WO2008075718A1

WO2008075718A1 - 蛍光発生分子

Info

Publication number: WO2008075718A1
Application number: PCT/JP2007/074424
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Abe; Yoshihiro Ito; Jin Wang; Kazuhiro Furukawa
Original assignee: Riken
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2008-06-26
Also published as: US8426127B2; JPWO2008075718A1; JP5360647B2; EP2103616A4; US20100190159A1; EP2103616A1

Abstract

　本発明の目的は、安定性が高く、かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することを可能とする、遺伝子解析用の蛍光on/off型蛍光化合物を提供することである。本発明によれば、下記式（１）又は（２）で示される化合物が提供される。【化１】（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基、アミノ基、保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）

Description

明細書

蛍光発生分子

技術分野

[0001] 本発明は、核酸などの生体関連物質を検出するための標識試薬として有用な蛍光発生分子に関する。より詳細には、本発明は、アジド基を有する無蛍光性分子であつて、該アジド基がアミノ基に還元されると蛍光を発生することを特徴とする分子に関する。さらに本発明は、上記の蛍光発生分子を含む標識試薬、及び上記の蛍光発生分子を用いた標的核酸配列の検出方法に関する。

背景技術

[0002] 特定の標的核酸配列を有する核酸分子を検出するための方法としては、その標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いるハイブリダィゼーシヨン法が広く使用されている。ノ、イブリダィゼーシヨン法では、標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用意し、そのプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を持つ試料のみが高レ、選択性でハイブリダィズする。ハイブリダィゼーシヨンの結果として形成されるハイブリッド体を検出するための手段としては、プローブ核酸をラジオァイソトープで標識する方法、蛍光物質で標識する方法、発光試薬を利用する方法などが挙げられる。核酸の標識に使用することができる蛍光物質としては、フルォレセィン、テトラメチルローダミン、 Cy3、 Cy5等が挙げられる力 S、これらの蛍光物質で標識した蛍光核酸プローブは、バックグラウンド蛍光シグナルが高ぐ高感度測定が困難であった。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安定性が高く（即ち、長期間において活性である）、かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することを可能とする、遺伝子解析用の蛍光 on/oft型蛍光化合物 (蛍光発生分子システム）を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記の蛍光 οη/οίϊ型蛍光化合物を用いた生体関連物質を検出するための標識試薬を提供することを解決すべき課題とした。

課題を解決するための手段

[0004] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ローダミン骨格などの蛍光物質骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子であって、該アジド基がアミノ基に還元されると蛍光を発生することを特徴とする分子を合成することに成功した。さらに、上記の無蛍光性分子で標識した第一の核酸プローブと、還元作用を有する分子で標識した第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダィズさせることによって、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基をァミノ基に還元し、これにより生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

[0005] 即ち、本発明によれば、下記式（1)又は（2)で示される化合物が提供される。

[化 1]

(式中、 Rは炭素数 1から 6のアルキル基、アミノ基、保護基若しくは置換基を有して

1

いてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、 Rはそれぞれ独立に炭素数 1から 6のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、 R³は炭素数 1から 6のアルキル基、ァリール基、又は水素原子を示し、 R⁴は酸素原子を含む基または水素原子を示し、 R³と R⁴は結合して環を形成していてもよい。 )

[0006] 好ましくは、本発明によれば、下記式（1A)又は（2A)で示される化合物が提供され [化 2]

(式中、 R1は、アミノ基、又は保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基を示す。）

[0007] 本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬が提供される。

本発明の標識試薬は、好ましくは、核酸の標識のために用いるものであり、好ましくは、還元剤と組み合わせて使用されるものである。

[0008] 本発明によればさらに、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、ローダミン骨格、クマリン骨格、ェチジゥムブ口ミド由来骨格、アタリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダィズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法が提供される。

[0009] 好ましくは、上記無蛍光性分子として、ローダミン骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子を使用する。

好ましくは、上記無蛍光性分子として、上記した本発明の化合物を用いる。好ましくは、標的核酸配列は RNAである。

好ましくは、標的核酸配列の一塩基多型を検出する。

[0010] 本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を用いて生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をァミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出することを含む、生体分子の分析方法が提供される。

好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識する。好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をァミノ基に還元させることにより生成する蛍光をフローサイトメトリーで検出する。

発明の効果

[0011] 本発明によれば、アジド基の還元反応をトリガーとする蛍光発生分子システムが提供される。さらに本発明によれば、この蛍光発生分子システムを応用して、生体関連物質を検出するための標識試薬が提供される。本発明の標識試薬は、標的 DNAあるいは、 RNA分子に結合して、還元されることにより蛍光を発すること力 Sできるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル 'バックグラウンド比を持っため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便'安価であり、試験管内のみではなぐ細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。発明を実施するための最良の形態

[0012] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明で開発した蛍光発生分子システムは、アジド基の還元をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光 off/on型センサーシステムとして一般化できる（図 1)。本発明の実施例として、蛍光分子ローダミンを化学修飾し、アジド基を導入した分子を合成した（図 2)。ローダミン 110を、モノ BOC化した。つづいて、亜硝酸イソァミルで処理することにより、アミノ基をジァゾ化し、ナトリウムアジドを加えることによりアジド体を得た。さらに、 4M 塩酸 -ジォキサン溶液で処理することにより、 BOC基を除去した。最後に、アミノ基をプロモアセチル化することにより、目的物であるローダミンのアジド誘導体（図 2の化合物 4)を得た。 [0013] このローダミンのアジド誘導体（図 2の化合物 4)の蛍光特性を解析した。アジド誘導体（図 2の化合物 4)は、無蛍光性であった。次に、 4をメタノール溶液中、還元剤である TCEP (リン化合物）（トリス [2—カルボキシェチル]ホスフィン）で処理したところ、アジド基はァミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約 2000倍蛍光強度が増加した（図 3)。本蛍光発生分子システムは、有機リン化合物の検出に有用である。

[0014] さらに、上記で合成した蛍光発生分子システムであるローダミン誘導体（図 2の化合物 4)を核酸鎖に導入して、遺伝子検出用化学反応プローブを開発した。本発明で開発した 2つの DNAプローブ（即ち、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブ）は、標的 DNAあるいは RNA上に標的配列特異的に結合し、化学反応 (還元反応）し、初めて高レ、強度の蛍光を発する（図 4)。

[0015] この蛍光シグナルの有無や強度を指標にすることによって、核酸配列を区別又は検出すること力 Sできる。本反応は、他の試薬や酵素を必要とせず、プローブを検出サンプルに加えるのみで測定できる。さらに、本検出反応は等温条件下、反応サイクルが回転し、蛍光シグナルを増幅することができる（図 5)。そのため、微量サンプルの測定が可能となる。細胞内あるいは、生体内においても、本プローブを用いて遺伝子発現の観測が可能になる。

[0016] さらに、本明細書の実施例では、本発明のプローブを用いて、ヒト ras遺伝子配列の検出実験を行った。標的 DNA配列および合成したプローブを図 6に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しな!、条件でも蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、化学反応プローブは、標的配列が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加は全く観察されな力た。そのため、本化学反応プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった（図 6)。

[0017] 本発明の化合物（蛍光発生分子）は、下記式（1)又は（2)で示される化合物である

〇

[化 3]

1

いてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、 Rはそれぞれ独立に炭素数 1から 6のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、 Rは炭素数 1から 6の

3

アルキル基、ァリール基、又は水素原子を示し、 Rは酸素原子を含む基または水素

4

原子を示し、 R³と R⁴は結合して環を形成していてもよい。 )

好ましくは、本発明の化合物は下記式（1A)又は（2A)で示される化合物である。

本発明において、炭素数 1から 6のアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよぐメチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はへキシル基を挙げること力 Sでさる。

[0020] 本発明において、アミド基は、保護基若しくは置換基を有していてもよい。保護基として、 t-ブトキシカルボニル基などのウレタン系保護基、ベンゾィル基などのァシル系保護基、トリチル基などのアルキル系保護基、ジメチルァセタールなどのイミン系保護基などがあげられる。置換基としては、核酸と反応して結合できる反応性基が好ましく、例えば、ハロゲン原子などを挙げることができる。なお、置換基とアミド基は連結基（例えば、メチレン基などのアルキレン基）を介して結合していてもよい。

[0021] 本発明において、ハロゲン原子のとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることカでさる。

本発明において、ァリール基としては、フエニル基、又はナフチル基を挙げることができる。

本発明において、酸素原子を含む基としては、—O—、又は OCO などを挙げること力 Sでさる。

[0022] 本発明によれば、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、ローダミン骨格、クマリン骨格、ェチジゥムブロミド由来骨格、アタリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダィズさせ、これにより第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がァミノ基に還元させ、生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出すること力 Sでさる。

[0023] ローダミン骨格、クマリン骨格、ェチジゥムブロミド由来骨格、アタリジン骨格、及びダンシル骨格の具体的構造を以下に示す。

[0024] [化 5] ローダミン骨格

Ri= alkyl, amide, halogen; f¾= alkyi, halogen; ₃=alky!; R₄=functional group including oxygen -ダミン骨格

i= al halogen; (¾= aikyl, halogen; alkyl; R₄= functional group including oxygen クマ

ェチジゥムプロミド由来の骨格

R₂= alkyi, halogen; R₄- aikyl, alchol, amine

本発明で用いる第一の核酸プローブは、上記した骨格を有し、かつ分子内ド基を有する無蛍光性分子で標識されて!/、る。

[0026] 本発明で用いる第二の核酸プローブは、還元作用を有する分子で標識されている。本発明で用いることができる還元作用を示す分子として、硫黄化合物や三価のリン化合物などがあげられる。硫黄化合物としては、 DTT (ジチオスレィトール）、三価のリン化合物としては、トリフエニルフォスフィン、アルキルフォスフィンなどをあげることができる。

[0027] 本発明にお!/、て、第一の核酸プローブは、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有し、第二の核酸プローブは、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する。ここで、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記の両プローブが標的核酸配列にハイブリダィズした際に、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基が、第二の核酸プローブ中の還元作用を有する分子の作用によりアミノ基に還元されるという条件を満たす限りは、任意に設定すること力 Sできる。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記条件を満たすためには、隣接または近接していることが一般的には好ましい。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、例えば、 1から 10塩基程度のスペースを介して近接してレ、ること力 S好ましレ、。

[0028] 式（1)又は（2)、若しくは式（1A)又は（2A)で示される蛍光発生分子を光（例えば、約 350nmの紫外光）で照射すると、アジドがァミンに還元され、蛍光を発する。即ち、式（1)又は（2)、若しくは式（1A)又は（2A)で示される化合物は、光照射前は、蛍光はないが、光照射後、 490匪の励起波長で観察される蛍光を発する。従って、生体分子に上記の蛍光発生分子を標識した後、特異的に、光を照射することにより、蛍光発生分子を活性化し、光による分子ラベルが可能となる。本現象は、一分子ィメージングの実験などに用いることができる。

[0029] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力本発明は実施例によつて限定されるものではなレ、。

実施例

[0030] 実施例 1：ローダミンのアジド誘導体 (4)の有機合成 (l)Azido-Rhl lO-t-Boc (図 2の化合物 2)の合成

アルゴン雰囲気下、モノ BOC化ローダミン（図 2の化合物 l) (48.0mg， 0.112mmol)をァセトニトリル（8mL)と塩化メチレン（4mL)に溶力、した。さらに、 0°C下、トリフルォロ酢酸 (12.4 1， 0.167mmol)、亜硝酸イソアミル (17.8 1， 0.134mmol)を溶液中に加え攪拌した。 0°C下、 40分攪拌した後、ナトリウムアジド (15.0mg， 0.223mmol)を加えて室温下 30分攪拌した。飽和重曹水を加えて反応停止後、酢酸ェチルを加えた。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、 azido-Rhl lO-t-Boc (図 2の化合部う 2) (36.5mg, 80.0 ^ mol, 71%)を黄色結晶として得た。

[0031] [化 6]

[0032] H NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 1.53 ( 9H， s )， 6.61 ( 1H， brs )， 6.68 ( 1H， d， J = 3.2

Hz )， 6.71 ( 1H， d， J = 3.2Hz )， 6.77 ( 1H， d， J = 8.5Hz )， 6.87 ( 1H， dd， J = 2.2Hz, 8.8Hz )， 6.93 ( 1H， d， J = 1.9Hz )， 7.12 ( 1H， brd, J = 7.3Hz )， 7.56 ( 1H， brs )， 7.6 2 ( 1H， dt， J = 1.0Hz, 7.5Hz )， 7.66 ( 1H， dt， J = 1.2Hz, 7.6Hz )， 8.02 ( 1H， brd, J = 7.3Hz )

¹³C NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 28.36, 81.25, 82.19, 105.97, 107.21, 112.87, 114.2

6， 114.74, 115.59, 123.70, 125.07, 126.22, 128.45, 129.43, 129.78, 135.04, 140.56, 142.37, 151.47, 152.08, 152.95, 169.13

QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH⁺] C25H21N405: 457.1512, fo und: 457.1509

[0033] (2)Azido-Rhl l0 (図 2の化合物 3)の合成

Azido-Rhl lO-t-Boc (図 2の化合物 2) (30.8mg, 67.5 mol)を 4M塩酸ジォキサン溶液（3mL)に溶解し、室温下 2時間半攪拌した。溶媒を留去し、 TLCプレートにより精製することにより Azido-Rhl lO (図 2の化合物 3) (23.8mg, 66.8 ^ mol, 99%)を淡桃色固体として得た。

[0034] [化 7]

[0035] H NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 3.92 ( 2H， s )， 6.36 ( 1H， dd， J = 2.4Hz, 8.5Hz )， 6.

52 ( 1H， d， J = 2.2Hz )， 6.55 ( 1H， d， J = 8.5Hz )， 6.67 ( 1H， dd， J = 2.2Hz, 8.5Hz ) ， 6.74 ( 1H， d， J = 8.5Hz )， 6.92 ( 1H， d， J = 2.2Hz )， 7.16 ( 1H， d， J = 7.6Hz )， 7.61 ( 1H， dt， J = 1.0Hz, 7.3Hz )， 7.66 ( 1H， dt， J = 1.2Hz, 7.5Hz )， 8.01 ( 1H， d， J = 7.

6Hz )

¹³C NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 82.82, 101.15, 106.95, 108.15, 111.67, 114.39, 115

•82， 123.63, 124.80, 126.54, 128.93, 129.38, 129.48, 134.73, 142.03, 148.62, 151.9 7， 152.11, 152.73, 169.06

QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH⁺] C20H13N4O3: 357.0988, fo und: 357.0988

[0036] (3) Bromoacetylamido-Rhl 10-azido (図 2の化合物 4)の合成

Azido-Rhl lO (図 2の化合物 3) (17.9mg, 50.2 mol)をクロ口ホルム（4mL)に溶解し、無水炭酸カリウム (138.2mg， l.Ommol)を加えた。氷零下、ブロモアセチルブロマイド（ 43.7 ^ 1, 0.50mmol)をゆっくりと反応液に加え、反応液を 2時間室温下攪拌した。その後、飽和重曹水を加えて反応を停止した。水層をクロ口ホルムで 2回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ一を用いて精製し、目的物である bromoacetylamido-Rhl 10-azido (図 2の化合物 4) ( 22.6mg， 47.4mmol, 94%)を淡黄色の固体として得た。

[0037] [化 8]

[0038] ^:H NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 4.03 ( 2H， s )， 6.71 ( 1H， dd， J = 2.2Hz, 8.6Hz )， 6.

75 ( 1H， d， J = 8.5Hz )， 6.79 ( 1H， d， J = 8.6Hz )， 6.95 ( 1H， d， J = 2.2Hz )， 7.05 ( 1 H， dd， J = 2.2Hz, 8.8Hz )， 7.13 ( 1H， brd, J = 7.6Hz )， 7.64 ( 1H， dt， J = 1.0Hz, 7.6 Hz )， 7.68 ( 1H， dt， J = 1.2Hz, 7.6Hz )， 7.74 ( 1H， d， J = 1.9Hz )， 8.04 ( 1H， brd, J = 6.8Hz )， 8.33 ( 1H， brs )

¹³C NMR ( 400MHz, CDC1 ) δ 29.21, 81.89, 107.11, 107.82, 114.86, 115.15， 115

•43， 123.57, 125.03, 125.87, 128.38, 129.26, 129.82, 135.12, 138.86, 142.46， 151.0 9， 151.77, 152.68, 163.60, 169.11

QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH⁺] C22H14BrN404: 477.0198, found: 477.0196

[0039] 実施例 2 :アジド誘導体の蛍光特性の変化

実施例 1で合成したアジド誘導体（図 2の化合物 4)は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図 2の化合物 4)をメタノール溶液中、還元剤である TCEP (リン化合物）（トリス [2—カルボキシェチル]ホスフィン）で処理したところ、アジド基はァミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約 2000倍蛍光強度が増加していた（図 3)。

[0040] 実施例 3：オリゴヌクレオチドの合成

全てのオリゴヌクレオチドは、 0.2 〃Mスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、 DNA自動合成機（H-8-SE; Gene World)で合成した。塩基の脱保護および CPG担体からの切り出しは、アンモニア水中で、 55°C、 4時間インキュペートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム（MicroPure II；

Biosearch Technologies)にて行い、 UV absorbanceを測定することにより濃度を決定した。

[0041] (1) 5' Triphenylphosphine- linked DNAの合成

Triphenylphosphine groupの付カロは、り amino— modified -リコと 1XJ心せることにより TTつた。り amino— modinedォリコの合成 ίこよ、 o amino— modifier 5 (Gien Researc h)を用いた。反応は、 8 mMの triphenylphosphine NHS ester (in DMF)、 50 mMの sodi urn tetraborate buffer, 200 μ Mの 5' amino-modifiedオリゴ溶液を含む混合液を、室温で 3時間激しく撹拌することにより行った（反応液中の DMF濃度は 46%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相 HPLC (グラジェント条件： 0— 50 % acetoni trile/50 mM triethylammonium acetateノにて精製をネ丁つた。また、 ESI-TOF mass spe ctrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。

5'-TGTGGGCA^{triphenylphosphine}-3': calculated mass, C H N O P 2931.6; found 293

104 126 33 51 9

2.6.

[0042] (2) 3' Bromoacetylamido-Rhl 10-azido -linked DNAの合成

Bromoacetylamido-Rhl 10-azido (4)の付加は、 3' phosphorothioateオリゴと反応させることにより行った。 3' phosphorothioateオリゴの合成は、 3'-phosphate CPGに始めのモノマーを 7ップリングしたのち、 sulfrizing reagent (Glen research)で、ホスホロチォエート化することにより行った。反応は、 3 mMの Bromoacetylamido- Rhl lO- azido (i n DMPA 80 mMの triethy mmomum Dicarbonate buffer、 300 μ IV [の 3 phosphorothio ateオリゴ溶液を含む混合液を、室温で 5時間激しく撹拌することにより行った (反応液中の DMF濃度は 80%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相 HPLC (グラジェント条件： 0— 80 % acetonitrile/50 mM triethylammonium acetate)にて精製を行った。また、 ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確した。

5 GCCGGCGG^RhU0_ 3，： calculated mass, C H N O P 2942.5; found 2942.5.

104 126 33 51 9

[0043] 実施例 4： DNAテンプレート上での反応および蛍光測定

DNAテンプレート上での反応は、それぞれ 500 nMの DNAテンプレート、 5' Tripheny lphosphine-linkedフロープ、 ό' Bromoacetylamido-Rhl 10-azido -linkedフロープをし igation buffer中 (70 mM Tris-base, 70 mM boric acid, 10 mM MgCl 6H O; pH 8.0) において、 25°Cで反応させることにより行った。用いた配列は以下の通りである。

[0044] DNAテンプレート： 5'_ GTC AGC GCA CTC TTG CCC ACA CCG CCG GCG CC C ACC ACC AGCTTA TA -3' (配列番号 1)

5 nphenylpnosphine-linkedフロープ： 5 _ Ο GG CA _3

5 Bromoacetylamido-Rhl 10-azido -linkedプローブ： 5 - GCC GGC GG _3

[0045] 蛍光シグナルは、蛍光分光光度計 (FP-6500; JASCO)を用いて解析した。 1分もしくは 5分おきに蛍光を測定し、励起波長は 490 nm、蛍光波長は 550 nmとした。蛍光シグナルの測定結果を図 6に示す。

[0046] 実施例 5 :

[化 9]

[0047] 6 ァミノ 1 ナフトール (95.8mg， 0.60mmol)、 4 カルボキシフタル酸無水物 (86.8m g， 0.45mmol)をトリフルォロメタンスルホン酸（15mL)に溶解し、 100°Cで 3. 5時間加熱した。その後、反応液を飽和食塩水/ 5%硫酸水溶液（75mL/5ml)に加えて、さらに、その溶液にクロ口ホルム/メタノール (4 : 1)を加えた。有機層を、飽和食塩水で洗浄し、 Na SO により乾燥した。未精製生成物として、カルボン酸に由来する 2つの位

2 4

置異性体が得られた。さらに、得られた化合物を水（5mL)に溶解し、 12規定塩酸（1 mL)、及び亜硝酸ナトリウム (92.5mg， 1.34mmol)を 0°C下で加えて、約 1時間攪拌した。さらに、アジ化ナトリウム (104.5mg， 1.61mmol)を加えて室温下 1時間攪拌した。その後、反応液にクロ口ホルムを加えて、有機層を飽和食塩水で洗浄し、 Na SO により乾

2 4 燥した。溶媒を留去し、シリカゲルクロマトグラフィ (クロ口ホルム/メタノール： 7: 1)にて精製し、目的物であるビスアジド体 (16.7mg， 31.7 ^ 0101, 2つの異性体)を黄色結晶として得た。

[0048] ^:H NMR (400MHz, CDC1 ) δ 6.95—7.12 (2Η， m)， 7.26-7.37 (2Η， m)， 7.40—7.53 (3Η

3

， m)， 7.68-7.80 (2H， m)， 8.01-8.21 (2H， m)， 8.29-8.32 (1H， m)， 8.72-8.80 (1H， m)， 12.75 (1H， brs)

QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH⁺] C29H14N605: 527.103, fou nd: 527.117

[0049] 実施例 6 :

実施例 5で合成したビスアジド誘導体の蛍光特性を解析した。ビスアジド誘導体は、無蛍光性であった。次に、ビスアジド誘導体をメタノール溶液中、還元剤である TCE P (リン化合物）で処理したところ、アジド基はァミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。その蛍光波長は、 664に最大強度を示し、赤色蛍光であった。また、処理前と比較し、約 1500倍蛍光強度が増加した（図 7)。

[0050] 実施例 7 :

実施例 1で合成したアジド誘導体（図 2の化合物 4)は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図 2の化合物 4)の 1 μ Μメタノール溶液を、 350nmの紫外光で約 60秒間照射した。その後、 490匪の励起光により、蛍光スペクトルを測定した（図 8)。本化合物は、光照射前は、蛍光はないが、光照射後、 490nmの励起波長で観察される蛍光を発する。

[0051] 実施例 8： SNP検出および RNAをテンプレートとした反応

図 9にテンプレートおよびプローブの配列を示す (Az:アジド基修飾した蛍光基， Re d :還元剤）。テンプレートは，フルマツチの DNAおよび一塩基変異の DNA,さらにフルマッチの RNAを用意した。本プローブを用いて、実施例 6と同様の方法で、ヒト ras 遺伝子配列の検出実験を行った結果、 DNAをテンプレートとした場合と同様に， RNA をテンプレートとした場合も，標的配列が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した（図 10)。また，一塩基変異を識別することも可能であった（図 11)。

[0052] 実施例 9 :大腸菌細胞の検出

E.coli 12 (NBRC 3301)を、オートクレーブ滅菌した Luria- Bertani Broth (NIHON S EIYAKU)の中、 30°Cで 20時間振とう培養した。培養液を 5，000rpmで 5分間遠心分離し、上澄みを捨て、菌体を phosphate-buffered saline buffer (ρΗ7·2)中で再分散した。分散させた液を 4% paraformaldehhydeで固定した（Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172:762-770.)。

[0053] 固定サンプルをスライドグラスに定着させ、最終濃度 440nmの rhodamine azideプローブと 440nmの phosphineプローブを含むハイブリダィゼーシヨンバッファー [0.9M Na Cl， 20mM Tris-HCl(pH7.2), 0.01 or 0.1% SDS, 2.5% PEG]を各ゥエルに 9 Lずつ滴下し、 37°Cで 30minインキュベートした。ハイブリバッファーを超純水で洗い流し、乾燥後、褪色防止剤 (invitrogen Slow Fade (登録商標） Gold antifade reagent )をはさんでカバーガラスをかぶせた。

[0054] ターゲットプローブは高圧水銀ランプを光源とする蛍光顕微鏡 (Carl Zeiss Axioskop

(登録商標） 2 Plus)で、 ex. 480/40， em. 510LPの条件で撮影した。全菌画像はハロゲンランプを光源として位相差像として観察し、モノクロデジタルカメラ (Carl Zeiss Axio Cam HRm)とソフト (Carl Zeiss AxioVision 3.0)を用いて撮影した。

[0055] 図 12Aにターゲットとした大腸菌 23S rRNAの配列および作成したプローブの配列を示す。コントロールとして、ミスマッチ配列のプローブも作成した。まず、試験管内で本プローブの性能を評価したところ，フルマツチ配列のプローブでは蛍光の顕著な増加を示したのに対し、ミスマッチ配列のプローブでは，蛍光の増加が見られなかつた（図 12B)。本プローブを実際に大腸菌細胞に適用した結果，フルマツチのプロ一ブでは細胞から蛍光が見られたのに対し（図 12C及び E)、ミスマッチのプローブでは ,ほとんど蛍光が見られなかった（図 12D及び F)。よって，本プローブは，細胞内の R NA検出手法としても有用であるといえる。

[0056] また、上記と同様の大腸菌サンプルをフローサイトメーターにより解析した。蛍光強度を横軸、細胞出現頻度を縦軸にしたヒストグラムを図 13に示す。 RETFプローブぺァ（蛍光プローブ、 TPPプローブ）を導入した場合のみ、高い蛍光強度を示す細胞分布が観察された。一方、蛍光プローブのみ（TPPプローブなし）を導入した場合は、大腸菌のみの場合と全く同じ蛍光強度分布を示した。このことは、アジドメチレン保護基を有する蛍光発生分子が、細胞内において、全くバックグラウンド蛍光を持たないことを意味し、 RETFプローブの非常に高い感度 (高いシグナル 'バックグラウンド比)を保証する結果である。

[0057] 実施例 10 :ヒト細胞内 28S rRNAのイメージング

ラボテックチャンバ一（Nunc)上で細胞を培養し，細胞を Mg， Caフリーの PBSで 2度洗浄した。洗浄した細胞に， 600nMのプローブ（28S rRNAを標的としたプローブ）と 10 U/mlの Streptolysin 0 (SLO； Sigma-aldrich)を 300 L各チャンバ一に加え，室温で 1 Ominインキュベートした。このとき SLOは， lOOmMの DTT中で 2時間インキュベートし，十分に活性化したものを用いた。 10分のインキュベート後， 0.2g/Lの CaClを含む ME M培地を各ゥエルに 300uL加えて SLOの不活性化した。さらに 37°Cで lhrインキュベートしたのち， PBSで細胞を 1度洗浄した。検出した細胞は，蛍光顕微鏡（Zeiss)下で， e X. 470/40， em. 525/50のフィルターを用いて撮影した。結果を図 14に示す。図 14にぉレヽ飞、 Αίま rhodamine azideプローブ +phosphineフロープ ( 兄野)、 Βίま rhodamin e azideプローブのみ（明視野）、 Cは rhodamine azideプローブ + phosphineプローブ（蛍光）、 Bは rhodamine azideプローブのみ（蛍光）を示す。フルマツチのプローブを導入後、約 5分で蛍光シグナルが観察された（図 14)。一方、ミスマッチプローブにおいては、全くシグナルは観察されなかった。

産業上の利用可能性

[0058] 本発明の標識試薬は、標的 DNAあるいは、 RNA分子に結合して、還元されることにより蛍光を発すること力 Sできるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル 'バックグラウンド比を持っため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便'安価であり、試験管内のみではなぐ細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。

図面の簡単な説明

[0059] [図 1]図 1は、アジド基の還元をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する、本発明の蛍光 off/on型センサーシステムを示す。

[図 2]図 2は、実施例で行ったローダミンのアジド誘導体の有機合成の反応スキームを示す。

[図 3]図 3は、本発明のローダミンのアジド誘導体について、還元前 (未反応）の蛍光と、還元後（反応後）の蛍光を示す。

[図 4]図 4は、本発明の蛍光発生分子を用いて標的核酸配歹 IJを検出する方法の原理を示す。

[図 5]図 5は、本発明の蛍光発生分子を用いた標的核酸配列の検出方法における蛍光シグナルの化学的増幅の原理を示す。

[図 6]図 6は、実施例において本発明の蛍光発生分子を用いて標的核酸配列を蛍光検出した結果を示す。

[図 7]図 7は、本発明のローダミンのビスアジド誘導体について、還元前 (未反応）の蛍光と、還元後（反応後）の蛍光を示す。

[図 8]図 8は、図 3は、本発明のローダミンのアジド誘導体について、還元前 (未反応）の蛍光と、還元後（反応後）の蛍光を示す。

[図 9]図 9は、 SNP検出および RNAをテンプレートとした反応で用いたテンプレートおよびプローブの配列を示す。

園 10]図 10は、本発明の蛍光発生分子を用いて RNAをテンプレートとして検出を行つた場合の結果を示す。

園 11]図 11は、本発明の蛍光発生分子を用レ、て一塩基変異を識別した結果を示す園 12]図 12は、本発明の蛍光発生分子を用いて大腸菌細胞を検出した結果を示す園 13]図 13は、フローサイトメトリーによる大腸菌 RNA発現の定量を示す。

[図 14]図 14は、本発明の蛍光発生分子を用いたヒト生細胞内 rRNAのイメージングを示す。

Claims

請求の範囲下記式（1)又は（2)で示される化合物。

[化 1]

1

下記式（1A)又は（2A)で示される化合物。

[化 2]

2 A) (式中、 R1は、アミノ基、又は保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基を示す。）

[3] 請求項 1又は 2に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。

[4] 核酸の標識のために用いる、請求項 3に記載の試薬。

[5] 還元剤と組み合わせて使用される、請求項 3又は 4に記載の試薬。

[6] 標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであつて、ローダミン骨格、クマリン骨格、ェチジゥムブロミド由来骨格、アタリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダィズさせるェ程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。

[7] 上記無蛍光性分子として、ローダミン骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子を使用する、請求項 6に記載の方法。

[8] 上記無蛍光性分子として、請求項 1又は 2に記載の化合物を用いる、請求項 6又は 7 に記載の方法。

[9] 標的核酸配列が RNAである、請求項 6から 8の何れかに記載の方法。

[10] 標的核酸配列の一塩基多型を検出する、請求項 6から 8の何れかに記載の方法。

[11] 請求項 1又は 2に記載の化合物を用いて生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をァミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出することを含む、生体分子の分析方法。

[12] 請求項 1又は 2に記載の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識する、請求項 11 に記載の生体分子の分析方法。

[13] 請求項 1又は 2に記載の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をァミノ基に還元させることにより生成する蛍光をフローサイトメトリーで検出する、請求項 11又は 12に記載の生体分子の分析方法。