JP2002034595A - 生細胞の検出方法 - Google Patents
生細胞の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来の生細胞の検出方法における欠点である
対数増殖期にあるグラムネガティブ細菌を染色できない
ことを解消し、対数増殖期にあるグラム陰性細菌を含む
全ての生細胞の検出方法を提供すること。 【解決手段】 細胞を含む媒体をカルシウムイオンの存
在下で蛍光性酵素基質により染色し、蛍光を測定するこ
とを特徴とする生細胞の検出方法。
対数増殖期にあるグラムネガティブ細菌を染色できない
ことを解消し、対数増殖期にあるグラム陰性細菌を含む
全ての生細胞の検出方法を提供すること。 【解決手段】 細胞を含む媒体をカルシウムイオンの存
在下で蛍光性酵素基質により染色し、蛍光を測定するこ
とを特徴とする生細胞の検出方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生細胞の検出方法に
関し、さらに詳しくはカルシウムイオンの存在下で蛍光
性酵素基質により細胞を含む媒体を染色することにより
生細胞を特異的に検出する方法に関する。本発明はま
た、上記方法で使用するための試薬キット、並びに上記
方法を実施するための生細胞検出装置にも関する。
関し、さらに詳しくはカルシウムイオンの存在下で蛍光
性酵素基質により細胞を含む媒体を染色することにより
生細胞を特異的に検出する方法に関する。本発明はま
た、上記方法で使用するための試薬キット、並びに上記
方法を実施するための生細胞検出装置にも関する。
【０００２】
【従来の技術】媒体中における生細胞の検出は、滅菌状
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出する上で非常
に重要な手段の一つである。生細胞を特異的に検出する
方法としては、生体染色法（Darzynkiewicz,Z. etal.,
Experimental Cell Research,95,143-153(1975)）や、
蛍光性酵素基質または色素を媒体に添加し、媒体中に存
在する細胞内で発せられる蛍光を測定する方法（Lundgr
en,B et al.,Oikos,36,17-22(1981)）が知られている。
また、発明者らは特開平１０−１７９１９１号公報に
て、生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質に変化し得る蛍
光性酵素基質を媒体に添加し、検出を該蛍光物質のｐＨ
に適した励起光を照射して行うことを特徴とする生細胞
の検出方法や、特開平１０−２１５８９４号公報にて、
蛍光性酵素基質を媒体に添加し、その蛍光画像を記録し
た後、この染色された媒体を光照射により光退色させ、
その蛍光画像を記録し、光退色前の画像との差画像を取
ることを特徴とする生細胞の検出方法を開示している。
しかしこれらのいずれの方法によっても対数増殖期にあ
るグラム陰性細菌については染色することができず、検
出が不可能であった。
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出する上で非常
に重要な手段の一つである。生細胞を特異的に検出する
方法としては、生体染色法（Darzynkiewicz,Z. etal.,
Experimental Cell Research,95,143-153(1975)）や、
蛍光性酵素基質または色素を媒体に添加し、媒体中に存
在する細胞内で発せられる蛍光を測定する方法（Lundgr
en,B et al.,Oikos,36,17-22(1981)）が知られている。
また、発明者らは特開平１０−１７９１９１号公報に
て、生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質に変化し得る蛍
光性酵素基質を媒体に添加し、検出を該蛍光物質のｐＨ
に適した励起光を照射して行うことを特徴とする生細胞
の検出方法や、特開平１０−２１５８９４号公報にて、
蛍光性酵素基質を媒体に添加し、その蛍光画像を記録し
た後、この染色された媒体を光照射により光退色させ、
その蛍光画像を記録し、光退色前の画像との差画像を取
ることを特徴とする生細胞の検出方法を開示している。
しかしこれらのいずれの方法によっても対数増殖期にあ
るグラム陰性細菌については染色することができず、検
出が不可能であった。
【０００３】対数増殖期のグラム陰性細菌が染色可能に
なることは、例えば食品中に含まれる大腸菌等の微生物
検出、下水処理場における活性汚泥中の微生物検査、上
水を取水する河川や湖の微生物検査、２４時間風呂の微
生物検査、及び抗菌剤の品質管理等、従来染色方法によ
るリアルタイム検査が不可能でった分野において感度の
よいリアルタイム検査が可能になることを意味する。
なることは、例えば食品中に含まれる大腸菌等の微生物
検出、下水処理場における活性汚泥中の微生物検査、上
水を取水する河川や湖の微生物検査、２４時間風呂の微
生物検査、及び抗菌剤の品質管理等、従来染色方法によ
るリアルタイム検査が不可能でった分野において感度の
よいリアルタイム検査が可能になることを意味する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、従来の生細胞の検出方法における
欠点である対数増殖期にあるグラム陰性細菌を染色でき
ないことを解消し、対数増殖期にあるグラム陰性細菌を
含む全ての生細胞の検出方法を提供することを解決すべ
き課題とした。
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、従来の生細胞の検出方法における
欠点である対数増殖期にあるグラム陰性細菌を染色でき
ないことを解消し、対数増殖期にあるグラム陰性細菌を
含む全ての生細胞の検出方法を提供することを解決すべ
き課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、対数増殖期にある大
腸菌に５−カルボキシフルオレセインジアセテート又は
５−スルホフルオレセインジアセテートを添加し染色す
る際に、カルシウム塩を添加すると、該細菌が非常によ
く染色され感度良く検出し得ることを発見し、本発明を
完成するに至った。
解決するために鋭意検討した結果、対数増殖期にある大
腸菌に５−カルボキシフルオレセインジアセテート又は
５−スルホフルオレセインジアセテートを添加し染色す
る際に、カルシウム塩を添加すると、該細菌が非常によ
く染色され感度良く検出し得ることを発見し、本発明を
完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の第１の態様によれば、細胞
を含む媒体をカルシウムイオンの存在下で蛍光性酵素基
質により染色し、蛍光を測定することを特徴とする生細
胞の検出方法が提供される。
を含む媒体をカルシウムイオンの存在下で蛍光性酵素基
質により染色し、蛍光を測定することを特徴とする生細
胞の検出方法が提供される。
【０００７】本発明の第２の態様によれば、（ａ）蛍光
性酵素基質及びカルシウム塩を含有する試薬、又は
（ｂ）蛍光性酵素基質を含有する試薬とカルシウム塩を
含有する試薬の組み合わせの何れかを含む、本発明によ
る生細胞の検出方法に使用するための試薬キットが提供
される。
性酵素基質及びカルシウム塩を含有する試薬、又は
（ｂ）蛍光性酵素基質を含有する試薬とカルシウム塩を
含有する試薬の組み合わせの何れかを含む、本発明によ
る生細胞の検出方法に使用するための試薬キットが提供
される。
【０００８】本発明の第３の態様によれば、少なくと
も、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光
性酵素基質とカルシウム塩とを該媒体に添加する手段、
及び（ｃ）染色された媒体の蛍光強度を測定する手段を
有することを特徴とする生細胞検出装置が提供される。
も、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光
性酵素基質とカルシウム塩とを該媒体に添加する手段、
及び（ｃ）染色された媒体の蛍光強度を測定する手段を
有することを特徴とする生細胞検出装置が提供される。
【０００９】好ましくは、蛍光性酵素基質は、細胞膜を
透過でき、且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合
物である。好ましくは、蛍光性酵素基質は、５−カルボ
キシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエス
テル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテ
ート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−
５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチ
ルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセ
テート、フルオレセインジアセテート、カルサインアセ
トキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセイ
ンジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレ
セイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群
から選択される化合物である。好ましくは、生細胞は対
数増殖期のグラム陰性細菌である。
透過でき、且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合
物である。好ましくは、蛍光性酵素基質は、５−カルボ
キシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエス
テル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテ
ート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−
５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチ
ルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセ
テート、フルオレセインジアセテート、カルサインアセ
トキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセイ
ンジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレ
セイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群
から選択される化合物である。好ましくは、生細胞は対
数増殖期のグラム陰性細菌である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法および実
施態様について詳細に説明する。本発明は、細胞を含む
媒体を蛍光性酵素基質により染色し、蛍光を測定するこ
とを含む生細胞の検出方法に関するものであり、本発明
の方法では、カルシウムイオンの存在下で細胞を含む媒
体を蛍光性酵素基質により染色することを特徴とするも
のである。このようにカルシウムイオンの存在下で染色
を行うことにより任意の媒体中における生細胞を、感度
よく、簡便にリアルタイムで検出することが可能にな
り、特に従来染色方法では検出不可能であった対数増殖
期にあるグラム陰性菌を検出することが可能になった。
施態様について詳細に説明する。本発明は、細胞を含む
媒体を蛍光性酵素基質により染色し、蛍光を測定するこ
とを含む生細胞の検出方法に関するものであり、本発明
の方法では、カルシウムイオンの存在下で細胞を含む媒
体を蛍光性酵素基質により染色することを特徴とするも
のである。このようにカルシウムイオンの存在下で染色
を行うことにより任意の媒体中における生細胞を、感度
よく、簡便にリアルタイムで検出することが可能にな
り、特に従来染色方法では検出不可能であった対数増殖
期にあるグラム陰性菌を検出することが可能になった。
【００１１】本発明において用いられる蛍光性酵素基質
としては、単独では蛍光を発しないが、生細胞内でエス
テラーゼ等の生体内酵素の作用により蛍光を発する物質
（蛍光性物質）に変化し得る化合物であって、かつ細胞
膜を透過しやすい物質であればいかなるものであっても
よい。蛍光性酵素基質の具体例としては以下のものが挙
げられるがこれらに限定されるものではない。
としては、単独では蛍光を発しないが、生細胞内でエス
テラーゼ等の生体内酵素の作用により蛍光を発する物質
（蛍光性物質）に変化し得る化合物であって、かつ細胞
膜を透過しやすい物質であればいかなるものであっても
よい。蛍光性酵素基質の具体例としては以下のものが挙
げられるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】５−カルボキシフルオレセインジアセテー
トアセトキシメチルエステル（5-carboxyfluorescein d
iacetate acetoxymethyl ester；以下、「ＣＦＤＡ−Ａ
Ｍ」と称することがある。）；５−（６−）カルボキシ
フルオレセインジアセテート（5-(and-6)carboxyfluore
scein diacetate；以下、「ＣＦＤＡ」と称することが
ある。）；２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチ
ル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキ
シメチルエステル（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(an
d-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester；以
下、「ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：１」と称することがあ
る。）；５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト（5-(and6-)sulfofluorescein diacetate；以下、
「ＳＦＤＡ」と称することがある。）；フルオレセイン
ジサセテート（fluorescein diacetate；以下、「ＦＤ
Ａ」と称することがある。）；カルサインアセトキシメ
チルエステル（calcein acetoxymethyl ester；以下、
「Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ」と称することがある。）；５
−クロロメチルフルオレセインジアセテート（5-chloro
methylfluoresceindiacetate；以下、「ＣＭＦＤＡ」と
称することがある。）；及び５−（６−）カルボキシフ
ルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル（5-
(and 6-)carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl
ester；以下、「ＣＦＤＡ−ＳＥ」と称することがあ
る。）；及びフルオレセイン−５−カルボニルアジドジ
アセテート（fluorescein-5-carbonylazide diacetat
e；以下、「ＣＦＤＡ azide」と称することがあ
る。）：
トアセトキシメチルエステル（5-carboxyfluorescein d
iacetate acetoxymethyl ester；以下、「ＣＦＤＡ−Ａ
Ｍ」と称することがある。）；５−（６−）カルボキシ
フルオレセインジアセテート（5-(and-6)carboxyfluore
scein diacetate；以下、「ＣＦＤＡ」と称することが
ある。）；２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチ
ル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキ
シメチルエステル（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(an
d-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester；以
下、「ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：１」と称することがあ
る。）；５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト（5-(and6-)sulfofluorescein diacetate；以下、
「ＳＦＤＡ」と称することがある。）；フルオレセイン
ジサセテート（fluorescein diacetate；以下、「ＦＤ
Ａ」と称することがある。）；カルサインアセトキシメ
チルエステル（calcein acetoxymethyl ester；以下、
「Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ」と称することがある。）；５
−クロロメチルフルオレセインジアセテート（5-chloro
methylfluoresceindiacetate；以下、「ＣＭＦＤＡ」と
称することがある。）；及び５−（６−）カルボキシフ
ルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル（5-
(and 6-)carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl
ester；以下、「ＣＦＤＡ−ＳＥ」と称することがあ
る。）；及びフルオレセイン−５−カルボニルアジドジ
アセテート（fluorescein-5-carbonylazide diacetat
e；以下、「ＣＦＤＡ azide」と称することがあ
る。）：
【００１３】これらの化合物はいずれも既知の化合物で
あり、市販されている。これらのうち、ＣＦＤＡあるい
はＳＦＤＡが特に望ましい。
あり、市販されている。これらのうち、ＣＦＤＡあるい
はＳＦＤＡが特に望ましい。
【００１４】上記の蛍光性酵素基質はそれ自体単独で使
用することもできるが、複数のものを組み合わせて使用
することもできる。蛍光性酵素基質は一般に水に難溶性
であるので、媒体が水性である場合には、蛍光性酵素基
質を溶媒に溶解した後、媒体に添加することにより行え
ばよい。媒体が固体の場合にも、同様に溶媒に蛍光性酵
素基質を溶解し、媒体に添加することによって行えばよ
い。蛍光性酵素基質を溶解する溶媒としては、通常アセ
トン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノー
ル、水等を用いる。これらの溶媒は検出しようとする生
細胞中の酵素を失活させたり、細胞自体にダメージを与
えないものが望ましい。また、必要に応じて非イオン性
界面活性剤を用いて溶解してもよい。このような溶媒に
溶かした後、媒体を染色するのに適当な濃度に水あるい
は通常生化学的に用いられる適当な緩衝液を用いて調製
する。
用することもできるが、複数のものを組み合わせて使用
することもできる。蛍光性酵素基質は一般に水に難溶性
であるので、媒体が水性である場合には、蛍光性酵素基
質を溶媒に溶解した後、媒体に添加することにより行え
ばよい。媒体が固体の場合にも、同様に溶媒に蛍光性酵
素基質を溶解し、媒体に添加することによって行えばよ
い。蛍光性酵素基質を溶解する溶媒としては、通常アセ
トン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノー
ル、水等を用いる。これらの溶媒は検出しようとする生
細胞中の酵素を失活させたり、細胞自体にダメージを与
えないものが望ましい。また、必要に応じて非イオン性
界面活性剤を用いて溶解してもよい。このような溶媒に
溶かした後、媒体を染色するのに適当な濃度に水あるい
は通常生化学的に用いられる適当な緩衝液を用いて調製
する。
【００１５】本発明の方法では、細胞を含む媒体をカル
シウムイオンの存在下で染色することを特徴とする。カ
ルシウムイオンは通常、カルシウム塩を含む溶液の形で
供給される。本発明で用いられるカルシウム塩として
は、水溶性でありカルシウムイオンを産生するものであ
ればいかなるものであってもよい。具体的には例えば、
塩化カルシウム、硝酸カルシウム等を用いることができ
るが、このうち塩化カルシウムが好ましく用いられる。
シウムイオンの存在下で染色することを特徴とする。カ
ルシウムイオンは通常、カルシウム塩を含む溶液の形で
供給される。本発明で用いられるカルシウム塩として
は、水溶性でありカルシウムイオンを産生するものであ
ればいかなるものであってもよい。具体的には例えば、
塩化カルシウム、硝酸カルシウム等を用いることができ
るが、このうち塩化カルシウムが好ましく用いられる。
【００１６】カルシウム塩は、水あるいは適当な通常生
化学的に用いられる緩衝液に適当な濃度に溶解して用い
ても、また上記蛍光性酵素基質とともに溶液として調製
してもよい。即ち、本発明の方法では、蛍光性酵素基質
を含有する染色液とカルシウム塩を含有する液を別々に
調製し、それらを別個に細胞を含む媒体に添加してもよ
いし、あるいは蛍光性酵素基質及びカルシウム塩を含有
する溶液（以下、染色液とも称する）を調製し、これを
細胞を含む媒体に添加してもよい。
化学的に用いられる緩衝液に適当な濃度に溶解して用い
ても、また上記蛍光性酵素基質とともに溶液として調製
してもよい。即ち、本発明の方法では、蛍光性酵素基質
を含有する染色液とカルシウム塩を含有する液を別々に
調製し、それらを別個に細胞を含む媒体に添加してもよ
いし、あるいは蛍光性酵素基質及びカルシウム塩を含有
する溶液（以下、染色液とも称する）を調製し、これを
細胞を含む媒体に添加してもよい。
【００１７】本発明の方法で検出する生細胞としては、
バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生物、カイコ
のＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 77, 4216, (1980)）、ＣＯＳ−７細胞（Ａ
ＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）等の哺乳動物由来の細胞等が
挙げられるが、これらに限定されるものではなく、いず
れの細胞でもよい。対数増殖期にあるグラム陰性細菌は
本方法にのみ染色される。生細胞を検出しようとする媒
体としては、土壌、砂、サンプリングテープ等固体の媒
体、水、培養液、酒等の液体の媒体、寒天、ゲル等の半
固体やそれらの混合物等が挙げられる。
バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生物、カイコ
のＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 77, 4216, (1980)）、ＣＯＳ−７細胞（Ａ
ＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）等の哺乳動物由来の細胞等が
挙げられるが、これらに限定されるものではなく、いず
れの細胞でもよい。対数増殖期にあるグラム陰性細菌は
本方法にのみ染色される。生細胞を検出しようとする媒
体としては、土壌、砂、サンプリングテープ等固体の媒
体、水、培養液、酒等の液体の媒体、寒天、ゲル等の半
固体やそれらの混合物等が挙げられる。
【００１８】本発明で使用する蛍光性酵素基質及びカル
シウム塩（カルシウムイオン）を媒体に添加する方法と
しては、媒体に応じて適宜行えばよい。媒体の調製方法
としては、土壌のような固体媒体を染色しようとする場
合には、土壌そのままでも、水あるいは通常生化学的に
用いられる適当な緩衝液等に懸濁したものに、蛍光性酵
素基質及びカルシウム塩を含有する染色液、又は蛍光性
酵素基質を含有する溶液とカルシウム塩を含有する溶液
を添加すればよい。土質によっては、蛍光性酵素基質が
土の触媒作用により非生物的に分解して背景光が強くな
る場合があるが、この場合は、１〜２回水あるいは適当
な緩衝液等により洗浄する操作を加えると効果的であ
る。また食品等の固体を媒体とする場合には、ホモゲナ
イザー等を用いて摩砕した後に水また通常生化学的に用
いられる適当な緩衝液等で薄めたものを用いることがで
きる。
シウム塩（カルシウムイオン）を媒体に添加する方法と
しては、媒体に応じて適宜行えばよい。媒体の調製方法
としては、土壌のような固体媒体を染色しようとする場
合には、土壌そのままでも、水あるいは通常生化学的に
用いられる適当な緩衝液等に懸濁したものに、蛍光性酵
素基質及びカルシウム塩を含有する染色液、又は蛍光性
酵素基質を含有する溶液とカルシウム塩を含有する溶液
を添加すればよい。土質によっては、蛍光性酵素基質が
土の触媒作用により非生物的に分解して背景光が強くな
る場合があるが、この場合は、１〜２回水あるいは適当
な緩衝液等により洗浄する操作を加えると効果的であ
る。また食品等の固体を媒体とする場合には、ホモゲナ
イザー等を用いて摩砕した後に水また通常生化学的に用
いられる適当な緩衝液等で薄めたものを用いることがで
きる。
【００１９】液体媒体については、上記した蛍光性酵素
基質及びカルシウム塩を含有する染色液、又は蛍光性酵
素基質を含有する溶液とカルシウム塩を含有する溶液を
液体媒体に添加すればよい。また、細胞密度が低い場合
等は遠心分離法等を用いて濃縮を行うとよい。
基質及びカルシウム塩を含有する染色液、又は蛍光性酵
素基質を含有する溶液とカルシウム塩を含有する溶液を
液体媒体に添加すればよい。また、細胞密度が低い場合
等は遠心分離法等を用いて濃縮を行うとよい。
【００２０】蛍光性酵素基質の媒体への添加量として
は、媒体が十分に染色される量であれば特に制限はない
が、通常媒体中で最終濃度が１μＭ〜１ｍＭ、より好ま
しくはＳＦＤＡの場合は５０μＭ〜１ｍＭ、その他の蛍
光性基質では１μＭ〜０．５ｍMとなるように調製し、
添加するのが適当である。色素濃度が低すぎると、蛍光
強度の絶対値が低下し検出に不適当になってしまう。ま
た、色素濃度が高すぎても色素が不溶化して沈殿した
り、細胞外部の蛍光物質による背景光が強く細胞からの
蛍光が隠されてしまうために検出効率が下がる傾向があ
るため、ふさわしくない。染色液と媒体との混合比は、
特に制限されない。
は、媒体が十分に染色される量であれば特に制限はない
が、通常媒体中で最終濃度が１μＭ〜１ｍＭ、より好ま
しくはＳＦＤＡの場合は５０μＭ〜１ｍＭ、その他の蛍
光性基質では１μＭ〜０．５ｍMとなるように調製し、
添加するのが適当である。色素濃度が低すぎると、蛍光
強度の絶対値が低下し検出に不適当になってしまう。ま
た、色素濃度が高すぎても色素が不溶化して沈殿した
り、細胞外部の蛍光物質による背景光が強く細胞からの
蛍光が隠されてしまうために検出効率が下がる傾向があ
るため、ふさわしくない。染色液と媒体との混合比は、
特に制限されない。
【００２１】カルシウム塩の媒体への添加量としてはと
もに用いる蛍光性酵素基質及び細胞の種類によって適当
な濃度は異なるが、一般的に添加するカルシウム塩の濃
度が高いほど細胞の蛍光強度は増強する傾向がある。具
体的には塩化カルシウム水溶液とＳＦＤＡを大腸菌に添
加した場合には、媒体最終濃度が５０μＭ〜１ｍＭ程度
となるようにするのが好ましい。
もに用いる蛍光性酵素基質及び細胞の種類によって適当
な濃度は異なるが、一般的に添加するカルシウム塩の濃
度が高いほど細胞の蛍光強度は増強する傾向がある。具
体的には塩化カルシウム水溶液とＳＦＤＡを大腸菌に添
加した場合には、媒体最終濃度が５０μＭ〜１ｍＭ程度
となるようにするのが好ましい。
【００２２】媒体への蛍光性酵素基質あるいはカルシウ
ム塩の添加の順番は特に限定されない。蛍光性酵素基質
の媒体への添加の前後の適当な時間にカルシウム塩を添
加してもよいし、蛍光性酵素基質とカルシウム塩を共に
含有する溶液（好ましくは水溶液）とし、媒体に同時に
添加してもよい。
ム塩の添加の順番は特に限定されない。蛍光性酵素基質
の媒体への添加の前後の適当な時間にカルシウム塩を添
加してもよいし、蛍光性酵素基質とカルシウム塩を共に
含有する溶液（好ましくは水溶液）とし、媒体に同時に
添加してもよい。
【００２３】上記、媒体の染色操作は、媒体をスライド
グラスとカバーグラスに挟むか、ホールスライドグラス
に入れてカバーグラスで密閉した状態で行ったり、適当
な容器、例えばプラスチック容器等の中で染色操作を行
った後に、スライドグラスとカバーグラスに挟み蛍光の
測定に供される。
グラスとカバーグラスに挟むか、ホールスライドグラス
に入れてカバーグラスで密閉した状態で行ったり、適当
な容器、例えばプラスチック容器等の中で染色操作を行
った後に、スライドグラスとカバーグラスに挟み蛍光の
測定に供される。
【００２４】蛍光測定の方法としては、特に制限されな
いが、例えば蛍光顕微鏡等のもとで誘導した発光に適し
た励起光を媒体に照射し、発せられる蛍光強度を冷却Ｃ
ＣＤ等の検出機を用い測定する方法等が用いられる。照
射される励起光源としては、蛍光顕微鏡の光源として一
般的に知られているものを用いることができるが、具体
的には超高圧水銀灯やＡｒ+レーザー等を用いることが
できるが、蛍光性酵素基質にＣＦＤＡを用い、生成する
カルボキシフルオレセインを励起する場合には、特にＡ
ｒ+レーザーが好ましい。かくして得られた蛍光の検出
値をマイクロコンピューター等を用いた画像処理システ
ムにより画像化することによっても生細胞の特異的かつ
リアルタイムな検出が可能である。
いが、例えば蛍光顕微鏡等のもとで誘導した発光に適し
た励起光を媒体に照射し、発せられる蛍光強度を冷却Ｃ
ＣＤ等の検出機を用い測定する方法等が用いられる。照
射される励起光源としては、蛍光顕微鏡の光源として一
般的に知られているものを用いることができるが、具体
的には超高圧水銀灯やＡｒ+レーザー等を用いることが
できるが、蛍光性酵素基質にＣＦＤＡを用い、生成する
カルボキシフルオレセインを励起する場合には、特にＡ
ｒ+レーザーが好ましい。かくして得られた蛍光の検出
値をマイクロコンピューター等を用いた画像処理システ
ムにより画像化することによっても生細胞の特異的かつ
リアルタイムな検出が可能である。
【００２５】本発明の生細胞の検出方法における操作手
順は特に制限はないが、例えば以下のようにして行うこ
とができる。 （１）媒体を染色液の添加にふさわしい状態に調製す
る。例えば媒体が水等で細胞の密度が低い場合には遠心
分離法等を用いて濃縮しておく。 （２）蛍光性酵素基質及びカルシウム塩を適当な溶媒に
溶解し、さらに適当な緩衝液に溶かし染色液を調製す
る。 （３）上記（１）の媒体と（２）の染色液を混ぜ、適当
時間反応させ染色を行う。 （４）上記（３）の媒体をスライドグラスとカバーグラ
スに挟む。 （５）蛍光顕微鏡下で適当な励起光を照射し、生細胞を
検出する。
順は特に制限はないが、例えば以下のようにして行うこ
とができる。 （１）媒体を染色液の添加にふさわしい状態に調製す
る。例えば媒体が水等で細胞の密度が低い場合には遠心
分離法等を用いて濃縮しておく。 （２）蛍光性酵素基質及びカルシウム塩を適当な溶媒に
溶解し、さらに適当な緩衝液に溶かし染色液を調製す
る。 （３）上記（１）の媒体と（２）の染色液を混ぜ、適当
時間反応させ染色を行う。 （４）上記（３）の媒体をスライドグラスとカバーグラ
スに挟む。 （５）蛍光顕微鏡下で適当な励起光を照射し、生細胞を
検出する。
【００２６】本発明は、（ａ）蛍光性酵素基質及びカル
シウム塩を含有する試薬、又は（ｂ）蛍光性酵素基質を
含有する試薬とカルシウム塩を含有する試薬の組み合わ
せの何れかを含む、上記した本発明による生細胞の検出
方法に使用するための試薬キットにも関する。本発明の
試薬キットは、上記した生細胞の検出方法に基づいて、
それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製する
ことができる。
シウム塩を含有する試薬、又は（ｂ）蛍光性酵素基質を
含有する試薬とカルシウム塩を含有する試薬の組み合わ
せの何れかを含む、上記した本発明による生細胞の検出
方法に使用するための試薬キットにも関する。本発明の
試薬キットは、上記した生細胞の検出方法に基づいて、
それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製する
ことができる。
【００２７】蛍光性酵素基質を含有する試薬は、先ず蛍
光性酵素基質を溶媒に溶解することにより調製すること
ができる。蛍光性酵素基質を溶解する溶媒としては、通
常アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタ
ノール、水等を用いる。これらの溶媒は検出しようとす
る生細胞中の酵素を失活させたり、細胞自体にダメージ
を与えないものが望ましい。また、必要に応じて非イオ
ン性界面活性剤を用いて溶解してもよい。このような溶
媒に溶かした後、媒体を染色するのに適当な濃度に水あ
るいは通常生化学的に用いられる適当な緩衝液を用いて
調製することができる。キットに含める試薬としては、
固体状態の蛍光性酵素基質でもよいし、上記したような
溶媒に溶解させた蛍光性酵素基質でもよい。
光性酵素基質を溶媒に溶解することにより調製すること
ができる。蛍光性酵素基質を溶解する溶媒としては、通
常アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタ
ノール、水等を用いる。これらの溶媒は検出しようとす
る生細胞中の酵素を失活させたり、細胞自体にダメージ
を与えないものが望ましい。また、必要に応じて非イオ
ン性界面活性剤を用いて溶解してもよい。このような溶
媒に溶かした後、媒体を染色するのに適当な濃度に水あ
るいは通常生化学的に用いられる適当な緩衝液を用いて
調製することができる。キットに含める試薬としては、
固体状態の蛍光性酵素基質でもよいし、上記したような
溶媒に溶解させた蛍光性酵素基質でもよい。
【００２８】カルシウム塩を含有する試薬は、通常、水
あるいは適当な通常生化学的に用いられる緩衝液に適当
な濃度に溶解して調製することができる。上記した蛍光
性酵素基質とともに溶液として調製してもよい。
あるいは適当な通常生化学的に用いられる緩衝液に適当
な濃度に溶解して調製することができる。上記した蛍光
性酵素基質とともに溶液として調製してもよい。
【００２９】本発明はさらに、少なくとも、（ａ）細胞
を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質とカ
ルシウム塩とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色
された媒体の蛍光強度を測定する手段を有することを特
徴とする生細胞検出装置にも関する。本発明の生細胞検
出装置は、本発明による生細胞の検出方法を実施するの
に十分な手段（具体的には、少なくとも、（ａ）細胞を
含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質とカル
シウム塩とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色さ
れた媒体の蛍光強度を測定する手段）を有するものであ
ればいかなるものでもよい。
を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質とカ
ルシウム塩とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色
された媒体の蛍光強度を測定する手段を有することを特
徴とする生細胞検出装置にも関する。本発明の生細胞検
出装置は、本発明による生細胞の検出方法を実施するの
に十分な手段（具体的には、少なくとも、（ａ）細胞を
含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質とカル
シウム塩とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色さ
れた媒体の蛍光強度を測定する手段）を有するものであ
ればいかなるものでもよい。
【００３０】細胞を含む媒体を保持する手段とは、媒体
が水や水に懸濁された固体の場合にはホールスライドグ
ラス等、又物体の表面に付着した微生物等を検索する場
合にはこれを付着するためのテープ及びそれを保持する
ためのスライドグラス等が挙げられる。
が水や水に懸濁された固体の場合にはホールスライドグ
ラス等、又物体の表面に付着した微生物等を検索する場
合にはこれを付着するためのテープ及びそれを保持する
ためのスライドグラス等が挙げられる。
【００３１】蛍光性酵素基質とカルシウム塩とを該媒体
に添加する手段とは、上記したように保持された媒体に
蛍光性酵素基質とカルシウム塩とを添加することができ
るものであれば特に制限されないが、通常は、蛍光性酵
素基質及びカルシウム塩を含有する試薬を収容するため
の容器、あるいは蛍光性酵素基質を含有する試薬とカル
シウム塩を含有する試薬とを各々別個に収容するための
少なくとも２つの容器と、該容器から保持手段に液を滴
下するための装置とを有する。
に添加する手段とは、上記したように保持された媒体に
蛍光性酵素基質とカルシウム塩とを添加することができ
るものであれば特に制限されないが、通常は、蛍光性酵
素基質及びカルシウム塩を含有する試薬を収容するため
の容器、あるいは蛍光性酵素基質を含有する試薬とカル
シウム塩を含有する試薬とを各々別個に収容するための
少なくとも２つの容器と、該容器から保持手段に液を滴
下するための装置とを有する。
【００３２】染色された媒体の蛍光又は色素を検出又は
測定する手段とは、蛍光顕微鏡が挙げられ、蛍光強度を
測定する装置や励起光を照射する装置などが付属された
蛍光顕微鏡が好ましい。さらに、得られた蛍光の検出値
を画像化するためのマイクロコンピューター等を用いた
画像処理システムを使用してもよい。以下の実施例によ
り本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例
によって限定されるものではない。
測定する手段とは、蛍光顕微鏡が挙げられ、蛍光強度を
測定する装置や励起光を照射する装置などが付属された
蛍光顕微鏡が好ましい。さらに、得られた蛍光の検出値
を画像化するためのマイクロコンピューター等を用いた
画像処理システムを使用してもよい。以下の実施例によ
り本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例
によって限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】実施例１ （Ａ）対数増殖期にある大腸菌の培養液の染色 大腸菌（Escherichia coli；ＡＴＣＣ１１７７５）をＬ
Ｂブロス培地（１％バクトトリプトン、０．０５％イー
ストエキストラクト，０．０５％塩化ナトリウム）に埴
菌し、３７℃にて１時間培養を行った。培養液は３００
０×ｇで１０分間室温にて遠心分離した後、沈殿を純水
で洗浄する作業を３回繰り返した。沈殿をそれぞれカル
シウム塩濃度の異なるＢＴＰ緩衝液（２０ｍＭビストリ
スプロパン（ｐＨ６．０）、０、１０、１００、２０
０、４００、８００ｍＭ塩化カルシウム）１００μｌに
懸濁した。また対照として、上記培養液をパラホルムア
ルデヒド（最終濃度：３％）にて１晩固定した死菌液を
調製し、カルシウム塩濃度８００ｍＭのＢＴＰ緩衝液１
００μｌに懸濁した。
Ｂブロス培地（１％バクトトリプトン、０．０５％イー
ストエキストラクト，０．０５％塩化ナトリウム）に埴
菌し、３７℃にて１時間培養を行った。培養液は３００
０×ｇで１０分間室温にて遠心分離した後、沈殿を純水
で洗浄する作業を３回繰り返した。沈殿をそれぞれカル
シウム塩濃度の異なるＢＴＰ緩衝液（２０ｍＭビストリ
スプロパン（ｐＨ６．０）、０、１０、１００、２０
０、４００、８００ｍＭ塩化カルシウム）１００μｌに
懸濁した。また対照として、上記培養液をパラホルムア
ルデヒド（最終濃度：３％）にて１晩固定した死菌液を
調製し、カルシウム塩濃度８００ｍＭのＢＴＰ緩衝液１
００μｌに懸濁した。
【００３４】蛍光性酵素基質としてＳＦＤＡ及びＣＦＤ
Ａをジメチルスルホキシドに５０ｍＭの濃度となるよう
に溶解した。上記で調製した菌体液、及び死菌体液をマ
イクロチューブに入れ、それぞれ１μｌのＳＦＤＡ溶液
及びＣＦＤＡ溶液を添加した。９０分間室温にて静置し
た後に、３０００×ｇ、１０分間、室温にて遠心し、沈
殿を純水に懸濁し、これを直径８ｍｍ、深さ１ｍｍの円
柱形のホールを持つスライドグラス（池田理化社製）に
のせ、カバーグラス（Matsunami Glass社製）で密封し
た。
Ａをジメチルスルホキシドに５０ｍＭの濃度となるよう
に溶解した。上記で調製した菌体液、及び死菌体液をマ
イクロチューブに入れ、それぞれ１μｌのＳＦＤＡ溶液
及びＣＦＤＡ溶液を添加した。９０分間室温にて静置し
た後に、３０００×ｇ、１０分間、室温にて遠心し、沈
殿を純水に懸濁し、これを直径８ｍｍ、深さ１ｍｍの円
柱形のホールを持つスライドグラス（池田理化社製）に
のせ、カバーグラス（Matsunami Glass社製）で密封し
た。
【００３５】（Ｂ）蛍光の測定及び生細胞の検出 生細胞の検出は、倒立蛍光顕微鏡（Zeiss社製：Axiover
t）下、微分干渉で細胞数を計測した後に、フィルター
（中心波長４９０ｎｍ、半値幅１０ｎｍ：オメガ社製）
を励起フィルターに用いたＢ励起を照射し、蛍光を発し
ている細胞を計測した。無蛍光の蛍光性酵素基質は、全
ての生細胞中に含まれるエステラーゼの活性により蛍光
性の色素（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎ
ｍ）に変化し観察が可能となる。その結果を図１に示
す。カルシウムイオン濃度が高くなるほど染色された細
胞の比率が上昇することが明らかになった。また、パラ
ホルムアルデヒドで固定化した死菌は染色されなかっ
た。以上の結果から、１）カルシウムイオンの存在によ
って染色細胞数が増加する、２）本発明の染色方法によ
ると対数増殖期にあるグラム陰性菌の生細胞が染色され
る、ことが明らかとなった。
t）下、微分干渉で細胞数を計測した後に、フィルター
（中心波長４９０ｎｍ、半値幅１０ｎｍ：オメガ社製）
を励起フィルターに用いたＢ励起を照射し、蛍光を発し
ている細胞を計測した。無蛍光の蛍光性酵素基質は、全
ての生細胞中に含まれるエステラーゼの活性により蛍光
性の色素（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎ
ｍ）に変化し観察が可能となる。その結果を図１に示
す。カルシウムイオン濃度が高くなるほど染色された細
胞の比率が上昇することが明らかになった。また、パラ
ホルムアルデヒドで固定化した死菌は染色されなかっ
た。以上の結果から、１）カルシウムイオンの存在によ
って染色細胞数が増加する、２）本発明の染色方法によ
ると対数増殖期にあるグラム陰性菌の生細胞が染色され
る、ことが明らかとなった。
【００３６】実施例２：各種細菌の染色 以下に示す各種細菌の細胞をＬＢブロス培地（バクトト
リプトン１％、イーストエキストラクト０．０５％、塩
化ナトリウム０．０５％）中、３０℃でE.coliは１時
間、その他の細菌は４時間培養した対数増殖期の細胞
と、E.coliは２時間、その他の細菌は８〜１５時間培養
した定常期の細胞を得た。培養物は遠心分離により細胞
を分離した後、純水で３回洗浄（遠心、１０分、３，０
００ｇ、室温）し菌液として用いた。１００μｌの２０
ｍＭ ＢＴＰ緩衝液（最終カルシウムイオン濃度：４０
０ｍＭ）に１μｌの５０ｍＭのＳＦＤＡ溶液と５μｌの
菌液を加えた。９０分後、蛍光顕微鏡で細胞を観察し
た。その結果、全ての菌種において、対数増殖期及び定
常期のどちらの細胞も明瞭に染色されていた。この結果
から、本染色法は多くの種類の細胞検出に有効であるこ
とが示された。
リプトン１％、イーストエキストラクト０．０５％、塩
化ナトリウム０．０５％）中、３０℃でE.coliは１時
間、その他の細菌は４時間培養した対数増殖期の細胞
と、E.coliは２時間、その他の細菌は８〜１５時間培養
した定常期の細胞を得た。培養物は遠心分離により細胞
を分離した後、純水で３回洗浄（遠心、１０分、３，０
００ｇ、室温）し菌液として用いた。１００μｌの２０
ｍＭ ＢＴＰ緩衝液（最終カルシウムイオン濃度：４０
０ｍＭ）に１μｌの５０ｍＭのＳＦＤＡ溶液と５μｌの
菌液を加えた。９０分後、蛍光顕微鏡で細胞を観察し
た。その結果、全ての菌種において、対数増殖期及び定
常期のどちらの細胞も明瞭に染色されていた。この結果
から、本染色法は多くの種類の細胞検出に有効であるこ
とが示された。
【００３７】実施例２で使用した細菌： （グラム陰性菌）Acinetobacter lwoffii (ATCC:15309)Agrobacterium radiobacter (IAM:12048)Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans (IAM:1
2684)Brevundimonas diminuta (JCM:2788)Comamonas testosteroni (ATCC:11996)Escherichila coli (ATCC:11775)Pseudomonas putida (ATCC:12633)Serratia marcescens (IFO:12648)
2684)Brevundimonas diminuta (JCM:2788)Comamonas testosteroni (ATCC:11996)Escherichila coli (ATCC:11775)Pseudomonas putida (ATCC:12633)Serratia marcescens (IFO:12648)
【００３８】（グラム陽性菌）Arthrobacter globiformis (IFO:12137)Corynebacterium glutamium (ATCC:13032)Rhodococcus rhodochrous (ATCC:13808)Bacillus subtilis (ATCC:6051)Micrococcus luteus (ATCC:9341)Staphylococcus aureus (ATCC:12600)
【００３９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、任意の媒体中に
おける生細胞を、感度よく、簡便にリアルタイムで検出
することができる。特に従来の染色方法では検出不可能
であった対数増殖期にあるグラム陰性菌が染色されるた
め、食品等の試料の場合に、本発明の方法は特に有効で
ある。
おける生細胞を、感度よく、簡便にリアルタイムで検出
することができる。特に従来の染色方法では検出不可能
であった対数増殖期にあるグラム陰性菌が染色されるた
め、食品等の試料の場合に、本発明の方法は特に有効で
ある。
【図１】図１は、 大腸菌染色時のカルシウムイオン濃
度と染色された細胞の数を示す図である。図中、斜線と
白抜きのグラフは、それぞれＳＦＤＡ及びＣＦＤＡによ
る染色を示し、対照として死菌を染色した結果を示し
た。ＳＦＤＡによる染色実験は３回行い、グラフには平
均と標準偏差を示した。
度と染色された細胞の数を示す図である。図中、斜線と
白抜きのグラフは、それぞれＳＦＤＡ及びＣＦＤＡによ
る染色を示し、対照として死菌を染色した結果を示し
た。ＳＦＤＡによる染色実験は３回行い、グラフには平
均と標準偏差を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｐ //(Ｃ１２Ｑ 1/06 (Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 吉村 義隆 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 河崎 行繁 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 辻 堯 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１丁目１番３号 通商産 業省 工業技術院 生命工学工業技術研究 所内 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA17 DA02 EA01 FA02 KA09 LA03 2G045 AA28 BB10 BB25 CB21 FA12 FA16 FB01 FB12 GC22 2G054 AA10 AB10 CA30 CE10 EA03 GB10 4B029 AA07 BB01 BB02 FA01 FA09 4B063 QA01 QQ05 QQ06 QQ08 QQ15 QQ16 QQ18 QQ19 QR50 QR58 QS36 QS39 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】 細胞を含む媒体をカルシウムイオンの存
在下で蛍光性酵素基質により染色し、蛍光を測定するこ
とを特徴とする生細胞の検出方法。 - 【請求項２】 蛍光性酵素基質が、細胞膜を透過でき、
且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合物である請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 蛍光性酵素基質が、５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５
−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、
２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−
（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエ
ステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト、フルオレセインジアセテート、カルサインアセトキ
シメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジ
アセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジ
アセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイ
ン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から
選択される化合物である請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 生細胞が対数増殖期のグラム陰性細菌で
ある、請求項１から３の何れかに記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）蛍光性酵素基質及びカルシウム塩
を含有する試薬、又は（ｂ）蛍光性酵素基質を含有する
試薬とカルシウム塩を含有する試薬の組み合わせの何れ
かを含む、請求項１から４の何れかに記載の生細胞の検
出方法に使用するための試薬キット。 - 【請求項６】 蛍光性酵素基質が、細胞膜を透過でき、
且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合物である請
求項５に記載の試薬キット。 - 【請求項７】 蛍光性酵素基質が、５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５
−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、
２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−
（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエ
ステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト、フルオレセインジアセテート、カルサインアセトキ
シメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジ
アセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジ
アセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイ
ン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から
選択される化合物である、請求項５又は６に記載の試薬
キット。 - 【請求項８】 生細胞が対数増殖期のグラム陰性細菌で
ある、請求項５から７の何れかに記載の試薬キット。 - 【請求項９】 少なくとも、（ａ）細胞を含む媒体を保
持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質とカルシウム塩とを
該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色された媒体の蛍
光強度を測定する手段を有することを特徴とする生細胞
検出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000222567A JP2002034595A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2000222567A JP2002034595A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034595A true JP2002034595A (ja) | 2002-02-05 |
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|---|---|---|---|
| JP2000222567A Pending JP2002034595A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
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| KR101343350B1 (ko) | 2012-05-04 | 2013-12-19 | 한국과학기술연구원 | 형광 화합물 패턴을 이용한 에스케리키아 콜라이 종 균주의 구별 방법 및 키트 |
| KR101343357B1 (ko) | 2012-05-04 | 2013-12-20 | 한국과학기술연구원 | ｙｏｇＡ 유전자로부터 발현되는 디히드로게나아제를 활용한 엔테로박터 클로아세 및 바실러스 서브틸리스의 구별 방법 |
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