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WO2017126170A1 - 微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法 - Google Patents

微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法 Download PDF

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WO2017126170A1
WO2017126170A1 PCT/JP2016/080653 JP2016080653W WO2017126170A1 WO 2017126170 A1 WO2017126170 A1 WO 2017126170A1 JP 2016080653 W JP2016080653 W JP 2016080653W WO 2017126170 A1 WO2017126170 A1 WO 2017126170A1
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WO
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output pulse
information processing
detection unit
control signal
height
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/080653
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English (en)
French (fr)
Inventor
克俊 田原
Original Assignee
ソニー株式会社
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Filing date
Publication date
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Priority to CN201680078961.1A priority patent/CN108474730A/zh
Priority to JP2017562436A priority patent/JP6708983B2/ja
Priority to EP16886410.6A priority patent/EP3392645A4/en
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology

Definitions

  • This technology relates to a microparticle measuring apparatus that optically measures the characteristics of microparticles. More specifically, the present invention relates to a microparticle measuring apparatus, an information processing apparatus, and an information processing method for optically measuring characteristics of microparticles such as cells.
  • microparticles such as cells and microorganisms
  • microparticles such as microbeads
  • Techniques for analyzing or sorting the measured fine particles are being developed.
  • Flow cytometry is a method of detecting fluorescence and scattered light emitted from each microparticle by pouring the microparticles to be analyzed in a state of being aligned in the fluid and irradiating the microparticles with laser light, etc. This is an analysis method for analyzing and sorting microparticles.
  • cells labeled with a fluorescent dye are irradiated with excitation light having an appropriate wavelength and intensity such as laser light. Then, the fluorescent light emitted from the fluorescent dye is collected by a lens or the like, light of an appropriate wavelength range is selected using a wavelength selection element such as a filter or a dichroic mirror, and the selected light is converted into PMT (photoelectron multiplier: photo Detection is performed using a light-receiving element such as a multiplier (tube). At this time, it is also possible to simultaneously detect and analyze fluorescence from a plurality of fluorescent dyes labeled on cells by combining a plurality of wavelength selection elements and light receiving elements. Furthermore, the number of fluorescent dyes that can be analyzed can be increased by combining excitation light having a plurality of wavelengths.
  • spectral flow cytometry capable of measuring a fluorescence spectrum
  • the fluorescence emitted from fine particles is dispersed using a spectroscopic element such as a prism or a grating. Then, the dispersed fluorescence is detected using a light receiving element array in which a plurality of light receiving elements having different detection wavelength ranges are arranged.
  • the light receiving element array includes a plurality of independent detection channels such as a PMT array or a photodiode array in which light receiving elements such as a PMT and a photodiode are arranged one-dimensionally, or a two-dimensional light receiving element such as a CCD or a CMOS. It is used.
  • microparticles such as flow cytometry
  • many optical methods are used to detect the fluorescence and scattered light emitted from the microparticles by irradiating the microparticles to be analyzed with light such as a laser. . Then, based on the detected optical information, a histogram is extracted by an analysis computer and software, and analysis is performed.
  • quality control In the optical analysis of microparticles, quality control (QC: Quality Control) is required to verify the accuracy, check the operation of the equipment, and standardize before optical measurement of the actual microparticles to be tested. May do.
  • QC Quality Control
  • a plurality of beads labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities for example, 3 peak beads, 6 peak beads, 8 peak beads, etc.
  • one kind of beads that can obtain a wide spectrum For example, alignment check beads (Align Check Beads, Ultra Rainbow fluorescent particles) are used.
  • Patent Document 1 relates to a fluorescence-labeled test cell from a two-dimensional correlation diagram of the fluorescence-labeled test cell obtained by a flow cytometer.
  • a program that calculates the centroid value of a fluorescent population and corrects the fluorescence value using the fluorescence value of a fluorescently labeled test cell corresponding to the centroid value and a predetermined determinant.
  • a photodetector such as a PMT has a sensitivity difference for each individual, and a sensitivity difference occurs over time even for the same individual.
  • One cause of this difference in sensitivity is the variation in sensitivity of the photodetector. Even if the sensitivity variation is set to the same voltage value, it may differ by several tens of times or more depending on individual differences or with time, and this appears to be dominant in the difference in the output level of the device as it is. Therefore, even if the setting is the same as that of the previous measurement between apparatuses or in the apparatus, a difference occurs in the output level.
  • the main purpose of this technique is to provide a technique for accurately correcting the difference in output level in the measurement of fine particles that optically measures the characteristics of the fine particles.
  • the inventor of the present application has determined the output level by specifying the relationship between the applied voltage coefficient corresponding to the feature amount of the predetermined output pulse and the control signal of the detection unit. We succeeded in correcting the difference between the two with high accuracy, and completed this technology.
  • a detection unit that detects light from a fluorescent reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, a feature amount of the output pulse detected by the detection unit, and a feature amount of the output pulse
  • An information processing unit that identifies a relationship between an applied voltage coefficient corresponding to a feature amount of a predetermined output pulse and the control signal of the detection unit based on the control signal of the detection unit when detected
  • the feature quantity of the output pulse is a value that depends on the control signal of the detection unit.
  • the detection unit may be composed of a plurality of PMTs. In this case, it is possible to have an output difference between the plurality of PMTs.
  • the feature quantity of the output pulse can be the height of the output pulse or the area of the output pulse, and in particular, the height of the output pulse.
  • the information processing unit may correct the control signal based on the applied voltage coefficient. In this case, the target fine particles can be measured by the detection unit to which the corrected control signal is input.
  • the feature amount of the output pulse detected by the detection unit that detects light from the fluorescence reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, and the feature amount of the output pulse are detected.
  • An information processing unit for identifying a relationship between an applied voltage coefficient corresponding to a feature value of a predetermined output pulse and a control signal of the detection unit based on a control signal of the detection unit, and a feature value of the output pulse Provides an information processing device that is a value that depends on the control signal of the detection unit.
  • the feature quantity of the output pulse can be the height of the output pulse or the area of the output pulse, and in particular, the height of the output pulse.
  • the information processing unit may correct the control signal based on the applied voltage coefficient.
  • the information processing apparatus according to the present technology may further include a storage unit that stores the applied voltage coefficient.
  • the feature amount of the output pulse detected by the detection unit that detects light from the fluorescence reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, and the feature amount of the output pulse are detected.
  • an information processing step for specifying the relationship between the applied voltage coefficient corresponding to the feature amount of the predetermined output pulse and the control signal of the detection unit is performed, and the feature amount of the output pulse Provides an information processing method which is a value depending on the control signal of the detection unit.
  • the feature quantity of the output pulse can be the height of the output pulse or the area of the output pulse, and in particular, the height of the output pulse.
  • the control signal may be corrected based on the applied voltage coefficient.
  • microparticles widely include living body-related microparticles such as cells, microorganisms, and liposomes, or synthetic particles such as latex particles, gel particles, and industrial particles.
  • Biologically relevant microparticles include chromosomes, liposomes, mitochondria, organelles (organelles) that constitute various cells.
  • the cells include animal cells (for example, blood cells) and plant cells.
  • Microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and fungi such as yeast.
  • biologically relevant microparticles can include biologically relevant polymers such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof.
  • the industrial particles may be, for example, an organic or inorganic polymer material, a metal, or the like.
  • Organic polymer materials include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethyl methacrylate, and the like.
  • Inorganic polymer materials include glass, silica, magnetic materials, and the like.
  • Metals include gold colloid, aluminum and the like.
  • the shape of these fine particles is generally spherical, but in the present technology, it may be non-spherical, and the size, mass and the like are not particularly limited.
  • the difference in output level can be corrected with high accuracy in the microparticle measurement for optically measuring the characteristics of the microparticles.
  • the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
  • Fine particle measuring device 1 (1) Detection unit 11 (2) Information processing unit 12 [Sensitivity standardization method for PMT between devices] [Means of accuracy improvement] [Sensitivity standardization method for multiple PMTs] (3) Light irradiation unit 13 (4) Sorting unit 14 (5) Storage unit 15 (6) Flow path P (7) Display unit 16 (8) User interface 17 2.
  • Information processing apparatus 10 (1) Information processing unit 12 (2) Storage unit 15 (3) Others Information processing method
  • FIG. 1 is a schematic conceptual view schematically showing a first embodiment of a microparticle measuring apparatus 1 according to the present technology
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a second embodiment of the microparticle measuring apparatus 1 according to the present technology.
  • the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology is an apparatus that optically measures the characteristics of microparticles, and includes at least a detection unit 11 and an information processing unit 12. Moreover, you may provide the light irradiation part 13, the fractionation part 14, the memory
  • each part will be described in detail.
  • the detector 11 detects light from the fluorescence reference particles that emit fluorescence having a predetermined wavelength range. Moreover, the detection of the light from a microparticle can also be performed.
  • the type of the detection unit 11 that can be used in the present technology is not particularly limited as long as it can detect light from the fluorescence reference particles, and a known photodetector can be freely selected and employed.
  • fluorescence measuring device scattered light measuring device, transmitted light measuring device, reflected light measuring device, diffracted light measuring device, ultraviolet spectroscopic measuring device, infrared spectroscopic measuring device, Raman spectroscopic measuring device, FRET measuring device, FISH measuring device
  • various types of spectrum measuring devices so-called multi-channel photodetectors in which a plurality of photodetectors are arranged in an array, etc. can be used alone or in combination of two or more.
  • an area imaging device such as a CCD or a CMOS device, a PMT, a photodiode, or the like can be provided as the detection unit 11.
  • a PMT is preferably provided as the detection unit 11.
  • the detection unit 11 includes a plurality of light receiving elements having different detection wavelength ranges.
  • the intensity of light in the continuous wavelength range can be measured as a fluorescence spectrum.
  • a plurality of independent detection channels such as a PMT array or a photodiode array in which light receiving elements are arranged one-dimensionally, or a two-dimensional light receiving element such as a CCD or a CMOS are arranged.
  • the detection unit 11 is configured from a plurality of PMTs
  • the output of each PMT can be set to a desired level in one apparatus, the convenience of the user at the time of measurement is improved.
  • the installation location of the detection unit 11 in the microparticle measurement apparatus 1 is not particularly limited as long as it can detect light from the fluorescence reference particles, and can be freely designed.
  • positioning the detection part 11 on the opposite side to the light irradiation part 13 on both sides of the flow path P the detection part 11 and the light irradiation part 13 can be arrange
  • the detection unit 11 may be arranged on the same side as the light irradiation unit 13 or on the 90 ° side surface with respect to the flow path P. I do not care.
  • Information processing unit 12 In the information processing unit 12, information processing and control of the detection unit 11, a light irradiation unit 13, a sorting unit 14, a storage unit 15, a display unit 16, a user interface 17, and the like which will be described later are performed. As information processing, based on the feature quantity of the output pulse detected by the detection section 11 and the control signal of the detection section 11 when the feature quantity of the output pulse is detected, the feature quantity of the predetermined output pulse is obtained. The relationship between the corresponding applied voltage coefficient and the control signal of the detection unit 11 is specified. In the present technology, the feature amount is a value depending on a control signal of the detection unit 11.
  • the control signal of the detection unit 11 is standardized by adopting the above-described configuration as the configuration of the information processing unit 12, the anode sensitivity (set to a certain voltage) generated in the device between devices and over time. Variation in sensitivity such as output from a detector such as PMT at the time. Therefore, even if the absolute output of the apparatus changes due to individual differences of detectors or with time, it is possible to measure at the same output level.
  • the feature amount of the output pulse is not particularly limited as long as it is a value depending on the control signal of the detection unit 11. However, in the present technology, it is preferable to set the height of the output pulse or the area of the output pulse. More preferably, the height of Thereby, the difference in output level can be corrected with higher accuracy. In this technology, the median or average of these values can be used, but the median such as Height Median (median of output pulse height), Area Median (median of output pulse area), etc. Is preferably used.
  • Fluorescent reference particles that can be used in the present technology are particles that emit fluorescence having a predetermined wavelength range.
  • the fluorescent reference particles particles that emit fluorescence having a wavelength band according to the type of the microparticle measuring device 1 and the detection unit 11, the type of microparticles to be measured, the measurement purpose, and the like can be freely selected. .
  • fluorescent reference particles include alignment check beads, Ultra Rainbow fluorescent particles, and the like.
  • the conditions that can be used as the fluorescence reference particles include that the fluorescence intensity can be sufficiently obtained in the wavelength band width of the sensitivity of the PMT to be corrected. Further, for example, particles such as beads labeled with a fluorescent dye can be used.
  • fluorescent dyes examples include Cascade Blue, Pacific Blue, Fluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumiodide (PI), Texas red (TR), Peridinin chlorophyll protein (PerCP), Allophycocyanin ( APC), 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), Cy3, Cy5, Cy7 and the like can be used singly or in combination of two or more.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • PE Phycoerythrin
  • PI Propidiumiodide
  • TR Texas red
  • APC Allophycocyanin
  • 4 ′ 6-Diamidino-2-phenylindole
  • Cy3, Cy5, Cy7 and the like can be used singly or in combination of two or more.
  • the wavelength range of the fluorescence emitted from the fluorescence reference particles covers at least a part of each of the detection wavelength ranges of the plurality of light receiving elements. Preferably, it is more preferable to cover the whole. For example, in the case of a general flow cytometer, it is preferable to select particles that emit fluorescence having a wavelength range of 400 to 800 nm.
  • the types of the microparticle measurement device 1 and the detection unit 11 and the types of microparticles to be measured can be specified by a free method.
  • a method of calculating an applied voltage coefficient based on HV (High Voltage; voltage) and Height Median (median value of the height of an output pulse) obtained from fluorescent reference particles can be used.
  • HV High Voltage; voltage
  • Height Median median value of the height of an output pulse
  • a1 for example, a predetermined value specified at the time of the previous measurement
  • an initial value of HV2 of Height adjustment target value (hereinafter referred to as “Target”) 2 is obtained based on Equation (1) below. HV adjustment starts from there. And HV2 and Height Median2 are acquired.
  • HV3 and Height Median3 and HV4 and Height Median4 are obtained in the same way.
  • Hst3 is a Height Median value when St is 3.0.
  • a and b are further obtained from St1 to 4 and HV1 to 4 obtained as described above.
  • the corresponding HV value is set using the recorded correspondence relationship between St and HV.
  • HV can be determined in light of the recorded linear function based on the St value set by the user. Thereby, as described below, even when the sensitivity is different between PMT_1 and PMT_2, HV can be set so that the same experimental result can be obtained.
  • the corresponding HV value is set using the recorded correspondence relationship between St and HV.
  • HV can be determined in light of the recorded linear function based on the St value set by the user.
  • the HVs of a plurality of PMTs can be controlled with one HV.
  • the applied voltage coefficient (St) is calculated using Height Median, but in this technology, Area Median (the median value of the area of the output pulse) is used instead of Height Median. Is also possible. Further, the applied voltage coefficient is not particularly limited as long as it corresponds to a feature amount of a predetermined output pulse, and can be calculated with an arbitrary setting. Furthermore, in the above two specific examples, when the straight line is obtained, the plot is made with 4 points. However, the present technology is not limited to this, and the plot may be made with 2 or more points.
  • the correspondence relationship between St and HV may be a method of storing a correspondence table as well as a method of obtaining and storing a primary straight line for measurement.
  • the setting of the St value at the time of measurement is not limited to that by the user, but the St value can also be set by the information processing unit 12 based on the measurement sample and conditions.
  • the microparticle measurement apparatus 1 can further include a light irradiation unit 13 that performs light irradiation on the fluorescence reference particles and the microparticles.
  • a light irradiation unit 13 that performs light irradiation on the fluorescence reference particles and the microparticles.
  • the kind of light irradiated from the light irradiation part 13 is not specifically limited, In order to generate
  • the type is not particularly limited, but an argon ion (Ar) laser, helium-neon (He-Ne) laser, die laser, krypton (Cr) laser, semiconductor laser, or semiconductor laser and wavelength.
  • Ar argon ion
  • He-Ne helium-neon
  • Cr krypton
  • semiconductor laser semiconductor laser
  • One or more solid lasers combined with conversion optical elements can be used in any combination.
  • the microparticle measurement apparatus 1 can further include a sorting unit 14 that sorts microparticles.
  • the sorting unit 14 sorts microparticles based on spectrum data generated by correcting the value detected by the detection unit 11 by the information processing unit 12.
  • the sorting unit 14 can sort the microparticles downstream of the flow path P based on the analysis result of the size, shape, internal structure, and the like of the microparticles analyzed from the spectrum data.
  • the vibration element 14a to be used is not particularly limited, and a known element can be freely selected and used.
  • a piezoelectric vibration element or the like can be given.
  • the size of the liquid droplet is adjusted to generate a liquid droplet containing a certain amount of fine particles. Can do.
  • a positive or negative charge is charged based on the analysis result of the size, form, internal structure, etc. of the microparticles analyzed based on the spectrum data corrected and generated by the information processing unit 12 (FIG. 2 (see reference numeral 14b). Then, the charged droplets are sorted by changing the path in a desired direction by the counter electrode 14c to which a voltage is applied.
  • the fine particle measurement apparatus 1 can further include a storage unit 15 that stores a relationship (for example, a linear function, a correspondence table, etc.) between the HV and the applied voltage coefficient.
  • a storage unit 15 that stores a relationship (for example, a linear function, a correspondence table, etc.) between the HV and the applied voltage coefficient.
  • the storage unit 15 includes the value detected by the detection unit 11, the spectrum data generated by the information processing unit 12, the reference spectrum of each channel, and specified by the previous measurement. It is also possible to memorize all matters related to measurement, such as the relationship between the measured HV and the applied voltage coefficient.
  • the storage unit 15 is not essential, and an external storage device may be connected.
  • an external storage device may be connected.
  • a hard disk or the like can be used as the storage unit 15.
  • the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology can further include a flow path P.
  • the flow path P may be provided in the microparticle measurement apparatus 1 in advance, but a commercially available flow path P or a disposable chip or the like provided with the flow path P is installed in the microparticle measurement apparatus 1 for analysis or sorting. It is also possible to perform.
  • the form of the flow path P is not particularly limited, and can be freely designed.
  • it is not limited to the flow path P formed in a two-dimensional or three-dimensional plastic or glass substrate T as shown in FIG. 1, but is used in a conventional flow cytometer as shown in FIG.
  • a simple flow path P can also be used in the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology.
  • the channel width, the channel depth, and the channel cross-sectional shape of the channel P are not particularly limited as long as they can form a laminar flow, and can be freely designed.
  • a micro flow channel having a flow channel width of 1 mm or less can also be used in the microparticle measurement apparatus 1.
  • a microchannel having a channel width of about 10 ⁇ m or more and 1 mm or less can be suitably used for the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology.
  • the microparticle measurement apparatus 1 can further include a display unit 16.
  • the display unit 16 displays all items related to measurement, such as the value detected by the detection unit 11, the spectrum data generated by the information processing unit 12, the calculated applied voltage coefficient, the reference spectrum of each channel, and the like. Can do.
  • the display unit 16 is not essential, and an external display device may be connected.
  • a display or a printer can be used as the display unit 16.
  • the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology can further include a user interface 17 that is a part for a user to operate. The user can access the information processing unit 12 through the user interface 17 and control each unit of the microparticle measurement apparatus 1 according to the present technology.
  • the user interface 17 is not essential, and an external operating device may be connected.
  • an external operating device for example, a mouse or a keyboard can be used as the user interface 17.
  • FIG. 8 is a schematic conceptual diagram schematically showing an example of a flow cytometer that can use the first embodiment of the information processing apparatus 10 according to the present technology
  • FIG. 9 is an information processing device according to the present technology.
  • It is a schematic conceptual diagram which shows typically an example of the flow cytometer which can use 10 2nd Embodiment.
  • the information processing apparatus 10 according to the present technology includes at least an information processing unit 12. Moreover, you may provide the memory
  • the display part 16 and the user interface 17 are the same as the detail of the display part 16 and the user interface 17 of the microparticle measurement apparatus 1 mentioned above, description is omitted here.
  • Information processing unit 12 In the information processing unit 12, information processing and control of the storage unit 15, the display unit 16, the user interface 17, and the like are performed.
  • the detection unit that detects light from the fluorescence reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, the feature amount of the output pulse detected by the detection unit, and the detection when the feature amount of the output pulse is detected
  • the relationship between the applied voltage coefficient corresponding to the feature quantity of the predetermined output pulse and the control signal of the detection unit is specified based on the control signal of the unit.
  • the feature amount is a value depending on a control signal of the detection unit.
  • the details of the information processing performed by the information processing unit 12 and the details of the fluorescence reference particles are the same as those of the information processing method performed by the information processing unit 12 and the fluorescence reference particles used in the microparticle measuring apparatus 1. I will omit the explanation.
  • the information processing apparatus 10 may further include a storage unit 15 that stores an applied voltage coefficient.
  • storage part 15 is the same as the detail of the memory
  • the information processing apparatus 10 may include a display unit 16 and a user interface 17 as illustrated in FIGS. Moreover, as shown in FIG. 9, it is also possible to connect the information processing apparatus 10 and each part (detection part 11, light irradiation part 13, sorting part 14, etc.) of a flow cytometer via a network. Furthermore, although not shown, the storage unit 15, the display unit 16, and the user interface 17 are provided outside the information processing apparatus 10, and these can be connected via a network.
  • the information processing method according to the present technology is a method of performing at least an information processing step.
  • a specific information processing method performed in the information processing step is the same as the information processing method performed in the information processing unit 12 of the information processing apparatus 10 described above.
  • FIGS. 10 and 11 an example of the flow of fine particle measurement using the information processing method according to the present technology will be described with reference to FIGS. 10 and 11 is performed by, for example, the detection unit 11 or the information processing unit 12 described above.
  • FIG. 10 is a flowchart showing an example of an information processing method according to the present technology, and shows a flow related to specifying the relationship between the applied voltage coefficient (St) and the HV value for PMT sensitivity standardization.
  • step S1 PMT is set to the initial value of HV1 (step S1).
  • step S2 sample measurement is performed (step S2), and a measurement value of a sample indicating Singlet is extracted (step S3).
  • Height Median1 is calculated (step S4). If it is determined in step S5 that the calculated value of Height Median1 is not Target1 ⁇ 10%, the HV1 value of the PMT is changed (step S6), and the process returns to step S2. Steps S2 to S6 are repeated until the calculated value of Height Median1 is included in Target1 ⁇ 10%. If it is determined that Target1 ⁇ 10%, the calculated value of Height Median1 and the HV1 value are recorded in association (step) S7).
  • Step S10 After recording the calculated value of Height Median1 and HV1 value, set PMT to the initial value of HV2 (step S1), repeat steps S2 to S6 until the calculated value of Height Median2 reaches Target2 ⁇ 10%, and so on In Step S7, the calculated value of Height Median2 and the HV2 value are recorded.
  • the above processing is performed on a numerical value range of N Heights that can be approximated to a linear function, and the calculated values of N Height Median and HV values are recorded (step S8).
  • FIG. 11 is a flowchart showing an example of microparticle measurement using a linear function recorded by the information processing method according to the present technology, and shows a flow relating to sample measurement based on setting of an applied voltage coefficient (St). .
  • the St value is set (Step S11).
  • the HV value of the PMT is set based on the recorded linear function (step S12).
  • sample measurement is performed (step S13), and the process is terminated.
  • the present technology may have the following configurations.
  • a detection unit for detecting light from fluorescent reference particles that emit fluorescence of a predetermined wavelength range An applied voltage coefficient corresponding to a feature value of a predetermined output pulse based on the feature value of the output pulse detected by the detection unit and the control signal of the detection unit when the feature value of the output pulse is detected
  • an information processing unit for specifying a relationship between the control signal of the detection unit, With The fine particle measuring apparatus, wherein the feature amount of the output pulse is a value depending on a control signal of the detection unit.
  • a detection unit that detects light from a fluorescent reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, a feature amount of the output pulse detected by the detection unit, and a control signal of the detection unit when the feature amount of the output pulse is detected; Based on the information processing unit for specifying the relationship between the applied voltage coefficient corresponding to the characteristic amount of the predetermined output pulse and the control signal of the detection unit, With The information processing apparatus, wherein the feature amount of the output pulse is a value depending on a control signal of the detection unit. (9) The information amount according to (8), wherein the feature amount of the output pulse is the height of the output pulse or the area of the output pulse.
  • the characteristic amount of the output pulse is the information processing apparatus according to (8) or (9), wherein the output pulse has a height.
  • a detection unit that detects light from a fluorescent reference particle that emits fluorescence of a predetermined wavelength range, a feature amount of the output pulse detected by the detection unit, and a control signal of the detection unit when the feature amount of the output pulse is detected; Based on the information processing step for specifying the relationship between the applied voltage coefficient corresponding to the feature quantity of the predetermined output pulse and the control signal of the detection unit, And The information processing method, wherein the feature amount of the output pulse is a value depending on a control signal of the detection unit. (14) The information processing method according to (13), wherein the feature amount of the output pulse is a height of the output pulse or an area of the output pulse.
  • the feature amount of the output pulse is the information processing method according to (13) or (14), which is a height of the output pulse.

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Abstract

微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、出力レベルの差を精度高く補正する技術を提供すること。　本技術では、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部と、前記検出部により検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部と、を備え、前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、微小粒子測定装置などを提供する。

Description

微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法
　本技術は、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、細胞等の微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法に関する。
　近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズ等の微小粒子などを流路中に通流させ、通流させる工程において、微小粒子等を個々に測定したり、測定した微小粒子等を解析又は分取したりする手法が開発されつつある。
　このような微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、微小粒子の解析や分取を行う分析手法である。
　例えば、細胞の蛍光を検出する場合、蛍光色素により標識した細胞にレーザー光などの適当な波長かつ強度を有する励起光を照射する。そして、蛍光色素から発せられる蛍光をレンズなどで集光し、フィルタやダイクロイックミラー等の波長選択素子を用いて適当な波長域の光を選択し、選択された光をＰＭＴ（光電子倍増管：photo multiplier tube）などの受光素子を用いて検出する。このとき、波長選択素子と受光素子とを複数組み合わせることによって、細胞に標識された複数の蛍光色素からの蛍光を同時に検出し、解析することも可能である。更に、複数波長の励起光を組み合わせることで、解析可能な蛍光色素の数を増やすこともできる。
　フローサイトメトリーにおける蛍光検出には、フィルタなどの波長選択素子を用いて不連続な波長域の光を複数選択し、各波長域の光の強度を計測する方法の他に、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測する方法もある。蛍光スペクトルの計測が可能なスペクトル型フローサイトメトリーでは、微小粒子から発せられる蛍光を、プリズム又はグレーティングなどの分光素子を用いて分光する。そして、分光された蛍光を、検出波長域が異なる複数の受光素子が配列された受光素子アレイを用いて検出する。受光素子アレイには、ＰＭＴやフォトダイオード等の受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、或いはＣＣＤ又はＣＭＯＳ等の２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが用いられている。
　フローサイトメトリー等に代表される微小粒子の解析では、分析対象となる微小粒子にレーザーなどの光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する光学的手法が多く用いられている。そして、検出された光学的情報をもとに、解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析が行われる。
　微小粒子の光学的解析においては、実際に被検対象となる微小粒子の光学的測定の前に、その精度等の検証や装置の動作確認・標準化等のため、クオリティーコントロール（ＱＣ：Quality Control）を行う場合がある。このクオリティーコントロールにおいては、通常、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数のビーズ（例えば、３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等）や広範囲のスペクトルが得られる一種類のビーズ（例えば、アラインチェックビーズ：Align Check Beads、Ultra Rainbow 蛍光粒子）等が用いられている。
　複数の蛍光色素間で測定を行う際に、蛍光補正を行う技術としては、例えば、特許文献１に、フローサイトメーターによって得られた蛍光標識被験細胞の二次元相関図から当該蛍光標識被験細胞に関する蛍光集団の重心値を算出し、重心値に該当する蛍光標識被験細胞の蛍光値と所定の行列式を用いて蛍光値の補正計算を行うようなプログラムを開発することにより、複数の蛍光色素間や、複数のレーザー光を用いて蛍光の測定を行う際にも蛍光補正が可能であり、また、被験細胞の測定処理が終了した後でも試料の再調製を行うことなく蛍光補正を実施することが可能な技術が開示されている。
特開２００３－８３８９４号公報
　ＰＭＴのような光検出器には、個体毎に感度差があり、同一の個体であっても経時により感度差が生じる。この感度差が生じる原因の一つに、光検出器の感度のバラつきがある。感度のバラつきは、同一の電圧値に設定したとしても、個体差や経時により数十倍以上異なる場合もあり、これがそのまま装置の出力レベルの差に支配的に現れる。そのため、装置間や装置内で前回の測定時と同一の設定にしても、その出力レベルに差が生じてしまう。
　そこで、本技術では、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、出力レベルの差を精度高く補正する技術を提供することを主目的とする。
　本願発明者は、前述した目的を解決するために鋭意研究を行った結果、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と検出部の制御信号との関係を特定することで、出力レベルの差を精度高く補正することに成功し、本技術を完成させるに至った。
　すなわち、本技術では、まず、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部と、前記検出部により検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部と、を備え、前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、微小粒子測定装置を提供する。
　前記検出部は、複数のＰＭＴからなるものであってもよい。この場合、前記複数のＰＭＴ間で出力差を有するものとすることができる。
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積とすることができ、特に、出力パルスの高さとすることができる。
　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正してもよい。この場合、補正された前記制御信号が入力された前記検出部により、対象の微小粒子を測定するものとすることができる。
　また、本技術では、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部、を備え、前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理装置も提供する。
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積とすることができ、特に、出力パルスの高さとすることができる。
　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正するものであってもよい。
　本技術に係る情報処理装置は、前記加電圧係数を記憶する記憶部、を更に備えていてもよい。
　更に、本技術では、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理工程、を行い、前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理方法も提供する。
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積とすることができ、特に、出力パルスの高さとすることができる。
　前記情報処理工程では、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正してもよい。
　本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソーム等の生体関連微小粒子、或いはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子等の合成粒子などが広く含まれるものとする。
　生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(例えば、血球系細胞等)及び植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌等の細菌類、タバコモザイクウイルス等のウイルス類、イースト菌等の菌類などが含まれる。更に、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体等の生体関連高分子も包含され得る。また、工業用粒子は、例えば、有機若しくは無機高分子材料、金属等であってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート等が含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料等が含まれる。金属には、金コロイド、アルミ等が含まれる。これらの微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、本技術では、非球形であってもよく、また、その大きさ、質量等も特に限定されない。
　本技術によれば、微小粒子の特性を光学的に測定する微小粒子測定において、出力レベルの差を精度高く補正することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。 本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。 Forward Scatter/Side Scatter（FSC/SSC）の２次元プロット図において、Singlet（粒子が１個のみ通流した場合のデータ）のみをゲーティングする様子を示す図である。 ＰＭＴ（Ｘ）において、縦軸をLog HV、横軸をStとした場合の直線関係を示す図面代用グラフである。 ＰＭＴ（Ｙ）において、縦軸をLog HV、横軸をStとした場合の直線関係を示す図面代用グラフである。 感度標準化方法において、一次関数を適用した場合（縦軸：Log HV、横軸：St）の関係を示す図面代用グラフである。 感度標準化方法において、三次関数を適用した場合（縦軸：Log HV、横軸：St）の関係を示す図面代用グラフである。 本技術に係る情報処理装置１０の第１実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。 本技術に係る情報処理装置１０の第２実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。 本技術に係る情報処理方法の一例を示すフローチャートである。 本技術に係る情報処理方法にて記録した一次関数を用いた微小粒子測定の流れの一例を示すフローチャートである。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
　１．微小粒子測定装置１
　（１）検出部１１
　（２）情報処理部１２
［装置間のＰＭＴに対する感度標準化方法］
［精度向上の手段］
［複数のＰＭＴに対する感度標準化方法］
　（３）光照射部１３
　（４）分取部１４
　（５）記憶部１５
　（６）流路Ｐ
　（７）表示部１６
　（８）ユーザーインターフェース１７
　２．情報処理装置１０
　（１）情報処理部１２
　（２）記憶部１５
　（３）その他
　３．情報処理方法
＜１．微小粒子測定装置１＞
　図１は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図であり、図２は、本技術に係る微小粒子測定装置１の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の特性を光学的に測定する装置であって、検出部１１と、情報処理部１２と、を少なくとも有する。また、必要に応じて、光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、流路Ｐ、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７等を備えていてもよい。以下、各部について詳細に説明する。
　（１）検出部１１
　検出部１１では、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する。また、微小粒子からの光の検出も行うことができる。本技術に用いることができる検出部１１は、蛍光基準粒子からの光の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器、その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、所謂マルチチャンネル光検出器などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
　本技術では、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ、フォトダイオード等を検出部１１として備えることができるが、中でも特に、ＰＭＴを検出部１１として備えることが好ましい。本技術を用いることで、特に、ＰＭＴを検出部１１として備えた場合に、出力レベルの差を精度高く補正できる。
　本技術では、検出部１１を異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することが好ましい。検出部１１を異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成することで、連続した波長域における光の強度を蛍光スペクトルとして計測することができる。具体的には、例えば、受光素子を一次元に配列したＰＭＴアレイ又はフォトダイオードアレイ、或いはＣＣＤ又はＣＭＯＳ等の２次元受光素子などの独立した検出チャネルが複数並べられたものが挙げられるが、中でも特に、複数のＰＭＴから検出部１１を構成することが好ましい。
　複数のＰＭＴから検出部１１を構成した場合、後述する［複数のＰＭＴに対する感度標準化方法］で示すように、前記複数のＰＭＴ間で出力差を有していてもよい。これにより、一つの装置内で各々のＰＭＴの出力を所望のレベルに設定できるため、測定時のユーザーの利便性が向上する。
　微小粒子測定装置１における検出部１１の設置箇所は、蛍光基準粒子からの光の検出ができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１及び２に示すように、流路Ｐを挟んで後述する光照射部１３と逆側に配置することが好ましい。検出部１１を、流路Ｐを挟んで光照射部１３と逆側に配置することで、検出部１１や光照射部１３をより自由な構成で配置させることができる。また、例えば、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、流路Ｐを基準に光照射部１３と同じ側や９０度側面の側に検出部１１を配置しても構わない。
　（２）情報処理部１２
　情報処理部１２では、情報処理、並びに、検出部１１や後述する光照射部１３、分取部１４、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７等の制御が行われる。情報処理としては、検出部１１により検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の検出部１１の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と検出部１１の制御信号との関係を特定する。本技術では、前記特徴量は、検出部１１の制御信号に依存する値である。
　本技術では、情報処理部１２の構成として上記の構成を採用したことで、検出部１１の制御信号が標準化されるため、装置間や経時により装置内で生じる、陽極感度（ある電圧に設定した際のＰＭＴ等の検出器からの出力）等の感度のバラつきを無くすことができる。そのため、装置の絶対出力が検出器の個体差や経時により変化しても、同一の出力レベルで測定することが可能となる。
　また、装置間や装置内でのデータの互換性も可能となるため、検出器の感度のバラつきに起因するデータの齟齬を補正する必要が無くなり、データ利用時のユーザーの利便性も向上する。
　前記出力パルスの特徴量とは、検出部１１の制御信号に依存する値であれば特に限定されないが、本技術では、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積とすることが好ましく、出力パルスの高さとすることがより好ましい。これにより、出力レベルの差を更に精度高く補正できる。
　また、本技術では、これらの値の中央値又は平均値を用いることができるが、Height Median（出力パルスの高さの中央値）、Area Median（出力パルスの面積の中央値）等の中央値を用いることが好ましい。
　本技術で用いることができる蛍光基準粒子とは、所定の波長域幅の蛍光を発する粒子である。この蛍光基準粒子は、微小粒子測定装置１や検出部１１の種類、測定対象となる微小粒子の種類、測定目的等に応じた波長域幅の蛍光を発する粒子を、自由に選択することができる。
　蛍光基準粒子としては、具体的には、例えば、アラインチェックビーズ、Ultra Rainbow 蛍光粒子等である。蛍光基準粒子として用いることができる条件としては、補正対象となるＰＭＴの感度の波長域幅で蛍光強度が十分に得られることが挙げられる。また、例えば、蛍光色素で標識されたビーズ等の粒子を用いることも可能である。本技術で使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidiumiodide(PI)、Texas red(TR)、Peridinin chlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、Cy3、Cy5、Cy7等を１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
　蛍光基準粒子が発する蛍光の波長域幅は、検出部１１が異なる検出波長域を有する複数の受光素子から構成される場合、複数の受光素子の検出波長域のそれぞれに対して少なくとも一部をカバーすることが好ましく、全部をカバーすることがより好ましい。例えば、一般的なフローサイトメーターであれば、波長域幅が４００～８００ｎｍの蛍光を発する粒子を選択することが好ましい。
　所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と検出部１１の制御信号との関係を特定する方法としては、微小粒子測定装置１や検出部１１の種類、測定対象となる微小粒子の種類、測定目的等に応じて、自由な方法で特定することができる。例えば、HV（High Voltage；電圧）と、蛍光基準粒子から得られるHeight Median（出力パルスの高さの中央値）と、に基づいて、加電圧係数を算出する方法等を挙げることができる。以下、加電圧係数の具体的な特定方法について、例を挙げて説明する。
［装置間のＰＭＴに対する感度標準化方法］
※「感度標準化のための加電圧係数・HV値の関係特定」
（ａ）ＰＭＴをHV初期値に調整し蛍光基準粒子の測定を行い、得られたForward Scatter/Side Scatter（以下、「FSC/SSC」）の２次元プロット図において、図３に示すように、Singlet（粒子が１個のみ通流した場合のデータ）を示す部分をゲーティングする。
（ｂ）ゲーティングした細部集団において、ＰＭＴの出力パルスの高さ（Height）から中央値（Median）（以下、「Height Median」）を算出する。
（ｃ）Height Medianが所定の数値範囲（例えば、Height Median＝60,000の±10%の調整範囲）になるまでHVを調整し、対応するHVを特定する。
（ｄ）前述した（ａ）～（ｃ）の処理をHeight Medianの異なる数値範囲に対して行い、対応するHVを特定する。なお、前述した（ａ）～（ｃ）の処理は、一次関数に近似できる程度に複数の数値範囲に対して行う。
　具体的には、例えば、４点の数値範囲（Height Median＝600, 6000, 60000, 600000の±10%の調整範囲）で、HVを取得する。
（ｅ）取得されたHeight MedianとHVとの対応関係から、図４及び５に示すように、Log HVとLog Height Medianを軸にしたプロットを行い、一次関数を求める。その際、Log Height Medianを加電圧係数「St」で定義する。そして、Stをｘ、Log HVをｙとし、ｙ＝ａｘ＋ｂにおけるａ及びｂを求める。
　具体的には、例えば、Height Medianが10,000（Log Height Medianが４）の時、Stを３と定義する。更に、Height Medianが１０倍増加すると、Stが１．０増えるように設定する。Stをｘ、Log HVをｙとすると、図４に示すように、ＰＭＴ_１では、ａ＝０．０８９８、ｂ＝４．１５５６となり、図５に示すように、ＰＭＴ_１より低感度であるＰＭＴ_２では、ａ＝０．０９２９、ｂ＝４．２９１１となる。
　ａ及びｂを求める方法の詳細の一例としては、例えば、以下の数式（１）～（５）を用いた方法等が挙げられる。
　まず、前回の測定時に特定されたHeight Median＝60,000の時のHV値に基づきHV1初期値を設定し、上記に記載した通りHeight Medianが数値範囲に含まれるようHVの調整を行う。そして、HV1とHeight Median1を取得する。
　次に、ａ１（例えば、前回の測定時に特定された所定の値）を使用し、下記数式（１）に基づき、Heightの調整目標値（以下、「Target」）2のHV2初期値を求め、そこからHVの調整を開始する。そして、HV2とHeight Median2を取得する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　下記数式（２）及び（３）に基づき、HV3とHeight Median3、HV4とHeight Median4も同様に取得する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　４点のHeight Median（Height Median1～4）より、下記数式（４）を用いて、St1～4を求める。なお、下記数式（４）では、Hst3は、Stが３．０の時のHeight Median値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　上記のようにして求めたSt1～4とHV1～4により、下記数式（５）から、更にａ及びｂを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　なお、上記数式は、以下の基礎式に基づいている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
※「加電圧係数を用いた測定時のHV値の設定」
　測定時は、加電圧係数Stを基に、記録されたStとHVとの対応関係を用いて、対応するHV値を設定する。具体的には、例えば、ユーザーが設定したSt値に基づき、記録された一次関数に照らしてHVを決定することができる。これにより、以下の通り、ＰＭＴ_１、ＰＭＴ_２で感度が異なる場合でも、同様の実験結果が得られるようにHVを設定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［精度向上の手段］
　先の内容では、加電圧係数とLog HVの関係に対して一次関数による近似を適用したが、更なる精度の向上は、近似関数の次数を上げることにより達成することができる。実際、HVの設定範囲やＰＭＴ自身の特性により、加電圧係数とLog HVは直線特性より僅かに逸脱している場合がある。この時、一次関数適用時では誤差があるが、三次関数適用時には精度が向上する。具体的には、例えば、図６に示すように、一次関数を適用した場合においては、左から二点目が直線性から逸脱しており、特に二点目付近での精度が下がっている。一方で、図７に示すように、三次関数を適用した場合においては、四点は近似曲線上にあり、精度が向上していることが分かる。
［複数のＰＭＴに対する感度標準化方法］
※「感度標準化のための加電圧係数・HV値の関係特定」
　１台のフローサイトメーターに複数のＰＭＴが備えられている場合、感度の比率を固定値で設定し、装置内の各ＰＭＴを標準化して、一つのHVで複数のＰＭＴのHVを制御することも可能である。
（ａ）例えば、１台のフローサイトメーターが４つのＰＭＴ（ＰＭＴ_Ａ～ＰＭＴ_Ｄ）を備えている場合について考える。その出力比率を、アラインチェックビーズで、ＰＭＴ_Ａ：ＰＭＴ_Ｂ：ＰＭＴ_Ｃ：ＰＭＴ_Ｄ＝１：２：３：４とし、かつ、Stが３．０の時のＰＭＴ_ＡのHeight Median値を10,000とすることを調整目標とする。その際に、以下の手順が考えられる。
（ｂ）前述した［装置間のＰＭＴに対する感度標準化方法］における（ａ）～（ｄ）を参考に、各ＰＭＴで４点、Height MedianとHVのデータを取得する。
（ｃ）取得されたHeight MedianとHVとの対応関係から、Log HVとLog Height Medianを軸にしたプロットを行い、一次関数を求める。その際、Log Height Medianを加電圧係数「St」で定義する。そして、Stをｘ、Log HVをｙとし、上述した調整目標（ＰＭＴ_Ａ：ＰＭＴ_Ｂ：ＰＭＴ_Ｃ：ＰＭＴ_Ｄ＝１：２：３：４であり、かつ、Stが３．０の時のＰＭＴ_ＡのHeight Median値が10,000）が成立する、ｙ＝ａｘ＋ｂにおけるａ及びｂを求める。
※「加電圧係数を用いた測定時のHV値の設定」
　測定時は、加電圧係数Stを基に、記録されたStとHVとの対応関係を用いて、対応するHV値を設定する。具体的には、例えば、ユーザーが設定したSt値に基づき、記録された一次関数に照らしてHVを決定することができる。これにより、装置内の各ＰＭＴで感度が異なる場合でも、一つのHVで複数のＰＭＴのHVを制御することができる。
　なお、上記二つの具体例では、Height Medianを用いて加電圧係数（St）を算出しているが、本技術では、Height Medianの代わりにArea Median（出力パルスの面積の中央値）を用いることも可能である。また、加電圧係数も所定の出力パルスの特徴量に対応するものであれば特に限定されず、任意の設定で算出することができる。更に、上記二つの具体例では、直線を求める際に４点でプロットしているが、本技術ではこれに限定されず、２点以上のプロットであればよい。
　また、本技術では、StとHVとの対応関係は、測定時のために一次直線を求めて記憶する方法だけでなく、対応表を記憶する方法であってもよい。更に、測定時のSt値の設定は、ユーザーによるものだけでなく、測定サンプル・条件等に基づき、情報処理部１２にて、St値を設定することも可能である。
　（３）光照射部１３
　本技術に係る微小粒子測定装置１は、蛍光基準粒子や微小粒子への光の照射を行う光照射部１３を更に備えることができる。光照射部１３から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が好ましい。具体的には、例えば、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム－ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、又は半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
　（４）分取部１４
　本技術に係る微小粒子測定装置１は、微小粒子の分取を行う分取部１４を更に備えることができる。例えば、分取部１４では、検出部１１により検出された値を情報処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて、微小粒子の分取が行われる。分取部１４では、該スペクトルデータから解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、微小粒子の分取を行うことができる。
　具体的には、例えば、図２に示すように、所定の振動数で振動する振動素子１４ａ等を用いて、流路Ｐの全体又は一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１４ａは特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子等を挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数等を調整することにより、液滴の大きさを調整し、微小粒子を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
　次に、情報処理部１２で補正して生成されたスペクトルデータに基づいて解析された微小粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラス又はマイナスの電荷を荷電する（図２中符号１４ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１４ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
　（５）記憶部１５
　本技術に係る微小粒子測定装置１では、HVと加電圧係数との関係（例えば、一次関数、対応表等）を記憶する記憶部１５を更に備えることができる。記憶部１５には、HVと加電圧係数との関係以外にも、検出部１１で検出された値、情報処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、各チャンネルの基準スペクトル、前回の測定で特定されたHVと加電圧係数との関係等の、測定に関わるあらゆる事項を記憶することも可能である。
　微小粒子測定装置１において、記憶部１５は必須ではなく、外部の記憶装置を接続してもよい。記憶部１５としては、例えば、ハードディスク等を用いることができる。
　（６）流路Ｐ
　本技術に係る微小粒子測定装置１では、流路Ｐを更に備えることができる。本技術に係る微小粒子測定装置１では、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。
　流路Ｐは、微小粒子測定装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップ等を微小粒子測定装置１に設置して解析又は分取を行うことも可能である。
　流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、図２に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路Ｐも、本技術に係る微小粒子測定装置１に用いることができる。
　また、流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、微小粒子測定装置１に用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る微小粒子測定装置１に好適に用いることができる。
　（７）表示部１６
　本技術に係る微小粒子測定装置１では、表示部１６を更に備えることができる。表示部１６では、検出部１１で検出された値、情報処理部１２にて生成されたスペクトルデータ、算出された加電圧係数、各チャンネルの基準スペクトル等の、測定に関わるあらゆる事項を表示することができる。
　微小粒子測定装置１において、表示部１６は必須ではなく、外部の表示装置を接続してもよい。表示部１６としては、例えば、ディスプレイやプリンタ等を用いることができる。
　（８）ユーザーインターフェース１７
　本技術に係る微小粒子測定装置１では、ユーザーが操作するための部位であるユーザーインターフェース１７を更に備えることができる。ユーザーは、ユーザーインターフェース１７を通じて、情報処理部１２にアクセスし、本技術に係る微小粒子測定装置１の各部を制御することができる。
　微小粒子測定装置１において、ユーザーインターフェース１７は必須ではなく、外部の操作装置を接続してもよい。ユーザーインターフェース１７としては、例えば、マウスやキーボード等を用いることができる。
＜２．情報処理装置１０＞
　図８は、本技術に係る情報処理装置１０の第１実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図であり、図９は、本技術に係る情報処理装置１０の第２実施形態を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る情報処理装置１０は、情報処理部１２を少なくとも有する。また、必要に応じて、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７等を備えていてもよい。以下、各部について、詳細に説明する。なお、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７は、前述した微小粒子測定装置１の表示部１６、及びユーザーインターフェース１７の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　（１）情報処理部１２
　情報処理部１２では、情報処理、並びに、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７等の制御が行われる。情報処理としては、所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する。本技術では、前記特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である。
　なお、情報処理部１２で行う情報処理の詳細や蛍光基準粒子の詳細は、前述した情報処理部１２で行う情報処理の方法や微小粒子測定装置１で用いる蛍光基準粒子と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　（２）記憶部１５
　本技術では、図８及び９に示すように、情報処理装置１０内に加電圧係数を記憶する記憶部１５を更に備えることができる。なお、記憶部１５は、前述した微小粒子測定装置１の記憶部１５の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　（３）その他
　本技術に係る情報処理装置１０は、図８及び９に示すように、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７を備えていてもよい。また、図９に示すように、情報処理装置１０と、フローサイトメーターの各部（検出部１１、光照射部１３、分取部１４等）とをネットワークを介して接続することも可能である。更に、図示しないが、情報処理装置１０の外部に、記憶部１５、表示部１６、及びユーザーインターフェース１７を備え、これらを、それぞれ、ネットワークを介して接続することも可能である。
＜３．情報処理方法＞
　本技術に係る情報処理方法は、情報処理工程を少なくとも行う方法である。情報処理工程で行う具体的な情報処理方法は、前述した情報処理装置１０の情報処理部１２で行われる情報処理方法と同一である。以下、本技術に係る情報処理方法を用いた微小粒子測定の流れの一例について、図１０及び１１を参照しながら説明する。なお、図１０及び１１に示すフローチャートの各ステップの処理は、例えば、前述した検出部１１、或いは情報処理部１２等によって行われる。
　図１０は、本技術に係る情報処理方法の一例を示すフローチャートであり、ＰＭＴの感度標準化のための加電圧係数（St）とHV値の関係特定に関するフローを示すものである。
　まず、ＰＭＴをHV1初期値に設定する（ステップS1）。次に、サンプル測定を行い（ステップS2）、Singletを示すサンプルの測定値を抽出する（ステップS3）。その後、Height Median1を算出する（ステップS4）。そして、ステップS5において、Height Median1の算出値がTarget1±10%でないと判断した場合、PMTのHV1値を変更し（ステップS6）、ステップS2に戻る。Height Median1の算出値がTarget1±10%に含まれるまでS2からS6のステップを繰り返し行い、Target1±10%であると判別した場合、Height Median1の算出値とHV1値を対応付けて記録する（ステップS7）。
　Height Median1の算出値とHV1値とを記録した後、PMTをHV2初期値に設定し（ステップS1）、S2からS6のステップをHeight Median2の算出値がTarget2±10%になるまで繰り返し行い、同様にHeight Median2の算出値とHV2値とを記録する（ステップS7）。以上の処理を一次関数に近似できる程度であるＮ個のHeightの数値範囲に対して実施し、Ｎ個のHeight Medianの算出値とHV値とを記録する（ステップS8）。記録されたＮ個の値群から一次関数ｙ＝ａｘ＋ｂを算出する。この際、ｘ＝「加電圧係数（St）」＝Log Height Medianとし、ｙ＝Log HVとする（ステップS9）。そして、その一次関数を記録し（ステップS10）、処理を終了する。
　図１１は、本技術に係る情報処理方法にて記録した一次関数を用いた微小粒子測定の一例を示すフローチャートであり、加電圧係数（St）の設定に基づくサンプル測定に関するフローを示すものである。
　まず、St値を設定する（ステップS11）。次に、記録された一次関数に基づきＰＭＴのHV値を設定する（ステップS12）。その後、サンプル測定を行い（ステップS13）、処理を終了する。
　なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部と、
　前記検出部により検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部と、
を備え、
　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、微小粒子測定装置。
（２）
　前記検出部は、複数のＰＭＴからなる、（１）に記載の微小粒子測定装置。
（３）
　前記複数のＰＭＴ間で出力差を有する、（２）に記載の微小粒子測定装置。
（４）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、（１）～（３）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（５）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、（１）～（４）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（６）
　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、（１）～（５）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（７）
　補正された前記制御信号が入力された前記検出部により、対象の微小粒子を測定する、（６）に記載の微小粒子測定装置。
（８）
　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部、
を備え、
　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理装置。
（９）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、（８）に記載の情報処理装置。
（１０）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、（８）又は（９）に記載の情報処理装置。
（１１）
　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、（８）～（１０）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１２）
　前記加電圧係数を記憶する記憶部、を更に備える、（８）～（１１）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１３）
　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理工程、
を行い、
　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理方法。
（１４）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、（１３）に記載の情報処理方法。
（１５）
　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、（１３）又は（１４）に記載の情報処理方法。
（１６）
　前記情報処理工程では、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、（１３）～（１５）のいずれかに記載の情報処理方法。
（１７）
　Ｎ個のHeight Medianの算出値とHV値とを記録し（ステップS8）、その記録されたＮ個の値群から三次関数ｙ＝ａｘ^3＋ｂｘ^2＋ｃｘ＋ｄを算出し、ＰＭＴのHV値を設定する（ステップS12）。
１　微小粒子測定装置
１１　検出部
１２　情報処理部
１３　光照射部
１４　分取部
１５　記憶部
Ｐ　流路
Ｔ　基板
１６　表示部
１７　ユーザーインターフェース
１０　情報処理装置

Claims (16)

  1. 　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部と、
    　前記検出部により検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部と、
    を備え、
    　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、微小粒子測定装置。
  2. 　前記検出部は、複数のＰＭＴからなる、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
  3. 　前記複数のＰＭＴ間で出力差を有する、請求項２に記載の微小粒子測定装置。
  4. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
  5. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
  6. 　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、請求項１に記載の微小粒子測定装置。
  7. 　補正された前記制御信号が入力された前記検出部により、対象の微小粒子を測定する、請求項６に記載の微小粒子測定装置。
  8. 　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理部、
    を備え、
    　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理装置。
  9. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、請求項８に記載の情報処理装置。
  10. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、請求項８に記載の情報処理装置。
  11. 　前記情報処理部は、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、請求項８に記載の情報処理装置。
  12. 　前記加電圧係数を記憶する記憶部、を更に備える、請求項８に記載の情報処理装置。
  13. 　所定の波長域幅の蛍光を発する蛍光基準粒子からの光を検出する検出部、で検出された出力パルスの特徴量と前記出力パルスの特徴量が検出された際の前記検出部の制御信号とを基にして、所定の出力パルスの特徴量に対応する加電圧係数と前記検出部の制御信号との関係を特定する情報処理工程、
    を行い、
    　前記出力パルスの特徴量は、前記検出部の制御信号に依存する値である、情報処理方法。
  14. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さ、又は出力パルスの面積である、請求項１３に記載の情報処理方法。
  15. 　前記出力パルスの特徴量は、出力パルスの高さである、請求項１３に記載の情報処理方法。
  16. 　前記情報処理工程では、前記加電圧係数を基にして、前記制御信号を補正する、請求項１３に記載の情報処理方法。
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