JPWO2008075718A1 - 蛍光発生分子 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、安定性が高く、かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することを可能とする、遺伝子解析用の蛍光on/off型蛍光化合物を提供することである。本発明によれば、下記式（１）又は（２）で示される化合物が提供される。【化１】（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基、アミノ基、保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
Description
本発明は、核酸などの生体関連物質を検出するための標識試薬として有用な蛍光発生分子に関する。より詳細には、本発明は、アジド基を有する無蛍光性分子であって、該アジド基がアミノ基に還元されると蛍光を発生することを特徴とする分子に関する。さらに本発明は、上記の蛍光発生分子を含む標識試薬、及び上記の蛍光発生分子を用いた標的核酸配列の検出方法に関する。
特定の標的核酸配列を有する核酸分子を検出するための方法としては、その標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いるハイブリダイゼーション法が広く使用されている。ハイブリダイゼーション法では、標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用意し、そのプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を持つ試料のみが高い選択性でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの結果として形成されるハイブリッド体を検出するための手段としては、プローブ核酸をラジオアイソトープで標識する方法、蛍光物質で標識する方法、発光試薬を利用する方法などが挙げられる。核酸の標識に使用することができる蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられるが、これらの蛍光物質で標識した蛍光核酸プローブは、バックグラウンド蛍光シグナルが高く、高感度測定が困難であった。
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安定性が高く（即ち、長期間において活性である）、かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することを可能とする、遺伝子解析用の蛍光on/off型蛍光化合物（蛍光発生分子システム）を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記の蛍光on/off型蛍光化合物を用いた生体関連物質を検出するための標識試薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ローダミン骨格などの蛍光物質骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子であって、該アジド基がアミノ基に還元されると蛍光を発生することを特徴とする分子を合成することに成功した。さらに、上記の無蛍光性分子で標識した第一の核酸プローブと、還元作用を有する分子で標識した第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせることによって、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基をアミノ基に還元し、これにより生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、下記式（１）又は（２）で示される化合物が提供される。
（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基、アミノ基、保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
好ましくは、本発明によれば、下記式（１Ａ）又は（２Ａ）で示される化合物が提供される。
（式中、Ｒ１は、アミノ基、又は保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基を示す。）
本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬が提供される。
本発明の標識試薬は、好ましくは、核酸の標識のために用いるものであり、好ましくは、還元剤と組み合わせて使用されるものである。
本発明の標識試薬は、好ましくは、核酸の標識のために用いるものであり、好ましくは、還元剤と組み合わせて使用されるものである。
本発明によればさらに、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、ローダミン骨格、クマリン骨格、エチジウムブロミド由来骨格、アクリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法が提供される。
好ましくは、上記無蛍光性分子として、ローダミン骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子を使用する。
好ましくは、上記無蛍光性分子として、上記した本発明の化合物を用いる。
好ましくは、標的核酸配列はＲＮＡである。
好ましくは、標的核酸配列の一塩基多型を検出する。
好ましくは、上記無蛍光性分子として、上記した本発明の化合物を用いる。
好ましくは、標的核酸配列はＲＮＡである。
好ましくは、標的核酸配列の一塩基多型を検出する。
本発明によればさらに、上記した本発明の化合物を用いて生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出することを含む、生体分子の分析方法が提供される。
好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識する。
好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をアミノ基に還元させることにより生成する蛍光をフローサイトメトリーで検出する。
好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識する。
好ましくは、上記した本発明の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をアミノ基に還元させることにより生成する蛍光をフローサイトメトリーで検出する。
本発明によれば、アジド基の還元反応をトリガーとする蛍光発生分子システムが提供される。さらに本発明によれば、この蛍光発生分子システムを応用して、生体関連物質を検出するための標識試薬が提供される。本発明の標識試薬は、標的DNAあるいは、RNA分子に結合して、還元されることにより蛍光を発することができるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル・バックグラウンド比を持つため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便・安価であり、試験管内のみではなく、細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明で開発した蛍光発生分子システムは、アジド基の還元をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光off/on型センサーシステムとして一般化できる（図１）。本発明の実施例として、蛍光分子ローダミンを化学修飾し、アジド基を導入した分子を合成した（図２）。ローダミン１１０を、モノBOC化した。つづいて、亜硝酸イソアミルで処理することにより、アミノ基をジアゾ化し、ナトリウムアジドを加えることによりアジド体を得た。さらに、４M 塩酸-ジオキサン溶液で処理することにより、BOC基を除去した。最後に、アミノ基をブロモアセチル化することにより、目的物であるローダミンのアジド誘導体（図２の化合物4）を得た。
本発明で開発した蛍光発生分子システムは、アジド基の還元をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光off/on型センサーシステムとして一般化できる（図１）。本発明の実施例として、蛍光分子ローダミンを化学修飾し、アジド基を導入した分子を合成した（図２）。ローダミン１１０を、モノBOC化した。つづいて、亜硝酸イソアミルで処理することにより、アミノ基をジアゾ化し、ナトリウムアジドを加えることによりアジド体を得た。さらに、４M 塩酸-ジオキサン溶液で処理することにより、BOC基を除去した。最後に、アミノ基をブロモアセチル化することにより、目的物であるローダミンのアジド誘導体（図２の化合物4）を得た。
このローダミンのアジド誘導体（図２の化合物4）の蛍光特性を解析した。アジド誘導体（図２の化合物4）は、無蛍光性であった。次に、4をメタノール溶液中、還元剤であるTCEP（リン化合物）（トリス[2−カルボキシエチル]ホスフィン）で処理したところ、アジド基はアミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約２０００倍蛍光強度が増加した（図３）。本蛍光発生分子システムは、有機リン化合物の検出に有用である。
さらに、上記で合成した蛍光発生分子システムであるローダミン誘導体（図２の化合物４）を核酸鎖に導入して、遺伝子検出用化学反応プローブを開発した。本発明で開発した２つのDNAプローブ（即ち、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブ）は、標的DNAあるいはRNA上に標的配列特異的に結合し、化学反応(還元反応）し、初めて高い強度の蛍光を発する（図４）。
この蛍光シグナルの有無や強度を指標にすることによって、核酸配列を区別又は検出することができる。本反応は、他の試薬や酵素を必要とせず、プローブを検出サンプルに加えるのみで測定できる。さらに、本検出反応は等温条件下、反応サイクルが回転し、蛍光シグナルを増幅することができる（図５）。そのため、微量サンプルの測定が可能となる。細胞内あるいは、生体内においても、本プローブを用いて遺伝子発現の観測が可能になる。
さらに、本明細書の実施例では、本発明のプローブを用いて、ヒトras遺伝子配列の検出実験を行った。標的DNA配列および合成したプローブを図６に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しない条件でも蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、化学反応プローブは、標的配列が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加は全く観察されなかった。そのため、本化学反応プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった（図６）。
本発明の化合物（蛍光発生分子）は、下記式（１）又は（２）で示される化合物である。
（式中、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基、アミノ基、保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、又は水素原子を示し、Ｒ3は炭素数１から６のアルキル基、アリール基、又は水素原子を示し、Ｒ4は酸素原子を含む基または水素原子を示し、Ｒ3とＲ4は結合して環を形成していてもよい。）
好ましくは、本発明の化合物は下記式（１Ａ）又は（２Ａ）で示される化合物である。
（式中、Ｒ１は、アミノ基、又は保護基若しくは置換基を有していてもよいアミド基を示す。）
本発明において、炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基を挙げることができる。
本発明において、アミド基は、保護基若しくは置換基を有していてもよい。保護基として、t-ブトキシカルボニル基などのウレタン系保護基、ベンゾイル基などのアシル系保護基、トリチル基などのアルキル系保護基、ジメチルアセタールなどのイミン系保護基などがあげられる。置換基としては、核酸と反応して結合できる反応性基が好ましく、例えば、ハロゲン原子などを挙げることができる。なお、置換基とアミド基は連結基（例えば、メチレン基などのアルキレン基）を介して結合していてもよい。
本発明において、ハロゲン原子のとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
本発明において、アリール基としては、フェニル基、又はナフチル基を挙げることができる。
本発明において、酸素原子を含む基としては、−Ｏ−、又は−ＯＣＯ−などを挙げることができる。
本発明において、アリール基としては、フェニル基、又はナフチル基を挙げることができる。
本発明において、酸素原子を含む基としては、−Ｏ−、又は−ＯＣＯ−などを挙げることができる。
本発明によれば、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、ローダミン骨格、クマリン骨格、エチジウムブロミド由来骨格、アクリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせ、これにより第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がアミノ基に還元させ、生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出することができる。
ローダミン骨格、クマリン骨格、エチジウムブロミド由来骨格、アクリジン骨格、及びダンシル骨格の具体的構造を以下に示す。
本発明で用いる第一の核酸プローブは、上記した骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識されている。
本発明で用いる第二の核酸プローブは、還元作用を有する分子で標識されている。本発明で用いることができる還元作用を示す分子として、硫黄化合物や三価のリン化合物などがあげられる。硫黄化合物としては、DTT（ジチオスレイトール）、三価のリン化合物としては、トリフェニルフォスフィン、アルキルフォスフィンなどをあげることができる。
本発明において、第一の核酸プローブは、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有し、第二の核酸プローブは、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する。ここで、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記の両プローブが標的核酸配列にハイブリダイズした際に、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基が、第二の核酸プローブ中の還元作用を有する分子の作用によりアミノ基に還元されるという条件を満たす限りは、任意に設定することができる。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記条件を満たすためには、隣接または近接していることが一般的には好ましい。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、例えば、１から１０塩基程度のスペースを介して近接していることが好ましい。
式（１）又は（２）、若しくは式（１Ａ）又は（２Ａ）で示される蛍光発生分子を光（例えば、約３５０nmの紫外光）で照射すると、アジドがアミンに還元され、蛍光を発する。即ち、式（１）又は（２）、若しくは式（１Ａ）又は（２Ａ）で示される化合物は、光照射前は、蛍光はないが、光照射後、４９０nmの励起波長で観察される蛍光を発する。従って、生体分子に上記の蛍光発生分子を標識した後、特異的に、光を照射することにより、蛍光発生分子を活性化し、光による分子ラベルが可能となる。本現象は、一分子イメージングの実験などに用いることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ローダミンのアジド誘導体（4）の有機合成
（１）Azido-Rh110-t-Boc (図２の化合物2) の合成
アルゴン雰囲気下、モノBOC化ローダミン（図２の化合物1）(48.0mg, 0.112mmol)をアセトニトリル（８ｍL）と塩化メチレン（４ｍL）に溶かした。さらに、0℃下、トリフルオロ酢酸(12.4μl, 0.167mmol)、亜硝酸イソアミル(17.8μl, 0.134mmol)を溶液中に加え攪拌した。0℃下、４０分攪拌した後、ナトリウムアジド(15.0mg, 0.223mmol)を加えて室温下３０分攪拌した。飽和重曹水を加えて反応停止後、酢酸エチルを加えた。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、azido-Rh110-t-Boc (図２の化合部う2) (36.5mg, 80.0μmol, 71%)を黄色結晶として得た。
（１）Azido-Rh110-t-Boc (図２の化合物2) の合成
アルゴン雰囲気下、モノBOC化ローダミン（図２の化合物1）(48.0mg, 0.112mmol)をアセトニトリル（８ｍL）と塩化メチレン（４ｍL）に溶かした。さらに、0℃下、トリフルオロ酢酸(12.4μl, 0.167mmol)、亜硝酸イソアミル(17.8μl, 0.134mmol)を溶液中に加え攪拌した。0℃下、４０分攪拌した後、ナトリウムアジド(15.0mg, 0.223mmol)を加えて室温下３０分攪拌した。飽和重曹水を加えて反応停止後、酢酸エチルを加えた。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、azido-Rh110-t-Boc (図２の化合部う2) (36.5mg, 80.0μmol, 71%)を黄色結晶として得た。
1H NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 1.53 ( 9H, s ), 6.61 ( 1H, brs ), 6.68 ( 1H, d, J = 3.2Hz ), 6.71 ( 1H, d, J = 3.2Hz ), 6.77 ( 1H, d, J = 8.5Hz ), 6.87 ( 1H, dd, J = 2.2Hz, 8.8Hz ), 6.93 ( 1H, d, J = 1.9Hz ), 7.12 ( 1H, brd, J = 7.3Hz ), 7.56 ( 1H, brs ), 7.62 ( 1H, dt, J = 1.0Hz, 7.5Hz ), 7.66 ( 1H, dt, J = 1.2Hz, 7.6Hz ), 8.02 ( 1H, brd, J = 7.3Hz )
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 28.36, 81.25, 82.19, 105.97, 107.21, 112.87, 114.26, 114.74, 115.59, 123.70, 125.07, 126.22, 128.45, 129.43, 129.78, 135.04, 140.56, 142.37, 151.47, 152.08, 152.95, 169.13
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C25H21N4O5: 457.1512, found: 457.1509
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 28.36, 81.25, 82.19, 105.97, 107.21, 112.87, 114.26, 114.74, 115.59, 123.70, 125.07, 126.22, 128.45, 129.43, 129.78, 135.04, 140.56, 142.37, 151.47, 152.08, 152.95, 169.13
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C25H21N4O5: 457.1512, found: 457.1509
（２）Azido-Rh110 (図２の化合物3)の合成
Azido-Rh110-t-Boc (図２の化合物2) (30.8mg, 67.5μmol)を４M 塩酸ジオキサン溶液（３ｍL）に溶解し、室温下２時間半攪拌した。溶媒を留去し、TLCプレートにより精製することによりAzido-Rh110 (図２の化合物3) (23.8mg, 66.8μmol, 99%)を淡桃色固体として得た。
Azido-Rh110-t-Boc (図２の化合物2) (30.8mg, 67.5μmol)を４M 塩酸ジオキサン溶液（３ｍL）に溶解し、室温下２時間半攪拌した。溶媒を留去し、TLCプレートにより精製することによりAzido-Rh110 (図２の化合物3) (23.8mg, 66.8μmol, 99%)を淡桃色固体として得た。
1H NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 3.92 ( 2H, s ), 6.36 ( 1H, dd, J = 2.4Hz, 8.5Hz ), 6.52 ( 1H, d, J = 2.2Hz ), 6.55 ( 1H, d, J = 8.5Hz ), 6.67 ( 1H, dd, J = 2.2Hz, 8.5Hz ), 6.74 ( 1H, d, J = 8.5Hz ), 6.92 ( 1H, d, J = 2.2Hz ), 7.16 ( 1H, d, J = 7.6Hz ), 7.61 ( 1H, dt, J = 1.0Hz, 7.3Hz ), 7.66 ( 1H, dt, J = 1.2Hz, 7.5Hz ), 8.01 ( 1H, d, J = 7.6Hz )
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 82.82, 101.15, 106.95, 108.15, 111.67, 114.39, 115.82, 123.63, 124.80, 126.54, 128.93, 129.38, 129.48, 134.73, 142.03, 148.62, 151.97, 152.11, 152.73, 169.06
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C20H13N4O3: 357.0988, found: 357.0988
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 82.82, 101.15, 106.95, 108.15, 111.67, 114.39, 115.82, 123.63, 124.80, 126.54, 128.93, 129.38, 129.48, 134.73, 142.03, 148.62, 151.97, 152.11, 152.73, 169.06
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C20H13N4O3: 357.0988, found: 357.0988
（３）Bromoacetylamido-Rh110-azido (図２の化合物4)の合成
Azido-Rh110 (図２の化合物3) (17.9mg, 50.2μmol)をクロロホルム（４ｍL）に溶解し、無水炭酸カリウム(138.2mg, 1.0mmol)を加えた。氷零下、ブロモアセチルブロマイド(43.7μl, 0.50mmol)をゆっくりと反応液に加え、反応液を２時間室温下攪拌した。その後、飽和重曹水を加えて反応を停止した。水層をクロロホルムで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、目的物であるbromoacetylamido-Rh110-azido (図２の化合物4) (22.6mg, 47.4mmol, 94%)を淡黄色の固体として得た。
Azido-Rh110 (図２の化合物3) (17.9mg, 50.2μmol)をクロロホルム（４ｍL）に溶解し、無水炭酸カリウム(138.2mg, 1.0mmol)を加えた。氷零下、ブロモアセチルブロマイド(43.7μl, 0.50mmol)をゆっくりと反応液に加え、反応液を２時間室温下攪拌した。その後、飽和重曹水を加えて反応を停止した。水層をクロロホルムで２回抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、目的物であるbromoacetylamido-Rh110-azido (図２の化合物4) (22.6mg, 47.4mmol, 94%)を淡黄色の固体として得た。
1H NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 4.03 ( 2H, s ), 6.71 ( 1H, dd, J = 2.2Hz, 8.6Hz ), 6.75 ( 1H, d, J = 8.5Hz ), 6.79 ( 1H, d, J = 8.6Hz ), 6.95 ( 1H, d, J = 2.2Hz ), 7.05 ( 1H, dd, J = 2.2Hz, 8.8Hz ), 7.13 ( 1H, brd, J = 7.6Hz ), 7.64 ( 1H, dt, J = 1.0Hz, 7.6Hz ), 7.68 ( 1H, dt, J = 1.2Hz, 7.6Hz ), 7.74 ( 1H, d, J = 1.9Hz ), 8.04 ( 1H, brd, J = 6.8Hz ), 8.33 ( 1H, brs )
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 29.21, 81.89, 107.11, 107.82, 114.86, 115.15, 115.43, 123.57, 125.03, 125.87, 128.38, 129.26, 129.82, 135.12, 138.86, 142.46, 151.09, 151.77, 152.68, 163.60, 169.11
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C22H14BrN4O4: 477.0198, found: 477.0196
13C NMR ( 400MHz, CDCl3 ) δ 29.21, 81.89, 107.11, 107.82, 114.86, 115.15, 115.43, 123.57, 125.03, 125.87, 128.38, 129.26, 129.82, 135.12, 138.86, 142.46, 151.09, 151.77, 152.68, 163.60, 169.11
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C22H14BrN4O4: 477.0198, found: 477.0196
実施例２：アジド誘導体の蛍光特性の変化
実施例１で合成したアジド誘導体（図２の化合物4）は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図２の化合物4）をメタノール溶液中、還元剤であるTCEP（リン化合物）（トリス[2−カルボキシエチル]ホスフィン）で処理したところ、アジド基はアミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約２０００倍蛍光強度が増加していた（図３）。
実施例１で合成したアジド誘導体（図２の化合物4）は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図２の化合物4）をメタノール溶液中、還元剤であるTCEP（リン化合物）（トリス[2−カルボキシエチル]ホスフィン）で処理したところ、アジド基はアミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。処理前と比較し、約２０００倍蛍光強度が増加していた（図３）。
実施例３：オリゴヌクレオチドの合成
全てのオリゴヌクレオチドは、0.2 μMスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機（H-8-SE; Gene World）で合成した。塩基の脱保護およびCPG担体からの切り出しは、アンモニア水中で、55℃、4時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム（MicroPure II; Biosearch Technologies）にて行い、UV absorbanceを測定することにより濃度を決定した。
全てのオリゴヌクレオチドは、0.2 μMスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機（H-8-SE; Gene World）で合成した。塩基の脱保護およびCPG担体からの切り出しは、アンモニア水中で、55℃、4時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム（MicroPure II; Biosearch Technologies）にて行い、UV absorbanceを測定することにより濃度を決定した。
（１）5' Triphenylphosphine-linked DNAの合成
Triphenylphosphine groupの付加は、 5' amino-modifiedオリゴと反応させることにより行った。 5' amino-modified オリゴの合成には、5' amino-modifier 5 (Glen Research)を用いた。反応は、8 mM のtriphenylphosphine NHS ester (in DMF)、50 mMのsodium tetraborate buffer、200 μMの5' amino-modifiedオリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のDMF濃度は46％）。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−50 % acetonitrile/50 mM triethylammonium acetate)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。
5'-TGTGGGCAtriphenylphosphine-3': calculated mass, C104H126N33O51P9 2931.6; found 2932.6.
Triphenylphosphine groupの付加は、 5' amino-modifiedオリゴと反応させることにより行った。 5' amino-modified オリゴの合成には、5' amino-modifier 5 (Glen Research)を用いた。反応は、8 mM のtriphenylphosphine NHS ester (in DMF)、50 mMのsodium tetraborate buffer、200 μMの5' amino-modifiedオリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のDMF濃度は46％）。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−50 % acetonitrile/50 mM triethylammonium acetate)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。
5'-TGTGGGCAtriphenylphosphine-3': calculated mass, C104H126N33O51P9 2931.6; found 2932.6.
（２）3' Bromoacetylamido-Rh110-azido -linked DNAの合成
Bromoacetylamido-Rh110-azido (4)の付加は、 3' phosphorothioateオリゴと反応させることにより行った。 3' phosphorothioate オリゴの合成は、3'-phosphate CPGに始めのモノマーをカップリングしたのち、sulfrizing reagent (Glen research)でホスホロチオエート化することにより行った。反応は、3 mM のBromoacetylamido-Rh110-azido (in DMF)、80 mMのtriethylammonium bicarbonate buffer、300 μMの3' phosphorothioateオリゴ溶液を含む混合液を、室温で5時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のDMF濃度は80%）。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−80 % acetonitrile/50 mM triethylammonium acetate)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。
5'-GCCGGCGGRh110-azide-3': calculated mass, C104H126N33O51P9 2942.5; found 2942.5.
Bromoacetylamido-Rh110-azido (4)の付加は、 3' phosphorothioateオリゴと反応させることにより行った。 3' phosphorothioate オリゴの合成は、3'-phosphate CPGに始めのモノマーをカップリングしたのち、sulfrizing reagent (Glen research)でホスホロチオエート化することにより行った。反応は、3 mM のBromoacetylamido-Rh110-azido (in DMF)、80 mMのtriethylammonium bicarbonate buffer、300 μMの3' phosphorothioateオリゴ溶液を含む混合液を、室温で5時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のDMF濃度は80%）。 反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC (グラジエント条件: 0−80 % acetonitrile/50 mM triethylammonium acetate)にて精製を行った。また、ESI-TOF mass spectrometryにより目的の産物が得られていることを確認した。
5'-GCCGGCGGRh110-azide-3': calculated mass, C104H126N33O51P9 2942.5; found 2942.5.
実施例４：DNAテンプレート上での反応および蛍光測定
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ500 nMのDNAテンプレート、5' Triphenylphosphine-linked プローブ、3' Bromoacetylamido-Rh110-azido -linkedプローブをLigation buffer中（70 mM Tris-base, 70 mM boric acid, 10 mM MgCl2 6H2O; pH 8.0）において、25℃で反応させることにより行った。用いた配列は以下の通りである。
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ500 nMのDNAテンプレート、5' Triphenylphosphine-linked プローブ、3' Bromoacetylamido-Rh110-azido -linkedプローブをLigation buffer中（70 mM Tris-base, 70 mM boric acid, 10 mM MgCl2 6H2O; pH 8.0）において、25℃で反応させることにより行った。用いた配列は以下の通りである。
DNAテンプレート：5'- GTC AGC GCA CTC TTG CCC ACA CCG CCG GCG CCC ACC ACC AGCTTA TA -3'（配列番号１）
5' Triphenylphosphine-linked プローブ：5'- TGT GGG CA -3'
5' Bromoacetylamido-Rh110-azido -linkedプローブ：5'- GCC GGC GG -3'
5' Triphenylphosphine-linked プローブ：5'- TGT GGG CA -3'
5' Bromoacetylamido-Rh110-azido -linkedプローブ：5'- GCC GGC GG -3'
蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP-6500; JASCO)を用いて解析した。1分もしくは5分おきに蛍光を測定し、励起波長は490 nm、蛍光波長は550 nmとした。蛍光シグナルの測定結果を図６に示す。
実施例５：
６−アミノ１−ナフトール(95.8mg, 0.60mmol)、４−カルボキシフタル酸無水物(86.8mg, 0.45mmol)をトリフルオロメタンスルホン酸（15mL）に溶解し、１００℃で３．５時間加熱した。その後、反応液を飽和食塩水／５％硫酸水溶液（75mL/5ml）に加えて、さらに、その溶液にクロロホルム/メタノール（４：１）を加えた。有機層を、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4 により乾燥した。未精製生成物として、カルボン酸に由来する２つの位置異性体が得られた。さらに、得られた化合物を水（５ｍL）に溶解し、１２規定塩酸（１ｍL）、及び亜硝酸ナトリウム(92.5mg, 1.34mmol)を０℃下で加えて、約１時間攪拌した。さらに、アジ化ナトリウム(104.5mg, 1.61mmol)を加えて室温下１時間攪拌した。その後、反応液にクロロホルムを加えて、有機層を飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4 により乾燥した。溶媒を留去し、シリカゲルクロマトグラフィ(クロロホルム/メタノール: 7:1)にて精製し、目的物であるビスアジド体(16.7mg, 31.7μmol, ２つの異性体)を黄色結晶として得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.95-7.12 (2H, m), 7.26-7.37 (2H, m), 7.40-7.53 (3H, m), 7.68-7.80 (2H, m), 8.01-8.21 (2H, m), 8.29-8.32 (1H, m), 8.72-8.80 (1H, m), 12.75 (1H, brs)
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C29H14N6O5: 527.103, found: 527.117
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI): [MH+] C29H14N6O5: 527.103, found: 527.117
実施例６：
実施例５で合成したビスアジド誘導体の蛍光特性を解析した。ビスアジド誘導体は、無蛍光性であった。次に、ビスアジド誘導体をメタノール溶液中、還元剤であるTCEP（リン化合物）で処理したところ、アジド基はアミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。その蛍光波長は、６６４に最大強度を示し、赤色蛍光であった。また、処理前と比較し、約１５００倍蛍光強度が増加した（図７）。
実施例５で合成したビスアジド誘導体の蛍光特性を解析した。ビスアジド誘導体は、無蛍光性であった。次に、ビスアジド誘導体をメタノール溶液中、還元剤であるTCEP（リン化合物）で処理したところ、アジド基はアミノ基に変換され、高い蛍光性を示した。その蛍光波長は、６６４に最大強度を示し、赤色蛍光であった。また、処理前と比較し、約１５００倍蛍光強度が増加した（図７）。
実施例７：
実施例１で合成したアジド誘導体（図２の化合物4）は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図２の化合物4）の１μMメタノール溶液を、３５０nmの紫外光で約６０秒間照射した。その後、４９０nmの励起光により、蛍光スペクトルを測定した（図８）。本化合物は、光照射前は、蛍光はないが、光照射後、４９０nmの励起波長で観察される蛍光を発する。
実施例１で合成したアジド誘導体（図２の化合物4）は、無蛍光性であった。次に、この化合物（図２の化合物4）の１μMメタノール溶液を、３５０nmの紫外光で約６０秒間照射した。その後、４９０nmの励起光により、蛍光スペクトルを測定した（図８）。本化合物は、光照射前は、蛍光はないが、光照射後、４９０nmの励起波長で観察される蛍光を発する。
実施例８：SNP検出およびRNAをテンプレートとした反応
図９にテンプレートおよびプローブの配列を示す（Az:アジド基修飾した蛍光基，Red：還元剤）。テンプレートは，フルマッチのDNAおよび一塩基変異のDNA，さらにフルマッチのRNAを用意した。本プローブを用いて、実施例６と同様の方法で、ヒトras遺伝子配列の検出実験を行った結果、DNAをテンプレートとした場合と同様に，RNAをテンプレートとした場合も，標的配列が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した（図１０）。また，一塩基変異を識別することも可能であった（図１１）。
図９にテンプレートおよびプローブの配列を示す（Az:アジド基修飾した蛍光基，Red：還元剤）。テンプレートは，フルマッチのDNAおよび一塩基変異のDNA，さらにフルマッチのRNAを用意した。本プローブを用いて、実施例６と同様の方法で、ヒトras遺伝子配列の検出実験を行った結果、DNAをテンプレートとした場合と同様に，RNAをテンプレートとした場合も，標的配列が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した（図１０）。また，一塩基変異を識別することも可能であった（図１１）。
実施例９：大腸菌細胞の検出
E.coli K12 (NBRC 3301)を、オートクレーブ滅菌したLuria-Bertani Broth (NIHON SEIYAKU)の中、30℃で20時間振とう培養した。培養液を5,000rpmで5分間遠心分離し、上澄みを捨て、菌体をphosphate-buffered saline buffer (pH7.2)中で再分散した。分散させた液を4% paraformaldehhydeで固定した (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172:762-770.)。
E.coli K12 (NBRC 3301)を、オートクレーブ滅菌したLuria-Bertani Broth (NIHON SEIYAKU)の中、30℃で20時間振とう培養した。培養液を5,000rpmで5分間遠心分離し、上澄みを捨て、菌体をphosphate-buffered saline buffer (pH7.2)中で再分散した。分散させた液を4% paraformaldehhydeで固定した (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172:762-770.)。
固定サンプルをスライドグラスに定着させ、最終濃度440nmのrhodamine azideプローブと440nmのphosphine プローブを含むハイブリダイゼーションバッファー[0.9M NaCl, 20mM Tris-HCl(pH7.2), 0.01 or 0.1% SDS, 2.5% PEG]を各ウェルに9μLずつ滴下し、37℃で30minインキュベートした。ハイブリバッファーを超純水で洗い流し、乾燥後、褪色防止剤(invitrogen Slow Fade（登録商標） Gold antifade reagent )をはさんでカバーガラスをかぶせた。
ターゲットプローブは高圧水銀ランプを光源とする蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Axioskop（登録商標）2 Plus)で、ex. 480/40, em. 510LPの条件で撮影した。全菌画像はハロゲンランプを光源として位相差像として観察し、モノクロデジタルカメラ(Carl Zeiss AxioCam HRm)とソフト(Carl Zeiss AxioVision 3.0)を用いて撮影した。
図１２Ａにターゲットとした大腸菌23S rRNAの配列および作成したプローブの配列を示す。コントロールとして、ミスマッチ配列のプローブも作成した。まず、試験管内で本プローブの性能を評価したところ，フルマッチ配列のプローブでは蛍光の顕著な増加を示したのに対し、ミスマッチ配列のプローブでは，蛍光の増加が見られなかった（図１２Ｂ）。本プローブを実際に大腸菌細胞に適用した結果，フルマッチのプローブでは細胞から蛍光が見られたのに対し（図１２Ｃ及びＥ）、ミスマッチのプローブでは，ほとんど蛍光が見られなかった（図１２Ｄ及びＦ）。よって，本プローブは，細胞内のRNA検出手法としても有用であるといえる。
また、上記と同様の大腸菌サンプルをフローサイトメーターにより解析した。蛍光強度を横軸、細胞出現頻度を縦軸にしたヒストグラムを図１３に示す。RETFプローブペア（蛍光プローブ、TPPプローブ）を導入した場合のみ、高い蛍光強度を示す細胞分布が観察された。一方、蛍光プローブのみ（TPPプローブなし）を導入した場合は、大腸菌のみの場合と全く同じ蛍光強度分布を示した。このことは、アジドメチレン保護基を有する蛍光発生分子が、細胞内において、全くバックグラウンド蛍光を持たないことを意味し、RETFプローブの非常に高い感度(高いシグナル・バックグラウンド比)を保証する結果である。
実施例１０：ヒト細胞内28S rRNAのイメージング
ラボテックチャンバー（Nunc）上で細胞を培養し，細胞をMg, CaフリーのPBSで２度洗浄した。洗浄した細胞に，600nMのプローブ（28S rRNAを標的としたプローブ）と10U/mlのStreptolysin O（SLO；Sigma-aldrich）を300μL各チャンバーに加え，室温で10minインキュベートした。このときSLOは，100mMのDTT中で2時間インキュベートし，十分に活性化したものを用いた。10分のインキュベート後，0.2g/LのCaCl2を含むMEM培地を各ウェルに300uL加えてSLOの不活性化した。さらに37℃で1hrインキュベートしたのち，PBSで細胞を１度洗浄した。検出した細胞は，蛍光顕微鏡（Zeiss）下で，ex. 470/40, em. 525/50のフィルターを用いて撮影した。結果を図１４に示す。図１４において、Ａはrhodamine azideプローブ＋phosphine プローブ（明視野）、Ｂはrhodamine azideプローブのみ（明視野）、Ｃはrhodamine azideプローブ＋phosphine プローブ（蛍光）、Ｂはrhodamine azideプローブのみ（蛍光）を示す。フルマッチのプローブを導入後、約5分で蛍光シグナルが観察された（図１４）。一方、ミスマッチプローブにおいては、全くシグナルは観察されなかった。
ラボテックチャンバー（Nunc）上で細胞を培養し，細胞をMg, CaフリーのPBSで２度洗浄した。洗浄した細胞に，600nMのプローブ（28S rRNAを標的としたプローブ）と10U/mlのStreptolysin O（SLO；Sigma-aldrich）を300μL各チャンバーに加え，室温で10minインキュベートした。このときSLOは，100mMのDTT中で2時間インキュベートし，十分に活性化したものを用いた。10分のインキュベート後，0.2g/LのCaCl2を含むMEM培地を各ウェルに300uL加えてSLOの不活性化した。さらに37℃で1hrインキュベートしたのち，PBSで細胞を１度洗浄した。検出した細胞は，蛍光顕微鏡（Zeiss）下で，ex. 470/40, em. 525/50のフィルターを用いて撮影した。結果を図１４に示す。図１４において、Ａはrhodamine azideプローブ＋phosphine プローブ（明視野）、Ｂはrhodamine azideプローブのみ（明視野）、Ｃはrhodamine azideプローブ＋phosphine プローブ（蛍光）、Ｂはrhodamine azideプローブのみ（蛍光）を示す。フルマッチのプローブを導入後、約5分で蛍光シグナルが観察された（図１４）。一方、ミスマッチプローブにおいては、全くシグナルは観察されなかった。
本発明の標識試薬は、標的DNAあるいは、RNA分子に結合して、還元されることにより蛍光を発することができるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル・バックグラウンド比を持つため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便・安価であり、試験管内のみではなく、細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。
Claims (13)
- 下記式（１）又は（２）で示される化合物。
- 下記式（１Ａ）又は（２Ａ）で示される化合物。
- 請求項１又は２に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
- 核酸の標識のために用いる、請求項３に記載の試薬。
- 還元剤と組み合わせて使用される、請求項３又は４に記載の試薬。
- 標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、ローダミン骨格、クマリン骨格、エチジウムブロミド由来骨格、アクリジン骨格又はダンシル骨格から選択される骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、還元作用を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子のアジド基がアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。
- 上記無蛍光性分子として、ローダミン骨格を有し、かつ分子内にアジド基を有する無蛍光性分子を使用する、請求項６に記載の方法。
- 上記無蛍光性分子として、請求項１又は２に記載の化合物を用いる、請求項６又は７に記載の方法。
- 標的核酸配列がＲＮＡである、請求項６から８の何れかに記載の方法。
- 標的核酸配列の一塩基多型を検出する、請求項６から８の何れかに記載の方法。
- 請求項１又は２に記載の化合物を用いて生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をアミノ基に還元させることにより生成する蛍光を検出することを含む、生体分子の分析方法。
- 請求項１又は２に記載の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識する、請求項１１に記載の生体分子の分析方法。
- 請求項１又は２に記載の化合物を用いて細胞内の生体分子を標識し、該化合物に光を照射してアジド基をアミノ基に還元させることにより生成する蛍光をフローサイトメトリーで検出する、請求項１１又は１２に記載の生体分子の分析方法。
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