WO2011066684A1

WO2011066684A1 - 伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法

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Publication number: WO2011066684A1
Application number: PCT/CN2009/075298
Authority: WO
Inventors: 仝新勇; 雷国锋; 余成霞; 陈亮
Original assignee: 江苏恒瑞医药股份有限公司; 上海恒瑞医药有限公司
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2011-06-09
Also published as: KR101780915B1; PT2508170E; ZA201203316B; BR112012012151B8; EP2508170B1; ES2547698T3; BR112012012151B1; KR20120089754A; JP2013512262A; AU2009356132B2; RU2012123875A; US20120282325A1; KR20160140992A; CA2782911A1; CA2782911C; CY1116811T1; SMT201500245B; CN102271659B; AU2009356132A1; BR112012012151A2

Description

伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法技术领域

本发明涉及一种伊立替康或盐酸伊立替康脂质体及其制备方法，以及含有该脂质体的注射剂及其制备方法。背景技术

伊立替康是喜树碱的半合成衍生物。喜树碱可特异性地与拓扑异构酶 I结合，后者诱导可逆性单链断裂，从而使 DNA双链结构解旋；伊立替康及其活性代谢物 SN-38可与拓扑异构酶 I-DNA复合物结合，从而阻止断裂单链的再连接。现有研究提示，伊立替康的细胞毒作用归因于 DNA合成过程中，复制酶与拓扑异构酶 I-DNA-伊立替康（或 SN-38) 三联复合物相互作用，从而引起 DNA双链断裂。

盐酸伊立替康药理作用明显，临床疗效确切，在恶性肿瘤治疗中应用广泛，但是，它和其他喜树碱类药物一样，同样存在的一个问题就是，其结构中的饱和内酯环具有 pH依赖性，在生理条件下会可逆的转变为其羧酸盐形式，而使抗肿瘤活性减弱。盐酸伊立替康的现有市售制剂为盐酸伊立替康注射液及其冻干粉针制剂，临床上经静脉给药后，游离药物直接处在偏碱性的生理环境下，其结构中的内酯环易发生水解反应转变为羧酸盐形式，从而失去活性，间接的降低了药物的疗效。而且，制剂的毒副作用较大，主要表现为中性粒细胞减少和迟发性腹泻。

脂质体作为近年来研究较为广泛的一种药物载体，其主要特点是可以保护被包封药物，增加药物稳定性，改变药物在体内的分布行为，携载药物被动或主动靶向到病变部位。脂质体作为抗肿瘤药物的良好载体可有效的提高药物疗效，降低毒副作用。

国际申请 WO2005/117878 公开了伊立替康脂质体的处方和制备方法，该制剂中含有伊立替康或盐酸伊立替康、选自氢化大豆磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、心磷脂等磷脂、胆固醇。同样,中国专利申请 CN1994279A也公开了伊立替康脂质体的处方和制备方法，其中实施例 5的使用磷脂酰胆碱作为磷脂制备了脂质体。

虽然上述专利文献中记载的处方已经具有较好效果，但是如果制备成适合人体使用的制剂，该脂质体在稳定性、粒径等方面仍不能令人满意。发明内容

本发明的目的是提供一种载药量较高，且能同时满足包封率高，稳定性好、适合制备成制剂的伊立替康或盐酸伊立替康脂质体。

虽然目前一些文献（例如国际申请 WO2005/117878 和 CN1994279A)中记载了伊立替康的脂质体组成和制备方法，其中个别方案的部分指标较好。但针对稳定性、粒径等方面的控制并未提供任何信息。申请人经对脂质体进一歩研究，令人惊奇的发现当选择处方的辅料和用量关系符合某些条件时，特别胆固醇的用量对脂质体粒径和稳定性有一定的影响，在选择中性磷和胆固醇的基础上控制二者之间的比例，能够使脂质体的粒径变得小而均匀，并且提高了脂质体的稳定性。与其他处方相比，本申请脂质体的稳定性等指标明显提高。另外本发明与国际申请 WO2005/117878和 CN1994279A等技术相比，产品中不含碱性官能团化合物和阳离子脂质，处方组成简单，载药量高，稳定性好，本发明的脂质体有很好的抗肿瘤效果。

本发明的脂质体含有伊立替康或盐酸伊立替康、中性磷脂以及胆固醇，其中所述胆固醇与中性磷脂的重量比例为 1 : 3〜5，优选比例为 1： 3.5-4.5 , 最优选为 1 : 4。

本发明所使用的中性磷脂可选择氢化大豆卵磷脂（HSPC)、蛋黄磷脂（EPC )、大豆磷脂（SPC ) 等材料，特别是当中性磷脂使用氢化大豆卵磷脂时，其效果最好。当进一歩控制药物和磷脂之间的重量配比关系为下述关系时，脂质体的载药量极大地提高：

伊立替康或盐酸伊立替康 1份

中性磷脂 2〜5份，优选 2.5-4份。本发明的脂质体可根据本领域常规的脂质体制备方法制备得到，对于本发明的脂质体来说，优选使用离子梯度法制备。在使用离子梯度法时，所述脂质体内水相与外水相之间具有缓冲剂形成的离子梯度，优选所述脂质体内水相比外水相具有离子浓度高的离子梯度，这可提高贮存期间脂质体的粒径稳定，更好的维持药效，这能够控制脂质体平均粒径小而均匀，可使脂质体粒径在贮存期的变化减小到最低程度。

本发明通过在配方中加入亲水性高分子的脂质衍生物可使脂质体粒径在贮存期的变化减小到最低程度，同时聚乙二醇衍生物的加入可以延长脂质体在体内的循环时间。聚乙二醇衍生物选自聚乙二醇 2000- 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG_2QQQ)聚乙二醇 5000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇 2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇 5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。因此为了提高药物的长效性，本申请优选在脂质体中添加亲水性高分子的脂质衍生物，在该处方比例基础上，使用 DSPE-PEG₂₀₀₀是效果最明显的。优选脂质衍生物与伊立替康或盐酸伊立替康的重量比为 0.2〜0.4。

脂质体可进一歩含有带电荷磷脂，带电荷磷脂选自二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二油酸磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸中的一种或多种，且带电荷磷脂与中性磷脂的重量比例为 1 :5〜1 : 100。

本发明优选的脂质体含有以下重量配比的成分：

盐酸伊立替康 1份

氢化大豆卵磷脂 3.4-3.8份

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺 0.34-0.38份

胆固醇 0.8-0.95份，且胆固醇与氢化大豆卵磷脂的比例为 1 : 4。本申请还提供了伊立替康或盐酸伊立替康脂质体的制备方法，本发明的脂质体可选择通常的脂质体制备方法制备得到。本领域技术人员可根据本发明提供的脂质体的处方，选择各种方法制备得到。对于本发明的脂质体所选择的处方而言，优选的制备方法是离子梯度法。该制备方法包含下述歩骤：

1)通过下述 A至 D中任何一种方法制备空白脂质体： A、根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于无水乙醇或无水乙醇-叔丁醇混合溶剂中，与缓冲剂混合，减压除掉乙醇后得到空白脂质体粗品，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

B、根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于氯仿或氯仿 -甲醇混合溶剂，旋转蒸发形成脂质膜，加入缓冲剂水化得到空白脂质体粗品，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒

C、根据配方选用中性磷脂、胆固醇与缓冲剂混合，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

D、根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于无水乙醇或无水乙醇-叔丁醇混合溶剂中，与缓冲剂混合，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

2)脂质体膜内外水相离子梯度的产生：置换空白脂质体外水相，使脂质体内水相与外水相产生离子梯度；

3)含药脂质体制备：配制盐酸伊立替康水溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中，加热搅拌，孵育一定时间即得。

在歩骤 3 ) "含药脂质体制备"歩骤后，还可包含以下歩骤：

4)游离药物的去除及样品的浓縮:在盐酸伊立替康脂质体中加入缓冲介质，采用切向流装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至适当的体积。本申请还提供了含有上述脂质体的脂质体注射剂。在将脂质体制备成适合使用的注射剂时，添加稳定剂是有益的。本发明所使用的稳定剂也可选择通常使用的稳定剂，例如维生素 E、乙二胺四乙酸等，这些稳定剂都对制剂的稳定性有所帮助。对于上述处方而言，通过对稳定剂的研究发现乙二胺四乙酸或其盐相对于其他稳定剂效果最好，对于提高脂质体的稳定性最有好处，因此可选用乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钙盐中的一种或多种，且稳定剂的加入比例为 0%〜0.5 w/v %且下限不为 0%。

本发明的组合物中优选含有抗氧剂，所述抗氧剂可选自水溶性抗氧剂或油溶性抗氧剂，所述油溶性抗氧剂选自 α-生育酚、 α-生育酸琥珀酸酯、 α-醋酸生育酚或其混合物，所述水溶性抗氧剂选自抗坏血酸、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、 L-半胱氨酸或其混合物，抗氧剂的加入比例为 0%〜0.5 w/v %且下限不为 0 %。

注射剂可以是注射液或冻干粉针形式。制剂中可含有渗透压调节剂，所述渗透压调节剂选自葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、氯化钠、甘油、组氨酸及其盐酸化物、甘氨酸及其盐酸化物、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸或缬氨酸中的一种或多种，且渗透压调节剂的加入比例为 0%〜5 w/v %且下限不为 0%。

对于冻干粉形式的制剂来说，注射剂进一歩含有冻干保护剂，进行冷冻干燥后制得脂质体冻干粉针。冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐或乳糖中的一种或多种。

本发明优选的注射剂脂质体含有以下重量配比的成分：

盐酸伊立替康 1份

氢化大豆卵磷脂 3.4-3.8份

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺 0.34-0.38份

胆固醇 0.8-0.95份

乙二胺四乙酸二钠 0.05-0.09份，

上述注射剂的制备方法包含下述歩骤：

1)通过下述 A至 D中任何一种方法制备空白脂质体：

A、根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于无水乙醇或无水乙醇-叔丁醇混合溶剂中，与缓冲剂混合，减压除掉乙醇后得到空白脂质体粗品，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

在歩骤 3 ) "含药脂质体制备"歩骤后，还可包含以下歩骤： 4)游离药物的去除及样品的浓縮:在盐酸伊立替康脂质体中加入缓冲介质，采用切向流装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至适当的体积。

在得到脂质体后，还可通过调整脂质体药物浓度，定容，过滤除菌，灌封于小瓶中，得脂质体注射液；或者向脂质体药物样品中加入冻干保护剂，调整药物浓度，定容，过滤除菌，灌封于瓶中，冷冻干燥，得冻干粉针。

本发明的有益效果：

将盐酸伊立替康制成脂质体制剂，克服现有产品和技术的不足，将药物包裹于脂质体内水相中，提高药物稳定性，使药物在体内以内酯环的状态存在，能够长时间维持活性代谢物 SN-38在血浆中的浓度，以达到增加制剂疗效，降低药物的毒副作用。

本发明的伊立替康或盐酸伊立替康脂质体制剂通过控制特定的药物、磷脂和胆固醇的比例关系，可达到解决脂质体载药量低的问题，药脂比（w/w) 可达 0.25 以上，同时药物包封率可达 90%以上，优选的处方可达 95%以上；本发明通过进一歩选择胆固醇和磷脂的用量关系，制备的脂质体粒径较小，提高了脂质体的稳定性。本发明还通过对稳定剂的筛选，优选出加入一定比例的乙二胺四乙酸盐明显提高了脂质体的稳定性；脂质体的粒径在 10nm-220nm之间，分布均匀；性质稳定，伊立替康或盐酸伊立替康脂质体注射剂影响因素实验结果表明， 40°C度条件下放置 10天，粒径和包封率均无显著变化，各项指标符合要求；伊立替康或盐酸伊立替康脂质体注射剂与市售制剂相比，抑瘤率显著提高，毒性显著降低。附图说明

图 1 显示本发明伊立替康或盐酸伊立替康脂质体注射剂的粒径分布。

图 2显示本发明伊立替康或盐酸伊立替康脂质体注射剂的形态图。图 3 显示本发明伊立替康或盐酸伊立替康脂质体注射剂的体内抗肿瘤药效试验的结果。具体实施方式

下面实施例用于进一歩说明本发明，但本发明并不仅限于此实施例。

实施例 1

处方

制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂（HSPC)、胆固醇（CHOL )溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸铵溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 1000bar均质 5次循环，之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径（挤出器铺 2张 Ο. ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。之后加入配制好的 DSPE-PEG O水溶液，搅拌孵育 20分钟。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。

用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，按照盐酸伊立替康与 HSPC 的重量比例为 1 :3.5加入到上述具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入 0.45g氯化钠调节渗透压。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。

HSPC: CHOL 制备方法平均粒径

均质后 138.7

6： 1

Ο. ΐμηι挤出 5次 92.26

均质后 136.2

5： 1

Ο. ΐμηι挤出 5次 89.5

均质后 123.4

4： 1

Ο. ΐμηι挤出 5次 87.26

均质后 145,1

3： 1

Ο. ΐμηι挤出 5次 Q '¾ 4

均质后 142

2.5：： 1

Ο. ΐμηι挤出 5次 98.56 制备的各处方粒径变化如下表所示，结果表明，磷脂与胆固醇重量比为 4: 1时样品粒径最小。

将不同磷脂与胆固醇重量比制备的样品在 25°C条件下放置，考察稳定性。结果如下表， 25°C条件下放置 60天，磷脂与胆固醇重量比为 4:1样品粒径及包封率无明显变化，其它比例的样品粒径增大，包封率也有所下降，可见，磷脂与胆固醇重量比为 4:1的样品稳定性较好。粒径

HSPC/ 放置时间外观电位冷兽

口里心水溶血

EN% (z-v)

CHOL (25 °C，天）性状 (mv) (mg/ml) 质⁰ /₀ 磷脂 nm

类白色

0 98.86 92.3 -30.5 5.05 0.58 0.39 混悬液

类白色

6： 1 30 98.56 94.3 -26.8 5.04 0.75 0.56 混悬液

类白色

60 98.20 95.9 -24.9 5.06 0.85 0.66 混悬液

类白色

0 99.37 87.3 -32.1 5.10 0.55 0.40 混悬液

4： 1 类白色

30 99.25 87.5 -30.9 5.11 0.64 0.50 混悬液

60 类白色 99.18 87.8 -28.6 5.09 0.70 0.62 混悬液

类白色

0 99.27 98.5 -35.8 5.12 0.60 0.38 混悬液

类白色

.5 1 30 98.75 100.2 -28.6 5.09 0.73 0.51 混悬液

类白色

60 98.19 101.7 -25.3 5.07 0.84 0.67 混悬液结论：综合各项指标，结果证明胆固醇与磷脂之间的比例控制在 1 : 3〜5可达到比较好的使用效果，最佳配比为 1 : 4。实施例 2

处方

盐酸伊立替康 0.28g

氢化大豆卵磷脂（HSPC) lg

醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺

O.lg

(DSPE-PEG

胆固醇 0.25g

硫酸铵 5g

乙二胺四乙酸二钠 0.02g

氯化钠 0.45g

注射用水加至所需体积制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸铵溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 lOOObar均质 5次循环，之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径（挤出器铺 2张 Ο.ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。之后加入配制好的 DSPE-PEG_2QQQ水溶液，搅拌孵育 20分钟。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。

用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，按照盐酸伊立替康与 HSPC 的重量比例为 1:3.5加入到上述具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入 0.45g氯化钠调节实施例 3

空白脂质体处方及制备方法与实施例 2相同，不同的是按照盐酸伊立替康与 HSPC的重量比例分别为为 1:1.5、 1:2、 1:3.5、 1:4及 1:5 进行制备脂质体，盐酸伊立替康脂质体样品包封率及粒径见下表。

CPT11/HSPC 包封率（％) 载药量（mg/ml) 粒径 (nm)

1:1.5 83.2 5.11 87.1

1:2 90.8 5.15 86.5

1:3.5 99.4 5.08 85.9

1:4 99.1 4.81 85.4

1:5 99.4 4.25 86.7 结果说明，当盐酸伊立替康与 HSPC的比例为 1:1.5时包封率显著降低，而当其比例为 1:5时载药量下降明显，不适合制备成临床应用的制剂，当其比例在 1:2与 1:4之间时包封率及载药量均较高。实施例 4

按照实施例 2中处方组份的用量来制备空白脂质体及载药脂质体，制备方法同实施例 2 所述方法，所不同的是分别采用高纯蛋黄磷脂 (EPC)、高纯大豆磷脂（SPC) 替换处方中的 HSPC来制备。将制备的脂质体样品置于 25°C条件下考察稳定性。结果见下表。试验结果表明，采用 HSPC制备的脂质体样品稳定性最好， 25°C条件下放置 2个月主要指标无明显变化。时间 PC组成包封率（％) 载药量（mg/ml) 粒径 (nm)

HSPC 99.4 5.08 85.9

0M EPC 99.5 5.10 87.5

SPC 99.2 5.01 86.9

HSPC 99.5 5.10 85.5

1M EPC 92.4 5.07 88.2

SPC 93.9 5.05 87.3 HSPC 98.7 5.07 86.5

2M EPC 85.8 5.06 93.2

SPC 89.6 5.02 91.5

、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、实施例 5

处方

盐酸伊立替康 0.28g

氢化大豆卵磷脂（HSPC) lg

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺

O.lg

(DSPE-PEG誦）

胆固醇 0.25g

生理盐水溶液 50ml

注射用水加至所需体积制备方法 <1> ：

乙醇注入法：将处方量的氢化大豆卵磷脂、 DSPE-PEG_2QQQ、胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，注入到盐酸伊立替康的生理盐水溶液中，减压除掉乙醇得到脂质体粗品。之后采用高压均质机 lOOObar 均质 5次循环，之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径（挤出器铺 2 张 Ο.ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。

制备方法 <2>：

薄膜分散法：将处方量的氢化大豆卵磷脂、 DSPE-PEG_2QQQ、胆固醇溶于适量氯仿得脂质溶液，将脂质溶液旋转蒸发成膜，除尽氯仿然后加入盐酸伊立替康的生理盐水溶液水化孵育约 lh。之后采用高压均质机 1 OOObar均质 5次循环，再通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径 (挤出器铺 2张 Ο.ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη 滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。

测定制备方法 <1>、 <2>以及实施例 2制备的盐酸伊立替康脂质体包封率及粒径。实施例 2 99.4 85.9 制备方法 <1> 15.3 87.9

制备方法 <2> 17.8 90.2 结果表明，采用被动载药法如乙醇注入法及薄膜蒸发法制备盐酸伊立替康脂质体时，可以制备出目的产品。但其样品包封率较低，大部分药物都没有进入到脂质体中；而采用主动载药法制备的样品（实施例 2) 包封率高，载药量高，粒径小而均匀，所以采用主动载药法。本发明中即采用离子梯度法制备盐酸伊立替康脂质体有非常好的效果。

实施例 6 处方处方 1 处方 2 处方 3 处方 4

HSPC i g i g i g i g 胆固醇 250 mg 250 mg 250 mg 250 mg

PEG誦 -DSPE o. i g 0.1 g 0.1 g 0.1 g 维生素 E 1 0.02 g 1 0.02 g

EDTA-2Na 1 1 0.02 g 0.02 g 硫酸铵溶液（300mM) 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 盐酸伊立替康 0.3 g 0.3 g 0.3 g 0.3 g 制备方法：

空白脂质体：将脂质乙醇注入。均质 1000bar， 6次； 200nm挤出 3次， 100 nm挤出 5次；力口入 PEG₂₀₀₀-DSPE， 60°C赋予 30 min。切向流透析 3次，每次加入 50 ml。其中 VE加在磷脂有机溶剂中， EDTA 加在硫酸铵溶液中。

载药脂质体：配制约 10mg/ml的盐酸伊立替康水溶液，加入空白脂质体中， 60°C赋予 15 min。用切向流浓縮样品至约 50ml，即为 5mg/ml 样品。

稳定性结果见下表，可见，单独加入乙二胺四乙酸二钠样品各项指标无显著变化，能显著提高了脂质体的稳定性，而其它稳定剂对脂质体的稳定性没有明显改善。

实施例 7

处方 ( 1 )

盐酸伊立替康 0.5g 氢化大豆卵磷脂 1.5g

胆固醇 0.4g

硫酸锰 10g

甘露醇 2-5g

注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸锰溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径（挤出器铺 2张 Ο. ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 50°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入 2.5g甘露醇调节渗透压。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。经过纳米粒度测定仪测得脂质体粒度为 89.3nm 包封率为 97.5% 处方 (2)

盐酸伊立替康 lg

氢化蛋黄卵磷脂（HEPC) 3.45g

胆固醇 0.8g 硫酸镁 10g 组氨酸 2-5g 注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的氢化蛋黄卵磷脂、胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸镁溶液混合。之后通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径（挤出器铺 2张 Ο.ΐμιη挤出膜，挤出 5次）。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 50°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入 2.5g 组氨酸调节渗透压。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。经过纳米粒度测定仪测得脂质体粒度为 87.6nm，包封率为 98.1%。处方 (3 )

盐酸伊立替康 0.3g 氢化大豆卵磷脂（HSPC) lg

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙

0.05g

醇胺（DSPE-PEG₂₀₀₀)

胆固醇 0.25g

硫酸铵 5g 氯化钠 0.45g

注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸铵溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 lOOObar均质 5 次循环后，之后加入配制好的 DSPE-PEG_2QQQ水溶液，搅拌孵育 20分钟。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充注射用水，即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入 0.45g氯化钠调节渗透压。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。经过纳米粒度测定仪测得脂质体粒度为 87.3nm，包封率为 99.2%。实施例 8

处方

盐酸伊立替康 0.5g 氢化大豆卵磷脂（HSPC) ig

心肌磷脂（CL) 0.5g

聚乙二醇 5000-二硬酯酰磷脂酰乙醇

0.5g

胺（DSPE-PEG

α-生育酚 0.05g 胆固醇 0.35g

柠檬酸 5.76g

氯化钠约 3.6g

注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂、心肌磷脂、 DSPE-PEG_5QQQ、胆固醇、 α-生育酚溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml柠檬酸溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 lOOObar, 均质 5次。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充 0.9% 氯化钠溶液 400ml，即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。经过纳米粒度测定仪测得脂质体粒度为 85.8nm，包封率为 98.6%。实施例 9 盐酸伊立替康 0.8g

棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC) 2g

棕榈酰磷脂酰甘油 (DPPG) 0.2g

胆固醇 0.5g

抗坏血酸 0.05g

乙二胺四乙酸二钠 0.05g

硫酸铵 5g

氯化钠约 3.6g

注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的 DPPC、 DPPG,胆固醇溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸铵溶液（含乙二胺四乙酸二钠）混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 1000bar，均质 5次。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充 0.9%氯化钠溶液 400ml, 即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入抗坏血酸。调整药物浓度，定容， 0.22 μιη滤膜过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射剂。经过纳米粒度测定仪测得脂质体粒度为 89.4nm，包封率为 97.2%。实施例 10

处方

盐酸伊立替康 0.5g

氢化大豆卵磷脂（HSPC ) ig

聚乙二醇 5000-二硬酯酰磷脂酰乙

o.ig

醇胺（DSPE-PEG₂₀₀₀)

α-生育酚 0.05g

胆固醇 0.3g

硫酸铵 5g

氯化钠约 3.6g

蔗糖 2g 甘露醇 lg

注射用水加至所需体积

制备方法：

将处方量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇、 α-生育酚溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与 100ml硫酸铵溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品。之后采用高压均质机 1000bar，均质 5次，再通过挤出设备挤出脂质体（挤出器铺 5张 lOOnm挤出膜，挤出 5次），之后加入配制好的 DSPE-PEG_5QQQ水溶液，搅拌孵育 20分钟。采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充 0.9%氯化钠溶液 400ml，即得空白脂质体。用注射用水配制盐酸伊立替康溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中， 60°C加热搅拌，孵育 20分钟即得载药脂质体。采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至约 50ml，加入蔗糖和甘露醇使混合均匀。调整药物浓度，定容， 0.22 μηι滤膜过滤除菌，罐装于西林瓶中，冷冻干燥，即得盐酸伊立替康脂质体冻干粉针。将脂质体冻干粉针水化后测定脂质体粒度为 90.8nm，包封率为 97.5%。试验例 1

根据本发明制得的成品（按实施例 2 ) 的理化特征：

【粒径分布】取本品适量，以水稀释后用动态光散射法进行测定。测定波长 λ=633ηιη，测定角度 173°，温度 25°C。粒径大小以强度径 (Intensity) 数据表示。粒径分布图见图 1，平均粒径为 85.9nm。

【形态学考察】吸取脂质体样品适量，将铜网置于干净滤纸上，向铜网上滴加样品，用 2%磷钨酸染色，待干燥后在 JEM2010透射电镜 (日本电子株式会社）下观察本品。形态图见图 2。经透射电镜观察，伊立替康脂质体形态均为典型的双分子层结构，粒径大部分在 200 nm 以下，与动态光散射法测定的结果相吻合。

【包封率测定】药物含量测定方法：色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6χ 150ηιηι,5μηι) ; 流动相：乙腈 - 0.05Μ磷酸二氢钾缓冲液（ρΗ 4，含 1%三乙胺） = 20:80; 柱温： 40°C ·' 进样体积： 20 μ∑·, 流速： 1.0mL/min。包封率测定方法：吸取 lmL样品溶液至 10mL量瓶中，加入水稀释至刻度，摇匀，置 8010型超滤器（MILLIPORE公司）超滤，弃去初滤液，取续滤液为供试品溶液。分别吸取供试品溶液、对照品溶液 20μΙ注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算制剂游离药物含量，记为 W; 另按含量测定项下方法计算本品的药物总含量，记为 W_Q。按下式计算样品的包封率。

w - w

包封率 = ^w° ^W x lOO%

w₀

测定结果：本品包封率为 99.4。

【影响因素试验】取本品置于不同条件下进行影响因素考察，结果如下表所示：

结果表明，样品对光照敏感，经过强光照射样品外观变黄，含量下降，有关物质明显增大；样品在高温 40°C时包封率和粒径无明显变化，但有关物质略增大；低温和冷冻循环试验表明样品产生大粒子。综合考虑磷脂在高温状态下的不稳定性，结合影响因素试验结果，本品应低温避光贮存。

【体内抗肿瘤药效试验】

药物名称：按实施例 2制备的盐酸伊立替康脂质体（CPT-11脂质体）由上海恒瑞医药有限公司提供，盐酸伊立替康注射液（CPT-11 , 江苏恒瑞医药股份有限公司提供）

配制方法：均用生理盐水配成所需浓度。

实验动物： BALB/cA-nude裸小鼠， 6-7周， $，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。合格证号： SCXK (沪） 2007— 0005。饲养环境： SPF级。

试验方法：裸小鼠皮下接种人结肠癌 Ls-174t细胞，待肿瘤生长至 150-300mm³后，将动物随机分组 ((10：)。给药剂量和给药方案见下表。每周测 2— 3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积（V) 计算公式为：

_V= l/2x_axb² 其中 a、 b分别表示长、宽。

体积簡 ϊ ) 体积(1議3) RTV

Veliicle DO, 5 IV 219.S ± 37.2 2013.7 303.1 ± 2.3

CPT-i l廳质偉 Ltoig kg DO, 3 W 212.2. ± 42.1 732..Z 162.6 ±： 0.7

CPT-U撤质体 3i mg/kg DO, 3 IV 205.0 ± 49.0 265..! 122.9 ± 0.4

CPT-I i I ffig¾ DO, 3 IV 204.6 ± 44.7 844, 197.5 ± 0.9 c!O: 第一'次给药 UT ¹瘤体积; P value指与对照相比。实验结果：

CPT-11脂质体及 CPT-11均明显抑制人结肠癌 Ls-174t裸小鼠移植瘤的生长， CPT-1 明显的剂量依赖性，高剂量（3mg/kg) 给药时，有 4/14个肿瘤部分消退，低剂量（lmg 10mg/kg给药时相当，提示 CPT-11脂质体的疗效有可能比其注射液至少提高 10倍，具

4325

Claims

权利要求书-

1、一种伊立替康或盐酸伊立替康脂质体，其特征在于所述脂质体含有伊立替康或盐酸伊立替康、中性磷脂以及胆固醇，其中所述胆固醇与中性磷脂的重量比例为 1 : 3〜5。

2、根据权利要求 1所述的脂质体，其特征在于所述中性磷脂和伊立替康或盐酸伊立替康符合以下重量配比：

伊立替康或盐酸伊立替康 1份

中性磷脂 2〜5份，优选 2.5-4份。

3、根据权利要求 1所述的脂质体，其特征在于所述中性磷脂含有氢化大豆卵磷脂。

4、根据权利要求 3所述的脂质体，其特征在于所述中性磷脂是氢化大豆卵磷脂。

5、根据前述任意一项权利要求所述的脂质体，其特征在于所述胆固醇与中性磷脂的比例为 1 : 3.5-4.5 , 最优选为 1 : 4。

6、根据前述任意一项权利要求所述的脂质体，其特征在于在所述脂质体通过离子梯度法制备得到。

7、根据权利要求 6所述的脂质体，其特征在于在所述脂质体内水相与外水相之间具有缓冲剂形成的离子梯度，优选所述脂质体内水相比外水相具有离子浓度高的离子梯度。

8、根据前述任意一项权利要求所述的脂质体，其特征在于所述脂质体还含有亲水性高分子的脂质衍生物，优选是 DSPE-PEG_2QQQ。

9、根据权利要求 8所述的脂质体，其特征在于所述亲水性高分子的脂质衍生物与伊立替康或盐酸伊立替康的重量比为 0.2〜0.4。

10、根据前述任意一项权利要求所述的脂质体，其特征在于所述脂质体进一歩含有带电荷磷脂，所述带电荷磷脂选自二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二油酸磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸中的一种或多种，且带电荷磷脂与中性磷脂的重量比例为 1 :5〜1 : 100。

11、根据权利要求 1 所述的脂质体，其特征在于所述脂质体含有以下重量配比的成分：

盐酸伊立替康 1份

氢化大豆卵磷脂 3.4-3.8份

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺 0.34-0.38份

胆固醇 0.8-0.95份，且胆固醇与氢化大豆卵磷脂的比例为 1 : 4。

12、权利要求 1-11任意一项所述脂质体的制备方法，其特征在于该制备方法包含下述歩骤：

1)通过下述 A至 D中任何一种方法制备空白脂质体：

A.根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于无水乙醇或无水乙醇 -叔丁醇混合溶剂中，与缓冲剂混合，减压除掉乙醇后得到空白脂质体粗品，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

B.根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于氯仿或氯仿-甲醇混合溶剂，旋转蒸发形成脂质膜，加入缓冲剂水化得到空白脂质体粗品，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

C.根据配方选用中性磷脂、胆固醇与缓冲剂混合，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

D.根据配方选用中性磷脂、胆固醇溶于无水乙醇或无水乙醇 -叔丁醇混合溶剂中，与缓冲剂混合，之后采用高压均质机或 /和挤压设备制备空白脂质体至所需的粒度；

2)脂质体膜内外水相离子梯度的产生：置换空白脂质体外水相，使脂质体内水相与外水相产生离子梯度； 3)含药脂质体制备：配制盐酸伊立替康水溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体分散液中，加热搅拌，孵育，即得。

13、根据权利要求 12所述的制备方法，其特征在于在 3 ) 含药脂质体制备歩骤后，还包含以下歩骤：

4)游离药物的去除及样品的浓縮:在盐酸伊立替康脂质体中加入缓冲介质，采用切向流装置除去未包封的药物，同时将样品浓縮至适当的体积。

14、根据权利要求 12-13任意一项所述的制备方法，其特征在于所述缓冲剂选自含有 Na⁺、 K⁺、 Fe²⁺、 Ca²⁺、 Ba²⁺、 Mn²⁺、 Mg²⁺、 Li⁺、 NH₄ ⁺ 或 H⁺离子盐的一种或多种。

15、含有权利要求 1-11任意一项所述伊立替康或盐酸伊立替康脂质体的脂质体注射剂。

16、根据权利要求 15所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂含有稳定剂，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钙盐中的一种或多种，稳定剂的加入比例为 0%〜0.5 w/v %且下限不为 0%，优选是乙二胺四乙酸二钠。

17、根据权利要求 15所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂是注射液或冻干粉针。

18、根据权利要求 15所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂含有渗透压调节剂，所述渗透压调节剂选自葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、氯化钠、甘油、组氨酸及其盐酸化物、甘氨酸及其盐酸化物、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸或缬氨酸中的一种或多种，渗透压调节剂的加入比例为 0%〜5 w/v %且下限不为 0%。

19、根据权利要求 15所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂进一歩含有抗氧剂，所述抗氧剂选自水溶性抗氧剂或油溶性抗氧剂，所述油溶性抗氧剂选自 α-生育酚、 α-生育酸琥珀酸酯、 α-醋酸生育酚或其混合物，所述水溶性抗氧剂选自抗坏血酸、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、 L-半胱氨酸或其混合物，抗氧剂的加入比例为 0%〜0.5 w/v %且下限不为 0%。

20、根据权利要求 17所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂是冻干粉针，其中含有冻干保护剂，是通过冷冻干燥制得的脂质体冻干粉针。

21、根据权利要求 15所述的脂质体注射剂，其特征在于所述注射剂脂质体含有以下重量配比的成分：：

盐酸伊立替康 1份

氢化大豆卵磷脂 3.4-3.8份

聚乙二醇 2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺 0.34-0.38份

胆固醇 0.8-0.95份

乙二胺四乙酸二钠 0.05-0.09份，且胆固醇与氢化大豆卵磷脂的比例为 1 : 4。

22、权利要求 15-21任意一项所述脂质体注射剂的制备工艺，其特征在于所述工艺包括权利要求 12-13任意一项的制备方法。

23、根据权利要求 22的制备工艺，其特征在于所述工艺还包括：定容、除菌、分装：调整脂质体药物浓度，定容，过滤除菌，灌封于小瓶中，得脂质体注射液；或者

向脂质体药物样品中加入冻干保护剂，调整药物浓度，定容，过滤除菌，灌封于瓶中，冷冻干燥，得冻干粉针。