在根据本发明的所有方法中，除第五方法外，图像数据的第一采集还可包括根据宽视场荧光方法的采集步骤，即根据也借助于宽视场照射来激发的方法的采集步骤。例如，首先可以借助于宽视场荧光显微术采集概览图像；在概览图像中可以寻找共焦扫描的区域。然后在共焦扫描中，可以另外进行宽视场探测，特别是在所选择的区域的边缘区域中进行宽视场探测。基于在宽视场和以去扫描方式成像的图像部分，可以将宽视场图像和扫描图像对齐。然后，在对齐的扫描图像中，可以选择感兴趣的区域和子区域。

在进一步的设计方案中，第一方法包括在感兴趣的区域中根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对单个荧光团进行定位或跟踪，其中荧光光子的探测分别在为多种染料进行优化的比率法分离确定的波长范围内进行。可替代地或附加地，用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围被存储在数据库中，其中术语“数据库”在这里应作广义解释。重要的是，这些相应的数据与其他数据一起存储，以便在以后对同一样本或其他可比样本进行检查时可以访问这些数据。

根据本发明的第二方法是对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查的方法。该方法包括：

对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，

基于图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，使得在该感兴趣的样本区域中包含多种染料的荧光团，

(特别是在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法对多种染料的单个荧光团进行定位，其中用第一激发波长的激发光进行激发，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内分别对荧光光子进行探测，第二波长范围不同于第一波长范围。

这种方法在现有技术中也是已知，例如从现有技术部分中提到的公开文件“Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins”(Jasmin Pape等人)中或者相关的补充信息中已知。与现有技术相比，根据本发明的第二方法的特征在于，该第二方法还包括：

(特别是随后在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对多种染料的单个荧光团进行定位，其中在另外的两个波长范围内对荧光光子进行探测，其中该另外的两个波长范围中的至少一个波长范围与第一波长范围或第二波长范围不一致。

因此，与现有技术不同的是，当根据MINFLUX方法进行定位时，不仅是在两个预定的波长范围内执行探测，而是执行进一步的定位，其中至少在一个另外的波长范围内进行探测。通过这种方式，在执行样本成像期间，可以寻找实现最佳分离的波长范围。在此，不需要在多于两个的波长范围内对每个单独的荧光团进行探测。相反，可以只使用两个波长范围来定位一个单独的荧光团或甚至是多个单独的荧光团，然后只使用两个波长范围来定位其他的单个荧光团或甚至是其他多个单个荧光团，其中至少一个波长范围与第一波长范围不一致。这还包括，只使用两个波长范围来确定感兴趣的区域的第一图像，然后至少使用第三波长范围或其他波长范围来确定感兴趣的区域的另外的图像。然后，这些图像在与错误染料相关联的定位的比例方面有所不同。

优选地，以如下方式执行第二方法，即使用两个波长范围开始对单个分子进行定位。在执行该方法期间或甚至之后，对荧光信号进行评估，看是否可以对染料进行良好的比率法分离。优选地，这可以通过形成和评估直方图来完成，如上文结合第一方法在第二扩展方案中所阐述的那样。现在至少一个波长范围改变了至少一次，并且另外的单个分子被定位。现在参照改变的波长范围，可以形成另外的直方图。对所获得的数据进行检查，看使用哪些波长范围可以实现最佳的比率法分离。通过这种方式，在借助于MINFLUX或STED-MINFLUX对样本进行成像的过程中(还应包括对粒子的跟踪)，可以确定用于多种染料的比率法分离的优化的波长范围。

也可以在成像过程中改变用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围，或者这些波长范围在感兴趣的区域的不同子区域中是不同的。根据该方法，现在可以连续地和/或根据待成像的子区域，确定并相应地应用为对多种染料的比率法分离优化的波长范围。例如，这些变化可能来自样本本身中所用染料的荧光性质的变化，但也可能来自背景荧光的变化，或者特别地来自所用荧光团的频率的位置依赖性。这也可能取决于具体的、可能与位置有关的测量任务。因此，例如，在一个子区域中，在定位时特别灵敏地检测到特定染料可能是重要的，而同时，如果将另一种染料的定位错误地与该特定染料相关联，则没那么关键了，而在另一个区域中，排除错误的关联可能是重要的。因此，在一实施方式中，第二方法包括用户定义标准并将其通过输入设备传递给控制和/或计算单元的可能性，这些标准决定了波长范围被优化以用于多种染料的比率法分离。在进一步优选的实施方式中，规定了在方法的执行过程中，例如在第一采集之后，但特别优选地在MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法的执行过程中，用户定义和传递标准；这也包括在用户定义和传递标准过程中，中断MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法的执行。

同样在第二方法中，优选地，第一波长范围和第二波长范围可以在第一临界波长处彼此相邻；另外的两个波长范围在与第一临界波长不一致的另外的临界波长处彼此相邻；第一波长范围和/或另外的波长范围中的一个波长范围包括小于第一激发波长的波长，优选地仅包括小于第一激发波长的波长；对图像数据的第一采集包括对样本进行扫描的采集步骤，其中扫描是通过在激发光的光学路径中应用第一偏转单元来完成的；扫描包括用聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共焦扫描或共同扫描；以及在用聚焦的激发光和荧光阻抑光进行共焦扫描或共同扫描时，探测是在连续的波长范围内进行的，并且是以非光谱分辨的方式进行的。上文结合第一方法在第二扩展方案中所阐述的内容适用于与特征相关的技术措施的各效果和优点。

进一步优选的实施方式的细节已经在上文结合第一方法的描述给出。在那里明确指出了哪些细节是明确指所有的方法，即也指第二方法。

根据本发明的第三方法是用于对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查的进一步的方法。其前序部分对应于第二方法。因此，该第三方法包括：

对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，

基于图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，使得在感兴趣的样本区域中包含多种染料的荧光团，

(在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对多种染料的单个荧光团进行定位，其中用第一激发波长的激发光进行激发，并且在第一波长范围和第二波长范围内分别对荧光光子进行探测，第二波长范围不同于第一波长范围。

与现有技术相比，根据本发明的第三方法的特征在于，对样本或者样本的一个子区域或该子区域的图像数据的第一采集包括用聚焦的激发光和荧光阻抑光(优选用STED光)进行共焦扫描或共同扫描的采集步骤，其中探测是在连续的波长范围内进行的，并且是以非光谱分辨的方式进行的。因此，与现有技术不同的是，第一采集并不完全在宽视场方法中进行采集。通过选择指定的扫描方法中的一种，在第一采集时获得的图像的分辨率就会提高。同时，在连续的波长范围内以非光谱分辨的方式进行探测使得在相对较低的样本加载下能够实现高分辨率。当选择共焦扫描时，可以实现较低的加载，但也可以实现较低的样本加载；反之，例如选择STED扫描则会导致更高的分辨率。

优选地，现在可以使用位于第一波长的激发光的光束路径中的偏转单元进行扫描。该措施的优点和关于其它优选实施方式的细节在上面结合第一方法的描述中进一步进行了说明。在说明书中，指出了哪些实施明确适用于所有方法，因此也适用于第三方法。

根据本发明的第四方法也是用于对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查的方法。更具体地说，该方法涉及对含有激发光谱或者吸收光谱强烈不同的染料的样本的应用。例如，这些染料的吸收最大值在光谱上彼此相隔120nm或更多。因此，染料的可区分性不一定必须通过在多个波长范围内进行探测来保证，但原则上该可区分性也可以通过单独的激发来实现。根据本发明的方法现在实现了以最小的样本加载和缩短的采集时间实现了优化的数据采集，但现在刚好使用两个波长范围进行探测，并使用了两个激发波长。

第四方法包括：

对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，

基于图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，使得在感兴趣的样本区域中包含多种染料的荧光团，

(特别是在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对多种染料的单个荧光团进行定位。

与现有技术相比，根据本发明的第四方法的特征在于，该方法还包括：

在根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行定位之前，用第一激发波长的激发光和第二激发波长的激发光对所选择的感兴趣的样本区域内的第一子区域中的单个荧光团进行第一照射，使得单个荧光团被激发发出荧光，

在第一波长范围和第二波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，并获得第一探测值和第二探测值，第二波长范围不同于第一波长范围，

选择激发波长，用该激发波长，单个分子被激发发出荧光，以根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行定位，并使用所选择的激发波长的激发光作为唯一激发光进行定位。

通过使用多个激发波长，可以使具有强烈不同的激发光谱的多种染料用于借助于MINFLUX或STED-MINFLUX方法进行多色图像采集。这是一个重要的优势，因为本发明的任务就在于，将具有高达分子分辨率的纳米显微镜成像置于显微镜成像的空间环境中，或者在显微镜成像的空间环境中执行单个分子的纳米显微镜跟踪。例如，在共焦显微术中，经常使用具有通过激发被分开的同伴的荧光团配对(Fluorophorpaarung)。根据本发明的方法使得这些配对也能够用于MINFLUX显微术。即使使用多个激发波长而不是只有一个激发波长在不同荧光团的可共定位性方面有缺点，但在这里优点占主导地位。至少借助于所使用的两个激发波长之一所采集的子图像可以(即，以对应于第一采集的空间分辨率的精度)很好地嵌入到在第一采集时获得的图像中。

该方法与现有技术的不同之处在于，第一波长和第二波长的激发光都被用于找出单个荧光团。优选地，这种光被同时，但可替代地也可以快速交替地聚焦到样本上或指向样本；在此，聚焦也包括具有中心最小值的强度分布。这种措施的优点是可以找到处于激发状态的单个荧光团并对其进行定位，而不管这些荧光团属于哪种染料。

在两个波长范围内(优选地用两个同时激活的探测单元)进行探测，使得能够在发现后立即识别出所发现的单个荧光团属于哪种染料。这是选择用于定位的激发波长并将其应用于定位的进一步措施的前提条件。在这里，所选择的波长也可以是不同于寻找时使用的第一波长和第二波长的波长。例如，使用一次强烈激发一个荧光团的波长来查找可能是有意义的，这将最小化无法找到处于可激发状态的单个荧光团的风险。原则上，这些波长之一也可以用于定位。那么显微镜就没有必要可以提供另外的激发波长了。然而，选择其他的激发波长进行定位也是有意义的，例如如果其他的波长导致背景荧光的减少比单个荧光团的激发减少得更多。

最后，选择的激发波长的激发光作为唯一的激发光具有多个优点。如果样本额外被施加以未选择的激发光，这将导致背景荧光的增加，并且会有更大的风险，即刚要定位的荧光团的分离会因此被取消或干扰，因为可被额外的激发光激发的荧光团在紧邻的地方变成可激发状态并被激发，而样本将被不必要地加载和漂白。

进一步优选的实施方式的细节已经上面结合第一方法的描述给出。在那里指出哪些细节明确适用于所有方法，因此也适用于第四方法。

第五方法是用于对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查的进一步的方法。该方法包括：

通过以下方式对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集

i)用第一激发波长的聚焦的激发光对样本或样本的子区域进行共焦扫描，或用第一激发波长的聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用探测单元在第一波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，以及

ii)随后用第二激发波长的聚焦的激发光对样本或样本的子区域进行共焦扫描，或用第二激发波长的聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用探测单元在与第一波长范围不一致的第二波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，其中第一波长范围和第二波长范围分别是连续的，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内进行的探测都是以非光谱分辨的方式进行的，并且其中探测单元被相应地设置用于各个探测，

基于图像数据或图像数据的一部分确定和选择感兴趣的样本区域，其中在感兴趣的样本区域中包含多种染料的荧光团，

(特别是在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法，特别是根据MINFLUX方法，对第一染料的单个荧光团进行定位，其中使用第一激发波长的激发光来激发单个荧光团，并且其中使用探测单元在第三波长范围内对由激发的单个荧光团发射的荧光光子进行探测，

(特别是在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法，特别是根据MINFLUX方法，对第二染料的单个荧光团进行定位，其中使用第二激发波长的激发光来激发单个荧光团，并且其中使用探测单元在第四波长范围内对由激发的单个荧光团发射的荧光光子进行探测。

表述“通过...对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集”并不旨在限制该方法，即排除与其他方法相关的所述类型的其他图像采集方法的组合。

该方法旨在应显微镜的应用，该显微镜专门有一个适于在共焦或STED图像采集以及MINFLUX或STED-MINFLUX采集时进行探测的探测单元。这并不排除显微镜没有另外的探测单元。这仅仅意味着显微镜只有一个相应合适的探测单元。例如，这可能意味着，可以有意义地执行该方法的显微镜恰好有一个特别低噪声的探测单元或恰好一个敏感的微阵列，该微阵列被构造用于以空间分辨的方式检测点光源的衍射图像。该方法合理应用的另外的前提条件是样本中的染料在激发光谱或者吸收光谱上有非常大的差异。例如，它们的吸收最大值在光谱上彼此相隔120nm或更多。

根据该方法，在第一采集时，根据共焦方法或STED方法采集第一图像。在此，探测是在第一连续的波长范围内以非光谱分辨的方式进行的。激发是用第一激发波长的光进行的。随后，作为第一采集的另一部分，根据共焦方法或STED方法采集第二图像。在此，探测是与第一连续的波长范围不同的第二连续的波长范围内以非光谱分辨的方式进行的。激发是用第二激发波长的光进行的。然后，选择感兴趣的样本区域。可选地，即使在采集第一图像之后，也可以确定感兴趣的样本区域或包括感兴趣的样本区域的样本区域。然后，第二图像的采集最好限于该区域内。然后，在采集第二图像之后选择感兴趣的样本区域可以选择该区域，或可以包括从第二图像或第一图像和第二图像中重新确定感兴趣的样本区域。

从所采集的图像中，已经可以推断出为了在定位显微镜图像采集中针对多种染料的优化的比率法分离要选择的波长范围。因此可选地，在第一采集之后确定优化的波长范围。例如，从采集的图像中可以推断出会出现的背景荧光。因此，基于所采集的图像确定优化的波长范围，使得特别是在随后的定位显微镜采集中预期最小化的干扰的背景荧光，可能是有利的。

在第一采集完成后，对感兴趣的样本区域进行采集，或者更准确地说，根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法在感兴趣的样本区域中对单个荧光团进行定位，其中第一波长的激发光用于该定位。探测在与待定位荧光团的染料相匹配的波长范围内进行。该波长范围可以是第一波长范围，但也可以不同于第一波长范围。因此，在第一采集完成后，根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法在感兴趣的样本区域中对单个荧光团进行定位，其中第二波长的激发光用于该定位。探测在与待定位的荧光团的染料相匹配的波长范围内进行。该波长范围可以是第二个波长范围，但也可以不同于第二个波长范围。两个定位步骤的顺序可以自由选择。由于变换探测装置(或者探测单元)探测的波长范围需要时间，因此通常方便的做法是，使用第一波长的激发光依次执行至少一些定位，并且对用第二波长的激发光的定位进行同样操作。例如，可以首先用一波长的激发光对样本的感兴趣的区域进行完全定位，然后用另一波长的激发光进行完全定位。

在可替代的实施方式中，与第四方法类似，并且出于相应的原因，可以选择不同于执行第一采集时的激发波长来根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法执行定位。

根据本发明的用于对用多种染料染色的样本进行定位显微镜检查的第六方法结合了前面讨论的第四方法和第五方法的效果和优点。该方法包括对样本或样本的子区域的图像数据进行第一采集，基于图像数据确定和选择感兴趣的样本区域，使得在感兴趣的样本区域中包含多种染料的荧光团，以及(特别是在感兴趣的样本区域中)根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对多种染料的单个荧光团进行定位。

根据本发明，该方法还包括在根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行定位之前：用第一激发波长和第二激发波长的激发光对单个荧光团或多个单个荧光团进行照射或者第一照射，使得单个荧光团或多个单个荧光团被激发发出荧光；在第一波长范围和第二波长范围内对由激发的一个荧光团或多个荧光团发射的荧光光子进行探测，第二波长范围不同于第一波长范围；以及选择一个激发波长或多个激发波长，用该一个激发波长或多个激发波长，单个荧光团或多个荧光团被激发发出荧光，以根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行定位。

根据相当于上述本发明的第四方法的第六方法的第一实施方式，单个荧光团的第一照射在所选择的感兴趣的样本区域内的第一子区域中进行，其中从在第一波长范围和第二波长范围内探测到的荧光光子获得第一探测值和第二探测值，并且其中使用所选择的激发波长的激发光作为唯一激发光来执行定位。在本说明书中描述的为第四方法公开的或可与第四方法组合的所有实施方式和变型也可与第六方法的第一实施方式组合。

此外，本发明包括相当于上述第五方法的第六方法的第二实施方式，其中通过如下方式对图像数据进行第一采集：i)用第一激发波长的聚焦的激发光对样本或样本的子区域进行共焦扫描，或用第一激发波长的聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用探测单元在第一波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，以及ii)随后用第二激发波长的聚焦的激发光对样本或样本的子区域进行共焦扫描，或用第二激发波长的聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用探测单元在与第一波长范围不一致的第二波长范围内对由激发的荧光团发射的荧光光子进行探测，其中第一波长范围和第二波长范围分别是连续的，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内记性的探测都是以非光谱分辨的方式进行的，并且其中探测单元被相应地设置用于各个探测，并且其中：当定位第一染料的单个荧光团时，利用第一激发波长的激发光来激发单个荧光团，并且使用探测单元在第三波长范围内对由激发的单个荧光团发射的荧光光子进行探测；并且当定位第二染料的单个荧光团时，利用第二激发波长的激发光来激发单个荧光团，并且使用探测单元在第四波长范围内对由激发的单个荧光团发射的荧光光子进行探测。对第二染料和第三染料的单个荧光团的定位特别是根据MINFLUX方法进行的。

最后，根据本发明的显微镜被设计用于执行根据本发明的方法之一，优选地用于执行第一方法至第六方法。根据本发明的显微镜具有：

激发荧光的激光器，

扫描单元，其用于用聚焦的激发光扫描样本，

探测单元，其被设置为成可调节的光谱范围内，以非光谱分辨的方式探测荧光光子，该荧光光子从样本通过光学路径被引导到与激发光的焦点共轭的平面上；和

装置，优选是可变的可调节的波前调制器，该装置用于影响激发光的波前，使得激发光在聚焦区域内的样本的位置处形成具有中心最小值的强度分布；以及

控制单元，其被设置用于执行MINFLUX方法。

特别地，控制单元被设计用于执行上述方法之一，即第一方法至第六方法。

优选地，显微镜具有至少两个探测单元，该探测单元分别被设置为在可调节的光谱范围内，以非光谱分辨的方式探测荧光，其中优选地，探测单元中的至少一个探测单元被设置为以空间分辨的方式检测点对象的衍射图像。使用这种显微镜通常也可以执行第五方法，但由于在这种优选的变型中有一个以上的合适的探测单元，因此就没有什么意义了。

优选地，显微镜具有：支架，支架具有样本支撑体；物镜，其固定在物镜更换设备中；以及管状透镜，其中扫描单元、管状透镜和物镜沿着光学路径布置，并且其中探测单元布置在包括物镜、管状透镜和扫描单元的光学路径中。这种构造的优点是，也可用于不是根据本发明的显微镜的基本部件在很大程度上可用于根据本发明的显微镜。优选地，显微镜在物镜更换设备中具有多个不同的物镜。这使得可以使用不同放大倍率的物镜来采集不同大小的像场。例如，该方法中的第一采集可以如下方式容易地进行，即首先用低倍率物镜采集概览图像，然后用高倍率物镜采集片段图像。

此外，使用支架的另一个优点是，可以比较容易地添加其他部件。例如，可以在支架上安装通过检测微分干涉对比度来采集图像的探测器。因此优选地，显微镜具有用于检测微分干涉对比度的这种探测器，该探测器可拆卸地安装在支架上。该探测器应该是可拆卸的，以便在不需要该探测器时就不会占用光学路径中的任何空间，并可以防止将其用于其他目的，例如观察者的直接视觉观察。如果显微镜具有这样的探测器，则优选地，显微镜的控制单元与探测器连接或是可连接的，以检测微分干涉对比度，并且还被设置用于控制探测器并处理其探测信号。

在一变型中，显微镜具有宽视场探测器。例如，当使用支架时，该宽视场探测器可以连接到支架上的相机端口。

优选地，显微镜具有另外的偏转单元，该偏转单元被布置在用于照射样本的光学路径中，而不是布置在通往探测单元的路径中。该单元被设置成使得在极快但非常小的区域(其扩展范围的尺寸级为1μm)内进行扫描，该区域对于MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法特别有用。这样的单元可以例如是电光偏转单元，或者由多个电光偏转单元构成。

可替代地，第一偏转单元也可以被设计成执行小的空间扫描。这通常会减慢扫描速度，但大大降低了设备复杂性。特别地，由于根据本发明的显微镜作为一个整体上也被设计成借助于MINFLUX方法以外的方法采集高分辨率图像，或特别是当集成了STED激光器的情况下，采集超分辨率图像，这种变型可能是有用的，因为执行MINFLUX方法不一定是主要应用，并且仅在有特殊需要的情况下才进行，因此时间损失不大。

优选地，显微镜具有脉冲式激光器，其用于用荧光阻抑光、优选用STED光，照射样本。此外优选地，控制单元被设计用于执行STED-MINFLUX方法。

从上述对根据本发明的方法的优选实施方式的阐述中，产生了根据本发明的显微镜的相应优选实施方式。

以下内容适用于原始申请文件和专利的公开内容，而不是保护范围：进一步的特性可以在附图中，特别是所示的流程图中找到。本发明不同实施方式的特征或不同权利要求的特征的组合也有可能偏离所选择的权利要求的引用关系，并特此提出。这也适用于那些在单独附图中显示的、可以从流程图中提取的或者在对附图或流程图的描述中提到的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合起来。同样，权利要求中列出的特征对于本发明的进一步实施方式可以被省略，但这不适用于已授权专利的独立权利要求。

附图描述和基于附图对本发明的阐述

下面基于附图中所示的优选的实施例进一步阐述和描述本发明。

图1示意性地示出了根据本发明的显微镜。

图2示意性地图示了从大像场开始对样本进行成像直到以分子分辨率对片段进行成像的过程。

图3图示了第五、第四和第三方法的优选实施方式。

图4图示了第二和第一方法的优选实施方式。

图1中示出的根据本发明显微镜1具有共焦布置的探测单元2，该探测单元2具有可调节的波长范围，并且被设置成在每个选定的设置下，检测相关波长范围的光。该显微镜还具有光源单元3。该光源单元3包括激发激光器和用于调制激发光31的波前的单元。激发光31沿着照射光路径21被引导到二向色元件15上。借助于二向色元件，激发光31耦合到光路径的区段中，该光路径的区段形成用于激发光31和探测光32的共同的光路径23。偏转单元4位于共同的光路径23中，在这里，该偏转单元4被设计成在共焦显微镜图像采集过程中，以扫描方式在较大的像场内移动激发光31，并执行小的扫描运行以执行MINFLUX方法。通过偏转反射镜11、管状透镜12和保持在物镜更换设备13中的物镜5，激发光31被聚焦到位于样本支撑体6上的样本7中。如果激发光31适于激发样本7中的荧光，则在样本7中被激发的荧光作为探测光32在同一共同的光路径23上相相反的方向上被引导到二向色元件15。探测光32穿过二向色元件15，而任何散射的激发光31被阻止穿过，并向光源单元3偏转。探测光32沿着探测光路径22被引导到共焦布置的探测单元2上并由探测单元2进行检测。该显微镜还具有控制单元14，该控制单元14被设置用于执行MINFLUX方法。同时，该控制单元在这里还被设置用于执行共焦图像采集。此外，该控制单元还与显微镜1的自动控制部件(如偏转单元)连接，以及与探测单元2和另一探测器9连接。这里的连接是指，在控制单元14和所连接的部件和探测器之间，可以在至少一个方向上发送信号，例如通过无线电或通过电缆连接发送。显微镜1还具有支架10，该支架10特别地支撑或包含管状透镜12、物镜5和样本支撑体6。另一的探测器9可拆卸地固定在支架10上。该探测器9检测通过样本7透射的光34，该光34沿着透射光探测光路径24通过聚光器8被引导到探测器9中。

图2示意性地图示了根据本发明方法的过程。在示出的示例中，第一采集100包括三个子步骤101、102、13。用第一采集的子步骤101对在这里完全填充整个区域70的样本7进行成像，以找到待检查的对象，并且在必要时对其进行识别。在子步骤101中，可以使用扫描式对比方法。对于照射，选择低倍放大率(例如，10倍放大率)的物镜5，由此确保了扫描单元4可以完全扫描到整个区域70。可以使用图1所示的探测器9进行探测。在扫描单元4前面的照射方向上的光学路径21、23中使用未示出的光学部件，即以这样的方式使得照射光首先到达这些部件然后才到达扫描单元4，并且在透射光探测光路径24中，可以应用微分干涉对比作为对比方法。在切换到荧光显微镜成像方法之前，至少从包括共同的光路径23在内的探测光路径22中移除这些未示出的部件，例如通过电机枢转出来。在整个区域70中，在子区域71中发现对象。现在，在第二子步骤102中使用具有较高(例如，100)放大倍率的物镜5对该子区域71进行扫描并成像。为此，可以使用与第一步相同或不同的成像方法。优选地，选择对样本7加载尽可能小的的方法。在子区域71中，有具有细胞膜711、细胞器712(细线)和其他细胞器(粗线，为了清楚起见没有附图标记)以及细胞核713的细胞。观察者现在选择细胞内包含细胞器712的子区域72。该子区域现在用高分辨率的扫描式方法(例如，借助于共焦显微镜成像或借助于STED成像)来进行成像。在所获得的图像中，确定感兴趣的样本区域80。感兴趣的样本区域80在此以如下方式选择，使得确定用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围的测量以及荧光团90本身的定位200都在其中进行。

在图3中，示出了第五方法45、第四方法44和第三方法43的流程图。此外，在上面还示出了决策树，从中可以看出在哪些条件下优选地应用相应的方法。例如，如果显微镜没有平行的、适合的探测通道，而只有一个适合的探测单元，则特别地应用左侧的方法。如果样本7中所含的两种染料的光谱性质基本上是已知的，并且通过选择不同的激发波长，分离染料的吸收最大值相差足够远，例如超过120nm，则有利地可以应用第五方法45。在流程图中，按时间顺序执行的步骤现在用指向箭头来标记。如果在一个方框内几个步骤从上往下示出，但没有连接起来，则顺序是不固定的。这方面的一个例外是关于选择和设置激发激光器以及执行MINFLUX定位的第五方法45的信息。当然，这里是通过对染料A的设置来执行染料A的MINFLUX定位的，这同样适用于染料B。在本发明的描述中关于第五方法的说明和相应实施的背景下，流程图是不言自明的。

另一方面，如果显微镜1具有平行的、适合的探测通道，并且样本7中所包含的两种染料的光谱性质原则上是已知的，并且如果通过选择不同的激发波长来分离染料的吸收最大值相差足够远，例如大于120nm，则可以有利地应用第四方法44。在本发明的描述中关于第五方法的相应说明的背景下，流程图是不言自明的。

对于用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围事先已经非常清楚的情况，例如因为已经根据本发明的方法在比较样本上确定了这些波长范围，待解决的任务是执行整体上尽可能光子高效的成像，该成像在图像中将借助于MINFLUX方法采集的区域高精度嵌入到在第一采集100过程中过的图像区域中。特别是对于所使用的多种染料的吸收光谱太相似而无法通过使用不同的激发波长进行分离的情况，这一任务通过第三方法解决。在第一探测通道中使用宽带探测执行预扫描；进一步确定感兴趣的样本区域80。通常情况下，在开始设置随后使用的两个探测通道之前，用户首先确定感兴趣的样本区域80。因此，相应的步骤在这里由定向箭头连接起来。然而实际上，顺序也是可以调换的。在改变了第一探测通道和调节第二探测通道后，使用两个探测通道执行MINFLUX定位。荧光团90被按比率法分离。原则上，也可以设想在预扫描期间使用一个不用于MINFLUX定位的探测单元执行探测。然而，这不仅需要另外的探测单元，而且还增加了调整工作量。如果使用级联探测装置进行探测，特别是从专利DE 10 2018126 232B3中已知的那种探测装置，则在预扫描期间优选地使用第一探测单元来执行探测。另外的探测器仅由波长未被引导到该第一探测单元的光到达。因此，对于通常至少与第一宽探测通道重叠的两个通道中的探测，必须改变第一探测通道。

在图4中，示出了第二方法42和第一方法41的实施方式的流程图。在本发明的描述中，这些流程图在相关方法41、42的相应说明的背景下，在很大程度上也是不言自明的。然而，这里应该解释一下，在象征第二方法42的框架内，两个虚线箭头和与之相连的线所表示的内容。在多个探测通道中定位的不同步骤之间，探测通道被改变。一方面，这样做是为了比较比率法分离的质量来找到优化的设置。然而，如果从数据中识别到必须改变优化分离的设置，也可能发生这种情况。在这种情况下，在改变设置之前，首先确定优化的或至少改进的探测通道。此外，应该注意的是，第一定位(其同时用于寻找改进的或优化的探测通道)，也可以是像PALM这样的方法。原则上，这也适用于下面的定位。然而，只有在非常有利的条件下，才能用这种方法实现分子分辨率。因此，非常优选地，应用MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法。

参考标记列表

1 显微镜

2 探测装置或者探测单元

3 光源单元

4 扫描单元

5 物镜

6 样本支撑体

7 样本

8 聚光器

9 探测器

10 支架

11 偏转反射镜

12 管状透镜

13 物镜更换设备

14 控制单元

15 二向色元件

21 照射光路径

22 探测光路径

23 共同的光路径

24 透射光探测光路径

31 激发光

32 探测光

34 透射光

41 第一方法

42 第二方法

43 第三方法

44 第四方法

45 第五方法

70 整个区域

71 子区域

72 子区域

80 感兴趣的样本区域

90 荧光团

100 第一采集

101 子步骤

102 子步骤

103 子步骤

200 定位

411 第一扩展方案

412 第二扩展方案

711 细胞膜

712 细胞器

713 细胞核。

Claims (39)

1.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查(200)的方法，包括：

对所述样本(7)或所述样本的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集(100)，

基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，

用第一激发波长的激发光(31)激发在所选择的感兴趣的样本区域(80)内的第一子区域中的荧光团(90)，并使用第一探测单元(2)在第一波长范围内对由激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行第一探测，

用一个探测单元(2)或所述探测单元(2)在第二波长范围内对由用所述第一激发波长的激发光(31)激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行第二探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，

其特征在于，

所述第一探测单元(2)被设计成，所述第一探测单元(2)探测到荧光光子的波长范围是可调节的，并且所述方法还包括：

在多个光谱探测通道中对所述样本(7)进行定位显微镜图像采集时，确定用于多种染料的优化的比率法分离的波长范围，其中在所述感兴趣的样本区域(80)中，根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法执行单个荧光团(90)的定位(200)或跟踪，其中所述荧光光子的探测分别在针对多种染料的优化的比率法分离所确定的波长范围内进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据在所述感兴趣的样本区域(80)内选择所述第一子区域，使得在所述第一子区域中只包含或基本上只包含第一染料的荧光团(90)，并且在所述第一子区域中，用所述第一激发波长的激发光(31)激发多个荧光团(90)，并且从所述第一探测和所述第二探测获得表征所述第一染料的光谱发射的第一值和第二值。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据在所述感兴趣的样本区域(80)内选择第二子区域或可选的另外的子区域，使得在所述第二子区域或每个可选的另外的子区域中只包含或基本上只包含第二染料或另外的染料的荧光团(90)，并且在所述第二子区域或每个另外的子区域中用所述第一激发波长的激发光(31)激发多个荧光团(90)，并且在所述第一波长范围和所述第二波长范围内对由各激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，并且分别获得表征所述第二染料或各个所述另外的染料的光谱发射的第一值和第二值。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在一个或更多个另外的波长范围内对分别用所述第一激发波长的激发光(31)激发的所述第一染料、所述第二染料或所述另外的染料中的一种染料的荧光团(90)发射的荧光光子进行进一步的探测，从而从对用多种染料染色的样本(7)的测量中获得表征所述第一染料、所述第二染料或所述另外的染料中的一种染料的光谱发射的多个值，所述一个或更多个另外的波长范围彼此不同并且不同于所述第一波长范围和所述第二波长范围。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，交替不同的波长范围不重叠。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，用于优化的比率法分离的波长范围是分别从表征所述第一染料或所述第二染料或可选的另外的染料的光谱发射的所述第一值和所述第二值中获得的，或从多个这样的值中获得的。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探测单元(2)用于在不同波长范围内进行探测。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述图像数据选择所述感兴趣的样本区域(80)内的第一子区域，使得在所述第一子区域中包含多种染料的荧光团(90)，并且在所述第一子区域中反复激发单个荧光团(90)，其中所有多种染料的荧光团(90)被整体激发。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用所述第一激发波长的激发光(31)对荧光团(90)进行另外的激发，并在另外的两个波长范围内进行另外的探测，其中所述另外的两个波长范围中的至少一个波长范围既不是所述第一波长范围也不是所述第二波长范围。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和所述第二波长范围在第一临界波长处彼此相邻。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述另外的两个波长范围在一个临界波长处或所述临界波长处或另外的临界波长处彼此相邻。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，多次进行另外的激发和探测，其中每次都选择不同的另外的临界波长。

13.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和/或所述另外的波长范围中一个波长范围包括小于所述第一激发波长的波长，优选地仅包括小于所述第一激发波长的波长。

14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其特征在于，在两个波长范围内、在所述第一波长范围和所述第二波长范围内和/或在所述另外的两个波长范围中的一个波长范围和另一个波长范围内进行探测期间，分别将探测到的荧光光子与单个荧光团(90)的突发相关联，并且分别为所述突发确定在一个波长范围和另一个波长范围内探测到的荧光光子的数量。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，用于优化的比率法分离的所述波长范围是根据为所述突发确定的在一个波长范围和另一个波长范围内探测到的荧光光子的数量确定的。

16.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查的方法，包括：

对所述样本(7)或所述样本的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集，

基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，使得在所述感兴趣的样本区域(80)中包含多种染料的荧光团(90)，

根据MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中用第一激发波长的激发光(31)进行激发，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内分别对荧光光子进行探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，

其特征在于，所述方法还包括：

根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中在另外的两个波长范围内分别对荧光光子进行探测，其中所述另外的两个波长范围中的至少一个波长范围与所述第一波长范围或所述第二波长范围不一致。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和所述第二波长范围在第一临界波长处彼此相邻。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述另外的两个波长范围在另外的临界波长处彼此相邻，所述另外的临界波长与所述第一临界波长不一致。

19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围和/或所述另外的波长范围中的一个波长范围包括小于所述第一激发波长的波长，优选地仅包括小于所述第一激发波长的波长。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，对图像数据的所述第一采集(100)包括对所述样本(7)进行扫描的采集步骤，其中所述扫描是通过在所述激发光(31)的光学路径(21)中应用第一偏转单元(4)来完成的。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述扫描包括用聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共焦扫描或共同扫描。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在使用聚焦的激发光和荧光阻抑光进行共焦扫描或共同扫描时，所述探测是在连续的波长范围内进行的，并且是以非光谱分辨的方式进行的。

23.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查方法，包括：

对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集(100)，

基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，使得在所述感兴趣的样本区域(80)中包含多种染料的荧光团(90)，

根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，其中用第一激发波长的激发光(31)进行激发，并且其中在第一波长范围和第二波长范围内分别对荧光光子进行探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，

其特征在于，

通过用聚焦的激发光和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共焦扫描或共同扫描，对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)的图像数据进行所述第一采集(100)，其中所述探测是在连续的波长范围内进行的，并且是以非光谱分辨的方式进行的。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述连续的波长范围包括所述第一波长范围和所述第二波长范围。

25.一种用于对用多种染料染色的样本(7)进行定位显微镜检查方法，包括：

对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)的图像数据进行第一采集(100)，

基于所述图像数据确定和选择感兴趣的样本区域(80)，使得在所述感兴趣的样本区域(80)中包含多种染料的荧光团(90)，

根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对所述多种染料的单个荧光团(90)进行定位(200)，

其特征在于，所述方法还包括：

在根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行定位(200)之前：用第一激发波长和第二激发波长的激发光(31)对单个荧光团(90)或多个单个荧光团(90)进行照射或者第一照射(90)，使得所述单个荧光团(90)或所述多个单个荧光团(90)被激发发出荧光，

在第一波长范围和第二波长范围内对由激发的一个荧光团(90)或多个荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，以及

选择一个激发波长或多个激发波长，用所述一个激发波长或多个激发波长，单个荧光团(90)或多个单个荧光团(90)被激发发出荧光，以根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法进行所述定位(200)。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述单个荧光团(90)的所述第一照射在所选择的感兴趣的样本区域(80)内的第一子区域中进行，其中从在所述第一波长范围和所述第二波长范围内探测到的荧光光子获得第一探测值和第二探测值，并且其中使用所选择的激发波长的激发光(31)作为唯一激发光(31)来执行所述定位(200)。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，图像数据的所述第一采集(100)包括根据微分干涉对比方法的采集步骤，优选地包括根据扫描式微分干涉对比方法的采集步骤。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，图像数据的所述第一采集(100)包括根据宽视场荧光方法的采集步骤。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述第一波长范围和所述第二波长范围内对荧光光子的所述探测是在同时激活的单独的探测装置上进行的。

30.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，图像数据的所述第一采集(100)通过如下方式进行调节：

i)用所述第一激发波长的聚焦的激发光(31)对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)进行共焦扫描，或用所述第一激发波长的聚焦的激发光(31)和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用探测单元(2)在所述第一波长范围内对由激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，以及

ii)随后用第二激发波长的聚焦的激发光(31)对所述样本(7)或所述样本(7)的子区域(101、102、103)进行共焦扫描，或用所述第二激发波长的聚焦的激发光(31)和荧光阻抑光、优选用STED光，进行共同扫描，并使用所述探测单元(2)在与所述第一波长范围不一致的第二波长范围内对由激发的荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，其中所述第一波长范围和所述第二波长范围分别是连续的，并且其中在所述第一波长范围和所述第二波长范围内进行的所述探测都是以非光谱分辨的方式进行的，并且其中所述探测单元(2)被相应地设置用于各个探测，并且其中：

当定位所述第一染料的单个荧光团(90)时，利用所述第一激发波长的激发光(31)来激发所述单个荧光团(90)，并且使用所述探测单元(2)在第三波长范围内对由激发的单个荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，其中对所述第二染料的单个荧光团(90)的所述定位特别是根据MINFLUX方法来进行，并且其中

当定位所述第二染料的单个荧光团(90)时，利用所述第二激发波长的激发光(31)来激发所述单个荧光团(90)，并且使用所述探测单元(2)在第四波长范围内对由激发的单个荧光团(90)发射的荧光光子进行探测，其中对所述第二染料的单个荧光团(90)的所述定位特别是根据MINFLUX方法来进行。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第三波长范围和所述第一波长范围是相同的和/或所述第四波长范围和所述第二波长范围是相同的。

32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第三波长范围和/或所述第四波长范围是基于对在图像数据进行所述第一采集(100)的过程中获得的图像数据的分析来确定的，使得在根据MINFLUX方法或STED-MINFLUX方法对第一染料和/或第二染料的单个荧光团(90)进行定位(200)时，干扰的背景荧光得以最小化。

33.一种用于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的显微镜(1)，包括：

激发荧光的激光器，

扫描单元(4)，所述扫描单元(4)用于用聚焦的激发光(31)扫描样本(7)，

探测单元(2)，所述探测单元(2)被设置成在可调节的波长范围内，以非光谱分辨的方式探测荧光光子，所述荧光光子从所述样本(7)通过光学路径(22)被引导到与所述激发光(31)的焦点共轭的平面上；和

装置，优选是可变的可调节的波前调制器，所述装置用于影响激发光(31)的波前，使得所述激发光(31)在聚焦区域内的所述样本(7)的位置处形成具有中心最小值的强度分布；以及

用于执行MINFLUX方法的控制单元(14)，特别地其中，所述控制单元(14)还被设计用于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。

34.根据权利要求33所述的显微镜(1)，其特征在于，所述显微镜(1)具有：支架(10)，其具有样本支撑体(6)；物镜(5)，其固定在物镜更换设备(13)中；以及管状透镜(12)，其中所述扫描单元(4)、所述管状透镜(12)和所述物镜(5)沿着光学路径(21，22，23)布置，并且其中所述探测单元(2)布置在包括所述物镜(5)、所述管状透镜(12)和所述扫描单元(4)的光学路径(22)中。

35.根据权利要求34所述的显微镜(1)，其特征在于，用于检测微分干涉对比度的另外的探测器(9)能够安装在所述支架(10)处，并且所述显微镜(1)具有控制单元(14)，所述控制单元(14)与用于检测微分干涉对比度的所述探测器(9)连接或是可连接的。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，所述显微镜(1)具有另外的偏转单元，所述另外的偏转单元被布置在用于照射所述样本(7)的光学路径中，而不是布置在通往所述探测单元(2)的路径中。

37.根据权利要求33至36中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，所述显微镜(1)具有至少两个探测单元，所述至少两个探测单元分别被设置成在可调节的波长范围内以非光谱分辨的方式探测荧光，其中优选地，所述探测单元中的至少一个被设置成以空间分辨的方式检测点对象的衍射图像。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的显微镜(1)，其特征在于，所述显微镜(1)具有脉冲式激光器，用于用荧光阻抑光、优选用STED光来照射所述样本(7)。

39.根据权利要求38所述的显微镜(1)，其特征在于，所述控制单元(14)被设置用于执行STED-MINFLUX方法。

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