Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

UA117223C2 - Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині - Google Patents

Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині Download PDF

Info

Publication number
UA117223C2
UA117223C2 UAA201500277A UAA201500277A UA117223C2 UA 117223 C2 UA117223 C2 UA 117223C2 UA A201500277 A UAA201500277 A UA A201500277A UA A201500277 A UAA201500277 A UA A201500277A UA 117223 C2 UA117223 C2 UA 117223C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
desaturase
acid
lipid
fatty acids
plant
Prior art date
Application number
UAA201500277A
Other languages
English (en)
Inventor
Джеймс Робертсон Петрі
Суріндер Пал Сінгх
Фейтер Роберт Чарльз Де
Original Assignee
Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн
Нусід Пті Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49756497&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA117223(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн, Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн, Нусід Пті Лтд filed Critical Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Publication of UA117223C2 publication Critical patent/UA117223C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/10—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • A01H1/101—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine or caffeine
    • A01H1/104—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine or caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/231—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having one or two double bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C07C57/03—Monocarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/02—Preparation of carboxylic acid esters by interreacting ester groups, i.e. transesterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/002—Sources of fatty acids, e.g. natural glycerides, characterised by the nature, the quantities or the distribution of said acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/003—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/06—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils with glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01075—Long-chain-alcohol O-fatty-acyltransferase (2.3.1.75)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Винахід стосується екстрагованого рослинного ліпіду, що містить дволанцюгові поліненасичені жирні кислоти в етерифікованій формі. Винахід також стосується способу одержання екстрагованого рослинного ліпіду, рослинної клітини, що містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують ферменти, які продукують дволанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенної рослини, макухи, способу одержання корму та способу лікування або попередження стану, при якому ПНЖК чинять сприятливу дію.

Description

(54) СПОСІБ ПРОДУКУВАННЯ ДОВГОЛАНЦЮГОВИХ ПОЛІНЕНАСИЧЕНИХ ЖИРНИХ КИСЛОТ У
РОСЛИННІЙ КЛІТИНІ
(57) Реферат:
Винахід стосується екстрагованого рослинного ліпіду, що містить дволанцюгові поліненасичені жирні кислоти в етерифікованій формі. Винахід також стосується способу одержання екстрагованого рослинного ліпіду, рослинної клітини, що містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують ферменти, які продукують дволанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенної рослини, макухи, способу одержання корму та способу лікування або попередження стану, при якому ПНЖК чинять сприятливу дію.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Цей винахід відноситься до способів синтезу довголанцюгових поліненасичених жирних кислот, особливо докозагексаєнової кислоти, в рекомбінантних рослинних клітинах.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Довголанцюгові омега-3 поліненасичені жирні кислоти (ДЛ-ПНЖК) на сьогоднішній день широко визнані як важливі сполуки для здоров'я людини і тварин. Вказані жирні кислоти можуть бути одержані з харчових джерелом або шляхом перетворення лінолевої (ЛК, 18:26) або а- ліноленової (АЛК, 18:3003) жирних кислот, обидві з яких розглядаються як незамінні жирні кислоти в раціоні людини. Хоча людина і багато інших хребетних тварин можуть перетворювати
ЛК або АЛК, одержані з рослинних джерел, на С22, вони здійснюють таке перетворення з дуже низькою швидкістю. Крім того, більшості сучасних суспільств властиве незбалансоване харчування, в якому щонайменше 90 95 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) складають об жирні кислоти, замість співвідношення 4:1 або менше для 0б:03 жирних кислот, яке вважається ідеальним (Тгацїмеїіїй, 2001). Безпосереднім харчовим джерелом ДЛ-ПНЖК, наприклад, ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:53) і докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:603) для людини, в основному, є риба або риб'ячий жир. Таким чином, медичні працівники рекомендують регулярно включати рибу до раціону людини, що містить значні рівні ДЛ-ПНЖК. Все частіше ДЛ-
ПНЖК, одержані з риб'ячого жиру, вводять, наприклад, в харчові продукти і дитяче харчування.
Однак за рахунок зменшення глобального і національного вилову риби, необхідні альтернативні джерела вказаних жирів, що проявляють позитивний вплив на здоров'я.
Квіткові рослини, на противагу тваринам, не володіють здатністю синтезувати поліненасичені жирні кислоти з довжиною ланцюга більше 18 атомів вуглецю. Зокрема, культивовані і садові рослини разом з іншими покритонасінними не мають ферментів, необхідних для синтезу 03 жирних кислот з довшим ланцюгом, наприклад, ЕПК, докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:53) і ДГК, одержаних з АЛК. Важливою метою в біотехнології рослин, таким чином, є створення культивованих рослин, що продукують значні кількості ДЛ-ПНЖК, таким чином забезпечуючи альтернативне джерело цих сполук.
Шляхи біосинтезу ДЛА-ПНЖК
Біосинтез ДЛ-ПНЖК в організмах, таких як мікроводорості, мохи і гриби, звичайно
Зо відбувається як серія реакцій кисень-залежної десатурації і елонгації (Фіг. 1). Найпоширеніший шлях одержання ЕПК у вказаних організмах включає Дб-десатурацію, Дб-елонгацію і Д5Ь- десатурацію (має назву шляху ДЛб-десатурації), тоді як в менш поширеному шляху використовується ЛОУ-елонгація, ДЛ8-десатурація і Д5-десатурація (має назву шляху ДЛо- десатурації). Вказані послідовні реакції десатурації і елонгації можуть починатися із субстрату б жирної кислоти ЛК, схематично проілюстрованого у верхній лівій частині Фіг. 1 (06) або субстрату 03 АЛК до ЕПК, проілюстрованого на нижній правій частині Фіг. 1 (03). Якщо початкова Дб-десатурація здійснюється на субстраті 06 ЛК, продукт серії із трьох ферментів
ДЛ-ПНЖК буде 06 жирною арахідоновою кислотою (АРК). Організми, які синтезують ДЛ-ПНЖК, можуть перетворювати 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти з використанням о03-десатурази, що проілюстровано як стадія А17-десатурази на Фіг. 1, для перетворення арахідонової кислоти (АРК, 20:406) на ЕПК. Деякі члени родини с3-десатурази можуть впливати на різні субстрати, що варіюють від ЛК до АРК. Рослинні 03-десатурази часто специфічно каталізують А15- десатурацію ЛК до АЛК, тоді як грибкові і дріжджові 3-десатурази можуть бути специфічними по відношенню до Л17-десатурації АРК до ЕПК (Регеїга еї аї., 2004а; 7апк еї аї., 2005). Деякі звіти наводять на думку про те, що можуть існувати неспецифічні Ф3-десатурази, які можуть перетворювати широкий спектр об субстратів на відповідні 03 продукти (2Папо еї аї., 2008).
Перетворення ЕПК на ДГК в таких організмах відбувається шляхом Д5-елонгації ЕПК з утворенням ДПК, після чого слідує Д4-десатурація з утворенням ДГК (Фіг. 1). І навпаки, ссавці використовують так званий шлях "Шпрехера", в якому ДПК перетворюється на ДГК в ході трьох окремих реакцій, незалежних від Л4-десатурази (Зргеспег еї а!., 1995).
Егопі-епа десатурази, загалом знайдені в рослинах, мохах, мікроводоростях і нижчих тваринах, наприклад, Саепогппабраїйїіх еієдап5, в основному приймають субстрати жирних кислот, етерифікованих в положенні 5п-2 фосфатидилхолінового (ФХ) субстрату. Вказані десатурази, таким чином, відомі як ацил-ФХ, зв'язані з ліпідом, їтопі-епа десатурази (Юотегодие еї аї., 2003). І навпаки, їгопі-епа десатурази вищих тварин загалом приймають субстрати ацил-КоА, де жирнокислотний субстрат зв'язаний з КоА замість ФХ (Ботегопе еї аї!., 2005). Відомо, що деякі десатурази мікроводоростей і одна рослинна десатураза використовують жирнокислотні субстрати, етерифіковані до КоА (Табл. 2).
Кожна реакція елонгації ПНЖК складається з чотирьох стадій, що каталізуються 60 багатокомпонентним білковим комплексом: спочатку, реакція конденсації приводить до додавання модуля 2С з малоніл-КОА до жирної кислоти, результатом чого є утворення В- кетоацильної проміжної сполуки. Далі вона відновлюється НАДФ-Н, з подальшою дегідратацією і утворенням єноїльної проміжної сполуки. Вкінці ця проміжна сполука повторно відновлюється з утворенням подовженої жирної кислоти. Загалом, вважається, що стадія конденсації в числі вказаних чотирьох реакцій є специфічною для субстрату, а інші стадії -- ні. На практиці це означає, що природний апарат елонгації рослини здатний до елонгації ПНЖК, за умови, що введений конденсаційний фермент (звичайно під назвою "елонгаза"), специфічний по відношенню до ПНЖК, хоча ефективність природного апарату елонгації рослини з точки зору елонгації неприродних субстратів ПНЖК може бути низькою. У 2007 році була опублікована інформація щодо ідентифікації та опису циклу елонгації дегідратази дріжджів (Оепіс апа
М/еів5тап, 2007).
Десатурація ПНЖК в рослинах, мохах і мікроводоростях природним чином відбувається на жирнокислотних субстратах, в основному, в пулі ацил-ФХ, тоді як елонгація відбувається на субстратах в пулі ацил-КоА. Перенесення жирних кислот від молекул ацил-ФХ до носія КоА здійснюється фосфоліпазами (ФЛА), тоді як перенесення жирних кислот ацил-КоА до носія ФХ здійснюється лізофосфатидил-холін ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (Фіг. 21) (5іпоп еї а!., 2005).
Сконструйоване продукування ДЛ-ПНЖК
Велика частина метаболічного конструювання ДЛ-ПНЖК здійснювалася з використанням аеробного шляху Дб-десатурація/елонгація. Про біосинтез у-ліноленової кислоти (ГЛК, 18:36) в тютюні з використанням Аб-десатурази із ціанобактерії Зупеспосувіїз вперше повідомлялося в 1996 році (Кедау апа Тпотавх, 1996). Пізніше ГЛК була одержана в культивованих рослинах, таких як сафлор (73 95 ГЛК в олії з насіння; Кпашії еї аї., 2006) і соя (28 95 ГлЛК; зай еї аї., 2004).
Продукування ДЛ-ПНЖК, наприклад, ЕПК і ДГК, включає складніше конструювання за рахунок збільшення кількості залучених стадій десатурації та елонгації. Про продукування ЕПК в наземній рослині вперше повідомлялося 0О) еї аї. (2004), які ввели гени, що кодують Д9У-елонгазу з Ізоспгузіз даірапа, Ав-десатуразу з Ецдієпа дгасіїє і Д5-десатуразу з Могіієгеїа аїріпа в
Агарідорзіє з одержанням до 3 95 ЕПК. Ця робота була продовжена Абрбаді еї аї. (2004), які повідомляли про продукування до 0,8 95 ЕПК в насінні льону з використанням генів, що кодують дб-десатуразу і Дб-елонгазу з РпузсоптійїгеїПа раїепз і Д5-десатуразу з Рпаєодасіу шт кісотишт.
Зо Перший звіт про одержання ДДЛ-ДГК, і на сьогоднішній день найвищих зареєстрованих рівнів ПНЖК з дуже довгим ланцюгом, міститься у УМО 04/017467, в якій розкрито продукування
З 96 ДГК у зародках сої, але не насінні, шляхом введення генів, що кодують Дб-десатуразу зЗаргоієдпіа аісіпа, Аб-десатуразу Могііегейа аїріпа, А5-десатуразу МогіегеМНа аїріпа, да4- десатуразу зЗаргоЇІедпіа адісіїпа, Д17-десатуразу зЗаргоЇІедпіа дісіїпа, Аб-елонгазу МогііегеПа аїріпа та АД5-елонгазу Раміома ІшПегі. Максимальний рівень ЕПК в ембріонах, які також продукують
ДГК, становив 19,695, вказуючи на низьку ефективність перетворення ЕПК на ДГК (УМО 2004/071467). Це відкриття було подобнім до опублікованого Кобегі еї аїЇ. (2005), де вихід перетворення ЕПК на ДГК був низьким, з продукуванням З 95 ЕПК і 0,5 95 ДГК в Агабрідорзів з використанням А5Б/б-десатурази БВапіо гегіо, ДАб-елонгази Саепогпарай5 еІедапз5 та А5-елонгази і
Дд4-десатурази Раміома заїїпа. Крім того, в 2005 році Ми еї ам. опублікували повідомлення щодо продукування 25 95 АРК, 15 95 ЕПК і 1,5 95 ДГК у Вгазвзіса |ипсеа з використанням Дб-десатурази
РуїШішт ігедиіаге, Д5-десатурази ТПгаивіоспуїгій, Дб-елонгази РпузсотійгеПйа раїеп5, А12- десатурази Саїепаціа ойісіпаїйє, Д5-елонгази ТПгаивзіоспуїгій, А17-десатурази Рпуорпїпога іптебїап5, елонгази ДЦ-ПНЖК Опсогпупси5з тукібз5, АЛ4-десатурази ТПгаивіоспуйій і ЛФХАТ
Тигаивіоспуїгій (УМи еї а, 2005). Короткий опис зусиль з одержання врожаю насіння олійних культур, яке синтезує Ф3 ДЛ-ПНЖК, наведений у Мепедаз-Саїегоп еї аї. (2010) ї Киї2-І оре? еї а. (2012). Як вказано Виїі2-І оре еї аї. (2012), на дату публікації результати з одержання ДГК у трансгенних рослинах навіть віддалено не нагадують рівнів, що спостерігаються в риб'ячому жирі.
Таким чином, залишається потреба в ефективнішому продукуванні ДЛ-ПНЖК в рекомбінантних клітинах, зокрема ДГК в насінні рослин олійних культур.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Авторами цьоговинаходу ідентифіковані способи і рослини для одержання ліпіду з високими рівнями ДГК.
У першому аспекті цьоговинаходу розкривається екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), та необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти бо (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), при тому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7- 20 95.
У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє однією або більше, або всіма наступними ознаками: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 2 95 до 18 95, від приблизно 2 95 до 16 95 або від приблизно 2 95 до 15 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 ую або менше, ніж приблизно 1 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, від приблизно З 95 до приблизно 30 95, від приблизно 695 до приблизно 3095, від 195 до приблизно 2095, від приблизно 3095 до приблизно 60 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95 або становить приблизно 30 95, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 95, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 40 95, від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 4 96 до приблизно 16 95 або від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 ую, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від 0,05 95 до приблизно 7 95, від 0,05 95 до приблизно 4 905, від 0,05 95 до приблизно 3 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 7 95, менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно 4 у, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 6 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно
Ко) З 9, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 6 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 90, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 195, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, від приблизно 0,0595 до приблизно 1095, від приблизно 0,0595 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 об, хі) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 95, хії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 895, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 1595, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 95, від приблизно 895 до 2095, від приблизно 1095 до 2095, від приблизно 1195 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 9, хії) ліпід містить фб-докозапентаєнову кислоту (22:545710и13153 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід по суті не містить 0б-докозапентаєновой кислоти (22:54710и13163 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хм) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Хмі) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, від приблизно 6 95 до приблизно 20 95, від приблизно 4 95 до приблизно 60 95, від приблизно 30 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95 або від 8 95 до приблизно 22 95, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 9» або від приблизно 60 95 до приблизно 75 95, хіх) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 35 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 3595, від приблизно 6 95 до 20 95, менше, ніж приблизно 20 95, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10 95 або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95, хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 95 до 4 95, ххі) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 95, від приблизно 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95, ххії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 15 95, приблизно 17 95 або приблизно 20 95, ххії) співвідношення загальних 0б жирних кислот: загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від
Ко) приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2, ххім) співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше приблизно 60 965, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, від приблизно 60 95 до приблизно 98 95, від приблизно 70 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 90 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Дб-десатурази щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 60 9565, щонайменше приблизно 70 95, від приблизно 30 95 до приблизно 70 95, від приблизно 35 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 70 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту
ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше приблизно 6095, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 95 95, від приблизно 70 95 до
БО приблизно 88 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 85 95, ххміїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 99 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 98 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази щонайменше приблизно 80 9565, щонайменше приблизно 8595, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 об, ххх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ДПК на ДГК під бо дією Д4-десатурази щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 93 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, від приблизно 80 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 95, хххі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 9565, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 95, хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, хххіїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 95, хххім) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше, ніж 1 95 Сб2071, хххм) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 95, хххмії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ), ххумії) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 95, менш ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 1 95 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 5 95 вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, хххмії) щонайменше 7095 або щонайменше 8095 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххіх) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і
ХІ) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід знаходиться у формі олії, причому ліпід становить щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 9565, щонайменше приблизно 98 95 або від приблизно 95 95 до приблизно 98 мас. 95 олії.
Зо У переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДГК становить від приблизно 7 95 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 290 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 6 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, АЛК присутня, ГЛК присутня, рівень СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень
ЕПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 10 95, рівень ДПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 956 до приблизно 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, і вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, і необов'язково ліпід по суті не містить холестерину та/або ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
У більш переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду рівень ДГК становить від приблизно 7 95 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, рівень 60 олеїнової кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, рівень АЛК становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ЕТрК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, рівень ЕПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 1095, рівень ДПК становить від приблизно 0,0595 до приблизно 8595, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 495 до приблизно 2595, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, рівень нових 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 96 до приблизно 75 95, рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 33 95, співвідношення загальних б жирних кислот: загальних с03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, співвідношення нових дб жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією д12-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення ДПК на
ДГК під дією Д4-десатурази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 95, ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 б, і у вмісті загальних жирних кислот в екстрагованому ліпіді С20:Ї становить менше, ніж 1 95, вміст триацилгліцеролу (ТАГ), в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, ліпід по суті не містить холестерину, і ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18). Переважно ліпід або олія є
Зо канолаолією каноли та/або не оброблений за методом переетерифікації після екстракції з рослини або частини рослини. У конкретному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія каноли в подальшому можуть бути оброблені, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Додаткова обробка може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК.
У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду рівень ДГК становить від приблизно 7 95 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, рівень АЛК становить від приблизно 2 96 до приблизно 16 95, рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно З 95, рівень СДК становить менше, ніж приблизно З 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ЕТрРК менше, ніж приблизно 2 95, рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 40 95 до приблизно 60 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 20 95, співвідношення загальних б жирних кислот: загальних с03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, ліпід по суті не містить холестерину, і ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18). Переважно 60 ліпід або олія по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК та/або є олією каноли та/або не оброблений за методом переетерифікації після виділення з рослини або частини рослини. У конкретному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія каноли в подальшому можуть бути оброблені, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Додаткова обробка може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК.
У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень
ДГК становить від приблизно 795 до 2095, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 295 до приблизно 1695, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 6 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, АЛК присутня, ГЛК присутня, рівень
СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95, рівень ЕПК становить від приблизно 0,05 96 до приблизно 10 95, рівень ДПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95.
У подальшому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід додатково містить один або більш стеролів, переважно рослинних стеролів.
В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід знаходиться у формі олії і містить менше, ніж приблизно 10 мг стеролів/г олії, менше, ніж приблизно 7 мг стеролів/г олії, від приблизно 1,5 мг до приблизно 10 мг стеролів/г олії, або від приблизно 1,5 мг до приблизно 7 мг стеролів/г олії.
Приклади стеролів, які можуть бути присутніми в екстрагованому ліпіді, включають, не обов'язково обмежуючись ними, один або більш або все з наступного: кампестрол/24- метилхолестерин, Д5-стигмастерол, ебурикол, ДВ-ситостерол/24-етилхолестерин, /-(Д5Б- авенастерол/ізофукостерол, Д7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-3р-ол і Д7-авенастерол.
У варіанті реалізації винаходу вид рослини є одним з наведених в Табл. 26, наприклад, канола, і рівень стеролів є приблизно таким же, як наведений в Табл. 26 для цього конкретного виду рослини.
У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід містить менше, ніж приблизно 0,5 мг холестерину/г олії, менше, ніж приблизно 0,25 мг холестерину/г олії, від приблизно 0 мг до приблизно 0,5 мг холестерину/г олії, або від приблизно 0 мг до приблизно 0,25 мг холестерину/г
Зо олії, або по суті не містить холестерину.
У подальшому варіанті реалізації винаходу ліпід є олією, переважно олією з олійної культури. Приклади таких олій включають, без обмеження, олію Вгазвзіса 5р., наприклад, олію каноли, олію Соззурішт Ппігзшцт, олію Гіпит и5найзвітит, олію Неїїапіпив 5р., олію Саппатив
Ііпсіогіи5, олію СіІусіпе тах, олію 7еа таув, олію Агабідор5і5 (Ппаапа, олію бБогапит бБісоіог, олію
Зогупит уцідагє, олію Амепа заїїма, олію ТийоЇйшт в5р., олію ЕІаевзі5 диіпеепі5, олію Місоїапа
Бепіпатіапа, олію Ногаешцт уцідаге, олію І иріпиє апдивійоїйшв, олію Огула з5аїїма, олію Огуа діабетіта, олію Сатеїймпа заїїма, олію Статье абруззіпіса, олію Мізсапіпи5 х дідапіви5 або олію
Мізсапійиз» віпепвів.
Також розкритий екстрагований рослинний ліпід, переважно екстрагована олія з насіння каноли, що містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що ліпід володіє наступними ознаками по відношенню до загального вмісту жирних кислот в ліпіді: ї) рівень ДГК становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або приблизно 7 95, ії) рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, ії) рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, їм) рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, м) рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, мі) рівень АЛК становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, мії) рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, мії) рівень СДК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95, їх) рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95, х) рівень ЕТрК становить менше, ніж приблизно 1 95, хі) рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 10 95 та/або рівень ЕПК становить 0,5-2,0 х рівень ДГК, бо хії) рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95,
хії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, хім) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 70 95, хм) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 15595 до приблизно 75595, переважно від приблизно 15 95 до приблизно 30 95, хмі) рівень нових Фб жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, хмії) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, хмії) рівень нових 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 20 95, хіх) співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, хх) співвідношення нових дб жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, ххі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, і ххії) ліпід по суті не містить холестерину. У варіанті реалізації винаходу ліпід містить три-ДГК
ТАГ (ТАГ 66:18). Більш переважно, ліпід по суті не містить СДК і ЕТК, та/або не оброблений за методом переетерифікації після виділення з рослини або частини рослини.
В іншому аспекті розкритий екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 003 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (ії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 795 до 20 95, (ії) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 9, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 6 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 195 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до
З5 90, (мі) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 9б, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 90, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 90, (їх) співвідношення загальних 0б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 90, і (хі) щонайменше 70 95 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. У варіанті реалізації винаходу присутні одна або більше, або всі з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 15 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 1 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 30 95, від приблизно 6 95 до приблизно 30 9б, від 1 95
БО до приблизно 20 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, або становить приблизно 30 95, ім) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 Об, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 4 95 до 16 95, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від 0,05 95 до 7 905, від 0,05 95 до 4 9о або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95,
мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно
З 9, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,595, від приблизно 0,0595 до приблизно 595, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 90, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, від 0,05 95 до 4 95, від 0,05 95 до З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, або від 0,05 95 до приблизно 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж приблизно 395, менше, ніж приблизно 2 95, від 0,05 95 до 10 95, від 0,05 95 до 5 9б5, або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 бь до приблизно 2 95, хі) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж приблизно 395, менше, ніж приблизно 2 95, від 0,05 95 до 8 9б, від 0,05 95 до 5 95, або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 895, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 1595, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 95, від приблизно 895 до 2095, від приблизно 1095 до 2095, від приблизно 1195 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 9, хії) ліпід містить об-докозапентаєнову кислоту (22:545710и13и16) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід в істотній мірі не містить Фб-докозапентаєнової кислоти (22:54710и13и183 серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Зо хм) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Хмі) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 6 95 до приблизно 20 95, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95, або від 8 95 до приблизно 22 95, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 95, або від приблизно 60 95 до приблизно 75 95, хіх) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 3595 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 3595, від приблизно 695 до 2095, менше 2095, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10 95 або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95, хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 95, менше 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 95 до 4 95, ххі) рівень загальних 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого
БО ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 95, від 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95, ххії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 9 95 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 15 95, приблизно 17 95 або приблизно 20 95, ххії) співвідношення загальних 0б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 60 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2,
ххім) співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 9565, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 95, ххмії) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше 1 95 02071, ххіх) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 95, ххх) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ),, хххі) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 956, менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 1 95 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 5 95 вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, хххії) щонайменше 80 95 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххії) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і хххім) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
Зо З особливою увагою до згаданого вище аспекту, у варіанті реалізації винаходу: ї) ліпід знаходиться у формі олії, причому олія містить один або більше стеролів, наприклад, один або більше або всі з кампестеролу, Д5-стигмастеролу, ебуриколу, ВД-ситостеролу, Д5- авенастеролу, Д7-стигмастеролу і Д7-авенастеролу, і олія необов'язково містить менше 10 мг стеролів/г олії та/або олія істотною мірою не містить холестерину, та/або і) ліпід знаходиться у формі олії з насіння олійної культури, такого як насіння олійної культури, що є насінням Вгазвзіса 5р. або насінням каноли.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, при тому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Ффб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше з ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), стеаридонової кислоти (СДК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, в частині рослини становить приблизно 7-20 95, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95.
У переважному варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє однією або більше ознак, визначених вище.
У варіанті реалізації винаходу, в якому частина рослини є насінням, переважним є насіння олійної культури. Приклади такого насіння включають, без обмеження, насіння Вгав5іса 5р.,
Созвуріит Пітт, Гіпит ивйаїввітит, Неїапіпив 5р., Саппативх І(псіогіи5, Сіусіпе тах, 7ва тауз, Агарідорвів Іпаіїапа, Зогупит бБісоЇог, Зогопит мцідаге, Амепа взаїїма, ТиоЇйшт звр., ЕІаевів диіпеепіб, Місойапа Брепіпатіапа, Ногдецт уцдаге, І иріпиє апдивійоїйш5, Огула заїїма, Огуга діабетіта, Сатеїїпа заїїма або Статре абуззіпіса, переважно Вгаззіса пари», В. |їипсеа або С. ваїма.
В іншому варіанті реалізації винаходу насіння містить щонайменше приблизно 18 мг, 60 щонайменше приблизно 22 мг, щонайменше приблизно 26 мг, від приблизно 18 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 22 мг до приблизно 70 мг, або від приблизно 24 мг до приблизно 50 мг ДГК на грам насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу частина рослини містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один з наступних наборів ферментів: ї) Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, і) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, ії) Д12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, Дб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Л15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) А12-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ДЛУ-елонгаза і д5ь- елонгаза, або мії) Д12-десатураза, о3-десатураза або Д15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині частини рослини.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу частина рослини володіє однією або більше або всіма з наступних ознак: її) Д12-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, від приблизно 60 95 до приблизно 98 95, від приблизно 70 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 90 95, ії) 03-десатураза перетворює 0б жирні кислоти на 003 жирні кислоти в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 65 95, щонайменше приблизно 75 95, щонайменше приблизно 85 95, від приблизно 65 95 до приблизно 95 95, від приблизно 75 95 до
Ко) приблизно 95 95 або від приблизно 80 95 до приблизно 95 95, ії) Дб-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 3095, щонайменше приблизно 4095, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 60 9565, щонайменше приблизно 70 95, від приблизно 95 до приблизно 70 95, від приблизно 35 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 70 95, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах рослини з ефективністю менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 2,5 95, менше, ніж приблизно 1 95, від приблизно 0,195 до приблизно 5 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 2,5 95, або від приблизно 0,5 95 до приблизно 1 95, м) Аб-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 88 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 85 95, мі) АБ-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 6095, щонайменше приблизно 7095, щонайменше приблизно 75 95, щонайменше приблизно 80 9565, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 60 95 до приблизно 99 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 98 95, мі) АбБ-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 8095, щонайменше приблизно 8595, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 б, мії) Д4-десатураза перетворює ДПК на ДГК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 8095, щонайменше приблизно 9095, щонайменше приблизно 93 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, від приблизно 80 95 до приблизно 95 95 або від приблизне 85 950 до приблизно 95 95, їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 1095, щонайменше приблизно 15 965, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до 60 приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 95,
х) ефективність перетворення ЛК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 1595, щонайменше приблизно 2095, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 1595 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 1795, щонайменше приблизно 2295, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 95, хі) одна або більше клітин частини рослини містять щонайменше приблизно на 15 95, щонайменше приблизно на 20 95, від приблизно 15 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 22,5 95 до приблизно 27,5 95, більше жирних кислот 03, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Аб-десатураза переважно зменшує насиченість а-ліноленової кислоти (АЛК) щодо лінолевої кислоти (ЛК), хім) Аб-елонгаза додатково володіє активністю Ло9-елонгази, хм) Д12-десатураза додатково володіє активністю А15-десатурази, хмі) Аб-десатураза додатково володіє активністю А8-десатурази, хмії) Ав-десатураза додатково володіє активністю Дб-десатурази або не володіє активністю дб-десатурази, хмії) А15-десатураза додатково володіє активністю 03-десатурази по відношенню до ГЛК, хіх) Фо3-десатураза додатково володіє активністю А15-десатурази по відношенню до ЛК, хх) Ф3-десатураза зменшує насиченість ЛК та/або ГЛК, ххі) Фо3-десатураза переважно зменшує насиченість ГЛК щодо ЛК, ххії) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 15 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 25 95, ххії) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше
Ко) приблизно 22 95, від приблизно 15 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 22 95 до приблизно 30 95, ххім) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 65 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 95, ххх) одна або більше або всі десатурази володіють вищою активністю на субстраті ацил-
КоА, ніж на відповідному субстраті адил-фосфатидилхоліну (ацил-ФХ), хххі) Аб-десатураза володіє вищою активністю Дб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж ЛК як жирнокислотного субстрату, хххії) Аб-десатураза володіє вищою активністю Аб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххії) Аб-десатураза володіє щонайменше в 2 рази вищою активністю Дб-десатурази, щонайменше в З рази вищою активністю, щонайменше в 4 рази вищою активністю або щонайменше в 5 разів вищою активністю по відношенню до АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК, хххім) Дб-десатураза володіє вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххм) Дб-десатураза володіє щонайменше в 5 разів вищою активністю Аб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххумі) десатураза являє собою їгопі-епа десатуразу, хххмії) Аб-десатураза не володіє активністю Д5-десатурази по відношенню до ЕТК, яку можна було б виявити.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу частина рослини володіє однією або більше або всіма з наступних ознак: її Д12-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 10, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну (510) ЗЕО ІЮО МО: 10,
ії) ю3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО І МО: 12, ії) Дб-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 16, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕОІЮО МО: 16, їм) Дб-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 25, її біологічно активний фрагмент, такий як ЗЕО ІЮ МО: 26, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 25 та/або 5ЕО ІЮ МО: 26, м) А5-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕБЕО ІЮ МО: 30, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 30, мі) АбБ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 37, мії) Д4-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 41, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО І МО: 41.
У варіанті реалізації винаходу частина рослини додатково містить екзогенний полінуклеотид, що кодує діацилгліцерол ацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилгліцерол ацилтрансферазу (МГАТ), гліцерол-3-фосфат ацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-гліцерол-3- фосфат ацилтрансферазу (ЛФКАТ) переважно ЛФКАТ, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, ацил-КоА:лізофосфатидилхолін ацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфоліпазу Аг (РІ Аг), фосфоліпазу С (РІ С), фосфоліпазу Ю (РГС), СДП-холін діацилгліцероллхолін фосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхолін діацилгліцерол ацилтрансферазу (ФДАТ), фосфатидилхолін:діацилгліцерол холін фосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтазу (АКС) або комбінацію двох або більше із вказаних ферментів.
В іншому варіанті реалізації винаходу частина рослини додатково містить введену мутацію
Зо або екзогенний полінуклеотид, який в клітині частини рослини негативно регулює продукування та/або активність ендогенного ферменту, вибраного серед РАЕТ, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ,
ЛФХАТ, РІ А», РІ С, РІ0, ХФТ, ФДАТ, тіоестерази, наприклад, ЕАТВ або Д12-десатурази, або комбінації двох або більше із вказаних ферментів.
У подальшому варіанті реалізації винаходу щонайменше один або всі промотори є специфічними для насіння промоторами. У варіанті реалізації винаходу щонайменше один або всі промотори одержані з генів біосинтезу або акумуляції олії, таких як олеозин, або із генів зберігання білка в насінні, таких як конлінін.
В іншому варіанті реалізації винаходу промотор(и), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують Д4-десатуразу і Д5-елонгазу, ініціює експресію полінуклеотидів в насінні частини рослини, що розвивається, перед або досягає піку експресії перед промотором(ами), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, що кодують А12- десатуразу і о3-десатуразу.
У подальшому варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди ковалентно з'єднані в молекулу ДНК, переважно молекулу Т-ДНК, інтегровану в геном клітин частини рослини, причому кількість таких молекул ДНК, інтегрованих в геном клітин частини рослини переважно становить не більше однією, двох або трьох, або становить дві або три.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу рослина містить щонайменше два різні екзогенні полінуклеотиди, кожний з яких кодує Дб-десатуразу з такою ж або іншою послідовністю амінокислот.
У подальшому варіанті реалізації винаходу загальний вміст олії в частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше приблизно 40 95, або щонайменше приблизно 50 95, або щонайменше приблизно 60 95, або щонайменше приблизно 70 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 80 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, в якій відсутні екзогенні полінуклеотиди. У цих варіантах реалізації винаходу максимальний вміст олії може становити приблизно 100 95 від вмісту олії у відповідній частині рослини дикого типу.
В іншому варіанті реалізації винаходу ліпід знаходиться у формі олії, переважно олії з насіння олійної культури, причому щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 9595, щонайменше приблизно 98 95 або від приблизно 95 95 до приблизно 98 мас. 95 ліпіду складають тріацилгліцероли.
У подальшому варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає обробку ліпіду, з метою підвищення рівня ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Наприклад, обробка може бути переєтерифікацією. Наприклад, ліпід, такий як олія каноли, може бути підданий обробці з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри, які далі можуть бути фракційовані із збагаченням ліпіду або олії
ДГК.
Додатково розкритий спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, переважно насіння каноли, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, фб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), стеаридонової кислоти (СДК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень
ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, в частині рослини становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або від приблизно 7 95, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, причому екстрагований ліпід володіє наступними ознаками загального вмісту жирних кислот в ліпіді; ї) рівень ДГК становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або приблизно 7 95, ії) рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, ії) рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, їм) рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, м) рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, мі) рівень АЛК становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, мії) рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, мії) рівень СДК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95,
Зо їх) рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95, х) рівень ЕТрК становить менше, ніж приблизно 1 95, хі) рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 10 95 та/або рівень ЕПК становить 0,5-2,0 х рівень ДГК, хії) рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95, хії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, хім) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 70 95, хм) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 15595 до приблизно 75595, переважно від приблизно 15 95 до приблизно 30 95, хмі) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, хмії) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, хмії) рівень нових 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 20 95, хіх) співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно
БО менше, ніж приблизно 0,50, хх) співвідношення нових дб жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, ххі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, і ххії) ліпід по суті не містить холестерину.У варіанті реалізації винаходу ліпід містить три-ДГК
ТАГ (ТАГ 66:18). Більш переважно, ліпід по суті не містить СДК і ЕТК, та/або не оброблений за методом переетерифікації після виділення з рослини або частини рослини.
Також розкритий спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову бо кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому: (і) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 9о до 20 905, (ії) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 9о до 16 90, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 9б, (мі) рівень а- ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 905, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 90, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 495 до 2595, (іх) співвідношення загальних 0б жирних кислот: загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 90, і (хі) щонайменше 70 95 етерифікованих ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. оо, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, при цьому, рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95.
Крім того, розкритий ліпід, або олія, що містить ліпід, одержані із застосуванням способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає переетерифікацію триацилгліцеролів в екстрагованому рослинному ліпіді, причому екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і
Ко) необов'язково одне або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень
ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95, з одержанням в такий спосіб етилових ефірів.
У переважному варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє однією або більше з ознак, визначених вище.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає переетерифікацію триацилгліцеролів в екстрагованому рослинному ліпід, причому екстрагований рослинний ліпід містить етерифіковані жирні кислоти у формі триацилгліцеролів, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (ї) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно З 95, приблизно 4 96, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або від 7 95 до 20 9б, (ії) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 905, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 9б, (мі) рівень а- ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 905, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 90, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 495 до 2595, (іх) співвідношення загальних Фб жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 90, і (хі) щонайменше 70 95 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, з одержанням в такий спосіб етилових ефірів. У варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід 60 володіє однією або більше або всіма з наступних ознак:
ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 15 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95, хххМм) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 30 95, від приблизно 6 95 до приблизно 30 9б, від 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95 або становить приблизно 30 95, хххмії) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 Об, ххумії) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 4 95 до 16 95, ххухмії) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від 0,05 95 до 7 95, від 0,05 95 до 4 95, або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хххіх) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно
З 9, або від 0,05 95 до приблизно 2 95,
ХІ) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,595, від приблизно 0,0595 до приблизно 595, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 об, хії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, від 0,05 95 до 4 95, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95 або від 0,05 95 до приблизно 1 95,
Хії) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж приблизно 395, менше, ніж приблизно 2 95, від 0,05 95 до 10 95, від 0,05 95 до 5 95 або від 0,05 95 до приблизно З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95,
Хіїйї) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 9о, від 0,05 95 до 8 905, від 0,05 95 до 5 9о або від 0,05 95 до приблизно З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хІїм) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 8 95, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 15 95, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 95, від приблизно 895 до 2095, від приблизно 1095 до 2095, від приблизно 1195 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 9,
ХІМ) ліпід містить юб-докозапентаєнову кислоту (22:545771013и6) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хімі) ліпід по суті не містить Фб-докозапентаєновой кислоти (22:5А710и13163 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хімії) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому, хімії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 6 95 до приблизно 20 95, хіїх) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95 або від 8 95 до приблизно 22 95, 1) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 95, або від приблизно 60 95 до приблизно 75 95,
І) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 3595 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 6 95 до 20 95, менше, ніж 20 95, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10 95 60 або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95,
Ії) рівень нових 006 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 95, менше 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 95 до 4 95,
Ійї) рівень загальних 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 95, від 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95,
Ім) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 9 956 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 95, приблизно 17 95 або приблизно 20 95,
Ім) співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж 15 приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2,
Імі) співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0,
Імії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 9565, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 95,
Імії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 95,
Зо Їх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 95,
Їх) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше 1 95 02071,
Їхі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 95,
Їхії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ),
Їхії) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 595, менше, ніж приблизно 195 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 595, вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду або по суті не містить їх,
Їхім) щонайменше 80 95 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ,
Їхм) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і
Їхмі) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
З особливою увагою до згаданого вище аспекту, у варіанті реалізації винаходу застосовують одне або більше або все з наступного: ї) ліпід знаходиться у формі олії, причому олія містить один або більше стеролів, наприклад, один або більше або всі з кампестеролу, Д5-стигмастеролу, ебуриколу, ВД-ситостеролу, Д5- авенастеролу, А7-стигмастеролу і А7-авенастеролу, і олія необов'язково містить менше 10 мг стеролів/г олії та/або олія істотною мірою не містить холестерину, і) ліпід знаходиться у формі олії з насіння олійної культури, такого як насіння олійної культури, що є насінням Вгазвзіса 5р. або насінням каноли, ії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95, або становить від 7 У до 20 95.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається химерна генетична конструкція, що містить у вказаному порядку: перший ген, другий ген, третій ген, четвертий ген, п'ятий ген і шостий ген, всі з яких ковалентно з'єднані в єдиній молекулі ДНК, причому перший, другий і 60 третій гени об'єднані як перший кластер генів, і четвертий, п'ятий і шостий гени об'єднані як другий кластер генів, притому, що кожен ген містить промотор, кодуючу ділянку і термінатор транскрипції та/або ділянку поліаденілювання таким чином, що кожен промотор функціонально пов'язаний з кодуючою ділянкою і термінатором транскрипції та/або ділянкою поліаденілювання, при цьому, кожен промотор незалежно є ідентичним або відрізняється від інших промоторів таким чином, що молекула ДНК містить три, чотири, п'ять або шість різних промоторів, причому один або більш або всі промотори є гетерологічними відносно кодуючої ділянки, з якою вони функціонально пов'язані, притому, що напрямок транскрипції першого гена йде від третього гена і протилежний напрямку транскрипції третього гена, при цьому, напрямок транскрипції четвертого гена йде від шостого гена і протилежний напрямку транскрипції шостого гена, причому напрямок транскрипції другого гена такий же, як для першого гена або третього гена, притому, що напрямок транскрипції п'ятого гена такий же, як для четвертого гена або шостого гена, при цьому, термінатор транскрипції та/або ділянка поліаденілювання другого гена відокремлені від промотору першого або третього гена, в залежності від того, який із них є ближчим, першою ділянкою розпірки розміром від приблизно 0,2 до приблизно 3,0 тисяч основ, причому перший кластер генів відокремлений від другого кластера генів другою ділянкою розпірки розміром від приблизно 1,0 до приблизно 10,0 тисяч основ, і при цьому, термінатор транскрипції та/або ділянка поліаденілювання п'ятого гена відокремлені від промотору четвертого або шостого гена, в залежності від того, який із них є ближчим, третьою ділянкою розпірки розміром від приблизно 0,2 до приблизно 3,0 тисяч основ.
У варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить сьомий ген, що відокремлений від першого кластера генів або другого кластера генів, в залежності від того, який із них є ближчим, ділянкою розпірки розміром від приблизно 1,0 до приблизно 10,0 тисяч основ.
В іншому варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить два або більше різних термінаторів транскрипції та/або ділянок поліаденілювання.
Зо Ще в одному варіанті реалізації винаходу щонайменше одна з ділянок розпірки містить ділянку прикріплення до матриксу (ДПМ).
У подальшому варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить праві і ліві ділянки межі, що фланкують гени, і являє собою молекулу Т-ДНК.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція знаходиться в клітині
Адгобрасієгійт або інтегрована в геном рослинної клітини.
У переважному варіанті реалізації винаходу щонайменше один з генів кодує десатуразу жирних кислот або елонгазу жирних кислот.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція містить гени, що кодують набір ферментів, як визначається в цьому документі, та/або один або більше генів кодують фермент, як визначається в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається виділений та/або екзогенний полінуклеотид, що містить: ї) послідовність нуклеотидів, вибрану як будь-яка із ФЕО ІЮ МО: 1-9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, та/або ії) послідовність нуклеотидів, щонайменше на 95 95 ідентичну або на 99 95 ідентичну одній або більше послідовностям, представленим у 5ЕО ІЮ МО: 1-9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45.
В особливо переважному варіанті реалізації винаходу виділений та/або екзогенний полінуклеотид містить:
БО ї) послідовність нуклеотидів ЗЕО ІЮО МО: 2 та/або ії) послідовність нуклеотидів, щонайменше на 9595 ідентичну або на 99595 ідентичну послідовності, представленій в 5ЕО ІЮ МО: 2.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається вектор або генетична конструкція, що містить полінуклеотид за винаходом та/або генетичну конструкцію за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу послідовність нуклеотидів, вибрана як будь-яка із «ФЕО ІЮ МО: 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, або послідовність нуклеотидів, щонайменше на 95 95 ідентична або на 99 95 ідентична одній або більше послідовностям, представленим у ЗЕО ІЮ
МО: 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, функціонально пов'язана з промотором.
У ще одному аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, що містить екзогенні бо полінуклеотиди, які кодують один з наступних наборів ферментів:
ї) Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, і) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, ії) Д12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, Дб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) А12-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛУ-елонгаза і дь- елонгаза, або мії) Д12-десатураза, о3-десатураза або Л15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, і при цьому, кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, що здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині.
У варіанті реалізації винаходу клітина містить ліпід, як визначається вище, або в ній одна або більше або всі десатурази або елонгази володіють однією або більше ознак, як визначається вище.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, яка містить: ї) перший екзогенний полінуклеотид, що кодує А12-десатуразу, яка містить амінокислоти з послідовністю, представленою в 5ЕБО ІЮО МО: 10, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 10, їі і) другий екзогенний полінуклеотид, що кодує 03-десатуразу, яка містить амінокислоти з послідовністю, представленою в 5ЕБО ІЮ МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 12, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, що містить один або більше полінуклеотидів за винаходом, генетичну конструкцію за винаходом, або вектор або генетичну конструкцію за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу клітина знаходиться в рослині, в частині рослини та/або є клітиною насіння зрілої рослини.
У варіанті реалізації винаходу рослина або насіння рослини є рослиною олійної культури або насінням олійної культури, відповідно.
Також розкритий трансгенний організм, що не належить до людського роду, який містить клітину за винаходом. Переважно трансгенний організм, що не належить до людського роду, є трансгенною рослиною, переважно рослиною олійної культури або Агабрідорвіз ІПаїйапа. У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною Вгаззіса, переважно В. парих або В. |ипсєа, або іншою рослиною, окрім Агабідорбзів ІНаїіапа.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається рослина олійної культури, що містить: а) ліпід в її насінні, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) А12-десатураза, грибкова 03-десатураза та/або грибкова Д15-десатураза, Дб-десатураза, д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або її) А12-десатураза, грибкова 03-десатураза та/або грибкова А15-десатураза, Дв-десатураза, д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9У-елонгаза і Д5-елонгаза, притому, що кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, які здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, що включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 003 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить приблизно 7-20 95.
Приклади рослин олійної культури включають, без обмеження, Вгаз5зіса 5р., Созвзурійит пПігвшійт, Гіпит ивійайввітит, Неїїапійив 5р., Сапйатив іпсіойи5, Суміусіпе тах, 76а таув,
Агабідорвзів ІНаійапа, Богуйит бБісоїог, богупит мцдагє, Амепа заїїма, ТийоЇйШт вр., ЕІаєвів диіпеепіб, Місойапа Брепіпатіапа, Ногдецт уцдаге, І иріпиє апдивійоїйш5, Огула заїїма, Огуга 60 діабетіта, Сатеїїпа займа або Статре абуззіпіса. У варіанті реалізації винаходу рослина олійної культури являє собою канола, Суіусіпе тах, рослину Сатеїїпа займа або Агарідорзів
ІНнаійапа. В альтернативному варіанті реалізації винаходу рослина олійної культури являє собою рослину, окрім А. ІПаїїапа.
У варіанті реалізації винаходу одна або більш десатураз здатні використовувати субстрат ацил-КоА. У переважному варіанті реалізації винаходу одна або більш з Аб-десатурази, Д5- десатурази, Л4-десатурази і Д8-десатурази, якщо вони присутні, здатні використовувати субстрат ацил-КоА, переважно кожна з ї) ДАб-десатурази, Д5-десатурази і Д4-десатурази або ії) д5-десатурази, Л4-десатурази і Дв-десатурази здатна використовувати субстрат ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу Л12-десатураза та/або о3-десатураза здатні використовувати субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА переважно являє собою АЛК-КоА, ЕТК-КоА, ДПК-КоА,
ЕТрК-КоА, ЛК-КоА, ГЛК-КоА або АРК-КОА.
У варіанті реалізації винаходу зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння, або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається рослина Вгаз5іса парив, В. |Їнпсєа або
Сатеїйпа заїїма, яка здатна давати насіння, що містить ДГК, причому зібране в процесі збору урожаю, зріле насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння, або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина рослини за винаходом, що містить екзогенні полінуклеотиди.
Також розкрита частина рослини, переважно насіння, яка володіє однією або більше з
Зо наступних ознак: ї) одержана з рослини за винаходом, ії) містить ліпід, розкритий в цьому документі, ії) може використовуватися в способі за винаходом, їм) містить генетичну конструкцію за винаходом, або м) містить набір екзогенних полінуклеотидів, як визначено в цьому документі.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння Вгаззіса парих, В. їнпсеа або Сатеїїмнпа заїїма, що містить ДГК, із вмістом вологи від приблизно 4 95 до приблизно 15 мас. 95, причому вміст ДГК в насінні становить щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
У варіанті реалізації винаходу розкрита клітина за винаходом, трансгенний організм за винаходом, рослина олійної культури за винаходом, рослина Вгаззіса парих5, В. |їнпсеа або
Сатвеїїйпа займа за винаходом, частина рослини за винаходом або насіння за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду, що володіє одним або більш або всіма ознаками, визначеними в цьому документі.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання клітини за винаходом, який включає: а) введення в клітину, переважно клітину, яка не здатна до синтезу ДЛ-ПНЖК, генної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, однієї або більш комбінацій екзогенних полінуклеотидів, визначених в цьому документі, б) необов'язково експресію генів або полінуклеотиду(ів) у клітині; в) необов'язково аналіз складу жирних кислот у клітині, і г) необов'язково селекцію клітини, яка експресує гени або полінуклеотид(и).
У варіанті реалізації винаходу ліпід в клітині володіє однією або більше ознак, визначених у цьому документі.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція, виділений та/або екзогенний полінуклеотид, вектор, генетична конструкція або комбінація екзогенних полінуклеотидів стають стабільно інтегрованими до геному клітини.
В іншому варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною рослини, і спосіб додатково включає стадію регенерації трансформованої рослини з клітини із стадії а).
В іншому варіанті реалізації винаходу гени та/або екзогенний(ії) полінуклеотид(и) тимчасово експресуються в клітині.
Також розкрита клітина, одержана із застосуванням способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання насіння, який включає: а) вирощування рослини за винаходом або рослини, яка утворює частину, розкриту в цьому документі, переважно в полі як частини популяції розміром щонайменше 1000 таких рослин або на площі щонайменше 1 гектар, насаджених із стандартною щільністю насадження, б) збір урожаю насіння з рослини або рослин, і в) необов'язково, екстракцію ліпіду з насіння, Переважно з одержанням олії із загальним виходом ДГК щонайменше 60 кг ДГК/гектар.
У варіанті реалізації винаходу рослина, клітина рослини, частина рослини або насіння за винаходом володіє однією або більше з наступних ознак: ї) олія є такою, як розкрито в цьому документі, ії) частина рослини або насіння можуть застосовуватися в способі за винаходом, ії) екзогенні полінуклеотиди введені в генетичну конструкцію за винаходом, ім) екзогенні полінуклеотиди включають екзогенний полінуклеотид за винаходом, м) клітина рослини є клітиною за винаходом, і мі) насіння одержане у відповідності до способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання однієї або більше десатураз жирних кислот та/(або елонгаз жирних кислот, або однієї або більше десатураз жирних кислот і однієї або більше елонгаз жирних кислот, причому вказаний спосіб включає експресію в клітині або неклітинній системі експресії генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектору або генетичної конструкції за винаходом, однієї або більше комбінацій екзогенних полінуклеотидів, розкритих в цьому
Зо документі, переважно в насінні олійної культури, що розвивається, на рослині олійної культури в полі.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається ліпід або олія, продуковані або одержані із застосуванням способу за винаходом, із клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгазвзіса парих, В. |нпсєа або Сатвеїїпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія одержані екстракцією олії з олійної культури.
Приклади олії з олійних культур включають, без обмеження, олію каноли (Вгаз5іса пари, підвид
Вгаззіса гара), олію гірчиці (Вгазбвіса |ппсеа), іншу олію Вгаззіса 5р., соняшникову олію (Неїапіпив аппив), льняну олію (І іпит и5іайввітит), соєву олію (Сіусіпе тах), сафлорову олію (Сапнатизвз ііпсіогіиз), кукурудзяну олію (7еа тауз), олію тютюну (Місоїапа іабасит), арахісове масло (Агаспі5 пуродаєа), пальмову олію, бавовняну олію ((зо55урішт пігшит), кокосове масло (Сосов писітега), олію авокадо (Регзеа атегісапа), оливкову олію (ОЇІеа еигораєа), олію кеш'ю (Апасагадішт оссідепіаіє), олію макадамії (Масадатіа іпіегагіоїйа), мигдальну олію (Ргипив5 атудаашв) або олію насіння Агарідорвзів (Агарідорвів ІНаїіапа).
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається жирна кислота, продукована або одержана із застосуванням способу за винаходом, з клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса париз, В. нпсєа або Сатеїнпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно жирна кислота являє собою ДГК. Жирна кислота може знаходитися в суміші жирних кислот, склад жирних кислот у якій є таким, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу жирна кислота є неетерифікованою.
Також розглядається шрот, отриманий з насіння за винаходом. Переважно шрот включає, не обов'язково обмежуючись ними, шрот Вгаз5зіса парив, В. |їнпсєа, Сатеїйна заїїма або Спіусіпе тах. У варіанті реалізації винаходу шрот містить екзогенний(і) полінуклеотид(и) та/або генетичні конструкції, як розкрито в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається композиція, що містить один або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за 60 винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса парих5, В. їдпсеа або
Сатвеіїпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом або макухи за винаходом. У варіантах реалізації винаходу композиція містить носій, придатний для фармацевтичного, харчового або сільськогосподарського застосування, сполуки для обробки насіння, добриво, інший харчовий продукт або поживний інгрідієнт, або додатковий білок або вітаміни.
Також розкриті харчові продукти (корми), косметика або хімічні речовини, що містять одне або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса пари5, В. |їнпсеа або
Сатвеіїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, макухи за винаходом або композиції за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання харчових продуктів (корму), який включає змішування одного або більше ліпідів, або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгабзіса парих5, В. їнпсеа або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, макухи за винаходом або композиції за винаходом, щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб лікування або попередження стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію, причому вказаний спосіб включає введення суб'єкту одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом,
Зо трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса парив, В. |їнпсєа або Сатвеїїйпа заїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом.
Приклади станів, при яких ПНЖК здійснюють сприятливу дію, включають, без обмеження, серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодістрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.
Також розкрите застосування одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгазвзіса парих5, В. |нпсєа або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування або попередження стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію. Одержання лікарського засобу може включати змішування олії за винаходом з фармацевтично прийнятним носієм, з метою лікування стану, розкритого в цьому документі. Спосіб може включати, по-перше, очищення та/або переетерифікацію олії та/"або фракціонування олії, з метою підвищення рівня ДГК. У конкретному варіанті реалізації винаходу спосіб включає обробку ліпіду або олії, наприклад, олії каноли, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Подальша обробка, наприклад, фракціонування або дистиляція, може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК. У переважному варіанті реалізації бо винаходу лікарський засіб містить етилові ефіри ДГК. У ще більш переважному варіанті реалізації винаходу рівень етилових ефірів ДГК в лікарському засобі становить від 30 95 до 50 95. Лікарський засіб може додатково містити етилові ефіри ЕПК, наприклад, від 30 95 до 50 95 від загального вмісту жирних кислот в лікарському засобі. Такі лікарські засоби придатні для введення суб'єктам-людям або тваринам при лікуванні медичних станів, як розкрито в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб торгівлі насінням, який включає одержання насіння за винаходом і торгівлі одержаним насінням з одержанням грошової вигоди.
У варіанті реалізації винаходу одержання насіння включає культивацію рослин за винаходом та/або збір урожаю насіння з рослин.
В іншому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає вміщення насіння до ємності та/або зберігання насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає перевезення насіння в інше місце.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає перевезення насіння в інше місце після продажу насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу торгівля здійснюється з використанням електронних засобів, наприклад, комп'ютера.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання бункерів з насінням, який включає: а) валкування, рядкове компостування та/або жнива наземних частин рослин, що містять насіння за винаходом, б) молотьбу та/або віяння частин рослин, з відокремленням насіння від залишку частин рослини, і в) просівання та/або сортування насіння, відокремленого на стадії б), і завантаження просіяного та/"або сортованого насіння в бункери, з одержанням в такий спосіб бункерів із насінням.
У варіанті реалізації винаходу, якщо це доречно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, за винаходом або придатні у відповідності до винаходу, містять приблизно такі рівні жиру, як розкрито в Таблиці в розділі Прикладів, наприклад, насіння 14 з Табл. 16.
Зо Будь-який варіант реалізації в цьому документі слід інтерпретувати як застосовний, з відповідними поправками, до будь-якого іншого варіанту, якщо конкретно не вказано інше.
Контекст цього винаходу не повинен обмежуватись конкретними варіантами, розкритими в цьому документі, які наведені тільки з метою ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи очевидно знаходяться в межах обсягу винаходу, розкритого в цьому документі.
В цьому документі, якщо конкретно не вказано інше або з контексту очевидно не слідує інше, посилання на єдину стадію, композицію речовини, групу стадій або групу композицій речовини повинно бути інтерпретоване як включаюче однину і множину (тобто, одну або більше) таких стадій, композицій речовини, груп стадій або груп композицій речовини.
Винахід додатково розкритий за допомогою наступних необмежуючих Прикладів, з посиланням на додані графічні матеріали.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фігура 1. Аеробні шляхи біосинтезу ДГК.
Фігура 2. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої меж руР3416-сА7. КВ позначає праву межу; ІВ, ліва межа; ТЕК, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання; РКО, промотор; кодуючі ділянки показані над стрілками, промотори і термінатори -- під стрілками.
Місри-АбО, Дб-десатуразаг! Місготопа5 ризіПа; Ругсо-ДАбЕ, Дб-елонгаза Ругатітопав согаайа;
Рамза-А5БО, Д5-десатураза Раміома заїїпа; Рісра-»30О, о3-десатураза Ріспіа разіогі5; Рамза-А40, да - десатураза Р. заїїпа; І асКкІ-А120, АЛ12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі; Ругсо-АБЕ, Д5-елонгаза
Ругатітопах согдаїйа. МОБ позначає ділянку термінатора транскрипції/поліаденілювання нопалінсинтази Адгобасіегічт їштеїасіеп5; ЕР1, укорочений промотор напіну Вгаб5зіса парив;
ЕАЕЇ, промотор Агарідорзів Іпнаіїапа ЕАЕ1; Ї есііп, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання лектину Сіусіпе тах; Спії і Спі2 позначає промотор або термінатор конлініну 1 або конлініну 2 Гіпит изіагйзвітит. ДПМ позначає ділянку прикріплення до матриксу КБ7 з Місоїапа їарасит.
Фігура 3. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої межі рОР3404. Позначення такі ж, як на Фіг. 2.
Фігура 4. Карта ділянки вставки від лівої до правої межі рОР3367. Позначення такі ж, як на
Фіг. 2.
Фігура 5. Рівні ДГК як відсоток загальних жирних кислот в ліпіді насіння декількох незалежних трансгенних зерен Агабідорзі5 Ійаїійапа в поколіннях Т» і Тз. Взяті в дужки події Т2 були відібрані для Тз. Проілюстровані події з генетичного оточення мутанта А. ІНаійапа Соїштбіа і тад2.
Фігура 6. Вміст олії (мас/мас) проти вмісту ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот ліпіду з трансгенних зерен Агарідорзів Шаїїапа.
Фігура 7. Характерний ЗТ-ПЛР гель, що ілюструє низьку експресію гена Аб-десатурази щодо інших трансгенів в Т-ДНК зародків В. парих5, трансформованих з використанням рОРЗ3416-СА7.
Доріжки зліва ілюструють продукти ЗТ-ПЛР: 1, ДНК маркери розміру; доріжка 2, Д12-десатураза; доріжка 3, 03-десатураза; доріжка 4, Дб-десатураза (низька експресія); доріжка 5, Аб-елонгаза; доріжка 6, Д5-десатураза; доріжка 7, Д5-елонгаза; доріжка 8, Л4-десатураза.
Фігура 8. Відсоток АЛК, нанесений на графік проти відсотка олеїнової кислоти, кожен у вигляді відсотку загальних жирних кислот в ліпіді, одержаному з трансгенних 355: ЕС2 соматичних ембріонів Вгаз5іса парив.
Фігура 9. Позиційний аналіз розподілу ЯМР на А) жирі тунця і, В) олії трансгенних зерен ДГК
Агарідорзів. Піки, позначені "ДГК-альфа" представляють кількість ДГК, присутньої в положеннях 5п-1 і 5п-3 ТАГ (без позиційної переваги це дорівнювало б 66 95 від загальної ДГК), тоді як піки, позначені "ДГК-бета" представляють кількість ДГК, присутньої в положенні 5п-2 ТАГ (без переваги це дорівнювало би 33 95 ДГК).
Фігура 10. Аналіз методом РХ-МС основних різновидів триацилгліцеролів, що містять ДГК, в трансгенному насінні, що розвивається (сірі), і зрілих (чорні), А. Іпаійапа. Число, наступне за ДГК, позначає загальну кількість атомів вуглецю і загальну кількість подвійних зв'язків у двох інших жирних кислотах. Таким чином, ДГК/34:1 може також бути позначений як ТАГ 56:7, тощо.
Фігура 11. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої межі рОКЕО4-411АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі. Позначення такі ж, як на Фіг. 2. 55), промотор маленької субодиниці рубіско Агабідорбвів ІПаїїапа.
Фігура 12. Карта бінарного вектора рОРЗ3364, що ілюструє рестрикційний сайт МОЇ!, в який були клоновані Д12-десатурази-кандидати.
Фігура 13. Коробчаста діаграма, що згенерована з використанням 5ідтаРіої та ілюструє
Зо відсоток жирної кислоти 20:4006 (АРК) в ліпіді насіння з популяцій насіння Т2 АгаБбідорзів, трансформованого реЕМОо45-реЕМО50. Межа кожного прямокутника, найближча до нуля, вказує на 25-й процентиль, лінія в межах кожного прямокутника позначає медіану, і межа кожного прямокутника, найвіддаленіша від нуля, вказує на 75-й процентиль. Стовпчики помилки, наведені вище і нижче кожного прямокутника, вказують на 90-й і 10-й процентилі.
Фігура 14. Середній рівень АРК як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння з насіння Т2 Агарідорзіз, трансформованого реЕМОо45-рЕМО50.
Фігура 15. Коробчата діаграма, що ілюструє відсоток жирної кислоти 20:206 (ЕДК) в ліпіді насіння з популяцій насіння Т2 Агабрідорзіх5, трансформованих реЕМОо45-рЕМО50. Коробчаста діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 16. Коробчаста діаграма, що ілюструє відсоток АРК в ліпіді насіння з популяцій насіння Т4 Агарідорзі5, трансформованих рЕМОо45-рЕМО50. Коробчата діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 17. Середній рівень АРК як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння з популяцій насіння Та Агарідорзіз, трансформованого рЕМОо45-рЕеЕМО50О.
Фігура 18. Коробчаста діаграма, що ілюструє відсоток ЕДК в ліпіді насіння з популяцій насіння Агарідорзіє Т4, трансформованих рЕМОо45-рЕМО50. Коробчата діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 19. (А) Основна структура фітостерину з кільцем і нумерацією бічного ланцюга. (В)
Хімічні структури деяких фітостеринів.
Фігура 20. Філогенетичне дерево відомих ЛФКАТ (І РААТ).
Фігура 21. Різноманітні ферменти обміну ацилу, які переносять жирні кислоти між ФХ, пулами КоА і пулами ТАГ. Адаптовано із 5іпдп еї аї. (2005).
КЛЮЧ ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІО МО: 1 -- послідовність нуклеотидів руР3416-САТ7.
ЗЕО ІО МО: 2 -- послідовність нуклеотидів роА7-тос В.
ЗЕО ІО МО: З -- послідовність нуклеотидів роА7-той 0.
ЗЕО ІО МО: 4 -- послідовність нуклеотидів роА7-той 0.
ЗЕО ІО МО: 5 -- послідовність нуклеотидів редА7-той Е.
ЗЕО ІО МО: 6 -- послідовність нуклеотидів роА7-той РЕ. бо ЗЕО ІО МО: 7 -- послідовність нуклеотидів роА7-той ОС.
ЗЕО ІЮ МО: 8 -- послідовність нуклеотидів РОКЕО4-11АВСВЕС Сомреа ЕРА іпзегі.
ЗЕБЕО І0О МО: 9 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А12- десатурази І аспапсеа Кіпумегі в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 10 -- Д12-десатураза І аспапсеа Кінумегі.
ЗБО І МО: 11 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Ф3- десатурази Ріспіа рабхіогі5 в рослинах.
ЗЕО ІО МО: 12 -- Ф3-десатураза Ріспіа равіогів.
ЗЕО ІЮ МО: 13 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-десатуразу Місготопах ризійа.
ЗЕБЕО 10 МО: 14 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Дб- десатурази Місготопах ризіа в рослинах (версія 1).
ЗЕБЕО 10 МО: 15 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Дб- десатурази Місготопаз ризіПа в рослинах (версія 2).
ЗЕО ІО МО: 16 -- Аб-десатураза Місготопах ризірна.
ЗЕБЕО ІЮ МО: 17 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча АДб-десатуразу О5ігеососси5
Іосітаїгіпив.
ЗЕБЕО 10 МО: 18 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Дб- десатурази О5ігеососсиз Іссітагіпи5 в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 19 -- ДАб-десатураза О5ігеососсиз Ісітагіпив.
ЗЕО ІЮ МО: 20 -- Аб-десатураза О5ігеососсиз їацгі.
ЗЕО ІЮ МО: 21 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-елонгазу Ругатітопазх согааца.
ЗЕО ІЮ МО: 22 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопаз согдага в рослинах (вкорочена на 3" кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 23 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопав5 согдаїа в рослинах (укорочена на 3" кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 2).
ЗЕО І МО: 24 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопаз согдага в рослинах (вкорочена на 3" кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 3).
Коо) ЗЕО ІЮ МО: 25 -- ДАб-елонгаза Ругатітопах согааїа.
ЗЕО І МО: 26 - вкорочена Аб-елонгаза Ругатітопах согааа.
ЗЕО ІЮ МО: 27 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Рамоома заїіпа.
ЗЕБЕО І0 МО: 28 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії д5- десатурази Раміома заїїпа в рослинах (версія 1).
ЗЕБЕО І0 МО: 29 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії д5- десатурази Раміома заїїпа в рослинах (версія 2).
ЗЕО ІЮ МО: 30 -- А5-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІО МО: 31 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Ругатітопах согааїа.
ЗЕО ІЮ МО: 32 -- А5-десатураза Ругатітопах согдаца.
ЗЕО ІЮ МО: 33 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-елонгазу Ругатітопах согааа.
ЗЕО І МО: 34 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопаз согааїа в рослинах (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 35 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопаз согааїа в рослинах (версія 2).
ЗЕО І МО: 36 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопаз согааїа в рослинах (версія 3).
ЗЕО ІЮ МО: 37 -- А5-елонгаза Ругатітопах согааїа.
ЗЕО І МО: 38 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Л4-десатуразу Рамоома заїіпа.
ЗЕБЕО І0 МО: 39 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії да4- десатурази Раміома заїїпа в рослинах (версія 1).
ЗЕБЕО І0 МО: 40 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Д4- десатурази Раміома заїїпа в рослинах (версія 2).
ЗЕО ІЮ МО: 41 -- Д4-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО: 42 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча лЛо9-елонгазу Ізоспгузі5 даїІбапа.
ЗЕО ІЮ МО: 43 -- Д9У-елонгаза Ізоспгузів даІбапа.
ЗЕБЕО І МО: 44 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча ЛОУ-елонгазу Епіїййапіа Пихіеуї
ССМРІ1516.
ЗЕО ІЮ МО: 45 --- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії ЛУ-елонгази
Етійапіа пихіеуї в рослинах. (510) ЗЕО ІЮ МО 46 -- Д9У-елонгаза Етіїїапіа пихієуї ССМР1516.
ЗЕО ІЮ МО 47 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Де9-елонгазу Раміома ріпдиі5.
ЗЕО ІЮ МО 48 -- Д9У-елонгаза Раміома ріпдиів.
ЗЕО ІЮ МО 49 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ле9-елонгазу Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 50 -- Д9У-елонгаза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 51 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ав8-десатуразу Раміома заїіпа.
ЗЕО І МО 52 - А8-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 53 -- вірусний супресор Р19.
ЗЕО ІЮ МО 54 -- вірусний супресор М2.
ЗЕО ІЮ МО 55 -- вірусний супресор РЗ38.
ЗЕО ІЮ МО 56 -- вірусний супресор Ре-РО.
ЗЕО ІЮ МО 57 -- вірусний супресор КРУ-РО.
ЗЕО ІЮ МО 58 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор Р19.
ЗЕО ІЮ МО 59 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор М2.
ЗЕО ІЮ МО 60 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор РЗ8.
ЗЕО ІЮ МО 61 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор Ре-РО.
ЗЕО ІЮ МО 62 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор КРУ-РО.
ЗЕО ІЮ МО 63 -- ЛФКАТ2 Агарідорвзів ІНаїіапа.
ЗЕО І МО 64 -- ЛФКАТ І ітпапінез аїра.
ЗЕО І МО 65 -- ЛФКАТ Засспаготусез сегемівіавє.
ЗЕО ІЮ МО 66 -- ЛФКАТ Містотопаз ризвіїа.
ЗЕО ІО МО 67 -- ЛФКАТ МопієгеїІа аїріпа.
ЗЕО ІО МО 68 -- ЛФКАТ Вгассіза парив.
ЗЕО ІО МО 69 -- ЛФКАТ Вгавзвіса парив.
ЗЕО ІЮ МО 70 -- 03 десатураза Рпуїюоріннога іптевіапв.
ЗЕО І МО 71 --- Ф3 десатураза ТНаїЇаззіовіга реейдопапа.
ЗЕО ІЮ МО 72 -- 3 десатураза РушШйіит ігедшаге.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Загальні способи і визначення
Якщо конкретно не визначено інше, всі технічні і наукові терміни, використані в цьому документі, слід розуміти, як маючі таке ж значення, якого завжди надає їм середній фахівець в даній галузі техніки (наприклад, в культивуванні клітин, молекулярній генетиці, синтезі жирних кислот, трансгенних рослинах, хімії білка і біохімії).
Якщо не вказано інше, рекомбінантний білок, культура клітин та імунологічні методи, що використовуються в цьому винаході, являють собою стандартні способи, добре відомі фахівцям з рівня техніки. Такі методики описані і пояснені в літературних джерелах, наприклад, -. Регваї,
А Ргасіїса! Сціде тю МоїіІесшіаг Сіопіпуд, допп Умієу апа 5опз (1984), 9). затрьгоок еї а!., МоІесшіаг
Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапаиаї, Соїа 5ргіпд Нагроиг І арогафогу Ргезз (1989), Т.А. Вгом/п (редактор),
Еззепіла! МоїІесшіаг Віоіоду: А Ргасіїса! Арргоасі, Моїштез 1 апа 2, ІКГ. Ргез5 (1991), О.М. сСіІомег апа В.О. Натез (редактори), ОМА Сіопіпд: А РгасіїсаІ! Арргоасії, МоЇїштез 1-4, ІКГ. Ргез5 (1995 і 1996), Г.М. А!йзибреї! еї аїЇ. (редактори), Сиггепі РгоїосоЇ5 іп Моїесшіаг Віоюду, Сгеепе Риб.
Авзосіаїе5 апа УМіеу-Іпіег5сіепсе (1988, включаючи всі видання до сьогоднішнього дня), Еа
Напомж апа Оамій ІГапе (редактори), Апііродіез: А ІГарогаїгу Мапиаї, Соїй Зргіпд Нагроиг
І арогагогу, (1988) і У.Е. Соїїдап еї а. (редактори), Ситепі Ргоїосої5 іп Іпттипоїоду, допп Уміеу 5 оп5 (включаючи всі видання до сьогоднішнього дня).
Термін "та/або", наприклад, "Х та/або У" слід розуміти, як такий, що позначає будь-яке з "Х і
У" або "Х або У", і його слід інтерпретувати як явно підтримуючий обидва значення або будь-яке із значень.
В цьому документі термін "близько", якщо не вказано протилежне, позначає ч/- 10 95, більш переважно ч-/- 5 95, більш переважно «/- 1 95 від наведеного значення.
В цьому документі слово "включають" або його варіації, наприклад, "включає" або "який включає" слід розуміти, як таке, що позначає включення заявленого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Деякі визначення
В цьому документі терміни "екстрагований рослинний ліпід" і "виділений рослинний ліпід" позначають ліпідну композицію, що виділена, наприклад, шляхом подрібнення, з рослини або її частини, такої як насіння. Екстрагований ліпід може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових бо кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені. Нижче розкриті приклади способів очищення. У варіанті реалізації винаходу екстрагований або виділений рослинний ліпід містить щонайменше приблизно 6095, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 мас./мас. 95 ліпіду в композиції. Ліпід може бути твердим або рідким за кімнатної температури, якщо він є рідиною, то має назву олії. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід за винаходом не змішується з іншим ліпідом, наприклад, ДГК, що не продукованою іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота: ДГК, пальмітинова кислота: ДГК, лінолева кислота: ДГК, і загальні 06 жирні кислоти: загальні 03 жирні кислоти, істотною мірою не змінюються (наприклад, не більш, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід не обробляється процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінити одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота: ДГК, пальмітинова кислота:
ДГК, лінолева кислота: ДГК і загальні 06 жирні кислоти: загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. Якщо екстрагований рослинний ліпід за винаходом міститься в олії, олія може додатково містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
В цьому документі терміни "екстрагована рослинна олія (масло)» і "виділена рослинна олія (масло)» позначають речовину або композицію, що містить екстрагований рослинний ліпід або виділений рослинний ліпід, що є рідким за кімнатної температури. Олію одержують з рослини або її частини, наприклад, насіння. Екстрагована або виділена олія може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі, з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені.
Композиція може містити інші компоненти, що можуть бути ліпідними або неліпідними. У варіанті реалізації винаходу олійна композиція містить щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 7095, щонайменше приблизно 80 956, щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 мабс./мас. 95 екстрагованого рослинного ліпіду. У варіанті реалізації винаходу екстрагована олія за винаходом не змішується з іншим маслом, таким як
Зо ДГК, не продукована іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу, після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота: ДГК, пальмітинова кислота: ДГК, лінолева кислота: ДГК і загальні об жирні кислоти: загальні 03 жирні кислоти істотно не змінюються (наприклад, не більше, ніж 10 9о або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстраговану олію рослини не обробляють процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінювати одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота: ДГК, пальмітинова кислота: ДГК, лінолева кислота: ДГК і загальні б жирні кислоти: загальні 003 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині.
Екстрагована рослинна олія за винаходом може містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
В цьому документі "олія (масло)» являє собою композицію, що містить в основному ліпід і є рідкою за кімнатної температури. Наприклад, олія за винаходом переважно містить щонайменше 75 956, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95 або щонайменше 90 мас. 95 ліпіду.
Як правило, очищена олія містить щонайменше 90 мас. 95 триацилгліцеролів (ТАГ), від вмісту ліпіду в олії. Мінорні компоненти олії, такі як діацилгліцероли (ДАГ,, вільні жирні кислоти (ВЖК), фосфоліпід і стероли, можуть бути присутніми, як розкрито в цьому документі.
В цьому документі термін "жирна кислота" позначає карбонову кислоту (або органічну кислоту), часто з довгим аліфатичним хвостом, насиченим або ненасиченим. Зазвичай жирні кислоти містять ланцюг вуглець-вуглецевих зв'язків завдовжки щонайменше 8 атомів вуглецю, більш переважно завдовжки щонайменше 12 атомів вуглецю. Більшість жирних кислот, що зустрічаються в природі, містить парну кількість атомів вуглецю, оскільки в їх біосинтезі приймає участь ацетат, що містить два атоми вуглецю. Жирні кислоти можуть бути у вільному стані (неетерифіковані) або в етерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку.
Жирна кислота може бути етерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. "Насичені жирні кислоти" не містять подвійних зв'язків або інших функціональних груп уздовж ланцюга. Термін "насичений" позначає водень, з тим, що всі атоми вуглецю (окрім групи бо карбонової кислоти |-СООНІ) містять максимально можливу кількість водню. Іншими словами,
омега (0)) кінець містить З атоми водню (СНЗ-), і кожен атом вуглецю в межах ланцюга містить 2 атоми водню (-СН2-). "Ненасичені жирні кислоти" за формою подібні до насичених жирних кислот, за винятком того, що одна або більше алкенових функціональних груп присутні вздовж ланцюга, причому кожен алкен замінює одинарний зв'язок «-СН2-СН2г-» частини ланцюга подвійним зв'язком «-
СнН-СН-» (тобто, вуглець приєднаний подвійним зв'язком до іншого атома вуглецю). Два наступні атоми вуглецю в ланцюгу, які приєднані до кожної із сторін подвійного зв'язку, можуть бути присутніми в цис або транс конфігурації.
В цьому документі термін "мононенасичена жирна кислота" позначає жирну кислоту, що містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу, і лише одну алкенову групу (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в ланцюгу. В цьому документі терміни "поліненасичена жирна кислота" або "ПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше дві алкенові групи (подвійні вуглець-вуглецеві
Зв'язки).
В цьому документі терміни "довголанцюгова поліненасичена жирна кислота" і "ДЛ-ІПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 20 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше два подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки, і таким чином включають ДДЛ-ПНЖК. В цьому документі терміни "поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом" і "ДДЛ-
ПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 22 атоми вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше три подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки. Звичайно, кількість атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу жирних кислот відноситься до нерозгалуженого вуглецевого ланцюга. Якщо вуглецевий ланцюг розгалужений, кількість атомів вуглецю виключає атоми вуглецю бічних груп. В одному варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота являє собою 03 жирну кислоту, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець- вуглецевий зв'язок) в положенні третього вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти. В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота є 0б жирною кислотою, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в положенні шостого вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти.
В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота вибрана з групи, що складається з: арахідонової кислоти (АРК, 20:4А5,8,11,14; 06), ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК, 20:4Д8,11,14,17, 03), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5А5,8,11,14,17; 03), докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:5А47,10,13,16,19, 03) або докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:6Д4,7,10,13,16,19, 03). Крім того, ДЛА-ПНЖК можуть являти собою дигомо-у-лінолеву кислоту (ДГЛК) або ейкозатриєнову кислоту (ЕТрК, 20:3А11,14,17, 03). Буде очевидно, що ДЛ-ПНЖК, одержана у відповідності до винаходу, може бути сумішшю будь-яких або всіх згаданих вище сполук, і може містити іншу ДЛ-ПНЖК або похідні будь-якої з наведених ДЛ-ПНЖК. В переважному варіанті реалізації винаходу 03 жирні кислоти являють собою щонайменше ДГК, переважно ДПК і ДГК або ЕПК, ДПК і ДГК.
Додатково, в цьому документі терміни "довголанцюгова поліненасичена жирна кислота" і "поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом" позначають жирну кислоту, що знаходиться у вільному стані (неетерифіковану) або в етерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку. Жирна кислота може бути етерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. Тому, ДЛ-ПНЖК може бути присутньою як суміш форм в ліпіді клітини або очищеній олії або ліпіді, екстрагованих з клітин, тканин або організмів. У переважних варіантах реалізації винаходу розкривається олія, що містить щонайменше 75 96 або щонайменше 85 95 триацилгліцеролів, причому решта представлена іншими формами ліпіду, такими як згадані вище, у яких присутні щонайменше вказані триацилгліцероли, що містять ДЛ-ПНЖК. В подальшому олія може бути додатково очищена або оброблена, наприклад гідролізом із сильною основою, з метою вивільнення вільних жирних кислот, або дистиляцією, тощо.
В цьому документі вираз "загальні б жирні кислоти" або "загальний вміст 0б жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 0б жирних кислот, етерифікованих і неетерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену як відсоток від загального вмісту жирних кислот. Вказані б жирні кислоти включають (за наявності) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї об6-ДПК, але виключають будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
В цьому документі вираз "нові 0б жирні кислоти" або "вміст нових об жирних кислот" або бо подібний позначає суму всіх 0б жирних кислот, за винятком ЛК, етерифікованих і неетерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові об жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослини і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (за наявності) ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї об-ДПК, але виключають ЛК і будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Характерний загальний вміст 0б жирних кислот і вміст нових 06 жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК їі результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
В цьому документі вираз "загальні 03 жирні кислоти" або "загальний вміст 03 жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 03 жирних кислот, етерифікованих і неетерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот. Такі 03 жирні кислоти включають (якщо вони присутні) АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК, і виключають будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
В цьому документі вираз "нові 03 жирні кислоти" або "вміст нових 03 жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 03 жирних кислот, за винятком АЛК, етерифікованих і неетерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові 03 жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослин і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (якщо вони присутні) СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК,
ДПК ї ДГК, але виключають АЛК і будь-які 0б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
Характерний загальний вміст 03 жирних кислот і вміст нових 03 жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК ії результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
Білки десатураза, елонгаза і ацилтрансфераза та гени, що кодують їх, які можуть застосовуватися у відповідності до винаходу, є будь-якими з відомих в рівні техніки або їх гомологами або похідними. Приклади таких генів і розмір кодованих білків наведені в Табл. 1.
Зо Ферменти десатурази, для яких продемонстровано участь в біосинтезі ДЛ-ПНЖК, всі належать до групи так званих "попі-епа" десатураз.
В цьому документі термін "пМопі-епі десатураза" позначає члена класу ферментів, які вводять подвійний зв'язок між карбоксильною групою і вже існуючою ненасиченою частиною ацильного ланцюга ліпідів, які структурно характеризуються присутністю домену М-кінцевого цитохром Б5, разом з типовим доменом десатурази жирних кислот, що містить три високою мірою консервативних гістидинових бокси (Маріеєг еї аї., 1997).
Активність будь-якої з елонгаз або десатураз для застосування у відповідності до винаходу може бути протестована шляхом експресії гена, що кодує фермент, в клітині, такій як, наприклад, дріжджова клітина, рослинна клітина, або переважно в соматичних ембріонах або трансгенних рослинах, і визначення того, чи володіє клітина, ембріон або рослина підвищеною здатністю до продукування ДЛ-ПНЖК, в порівнянні з аналогічною клітиною, ембріоном або рослиною, у яких фермент не експресується.
В одному варіанті реалізації винаходу одна або більше десатураз та/або елонгаз для застосування у відповідності до винаходу можуть бути одержані з мікроводорості і очищені, тобто мати послідовність амінокислот, ідентичну поліпептиду, який може бути одержаний з мікроводорості і очищений.
Хоча деякі ферменти конкретно розкриваються в цьому документі як "біфункціональні", відсутність такого терміну не обов'язково означає, що конкретний фермент не володіє іншою активністю, окрім конкретно розкритої.
Десатурази
В цьому документі термін "десатураза" позначає фермент, що здатний вводити подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок до ацильної групи жирнокислотного субстрату, який звичайно знаходиться в етерифікованій формі, наприклад, ефіри ацил-КоА. Ацильна група може бути етерифікована до фосфоліпіду, наприклад, фосфатидилхолін (ФХ), або до білка-носія ацилу (БНА), або, в переважному варіанті реалізації винаходу, до КоА. Десатурази загалом можуть бути розділені на три групи, відповідно. В одному варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою їгопі-епа десатуразу.
В цьому документі «Д4-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 4-го вуглець-вуглецевого зв'язку бо від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше «л4-десатураза" здатна перетворювати ДПК на ДГК. Стадія десатурації з утворенням ДГК з ДПК каталізується Д4- десатуразою в організмах, що не відносяться до ссавців, і ген, що кодує даний фермент, виділений із виду прісноводних найпростіших Ецпдіепа адгасіїї5 і морських видів Тпгаивіоспуїгіт (Оїм еї аїІ., 2001; Меуег еї аІ., 2003). В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Л4-десатурази відповідає представленій в ЗЕО ІЮ МО: 41, або Д4-десатуразі виду
Тигаивіоспуїсіцт, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній 5ЕО ІЮ МО: 41.
Таблиця 1
Клоновані гени, що беруть участь в біосинтезі ДЛА-ПНЖК
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (аю) да-десатураза АУг78558 Меуєег еї а... 2003 0 ІВодорості | Раміома ІшіНепі АУЗ332747 Топоп ві а!., 2003 : Регеїга єї аї., 11111011 |Рамомавайна /// |ААМТ5136 пом егаі., 2007
ААМ75707 . до пгашзіоспутит ААМ75708
Траустохітридієві ашецут ААМ75709 515 |Отсутствуют
ААМ75710
Тигаймвіоспуїнит 5р. !
Сно єї а!., 1999р д5-десатураза |Ссавці Ното зарієп5 АР199596 444 |Іеопаюега)., 2000р
Міснає!5оп еї аї.,
Нематода Саєпотнараїйів АР11440, 447 19986р; еіедапо ММ 069350 Мане апа Вгом/зе, 1999р
Міснає!5оп еї аї., . ! 1998а;
Гриби Мопіегеїа аіІріпа АРО67654 446
Кпиїгоп вії аї., 1998 0 ІРушіштійедшаге /|АЕ419297 Нопа ві а!., 2002а дівсоїдент 11111101 |Барюоієопіасїістта | 1 470 |М/О02081668 . . Рпаводасіу нт Ротегоие еї аї., 0 |ІВодорості 0/0 | Тигайвіоспуйнит зр. | АЕА89588 Ом еї а!., 2001 ашейт 11111011 (івоспгувівдарала,ї | | 442 |М/О02081668
Магснапійа КаїїКама еї аї!.,
Сно єї а!., 1999а; дб-десатураза |Ссавці Ното зарієп5 ММ 013402 444 (|Іеопаюдега)., 2000 11111101 |Мивтивсшив ММ 019699 444 |Споеїа)!. 19994 вівдапз
Еспішт АУО55117 Сагсіа-Магою єї
АХО55118 а!І., 2002
Зо
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (ак) ! ще Зауапома в! аї., р. М піїпеу єї аї.,
Магснапійа КаїїКама еї аї!., 1 ТРпузсотійгейа раїєпв| СААТ110О33 СсіїКе вї а!., 1998
Ниапа еї а!., 1999; ! ! АР110510 г " 0 ІРушіштійедшаге /|АЕ419296 Нопа ві а!., 2002а 0 1Мисог сіїсіпеоіде5 | АВО52086 МОВІ" 11110171 (вид ?Айігориз///// |АУЗгог88 папа еї а!., 2004 11111101 |Барюоієопіасїістта | 1 453 |М/О02081668 . . Рпаєдастут Ротегоие еї аї., 11111111 |Бактерї |Бупеспосувів///// |11421 Веддау еї а!., 1993 ашеит
Біфункціональна !
АБІДВ- рапіо гегіо АЕЗОеББЄ | 444 |бипОв Га, десатураза
С20 дВ- : Не маїїїв апа Вгомузе,
Дв-елонгаза | Нематода Саепотарайів ММ 069288 288 | еацооіп еї а, еієдапз 2000 0 |Мохи 00/00 |Рпузсотійнеїйіа раїєпзі АЕ428243 7апк еї а!., 2002
Магснапійа КаїїКама еї аї!., 11111111 Ф|Водорості |Рамомаішшей" | 501 |МО0о3078639
І Тпгайвіоснуйит АХ9О51565 МО 03093482 вид сно |АХ214454 УГО 0159128
Тпгаймвіоспуїит
Ї еопага вї аї.,
ПНЖК-елонгаза | Ссавці Ното зарієп5 Агг31981 299 |70000;
Ї еопага вї аї., 2002 11110171 |Вайивпогмедісив |АВО71985 Іпадакі еї а!., 2002 11101771 |Вайивпогмедісив" |АВО71986 Іпадакі еї а!., 2002 11110171 |Мивтивсшив //// ГАРТ70907 Тугаїк еї аї., 2000 11111011 |Мивтивслив//// ГАРТ7О908 Тугаїк еї аї., 2000 10017111 |Оапіотейо" ММ 199532, 266 Моеїа|. 2003
Савпогпабсійів Аррбої! еї а!., 1998
Черв'як сіедапе 4268749 309 |Веацабоіп еї аї., 9 2000 ашеит
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (аю) 11017711 (|Рамомашейї" | 0 320 |МО0о3078639 Щ 11101771 |Ецбієпадгасіїв/// | 0 258 |МОовлевг0 10001711 |Ругатітопавсогіатв///// 0 268 |М/О 2010/057246 вид Раміома Регеїга єї аї., п о о СТИ МОДІ Мао 11110171 |Рамомавайна |ААМІ5І35 / 302 |ВНорепегаї., 2009 фено ет рнню зе фюренаов рзепдопапа 11111111. Ф|Риба |Опсотйупспив пуківв САМ5586б2 295 |М/006/008099 Ж
Магснапійа КаїїКама еї аї!., мк 000 роутера ВАЕЛИо зе юри " перулумли. порі. піт. піп. дом/ "7" Функція не доведена/не продемонстрована
В цьому документі «Д5-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 5-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Приклади «Д5-десатураз" наведені в Киї?-
І оре? еї аї. (2012) і Реїгіє еї аї. (2010а), а також у Табл. 1 цього документу. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5-десатурази відповідає представленій в ЗЕ
ІО МО: 30, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній 5ЕО ІЮО МО: 30. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот д5-десатурази відповідає представленій 5ЕО ІЮ МО: 32, її біологічно активному фрагменту, або послідовності амінокислот, щонайменше на 53 95 ідентичній 5ЕО ІО МО: 32. В іншому варіанті реалізації винаходу Д5-десатураза одержана з виду Тпгаизіоспуїгічт або Етіїапіа пихіеуї.
В цьому документі «Дб-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 6-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Приклади Дб-десатураз наведені в Киї2-
І оре еї аї. (2012) і Реїгіє еї аІ. (2010а), а також в Табл. 1 цього документу. Переважні Дб- десатурази одержані з Місготопах ризійа, Рушйічт ігедшіаге або О5ігеососсиз їашгії.
У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза додатково характеризується наявністю щонайменше двох, переважно всіх трьох і переважно в рослинній клітині, з наступного: ї) вища активність Лб-десатурази по відношенню до а-ліноленової кислоти (АЛК, 18:349,12,15, Ф3), ніж по відношенню до лінолевої кислоти (ЛК, 18:2/А9,12, б) як жирнокислотного субстрату; ії) вища активність Дб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату; іїїї) активність Д8-десатурази по відношенню до ЕТрК. Приклади таких Аб-десатураз наведені в
Табл. 2.
У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю по відношенню до 03 субстрату, ніж по відношенню до відповідного 06 субстрату, і володіє активністю по відношенню до АЛК з утворенням октадекатетраєнової кислоти (стеаридонова кислота, СДК, 18:4А6,9,12,15, Ф3), з ефективністю щонайменше 30 95, більш переважно щонайменше 40 95, або найбільш переважно щонайменше 5095, при експресії з екзогенного полінуклеотиду в
Зо рекомбінантній клітині, такій як рослинна клітина, або щонайменше 3595 при експресії в дріжджовій клітині. В одному варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше приблизно в 2 рази вищою активністю Дб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж по відношенню до ЛК як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу Лб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше приблизно в 5 разів вищою активністю ДЛб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до
АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу, Аб-десатураза володіє активністю по відношенню до обох жирнокислотних субстратів -- АЛК-КоА і АЛК, приєднаних в положенні 5п-2 ФХ.
Таблиця 2
Десатурази, які продемонстрували активність на субстраті ацил-КоА
Фермент Тип Номери Размер Посилання організму доступу білка (ак) . МапіопієЇїа Нойтантнт ві аї.,
Реїгів вї аї.,
Містотопаз ривіїїа | ЕЕНЬ8637 2010ба (5ЗЕО ІЮ
МО: 13 . МапіопієЇїа Нойтантнт ві аї.,
Руїпійт Хие ві аї., 2012;
Гриби . Хие ві аї., 2012;
ШИ (ооміцет) гпитогит ГМУЗб2213 Зб МО2008/054565
В одному варіанті реалізації винаходу Аб-десатураза не володіє активністю А5-десатурази по відношенню до ЕТК, яка могла би бути виявлена. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 19 або ЗЕО
ІО МО: 20, їх біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 77 У ідентичною ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 19 або 5ЕО ІЮО МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДЛб-десатурази представлена 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮ
МО: 20, їх біологічно активним фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 67 95 ідентичною одній або обом з 5ЕО ІЮО МО:19 або 5ЕО ІЮ МО: 20. Крім того, Аб-десатураза може володіти активністю А8-десатурази.
В цьому документі «Д8-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 8-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше Дв8-десатураза здатна перетворювати ЕТрК на ЕТК. Приклади А8-десатураз наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Л8-десатурази відповідає представленій 5ЕО ІЮ
МО: 52, її біологічно активним фрагментом або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮО МО: 52.
В цьому документі «0ш3-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 3-ого вуглець-вуглецевого зв'язку від метилового кінця жирнокислотного субстрату. Таким чином, 03-десатураза може перетворювати ЛК на АЛК і ГЛК на СДК (всі С18 жирні кислоти), або ДГЛК на ЕТК та/або АРК на
ЗПК (020 жирні кислоти). Деякі 03-десатурази (група І) володіють активністю тільки на С18 субстратах, таких як рослинні і ціанобактеріальні 03-десатурази. Такі о3-десатурази також є
А15-десатуразами. Інші 03-десатурази виявляють активність на субстратах С20 без активності (група Ії) або з деякою активністю (група ІІ) на субстратах С18. Такі о3-десатурази також є А17- десатуразами. Переважними о03-десатуразами є група Ії типу, яка перетворює ЛК на АЛК, ГЛК на СДК, ДГЛК на ЗТК їі АРК на ЗПК, наприклад, Ріспіа разіогі5 Ф03-десатураза (ЗЕО ІЮ МО: 12).
Приклади о3-десатураз включають описані Регеїга еї аї. (2004а) (03-десатураза ЗаргоІедпіа
Зо адісіїпа, група ІІ), Ногідисні еї аїЇ. (1998), Вегрегісп еї аІ. (1998) ії 5руспайНа еї аї. (1997) (Ф3- десатураза С. еІєдап5, група ІІ). В переважному варіанті реалізації винаходу д03-десатураза являє собою грибкову 03-десатуразу. В цьому документі "грибкова ю3-десатураза" позначає 0ш3-десатуразу, одержану з грибкового джерела, в тому числі, ооміцетного джерела, або її варіант з послідовністю амінокислот, щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні 03-десатурази, виділені з грибкових джерел, таких як, наприклад, Рпуїорпїйога іптезіап5 (номер доступу САУЗОВ87О, УМО2005083053; 5ЕО ІЮО МО: 70), заргоієдпіа дісіїпа (номер доступу ААК20444, Регеїга еї аІ, 2004а і патент США Мо 7211656), Руїйпішт ігедшаге (МО2008022963, Група ІІ; 5ЕБО ІО МО: 72), МогііегеПа аїріпа (ЗаКигадапі еї аї., 2005; номер доступу ВАБУО1495; М/О2006019192), Тпаїіазвзіозіга роендопапа (Аптбгиві еї аї.,, 2004; номер доступу ХР 002291057; ММО2005012316, 5ЕО ІЮ МО: 71), І аспапсеа Кіпумегі (також відомий як засспаготусез Кішумегі; Оишга еї аї., 2004; номер доступу АВ118663). Хиє еї аї. (2012) описує Ф3- десатурази з ооміцетів Руїйішт арпапідептайшт, РпуорпїШога зоідає і Рпуїорпійога гатогит, здатні ефективно перетворювати жирнокислотні субстрати 06 на відповідні 03 жирні кислоти, з перевагою у відношенні субстратів С20, тобто ті, що володіють вираженішою активністю А17- десатурази порівняно з активністю Д15-десатурази. Такі ферменти не володіють активністю д12-десатурази, але здатні використовувати жирні кислоти в ацил-КоА і фосфоліпідній фракції як субстрати.
У більш переважному варіанті реалізації винаходу грибкова 03-десатураза являє собою 03- десатуразу/л15-десатуразу Ріспіа разіогі5 (також відома як КотадаїаєїІіа равіогі5) (папа еї аї., 2008; номер доступу ЕР116884; 5ЕО ІЮО МО: 12) або поліпептид, який щонайменше на 95 95 ідентичний їй.
У варіанті реалізації винаходу 0З-десатураза здатна здійснювати щонайменше одне з наступних перетворень: АРК на ЕПК, ДГЛК на ЕТК, ГЛК на СДК, АРК на ЕПК і ДГЛК на ЕТК, АРК на ЕПК і ГЛК на СДК, або всі три з них.
В одному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє активністю А17-десатурази по відношенню до жирної кислоти С20, яка містить щонайменше три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно АРК. В іншому варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє активністю ДІ15-десатурази по відношенню до жирної кислоти С18, яка містить три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно ГЛК. Переважно обидва види активності присутні.
В цьому документі «А12-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 12-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Звичайно А12-десатурази перетворюють олеоїл-фосфатидилхолін або олеоїл-КоА на лінолеоїл-фосфатидилхолін (18:1-
ФХ) або лінолеоїл-КоА (18:1-КоА), відповідно. Підклас, що використовує пов'язаний з ФХ субстрат, називають фосфоліпід-залежними Д12-десатуразами, другий підклас -- ацил-Код-
Зо залежними А12-десатуразами. Рослинні і грибкові А12-десатурази звичайно відносяться до першого підкласу, тоді як тваринні А12-десатурази відносяться до другого підкласу, наприклад,
Д12-десатурази, кодовані генами, які клоновані з комах 2Ппоци еї аї. (2008). Численні інші послідовності АТ2-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
В цьому документі «А15-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 15-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Численні гени, що кодують А15- десатурази, клоновані з рослинних і грибкових видів. Наприклад, в 55952544 розкриті нуклеїнові кислоти, що кодують рослинні А15-десатурази (ЕАОЗ). Ці ферменти містить мотиви амінокислот, які були характерними для рослинних А15-десатураз. У УМО200114538 розкритий ген, що кодує БАЮЗ сої. Численні інші послідовності ДТ5-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
В цьому документі «А17-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 17-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Крім того, А17-десатураза розцінюється як 03-десатураза, якщо вона діє на субстрат С20, з введенням десатурації в положенні зв'язку 003.
У переважному варіанті реалізації винаходу Д12-десатураза та/або Л15-десатураза являє собою грибкову Д12-десатуразу або грибкову А15-десатуразу. В цьому документі "грибкова А12- десатураза" або "грибкова А15-десатураза" позначає Д12-десатуразу або А15-десатуразу, одержану з грибкового джерела, зокрема, ооміцетного джерела, або її варіант, послідовність амінокислот якого є щонайменше на 95595 ідентичною їй. Гени, що кодують численні десатурази, виділені з грибкових джерел. У 05 7211656 розкрита Л12-десатураза із ЗаргоІедпіа дісіпа. У УМО2009016202 розкриті грибкові десатурази з Нейобраеїйа гобривіа, І ассагіа бБісоїог,
Гоша дідапієа, Місгтосоїєн5 сПпіпопоріабзієїх, Мопозіда Бгемісоїй5, МусозрпаєгейМйа Піепвів,
МусозраеєгеМйа дгатіпісоїа, Маедієпа дгибеп, Месійа Паєтайюсосса, МетаїйозівЇа месіеєпвів,
Рпусотусез ріаКезієвапив, ТПісподетта гевзії, РнпузсотійгеїМа раїєпв, Розійа ріасепіа, ЗеїІадіпеПа тоеїПепаогнії і Місгодоспішт пімаіе. У М/О2005/012316 розкрита А12-десатураза з ТНаїазвіовіга рхешйдопапа та інших грибів. У ММО2003/099216 розкриті гени, кодуючі грибкові Д12-десатурази і бо д15-десатурази, виділені з Меигозрога сгазза, АзрегудйШив піашапз, Воїгуїй5 сіпегеа і МогііегеПМа аіІріпа. У УМО2007133425 розкриті грибкові А15 десатурази, виділені з: Засспаготусевз Кішумегі,
Мопіегеїа аїріпа, Аврегодїйиє підшап5, Мецтозрога сгтабзбза, Еивагцт дгатіпеагит, Еизапйит топіїйопте і Мадпаройне дгізеєа. Переважна Л12 десатураза виділена з РНуїорнпіпога 5оі|ає (Виї2-І оре? ві а!., 2012).
Іншим підкласом грибкових А12-десатураз і грибкових Д15-десатураз є біфункціональні грибкові Д12/А15-десатурази. Гени, що кодують їх, клоновані з Ризагішт топоїїйогпте (номер доступу 00272516, Юатиде еї аї., 2006), Асапіпатоебра сазіеПапії (номер доступу ЕБО17656,
Зауапома еї аї., 2006), Реккіпзив таїгіпив (М/О2007042510), Сіамісер5 ритригеа (номер доступу
ЕР5З36898, Меезаруосазик еї а!., 2007) ії Соргіпи5 сіпегеи5 (номер доступу АЕ269266, 2Ппапо еї аї., 102007).
В іншому варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю, переважно більшою активністю, по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до субстрату відповідного ацил-ФХ. В цьому документі "відповідний субстрат ацил-ФХ" позначає етерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж жирною кислотою, як в субстраті ацил-КоА. Наприклад, субстрат ацил-КоА може бути АРК-КОА, і тоді відповідний субстрат ацил-ФХ являє собою 5п-2 АРК-ФХ. У варіанті реалізації винаходу активність щонайменше вдвічі вища. Переважно о03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА і відповідного субстрату ацил-ФХ, і володіє активністю по відношенню до субстратів С18 і С20. Приклади таких Ф3- десатураз відомі серед клонованих грибкових десатураз, наведених вище.
В іншому варіанті реалізації винаходу о3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІЮО МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 12, переважно є щонайменше на 90 95 або щонайменше на 95 95 ідентичною ЗЕО ІЮ МО: 12.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж відповідного субстрату ацил-ФХ. В іншому варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-ФХ, ніж відповідного субстрату ацил-КоА, але володіє деякою активністю по відношенню до обох субстратів. Як окреслено
Зо вище, "відповідний субстрат ацил-ФХ" позначає етерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж, як жирна кислота в субстраті ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу вища активність означає щонайменше вдвічі вищу активність. У варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою Д5- або Аб-десатуразу, або ошЗ3-десатуразу, приклади яких розкриті, без обмеження, в Табл. 2. З метою тестування того, на який субстрат діє десатураза, а саме, на субстрат ацил-КоА або ацил-ФХ, можуть бути проведені аналізи на дріжджових клітинах, як описано в Юотегопце еї аї. (2003) і (2005). Крім того, здатність десатурази діяти на субстрат ацил-КоА може передбачатися, якщо елонгаза, яка експресується разом з десатуразою, демонструє ефективність ферментного перетворення в рослинних клітинах щонайменше близько 90 95, якщо елонгаза каталізує елонгацію продукту десатурази. Базуючись на цьому, Д5-десатураза і Л4-десатурази, що експресуються із конструкта СА7 (Приклади 2 і 3) та їх варіанти (Приклад 5) здатні до десатурації відповідних ацил-КоА субстратів, ЕТК-КоА і ДПК-КоА.
Елонгази
Біохімічні докази наводять на думку про те, що елонгація жирної кислоти складається з 4-х стадій: конденсація, відновлення, дегідратація і друге відновлення. В контексті цього винаходу, "елонгаза" позначає поліпептид, що каталізує стадію конденсації в присутності інших членів комплексу елонгації, у відповідних фізіологічних умовах. Показано, що гетерологічна або гомологічна експресія в клітині тільки конденсуючого компоненту ("елонгаза") комплексу елонгації білка потрібна для елонгації відповідного ацильного ланцюга. Тому, введена елонгаза може успішно рекрутувати відновлювальну і дегідратувальну активність з трансгенного хазяїна, з метою здійснення успішної елонгації ацилу. Вважається, що за специфічність реакції елонгації щодо довжини ланцюга і ступеня десатурації жирнокислотних субстратів відповідає компонент конденсації. Крім того, вважається, що цей компонент є обмежуючим швидкість в реакції елонгації.
В цьому документі «Д5-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати ЕПК на ДПК.
Приклади Д5-елонгаз включають розкриті у УУМО2005/103253. В одному варіанті реалізації винаходу Д5-елонгаза володіє активністю по відношенню до ЕПК з утворенням ДПК із ефективністю щонайменше 6095, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 7095 або найбільш переважно щонайменше 8095 або 9095. В додатковому бо варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот А5-елонгази представлена 5ЕО ІЮО МО:
37, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 47 95 ідентичною 5ЕО ІО МО: 37. У подальшому варіанті реалізації винаходу Дб-елонгаза походить з
О5ігеососсиз їацгії або О5ігеососси5 Ішсітагіпи5 (052010/088776).
В цьому документі «Дб-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати СДК на ЕТК.
Приклади Аб-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІО МО: 25, її біологічно активний фрагмент (наприклад, фрагмент, розкритий як 5ЕО ІЮ МО: 26), або послідовність амінокислот, щонайменше на 55 95 ідентичну одній або обом з ЗЕО ІО МО: 25 або 5ЕО ІО МО: 26. У варіанті реалізації винаходу Аб-елонгаза одержана з Рпузсоптійгейа раїеп5 (7апК еї аї., 2002; номер доступу АЕ428243) або Тпаїіазвіовіга рхеендопапа (Еиі-І оре? єї аї., 2012).
В цьому документі «ДЛУ-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати АЛК на ЕТРрК.
Приклади Де9-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛУ-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 43, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 43.
В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена
ЗБО І МО: 46, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 81 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 46. У ще одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Л9-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 48, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 48.
В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена
ЗБО І МО: 50, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 50. У подальшому варіанті реалізації винаходу до9-елонгаза володіє вищою активністю по відношенню до 06 субстрату, ніж відповідного 03 субстрату, або навпаки.
В цьому документі термін "володіє вищою активністю по відношенню до субстрату шб, ніж відповідного субстрату 03" позначає відносну активність ферменту по відношенню до субстратів, яка відрізняється за активністю 03 десатурази. Переважно субстрат 06 являє собою
ЛК, і субстрат 03 являє собою АЛК.
Елонгаза з активністю Дб-елонгази і ДУ-елонгази щонайменше здатна (ії) перетворювати
Зо СДК на ЕТК і (ії) перетворювати АЛК на ЕТрК, а також володіє вищою активністю Дб-елонгази, ніж активністю ЛО-елонгази. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє ефективністю перетворення СДК з утворенням ЕТК, яка становить щонайменше 50 95, більш переважно щонайменше 60 95, та/або ефективністю перетворення АЛК з утворенням ЕТркК, яка становить щонайменше 6905 або більш переважно щонайменше 995. В іншому варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє активністю Аб-елонгази, щонайменше приблизно в 6,5 раз перевищуючою активність Д9-елонгази. У подальшому варіанті реалізації винаходу елонгаза не володіє активністю Д5-елонгази, яка могла би бути виявлена.
Інші ферменти
В цьому документі термін "І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза" (ЛФКАТ), що також має назву ацилтрансферази лізофосфатидинової кислоти або ацил-КоА-лізофосфатидат- ацилтрансферази, позначає білок, який ацилює 5п-1-ацил-гліцерол-З-фосфат (5йп-1 С-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням фосфатидної кислоти (ФК). Таким чином, термін "активність І- ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази" позначає ацилування (5п-1 (3-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням ФК (ЄС 2.3.1.51). Переважними ЛФКАТ є такі, що можуть використовувати поліненасичений С22 ацил-КоА як субстрат, для перенесення поліненасиченої групи ацилу С22 в положення 5п-2 ЛФК, з утворенням ФК. Приклади таких ЛФКАТ наведені в Прикладі 13 і можуть бути протестовані, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до винаходу, представлена будь- якою з 5ЕО ІЮ МО: 63-69, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот,
БО щонайменше на 4095 ідентичною будь-якій одній або більше із 5ЕБЕО ІЮ МО: 63-69. У переважному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до винаходу, представлена будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 67, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичною будь- який однієї або більш з 5БЕО ІЮ МО: 64, 65 і 67.
В цьому документі термін "діацилгліцерол ацилтрансфераза" (ЄС 2.3.1.20; ДГАТ), позначає білок, який переносить жирну групу ацилу з ацил-КоА до діацилгліцерольного субстрату, з утворенням триацилгліцеролу. Тому, термін "активність діацилгліцерол ацилтрансферази" позначає перенесення ацил-КоА до діацилгліцеролу, з утворенням триацилгліцеролу. Існує три відомих види ДГАТ, позначені як ДГАТІ, ДГАТ2 і ДГАТЗ, відповідно. Поліпептиди ДГАТ1 бо звичайно містять 10 трансмембранних доменів, ДГАТ2 звичайно містять 2 трансмембранних
Зб домени, тоді як ДГАТЗ звичайно є розчинним. Приклади поліпептидів ДГАТІ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТІ1 з Аврегойи5 Титідайше (номер доступу ХР 755172),
Агарідорвів ІНаійапа (САВ44774), Вісіпи5 соттипів (ААНІ1479), Мегпісіа їогаї (АВС94472),
Мегтпопіа даіатепвзіз (АВМ21945, АВМ21946), Епопутив аїайв (ААМЗ31083), Саєпогнабайів еіедап5 (ААЕ82410), Кайив5 погмедіси5 (МР 445889), Ното заріеєп5 (МР 036211), а також їх варіанти та/"або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТ2 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТаО з Агабрідорзів Іпаапа (номер доступу МР 566952), Кісіпи5 соттипі5 (ААМ16324),
Метісіа їогаїї (АВС94474), МопіегеЇПа гатаппіапа (ААК84179), Ното зарієп5 (096РО7, О58НТ5),
Во5 їашгив (970М08), Мив тивсшив (ААК84175), Місготопаз ССМР1545, а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТЗ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗ з арахісу (Агаспіз нуродаєа, Запа, еї аї., 2006), а також їх варіанти та/або мутанти.
Поліпептиди/пептиди
Термін "рекомбінантний" в контексті поліпептиду позначає поліпептид, який продукується клітиною або неклітинною системою експресії у модифікованій кількості або з модифікованою швидкістю, в порівнянні з його природним станом, коли він продується природним шляхом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, яка в природі не продукує поліпептиду.
Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний ген, що приводить до продукування модифікованої кількості поліпептиду. Рекомбінантний поліпептид за винаходом включає поліпептиди в клітині, тканині, органі або організмі, або неклітинній системі експресії, у якій він продукується, тобто поліпептид, який не був очищений або відокремлений від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини, в якій він був продукований, і поліпептидів, продукованих в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому очищають щонайменше від деяких інших компонентів.
Терміни "поліпептид" і "білок" загалом використовуються рівнозначно.
Поліпептид або клас поліпептидів може бути визначений за ступенем ідентичності (90 ідентичності) його послідовності амінокислот референтній послідовності амінокислот, або за більшим 95 ідентичності одній референтній послідовності амінокислот, ніж іншій. 95 ідентичності поліпептиду референтній послідовність амінокислот звичайно визначається за аналізом САР (Меєдієтап апа Ууспзсп, 1970; програма ССС) з параметрами штрафу на відкриття проміжку -
Зо 5 і штрафу на подовження проміжку - 0,3. Довжина послідовності запиту становить щонайменше 15 амінокислот, і аналіз СЗАР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 15 амінокислот. Переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 50 амінокислот, і аналіз СЗАР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 50 амінокислот. Переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 100 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 100 амінокислот. Навіть переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 250 амінокислот, і аналіз (АР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 250 амінокислот. Навіть більш Переважно аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом їх повної довжини. Поліпептид або клас поліпептидів може володіти такою ж ферментною активністю або іншою активністю або не володіти активністю референтного поліпептиду. Переважно поліпептид володіє ферментною активністю на рівні щонайменше 10 95, щонайменше 50 95, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 від активності референтного поліпептиду. "Біологічно активний фрагмент" є частиною поліпептиду, визначеного в цьому документі, яка зберігає певну активність повнорозмірного референтного поліпептиду, наприклад, володіючою активністю десатурази та/або елонгази або іншою ферментною активністю. Біологічно активні фрагменти в цьому документі виключають повнорозмірний поліпептид. Біологічно активні фрагменти можуть бути частиною будь-якого розміру, до тих пір, поки вони зберігають певну активність. Переважно біологічно активний фрагмент зберігає щонайменше 10 95, щонайменше 50 95, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 активності повнорозмірного білка.
Щодо певного поліпептиду або ферменту, необхідно розуміти, що 905 ідентичності, перевищуючий розкриті в цьому документі, включає переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 95 ідентичності, Переважно щоб поліпептид/фермент містив послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 7095, більш переважно щонайменше на 7595, більш переважно щонайменше на 76 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно бо щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99,695, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентична вказаній у зв'язку з нею 5ЕО ІЮ МО.
Варіанти/мутанти амінокислотної послідовності поліпептидів, розкритих в цьому документі, можуть бути одержані шляхом введення відповідних модифікацій нуклеотидів до нуклеїнової кислоти, розкритої в цьому документі, або синтезу цільового поліпептиду іп мйго. Такі варіанти/мутанти включають, наприклад, делеції, вставки або заміни залишків в межах послідовності амінокислот. Комбінація делеції, вставки і заміни може бути здійснена таким чином, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевий пептидний продукт володіє бажаною ферментною активністю.
Мутантні (модифіковані) пептиди можуть бути одержані із застосуванням будь-якої методології, відомої з рівня техніки. Наприклад, полінуклеотид, розкритий в цьому документі, може бути оброблений методами мутагенезу іп міго або тасування ДНК, як детально описано
Нагауата (1998). Скринінг продуктів, які одержують з видозміненої/модифікованої ДНК, може бути з легкістю здійснений із застосуванням способів, розкритих в цьому документі, для визначення того, чи володіють вони, наприклад, десатуразною або елонгазною активністю.
При конструюванні мутантів послідовності амінокислот, місцеположення сайту мутації і природа мутації залежатимуть від характеристики(ик), яку модифікують. Сайти для мутації можуть бути модифіковані індивідуально або посерійно, наприклад, шляхом: (1) заміни спочатку вибраних консервативних амінокислот, а потім більш радикальних замін, в залежності від досягнутих результатів, (2) видалення залишку-мішені, або (3) вставки інших залишків, суміжних з розміщеним сайтом.
Делеції в амінокислотній послідовності загалом варіюють від приблизно 1 до 15 залишків, переважніше від приблизно 1 до 10 залишків і звичайно приблизно від 1 до 5 суміжних залишків.
У мутантах заміни видалений щонайменше один залишок амінокислоти в молекулі поліпептиду, та інший залишок вставлений на його місце. Найцікавіші положення для
Зо мутагенезу шляхом заміни включають сайти, що не є консервативними в природних десатуразах або елонгазах. Заміни в таких сайти переважно здійснюються відносно консервативним чином, з метою збереження активності ферменту. Такі консервативні заміни проілюстровані в Табл. З під заголовком "приклади замін".
У переважному варіанті реалізації винаходу мутантний/варіантний поліпептид містить тільки або не більше ніж одну або дві або три або чотири консервативні модифікації амінокислот, в порівнянні з природним поліпептидом. Подробиці консервативних модифікацій амінокислот наведені в Табл. 3. Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, такі незначні модифікації можуть в розумних межах бути спрогнозовані як не впливаючі на активність поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині.
Поліпептиди можуть бути одержані різноманітними шляхами, зокрема, продукування і виділення природних поліпептидів або рекомбінантних поліпептидів у відповідності до методів, відомих з рівня техніки. В одному варіанті реалізації винаходу рекомбінантний поліпептид продукується культивованою клітиною, здатною експресувати поліпептид в умовах, ефективних для продукування поліпептиду, наприклад, клітиною-хазяїном, розкритою в цьому документі.
Більш переважною клітиною для продукування поліпептиду є клітина в рослині, особливо в насінні на рослині.
Полінуклеотиди
Крім того, у винаході розкриваються та/або застосовуються полінуклеотиди, які можуть бути, наприклад, геном, виділеним полінуклеотидом, химерною генетичною конструкцією, такою як молекула Т-ДНК або химерна ДНК. Це може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, двохланцюгова або одноланцюгова, а також комбінована з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами з метою здійснення конкретної активності, розкритої в цьому документі. Термін "полінуклеотид" використовується в цьому документі рівнозначно з терміном "молекула нуклеїнової кислоти". Під "виділеним полінуклеотидом" ми маємо на увазі полінуклеотид, який, при одержанні з природного джерела, був відокремлений від полінуклеотидних послідовностей, з якими він асоційований або зв'язаний в природному стані, або полінуклеотид, що не зустрічається в природі. Переважно виділений полінуклеотид є щонайменше на 60 95 вільним, переважніше щонайменше на 7595 вільним, і переважніше щонайменше на 90 95 вільним від інших компонентів, з якими він зв'язаний в природі. (510)
Таблиця З
Приклади замін
Шеф 77777711 Пешжуараа///////7777777711111111111111111111111111
Рю(РУ 77777711 1ЯУ1
У варіанті реалізації винаходу полінуклеотид за винаходом не зустрічається в природі.
Приклади полінуклеотидів, що не зустрічаються в природі, включають, без обмеження, такі, що мутували (наприклад, в результаті застосування способів, розкритих в цьому документі), і полінуклеотиди, у яких відкрита рамка зчитування, кодуюча білок, функціонально пов'язана з промотором, із яким вона не пов'язана в природі (наприклад, у конструкціях, розкритих в цьому документі).
В цьому документі термін "ген" використовується в найширшому контексті і включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що містять транскрибовану ділянку і, у випадку трансляції, ділянка кодування білка структурного гена, включаючи послідовності, розміщені суміжно з кодуючою ділянкою на 5' і 3' кінцях, на відстані щонайменше приблизно 2 тисячі пар основ на будь-якому кінці, що беруть участь в експресії гена. В цьому відношенні, ген містить контрольні сигнали, наприклад, промотори, енхансери, сигнали термінації та/або поліаденілювання, які в природі асоційовані з даним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, і в цьому випадку ген носить назву "Химерного гена". Послідовності, що розміщені на 5' кінці кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 5' нетрансльовані послідовності. Послідовності, що розміщені на 3' кінці або нижче по відношенню до кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 3' нетрансльовані послідовності. Термін "ен" включає кКДНК і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу ділянку, що може перериватися некодуючими послідовностями під назвою "інтрони" або "проміжні ділянки" або "проміжні послідовності". Інтрони являє собою сегменти гена, транскрибовані в ядерну РНК (гетерогенну ядерну РНК, гяЯРНК). Інтрони можуть містити регуляторні елементи, наприклад, енхансери. Інтрони видаляють або "зрощують" з ядерним або первинним транскриптом; таким чином, інтрони відсутні в транскрипті матричної РНК (мРНК).
Функція мРНК в ході трансляції полягає в конкретизації послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. Термін "ген" включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує повнорозмірні білки або їх частини за винаходом, розкриті в цьому документі, і нуклеотидну послідовність, комплементарну до будь-якої із згаданих вище.
В цьому документі "химерна ДНК" або "химерна генетична конструкція" позначає будь-яку
Зо молекулу ДНК, що не є природною молекулою ДНК в її природному місцеположенні, яка також позначається в цьому документі як "конструкція ДНК". Як правила, химерна ДНК або химерний ген містить регуляторну і транскрибовану або кодуючу білок послідовності, які не знайдені функціонально пов'язаними одна з однією в природі, тобто які є гетерологічними по відношенню одна до одної. Відповідно, химерна ДНК або химерний ген можуть містити регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з одного джерела, але організовані в інший спосіб, ніж знайдені в природі.
Термін "ендогенний" використовується в цьому документі для позначення субстанції, що звичайно присутня або продукується, наприклад, в немодифікованій рослині на такій же стадії розвитку, що і досліджувана рослина. "Ендогенний ген" позначає природний ген в його природному положенні в геномі організму. В цьому документі "молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти", "рекомбінантний полінуклеотид" або їх варіації позначають молекулу нуклеїнової кислоти, що конструюється або модифікується за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Терміни "чужорідний полінуклеотид" або "екзогенний полінуклеотид" або "гетерологічний полінуклеотид" і подібні позначають будь-яку нуклеїнову кислоту, що введена в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій. Чужорідні або екзогенні гени можуть являти собою гени, вставлені в неприродний організм, природні гени, що введені в нове місцеположення в межах природного хазяїна, або химерні гени. "Трансген" є геном, що введений в геном процедурою трансформації. Терміни "генетично модифікований", "грансгенний" та їх варіації включають введення генів в клітини шляхом трансформації або трансдукції, мутацію генів в клітинах і модифікацію або модуляцію регуляції гена в клітині або організмах, над якими здійснювалися вказані дії, або їх потомстві. "гГеномна ділянка" в цьому документі позначає положення в межах геному, в якому трансген або група трансгенів (також позначена в цьому документі як кластер) вставлені в клітину або її предка. Такі ділянки включають тільки нуклеотиди, що введені в результаті втручання людини, наприклад, за способами, розкритими в цьому документі.
Термін "екзогенний" в контексті полінуклеотиду позначає полінуклеотид, присутній в клітині в модифікованій кількості, в порівнянні з його природним станом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, що в природі не містять полінуклеотиду. Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний полінуклеотид, що приводить до зміни рівня продукування кодованого поліпептиду. Екзогенний полінуклеотид за винаходом включає полінуклеотиди, що не відокремлені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або неклітинної системи експресії, в якій вони присутні, і полінуклеотиди, продуковані в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому були очищені щонайменше від деяких інших компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути безперервним ланцюгом нуклеотидів, існуючим в природі, або містити дві або більше суміжних нуклеотидних ділянок з різних джерел (природних та/або синтетичних), сполучені таким чином, щоб утворити єдиний полінуклеотид. Звичайно такі химерні полінуклеотиди містять щонайменше відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид за винаходом, функціонально пов'язаний з промотором, придатним для управління транскрипцією відкритої рамки зчитування в цільовій клітині.
В цьому документі термін "різноманітні екзогенні полінуклеотиди" або його варіації означають, що нуклеотидна послідовність кожного полінуклеотиду відрізняється щонайменше одним, переважно більше нуклеотидами. Полінуклеотиди кодують РНК, що можуть транслюватися або не транслюватися в білок у межах клітини. В прикладі, кожен полінуклеотид переважно кодує білок з іншою активністю. В іншому прикладі, кожен екзогенний полінуклеотид є менше, ніж на 95 95, менше, ніж на 90 95 або менше, ніж на 80 95 ідентичним іншим екзогенним полінуклеотидам. Переважно екзогенні полінуклеотиди кодують функціональні білки/ферменти.
Крім того, різні екзогенні полінуклеотиди переважно є такими, що частково не перекриваються, в тому значенні, що кожен полінуклеотид являє собою чітко визначену ділянку, наприклад, позахромосомно переносиму нуклеїнову кислоту, що частково не перекривається з іншим екзогенним полінуклеотидом. Щонайменше, кожен екзогенний полінуклеотид містить сайт ініціації і термінації транскрипції, а також позначений промотор. Окремий екзогенний полінуклеотид може містити або не містити інтронів.
Щодо розкритих полінуклеотидів, необхідно розуміти, що вищий 95 ідентичності, ніж розкриті вище, включатиме переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального бо ідентичності, полінуклеотид переважно містить полінуклеотидну послідовність, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше 60 на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95,
більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99,6 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 595, і навіть більш переважно щонайменше на 99,995 ідентичною відповідній вказаній 5ЕО ІЮ МО.
Полінуклеотид за даним винаходом може селективно гібридизуватися, в суворих умовах, з полінуклеотидом, який кодує поліпептид за даним винаходом. В цьому документі суворі умови є наступними: (1) застосування в ході гібридизації денатуруючого агента, такого як формамід, наприклад, 50 об/об 95 формаміду, 0,1 мас/об 95 альбуміну телячої сироватки, що містить, 0,1 95
Фіколу, 0,1 95 полівінілпіролідону, 50 мМ натрій-фосфатний буфер, рН 6,5, що містить 750 мМ
Масі, 75 мМ натрію цитрату при 42 "С; або (2) застосування 50 95 формаміду, 5 х натрію хлорид ж натрію цитрат (ХЦН, 0,75 М Масі, 0,075 М натрій цитрату), 50 мМ натрію фосфату (рН 6,8), 0,1 95 натрію пірофосфату, 5 х розчин Денхардта, оброблена ультразвуком ДНК сперми лосося (50 г/мл), 0,1 95 натрію додецилсульфату і 10 95 декстрану сульфату при 42"С в 0,2 х натрій хлорид «я натрію цитрат і 0,1 95 натрію додецилсульфату та/або (3) застосування низької іонної сили і високотемпературного промивання, наприклад, 0,015 М МасСі/0,0015 М натрію цитрату/0,1 95 натрію додецилсульфату при 50 "С.
Полінуклеотиди за винаходом можуть містити, в порівнянні з молекулами, що зустрічаються в природі, одну або більше мутацій, що являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Полінуклеотиди, що містять мутації відносно референтної послідовності, можуть бути природними (тобто, виділеними з природного джерела) або синтетичними (наприклад, одержаними в результаті сайт-спрямованого мутагенезу або тасування ДНК з нуклеїнової кислоти, як розкрито вище). Таким чином, очевидно, що полінуклеотиди за винаходом можуть бути одержані з природного джерела або можуть бути рекомбінантними. Переважними полінуклеотидами є такі, що містять кодуючі ділянки, кодон- оптимізовані для трансляції в клітинах рослини, як відомо з рівня техніки.
Рекомбінантні вектори
Один варіант реалізації цього винаходу включає рекомбінантний вектор, який містить щонайменше одну молекулу полінуклеотиду, розкриту в цьому документі, вставлену в будь- який вектор, здатний доставити молекулу полінуклеотиду в клітину-хазяїна. Рекомбінантні
Зо вектори включають вектори експресії. Рекомбінантні вектори містять гетерологічні полінуклеотидні послідовності, тобто, полінуклеотидні послідовності, що в природі не знайдені суміжними з молекулами полінуклеотиду, розкритими в цьому документі, які переважно одержані з інших видів, ніж ті, з яких одержана(и) молекула(и) полінуклеотиду. Вектор може являти собою РНК або ДНК, і звичайно є плазмідою. Плазмідні вектори звичайно містять додаткові послідовності нуклеїнових кислот, які забезпечують простоту селекції, ампліфікації і трансформації касети експресії в прокаріотних клітинах, наприклад, одержані з рОС вектори, одержані з ре5К вектори, одержані з РОЕМ вектори, одержані з реР вектори, одержані з рВ5 вектори, або переважно бінарні вектори, що містять одну або більш ділянок Т-ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають джерела реплікації для забезпечення автономної реплікації вектора, гени селекційних маркерів, переважно кодуючі резистентність до антибіотика або гербіциду, унікальні множинні сайти клонування, які забезпечують множинні сайти вставки послідовностей нуклеїнових кислот або генів, кодованих в конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовності, які підвищують активність трансформації прокаріотних і еукаріотних (особливо рослинних) клітин. Рекомбінантний вектор може містити більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, три, чотири, п'ять або шість полінуклеотидів, розкритих в цьому документі, в комбінації, переважно химерну генетичну конструкцію за винаходом, в якій кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з послідовностями контролю експресії, активними в цільовій клітині. Більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів, переважно ковалентно сполучені в єдиному рекомбінантному векторі, переважно в межах єдиної молекули Т-ДНК, яка в подальшому може бути введена як єдина молекула в клітину, з одержанням рекомбінантній клітини за винаходом, і переважно інтегрована в геном рекомбінантної клітини, наприклад, в трансгенній рослині. Таким чином, полінуклеотиди, сполучені у такий спосіб, будуть успадковуватися разом як єдиний генетичний локус у нащадка рекомбінантної клітини або рослини. Рекомбінантний вектор або рослина може містити два або більше таких рекомбінантних векторів, кожен з яких містить декілька полінуклеотидів, наприклад, кожен рекомбінантний вектор містить 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів. "Функціонально пов'язаний" в цьому документі позначає функціональне взаємовідношення між двома або більш сегментами нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК). Як правило, це бо позначає функціональне взаємовідношення транскрипційного регуляторного елементу
(промотору) і транскрибованої послідовності. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, розкритий в цьому документі, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. Загалом, транскрипційні регуляторні елементи промотору, які функціонально пов'язані з транскрибованою послідовністю, є фізично суміжними з транскрибованою послідовністю, тобто, вони є сіз-діючими. Однак, для деяких транскрипційних регуляторних елементів, таких як енхансери, немає необхідності бути фізично суміжними або розташованими в безпосередній близькості від кодуючих послідовностей, транскрипцію яких вони збільшують.
Якщо присутні декілька промоторів, кожен промотор може незалежно бути таким же або іншим.
Крім того, рекомбінантні молекули, наприклад, химерні ДНК або генетичні конструкції, можуть містити: (а) один або більш секреторних сигналів, що кодують сигнальні пептидні послідовності, щоб дозволити експресованому поліпептиду, розкритому в цьому документі, секретуватися з клітини, яка продукує поліпептид, або яка забезпечує локалізацію експресованого поліпептиду, наприклад, для утримання поліпептиду в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) клітини або перенесення в пластиду, та/або (б) химерні послідовності, які приводять до експресії молекул нуклеїнових кислот у вигляді химерних білків. Приклади відповідних сигнальних сегментів включають будь-який сигнальний сегмент, здатний спрямовувати секрецію або локалізацію поліпептиду, розкритого в цьому документі. Додатково, рекомбінантні молекули можуть містити проміжні та/або нетрансльовані послідовності, навколо та/або в межах послідовностей нуклеїнових кислот молекул нуклеїнових кислот, розкритих в цьому документі.
Для спрощення ідентифікації трансформантів, бажано, щоб конструкція нуклеїнової кислоти містила ген селекційного або скринінгового маркера у вигляді або на додаток до чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. "Ген маркера" позначає ген, який надає відмінного фенотипу клітинам, що експресують ген маркера, таким чином, що трансформовані клітини відрізняються від клітин, які не містять маркера. Ген селекційного маркера забезпечує ознаку, за якою можна "здійснювати селекцію" на базі резистентності до селекційного агента (наприклад, гербіцид, антибіотик, випромінювання, нагрівання або інший вид обробки, ушкоджуючий
Зо нетрансформовані клітини). Ген придатного для скринінгу маркера (або репортерний ген) забезпечує ознаку, за якою можна ідентифікувати, шляхом спостереження або тестування, наприклад, за допомогою "скринінгу" (наприклад, активність Д-глюкуронідази, люциферази, зеленого флуоресцентного білка (ЗФБ) або іншого ферменту, відсутню в нетрансформованих клітинах). Ген маркера і цільова нуклеотидна послідовність не обов'язково повинні бути пов'язаними. Фактично, вибір маркера не є критичним, до тих пір, поки він є функціональним (тобто, селективним) в поєднанні з клітинами вибору, такими як рослинна клітина.
Прикладами бактеріальних селекційних маркерів є маркери, що забезпечують резистентність до антибіотиків, наприклад, резистентність до ампіциліну, еритроміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну, переважно резистентність до канаміцину. Приклади селекційних маркерів для селекції рослин включають, без обмеження, ген пуд, який кодує резистентність до гігроміцину В; ген неоміцин фосфотрансферази (прі), що забезпечує резистентність до канаміцину, паромоміцину, (418; ген глутатіон-5-трансферази з печінки щурів, що забезпечує резистентність до гербіцидів-похідних глутатіону, наприклад, таких як, розкриті у ЕР 256223; ген глутамінсинтетази, що при надмірній експресії забезпечує резистентність до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, наприклад, розкритий у УМО 87/05327, ген ацетилтрансферази із бігеріотусе5 мігідоспготодепе5, що забезпечує резистентність до селекційного агента фосфінотрицину, наприклад, розкритий у ЕР 275957, ген, що кодує 5-єнолшикімат-З3-фосфат синтазу (ЄШФС), що забезпечує переносимість М- фосфонометилгліцину, наприклад, розкритий Ніпспеє еї аі. (1988), ген Баг, що забезпечує резистентність до біалафосу, наприклад, розкритий у УМО91/02071; ген нітрилази, наприклад, рхп із Кіерзіва о7аепає, що забезпечує резистентність до бромоксинілу (еіаїКег еї а!., 1988); ген дигідрофолатредуктази (ДГФР), що забезпечує резистентність до метотрексату (Тріеї еї аї., 1988); ген мутанта ацетолактатсинтази (АЛС), який забезпечує резистентність до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших хімічних речовин, що інгібують АЛС (ЕР 154204); мутантний ген антранілат синтази, який забезпечує резистентність до 5-метилтриптофану; або ген далапон дегалогенази, який забезпечує резистентність до гербіциду.
Переважні скринінгові маркери включають, без обмеження, ген цшідфА, що кодує |- глюкуронідазу (505), фермент, для якого відомі різноманітні хромогенні субстрати, ген зеленого флуоресцентного білка (Мієа? еї аї., 1995) або його похідні; ген люциферази (Іс) (Ом/ 60 еї аїЇ,, 1986), який дозволяє виявити біолюмінесценцію, та інші, відомі з рівня техніки.
"Репортерною молекулою" в цьому документі називається молекула, яка, за своєю хімічною природою, забезпечує придатний для аналітичної ідентифікації сигнал, що спрощує визначення активності промотору на базі білкового продукту.
Переважно конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорована в геном клітини, наприклад, рослинної клітини. Відповідно, нуклеїнова кислота може містити відповідні елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном, переважно послідовності правої і лівої меж молекули Т-ДНК, або конструкція розміщена у відповідному векторі, який може бути інкорпорований в хромосому клітини.
Експресія
В цьому документі вектор експресії являє собою вектор ДНК, що здатний трансформувати клітину-хазяїна і здійснювати експресію однієї або більше вказаних молекул полінуклеотиду.
Переважні вектори експресії за даним винаходом можуть спрямовувати експресію гена в дріжджових та/або рослинних клітинах. Вектори експресії, придатні у відповідності до винаходу, містять регуляторні послідовності, наприклад, послідовності для контролю транскрипції, послідовності для контролю трансляції, джерела реплікації та інші регуляторні послідовності, сумісні з рекомбінантною клітиною, які контролюють експресію молекул полінуклеотиду за даним винаходом. Зокрема, полінуклеотиди або вектори, придатні у відповідності до цього винаходу, містять послідовності для контролю транскрипції. Послідовності для контролю транскрипції є послідовностями, які контролюють ініціацію, елонгацію і термінацію транскрипції.
Особливо важливими послідовностями для контролю транскрипції є такі, які контролюють ініціацію транскрипції, наприклад, послідовності промотору та енхансера. Відповідні послідовності для контролю транскрипції включають будь-яку послідовність для контролю транскрипції, яка може функціонувати щонайменше в одній з рекомбінантних клітин за даним винаходом. Вибір використовуваних регуляторних послідовностей залежить від організму- мішені, такого як рослина, та/або органу-мішені або цільової тканини. Такі регуляторні послідовності можуть бути одержані з будь-якого еукаріотного організму, такого як рослини, або віруси рослин, або можуть бути хімічно синтезовані. Численні такі послідовності для контролю транскрипції відомі фахівцям з рівня техніки. Особливо переважними послідовностями для контролю транскрипції є промотори, що активно спрямовують транскрипцію в рослинах, конститутивно або специфічним для стадії та/або тканини чином, в залежності від використання рослини або її частин.
Ряд векторів, придатних для стабільної трансфекції рослинних клітин або одержання трансгенних рослин, описаний, наприклад, у Рошмеї5 єї аї., Сіопіпуд Месіоге: А І арогагу МапаиаїЇ, 1985, з,ирр. 1987; М/єіз5басі апа М/еізвбаси, Меїпод3з Тог Ріапі Моїесшціаг Віоіоду, Асадетіс Ргевв, 1989; і Семп еї аї., Ріапі МоІесшаг Віоюду Мапиаї!, Кіпжмег Асадетіс Рибіїзпег5, 1990. Як правила, вектори експресії в рослинах містять, наприклад, один або більше клонованих генів рослини під транскрипційним контролем 5'і 3 регуляторних послідовностей і домінантний селекційний маркер. Додатково, такі вектори експресії в рослинах можуть містити регуляторну ділянку промотору (наприклад, регуляторна ділянка, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану умовами навколишнього середовища або стадією розвитку, або клітинно- або тканиноспецифічну експресію), старт-сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденілювання.
Описаний цілий ряд конститутивних промоторів, які активні в клітинах рослини. Придатні промотори для конститутивної експресії в рослинах включають, без обмеження, промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм), 355 мозаїчного вірусу ранника шишкуватого (ЕММ), промотор паличкоподібного вірусу цукрової тростини, промотор вірусу жовтої крапки комеліни, індуцибельний світлом промотор з маленької субодиниці рибулозо-1,5-біс-фосфат карбоксилази, промотор цитозольної триосефосфат ізомерази рису, промотор аденін фосфорибозилтрансферази Агарідорзії, промотор гена рисового актину 1, промотори манопінсинтази та октопінсинтази, промотор Аа, промотор синтази сахарози, промотор комплексу К гена і промотор гена хлорофіл-зв'язувального білка а/р.
З метою експресії у вихідних тканинах рослини, таких як листя, насіння, коріння або стебло, промоторам, використовуваним у відповідності до цього винаходу, переважно властива відносно висока експресія в цих конкретних тканинах. Для даної мети можна здійснювати вибір із цілого ряду промоторів для генів з тканино- або клітиноспецифічною або -підсиленою експресією. Відомі з літератури приклади таких промоторів включають промотор глутамін синтази 552 з хлоропласту гороху, промотор фруктозо-1,6-біросфатази хлоропласту з пшениці, промотор ядерного фотосинтетичного 51-І5 1 з картоплі, промотор серин кінази і промотор бо глюкоамілази (СН) з Агарідорзі5 (Шайапа. Також повідомлялося про активність у фотосинтетично активних тканинах промоторів рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази і промоторів Саб.
Різноманітні промотори рослинних генів, які регулюються у відповідь на екологічні, гормональні, хімічні та/або пов'язані з розвитком сигнали, також можуть використовуватися для експресії генів в клітинах рослини, зокрема, промотори, регульовані (1) нагріванням, (2) освітленням (наприклад, промотор Кро5-ЗА гороху, промотор Кро5 маїсу); (3) гормонами, наприклад, абсцизиновою кислотою, (4) пошкодженнями (наприклад, УУшипі); або (5) хімічними речовинами, наприклад, метилжасмонатом, саліциловою кислотою, стероїдними гормонами, спиртом, сафенерами (УУ097/06269), або може бути переважним використання (б) орган- специфічних промоторів.
В цьому документі термін "промотор, специфічний для насіння рослини" або його варіації позначає промотор, який переважно в порівнянні з іншими тканинами рослини, спрямовує транскрипцію гена в насінні рослини, що розвивається. У варіанті реалізації винаходу промотор, специфічний для насіння, експресується щонайменше в 5 разів активніше у насінні рослини, що розвивається, відносно листя та/або стебел рослини, і переважно експресується активніше в ембріоні насіння, що розвивається, в порівнянні з іншими тканинами рослини. Переважно промотор тільки спрямовує експресію цільового гена в насінні, що розвивається, та/або експресія цільового гена у інших частинах рослини, таких як листя, не може бути виявлена нозерн-блотингом та/або ЗТ-ПЛР. Звичайно, промотор контролює експресією генів в процесі росту і розвитку насіння, зокрема, в ході фази синтезу і акумуляції запасних речовин в насінні.
Такі промотори можуть контролювати експресією гена в суцільному запасному органі рослини або тільки в його частині, наприклад, оболонці насіння або сім'ядолі(ях), переважно в ембріонах, у насінні дводольних рослин або ендоспермі або алейроновому шарі насіння однодольних рослин.
Переважні промотори специфічної для насіння експресії включають: і) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі жирних кислот та їх акумуляції в насінні, наприклад, десатурази і елонгази, ії) промотори з генів, що кодують запасні білки для зберігання в насінні, і ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі вуглеводів та їх акумуляції в насінні. Придатними специфічними для насіння промоторами є промотор гена
Зо напіну олійної каноли (05 5608152), промотор О5Р Місіа Тара (Вашйтівїп еї аї!., 1991), промотор олеозину Агабідорвзіз (М/098/45461), промотор фазеоліну Рпазеоїи5 уцідагіє (005 5504200), промотор Все4 Вгазвзіса (М/О91/13980) або промотор легуміну ГІ еВ4 з Місіа таба (Вайтівїп еї аї., 1992), і промотори, які забезпечують специфічну для насіння експресію в однодольних, таких як маїс, ячмінь, пшениця, жито, рис, тощо. Як придатні слід зазначити такі промотори: промотор гена Ірі2 або ІрИ ячменю (М/095/15389 і УМО95/23230) або промотори, розкриті у УУО99/16890 (промотори з гена гордеїну ячменю, гена глютеліну рису, гена оризину рису, гена проламіну рису, гена гліадину пшениці, гена глютеліну пшениці, гена зеїну маїсу, гена глютеліну вівса, гена казирину сорго, гена секаліну жита). Інші промотори включають розкриті Вгоцп еї аї. (1998),
Роїеп;га еї аїЇ. (2004), 0520070192902 і 0О520030159173. У варіанті реалізації винаходу специфічний для насіння промотор переважно експресується в певних частинах насіння, таких як ембріон, сім'ядоля(ї) або ендосперм. Приклади таких специфічних промоторів включають, без обмеження, промотор ЕР1 (ЕїІегвзігот еї а!., 1996), промотор легуміну гороху (Регїтіп еї аї., 2000), промотор фітогемаглютиніну боба (Регїгтіп еї аї., 2000), промотори конлінін 1 і конлінін 2 для генів, що кодують запасні білюи 25 льону (Спепд еї аї., 2010), промотор гена ЕГАЕЇ1 з
Агарідорзі5 (паійапа, промотор ВпоїІ Р. гена глобулін-подібного білка Вгаззіса пари, промотор
РХЕК гена пероксиредоксину з І іпит и5йайвзвітит. 5 нетрансльована лідерна послідовність може бути одержана з промотору, вибраного для експресії гетерологічної послідовності гена полінуклеотиду за даним винаходом, або переважно є гетерологічною щодо ділянки, яка кодує фермент, що виробляється, і може бути специфічно модифікована, при бажанні, таким чином, щоб збільшити трансляцію мРНК. Огляд оптимізації експресії трансгенів див. у Коієї еї аї. (1996). Додатково, 5' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з РНК вірусів рослин (серед іншого, вірус мозаїки тютюну, вірус гравіювання тютюну, вірус карликової мозаїчності маїсу, вірус мозаїки люцерни), з відповідних еукаріотних генів, рослинних генів (лідер гена білка а/ю хлорофілу пшениці і маїсу, що зв'язується), або із синтетичної послідовності гена. Даний винахід не обмежується конструкціями, в яких нетрансльована ділянка одержана з 5 нетрансльованої послідовності, супроводжуючої послідовність промотору. Додатково, лідерна послідовність може бути одержана із неспорідненого промотору або кодуючої послідовності. Лідерні послідовності, придатні в контексті цього винаходу, включають лідер Нер70 маїсу (5 5362865 і 05 5859347) і омега- бо елемент вірусу мозаїки тютюну (ТММ).
Термінація транскрипції забезпечується 3 нетрансльованою послідовністю ДНК, функціонально пов'язаною в химерному векторі з цільовим полінуклеотидом. 3' нетрансльована ділянка рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілювання, функція якого в рослинах полягає у забезпеченні додавання аденілатних нуклеотидів до З3' кінця РНК. 3' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з різноманітних генів, які експресуються в клітинах рослин. У такому випадку звичайно використовуються 3' нетрансльована ділянка нопалінсинтази, 3 нетрансльована ділянка з маленької субодиниці гена Кибібсо гороху, З" нетрансльована ділянка з гена запасного білка 75 насіння сої або гена конлініну льону. Крім того, придатними є 3' транскрибовані, нетрансльовані ділянки, що містять поліаденілатний сигнал індукуючих пухлину (Ті) Адгобасівгічт плазмідних генів.
Технології рекомбінантної ДНК можуть застосовуватися для покращення експресії трансформованої молекули полінуклеотиду, шляхом маніпуляції, наприклад, кількістю копій молекули полінуклеотиду в межах клітини-хазяїна, ефективністю, з якою такі молекули полінуклеотиду транскрибуються, ефективністю, з якою транслюються копії, що утворюються в результаті, та ефективністю посттрансляційних модифікацій. Рекомбінантні методи, придатні для збільшення експресії молекул полінуклеотиду, розкритих в цьому документі, включають, без обмеження, інтеграцію молекули полінуклеотиду в одну або більше хромосом клітини-хазяїна, введення стабілізуючих послідовностей в мРНК, заміни або модифікації сигналів контролю транскрипції (наприклад, промотори, оператори, енхансери), заміни або модифікації сигналів контролю трансляції (наприклад, сайти зв'язування з рибосомою, послідовності Шайна-
Дальгарно), модифікацію молекул полінуклеотиду для відповідності використанню кодонів в клітині-хазяїні і делецію послідовностей, що дестабілізують транскрипти.
Рекомбінантні клітини
У винаході також розкривається рекомбінантна клітина, переважно рекомбінантна клітина рослини, що є клітиною-хазяїном, трансформованою однією або більше рекомбінантними молекулами, такими як полінуклеотиди, химерні генетичні конструкції або рекомбінантні вектори, розкриті в цьому документі. Рекомбінантна клітина може містити будь-яку їх комбінацію, наприклад, два або три рекомбінантних вектори, або рекомбінантний вектор і один або більше додаткових полінуклеотидів або химерних ДНК. Придатні клітини за винаходом
Зо включають будь-яку клітину, яка може бути трансформована полінуклеотидом, химерною ДНК або рекомбінантним вектором за винаходом, таку як молекула, що кодує поліпептид або фермент, розкритий в цьому документі. Переважно клітина є клітиною, яка, таким чином, придатна для використання з метою одержання ДЛ-ПНЖК. Рекомбінантна клітина може бути клітиною в культурі, клітиною іп міго, або в організмі, такому як, наприклад, рослина, або в органі, такому як, наприклад, насіння або лист. Переважно клітина знаходиться в рослині або частині рослини, переважніше в насінні рослини.
Клітини-хазяї, до яких введений(і) полінуклеотид(и), можуть бути нетрансформованими клітинами або клітинами, які вже трансформовані щонайменше однією молекулою нуклеїнової кислоти. Такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути пов'язані з синтезом ДЛ-ПНЖК або не пов'язані з ним. Клітини-хазяї за даним винаходом можуть бути ендогенно (тобто, природним чином) здатні до продукування білків, розкритих в цьому документі, і в цьому випадку рекомбінантна клітина, одержана з них, володіє підвищеною здатністю до продукування поліпептидів, або вони можуть бути здатні до продукування таких білків тільки після трансформації щонайменше одним полінуклеотидом за винаходом. У варіанті реалізації винаходу рекомбінантна клітина за винаходом володіє підвищеною здатністю до синтезу довголанцюгової поліненасиченої жирної кислоти. В цьому документі термін "клітина з підвищеною здатністю до синтезу довголанцюгової поліненасиченої жирної кислоти" є відносним терміном, за допомогою якого рекомбінантна клітина за винаходом порівнюється з клітиною-хазяїном, в якій відсутній() полінуклеотид(и) за винаходом, з рекомбінантною клітиною, яка продукує поліненасичені жирні кислоти з довшим ланцюгом, або з більшою концентрацією ДЛ-ПНЖК, наприклад, ДГК (щодо інших жирних кислот), ніж у природній клітині.
Клітина з підвищеною здатністю до синтезу іншого продукту, наприклад, іншої жирної кислоти, ліпіду, вуглеводу, такого як крохмаль, молекули РНК, поліпептиду, фармацевтичного або іншого продукту, має відповідне значення.
Клітини-хазяї за даним винаходом можуть являти собою будь-яку клітину, здатну до продукування щонайменше одного білка, розкритого в цьому документі, і включають клітини бактерій, грибів (зокрема, дріжджів), паразитів, членистоногих, тварин і рослин. Клітини можуть бути прокаріотними або еукаріотними. Переважні клітини-хазяї являють собою клітини дріжджів і рослин. У переважному варіанті реалізації винаходу клітина рослини являє собою клітину бо насіння, зокрема, клітину в сім'ядолі або ендоспермі насіння. В одному варіанті реалізації винаходу клітина являє собою тваринну клітину або водоростеву клітину. Тваринна клітина може належати до будь-якого виду тварин, наприклад, клітина тварини, що не належить до людського роду, клітина хребетного, що не належить до людського роду, клітина ссавця, що не належить до людського роду, або клітини водних тварин, таких як риба або ракоподібні, безхребетних, комах, тощо. Клітини можуть належати організму, придатному для процесу ферментації. В цьому документі термін "процес ферментації" позначає будь-який процес ферментації або будь-який процес, що включає стадію ферментації. Приклади ферментувальних мікроорганізмів включають грибкові організми, наприклад, дріжджі. В цьому документі "дріжджі" включають вид Засспаготусе5, Засспаготусев сегемізіає, засспаготусев сапрегдепзі5, вид Сапаїда, види Кіимеготусе5, види Ріспіа, вид Напзепиціа, вид Тгісподегта,
Протусез «іагкеу і Маггом/а Ігроїуіса. Переважні дріжджі включають штами видів засспаготусев і, зокрема, Засспаготусез сегемівіавє.
Трансгенні рослини
Додатково, у винаході розкривається рослина, що містить клітину за винаходом, наприклад, трансгенна рослина, що містить один або більше полінуклеотидів за винаходом. Термін "рослина" в цьому документі як іменник позначає суцільні рослини, але при використанні в ролі прикметника ("рослинний") позначає будь-яку субстанцію, в якій присутній, одержану 3, що походить із або пов'язану з рослиною, наприклад, органи рослини (такі як листя, стебла, коріння, квіти), одиничні клітини (такі як пилок), насіння, рослинні клітини, тощо. Термін "частина рослини" позначає всі частини рослини, які містять ДНК рослини, зокрема, вегетативні структури, наприклад, листя або стебла, коріння, квіткові органи або структури, пилок, насіння, частини насіння, такі як ембріон, ендосперм, щиток зародка або оболонка насіння, тканину рослини, таку як судинна тканина, клітини і їх потомство, до тих пір, поки частина рослини синтезує ліпід за винаходом. "Трансгенна рослина", "генетично модифікована рослина" або їх варіації позначають рослину, яка містить генетичну конструкцію ("трансген"), не знайдену в рослині дикого типу такого ж виду, різновиди або сорти. Трансгенні рослини в контексті цього винаходу включають рослини та їх потомство, генетично модифіковані із застосуванням рекомбінантних методів, що приводить до продукування ліпіду або щонайменше одного поліпептиду, розкритого в цьому
Зо документі, у цільовій рослині або органі рослини. Трансгенні клітини рослини і трансгенні частини рослини мають відповідне значення. "Грансген" в цьому документі має звичайне значення для даної галузі біотехнології і містить генетичну послідовність, яка одержана або модифікована технологією рекомбінації ДНК або РНК, і яка введена до клітини за винаходом, переважно клітини рослини. Трансген може містити генетичні послідовності, одержані з клітини рослини, яка може належати до того ж виду, різновиду або сорту, що і клітина рослини, до якої введений трансген, або до іншого виду, різновиду або сорту, або з клітини, що не є рослинною.
Звичайно, трансген вводять до клітини, наприклад, рослинної, шляхом маніпуляції людиною, наприклад, трансформації, причому може застосовуватися будь-який спосіб за рішенням фахівця в цій галузі техніки.
Терміни "насіння" і "зерно" в цьому документі використовуються рівнозначно. "Зерно" позначає зріле зерно, наприклад, зібране в процесі збору врожаю зерно, або зерно, яке ще знаходиться на рослині, але готове для збору врожаю, а також може позначати насіння після набухання або проростання, згідно контексту. Зріле зерно або насіння звичайно містить вологу в кількості менше, ніж приблизно 18-20 95. "Насіння, що розвивається" в цьому документі позначає насіння до настання зрілості, звичайно знайдене в репродуктивних структурах рослини після запліднення або цвітіння, але може також позначати таке насіння до настання зрілості, яке виділено з рослини.
В цьому документі термін "одержання частини рослини" або "одержання насіння" позначає будь-які засоби для одержання частини рослини або насіння, відповідно, зокрема, збір урожаю частин рослини або насіння з рослин у полі або в закритому просторі, такому як теплиця або камера для росту, або придбання або одержання від постачальника частин рослини або насіння. Насіння може бути придатним для насадження, тобто здатним до проростання і утворення рослини-нащадка, або альтернативно, оброблено таким чином, що більше не може прорости, наприклад розколене, шліфоване або змолочене насіння, придатне для застосування при одержанні харчових продуктів або в харчуванні або для екстракції ліпіду за винаходом.
В цьому документі термін "запасаючий орган рослини" позначає частину рослини, що спеціалізується на зберіганні енергії у формі, наприклад, білків, вуглеводів, жирних кислот та/або олій. Прикладами запасаючих органів рослини є насіння, плід, бульбоподібне коріння і бульби. Переважним запасаючим органом рослини за винаходом є насіння.
В цьому документі термін "фенотипово нормальний" позначає генетично модифіковану рослину або орган рослини, особливо запасаючий орган, такий як насіння, бульбу або плід за винаходом, не володіючий істотною мірою зниженою здатністю до росту і відтворення, в порівнянні з немодифікованою рослиною або органом рослини. У варіанті реалізації винаходу генетично модифікована рослина або орган рослини, які є фенотипово нормальними, містять екзогенний полінуклеотид, що кодує супресор сайленсингу, функціонально пов'язаний з промотором, специфічним для запасаючого органу рослини, і володіє здатністю до росту або відтворення, по суті такою ж, як ізогенна рослина або орган, що не містить вказаного полінуклеотиду. Переважно біомаса, темпи росту, швидкість проростання, розмір запасаючого органу, розмір насіння та/або кількість утворених життєздатних зерен становить не менше 90 95 від показників рослини, яка не містить вказаного екзогенного полінуклеотиду, при вирощуванні в ідентичних умовах. Даний термін не охоплює ознак рослини, що можуть відрізнятися від рослини дикого типу, але при цьому не впливають на повноцінність рослини з точки зору комерційних цілей, наприклад, фенотип балерини листя саджанця.
Рослини, розкриті або включені для використання у практиці цього винаходу, включають однодольні рослини і дводольні рослини. В переважних варіантах реалізації рослини за даним винаходом являють собою урожайні рослини (наприклад, злакові і зернобобові, маїс, пшеницю, картоплю, тапіоку, рис, сорго, просо., маніоку, ячмінь або горох) або інші бобові. Рослини можеть бути вирощені для одержання їстівних коренів, клубенів, листя, стебел, квітів або плоду.
Рослини можуть бути овочевими або декоративними рослинами. Рослини за винаходом можуть являти собою: кукурудзу (7еа таувз), канола (Вгазвзіса пари, підвид Вгазвзіса гара), гірчицю (Вгаззіса |ипсеа), льон (І іпит изйаззітит), люцерну (Меадісадо заїїма), рис (Огула з5аїїма), жито (ЗесаІе сегаІе), сорго (Богупит бБісоїоиг, Зогупит миЇдаге), соняшник (Неїїапіпиб5 аппив), пшеницю (Т/гйішт аевзіїмит), сою (СіІусіпе тах), тютюн (Місоїапа їабасит), картоплю (зоЇїапит їмбего5цт), арахіс (Агаспіє Ппуродаєа), бавовник (Со55урішт Піг5шіцт), солодку картоплю (Гортоеа бБаїаскш5), маніоку (Мапіпої езсціепіа), каву (вид Соїеа), кокосовий горіх (Сосо5 писіїега), ананас (Апапа сотоз5ив5), цитрусове дерево (вид Сіїги5), какао (Пеобгота сасаоб), чай (Сатеїйа 5епепві5), банан (вид Миза), авокадо (Регзхеа атегісапа), інжир (Ріси5 сабвіса), гуаву (Рзідіншт диа)ама), манго (Мапоїїег іпаіса), оливу (ОїІєа еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю
Зо (Апасагдішт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іпіегугітоійа), мигдаль (Ргипи5 атудаа|нв5), цукровий буряк (Веїа миЇдагіб5), овес або ячмінь.
У переважному варіанті реалізації винаходу рослина є покритонасінною рослиною.
У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною олійної культури, переважно урожайною рослиною олійної культури. В цьому документі "рослина олійної культури" є видом рослини, використовуваним для комерційного одержання олій з насіння рослини. Рослина олійної культури може бути олійним канолаом (наприклад, канола), маїсом, соняшником, соєю, сорго, льоном (насіння льону) або цукровим буряком. Крім того, рослина олійної культури може бути іншими представниками Вгаззіса5, бавовником, арахісом, маком, гірчицею, рициною звичайною, кунжутом, сафлором або рослиною, що дає горіхи. Рослина може продукувати високі рівні олії в плоді, наприклад, олива, олійна пальма або кокосовий горіх. Садовими рослинами, до яких може бути застосований даний винахід, є салат, ендивій або хрестоцвітні овочі, включаючи капусту, броколі або цвітну капусту. Цей винахід може бути застосований до тютюну, гарбузових, моркви, суниці, помідора або перцю.
У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу нетрансгенна рослина, використовувана для одержання трансгенної рослини за винаходом, продукує олію, особливо у насінні, яке містить: ї) менше 20 95, менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:2 та/або ії) менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:3.
У переважному варіанті реалізації винаходу трансгенна рослина є гомозиготною по всіх і кожному введеному гену (трансгену), таким чином, що її потомство не розділяється для бажаного фенотипу. Крім того, трансгенна рослина може бути гетерозиготною по введеному(им) трансгену(ам), переважно однорідно гетерозиготною по трансгену, наприклад, в потомстві Е1, яке вирощене з гібридного насіння. Такі рослини можуть забезпечувати переваги, наприклад, гібридну силу, добре відому з рівня техніки.
Якщо це доречно, трансгенні рослини можуть містити додаткові трансгени, що кодують ферменти, які беруть участь у продукуванні ДЛ-ПНЖК, такі як, без обмеження, Аб-десатураза, д9-елонгаза, Дв-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-десатураза, ю03-десатураза, Д4-десатураза, Д5Ь- елонгаза, діацилгліцерол ацилтрансфераза, ЛФКАТ, А17-десатураза, Д1Т5-десатураза та/або
Д12-десатураза. Приклади таких ферментів з одним або більше вказаних видів активності відомі з рівня техніки і включають розкриті в цьому документі. У конкретних прикладах, бо трансгенна рослина щонайменше містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують:
а) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, А5-елонгазу і ДАб-елонгазу, б) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-елонгазу і Д9-елонгазу, в) А4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Дб-елонгазу і А15-десатуразу, г) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу, Д9У-елонгазу і А15-десатуразу, д) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Дб-елонгазу і А17- десатуразу, або е) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу, Д9-елонгазу і А17-десатуразу.
У варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди кодують набір поліпептидів, що являють собою ДЛб-десатуразу Руїйпішт ігедшіаге, А5-дезатуразу ТНигайвзіоснуні або д5Ь- дезатуразу Етійапа пихієуії, Аб-елонгазу Рнузсотійїгейа раїеп5, А5-елонгазу Тпгаивіоспуїтій або д5-елонгазу О5ігеосссиз Іашгії, оЗз-десатуразу Рпуїорпїнога іптехїап5 або о03-десатуразу Руїшійт іп тедшаге і Д4-десатуразу Тпгаивіоспуїгіа.
У варіанті реалізації винаходу рослини за винаходом вирощені в полі, переважно як популяція розміром щонайменше 1000 або 1000000 рослин, які по суті є однаковими, або на площі щонайменше 1 гектар. Щільність насадження варіює у відповідності до виду рослини, різновиду рослини, клімату, умов грунту, норм застосування добрив та інших факторів, як відомо з рівня техніки. Наприклад, канолу звичайно вирощують із щільністю насадження 1,2-1,5 млн. рослин на гектар. Урожай рослин збирають, як відомо з рівня техніки, що може включати валкування, рядне компостування та/або жнива плодів рослин, з подальшою молотьбою та/або віянням рослинного матеріалу для відокремлення насіння від решти частин рослини, часто у формі полови. Альтернативно, урожай насіння може бути зібраний з рослин у полі в ході єдиного процесу, а саме, комбайнування.
Трансформація рослин
Трансгенні рослини можуть бути одержані із застосуванням методів, відомих з рівня техніки, таких як загалом описані в А. Зіаїгег еї аї., Ріапі Віотесппоїосду -- Те Сепеїїс Мапіршіайоп ої
Ріапі5, Охіога Опімегейу Ргезз (2003), і Р. Спгізіои апа Н. Кіеєе, Напаброок ої Ріапі Віотесппоіоду,
Уонп Уміеу апа 5опв (2004).
В цьому документі терміни "стабільно трансформуючий", "стабільно трансформований" і їх варіації позначають інтеграцію екзогенних молекул нуклеїнових кислот в геном клітини таким чином, що вони передаються клітинам потомства в процесі поділу клітини, без необхідності в проведенні позитивної селекції щодо їх присутності. Стабільні трансформанти або їх потомство можуть бути відібрані будь-якими засобами, відомими з рівня техніки, такими як саузерн-блоти на хромосомній ДНК або гібридизація геномної ДНК іп 5йи.
Опосередковане Адгобрасієтішт перенесення є широко використовуваною системою для введення генів в рослинні клітини, оскільки ДНК може бути введена в клітини в суцільних тканинах рослини або органах рослини або експлантах в культурі тканини, з метою тимчасової експресії або стабільної інтеграції ДНК в геном клітини рослини. Використання опосередкованих
Адгорасієегішт векторів, що інтегруються, для рослин з метою введення ДНК в клітини рослини добре відоме з рівня техніки (див., наприклад, 5 5177010, 5 5104310, 05 5004863 або 05 5159135), включаючи методи занурення квіток з використанням Адгобасіегішт або інших бактерій, які можуть переносити ДНК в клітини рослини. Ділянка ДНК для перенесення визначається послідовностями межі, причому проміжна ДНК (Т-ДНК) звичайно вставляється до геному рослини. В подальшому, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, що приводить до декількох реорганізацій. У тих різновидах рослин, в яких опосередкована Адгобрасіегійт трансформація є ефективною, вона є способом вибору завдяки легкій і визначеній природі перенесення гена. Переважні вектори трансформації Адгобасіегічт здатні до реплікації в Е. соїїЇ, так само, як і Адгобасіегічт, дозволяючи здійснити необхідні маніпуляції, як було описано (Кіее еї аї., в: Ріапі ОМА Іптесійои5 Адепів, Нопп апа зсепеїї, ед5., Зргіпдег-Мепад, Мем МогК, рр. 179-203 (1985)).
Способи прискорення, які можуть застосовуватися, включають, наприклад, балістичну трансфекцію, тощо. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот в клітини рослини є балістична трансфекція. Даний спосіб розглянутий апа еї а)., Рапісіє Вотрагатепі Тесппоіоду тог Сепе Тгапвієг, Охіога Ргез5, Охгога, Епдіапа (1994).
Небіологічні частинки (мікрочастинки) в ньому можуть бути вкриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини рушійною силою. Приклади частинок включають виготовлені з вольфраму, золота, платини, тощо. Конкретна перевага балістичної трансфекції, на додаток до того, що вона є ефективним засобом відтворюваної трансформації однодольних, є те, що вона не вимагає ані виділення протопластів, ні сприйнятливості до інфекції Адгобасіегішт.
В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу пластиди можуть бути стабільно бо трансформовані. Способи, розкриті для трансформації пластиди у вищих рослинах, включають доставку за допомогою генної гармати частинки ДНК, що містить селекційний маркер, і націлювання ДНК на геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (05 5451513, 05 5545818, 5 5877402, 5 5932479 і ММО 99/05265).
Інші способи трансформації клітини можуть також застосовуватися і включають, без обмеження, введення ДНК в рослини прямим перенесенням ДНК в пилок, прямою ін'єкцією ДНК в репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих ембріонів, з подальшою регідратацією висушених ембріонів.
Регенерація, розвиток і культивування рослин з одинарних трансформантів протопласта рослини або з різноманітних трансформованих експлантів добре відомі з рівня техніки (УуеіззБасі еї аї. У: Метоаз ог Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, Саїїї., (1988)).
Така регенерація і процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин, культивування таких індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку, зокрема, стадію вкорінення саджанця. Трансгенні ембріони і насіння регенерують в такий же спосіб. Одержані трансгенні укорінені пагони в подальшому висаджують у відповідне середовище для росту рослини, таке як грунт.
Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомі з рівня техніки. Переважно регенеровані рослини є такими, що самозапилюються, щоб забезпечити гомозиготні трансгенні рослини. В іншому випадку, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещують з вирощеними із насіння рослинами важливих з агрономічної точки зору ліній. З другого боку, пилок рослин таких важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину за даним винаходом, що містить бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, культивують із застосуванням способів, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки.
Щоб підтвердити присутність трансгенів в трансгенних клітинах і рослинах, може бути здійснена ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз методом саузерн-блота, із застосуванням способів, відомих фахівцям в дані галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть бути виявлені будь-яким з численних шляхів, в залежності від природи продукту, що включають вестерн-блот і ферментний аналіз. Як тільки трансгенні рослини одержані, їх можна вирощувати для одержання тканин або частин рослини з бажаним
Зо фенотипом. Тканина рослини або частини рослини можуть бути зібрані як урожай, та/або зібране насіння. Насіння може служити джерелом вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що володіють бажаними характеристиками.
Трансгенна рослина, одержана із застосуванням Адгобасієгішт або інших способів трансформації, звичайно містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть носити назву гемізиготних по введеному(им) гену(ам). Більш переважною є трансгенна рослина, гомозиготна по введеному(им) гену(ам); тобто, трансгенна рослина, яка містить два додаткових гени, по одному гену в однакових локусах на кожній хромосомі з пари хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана шляхом самозапліднення гемізиготної трансгенної рослини, пророщування частини одержаного насіння та аналізу одержаних рослин щодо присутності цільового гена.
Крім того, необхідно розуміти, що дві різні трансгенні рослини, що містять два незалежно сегрегуючих екзогенних гени або локуси, можуть бути схрещеними (спареними), з метою одержання потомства, яке містить обидва набори генів або локусів. Самозапліднення відповідного нащадка ЕЇ може давати рослини, гомозиготні по обох екзогенних генах або локусах. Зворотне схрещування з материнською рослиною і знищення нетрансгенної рослини також розглядаються, як вегетативне розведення. Опис інших способів розведення, які звичайно використовуються для різноманітних ознак і врожаю, можна знайти в ЕРепйг, в: Вгеєедіпд
Меїподз їтог Сийімаг Оемеортепі, УМісох у). еєд., Атегісап Босієїу ої Адгопоту, Мадізоп М/ів. (1987).
Підвищення рівнів екзогенної РНК і стабілізована експресія
Супрессори сайленсингу
У варіанті реалізації винаходу клітина, рослина або частина рослини за винаходом містить екзогенний полінуклеотид, що кодує білок супресора сайленсингу.
Посттранскрипційний сайленсинг гена (ПТСГ) є специфічним для послідовності нуклеотидів механізмом захисту, що може бути націлений як на клітинні, так і на вірусні мРНК з метою їх розкладу. ПТСГ виникає в рослинах або грибах, стабільно або тимчасово трансформованих чужорідною (гетерологічною) або ендогенною ДНК, і приводить до зменшення акумуляції молекул РНК, послідовність яких подібна до введеної нуклеїнової кислоти.
Широко досліджений той факт, що співекспресія супресора сайленсинга з цільовим бо трансгеном підвищує рівні присутньої в клітині РНК, що транскрибована із трансгена. Хоча це є доведеним фактом для клітин іп мійго, значущі побічні ефекти спостерігаються в багатьох дослідженнях співекспресії у суцільних рослинах. Більш конкретно, як описано в Маїїогу еї аї. (2002), Спартап еї а!. (2004), Снеп єї а!. (2004), Юипоуєег вї а!. (2004), 7Напа еї а!. (2006), І ем/узеу еї аї. (2007) і Мепо еї аї. (2008) рослини, що експресують супресори сайленсинга, загалом під контролем конститутивних промоторів, часто є фенотипово аномальними до такої міри, що вони непридатні для комерційного виробництва.
Нещодавно було виявлено, що рівні молекул РНК можуть бути збільшені та/або рівні молекул РНК можуть бути стабілізовані протягом численних поколінь шляхом допомогою обмеження експресії супресора сайленсинга насінням рослини або його частиною (М/О2010/057246). В цьому документі "білок-супресор сайленсинга" або БСС являє собою будь- який поліпептид, який може експресуватися в клітині рослини, що підвищує рівень продукту експресії іншого трансгена в клітині рослини, особливо в подальших поколіннях, одержаних від початково трансформованої рослини. У варіанті реалізації винаходу БСС являє собою вірусний супресор сайленсинга або його мутант. Велика кількість вірусних супресорів сайленсинга відома з рівня техніки і включає, без обмеження, Р19, М2, РЗ8, Ре-Ро і КРУ-РО. У варіанті реалізації винаходу вірусний супресор сайленсинга містить послідовність амінокислот, представлену будь-якою з ЗЕО ІО МО: 53-57, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот щонайменше на 50 95 ідентичною будь-якій одній або більше із ЗЕО
ІО МО: 53-57, яка додатково володіє активністю супресора сайленсинга.
В цьому документі терміни "стабілізуючий експресію" "стабільно експресований", "стабілізована експресія" та їх варіації позначають рівень молекули РНК, по суті такий ж або перевищуючий рівень у рослинах-нащадках протягом наступних поколінь, наприклад, щонайменше 3, щонайменше 5 або щонайменше 10 поколінь, в порівнянні з ізогенними рослинами, які не містять екзогенного полінуклеотиду, що кодує супресор сайленсинга. Однак, даний(і) термін(и) не виключає(ють) можливості деякого зниження рівнів молекули РНК в наступних поколіннях, в порівнянні з попереднім поколінням, наприклад, зниження не менше 10 95 на покоління.
Супресор може бути вибраний з будь-якого джерела, наприклад, рослини, вірусу, ссавця, тощо. Див. ММО2010/057246 щодо переліку вірусів, з яких може бути одержаний супресор і
Зо позначення білка (наприклад, В2, Р14, тощо.) або кодуючої ділянки для супресора з кожного конкретного вірусу. Множинні копії супресора можуть бути використані. Різні супресори можуть використовуватися спільно (наприклад, в тандемі).
Молекули РНК
По суті будь-яка молекула РНК, яку бажано екпресувати в насінні рослини, може бути співекспресована із супресором сайленсинга. Кодовані поліпептиди можуть приймати участь в метаболізмі олії, крохмалю, вуглеводів, поживних речовин, тощо, або можуть бути відповідальними за синтез білків, пептидів, жирних кислот, ліпідів, воску, масел, крохмалів, цукру, вуглеводів, смакоароматичних речовин, ароматичних речовин, токсинів, каротиноїдів, гормонів, полімерів, флавоноїдів, запасних білків, фенолових кислот, алкалоїдів, лігніну, танінів, целюлози, глікопротеїнів, гліколіпідів, тощо, переважно біосинтез або збирання ТАГ.
У конкретному прикладі, рослини продукують підвищені рівні ферментів для продукування олії в рослинах, наприклад, видів Вгаз5іса, таких як канола або соняшника, сафлору, льону, бавовнику, соєвому бобі, Сатеїїйпа або магїгсі.
Рівні продукування ДЛ-ПНЖК
Рівні ДЛА-ПНЖК або комбінацій ДЛ-ПНЖК, що продукуються в рекомбінантній клітині або частині рослини, наприклад, насінні, мають велике значення. Рівні можуть бути виражені, як склад (у відсотках) загальних жирних кислот, які є конкретними ДЛ-ПНЖК або групою споріднених ДЛ-ПНЖК, наприклад, 03 ДЛ-ПНЖК або об ДЛ-ПНЖК, або ДДЛ-ПНЖК, або інші, що може бути визначене за способами, відомими з рівня техніки. Крім того, рівень може бути виражений, як вміст ДЛ-ПНЖК, наприклад як відсоток ДЛ-ПНЖК в сухій масі матеріалу, що містить рекомбінантні клітини, наприклад, відсоток від маси насіння, який представляє ДЛ-
ПНЖК. Необхідно розуміти, що рівень ДЛА-ПНЖК, що продукується в олійній культурі, може бути значно вищим за показниками вмісту ДЛ-ПНЖК, ніж в овочі або насінні, яке не вирощувалося для цілей одержання олії, хоча обидва можуть мати подібний склад ДЛ-ПНЖК і обидва можуть використовуватися як джерела ДЛ-ПНЖК для споживання людиною або твариною.
Рівні ДЛ-ПНЖК можуть бути визначені за будь-яким із способів, відомих у даній галузі техніки. У переважному способі загальний ліпід добувають з клітин, тканин або організмів, і жирну кислоту перетворюють на метилові ефіри перед аналізом газовою хроматографією (ГХ).
Такі методи розкриті у Прикладі 1. Розташування піку на хроматограмі може використовуватися бо для ідентифікації кожної конкретної жирної кислоти, і площу кожного піку інтегрують для визначення кількості. В цьому документі, якщо не вказано інше, відсоток конкретної жирної кислоти у зразку визначають, виражаючи площу піку вказаної жирної кислоти як відсоток від загальної площі піків жирних кислот на хроматограмі. По суті, це відповідає масовому відсотку (мас/мас). Ідентичність жирних кислот може бути підтверджена ГХ-МеС. Загальні ліпіди можуть бути виділені методами, відомими з рівня технікию, з метою очищення фракцій, наприклад, фракції ТАГ. Наприклад, тонкошарова хроматографія (ТШХ) може бути здійснена в аналітичному масштабі, щоб відокремити ТАГ від інших фракцій ліпіду, таких як ДАГ, ацил-КоА або фосфоліпід, з метою визначення складу жирних кислот конкретно для ТАГ.
В одному варіанті реалізації винаходу загальна сума АРК, ЕПК, ДПК і ДГК в жирних кислотах екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 25 95 загальних жирних кислот в клітині. У подальшому варіанті реалізації винаходу загальні жирні кислоти в клітині містять менше 1 95 С20:1. У переважних варіантах реалізації екстрагований ТАГ в клітині містить жирні кислоти в кількостях, вказаних у цьому документі. Кожна з можливих комбінацій ознак, що визначають ліпід, розкритий в цьому документі, також включена.
Додатково рівень продукування ДЛ-ПНЖК в рекомбінантній клітині, рослині або частині рослини, наприклад, насінні, може бути виражений, як відсоток перетворення конкретного жирнокислотного субстрату на один або більше жирнокислотних продуктів, що в цьому документі додатково носить назву "ефективності перетворення" або "ефективності ферменту".
Цей параметр базується на жирнокислотному складі ліпіду, екстрагованого з клітини, рослини, частини рослини або насіння, тобто, кількості утвореної ДЛ-ПНЖК (зокрема іншої ДЛ-ПНЖК, одержаної з неї), вираженому як відсоток від одного або більше жирнокислотних субстратів (зокрема, всіх інших жирних кислот, одержаних із нього). Загальна формула для відсотка перетворення: 100 х (сума відсотків продукту ДЛ-ПНЖК і всіх продуктів, одержаних із нього)/(сума відсотків жирнокислотного субстрату і всіх продуктів, одержаних із нього). Стосовно
ДГК, наприклад, це може бути виражено, як співвідношення рівня ДГК (у вигляді відсотка від загального вмісту жирних кислот в ліпіді) до рівня жирнокислотного субстрату (наприклад ОК,
ЛК, АЛК, СДК, ЕТК або ЕПК) і всіх продуктів, окрім ДГК, одержаних з субстрату. Відсоток перетворення або ефективність перетворення можуть бути виражені для єдиної ферментної стадії біохімічного шляху, а також для частини або всього шляху.
Зо Специфічна ефективність перетворення обчислена в цьому документі за наступними формулами: 1. ОК на ДГК - 100 х (95ДГКЮ)/(сума 96 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК,
ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 2. ЛК на ДГК - 100 х (96ДГК)/(сума до для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 3. АЛК на ДГК - 100 х (96ДГК)/(сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 4. ЕПК на ДГК - 100 х (9оДГК)/(сума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК). 5. ДПК на ДГК (ефективність Д4-десатурази) - 100 х (96ДГК)/ (сума 95 для ДПК і ДГК). 6. Ефективність Л12-десатурази - 100 х (сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК,
ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК ії ДГКЮМсума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 7. Ефективність 0З-десатурази - 100 х (сума 96 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і дгкю)/ сума до ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 8. ОК на АЛК - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК,
ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 9. Ефективність Дб-десатурази (на 03 субстраті АЛК) - 100 х (сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК,
ДПК і ДГЮЛО» АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 10. Ефективність Дб-елонгази (на 03 субстраті СДК) - 100 х (сума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і
ДдГгК)Хсума 9о для СДК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 11. Ефективність А5-десатурази (на 03 субстраті ЕТК) - 100 х (сума 95 для ЕПК, ДПК і
ДдГК)Хсума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 12. Ефективність Д5-елонгази (на 03 субстраті ЕПК) - 100 х (сума 95 для ДПК і ДГЮ.(сума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК).
Жирнокислотний склад ліпіду, переважно олії з насіння, за винаходом також відрізняється за співвідношенням б жирних кислот: 03 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот, для будь-яких загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот або для нових фб жирних кислот: 03 нових жирних кислот. Терміни загальні 06 жирні кислоти, загальні 003 жирні кислоти, нові 0б жирні кислоти і нові 003 жирні кислоти мають значення, визначені в цьому документі.
Співвідношення обчислюють на базі складу жирних кислот у ліпіді, екстрагованому з клітини, бо рослини, частини рослини або насіння ліпіду, за способом, приклад якого наведений у цьому документі. Більш бажаною є присутність в ліпіді вищого рівня 03 жирних кислот, ніж 0б жирних кислот, і таким чином співвідношення 06:03 менше 1,0 є переважним. Співвідношення 0,0 вказує на повну відсутність певних б жирних кислот; співвідношення 0,03 було досягнуте, як розкрито у Прикладі 6. Такі низькі значення співвідношення можуть бути досягнуті шляхом сполученого використання Аб-десатурази з перевагою по відношенню до субстрату 03, разом з ошЗ3-десатуразою, особливо грибковою с03-десатуразою, такою як 003-десатураза Ріспіа равіогів, приклад якої наведений в цьому документі.
Додатково вихід ДЛ-ПНЖК на масу насіння може бути обчислений на базі загального вмісту олії в насінні і 95 ДГК в олії. Наприклад, якщо вміст олії в насінні канолау становить приблизно 40 95 (мас./масс.), і приблизно 12 95 від загального вмісту жирних кислот в олії становить ДГК, вміст ДГК в насінні становить приблизно 4,8 95 або близько 48 мг на грам насіння. Як розкрито в
Прикладі 2, вміст ДГК в насінні Агарідорзі5, що містить приблизно 9 95 ДГК, в якому вміст олії нижчий, ніж в канолаї, становив 25 мг/г насіння. При вмісті ДГК приблизно 7 95, насіння канолау або насіння Сатеїїпа 5айма містить рівень ДГК приблизно 28 мг на грам насіння. У цьому винаході таким чином розкриваються рослини Вгаззіса пари, В. |їипсеа і Сатеїїйпа займа та одержане з них насіння, яке містить щонайменше близько 28 мг ДГК на грам насіння. Вміст вологи в насінні є стандартним для зібраного в процесі збору урожаю зрілого насіння після сушіння (4-15 95 вологи). У винаході також розкривається спосіб одержання олії, який включає одержання насіння і виділення олії з насіння, застосування олії і способи одержання насіння, включаючі збір урожаю насіння з рослин за винаходом.
Крім того, може бути обчислена кількість ДГК, що продукується на гектар, якщо вихід насіння з гектара відомий або може бути оцінений. Наприклад, урожайність каноли в Австралії зазвичай приблизно 2,5 тони насіння на гектар, що при вмісті олії 40 95 дає близько 1000 кг олії. При вмісті ДГК 12 95 в кінцевій олії, це забезпечує близько 120 кг ДГК на гектар. Якщо вміст олії знижується на 50 95, це все ще забезпечує близько 60 кг ДГК/га.
Одержані на сьогоднішній день докази свідчать про те, що деякі десатурази, що гетерологічно експресуються в дріжджах або рослинах, володіють відносно низькою активністю в комбінації з деякими елонгазами. Дану ситуацію можна покращити, надаючи десатуразі здатність використовувати форму ацил-КоОА жирної кислоти як субстрат у синтезі ДЛ-ПНЖК, і це
Зо вважається переважним в рекомбінантних клітинах, особливо у клітинах рослини. Особливо переважна комбінація для ефективного синтезу ДГК являє собою грибкову 03-десатуразу, наприклад, таку як Ф3-десатураза Ріспіа равіогіз (ЗЕО ІЮ МО: 12), що є Дб-десатуразою з перевагою по відношенню до 03 ацильних субстратів, наприклад, таку як Дб-десатураза
Місготопаз ризійа (ЗЕО ІЮ МО: 13) або її варіанти з ідентичністю послідовності амінокислот щонайменше 95 95.
В цьому документі термін "що по суті не містить" означає, що композиція (наприклад, ліпід або олія) містить невелику кількість (наприклад, менше, ніж приблизно 0,595, менше, ніж приблизно 0,25 95, менше, ніж приблизно 0,1 956, або менше, ніж приблизно 0,01 965) або не містить певного компоненту. У варіанті реалізації винаходу "такий, що по суті не містить" означає, що компонент неможливо знайти за допомогою шаблонної методики аналізу, наприклад, конкретна жирна кислота (наприклад, об-докозапентаєнова кислота) не може бути знайдена за допомогою газової хроматографії, як у загальних рисах розкрито в Прикладі 1
Отримання олій
Методи, які шаблонно практикуються в цій галузі техніки, можуть застосовуватися для виділення, обробки і аналізу олій, продукованих клітинами, рослинами, насінням, тощо за даним винаходом. Зазвичай насіння рослини термічно обробляють, пресують і екстрагують, щоб продукувати неочищену олію, яку далі гідратують, рафінують, відбілюють і дезодорують.
Загалом методи подрібнення насіння відомі з рівня техніки. Наприклад, насіння олійних культур може бути пом'якшено шляхом орошування його водою для підвищення вмісту вологи, наприклад, до 8,5 95, і провальцьоване за допомогою гладкого валу із щілинами розміром 0,23-- 0,27 мм. В залежності від виду насіння, перед подрібненням можна не додавати воду.
Застосування нагрівання інактивує ферменти, полегшує подальший розрив клітини, об'єднання олійних крапель, і забезпечує агломерацію частинок білка, причому все це спрощує процес екстракції.
У варіанті реалізації винаходу більшість олії з насіння вивільняється при пропусканні крізь гвинтовий прес. Макуху, що виходить з гвинтового пресу, далі екстрагують, наприклад, гексаном, з використанням колонки із супровідним теплоконтролем. Як альтернатива, неочищена олія, одержана в ході операції пресування, може бути пропущена крізь резервуар для осадження з дротяним дренажним верхом із прорізами, щоб видалити тверді речовини, які бо потрапляють в олію в ході операції пресування. Освітлена олія може бути пропущена крізь рамний і фільтр-прес для видалення будь-яких тонких механічних включень, що залишилися. За необхідності олія після процесу екстракції може бути об'єднана з освітленою олією, з одержанням змішаної неочищеної олії.
Як тільки розчинник відділений 3 неочищеної олії, пресовані та екстраговані порції об'єднують і обробляють звичайними процедурами обробки олії. В цьому документі термін "очищений", використовуваний у зв'язку з ліпідом або олією за винаходом, звичайно означає, що екстрагований ліпід або олія пройшли одну або більше стадій обробки, які підвищують ступінь чистоти ліпідного/олійного компоненту. Наприклад, стадія очищення може включати одне або більше або все із групи, що складається з: гідратації, дезодорування, відбілювання, сушіння та/або фракціонування екстрагованого олії. Однак в цьому документі термін "очищений" не включає процесу переетерифікації або іншого процесу, що модифікує склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом для збільшення вмісту ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Іншими словами, склад жирних кислот очищеного ліпіду або олії по суті є таким же, як склад неочищеного ліпіду або олії.
Гідратація
Гідратація є початковою стадією рафінацій олій, і його основна мета полягає у видаленні з олії більшості фосфоліпідів, які можуть бути присутніми в кількості приблизно 1-2 95 від загального екстрагованого ліпіду. Додавання до неочищеного олії -2 95 води, що звичайно містить фосфорну кислоту, при 70-80 "С приводить до відокремлення більшості фосфоліпідів, за наявності залишкових кількостей металів і пігментів. Нерозчинний матеріал, який відокремлюється, в основному є сумішшю фосфоліпідів і триацилгліцеролів, і також відомий як лецитин. Гідратація може здійснюватись шляхом додавання концентрованої фосфорної кислоти до неочищеної олії з насіння, з метою переведення нездатних до гідратації фосфатидів у здатну до гідратації форму та утворення хелатів металів, які присутні в незначних кількостях. Смолу відокремлюють від олії з насіння центрифугуванням.
Лужна рафінація
Лужна рафінація є одним із способів очищення для обробки неочищеного олії, який іноді також називають нейтралізацією. Вона зазвичай слідує за гідратацією і передує відбілюванню.
Після гідратації олія з насіння може бути оброблена додаванням достатньої кількості розчину
Зо лугу, щоб відтитрувати всі жирні кислоти і фосфорні кислоти, з подальшим видаленням утвореного мила. Придатні лужні матеріали включають натрію гідроксид, калію гідроксид, натрію карбонат, літію гідроксид, кальцію гідроксид, кальцію карбонат і амонію гідроксид. Цей спосіб, як правило, здійснюють за кімнатної температури, з видаленням фракції вільних жирних кислот. Мило видаляють центрифугуванням або екстракцією мила розчинником, ( нейтралізовану олію промивають водою. За необхідності, надлишок лугу в олії може бути нейтралізований відповідною кислотою, такою як хлористоводнева кислота або сірчана кислота.
Відбілювання
Відбілювання є способом очищення, за якого олію нагрівають до 90-120 "С, витримуючи за цієї температури протягом 10-30 хвилин у присутності відбілюючої глини (0,2-2,0 95) і за відсутності кисню, в атмосфері азоту або пари або під вакуумом. Ця стадія обробки олії розроблена таким чином, щоб видаляти небажані пігменти (каротиноїди, хлорофіл, госипол, тощо), причому спосіб додатково видаляє продукти окиснення, залишкові метали, сполуки сірки і залишок мила.
Дезодорування
Дезодорування є обробкою олій і жирів за високої температури (200-260 "С) і низького тиску (0,1-1 мм рт. ст). Зазвичай, це досягається шляхом введення пари в олію з насіння із швидкістю приблизно 0,1 мл/хвилину/100 мл олії з насіння. Приблизно через 30 хвилин зрошування олії з насіння охолоджують під вакуумом. Олію з насіння зазвичай подають до скляного контейнеру і пропускають аргон, після чого зберігають за низької температури. Така обробка покращує колір олії з насіння і видаляє більшість летючих субстанцій або пахучих сполук, включаючи вільні жирні кислоти, що залишилися, моноацилгліцероли і продукти окиснення.
Вінтеризація
Вінтеризація є способом, що іноді застосовується в комерційному виробництві олій з метою розділення олій і жирів на тверді (стеарин) і рідкі (олеїн) фракції шляхом кристалізації за температур, нижчих за температуру навколишнього середовища. Спочатку його застосовували до бавовняної олії, з метою одержання продукту, що не містить твердих речовин. Зазвичай, цей спосіб застосовують для зменшення вмісту насичених жирних кислот в олії.
Переетерифікація
Переетерифікація є способом обміну жирних кислот в межах і між ТАГ або перенесення жирних кислот на інший спирт, з утворенням ефіру, спочатку шляхом вивільнення жирних кислот з ТАГ у формі вільних жирних кислот або у формі ефірів жирних кислот, звичайно метилових ефірів або етилових ефірів жирних кислот. За умови поєднання із способом фракціонування, переетерифікація може застосовуватися для модифікації жирнокислотного складу ліпідів (Магапдопі еї аї., 1995). Для переєетерифікації можуть використовуватися хімічні (наприклад, каталізовані сильною кислотою або основою) або ферментні препарати, причому останні включають ліпази, що можуть бути специфічними до положення (5п-1/3 або 5п-2 специфічними) жирної кислоти в ТАГ, або з перевагою по відношенню до деяких жирних кислот в порівнянні з іншими (Зрегап;а еї аї., 2012). Фракціонування жирних кислот, з метою підвищення концентрації ДЛ-ПНЖК в олії може бути здійснено будь-яким із способів, відомих з рівня техніки, таких як, наприклад, кристалізація виморожуванням, утворення комплексів з використанням сечовини, молекулярна дистиляція, екстракція надкритичною рідиною |і утворення комплексів з іоном срібла. Утворення комплексів із сечовиною є переважним способом унаслідок його простоти та ефективності з точки зору зниження рівня насичених і мононенасичених жирних кислот в олії (сате? еї аї., 2003). Спочатку, ТАГ в олії розщеплюють на складові жирні кислоти, часто у формі ефірів жирних кислот, шляхом гідролізу в умовах каталізу кислотою або основою, внаслідок чого один моль ТАГ реагує щонайменше з З моль спирту (наприклад, етанолу у випадку етилових ефірів або метанолу у випадку метилових ефірів), причому використовують надлишок спирту, щоб забезпечує розділення алкілових ефірів, які утворилися, і гліцерину, який також утворюється, або за допомогою ліпаз. Такі вільні жирні кислоти або ефіри жирних кислот, що звичайно залишаються в незміненому виді у складі жирних кислот після обробки, в подальшому можуть бути змішані з етанольним розчином сечовини для утворення комплексів. Насичені і мононенасичені жирні кислоти легко утворюють комплекси із сечовиною, кристалізуються при охолодженні і далі можуть бути видалені фільтрацією. Фракція, що не утворила комплекси із сечовиною, таким чином, збагачується ДЛ-
ПНЖК.
Продукти харчування (корми)
Цей винахід включає композиції, які можуть використовуватися як продукти харчування
Зо (корми). Для цілей цього винаходу "продукти харчування (корми)» включають будь-який продукт харчування або препарат для споживання людиною або твариною, який при надходженні в організм: (а) служить цілям живлення або утворення тканин або постачання енергією; та/або (б) підтримує, відновлює або сприяє належному харчовому статусу або метаболічній функції.
Продукти харчування (корми) за винаходом включають харчові суміші для немовлят та/або дітей молодшого віку, такі як, наприклад, молочна суміш для дитячого харчування, і шрот за винаходом.
Продукти харчування (корми) за винаходом включають, наприклад, клітину за винаходом, рослину за винаходом, частину рослини за винаходом, насіння за винаходом, екстракт за винаходом, продукт способу за винаходом, продукт процесу ферментації за винаходом, або композицію разом з відповідним(и) носієм(ями). Термін "носій" використовується в найширшому значенні і включає будь-який компонент, який може мати харчове значення або не мати його. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, носій повинен бути придатним для використання (або використовуваним в достатньо низькій концентрації) в продукті харчування (кормі), таким чином, що він не здійснює шкідливого впливу на організм, якій споживає продукт харчування (корм).
Продукт харчування (корм) за цим винаходом включає олію, ефір жирної кислоти або жирну кислоту, одержану прямо або непрямо із застосуванням способів, клітин або рослин, розкритих у цьому документі. Додатково композиція може знаходитися в твердій або рідкій формі. Крім того, композиція може містити їстівні мікронутрієнти, білок, вуглеводи, вітаміни та/або мінерали в кількостях, бажаних для конкретного застосування. Кількості цих інгредієнтів варіюватимуть залежно від того, чи призначається композиція для застосування у здорових індивідуумів або для застосування у індивідуумів з особливими потребами, наприклад, індивідуумів, які страждають на метаболічні розлади, тощо.
Приклади придатних носіїв, що мають харчове значення, включають, без обмеження, макронутрієнти, наприклад, їстівні жири, вуглеводи і білки. Приклади таких їстівних жирів включають, без обмеження, кокосове масло, олію бурячника, олію грибів, олію чорної смородини, соєву олію, а також моно- і дигліцероли. Приклади таких вуглеводів включають (без обмеження): глюкозу, їстівну лактозу і гідролізований крохмаль. Додатково, приклади білків, які можуть використовуватися в харчовій композиції за винаходом, включають (без обмеження) білки сої, оброблену електродіалізом сироватку, оброблене електродіалізомзбиране молоко, 60 молочну сироватку або гідролізати вказаних білків.
Стосовно вітамінів і мінералів, наступне може бути додане до композицій харчових продуктів (кормів) за цим винаходом: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, вітаміни А, Е, 0, С і вітаміни групи В. Крім того, інші такі вітаміни і мінерали можуть бути додані.
Компоненти, що використовуються в композиціях продукту харчування (корма) за цим винаходом, можуть бути напівочищеними або очищеними. Під напівочищеним або очищеним мається на увазі матеріал, який одержаний шляхом очищення природного матеріалу або синтезу де помо.
Додатково композиція харчового продукту (корми) за даним винаходом може бути додана до їжі навіть в тому випадку, якщо немає необхідності в добавках до раціону. Наприклад, композиція може бути додана до їжі будь-якого типу, зокрема (без обмеження): маргарин, модифіковане масло, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерки, легкі закуски, олії для салатів, олії для приготування їжі, кулінарні жири, м'ясо, риба і напої.
Рід Засспаготусез зрр. використовується як при виготовленні пива, так і у виноробстві, а також як агент у випічці, особливо хліба. Крім того, інші види дріжджів, такі як дріжджі- продуценти ліпідів, включаючи, наприклад, вид Магтомжіа, є придатними для одержання ДлЛ-
ПНЖК. Дріжджі можуть використовуватися як добавка до харчування тварин, наприклад, в аквакультурі. Необхідно розуміти, що можуть бути запропоновані генетично сконструйовані штами дріжджів, адаптовані до синтезу ДЛ-ПНЖК, як розкрито в цьому документі. Такі штами дріжджів або продукуючі ДЛ-ПНЖК можуть в подальшому використовуватися в продовольчих продуктах, а також виробництві вина і пива, з метою забезпечення продуктів із підвищеним вмістом жирних кислот.
Додатково жирні кислоти, що отримують відповідно за цим винаходом, або клітини-хазяї, трансформовані таким чином, що в них містяться та експресуються цільові гени, можуть використовуватися як харчові добавки для тварин, з метою модифікації складу жирних кислот в тканині, яйці або молоці тварини до необхідного для споживання людиною або твариною.
Приклади таких тварин включають овець, велику рогату худобу, коней, домашніх птахів, наприклад, курей, тощо.
До того ж, продукти харчування (корми) за винаходом можуть використовуватися в
Зо аквакультурі, з метою підвищення рівнів жирних кислот в організмі риби або ракоподібних, таких як, наприклад, креветки, для споживання людиною або твариною. Переважно риба є лососем.
Переважні продукти харчування (корми) за винаходом є рослинами, насінням та іншими частинами рослини, такими як листя і стебла, що безпосередньо можуть використовуватися як їжа або корм для людини або тварин. Наприклад, тварини можуть безпосередньо пастися на таких рослинах, вирощуваних в полі, або їм можуть згодовуватися точніше визначені кількості в ході контрольованого годування. Винахід включає застосування таких рослин і частин рослини як їжі для підвищення рівнів ДЛ-ПНЖК в організмі людини і тварин.
Композиції
Цей винахід також включає композиції, особливо фармацевтичні композиції, що містять одну або більше жирних кислот та/або олій, одержаних із застосуванням способів за винаходом.
Фармацевтична композиція може містити одну або більше жирних кислот та/або олій, в комбінації із стандартним, відомим, нетоксичним фармацевтично прийнятним носієм, ад'ювантом або розчинником, таким як фосфатно-сольовий буфер, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, зволожуючий агент або емульсія, наприклад, емульсія вода/олія. Композиція може знаходитися в рідкій або твердій формі. Наприклад, композиція може бути у формі пігулки, капсули, рідини для ковтання або порошку, в ін'єкційній формі або у формі мазі або крему для місцевого застосування. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і використовування поверхнево- активних речовин. Крім того, може бути бажаним введення ізотонічних агентів, наприклад, цукру, натрію хлориду, тощо. Окрім таких інертних розбавлювачів, композиція може містити ад'юванти, такі як зволожувачі, емульгатори і суспендувальні агенти, підсолоджувачі, смакові добавки та ароматизатори.
Суспензії разом з активними сполуками можуть містити суспендувальні агенти, такі як етоксильовані ізостеарилові спирти, складні ефіри сорбіту і поліоксиетилен сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, мета-гідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші цих субстанцій.
Тверді лікарські форми, такі як таблетки і капсули, можуть бути одержані із застосуванням способів, добре відомих з рівня техніки. Наприклад, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, можуть бути таблетовані із звичайними основами таблеток, такими як лактоза, бо сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації із зв'язувальними речовинами, такими як акація,
кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегрантами, такими як картопляний крохмаль або альгінова кислота, і змащувальними речовинами, такими як стеаринова кислота або магнію стеарат. Капсули можуть бути одержані шляхом об'єднання вказаних допоміжних речовин в желатиновій капсулі з антиоксидантами і відповідною жирною(ими) кислотою(ами).
Для внутрішньовенного введення, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, або їх похідні, можуть бути введені в комерційні препарати.
Типові дози конкретної жирної кислоти становлять від 0,1 мг до 20 г, при введенні від 1 до 5 разів на день (до 100 г щоденно), і переважно знаходяться в інтервалі від приблизно 10 мг до приблизно 1, 2, 5 або 10 г щодня (у вигляді однієї або декількох доз). Як відомо з рівня техніки, бажано вводити щонайменше приблизно 300 мг/день жирної кислоти, особливо ДЛ-ПНЖК.
Проте необхідно розуміти, що будь-яка кількість жирної кислоти буде корисною для суб'єкта.
Можливі способи введення фармацевтичних композицій за цим винаходом включають, наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний. Наприклад, рідкий препарат може бути введений перорально або ректально. Додатково гомогенна суміш може бути повністю диспергована у воді, попередньо змішаній в стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розбавлювачами, консервантами, буферами або пропелентами для одержання спрею або засобу для інгаляцій.
Дози композиції для введення пацієнту можуть бути визначені звичайним фахівцем в цій галузі техніки і залежать від різних факторів, таких як маса тіла пацієнта, вік пацієнта, загальний стан здоров'я пацієнта, анамнез пацієнта, імунний статус пацієнта, тощо.
Додатково композиції за цим винаходом можуть застосовуватися для косметичних цілей.
Вони можуть додаватися до існуючих косметичних композицій таким чином, що утворюється суміш, або жирна кислота, одержана у відповідності до цього винаходу, може використовуватися як єдиний "активний" інгредієнт в косметичній композиції.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Матеріали і способи
Експресія генів в клітинах рослини в системі тимчасової експресії
Екзогенні генетичні конструкції експресують в клітинах рослини в системі тимчасової експресії, як суттєво описано Моїппеї еї аІ. (2003) ії оса еї аї. (2009). Плазміди, що містять
Зо кодуючу ділянку, яка експресується з високоактивного конститутивного промотору, наприклад, промотору Самм 355, вводять в Адгобасієгійт (шптегасіеп5, штам АСІ 1. Химерний ген 355 :р19 для експресії вірусного супресора сайленсинга р19 окремо вводять в Асі 1, як розкрито у УМО 2010/057246. Рекомбінантні клітини Адгобасіегішт вирощують за 28 "С в лізогенному бульйоні (ЛБ), що містить 50 мг/л канаміцину їі 50 мг/л рифампіцину, до стаціонарної фази. Далі бактерії гранулюють центрифугуванням при 5000 уд протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, після чого ресуспендують до 00600-1,0 в інфільтраційному буфері, що містить 10 мМ морфоліноетансульфонової кислоти (МЕС), рН 5,7, 10 мМ МасІі?» і 100 мкМ ацетосирингону. Далі клітини інкубують за 28 "С із струшуванням протягом З годин, після чого рівні об'єми культур
Адгорасіегішт, що містять 355:р19 і досліджувану цільову химерну конструкцію(ї), змішують перед інфільтрацією листової тканини. Рослини звичайно вирощують ще протягом 5 днів після інфільтрації, після чого листові диски витягують і сушать виморожуванням для аналізу жирних кислот методом ГХ.
Складні метилові ефіри жирних кислот (МЕЖК) загальних листових ліпідів у ліофілізованих зразках одержують, інкубуючи зразки протягом 2 годин при 80"Сб в розчині метанол/НСі/дихлорметан (10/1/1, об/об), що містить відому кількість гексадеканової кислоти як внутрішній стандарт. МЕЖК екстрагують в гексан/ДХМ, концентрують до невеликого об'єму в гексані і вводять в прилад для ГХ. Кількість присутніх індивідуальних і загальних жирних кислот в ліпідних фракціях визначають на базі відомої кількості внутрішнього стандарту.
Аналіз жирних кислот методом газової хроматографії (ГХ)
МЕЖК аналізують методом газової хроматографії за допомогою газового хроматографа
Адіїепі ТесппоЇодіеє 7890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного колонкою 5ОЕ-
ВРХ7О (70 95 ціанопропіл полісилфенілен-силоксану, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина плівки 0,25 мм) завдовжки 30 м, ПІД (плазмово-іонізаційним детектором), інжектором з розділенням/без розділення, а також серійним аутосамплером та інжектором Адіїепі
Тесппоодієз 7693. Гелій використовують як газ-носій. Зразки вводять інжекцією в методі з розділенням (співвідношення 50:1) при температурі печі 150 "С. Після інжекції температуру печі підтримують на рівні 150 "С протягом 1 хвилини, далі підвищують до 210 "С із швидкістю
З "С/хвилину, знову підвищують до 240 "С із швидкістю 50 "С/хвилину і остаточно підтримують протягом 1,4 хвилин на рівні 240 "С. Площу піків визначають за допомогою програмного бо забезпечення Адйепі Тесппоїодіеє Спетоечайцйоп (версія Кем 88.04.03 (16), Пало-Альто,
Каліфорнія, США), на базі відповіді відомої кількості зовнішнього стандарту СІ С-411 (МиспескК) і внутрішнього стандарту С17:О-МЕ.
Аналіз ліпідів методом рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ-МС)
Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого насіння, що розвивається, через 12 днів після цвітіння (дпц) і зрілого насіння після додавання відомої кількості три-С17:0-ТАГ як внутрішнього стандарту для кількісної оцінки. Екстраговані ліпіди розчиняють в 1 мл 10 мМ бутильованого гідрокситолуолу в суміші бутанол/метанол (1:1, об/об) на 5 мг сухого матеріалу і аналізують за допомогою рідинного хроматографа серії Адіїепі 1200 з РХ та іонізацією електророзпиленням за допомогою РХ-МС 64106 з трьома квадрупольними лінзами. Ліпіди хроматографічно розділяють з використанням колонки Азсепії5 Ехрге55 КР-Атіде (50 мм х 2,1 мм, 2,7 мкм, З,иреїсо) в режимі бінарного градієнта із швидкістю потоку 0,2 мл/хвилину. Рухомі фази: А. 10 мМ амонію форміату в суміші НгО/метанол/тетрагідрофуран (50:20:30 об/об/об); В. 10 мМ амонію форміату в суміші
НгО/метанол/гетрагідрофуран (5:20:75, об/об/06). Переліки для моніторингу множинних реакцій (ММР) базуються на наступних основних жирних кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 20:11, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, з використанням енергії зіткнення 30 В ії фрагментора 60
В. Індивідуальні ТАГ згідно ММР ідентифікують на базі іона амонізованого прекурсору та іона продукту, утвореного в результаті втрати нейтральних частинок 22:6. Кількість ТАГ визначають з використанням 10 мкМ зовнішнього стандарту тристеарину.
Визначення профілю жирних кислот і вмісту олії в насінні
За необхідності визначення вмісту олії в насінні, насіння сушать в ексикаторі протягом 24 годин, і приблизно 4 мг насіння переносять до скляного флакону місткістю 2 мл, із вкритою
Тефлоном нагвинчувальною кришкою. 0,05 мг тригептадеканоїну, розчиненого в 0,1 мл толуолу, додають у флакон як внутрішній стандарт.
МЕЖК насіння одержують, додаючи 0,7 мл 1 н метанольного НСІ (ЗиреїЇсо) у флакон, що містить матеріал насіння, короткочасно обробляють вихровим перемішуванням та інкубують при 80" С протягом 2 годин. Після охолодження до кімнатної температури, 0,3 мл 0,9 95 (мас/об) розчину Масі ї 0,1 мл гексану додають у флакон і ретельно перемішують протягом 10 хвилин в
НеїдоІри Міргатах 110. МЕЖК збирають у скляну вставку місткістю 0,3 мл і аналізують методом
ГХ з плазмово-іонізаційним детектором (ПІД), як було згадано раніше.
Зо Площу піку окремого МЕЖК спочатку коректують на базі відповіді у вигляді площі піку відомої кількості таких же МЕЖК, присутніх в комерційному стандарті СІ С-411 (МО-СНЕК РЕЕР,
ІМС., США). СІ С-411 містить рівні кількості 31 жирної кислоти (мас. 95), в інтервалі від С8:0 до
С22:6. У випадку жирних кислот, які відсутні в стандарті, винахідники використовували відповіді у вигляді площі піку найбільш подібного МЕЖК. Наприклад, відповідь у вигляді площі піку МЕЖК 161149 використовували для 16147, і відповідь МЕЖК С22:6 використовували для С22:5.
Скоректовані значення площі піку використовують для обчислення маси кожного МЕЖК в зразку, в порівнянні з масою внутрішнього стандарту. Олія зберігається в основному у формі
ТАГ, і її масу обчислюють на базі маси МЕЖК. Загальну кількість моль гліцерину визначають шляхом обчислення кількості моль кожного МЕЖК і поділу загальної кількості моль МЕЖК на три. Вміст ТАГ обчислюють як суму гліцерину і жирних ацильних фрагментів, з використанням співвідношення: мас. 95 олії - 100 х ((41 х загальна кількість моль МЕЖК/З) « (загальна кількість грам МЕЖК - (15 х загальна кількість моль МЕЖК)))/грам насіння, де 41 і 15 -- молекулярна маса залишку гліцеролу і метильної групи, відповідно.
Аналіз вмісту стеролів у зразках олії
Зразки приблизно по 10 мг олії, разом з доданою аліквотою С24:0 монолу як внутрішнього стандарту, омилюють за допомогою 4 мл 5 95 розчину КОН у 80 95 Меон і нагрівання до 80 "С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі, у вкритій Тефлоном скляній пробірці з нагвинчувальною кришкою. Після охолодження реакційної суміші додають 2 мл води МіїЇ-О), їі стероли екстрагують 2 мл суміші гексан/дихлорметан (4:21, об./06.) при струшуванні і вихровому перемішуванні. Суміш центрифугують, екстракт стеролів витягають і промивають 2 мл води
МІ -О. Далі екстракт стеролів відокремлюють після струшування і центрифугування. Екстракт упарюють в потоку газоподібного азоту, і стероли силілюють з використанням 200 мл М, О- бис(триметилсиліл)трифторацетаміду (БСТФА) при нагріванні до 80 "С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі.
Для аналізу стеролів методом ГХ/ГХ-МС, похідні стерол-О-триметилсилілу (стерол-ЮОТМ5І) сушать в потоку газоподібного азоту на термоблоці при 40 "С, і далі повторно розчиняють у хлороформі або гексані безпосередньо перед аналізом методом ГХ/"Х-МС. Похідні стерол-
ОТМ5 аналізують газовою хроматографією (ГХ) за допомогою газового хроматографа Адіїепі
ТесппоЇодіеє 6890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою з бо кварцевого скла ЗиреїЇсо Едийу "м-1 (15 м х 0,1 мм внутрішній діаметр, товщина плівки 0,1 мкм),
ПІД та інжектором з розщепленням/без розщеплення, а також серійним аутосемплером Адіїепі
ТесппоІодіеє 7683В та інжектором. Як газ-носій використовують гелій. Інжекцію зразків здійснюють в режимі без розщеплення при температурі печі 120 "С. Після інжекції температуру печі підвищують до 270 "С із швидкістю 10 "С/хвилину, і в кінці до 300 "С із швидкістю 5 "С/хвилину. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адіепі
Тесппоїодіеєз Спетеїайцоп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містять помилку ж 5 95, від значень площі піку окремих компонентів.
Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МС) здійснюють за допомогою приладів для ГХ-
МС Ріппідап Тпегптодциебхі СО і Ріппідап Тепто ЕІвсігоп Согрогайоп С24ОС-М5, притому, що обидві системи обладнані інжектором для введення проб безпосередньо на колонку, і програмного забезпечення ТПпептодиеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Кожний з приладів для ГХ обладнаний капілярною колонкою, полярність якої подібна до розкритої вище. Індивідуальні компоненти ідентифікують, використовуючи дані мас-спектрометрії і порівнюючи дані часу утримування з одержаними для автентичних і лабораторних стандартів. Повну методику холостого аналізу виконують паралельно із серією зразків.
Умови ЗТ-ПЛР
Ампліфікацію методом ПЛР із зворотною транскриптазою (З3Т-ПЛР) звичайно здійснюють з використанням системи ЗТ-ПЛР Зирегзспрі ПШ Опе-5(ер (Іпмйгодеп) в об'ємі 25 мкл, з використанням 10 пмоль прямого праймера і 30 пмоль зворотного праймера, Мд5О5 до кінцевої концентрації 2,5 мМ, 400 нг загальної РНК з буфером і нуклеотидними компонентами згідно інструкцій виробника. Типові температурні режими були наступними: 1 цикл при температурі 45 "С протягом 30 хвилин для виникнення зворотної транскрипції; потім 1 цикл при температурі 94 7С протягом 2 хвилин, і далі 40 циклів з температурою 94 "С протягом 30 секунд, 527 протягом 30 секунд, 70 "С протягом 1 хвилини; потім 1 цикл при температурі 72 "С протягом 2 хвилин перед охолодженням реакційних сумішей до 5 "С.
Одержання соматичних ембріонів В. парих5 за допомогою індукції за допомогою 355-І ЕС2
Насіння В. паризх (сорт Озсаг) стерилізують газоподібним хлором, як описано (Ана Кегезв7і еї а, 2007). Стерилізоване насіння пророщують на середовищах М5 (Мигазпіде апа 5Коо9, 1962) з 1/2 активності, що містять 0,8 95 агару, з корекцією рН до 5,8, і вирощують при 24 "С при
Зо освітленні флуоресцентним світлом (50 мкЕ/мгс) з фотоперіодом 18/6 годин (освітлення/темрява) протягом 6-7 днів. Сім'ядольні черешки з довжиною ніжки 2-4 мм виділяють в асептичних умовах з одержаних пагонів і використовують як експланти. Культури трансформованого А. ішптеїасіеп5, штам АСі1, одна з яких несе специфічний для насіння бінарний вектор і друга -- конструкцію 355-І ЕС2, інокулюють з одиничних колоній із свіжих планшетів та вирощують в 10 мл середовища Лурія-Бертані з відповідними антибіотиками протягом ночі при 28" С і збовтуванні із швидкістю 150 об/хв. Бактеріальні клітини збирають центрифугуванням із швидкістю 4000 об/хв протягом 5 хвилин, промивають середовищами М5, що містять 295 сахарози, ресуспендують в 10 мл такого ж середовища і вирощують з антибіотиками для селекції у відповідних умовах протягом 4 годин після додавання ацетосирингону до концентрації 100 мкМ. За 2 години до додавання рослинних тканин, додають спермідин до кінцевої концентрації 1,5 мМ, і кінцеву щільність бактерій доводять до ОО 600 нм - 0,4 за допомогою свіжого середовища. Дві культури бактерій, одна з яких несе специфічну для насіння конструкцію, а інша несе 355-АЇІ ЕС2, змішують у співвідношеннях від 1:1 до 1:1,5.
Свіжовиділені сім'ядольні черешки В. париз інфікують 20 мл культур А. їштеїасіеєп5 протягом б хвилин. Сім'ядольні черешки промокають стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку А. іштегасіеп5, і далі переносять в середовища для співкультивування (середовища М5, що містять 1 мг/л тідіазурону (ТДЗ), 0,1 мг/л а-нафталіноцтової кислоти (НОК), 100 мкМ ацетосирингону з додаванням І -цистеїну (50 мг/л), аскорбінової кислоти (15 мг/л) і морфоліноетанолсульфонової кислоти (МЕС, 250 мг/л) Планшети герметизують мікропористою стрічкою та інкубують в темряві при 24 "С протягом 48 годин. Співкультивовані експланти переносять у передселекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК,
З мг/л АЯМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивують протягом 4-5 днів при температурі 247 С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. В подальшому експланти переносять на селекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, 3 мг/л АЯМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину), що відповідають гену селекційного маркера на специфічному для насіння векторі, і культивують протягом 2-3 тижнів при 24 "С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. Експланти із зеленим ембріогенним калюсом переносять в середовища М5, що не містять гормонів (М5, що містять З мг/л АОМО»з, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і селекційний агент), і культивують ще протягом 2-3 тижнів. Торпедоподібні ембріони або ембріони сім'ядольної стадії, виділені з експлантів, що вижили на селекційному середовищі, аналізують щодо складу жирних кислот в загальному ліпіді методом ГХ.
Приклад 2. Стабільна експресія трансгенних біохімічних шляхів ДГК в насінні Агабідорвів
ІТШаїїапа
Конструкція бінарного вектора
Бінарні вектори руРЗ416-5А7 і руРЗ404, кожен з яких містить 7 гетерологічних генів біосинтезу жирних кислот, кодуючих 5 десатураз і 2 елонгази, та селекційний маркер для рослин між повторами лівої і правої меж Т-ДНК, присутніми в кожному векторі (Фіг. 2 і 3). У БЕО
ІО МО: 1 розкрита нуклеотидна послідовність ділянки Т-ДНК руР3416-сА?7 від правої до лівої граничних послідовностей. Обидві генетичні конструкції містять рослинні кодон-оптимізовані гени, що кодують А12-десатуразу І аспапсеа Кіпсумегі (містить нуклеотиди 14143-16648 із БЕО ІЮ
МО: 1), ю3-десатуразу Ріспіа равіогі5 (містить нуклеотиди 7654-10156 із БЕ ІЮ МО: 1), Дб- десатуразу Місготопах ризійа (містить нуклеотиди 226-2309 із 5ЕБО ІЮО МО: 1), Д5Б- і дА- десатурази Раміома заїїпа (містять нуклеотиди 4524-6485 і 10157-14142 із 5ЕО ІЮО МО: 1, відповідно) і Дб- і Д5-елонгази Ругатітопа5 согдаїа (містить нуклеотиди 2310-4523 і 17825- 19967 із 5ЕО ІЮ МО: 1, відповідно). Конкретні ділянки Т-ДНК (орієнтація: від правої до лівої граничної послідовності) бінарного вектора руР3416-СА7 щодо 5ЕО ІО МО: 1 є наступними: нуклеотиди 1-163: права межа; 480-226, термінатор нопалінсинтази Адгобасіегійт їмтеїасієпе (ТЕН МОБ); 1883-489, Аб-десатураза Місготопа5 ри5Ша; 2309-1952, вкорочений промотор напіну Вгаззіса пари5 (РВО ЕР); 2310-3243, промотор ЕАЕ1 Агабідорвів ІНаїїапа (РРО ЕБЕАЕЇТ1); 3312-4181, Аб-елонгаза Ругатітопа5 согдаїа; 4190-4523, термінатор лектину
СПіІусіпе тах (ТЕВ І есійп); 4524-4881, РО ЕРІ; 4950-6230: А5-десатураза Раміома заїїпа; 6231-6485: ТЕН МО5; 7653-6486, ділянка прикріплення до матриксу КБ7 Місойапа їабасит (ДПМ); 8387-7654, термінатор конлініну 1 Ііпит ивіайввітит (ТЕЙ Спі!); 9638-8388, Ф3- десатураза Ріспіа равюгів; 10156-9707, промотор конлініну 1 Гіпит изкнаїйбззітит (РКО Спіл1); 10157-12189, промотор конлініну 1 Гіпит иб5іїайввітит; 12258-13604, Д4-десатураза Раміома запа; 13605-14142, термінатор конлініну 2 Гіпит изйаїййббітит; 14143-14592, РВО Спі!; 14661-15914, Д12-десатураза І аспапсеа Кісумегі; 15915-16648, ТЕН Спії!; 17816-16649, ДПМ; 17825-18758, РВО ЕАЕТ; 18827-19633, А5-елонгаза Ругатітопаб5 согдаїа; 19634-19967,
Зо ТЕА Гесійп; 19990-20527, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 з подвоєною ділянкою енхансера; 20537-21088, гени фосфінотрицин-М-ацетилтрансферази Зігеріотусез мігідоспгото; 21097-21349, ТЕН МОБ; 21367-21527, ліва межа.
Кожна із 7 кодуючих ділянок в конструкціях знаходиться під контролем специфічного для насіння промотору, причому використовуються три різних промотори, а саме вкорочений промотор напіну Вгаззіса париз (рВпЕР'І), промотор Агарідорзіз (Таїіапа ЕРАЕ1 (рАїКАЕЇ) і промотор конлініну 1 Гіпит и5наїйввітит (рі иСпі!). Сім генів біосинтезу жирних кислот спільно кодують повний біохімічний шлях синтезу ДГК, сконструйований з метою перетворення 18:149 (олеїнова кислота) на 22:64 710и1316и9 (ДГК). Обидва бінарні вектори містять селекційний маркер для рослин ВАК, кодуючий ділянку, функціонально пов'язану з промотором вірусу мозаїки цвітної капусти 355 (Саму), що містить подвоєну ділянку енхансера, а також з термінатором транскрипції-ділянкою поліаденілювання по53" А. їшптеїасіеп5. Селекційний маркер для рослин розташований суміжно з лівою межею Т-ДНК, тобто, дистально на Т-ДНК відносно орієнтації перенесення Т-ДНК в клітини рослини. Це підвищує вірогідність того, що часткове перенесення
Т-ДНК, яке, ймовірно, не включає ген селекційного маркера, не пройде селекцію. Кожний з руРЗа416-сА?7 і руРЗ3404 містить джерело реплікації КіА4 з Адгобасівегішт гпі2годепез5 (Натійоп, 1997). руРЗ416-сА7 генерують шляхом синтезу ділянки ДНК, що відповідає нуклеотидам 226- 19975 5ЕО ІО МО: 1 (ділянка СА?) і вставки даної ділянки в бінарний вектор-реципієнт руР3416 на сайті РерОМІ. Кожен ген біосинтезу жирних кислот на СА7 містить послідовність 5' нетрансльованої ділянки (5'ЮТК) вірусу мозаїки тютюну, функціонально пов'язану з кожною кодуючою ділянкою, між промотором і кодоном ініціації трансляції АТО, з метою максимізації ефективності трансляції мРНК, одержаних з генів. Конструкція ЗА також містить дві послідовності ділянки прикріплення до матриксу Кр7 (ДПМ) Місоїапа їарбасит, як описано Наї! єї аІ. (1991). Послідовності ДПМ, які іноді називають ядерними ділянками прикріплення, відомі як такі, що специфічно зв'язуються з ядерним матриксом іп мійго і можуть опосередкувати зв'язування хроматину з ядерним матриксом іп мімо. Вважається, що ДПМ зменшують сайленсинг трансгена. У руР3416-ЗА7 ДПМ також вставлені і розташовані в межах ділянки Т-
ДНК для того, щоб вони виконували функцію розпірок ДНК, з метою ізоляції трансгенних касет експресії. Вектор руР3416 перед вставкою ділянки (зЗА7 містить тільки касету селекційного 60 маркера для рослин між межами.
Генетичну конструкцію руРЗ3404 одержують послідовною вставкою, що базується на рестрикційних ферментах, в ході якої касети генів додають до бінарного вектора, руР3367, який містить гени для продукування СДК у насінні. Дана конструкція містить гени, що кодують А12- десатуразу Г. Кісумегі і о3-десатуразу Р. равзіогіх, причому обидва експресуються вкороченим промотором напіну В. париз (ЕР), і ДАб-десатуразу М. ризіПа, експресовану промотором ЕАЕТ А.
Іпаїіапа (Фіг. 4). Спочатку, інтрон ЕАб2 А. ІПайапа фланкують сайтами ЕсокІі і клонують в сайт
Ме! руР3367 з одержанням руР3395. Фрагмент, що містить касети Дб- і Д5-елонгази Р. согдаїа під контролем промоторів ЕАЕТ1 і ЕРІТ, відповідно, клонують в сайт Казі роуР3395 з одержанням ругР3398. Далі одержують р)РЗ3399 шляхом заміни джерела реплікації КК2 в руР3398 джерелом реплікації КіА4. Кінцевий бінарний вектор рОР3404 одержують шляхом клонування ЗБІ- фланкованого фрагмента, що містить касети Д5- і Д4-десатурази Р. заїїпа під контролем промоторів ЕР і РАЕТ, відповідно, у сайт БОБИ рурР3399.
Трансформація А. ІНаїїапа і аналіз складу жирних кислот
Химерні вектори вводять в А. іштеїасіеп5, штам АСІ 1, і клітини з культур трансформованої
Адгобрасієгішт використовують для обробки. рослин А. ІПаїїапа (екотипи СоЇштрбіа і мутант Тайг), застосовуючи для трансформації спосіб занурення квіток (Сіоцдпй апа Вепі, 1998). Після дозрівання врожай зерен Ті з оброблених рослин збирають і наносять на планшети М5, що містять фосфінотрицин (ФФТ), з метою селекції рослин, що містять ген селекційного маркера
ВАК. Саджанці Ті, що вижили і є здоровими, переносять в грунт. Після вирощування рослин до стану зрілості і надання їм можливості для самозапліднення, збирають урожай зерен То з одержаних рослин, і склад жирних кислот у ліпіді їх насіння аналізують за методом ГХ, як розкрито у Прикладі 1.
Дані щодо рівня ДГК в ліпідах насіння проілюстровані на Фіг. 5 (вузькі доріжки з відміткою Т2) для 13 трансформантів з руР3416-5А7, введеним в генетичний фон СоїЇштрбріа, і для 6 трансформантів з використанням мутанта їад2. Конструкція руР3416-5ЗА7 приводить до продукування дещо вищих рівнів ДГК, виражених як відсоток від загального вмісту жирних кислот, в середньому щодо конструкції руР3404. У Табл. 4 наведений склад жирних кислот в загальному ліпіді насіння ліній Т2 з найвищими рівнями ДГК. Обчислена ефективність перетворення для кожної стадії ферментації в продукуванні ДГК з олеїнової кислоти в тому ж
Зо насінні наведена в Табл. 5. Ефективність перетворення обчислена як (95 продуктів х 100)/(90 субстрату, що залишився - 95 продуктів), і таким чином виражена у відсотках.
Найвищий спостережуваний рівень продукування ДГК в трансформованих руР3416-сА7 лініях Тг становить 6,2 95, додатково з 0,5 95 ЕПК і 0,2 95 ДПК (лінія 214). Вказане насіння Те все ще було сегрегованим по трансгену, тобто ще не було однорідно гомозиготним. Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння (Табл. 4) наведені в Табл. 6. Рівень 03 жирних кислот, продукованих в результаті наявності трансгенів в цьому насінні (нові загальні 003 жирні кислоти, за винятком рівня АЛК, яка виробляється ендогенно в екотипі СоЇштрбіа), становить 10,7 95, тоді як рівень 06 жирних кислот (нові загальні 0б жирні кислоти, за винятком 18:224912) становить 1,595. Це представляє надзвичайно сприятливе співвідношення нових 03 жирних кислот: нових 06 жирних кислот, а саме 7,3:1.
Насіння Т» відібраних ліній, трансформованих руР3416-ОАТ, а саме ліній, позначених 7, 10, 14, 22 і 34 в екотипі СоЇштріа, і ліній, позначених 18, 21 і 25 в мутанті екотипі Тад2, наносять на планшети із середовищами М5, що містять ФФТ, для селекції трансгенних саджанців іп міго. По 20 ФФТ-резистентних саджанців з кожної лінії переносять в грунт і вирощують до стану зрілості після самозапліднення. Було високою мірою вірогідним, що ці рослини будуть гомозиготними по гену селекційного маркера, і таким чином, містити щонайменше по одній вставці Т-ДНК в геномі рослин. Урожай зерен Тз з цих рослин збирають і аналізують склад жирних кислот в олії з насіння за методом ГХ. Дані наведені в Табл. 7. Даний аналіз виявив, що конструкції рОР3416-
СА7 генерують вищі рівні 03 ДЛ-ПНЖК ДГК в насінні Тз гомозиготних рослин, ніж в сегрегованому насінні Т2. До приблизно 13,995 ДГК спостерігається в трансформованій руРЗ416-сА7 лінії Тз, позначеній 22.2 в екотипі СоІштбіа, що означає збільшення з рівня приблизно 5,5 95 в гемізиготному насінні Т2, причому сумарний рівень нових 03 жирних кислот становить приблизно 24,3 95 від вмісту загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Рівень нових 06 жирних кислот становить 1,1 95 від загальних жирних кислот, представляючи високою мірою сприятливе співвідношення нових 003 жирних кислот: нових 0б жирних кислот, а саме, приблизно 22:1. Так само, трансформанти в екотипі Тад2 дають сумарну кількість нових 03 жирних кислот 20,6 95, включаючи 11,5 95 ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння. бо
Таблиця 4
Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння незалежного трансгенного насіння Т2
Агабрідорзі5 з рівнями ДГК на верхній межі спостережуваного інтервалу. "Со!" позначає екотип
СоІштрбіа, і "РАб2" позначає мутантний екотип Тад2. "ЗА?" позначає трансформацію за допомогою Т-ДНК з вектора рОР3416-СА7, руРЗ3404 -- за допомогою Т-ДНК з вектора руР3404.
Жирні кислоти 20:1п-9 і 20:11-11 не розділяли в ході аналізу ГХ. "Інші незначні" жирні кислоти включають 14:0, 16:1п7, 16:1п9, 16:1п13ї, 16:2п6, 16:3п3, і18:0, 18:1п5, 20:1п5, 22:0, 22117, 22:1п11/п113, 24:0, 247119. - . Ж,
У шео З що т З е й «з Ж г ш 9, Еш ІІ а: ж ес с ос ос ос ос Вс НН
Ж 5 ме, че, я, ме, че, ме, Як, шо їх, т т ак ши нини ни ши ши кеш шаг шк рек - - - - - - - - - щ. ш м - м С і їнк м - о
Таблиця 5
Ефективність перетворення для окремих ферментних стадій в процесі одержання ДГК з олеїнової кислоти, що спостерігалася в загальних ліпідах насіння незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 4. т і їй Ка їх; В - - 4 - х. т В, ж - к- та їз - т - і І і ї-і Як М я, з, ЗЕ, Я, Зк, т с Мк з | | З є: 5 | 5 |х їх х
Е - о, о, но Я, , м, шк, їн. к - Ф К- --о р- де то я -- те де
Е Е - - - - - - є - - деє
Чі- ЗВ Ета 37,55 | і | Би би 7175 | тт | 77 7077 Обде ЖЕ ло ;
Ж еле 7
В ПИ ПОН ПОЛОН ПОЛОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОН КОН КОНЯ
-, з |ЗЛоЇ
Таблиця 6
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 2. Обчислення не включають "незначні жирні кислоти" в Табл. 4.
Ф
- я т - ж о й - 2 т З 5 ЕзУ 5
ТЕ - К- - 23 т 24 -т і і І т о як. Ж, я. шк, я. к, с ро у 2 3: 5 5 5 15515 хх |5 х щ- -к ж, М, ж, -й ж, -, не, не, й
ОБ |У |З 55 | | 5
ЯТараметі я я Но п І Но Щи п р щ
Загальніста 21,8 15.5 | 34,9 | 356 зе | зві ВО 00 45,х зах | 3313858 ї?» від загальних
ЖЕ
Загальні зб 325 | 510 17.5 77 15,4 1552 154 ни 7.6 15.6 м: ї?ео від загальних
ЖЕ
Я піввілношеня паб | і Бе | 1 Бах | 2,0 37 ща К.55 тай я Іри
Співвілнеаштеня Бі 1. ПДВ що бо ол о | ол | 0251 0051) 613 залі
Загальні нові ха х2 35 ха 5 Хе В? 15,5 107 кН 5.Х Х.
ЖК
Загальні нові жо 3 7 1.5 1,6 1.5 7 15 і ха пд іЗе віл ззгальних
ЖКІі
Співвідношеня 1.5 1,44 | 3,53 | 35.75 15 | 847 | 6515 7.13 161825 | 565 мен невних ал
Ефективність 4555 | 5595 | 45 | Я 0 ат | Ба | ТАК | ба | в | б тов перетворення СК на ЕНК
Ефективність Зх | 5аб5 0 тт | 38555 | Я їбе | Я Жба | В Ббв | 705 0 5.0275 | Буль 00 5 перетворення ОК на дДІК
Ефективність Б. | хх | Боб | Бязь | 7,25 | 155 | 11455 1275 135 | 8395 | 10,77 перетнопення ЛЕ на ЛІК
Ефективність б.вта Я5б | та | 555 | ш.3бе | 7,25 | 5 |та | 11455 | Боб | со неретворення ЯК на ДІК
Ефективність іт | 4955 | 0 ба | НІ | йо | 1.55 | 5 дб 155 | 17,35 | 1415 | 1 Я перетворення
АлЛК на ЕНК
Гфектнвність ібязе | го | Боба | 879 1055 Оле | Зав Я дов ЯКУ | 125 | СЕК перетворення
АК на ЛЕК
Загальні 1341 ех ше ие 144 | 155 | 154 іх 120 | 1465 | 1260 насичені жнині кнелоти
Загальні 3 Іза | 515 І З І ЗР І 516 | 257 | 266 ЯК | с | 8 жирні кнолотн
Звгальні 53.7 | Я95 | 52.5 5У35 | 52,5 | 54.5 | 553 | 56 | 376 545 | 540 ноліненаесичені жирні кнолоти
Загальністї | 6Я 1 5 | 46 | 47 51 0 55 | 52 | 58 | ва 1 БЯ 1
Сніввідношення | 2.75 | Я | 825 Яд | 5 І 54061 257 | 225 | 5,57 3,05 | 5.05 загальній 2023
Таблиця 7
Склад жирних кислот загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння нащадків
Тз і Та Агарідорзі5, одержаних з ліній рослин, наведених в Табл. 3. Помилка, вказана в поколінні
Та, позначає стандартне відхилення (3) для п--10. е
Ж
ЕВ щ- не -3 Які 5 тв, Фт м - К ше
З - МН - а «3 ме шо Ф не ех Ж Не х ті - - о Ж я з М ни и МОВ НЕННЯ НН М шо ер о е - - - - - ; ж т 2 ке и т 2 - вій - -з Ек 7
М, -, що. ши ше. Ше Шк й, - вик - ж -е ї- « т -е- ті п в ЖЕ МЕ - - - - - - « - в ж 7 Кк ж ж хв хв "ж ОО 5 х ве ще щ ц ве г га сво вом - 60011111155159|55 п2|в1,) | 77 |тю5105| пз
Інші незначні 1.8 1,5 1.5 з зе 7 ре 1,6 реа 2,3 зе 01191515. 5151515 1 за 00175 151,515151515151 пе 15151515 5195151 1
Ефективність ферментного перетворення для кожної ферментної стадії в біохімічному шляху одержання ДГК з олеїнової кислоти наведена в Табл. 8 для насіння Тз з вищими рівнями
ДГК. Ефективність перетворення під дією А12-десатурази в насінні лінії 22.2 становила 81,6 95, і ефективність 03-десатурази становила 89,1 95, причому обидва значення є досить високими і вказують на те, що дані грибкові (дріжджові) ферменти можуть добре функціонувати в насінні, що розвивається. Активність інших екзогенних ферментів в дорозі ДГК була подібним чином високою по відношенню до субстратів 03, причому ефективність Дб-десатурази становить 42,2 95, ДАб-елонгази -- 76,8 96, ДБ5-десатурази -- 95,0 95, Д5-елонгази -- 88,7 905 і Д4-десатурази - 93,3 95. Активність Дб-десатурази по відношенню до субстрату 0б ЛК є набагато нижчою, і ефективність перетворення ЛК під дією Дб-десатурази становить тільки 0,7 95. ГЛК присутній на рівні всього 0,4 95 і являє собою єдиний новий продукт 06, за винятком 20:206, знайденої в насінні Тз з найвищим вмістом ДГК. Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння (Табл. 7) наведені в Табл. 9. Такі дані для лінії з найвищим рівнем ДГК включають співвідношення загального вмісту 06 ФК (зокрема, ЛК) до загального вмісту 03 ФК (зокрема, АЛК), що дорівнює 0,10. Співвідношення нових 0б ФК (за винятком ЛК) і нових 03 ФК (за винятком АЛК) в ліпіді даної лінії становило 0,05. Рівні загальних поліненасичених жирних кислот становлять більше 50 95 в даних лініях, і перевищують 60 95 щонайменше в 4 лініях. Загальна ефективність перетворення обчислена як: ОК на ЕПК - 21,8 95, ОК на ДГК - 18,0 90, ЛК на ЕПК - 26,9 95, ЛК на ДГК - 22,2 96, АЛК на ЕПК - 30,1 95, АЛК на ДГК - 24,9 9о.
Таблиця 8. - ін | 1 З де е ре "ет й а в | й Е ві ре хЕ т - т -е е а жов -х -і т--! -і -кі т--! к- - - «щи ті Ж я Же ве ве я - - т з в хх ся ж вБНІ ш | | 15 15555 УББ ій : У й ще і ій їй - Щ ЙО - В мак 5 їн ч й рн г Мн -кЕ - ЩЕ яяє |зиае|ти|те він олим|зеє|тан|вми:|; о ве; |В. о Яібодее ях асо| вач | квот 8еіз5| 70,25. 87, 82235|87695 0 ВІ | еп с о етос и от озт ово пт от ою Рея е
Ж (ах | 1 ГОСТ м С: СИ ПОН ПОЛОН ПОЛОН ПОЛОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОН КО КОНЯ
З рр р р р р Я Р ЯА-- « «5 р о пил ПИ ПНЯ ПОЛЯ ПОЛОН ОЛЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НО КОХАННЯ - і:
Таблиця 9
Компільовані дані з профілів загальних ліпідів насіння для незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 5. Обчислення не включають "незначні жирні кислоти", як в Табл. 7. аа 19 | | | |д|х 8| Є ши мк шк о МОМ ш ш
К- К К- ЕЕ: ке - х- - бра і а і - 5 не ще че, Я - - шо
Паваметв й м о ше ше о ще Но --е А ве Ж
Загальні ж (б5 від загальних ЖК (з від загальних ЖЕК) певшнанияю І іб5 від загальних ЖК
Уа
Співвіднатення нових Ко и МОЖ я ЕХ Би НКУ Я НЯ а ни НИЗ В НК ВИ ШЕ ЕК ДЕ зн ОО
ОК на ЕК
ОК нак -ІЇК на ЕТК
АК на ДІК
АЛЕ на ПК
АЛЕ на Дік кнІлотн жЖжнині кнелати жирні кислоти
Насіння Тз лінії руР3416-СА?7 22.2 в екотипі Соїштбіа, що є нащадками лінії Те» 22, висівають безпосередньо в грунт, і склад жирних кислот в зрілому насінні одержаних в результаті рослин
Тз аналізують за методом ГХ. Середній рівень ДГК в цьому насінні становить 13,3 90 ж 1,6 (п-10) як відсоток від загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Як проілюстровано в Табл. 6 (права колонка), лінія з найвищим рівнем ДГК містить 15,1 95 ДГК від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння. Ферментна ефективність перетворення наведена в Табл. 8 для кожної стадії одержання ДГК з олеїнової кислоти.
Співвідношення загального вмісту б ФК (зокрема, ЛК) до загального вмісту 03 ФК (зокрема, АЛК) в лінії з найвищим рівнем ДГК становило 0,102. Співвідношення нових 06 ФК (за винятком ЛК) і нових 03 ФК (за винятком АЛК) в лінії з найвищим рівнем ДГК становило 0,053.
Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 17,8 95, і рівень загальних мононенасичених жирних кислот становив близько 18,1 95. Рівень загальних Фб-жирних кислот становив близько 5,7 95, і рівень 0З-жирних кислот становив близько 55,9 95. Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 24,5 95, ОК на ДГК - 20,1 95, ЛК на
ЕПК - 29,9 95, ЛК на ДГК - 24,5 95, АЛК на ЕПК - 32,9 95, АЛК на ДГК - 27,0 95. Знайдено, що загальні омега-3 жирні кислоти акумулюються на рівні 55,9 95 від загальних жирних кислот, тоді як омега-6 жирні кислоти складають 5,7 905 від загального профілю.
Здійснюють аналіз гібридизації методом саузерн-блоту. Результати показують, що лінії з високим рівнем акумуляція ДГК містять одинарну або подвійну копію Т-ДНК з конструкції руРЗ416-сА?7, за винятком трансгенної лінії Соїштбріа 22, що містить три вставки Т-ДНК в геномі рослини Агабрідор5хі5. Насіння покоління Т5 також проаналізоване, і знайдено вміст до 13,6 95 ДГК в загальних ліпідах насіння. Конструкція ЗА7 продемонструвала стабільність протягом декількох поколінь з точки зору здатності до утворення ДГК.
Визначення вмісту олії в трансгенних лініях А. Іпаійапа ДГК
Вміст олії в трансгенному насінні А. Ійаїїапа з різними рівнями ДГК визначають за методом
ГХ, як розкрито в Прикладі 1. Дані проілюстровані на Фіг. 6, на якій наведений графік вмісту олії (95 олії від маси насіння) проти вмісту ДГК (як відсотка від загальних жирних кислот). Знайдено до 26,5 мг ДГК на грам насіння (Табл. 10). Знайдено, що вміст олії в трансгенному насінні
Агарідорзі5 негативно корелює з вмістом ДГК. Кількість ДГК на масу насіння була великою в трансформованому насінні, з рівнем ДГК приблизно 995 відносно насіння із вмістом ДГК приблизно 14 95. Чи буде це справедливо для іншого насіння, окрім Агабідорві5, встановлено не було.
Таблиця 10
Частка і кількість ДГК в насінні трансформованого СА? Агарідорзвів. ати ряконноко, веди | шани грам насіння мг/г насіння аА?7/сої 22.2-1 142 14,89 20,2 аА?7/сої 22.2-2 14,3 15,02 20,5 аА?7/сої 22.2-3 14,0 15,92 21,2 сА?Т/сої 10.15-1 8,7 30,23 25,06 сА?Т/сої 10.15-2 8,6 31,25 25,77 сіА?7/сої! 10.15-3 8,68 31,70 26,49
Приклад 3. Стабільна експресія трансгенного шляху ДГК в насінні Сатеїїпа займа
Бінарний вектор руР3416-сА7, розкритий вище, вводять в штам А. іштеїасієп5 АСІ1, і
Зо клітини з культури трансформованої Адгобасіепйцт використовують для обробки квітучої рослини б. заїїма, із застосуванням способу занурення квіток для трансформації (І и апа Капод, 2008). Після вирощування і дозрівання рослин, урожай насіння Ті. з оброблених рослин збирають, висівають в грунт, і одержані в результаті рослини обробляють шляхом обприскування гербіцидом ВАЗТА для селекції трансгенних рослин, що експресують ген селекційного маркера баг на Т-ДНК руР3416-сА?Т7. Рослини Ті, що вижили і є толерантними до гербіциду, вирощують до стану зрілості після того, як їм дають можливість самозапліднення, і збирають урожай насіння То, що утворилося. П'ять трансгенних рослин були одержані, тільки три з них містили повну Т-ДНК.
Ліпід екстрагують з пулу приблизно 20 насінин кожної з трьох рослин, що містили повну Т-
ДНК. Два з об'єднаних в пул зразків містили дуже низькі, ледве знайдені рівні ДГК, але третій пул зразків містив приблизно 4,7 95 ДГК (Табл. 12). Таким чином, ліпід був витягнутий із 10 індивідуальних насінин Т2 даної рослини, і склад жирних кислот проаналізований методом ГХ.
Дані щодо складу жирних кислот індивідуального насіння для даної трансформованої лінії також наведені в Табл. 11. Компільовані дані з профілів (Табл. 11) загального ліпіду насіння наведені в Табл. 12.
Таблиця 11
Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння з трансгенного насіння Тг Сатвеіїпа заїїма, трансформованих Т-ДНК з рОР3416-СА7. Склад жирних кислот наведений для об'єднаної в пул серії (ЕО5.46) насіння і для 10 окремих насінин, ранжируваних (зліва направо) від найвищого до найнижчого рівня ДГК.
Пул
Жирна кислота ЕОБ 46 2 А 8 Я 9 т ЯЗ я5 6 то 140 | 0 1 021|02|о011|021|02|02 1 02|01 02/02 167 | 02 | 00|о01|о011|о001|021|00 102102 02 | ог 163 | 03 | о |00|00/|о00|00|00 00 |о00 00 | о 187 | 108 8080 | 86 | 85 94 | 110 т102| 83 94 | 86 18:11 18:303 18:306 | 02 14 |03|031|04|02|05 00|05 04/06 18403 | 22 | 68|64 | 57 | 72 | 57 | 41 00 | 00 00 /|0о00 201а11 2блію, | 04 03030303 |031|00 05106 05 | 05 20206 | 08 | 08/09 08|06)|08|07 | 13 | 15 | 14 | 1.4 20303 | 06 | 0808 08|071|08|07|06|07 | 0 | 0,6 220 | 04 1 051051051|04|051|05 0606 06/06 20403 | 02 | 03 | 03 03 | 04 | 04 | 05100 | 00 | 00 | 0.0 221 | 1 11 | 12 | 1 | 05 | 09 | 08 | 16 | 22 | 1,9 | 20 205503 | 07 | 3 | 16 15 | 16 | 171 | 17 | 00 | 00 | оо | ом 22206 | 01 | 00|00 00 |00/|о00|о00 02 | оз | бе | 0.2 22:406-22:303| 03 | 02 | 03 | 03 00 | 03 00 | 041 06|05 05 240 | 03 03103103 00|031|00 04 |04 04 /|о4 241 | 03 04104 |031|00|03|00 05106 05 | 05 225503 | 03 | 171 | 12 | 171 | 1109608 100 | 00 | ою | 0.0 22603 | 47 | 90 | 85 | 83 | 83 | 71 | 49 | 00 | 00 | ою | 00
Таблиця 12
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 11. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 11.
Пул
Параметр ЕОБ 46 2 тА 8 Я 9 т ЯЗ я5 6 то
Загальні м/3 (90 від загальних 36,1 46 45,4 45 482 | 442 | 401 128,91 29,91 30,2 | 28,9
Ж
Загальні мб (90 від загальних 25,8 20,4 | 20,7 | 20,3 | 195 | 211 25 33,7 | 32,6 | 31,8 | 33,6
ЖК)
Співвідношен- | 40 | 225 | 219 | 222 | 247 | 209 | 1,60 086 | 092 0,95. 0,86 ня мЗЛУб
Співвідношен- | 474 | 044 | 046 | 045 | 040 | ов | 062 17 | 109 | 1,05 147 ня бл
Загальні нові мЗ (95 від 8,1 18,5 18 16,9 | 18,6 | 152 12 01 загальних ЖК)
Е0О5.46
Загальні нові мб (95 від 1,1 2,2 12 1,1 1 1 12 15) 23 2 2,2 загальних ЖК) понвннюме то в ес твав вною юю 1005 ня нових мЗЛУб пошле нео» м'|аи|ов зиіве! | 717 рве ня нових мб/мЗ
Ефективність перетворення 82 о 15,6 о 15,5 о 15,1 о 1571 о 12,8 о 10,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 01 Зо
ОК на ЕПК десни |в девлте чіп торт оч вожівюч пово перетворення 6,7 о 12,3 зв|11 6 6111 /5 о 11 4 о 10,0 о 7,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ОК на ДГК
Ефективність перетворення 92 о 172 о 17,1 о 16,7 о 16,2 о 13,9 о 11,4 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 02 Зо
ЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 7,6 о 13,6 о 12,9 о 12,7 о 12,3 о 10,9 Уо| 7,95 90 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ЛК на ДГК
Ефективність перетворення 15,8 о 24,8 о 24,9 о 242 о 22,8 о 20,6 о 18,5 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо 0,3 Зо
АЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 13,0 о 19,6 о 18,7 о 18,4 о 172 о 16,1 о 122 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо
АЛК на ДГК
Загальні насичені жирні | 17,6 17,8 | 17,8 | 17,6 18 17,8 | 18,1 | 18,2 | 17,7 | 17,8 | 1811 кислоти
Загальні мононенасиченії 19,8 15,5 16 16,6 | 14,3 | 16,6 | 16,68 | 18,7 | 19,3 | 19,6 | 18,6 жирні кислоти
Загальні поліненасичені | 62,5 66,4 | 65,6 | 67,7 | 65,6 | 65/11 63 16311 62,51 632 жирні кислоти
Загальніс2о | 96 / 93 | 98 / 99 | 81 | 89 | 85 86 11 |т103 | 10
Загальнісг2 | 54 / 1043| 10 / 97 | 94 | 83 | 57 06 09|07|07
Співвідношен- ня загальні 1,78 0,98 | 1,02 | 0,86 | 1,07 | 14,9 |14,33|12,22|14,71|1443 б2г0/С22
ДГК присутня в 6 з 10 індивідуальних насінин. Чотири інші насіння не містили ДГК, і, ймовірно, були нульовими сегрегантами, що не містять Т-ДНК, на базі гемізиготності вставки Т-
ДНК в материнській рослині. Екстрагований ліпід з єдиної насінини з найвищим рівнем ДГК містив 9,0 95 ДГК, тоді як сумарний відсоток для ЕПК, ДПК і ДГК становив 11,4 95. Сумарний відсоток для нових 03 жирних кислот, продукованих в цьому насінні в результаті перетворення (СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) становив 19,3 95, тоді як відповідний сумарний відсоток для нових 0б жирних кислот (ГЛК, ЕДК, ДГЛК, АРК ї будь-яких продуктів об елонгації) становив 2,2 9о; тільки ГЛК і ЕДК були знайдені як нові б жирні кислоти. Співвідношення загальних 0б
ЖК (включаючи ЛК) до 03 ЖК (включаючи АЛК) становило 0,44. Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) до нових 03 ЖК (за винятком АЛК) у насінині з найвищим рівнем ДГК становило 0,12. Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 17,8 9б, і рівень мононенасичених жирних кислот становив приблизно 15,5 95. Рівень загальних б жирних кислот становив приблизно 20,4 95, і рівень 03 жирних кислот становив приблизно 46 95.
Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 15,6 95, ОК на ДГК - 12,3 95, ЛК на ЕПК - 17,2 95, ЛК на ДГК - 13,6 Фо, АЛК на ЕПК - 24,8 95, АЛК на ДГК - 19,6 Ор.
Гомозиготне насіння цієї лінії одержують в поколінні Т4. До 10,3 95 ДГК продукується в події
ЕО5-46-18-110, із середньою величиною 7,3 95 ДГК, спостережуваною для всього покоління ТА.
Гомозиготне насіння висаджують в декілька теплиць, з метою одержання сумарно понад 600 індивідуальні рослини. Олію екстрагують з насіння із застосуванням різноманітних способів, зокрема, апарату Сокслета, екстракції ацетоном і гексаном.
Оскільки кількість одержаних незалежно трансформованих ліній С. займа, як розкрито вище, було низьким, виконуються подальші експерименти з трансформації С. займа за допомогою руРЗ3416-сСА7. Винахідники прогнозують, що в подальших трансформованих лініях будуть досягнуті рівні ДГК, що перевищують 10 95, як відсоток від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння, і в рослинах, гомозиготних по Т-ДНК -- до 20 95 ДГК. Одержані 20 подій С. заїїма
СА7 тон, і насіння проаналізоване щодо вмісту ДГК. Одержані З події СА7 тоаВ, і аналіз насіння Т1 від події СМО17.1 виявив вміст ДГК в пулі насіння 9,8 95. Найвищий вміст ДГК, знайдений в окремому насінні, становить 13,5 95.
Приклад 4. Стабільна експресія трансгенних шляхів ДГК в насінні Вгазвіса пари
Трансформація В. париз і аналіз складу жирних кислот з використанням єдиного вектора
Бінарний вектор руР3416-5А7 використовують для одержання трансформованих рослин
Вгаззіса париб5 і насіння з рослин. Вектор руРЗ416-ЗА7, розкритий вище, вводять в
Адгорасієгйт їштеїасієпо, штам АСІ1, за допомогою стандартних процедур електропорації.
Культури трансгенних клітин Адгорасіегішт вирощують протягом ночі при 28 "С в середовищі
Лурія-Бертані при збовтуванні із швидкістю 150 об/хв. Бактеріальні клітини збирають центрифугуванням із швидкістю 4000 об/хв протягом 5 хвилин, промивають середовищем
УМпапз АВ (УмМіпап5, 1988), ресуспендують в 10 мл середовища УмМіпап5 АВ (рн 5,2) і продовжують культивування протягом ночі в присутності канаміцину (50 мг/л), рифампіцину (25 мг/л) і 100 мкМ ацетосирингону. За 2 години до інфікування клітин Вгаззіса додають спермідин (120 мг/л), і кінцеву щільність бактерій доводять до ОО 600 нм 0,3-0,4 за допомогою свіжого середовища АВ. Свіжовиділені сім'ядольні черешки 8-денних саджанців Вгазвзіса пари», вирощених на середовищі М5 (Мигазпіде апа ЗКкоод, 1962) з 1/2 активності або сегменти підсім'ядольного коліна, попередньо кондиційовані протягом 3-4 днів на середовищах М5, що містять 1 мг/л тіадіазурону (ТДЗ) і 0,1 мг/л а-нафталіноцтової кислоти (НОК), інфікують 10 мл культури Адгорасіегішт протягом 5 хвилин. Експланти, інфіковані Адгорасіегічшт, в подальшому промокають стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку Аадгобасіегіт і
Зо переносять в середовища спів-культивування (середовища М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л
НОК ії 100 мкМ ацетосирингону), з додаванням або без додавання різних антиоксидантів (І - цистеїн, 50 мг/л і аскорбінова кислота 15 мг/л). Всі планшети герметизують парафіном та інкубують в темряві при температурі 23-24 "С протягом 48 годин.
Оброблені експланти далі промивають стерильною дистильованою водою, що містить 500 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину, протягом 10 хвилин, споліскують стерильною дистильованою водою протягом 10 хвилин, промокають стерильним фільтрувальним папером, переносять в передселекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, 20 мг/л аденіну сульфату (АДС), 1,5 мг/л АЗОМО»з, 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивують протягом 5 днів при температурі 24 "С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. Після цього їх переносять в селекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, 20 мг/л
АДС, 1,5 мг/л АЯМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) з додаванням 1,5 мг/л амонію глюфозинату як агента для селекції трансформованих клітин, і культивують протягом 4 тижнів при температурі 24 "С з фотоперіодом 16 годин/8 годин, кожні два тижні перевиваючи в такі ж середовища. Експланти із зеленим калюсом переносять в середовища ініціації пагонів (М5, що містять 1 мг/л кінетину, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л А9МО»з, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 1,5 мг/л амонію глюфозинату) і культивують ще протягом 2-3 тижнів. Пагони, що з'являються від резистентних експлантів, переносять в середовища для подовження пагонів (середовища
М5, що містять 0,1 мг/л гіберелової кислоти, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л АдМО»з, 250 мг/л цефотаксиму і 1,5 мг/л амонію глюфозинату) та культивують ще протягом двох тижнів. Здорові пагони довжиною 2-3 см відбирають і переносять в середовища для коренеутворення (1/2 М5, 1 мг/л
НОК, що містять, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л АдМО:з і 250 мг/л цефотаксиму) і культивують протягом 2-3 тижнів. Добре розвинені пагони з корінням переносять в горщики, що містять суміш для росту саджанців, вирощують в кімнаті для росту протягом двох тижнів, і далі переносять в теплицю. Приблизно 40 (То) рослин, трансформованих конструкцією СА?7, були одержані в такий спосіб.
Рослини вирощують до стану зрілості після надання їм можливості самозапліднення.
Насіння, одержане від трансформованих рослин, аналізують щодо складу жирних кислот в олії з насіння, як розкрито у Прикладі 1. Дані для трансформованої лінії з найвищим рівнем ДГК наведені в Табл. 13. Значно нижчі рівні ДГК в середньому присутні в олії з насіння В. пари», бо трансформованих Т-ДНК з руРЗ3416-сА?7, ніж у насінні А. (Шаїїапа (Приклад 2) або насінні
Сатеїпа (Приклад 3), трансформованому такою ж конструкцією. Найвищий рівень ДГК приблизно в 40 лініях був визначений як 1,52 95, причому більшість трансгенних ліній містила знайденні рівні ДГК. Слід зазначити, що значущою була акумуляція АЛК, приблизно 35 95 від загальних жирних кислот, в тому насінні, яке не здійснювало ефективного перетворення на СДК або наступні продукти в біохімічному шляху.
Проаналізовані профілі жирних кислот в окремих насінинах В. парих від події Ті, СТ125-2, з метою більш точного визначення кількості ДГК, продукованої в трансгенному насінні. Знайдено вміст в насінні від 0 95 (нульове насіння) до 8,5 95 ДГК (Табл. 13).
Деякі з насінин від лінії рослин СТ116, а також інших трансгенних ліній, що демонструють продукування ДГК, висівають з метою одержання рослин-нащадків. ЗТ-ПЛР виконують на загальній РНК, виділеній з ембріонів, що розвиваються, від таких рослин, для визначення того, чому конструкція (ЗА7 здійснює слабкий вплив з точки зору одержання ДГК відносно трансгенних А. ІПаійапа і С. займа, що містять таку ж конструкцію, і слабкий ефект відносно комбінації генів на руР3115 і руРЗ3116 (нижче). ЗТ-ПЛР проводять на загальній РНК з використанням набору для одностадійної ЗТ-ПЛР (Іпмігодеп) і специфічних для гена праймерів, націлених на кожен трансген. Це підтвердило, що кожний з генів в конструкції ЗА7 належним чином експресується в трансформантах В. пари5, за винятком Дб-десатурази, яка слабко експресувалася в більшості трансформованого насіння. Інші гени із вказаного конструкта функціонують належним чином в насінні В. паризх і А. Ійаїїапа, наприклад, А12- і Д15-десатурази, функція яких полягає у продукуванні підвищених рівнів ЛК ї АЛК в насінні, при зниженні рівнів олеїнової кислоти. Характерний гель ЗТ-ПЛР проілюстрований на Фіг. 7 і чітко демонструє низьку експресію Аб-десатурази відносно інших трансгенів з рОР3416-СА7.
Трансгенні рослини і насіння, гомозиготні по трансгенах, одержують вирощуванням потомства ліній із найвищим вмістом ДГК.
Таблиця 13
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для незалежного насіння Т; Вгаззіса парих5, трансформованого рОРЗ3416-ОА7, лінії СТ116-11 ії СТ-125-2, в порівнянні з контролем дикого типу (нетрансформований). 22:6003 представляє ДГК. Дані одиничних насінин СТ125-2 В. парих5 позначені "55".
Ст125-2 2 | СТ125-2 яЗ3 |ІСТ125-2 ТО
Сени сте | стова Кп тв Етно 161 | 02 | юж 05 | 04 | 03 | 03 | 08 / вла | 37 | 66 | 42 | 44 | 43 | 96 200 | 06 | 05 | 06 | 04 | 03 | 07 184093 | 00 | юж 09 | 03 | 05 | 06 | 26 / гола | 12 | 11 | 70 | 10 | 08 | 06 о 2голіюї/ | 777777/1717117102 | щ | 01 | щЩщ ФС Її 02 20303 | (0/7 13 | 107 | 08 | 16 | 09 20403 | (0/7 011 11103 | 04 | 06 | 05 ние ШИ Я Я ПО ПОЛЯ ПО ПООО 20503 | 77777771771111111111171Г111111171Г1111111117110м 13 п У тее и я Я ПО ПО КОН У ОНИ НО 22503 | (177 011101 1011 101105 22603 | юю 1152 | 712 | 13 | 27 | 85
Трансформація В. париз і аналіз складу жирних кислот з використанням двох векторів
В іншому експерименті з В. парих, і як альтернативний формат для введення трансгенів, бінарні вектори роР3115 ї руР3116, розкриті у УМО 2010/057246, використовують для окремого одержання трансформованих рослин В. парих5, і одержують трансформоване насіння від рослин. Т-ДНК на руРЗ3115 містить химерні гени, що кодують А12-десатуразу Стеріз раїезііпа, дб-десатуразу Місготопа5 ризійа, Аб-елонгазу Ругатітопав согдаїа і Д5-десатуразу Раміома заїїпа, ії Т-ДНК на руР3116 містить химерні гени, що кодують А15-десатуразу Репіа їшевзсепв, д5-елонгазу Ругатітопах согдаїа і Д4-десатуразу Раміома заїїпа. Дві Т-ДНК, якщо вони присутні спільно і експресуються в насінні, що розвивається, утворюють 7-генний шлях для одержання
ДГК з олеїнової кислоти, що продукується ендогенно. Вказані вектори вводять в Аадгобасієгійт
Іштегїасієп5, штам АСІ1, за допомогою стандартних процедур електропорації, і трансформовані клітини використовують незалежно для трансформації В. пари5 із застосуванням розкритого вище способу для одержання стабільно трансформованих рослин То. Були одержані 29 трансформантів рОРЗ115 і 19 трансформантів рОРЗ116, вказані рослини були вирощені до стану зрілості, і одержане насіння після самозапліднення було проаналізоване щодо складу жирних кислот в олії з насіння. У випадку Т-ДНК з руРЗ115 очікувалося, що перетворення буде приводити до утворення ЕПК з ендогенно продукованої АЛК, тоді як у випадку Т-ДНК з рОР3116 очікувався результат у вигляді підвищеного продукування АЛК з ЛК. Ідентифіковані деякі рослини, що демонстрували вказані фенотипи. Більшість подій демонструвала фенотип зниження ОК/підвищення ЛК в результаті А12 десатурації, з низьким рівнем продукування ЕПК.
До 2,6 956 ЕПК спостерігалося в пулі трансгенного насіння рОРЗ31115. Подібним чином знайдено, що більшість подій руР311б6 має фенотип підвищення АЛК в результаті активності А15- десатурази. До 18,5 95 АЛК знайдено в пулі насіння, трансформованого Т-ДНК з рОРЗ116.
Рослини Т|. з ліній із найвищими рівнями ЕПК і АЛК схрещують, і насіння нащадків (Е1) від 24 виділених подій аналізують щодо вмісту ДГК. У 17 з цих подій знайдена ДГК, причому до 1,9 95
ДГК знайдено в пулі насіння від цих подій. Аналіз одиничних насінин виконують з метою визначення інтервалу продукування ДГК -- дані наведені у Табл. 14. Великий інтервал рівнів
ДГК спостерігається у нащадків схрещування, ймовірно за рахунок гемізиготної природи Т-ДНК в материнських рослинах, таким чином, що деяке насіння не одержало обох Т-ДНК. До 6,7 95
Зо ДГК спостерігається в загальному ліпіді насіння.
Таблиця 14
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для одиничних насінин В. париз ЕТ, одержаних в результаті схрещування рослин, трансгенних по Т-ДНК із руРЗ3115, з рослинами, трансгенними по Т-ДНК із рОРЗ116. В1, В2 і В4 позначають події. 0,0 - неможливо виявити методом ГХ. 7... (віл | 812 в.з |В1.4-о|В1.5-9| вої | В22 |82.3о|82.49|82.59| ВЗ | 83.2 7160 | 66 | 64 | 45123) 79 | 51 | 50 |т101| 85168 53 | 72 61 | 04 |05|02|70 06/04/0406 | 1 |05105 06 вла | 46 | 58 | 27 | 6862 | 38 | 49 | 59 | 87 | 45 55 Б 200 |06|07|061|05107|081|09106|04|071|09 07 18403 | бе | 02 | 01 | 08 05021021 08 0002102 02 гола | то | 1л | 11 | 007 1 08 | 1 | ли | 0509 | 1 | 11 09 гбліво | 01 | ол | 00 | ол ол | ооо |о ооо 20306 | 00 | 0000100 100|о001|001001|о001|001|00 0 20406 | 00 | 0000100 100|001|00/|о0 00100100 00 20303 | 1,8 | 16 | 11 | 28 2 | ли | 70/27 | 07 | 14 | 09 16
77777777 віл 812 | віз |В1.4-9|81.5-9| во | в2.2 (82.39 |В2.49|82.59| ВЗ. | в322 20403 | 03 | 02 | 02 04 | 04 | 01 | 01 1 05 | 0002 | ом | 02 221 | 00 |00|001001|о001|о00|00 0000 /|о00|00 | 0 20503 | 00 | 00 | 00 1 ол | ол | 00 |00 02 00 |00 | 00 || 00 22206 | 00 | 00 | 00100 | 00 |00|00 0000 |00 | 00 | 00 22506 | 01 | 02 | 01 102 | 03 | о | 01 105 | 0002 | ом | 02 22503 | 07 | 07 | 03 | 21 | 16 | 03 | 04 32 | 00 | 05 | 04 | 125 22бю3 | 14 | 10 | 05155139 | 08 | 07 | 6,7 | 00 | 11 | 08 | 20
Таблиця 15
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 14. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 14.
Загальні м/З (5 від 46 | 39 | 23 | 124 27. | 26 | 148 36 26 загальних
Ж
Загальні ж/б (С від 445 | 385 385 488 | 503 | 40,5 | зай | 494 | Б2.7 | 405 | 357 загальних
ЖК)
ШК вою пе оно» зи о ов о вот ння мЗЛУб ння мб/мЗ
Загальні нові миЗ (95 від 26 2 1 6,5 1,4 14 | 114 2 1,5 загальних
ЖК)
Загальні нові мб 05 від зб5 | 7,5) 79 | ч94 | 154 | в4 | ви 158 | 283) 67 | 75 загальних
ЖК)
Співвідноше- появ я ефе яю я м ЗЛиб
Співвідноше- ння нових 4,04 | 3,75 7,18 2,15 2,37 4,36 | 1,39 3,35 | 5,00 м б/мЗ пре ев вит |овт ситі ват тая алаят поз но перетворення 2,5 о 21 о 0,9 о 101 о 6,9 о 1,3 о 1,3 о 12,8 о 1,9 о 14 о
ОК на ЕПК перен и ен|овт тах|нюн поя|овя ве» ах т перетворен- 1 7 о 1 2 о 0,6 о 7.2 о 4,8 о 0,9 о 0,8 о 8,5 о 1 З зо 1 Що) Зо ня ОК на ДГК перен чно |вот авт зач авя|волннити вел, хи перетворен- 4,3 о 4,0 о 2,0 о 12,6 о 9,4 о 2,5 о 3,0 о 15,7 о 3,6 о З о ня ЛК на ЕПК перен вет пня |ех вож|вех|неж ечфюн З Звет ан перетворен- 2,9 о 2,4 зо 2 о 9,0 о 6,6 зв | 1 не) зо | 1 8 о 104 о 2,5 о 21 о ня ЛК на ДГК
Ефективність перетворен- 1477 95 | 44,7 95| 36,4 95| 68,1 95 | 65,9 95 | 44,0 95 45,8 95172,1 95 47,1 9515О,О 96 ня АЛК на
ЕПК
Ефективність перегворент 134 8 95|26,3 95|22,7 95 48,7 95| 45,9 95. 32,0 95 29,2 95147,9 95 2,А 95 33,3 96 ня АЛК на дк
Загальні насичені 102 | 10,6 7,9 15,1 12,4 102 | 13,7 | 11,6 | 11,3 | 10,6 жирні кислоти
Загальні мононенасит! дод | 47 | 11) 23,8 | 28,7 472 | 53 | 218 | 347 | 4АЙ |. Бі чені жирні кислоти
Загальні поліненаси- чені жирні 492 | 42,5 | 40,9 61 59,4 | 43,3 | 368 | 64,3 | 53,7 | 442 | 384 кислоти
Співвідноше- ння загальні | 1,62 | 1,60 | 2,46 | 0,61 0,73 | 212 | 1,94 | 046 | 5,60 | 1,67 | 1,79
С2г0о/С22
Компільовані дані профілів загального ліпіду (Табл. 14) наведені в Табл. 15. На базі даних
Табл. 15, співвідношення загальних 06 ЖК (включаючи ЛК) і 03 ЖК (включаючи АЛК) в насінні з найвищим рівнем ДГК становило 3,34. Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) і нових 03
ЖК (за винятком АЛК) становило 1,39. Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 13,7 95, і рівень мононенасичених жирних кислот становив приблизно 21,8 95. Рівень загальних 0б жирних кислот становив приблизно 46,4 95, і рівень 03 жирних кислот становив приблизно 14,8 95. Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 12,8 95, ОК на ДГК - 8,5 95, ЛК на ЕПК - 15,7 95, ЛК на ДГК - 10,4 95, АЛК на ЕПК - 72,1 95, АЛК на ДГК - 47,9 95. Знижена ефективність перетворення 0б жирних кислот на 03 жирні кислоти, яка спостерігалася в цьому експерименті при використанні комбінації руР3115 і руР3116, була віднесена на рахунок нижчої ефективності рослинної Д15-десатурази, в порівнянні з грибковою 15/03 десатуразою (Приклади 2 і 3) при комбінації з генами для перетворення АЛК на ДГК.
Потомство ліній, що містять ДГК, гомозиготних по всіх введених трансгенах, було одержане для аналізу.
Приклад 5. Модифікації Т-ДНК, що кодують шляхи ДГК в насінні рослин
Для покращення рівня продукування ДГК у В. пари, в порівнянні з рівнями, розкритими у
Прикладі 4, бінарні вектори руР3416-4СА7-тодА, руРЗ416-СЕ7-тоаВ, руРЗА16-4,2А7-тоас, ругР3416-саА7-тодО, руР3416-сА7-тодЕ і рОРЗ3416-сСА7-тоав були сконструйовані, як розкрито нижче. Ці бінарні вектори є варіантами конструкції руР3416-сА?7, розкритої у Прикладі 2, і були сконструйовані з метою подальшого підвищення синтезу ДГК в насінні рослин, особливо шляхом покращення функцій Дб-десатурази і Дб-елонгази. Спостерігалася акумуляція СДК в деякому насінні, трансформованому конструкцією СА?7, внаслідок відносно низької ефективності елонгації, в порівнянні з Д5-елонгазою, тому, серед інших модифікацій, положення двох генів елонгази було змінене в Т-ДНК.
Дві послідовності, що кодують елонгази у р)Р3416-5А7, були поміняні місцями на Т-ДНК, з одержанням рур3416-сА7-тодА першим клонуванням нової касети Аб-елонгази Р. согдага між сайтами ЗБ руоуРЗ3416-СА7, для заміни касети Д5-елонгази Р. согдаїа. Ця конструкція була
Зо додатково модифікована шляхом обміну промотору ЕРІ, який контролює Аб-десатуразу М. ризійа, з промотором конлініну Спі2 (рі иСпі2), щоб одержати рОІРЗ416-СА7-тойВ. Дана модифікація була здійснена з метою збільшення експресії Дб-десатурази, і таким чином ефективності фермента. Вважається, що промотор Спі2 може давати більш вісоку експресію трансгену у В. парих5, ніж вкороченій промотор напінк. руР3416-СА7-тодС було одержано шляхом додавання другої касети Дб-десатурази М. ризійа з дещо іншим використанням кодонів (ЗЕО ІО МО: 15), контрольованої промотором ЕРІ, який було вставлено у сайт Ртеї! тільки всередині правої межі руР3416-СА7-тоаВ. Друга касета Аб-десатурази додана до р.ІРЗ416- сА7-тоавВ і руР3416-СЧ.4А7-тоав з метою підвищення рівня експресії Аб-десатурази і збільшення періоду часу в процесі розвитку насіння для експресії Аб-десатурази шляхом використання декілької промоторів. Різноманітні способи використання кодонів застосовувались у двох нуклеотидних послідовностях, щоб здійснити трансляцію однієї і тієї ж послідовності білка без ризику ко-супресії з боку подобніх кодуючих ділянок в межах одніє і тієї ж Т-ДНК. руР3416-С1А7- тод і руР3416-С(А7-тодЕ являють собою подібні варіанти, у яких третя послідовність ДПМ, що відповідає нуклеотидам 16649-17816 5ЕО ІО МО: 1, додана до рОРЗ3416-СА7 і руРЗ416-А?7- тоавВ, відповідно, на сайті Ртеї. руР3416-СА7-тодЕ одержаний шляхом додавання другої касети Дб-десатурази М. ризхійа, що містить нуклеотидну послідовність природної Дб-десатурази і контрольованої промотором ЕРІЇ на сайте Рітеї у правій границі рОРЗ3416-СА7-тоав. руРЗ416-
СпІА7-тодб одержаний спочатку заміною касети Аб-десатурази М. ризШа касетою Спі2:А5Б- елонгази Р. согдаїа рестрикційним клонуванням на сайтах Авсі-Расі. Далі руРЗ3416-сА7-тода був одержаний шляхом заміни оригінальної касети ЕАЕ1:Д5-елонгаза Р. согдайа касетою
ЕАЕ1:Аб-десатураза М. риба рестрикційним клонуванням на сайтах ЗБ. Нуклеотидні послідовності Т-ДНК з кожної із вказаних генетичних конструкцій наведені як: рОР3416-СА7- тоав (5ЕО ІО МО: 2), руРЗ4А16-с|А7-тоас (5ЕО ІО МО: 3), руР3416-сСА7-тодО (5ЕО ІО МО: 4), ругРЗ3416-саА7-тодЕ (ЗЕО ІО МО: 5), руРЗ416-С(|А7-тодЕ (ЗЕО ІО МО: 6) и рОР3416-СсА7-тода (ЗЕО ІО МО: 7).
Бінарні вектори руР3416-сА7-тоав, руРЗ416-СА7-тоаС, руРЗ416-СА7-тодО, руРЗ416- спА7-тодЕ, руРЗ416-сА7-тодЕ ії руОРЗ416-4,Б;А7-тодоб використовуються для одержання трансформованих соматичних ембріонів Вгабзвзіса і рослин Вгаззіса пари5, Сатеїйпа заїїма і
Агабідорвзів ІНайапа, а також насіння потомства. Дані для руР3416-с4А7-тоаВв наведені в наступному Прикладі.
Одержані 8 трансгенних подій руРЗ3416-с4А7-тойВ А. Шаїїапа і 15 трансгенних подій ругР3416-аА7-тоас А. Шаїїапа. Спостерігається від 3,4 95 до 7,2 95 ДГК в пулі насіння руР3416-
СА?7-тоаВ, і від 0,6 до 4,1 95 ДГК в пулі насіння 12 р)уР3416-СА7-тодо. Деякі з подій руР3416-
СІА7-тоаВ з найвищим рівнем висівають на селекційні середовища, і саджанці, що вижили, відбирають для наступного покоління. Насіння аналізують щодо вмісту ДГК. Оскільки об'єднане в пул насіння Т1 представляє популяції, сегреговані по трансгенах, і включають будь-які нульові сегреганти, очікується, що в гомозиготному насінні рослин-нащадків рівні ДГК будуть вищими, до 2095 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння. Інші модифіковані конструкції
Зо використовувалися для трансформації А. (паійапа. Хоча одержана тільки невелика кількість трансформованих ліній, жодна з них не давала вищих рівнів ДГК, ніж конструкція тоавВ.
Конструкція руР3416-С|А7-тоав також використовувалася для одержання трансформованих рослин В. париз сорту Озсаг і в лінії розведення, позначеній МХО005. Таким чином були одержані 10 незалежних трансформованих рослин (ТО) для трансформації Озсаг, і 20 незалежних ліній -- для МХО05. Урожай насіння (насіння Т1) одержаний від вказаних трансгенних ліній. Пули насіння були проаналізовані щодо рівнів ДГК в олії з насіння, і дві лінії, які продемонстрували найвищі рівні, були вибрані і позначені як лінії СТ132.5 (у сорті О5саг) і СТ133.15 (у МХОО05).
Набухають 20 насінин з СТ132.5 і 11 насінин з СТ133.15, і через два дні олію витягають з половини сім'ядолі кожної з індивідуальних насінин. Другу половину сім'ядоль з ембріональними осями утримують і культивують на середовищах, щоб зберегти конкретні лінії нащадків. Склад жирних кислот в олії визначають; дані для СТ132.5 наведені в Табл. 16. Рівень ДГК в 10 із проаналізованих 20 насінин, за даними аналізу методом ГХ, знаходиться в інтервалі 7-20 95 від загального вмісту жирних кислот. Інші насінини містили менше 7 95 ДГК і могли містити часткову (неповну) копію Т-ДНК із руР3416-сА7-тоаВ. Схоже, що трансгенна лінія містить множинні вставки трансгена, які були генетично роз'єднані. Насіння трансгенної лінії СТ133.15 продемонструвало рівні ДГК в інтервалі 0-5 95. Насінини без ДГК, ймовірно, були нульовими сегрегантами. Ці дані підтверджують, що конструкція тоаВ функціонує належним чином для одержання ДГК в насінні каноли.
Конструкції руРЗ416-сА7-тойдВ і руРЗ3416-4,лА7-тодЕ також використовувалися для одержання трансформованих рослин Сатеїйпа займа. Щонайменше 24 незалежні трансформовані рослини (Т0) були одержані і детальніше вивчені шляхом аналізу нащадків.
Урожай насіння (насіння Т1) був зібраний із вказаних трансгенних ліній. Пули насіння були проаналізовані щодо рівнів ДГК в олії з насіння, і 6 ліній, які продемонстрували найвищі рівні
ДГК (від 6 95 до 9 95), були відібрані. Рівні ДГК в 20 насінні Т1 з кожної лінії були проаналізовані, і більшість насіння продемонструвала рівні ДГК в інтервалі 6-14 95 від загального вмісту жирних кислот, за даними аналізу методом ГХ. Склад жирних кислот в олії був визначений; дані для декількох трансгенних насінин наведені в Табл. 17. Ці дані підтверджують, що конструкції тоаВ і той обидві належним чином функціонують для продукування ДГК в зерні Сатеїіпа.
Хабовия 8. робо жених жнслек В міння ках емМ'яаож; зрорешеного чемним везіння Ж Що новних ві міста. ковток т пий йз ЗіБ ге тоВнсреяног НасСІня і бом. Во містять коезрУЮТ ВпЕШВ. до Її ІК суттю о м им жк зу «кроку ж КЗ че скік ЕМО Ж сисстеривлося в чноденнях зразках, в миотеть бідне МБ ДЕК, ! Е: ї : ї В ї Н їх і Н ї х ї Е: ї Н Е З ї : і і НИ: | : Я | ї 5: ; і ОО Е ї 3 : : А Н ї ї ї 5 Я ї 1 1 ї ї ІЗ ІЗ ї ІЗ Е З І ІЗ І ІЗ ї ї І І Е ї Н у У Н ї і З ех. ї ГО НИ ї І Е; ї ГУМУ і ше ши ни ши ши че ща ВО Вт шк ше У З оо ї ж їж ГУ хх Ж с ху ож уче вка сік В І ВВ
Нав іі міш ме іі ГЕ НЕОН У и шен кн М ме Ес ск в и г ее же ее неья
НЕ! ЗІР КІ и ЕК ЗМК Я ЕК ІМЕНА І
ДМесесукюкю В СеКНЕНА ННК пен В М МК Ме КАК А Кн
ТОЖ ІВ ТВ Ек В ВК В Не Я КА КО НУО
ЕОЕ КЕ ЕІ ТІ ІМ ІЗ ТИ З КЕ ШЕ І ОК ЗІ ЕЕ ОВ ЕК Кер Че ВХ КК МК Сни кум Кн оо ПУ сн в в и Кн ни Кая р, мови соя и Мао ві
ОО Б ЗБ 155 БІ АТ КВ УК пе ЧЕН МН ОЇ ан по в в ня ЕК У ВК КВ я оХХхя КУ кА оду ук
Кві ОО в о НК А СЕН о в вони нн ан о УВА Ам АЗК КА ооо ння нн і х ІНК п ши ВА КЕКВ і БО ОЗ І ок АК ВЗ ЕЕ ОК нн и о М нон нм М ва ни КК кни а они УК КАК ово БД Не тА Я КЕР ЕЕ ВП БІК ЕК БО КР ТІ ВАН ЕН А КАК и УК ХК екв в я НО о я Ви нь кхкУКх ко ен в
ОО ЗІБ А БТ ЗІ ОХ ВЕК Б Я ВА Я ПК Я ВЕ МН В ОК в в и м в В КУ о ВВ Ж Я
ОБО ЕІ І еВ в ОРЕ В ЕК ЕІ ЕК ЕК Я НІ Я З 1 МЕ ЗИ КОЖ Я ес о нн зо и Коня КК ЕК ВЕК ВВА КЕКВ нка нок їж ІЧ п І Тв ЗИ ЕЕ Не КО ХК В ОН Я З АК І ВМ А он о я в в о ня но и но Ме ЕК у мм ки а а Ви вон Од ІЗ В С ІН У ІК Кв А ЕВ ОК М ЕОМ В А А КТ А
Деоелюсюююх не кОм нання он мк а ем Кв нив
Я БАБІ Аа ЖЕ Я і КА ТВОЯ ІВ КВІНКЕ В м но ДЕ функ АХ нак нка ко а КК пе а ола За фан в ЕК З НЕ ОО НК КВ І НО І ТЕО У Я ВН ТУ ЕТ 3 0
ТА КАК уичЕ нів я Ккя ик п доку ПОТ Ти
Оп х взішлійапіньві зав ВІ ііі Тк Ім З Ко КАК ред ММ ЕК скін кан Ежен нн АН
ОО БЕБІ вип ЕП ВБЕРЕ РЕ БВ КВ ЕІ НІ Б БЕ І БО ВК В о о в вон ан З КВ АК КК КК УК
ТО ЕІ НКР ОТО ОО ЗЕ Б ЕКО БЕ В В ЕВ КЗ М Я нн а в и кн Винна ЕРА Ох ОА Утя ТИ ОК КУ КК и ее іо НЕ ПМ Пе ЕВ І ВІ В ПО ВВ І БО БО ІТ НЕ КБ ЕН НЕ
У Кия ке дерен аа а МО пив и и и ВМО і Мате БЕ ОВ КО ЗКЕКТВЕ ВО КЕ БЕ КО То в о а ОВК ення Ам моно нн а ж о ие Ма и ВК М НВ в ни о нон УК
ДЕ У КО У В КІ ОК МН НК НА А
І З» аю КУМ А ех кі У ОК Хек тн п Ех им ст кет му мух А ТК МКМ Я МІМІКИ а о А НЕ Кр а ен а ва Ки в З ВЖИ
КОЛ БЕЗ ту з ЕЕ ЕН: и ВІКІ Ір РІПАК І КІ І ше ше ее кое ех КАЛ А ен нн
Рок ББЖ п ко ее Я НО ПІ Бе ЕІ ПІ ЕТ ТК ан п п А а На М В
Вч за ЕМ ЕТ хіх. сах и і сажу що сх куту су табанув БУ. ПОБН жнрних кнсзок трест о нн і КО Бо ЩО ме хь стажу кеВ ай конеевУЮ ЧюЮО бо вет. ї І І Н З ї ї їх : Н Е ї Е ї ' ї
Н Ї | ї Н ІЗ ї ї Е ! Е ї Е ї : : ї : ї І НИ ої : Н і ! ї : Е ГУ Н ї и и НИ Я НИ ЖИ ПИ ЖИ ми не ни пи пи з и Но по є з є п ЗИ: ї ї З Н їх ї : хе З ї : Н ї І , 3 ї Ї і: ї ї ї щі а Кк Н хх т ї іх : Е : ке» 3 І Н ї
В Ї Е ої шЖішішіюві Кш т, кг щі і ! із віаів і еВ в ВІВ ові : жЖІЩІВІШіІВІВІІВІВ ВІ ІІІ ВВІВ ВІВ ІІІ кі
Н пін вн в В ВВІВ ЖЕ кеш? пеня «вх Р У кое нм ОН В В УК НЕК НК ЕВ сіна
ЗИ і І Кі умі ха ши НН Я и В В НА а ВО У ЗІ:
ОН ЕЕ В ЕК | и Ем зим не у р зн в З З М
В НН ЗЕ КК ДО І ЧЕН їі НИЩЕ ЗМ ШЕ КИМ НЕ М НІ Й ЖИ: : о и во в в Оу ан и я Ні; и нн и ин вн нн и и сн
І В ЗІ КЕРІВ ЕФЕ ВА З БРІВ КІ ХМ ІВ БОЛІ ЕІ З ВІ ВЕК Б ІІ а ІА ВЗ Та НЕ ан и нн и ВЕНУ КАК па о ак як Як АК МК ЯКО ЯК ЯКИЙ Я КН ВЕ писк ви тин кни ко жо Ка се ак К й се док сх ій Ай ак ах пе, КККН.
ПДК За я КИ НК НЕ и ЕІ ки кА НЕ нео АК НЕ НААН НК ЯК ЯКА НЕК ПЕ А НК КЕНЕ ИН
Винахідники вважають, що, загалом, ефективність обмежуючої швидкість ферментної активності в біохімічному шляху ДГК може бути вищою у трансформантах, що містять декілька копій Т-ДНК, в порівнянні з трансформантами, що містять єдину копію Т-ДНК, або може бути збільшена за допомогою вставки в Т-ДНК декількох генів, що кодують фермент, який може бути обмежуючим в біохімічному шляху. Докази можливої значущості трансформантів, що містять декілька копій, спостерігалися в насінні Агарідорзі5, трансформованому конструкцією СА7 (Приклад 2), в яких подія з найвищим вмістом ДГК включала три Т-ДНК, вставлені в геном хазяїна. Декілька генів можуть бути ідентичними, або переважно є різними варіантами, що кодують один І Той же поліпептид, або що знаходяться під контролем різних промоторів, яким властивий характер експресії, що частково перекривається. Наприклад, збільшена експресія могла б бути досягнута шляхом експресії декількох ділянок, що кодують Дб-десатуразу, навіть, якщо продукується один і той же білок. Наприклад, в руР3416-сА7-тойЕ і рОР3416-СсА7-тоасС присутні дві версії Лб-десатурази М. ризіПа, які експресуються різними промоторами. Кодуючі
ПОСЛІДОВНОСТІ включають різне використання коОдонІВ, І таким чином різні нуклеотидні послідовності, з метою зменшення потенційного сайленсинга або ефектів ко-супресії, але що приводять до продукування одного і того ж білка.
Приклад 6. Активність специфічних для насіння конструкцій в соматичних ембріонах
Для одержання системи швидкого аналиізу, яка буде прогностичною для експресії генетичних конструкцій в насінні під контролем специфічних для насіння промоторів, система соматичних ембріонів була одержана для Вгахзіса пари5. Це здійснюється з використанням вектора для експресії фактора транскрипції І ЕС2, який приймає участь в ініціації соматичного ембріогенезу.
Як демонстрація, бінарні вектори 355:11ЕС2 і руР107 (Рей еї аїЇ.,, 2010а і 5) вводять в
Адгорасієтцт їштеїасієп5, штам Асі 1, шляхом стандартної електропорації, і трансформантів
Адгорасівегійт використовують /- для співтрансформації Вгазвіса пари шляхом співкультивування. Ділянка Т-ДНК рУуОРІТ07 містить гени, що кодують Ле9-елонгазу Ізоспгувів даІбапа, Д8-десатуразу Р. заїїпа і Д5-десатуразу Р. 5аїїпа, причому кожен ген експресується специфічним для насіння промотором. Для контрольної трансформації використовують тільки вектори 355: ЕС2. Експресія 355: ЕС2 приводить до генерації соматичних ембріонів в культурі тканини безпосередньо із тканини калюсу, трансформованої В. парив, як розкрито у Прикладі 1.
Аналіз жирних кислот продемонстрував, що специфічні для насіння гени на Т-ДНК конструкції руР107 експресуються в трансгенних соматичних ембріонах в присутності співтрансформуючого гена І ЕС2 і функціонують для продукування АРК (20:4858,11и14) з ЛК і ЕПК (20:57) з АЛК. Дані для трьох співтрансформованих соматичних ембріонів наведені у
Табл. 18, і склад жирних кислот кожного з них порівнюється зі складом жирних кислот олії з насіння для насіння Вгаззіса пари5, яке було трансгенним та експресуючим Т-ДНК руР107 (Реїгіє еї аїЇ., 2010а ї Б). Подібний загальний відсоток АРК і проміжних жирних кислот ЕДК (20:26) і ДГЛК (20:306), а також ефективність перетворення, спостерігалися для соматичної ембріональної тканини, при порівнянні з профілями стабільно трансформованого насіння.
Подібні результати спостерігалися для складу жирних кислот стабільного трансгенного насіння
Те» ії соматичних ембріонів: вміст Фб жирних кислот знаходився на рівні 26,6 95 і 25,6 95 (середня величина), відповідно, тоді як рівні АРК становили 9,795 і 10,695 (середня величина), відповідно.
При введенні тільки 35511ЕС2 і аналізі соматичних ембріонів в часі було знайдено, що профіль жирних кислот змінюється на більш подібний до ембріонів профіль, причому вміст 18:3491215 знижується, і вміст 18:19 підвищується зворотно корелюючим чином (Фіг. 8).
Одержані результати вказують на те, що соматичні ембріони дійсно ставали подібними насінню за характером, і експресувалися гени на Т-ДНК із рОР107. Це є демонстрацією того, що система соматичних ембріонів дозволяє швидку характеристику специфічних для насіння трансгенних
Зо конструкцій в В. пари, без необхідності у проведенні повного способу одержання трансгенної рослини та її зрілого насіння.
Таблиця 18
Склад жирних кислот ліпіду, одержаного із соматичних ембріонів Вгазвіса пари5, що генеруються за допомогою співтрансформації роуР107 і 355: ЕС2, в порівнянні з контрольним нетрансформованим насінням (ДТ) і насінням Т2, трансформованим рУРІ107. Ефективність перетворення для окремих ферментів наведена в дужках після відповідних ферментних стадій.
СрЗ-Ело позначає Д9-елонгазу, Ю8-Дес позначає Ав-десатуразу, і 05-Дес позначає Д5-десатуразу
Трансгенне насіння о о о 000 Фаб| б ореюу | вся | тля | івсояв й 7,1 -1,9(67 95009- | 5,2(61,8 95 | 9,7 (56,7 У5 09- о манної у дю вро еетечьовет) явити | ВОУВЕ ТЯ о ратаовяео папа пен, ляти | роя То от ото овяно тати осно года | | 40508 | 99 | 55 6ЮЖ | 73 годе | | озжом | 04 | 2 щ 03 | 04 гово! | гйжба | 76 | 64 2 Щ | 79 (Всьогонових | | 246 2 | 341 | 261 2 Щ | 38
З використанням такої ж системи для генерації соматичних ембріонів, клітини Вгазвіса пари5 окремо трансформують руРЗ3416-сА7-тоав їі руР3416-СА7-тодо. Були одержані 42 ембріони, 18 для тоаВ і 24 для тодО. Загальний ліпід екстрагують з ембріонів і аналізують склад жирних кислот. Ембріони містять від 0 95 до 16,9 95 ДГК (Табл. 19). Результати з 0 95 ДГК, ймовірно, були одержані унаслідок тільки часткової інтеграції Т-ДНК або вставки в транскрипціонально "мовчазну" ділянку геному. Співвідношення загальних 03 ЖК (зокрема, АЛК) до загальних об
ЖК (зокрема, ЛК) становить 2,3 для ембріона 2270 і 11,96 для ембріона 25284. Співвідношення загальних 0б ЖК (зокрема, ЛК) до загальних 03 ЖК (зокрема, АЛК) становить 0,08 для 5284.
Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) до нових 03 ЖК (за винятком АЛК) становить 0,03 для 2284. Обчислена загальна ефективність перетворення становить: (для ембріонів 2270, 284) ОК на ЕПК - 14,0 Фо, 29,8 до; ОК на ДГК - 9,7 Фо, 24,2 до; ЛК на ЕПК - 15,4 95, 30,7 до; ЛК на
ДГК - 10,7 Фо, 25,0 90; АЛК на ЕПК - 22,1 95, 33,3 до; АЛК на ДГК :- 15,3 95, 27,0 Фо. Ці значення ефективності подібні або перевищують, у випадку 25284, спостережувані для ліній Тз руРЗ416- сСаоА7 Агарідорвіз, що вказує на здатність вектора р/ІРЗ416-СА7-тодВ до належного функціонування в клітинах В. париз5. Рівень СДК становить менше 3,0 95, вказуючи на те, що Дб- елонгаза функціонує навіть краще, ніж конструкція СА?7. Індивідуальна ефективність ферментів, досягнута в 2284, становила: 97,4 95 для Д12-десатурази; 92,3 95 для 03-десатурази; 38,2 95 для дб-десатурази; 88,2 96 для Дб-елонгази; 98,8 956 для Д5-десатурази; 94,1 95 для Д5-елонгази; і 86,3 95 для Л4-десатурази. Загальний вміст насичених жирних кислот становить 21,2 95, загальний вміст мононенасичених жирних кислот становить 10,2 95, загальний вміст поліненасичених жирних кислот становить 68,6 95.
Винахідники вважають, що це був найвищий рівень ДГК, досягнутий в клітинах В. пари5 на даний момент, за винятком подальших даних, розкритих нижче. Це також продемонструвало, що модифікація рОРЗ416-сйА7-тоаВ відносно руРЗ416-зА7 є ефективною з точки зору з погляду підвищення рівня експресії гена Аб-десатурази. Бінарні вектори руР3416-СА?7, руРЗ3416- пА7-тодА, руРЗ3416-СсА7-тоас, руРЗ3416-СА7-тоа, руР3416-сА7-тоаєЕ, і руР3416-СА7-тоа, розкриті вище, використовуються для співтрансформації з 3551 ЕС2, з метою одержання трансформованих соматичних ембріонів В. пари5. До 7,0 95 ДГК спостерігається в ембріонах той, 9,9 У5 - в ембріонах тодйЕ, 8,3 95 -- в ембріонах тоаБ і 3,6 95 -- в невеликій кількості ембріонів тодо.
Таблиця 19
Склад жирних кислот олії із соматичних ембріонів Вгаз5іса пари 2270 і 24284, одержаних співтрансформацією специфічною для насіння конструкцією кислоти ДГК руР3416-сА7-тоаВ і 355: ЕС2, а також 2286 і 2289 (руРЗ3416-СА7-тоа) 11111120 | ягв4 | йг8б/ | й28907 16149 ї177717171007 | .ЮюЮЙо04 юЮюЮЦ(| 08 щ | (08 г Ф 11117163 17771105 2 | 5 Ющ 06 | їм (13 явила 17777166 77111815 1 л18лат 7 1777771163 | 1768 | 2 .-((656..ЙЙБЙ 67 шщ 11111827 1777111189 7 | 45 2 ющЩщ | 700 | (98 г Ф «( 118306 17771007. | .ЮюЮЙЙ08 ЮюЮщЩ(| 03 щ | 03 гФ 777717.200 771... 09 | 09 6 щЩ | 08 | 08 11120303 17777705 | щ00 2 ю Щ| 05 6 щЩ | 06 11111220 1771717117108 71117115 | 06 2 щЩщ | 07 2 Ф -Г 11120403 | 02 | щ(бе | 07 6 щЩщ | 07 " 11 2гмвов 17777100 | ..юЮюЮю712 2 щЩ | 00 6 щЩ | 00 г Ф 11122303 17777100 | 01100 1юЮюрю 0 11124077 17771117108 17111170 177111110717111111о 847 17111108 17111170 17771107 108 2 "
Приклад 7. Аналіз ТАГ з трансгенного насіння А. Ійаїїапа, що продукує ДГК
Позиційний розподіл ДГК в ТАГ із трансформованого насіння А. ІПайапа визначали за методом ЯМР. Загальний ліпід екстрагують приблизно з 200 мг насіння, спочатку роздавлюючи його під шаром гексану, з подальшим перенесенням роздавленого насіння до скляної пробірки, що містить 10 мл гексану. Пробірку нагрівають приблизно до 55 "С на водяній бані, після чого обробляють вихровим перемішуванням і центрифугують. Гексановий розчин екстрагують, і процедуру повторюють з додатковими порціями 4 х 10 мл. Екстракти об'єднують, упарюють за допомогою роторного випарника, і ТАГ в екстрагованому ліпіді очищують від полярних ліпідів шляхом пропускання крізь коротку колонку з кремнію діоксидом, з використанням 20 мл 7 90 дієтилового ефіру в гексані. Позиційний розподіл ацильної групи на очищеному ТАГ визначають кількісно, як було описано раніше (Реїгіє єї аї., 2010а їі Б).
Аналіз продемонстрував, що велика частина ДГК в загальній олії з насіння розташована в положеннях 5п-1/3 ТАГ, і невелика кількість знайдена в положенні 5-2 (Фіг. 9). На протилежність цьому, ТАГ з продукуючого АРК насіння продемонстрували, що 5095 АРК (20:4а5811и) розташовано в положенні 5п1-2 олії трансгенної каноли, тоді як очікувана величина для випадкового розподілу становить тільки 33 95 (Реїгіє вї а!., 2012).
Позиційний розподіл ДГК в ТАГ з насіння В. пари5, трансформованого рОРЗ3416-ЗА7 або комбінацією руРЗ3115 і руР3116, визначали по суті в такий же спосіб.
Додатково, загальний ліпід з трансгенного. насіння А. Ійаїійапа був проаналізований РХ-МС з потрійною квадрупольною лінзою, щоб визначити основні різновиди триацилгліцеролу, які містять ДГК (ТАГ) (Фіг. 10). Знайдено, що різновидами ТАГ з найвищим вмістом ДГК є ДГК-18:3- 18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описує позиційного розподілу), і на другому місці знаходиться
ДдГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) спостерігається в загальній олії з насіння, хоча і з низькими, але знайденими рівнями. Інші основні різновиди ТАГ, що містять ДГК, включали ДГК-34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК-36:7 (ТАГ 58:13) і
ДдГК-38:4 (ТАГ 60:10). Ідентичність двох основних ТАГ, що містять ДГК, була додатково підтверджена квадрупольною часопролітною (0-ТОЕ) МС/МС
Приклад 8. Прогнозування продукування ДГК в насінні В. пари5
Зо Ефективне продукування ДГК в насінні Агарідорвзіє з рівнем 15595 при використанні генетичної конструкції (АТ було продемонстроване у Прикладі 2. Така ж конструкція в насінні
Вгаззіса пари приводила до продукування тільки приблизно 1,5 95 ДГК у багатьох (але не всіх) із трансформантів, перш за все за рахунок слабкої експресії гена Аб-десатурази СА7 в цьому виді (Приклад 4). На базі припущення про те, що модифікації конструкції ЗА7 можуть подолати проблему (див. Приклад 5, як продемонстровано у Прикладі б) експресії гена Аб-десатурази, були здійснені обчислення для визначення вірогідного профілю жирних кислот для трансгенного насіння В. парих, що експресує гени з варіанту руР3416-5А7, в якому кожен кодований трансгеном фермент функціонує так само ефективно, як спостерігається для А. ІПпаїйапа, що містить конструкцію СА7. Передбачений склад жирних кислот для трьох обчислень (941, 22, ЖЗ3) наведений в Табл. 20. Дані базуються на складі жирних кислот дикого типу (нетрансформований) для В. пари, що містить 59 95 олеїнової кислоти, 20 90 ЛК і 8 95 АЛК. Три передбачені часткові профілі жирних кислот, наведені у нижній половині таблиці, базуються на ефективності перетворення для кожної ферментної стадії, наведеної у верхній половині таблиці. У прогнозі Ж2, комбінація Д12-десатурації з ефективністю 75 95, Д15-десатурації з ефективністю 75 95, ДАб-десатурації з ефективністю 35 90, Дб-елонгації з ефективністю 80 90, Д5Б- десатурації з ефективністю 90 95, Д5-елонгації з ефективністю 9095 і Д4-десатурації з ефективністю 90 95 приводила б до продукування приблизно 10 95 ДГК в типовому трансгенному насінні каноли. Всі наведені значення ефективності є нижчими або дорівнюють індивідуальній ефективності, спостережуваній в Агарідорзіз, тому прогноз Ж2 представляє консервативну оцінку. Ефективність трансформації, наведена в 23, представляє наближення, що базуються на ефективних перетвореннях, які спостерігалися в А. (Паїйапа, трансформованій руР3416-СА?7.
Згідно прогнозу, ДГК буде продукуватися на рівні приблизно 15 95 від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння, що продукується в насінні В. пари5, причому даний результат відображує найефективніші рівні продукування, спостережувані в А. ІПаїійапа. Очікується, що вставка декількох Т-ДНК в гомозиготному стані підвищуватиме рівень ДГК до 20 95 у В. парив.
Таблиця 20. ннвТиннининиининининининнннннншшш 11111111 Фермент / ЇЇ 1 т Їж | в 1111111аїадес///// | 77717171 17111 7096 | 75956 | 8096 " 11111111 аїбдес/////7777 | 77717171 17111 7096 | 75956 | 8096 11111111 ббдес(ю3) 7777/7771 3096 | 3595 | 4095 ( нин т я я ПО: ТУЯ ПОН: То ТУЯ ПОН ТУ 11111111аб-дес////777777777/ | 77717171 1717118096 | 9095 | 90956 "/( 11111111бб'ело77777777777771 71717171 17118096 | 9095 | 90956 11111айдес//////77777 | 7771717171717177118096 | 9095 | 90956 « нини ши 1 л1830677777777711Ї711111111711111т196 11296119 нІЕНИКНІНИИИИВВВ ОВТ НЯ НЯ ПО нн Ех хи я У ПО ЗСУ ПОЛ 11120431 Ї711111111171111а6 11196 |в нн Ін я ПО т ПО ТУ ПО 11122503 Ї771117171717171711111196 111196 |в нин Ух: и п СУЯ ПО ТС ТУЯ ОХ ТЕСТУ
Приклад 9. Стабільна експресія трансгенного біохімічного шляху ЕПК в листі рослини
Конструкція бінарного вектора
Бінарний вектор, РОКЕ0О4-11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі (ЗЕО ІЮО МО: 8) сконструйований для введення Т-ДНК в рослини з метою синтезу ЕПК в тканинах листя. Він містить химерні гени, що кодують ферменти: Аб-десатуразу М. ризШа (5ЕО ІО МО: 16), Аб-елонгазу Р. согааїа (ЗЕО ІЮ
МО: 25) і Д5-десатуразу Р. заїїпа (5ЕО ІЮ МО: 30), кожну під контролем Самм 355 і промоторів маленької субодиниці (ПМС) рубіско А. ІПаїїапа (Фіг. 9). Бінарний вектор конструюють шляхом синтезу ділянки 199-10878 ЗЕО ІЮ МО: 2 і клонування його в бінарний вектор-реципієнта
РОКЕО4 (Соши еї аї., 1997) на сайтах В5ім/ і Казі. Три гени біосинтезу жирних кислот, кодуючі ферменти, необхідні для перетворення АЛК, 18:329.1215 на ЕПК, 20:5А558111ли17,
Тимчасова експресія конструкції ЕПК в клітинах листя М. репінатіапа
Для перевірки правильності конструкції та її здатності ефективно експресувати гени в тканинах листа, химерний вектор рОоОКкЕО4-411АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі вводять в А. їШтеїасієп5, штам АС 1. Химерний вектор 355:р19 також вводять в А. Шштеїасієп5з, штам АСІ1, як розкрито у Прикладі 1. Клітинами з одержаних культур інфільтрують тканину листя рослин
Місоїйапа репінатіапа в кімнаті для росту з температурою 24 "С. Декілька зразків для прямого порівняння інфільтрують зразками для порівняння, розміщеними з обох боків одного і того ж листа. Експерименти виконують в трьох повтореннях. Після інфільтрації рослини вирощують ще протягом 5 днів, після чого листові диски витягають для аналізу профілю жирних кислот за методом ГХ, як розкрито у Прикладі 1. Аналіз за методом ГХ виявив, що вектор ЕПК здійснює свою функцію у вигляді продукування ЕПК в листі Місоїйапа репіпатіапа (Табл. 21) з найвищим рівнем ЕПК, який становить 10,7 95 від загальних ліпідів листа.
Стабільна трансформація Місойапа їарасит
Химерний вектор РОКЕО4-11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегії використовують для стабільної трансформації Місоцйапа їарасит. Вектор вводять в А. іШтеїасіеп5, штам АСІ1, шляхом стандартної процедури електропорації. Трансформовані клітини вирощують на твердих середовищах Лурія-Бертані з додаванням канаміцину (50 мг/л) і рифампіцину (25 мг/л) та
Зо інкубують при температурі 28 "С протягом двох днів. Одиничну колонію використовують для ініціації свіжої культури. Через 48 годин інтенсивного культивування, клітини збирають центрифугуванням при 2000 х 49, і супернатант видаляють. Клітини ресуспендують у свіжому розчині, що містить 5095 середовища Лурія-Бертані і 5095 середовища М5, з оптичною густиною ОЮвоо--0,5.
Таблиця 21
Склад жирних кислот загального ліпіду листя трансгенних подій Місоїйапа рбепіпатіапа (тимчасова експресія) і Місогйапа їарасит (стабільний первинний трансформант) з найвищими рівнями ЕПК із кожного експерименту 11111111 Морепшатідна.// | Моарбаситї7//З ши п ЕЕ пос Ж ПО ПО Як НО ши о ГУ я ПО Є: Ж ох ПО Ж: ПО ши п ТТ ЕТ НЯ ПО ТЕ ОХ ПО: Я: ОО явила ЇМ нн сх и По: пох ПО ся о ши п ЕХ Я ПО ТЕ Ох ПО: УР по ши о ЕХ ЕН ПО с ЖК ЗОН КО ЖК ТО нн хи Пс КЗ ПО Ж: ОО 22011 Ї111111111110211111111111111111111031 во Їм 04 нини нини Пи хо ПО МК ПО ши п ЕТ По Хо ПОЛО Я: У
Оме-| 20206. | 7777/0077 Ї771717171717171711100сссСсСС габ | 20306 | 77777701 11111111 00сссСс21С
Оме- га-3
Зразки листя М. їарасит, сорт МУ38, вирощеного іп міо, зрізають і розрізають на квадратні секції розміром приблизно 0,5-1 сме за допомогою гострого скальпеля в зануреному у розчин А.
Іштеїасіеєп5 стані. Пораненим фрагментам листя М. їарасит, зануреним в А. шптеїасіепв5, витримували за кімнатної температури протягом 10 хвилин, після чого промокали стерильним фільтрувальним папером і переносили на планшети М5 без добавок. Після періоду співкультивування протягом двох днів при 24 "С, експланти тричі промивають стерильним рідким середовищем М5, і далі промокають насухо стерильним фільтрувальним папером та вміщують на селекційний агар М5, 1,0 мг/л бензиламінопурину (БАП), що містять 0,25 мг/л індолоцтової кислоти (ІК), 50 мг/л канаміцину і 250 мг/л цефотаксиму. Планшети інкубують при температурі 24 С протягом двох тижнів, щоб дати можливість розвинутися пагонам із трансформованих фрагментів листя М. їарбасит.
Для одержання вкорінених трансгенних рослин іп міїго, здорові зелені пагони зрізають і переносять в горщики для культури тканини місткістю 200 мл, що містять агарове середовище
М5 з додаванням 25 мкг/л ІУК, 50 мг/л канаміцину їі 250 мг/л цефотаксиму. Після утворення коріння трансгенні пагони переносять в грунт і вирощують до стану зрілості в теплиці. Листові диски досить великого розміру одержані від 21 зрілої трансгенної рослини, і профіль жирних кислот аналізують, як розкрито у Прикладі 1. Виявлено, що всі трансгенні зразки містять ЕПК (Табл. 21), причому найвищий рівень ЕПК знайдений в первинному гемізиготному трансформанті і становить 12,1 95 від загальних ліпідів листя, причому зразки листя також містять невелику кількість (« 0,5 95) ДПК в ліпіді, що є результатом елонгації ЕПК з низьким рівнем Д5-елонгазной активності у Аб-елонгази. Співвідношення загальних 003 ЖК (зокрема,
АЛК) до об ЖК (зокрема, ЛК) становить 2,7. Обчислена загальна ефективність перетворення становить: ОК на ЕПК - 18,4 95, ЛК на ЕПК - 18,9 95, АЛК на ЕПК - 25,9 95. Продукування 12,1 95
ЕПК є особливо значущим, оскільки події були первинними гемізиготними трансформантами.
Зокрема, ефективність перетворення АЛК на ЕПК є близькою до спостережуваної в стабільних трансформантах насіння. Також слід зазначити, що конструкція не містить Д12- або А15-
десатурази, щоб збільшити перетворення ОК і ЛК на АЛК. Очікується підвищення ефективності при додаванні такої активності.
Урожай насіння гемізиготних трансформантів збирають і висівають для одержання гомозиготних рослин.
Набір насіння ліній з найвищими рівнями ЕПК виглядає нормальним, і насіння ліній 210 і 217 проростає достатньо добре, щоб одержати покоління Т2. Співвідношення ЕПК до вказаних нульових (відсутність ЕПК) ліній показує, що подія 228 була однолокусною, і покоління Тз було таким же. Аналіз профілю жирних кислот вказаної популяції Тз продемонстрував, що трансгени були гомозиготними без нульових подій та із стабільною кількістю ЕПК. Середня кількість ЕПК в загальних ліпідах листя загальної популяції Тз становить 9,4:0,3 95 (Табл. 22).
Таблиця 22
Характерні профілі жирних кислот загальних ліпідів листя дикого типа (ДТ) і незалежних трансгенних або тимчасово трансформованих ліній (ЕПК). Представлені види Місойапа
Бепіпатіапа (тимчасова трансформація), М. Табасит (стабільно трансформована популяція ТЗ),
Мідпа иподпиісціага (стабільно трансформована подія Т:). Помилка позначає стандартне відхилення для декількох зразків. Очевидна ефективність перетворення, наведена внизу, описує шлях 023 та обчислена як сума продуктів у вигляді ЖК/суму субстрату « продуктів у вигляді ЖК. 11111111 Морепійатіана | Моїарасит | У.шпоцісціав: 11111111 дт | воК ОЇ дт | впК ОЇ дт | вп 7160 | ол твихог|вохов|іівб5ов| 180 18202) 11111 лелом | зЗ2ажом| 2охо |ЗБом|30503 38 /20х09 717163 |в6бвжом|вбохом|Б2анов|Б5анов - | Дю- 7717711. 780 | зихо |З5хоЗз|гоаног|гбном 18 або 11111 Незначні | ї4х0 | 1401 | зи о4|25:03 23 |2БОМ ши о Я ПО ПОЛЯ ПОЛЯ ООН КО 11111 оК1111л | лом | го 1вноз|2ов 20 4318 11111117 (лабо тато іо |180 09 134 18230 11717711 АЛК (533 ж02|37202|Б22ні19|34006 586 380 ши о ПО ПО ПО ПОЛОН ОО КО 11лко 11 - |2гзх0и - |23ноз| - |бвх ог
Омегає 20206 | 0л1хо | - |о1х0|о0их0| - | охо 11 дК | бло | бло |. - | - 1 - 1 - 1 АРК | - |0350| - |б7жолі - ого 16дк | - |ї5х0| - |ї6жомі - | 150
Омега3і ЗК | - |о0о4в0| - |їтїхом| - |0Зхог
ЕКО | - |огжов| - 945031 - 702 док - |03х501| - |о045:01 - ово ж н-А НА НИВИ - о творен-| Аб-єло/ | | 8895 | | 8795 | (| 8595 ня | Абдес//// 777777 | 9796 | щ - | 9095 | 2 ющ | 9695 омега-3| Дбело | | 395 | (ХМ ОЇ 49 | (| лось
Зразки листя гомозиготних рослин Тз М. їабасит піддають подальшому біохімічному аналізу.
Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого листового матеріалу і фракціонують тонкошаровою хроматографією (ТШХ). Виявлено, що ЕПК присутня в ТАГ М. їТарасит в кількості до 30,1 95, а також у полярних ліпідах в кількості 6,3 95 (Табл. 23). Було цікаво відзначити, що
ЕПК, продукована трансгенним шляхом, присутня у всіх оцінених ліпідних фракціях зокрема,
ТАГ, моногалактозилдигліцероли (МГДГ), дигалактозилдигліцероли (ДГДГ, сульфохіновазилдіацилгліцероли (СХДГ), фосфатидилгліцерол (ФГ), ФХ, фосфатидилетаноламін (ФЕ), фосфатидилінозитол (ФЕ) і фосфатидилсерин (ФС). Всі пули ліпідів містили низькі рівні нової проміжної сполуки або 0б жирних кислот ДЛ-ПНЖК, із співвідношенням ТАГ нових 033 і б жирних кислот, що становить 10:1.
Стабільна трансформація вігни китайської (коров'ячий горох, Соуреа)
Химерний вектор РОКЕО4-11АВОИВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзегі трансформують у вігну китайську (Мідпа иподицісціаїа;), як розкрито нижче. Зріле сухе насіння є переважним початковим матеріалом, хоча насіння, зібране із незрілих стручків з максимальною масою свіжого насіння, також може використовуватися. Сухе насіння молотять уручну, щоб уникнути розколювання оболонки насіння, і таким чином зменшити інфікування мікроорганізмами.
Сухе насіння або незрілі стручки занурюють в 70 95 етанол на 2 хвилини, і далі обробляють протягом 30 хвилин в 20 95 комерційному відбілювачі (кінцева концентрація натрію гіпохлориту 8,4 г/л). Далі насіння кілька разів промивають стерильною водою. Незріле насіння витягують із стручків в асептичних умовах, тоді як зріле насіння замочують для набухання протягом ночі. Два різних експланти можуть використовуватися для одержання множинних пагонів, а саме, ембріональна вісь і сім'ядоля безпосередньо, переважно сім'ядоля з приєднаною, розрізаною навпіл ембріональною віссю. Пагони і кореневі бруньки видаляють з осі перед утворенням пошкодження в сім'ядольному вузлі, тобто точці прикріплення осі до сім'ядолі. На основі початкового порівняння 19 сортів і ліній стало зрозумілим, що більшість ліній вігни китайської може бути трансформована, і єдине застереження полягає у тому, що різні умови культивування тканин слід оптимізувати для кожної лінії.
Таблиця 23. 11111 хпороплаєтані | 0000000 Пезахлороплаєтдні 11 спомпаг|адескдг); є | ех | оз | си | вс. реа ре ве | міба реобвафноїюю зоря |магее| зотех|ятнх на
Стезях | рим 19618016 роси зв | 55 950153 ва абз овемо|ляни| опа || тв 1951 550196 98 ре ее | зе | опт || ле | є реяня| ма | рвя
Твена з5б5 | ма я арени пер анкет | мох
В ПИ ПНЯ ПОН ПОЛОН ПОЛОН КОНЯ ПОН ПОН ОН КОНЯ ПОН ек рек зло |з | зпж |з юне) юрверантр|еюі вт як тя овапох |азівк у ентя нав еегко згин |еелахі анти
Тако Гео |овоїна Твотня разтвє а ел |таіно|хапев | тяпея | зеіво
В ПИ ПНЯ ПОН ПОН НОЯ ПОН ПОН НАННЯ ПОН ОН НО
5
В ПИ ПИНЯ ПОН ПОН НОЯ НОЯ ПОН КОНЯ ПОН ОН КОХА
6
Гени селекційних маркерів Баг або Мрій можуть використовуватися для трансформації.
Адгорасієгит їштеїасіеєпо, штам АСІ1, є переважним штамом для трансформації вігни
Зо китайською. АдгоБбасіегішт, що несе вектор роКЕО04-11АВСОВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзей культивують протягом ночі при 28 "С на шейкері із швидкістю обертання 180 об/хв, суспензію центрифугують при 8000 д протягом 10 хвилин і ресуспендують в Середовищі 1 (середовище на базі М5, розбавлене 1/10, що містить 30 г/л сахарози, 20 мМ 2-МЕС, рН доводять до 5,6 перед обробкою в автоклаві, з додаванням оброблених стерилізуючою фільтрацією вітамінів
М5, 100 мг/л міоінозитолу, 1,7 мг/л БАП, 0,25 мг/л гіберелової кислоти (Аз), 02 мМ ацетосирингону, 250 мг/л Ма тіосульфату, 150 мг/л дитіотрейтолу і 0,4 г/л І -цистеїну). Експланти занурюють без струшування до бактеріальної суспензії на 1 годину після утворення пошкоджень в меристематичних ділянках з використанням скальпелю. Далі оброблені експланти промокають стерильним фільтрувальним папером і переносять до затверділого Середовища 2 (Середовище 1, що містить 0,895 агару), накрите фільтрувальним папером. Через 4 дні співкультивування, експланти переносять в Середовище З (середовище М5 з повною активністю, що містить 100 мг/л міоінозитолу, 150 мг/л тиментину, 30 г/л сахарози, З мМ МЕС, 1,7 мг/л БАП, 5 мг/л ФФТ або 25-50 мг/л генетицину або 150 мг/л канаміцину, 0,8 г/л агару, рН доведено до 5,6) для ініціації пагонів і селекції трансформованих пагонів. За два тижні з'являються перші пагони. Сім'ядолі видаляють з ділянки сім'ядольного вузла, і культури переносять у свіже Середовище 3. Культури переносять у свіже Середовище З кожні два тижні після видалення мертвої і вмираючої тканини. Перші чотири субкультури вирощують із селекцією канаміцином, і далі чергують генетицин і канаміцин. Після шести субкультур зелені пагони, що вижили, переносять в Середовище 4 (Середовище З без БАП, але з додаванням 0,5 мг/л АЗ, 50 мг/л аспарагіну, 0,1 мг/л З-індолоцтової кислоти (ІК), 150 мг/л тиментину або ФФТ (10 мг/л), генетицин (50 мг/л) або канаміцин (150 мг/л)) для подовження пагонів. Пагони перевивають кожні два тижні, до тих пір, поки довжина одиничних пагонів не буде становити більше 1 см. Такі великі пагони переносять із чашок Петрі в банки для культури (заввишки 80 мм) для подальшого росту в умовах селекції.
Більшість регенерованих пагонів може вкорінятися іп міго, причому рослини з утвореним корінням переносять в грунт і дозволяють укорінятися в камері з високою вологістю протягом 14-21 дня перед перенесенням в теплицю з умовами навколишнього середовища.
Для підвищення частоти перенесення гена у вігну китайську, до середовищ для співкультивування додають тіольні сполуки. Додавання І-цистеїну, дитіотрейтолу і натрію тіосульфату зменшує появу бурого забарвлення пораненої тканини.
Великі кількості експлантів вігни китайської можуть оброблятися за спрощеним протоколом.
Зо Коротко, протокол складається з наступних стадій: набухання стерилізованого зрілого насіння протягом ночі у воді; одержання експлантів шляхом подовжнього розрізання насіння навпіл, внаслідок чого розщеплена ембріональна вісь (з видаленими верхівками пагонів і коріння) все ще залишається приєднаною до сім'ядолі; інфікування Адгобасіегічт, штам АС 1, якому сприяє утворення місцевих пошкоджень на меристематичних ділянках, співкультивування на середовищах, що містять тіольні сполуки, протягом 4 днів при 25 "С в освітленому місці, ініціація пагонів і елонгації на середовищі, що містить селективні агенти, вкорінення пагонів іп міго і перенесення їх в умови теплиці для цвітіння і утворення насіння, ПЛР або ферментний аналіз передбачуваних трансгенних рослин, і скринінг наступного покоління нащадків за методом ПЛР або визначення ферментної активності.
Потомство трансгенних рослин То є фенотипово нормальним. Трансгени передаються потомству, і гомозиготні рослини Те» ідентифікують за допомогою скринінгу їх нащадків Тз щодо ферментної активності або ПЛР.
Із застосуванням даної системи трансформації одержані приблизно 10 трансгенних рослин на 1000 експлантів, що є подібним до частоти трансформації для інших бобів. В залежності від сорту або лінії, яку трансформують, даний протокол вимагає 5-8 місяців з моменту одержання експланту до збирання урожаю насіння ТТ.
Система трансформації використовується для введення бінарного вектора рРОНЕО4-11АВОВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзег ов регенеровані, трансформовані рослини вігни китайської.
Були здійснені модифікації бінарного вектора рРОКЕО0О4-11АВСВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзетп, в ході яких додані гени, що кодують Д5-елонгазу і Д4-десатуразу, щоб забезпечити генетичну конструкцію, яка володіє додатковою здатністю перетворення продукованої ЕПК на ДГК.
Конструкцію трансформують в рослини для одержання ДГК у вегетативних тканинах.
Присутність ЕПК була знайдена в невеликій кількості подій, що вижили в результаті хімічної селекції. Лінія з найвищим вмістом містила 7,1520,2 95 ЕПК в загальних ліпідах листя. Швидкість перетворення була нижчою, ніж звичайно спостерігається для вігни китайською, причому тільки 6 ліній були підтверджені як трансгенні. Це означає, що на даний момент невідоме, що саме спричиняло вказаний ефект, хоча цікаво відзначити, що більша, ніж звичайно частка трансгенних подій містила неповні ділянки Т-ДНК. Можливо, великий розмір конструкції сприяв бо зниженню ефективності. Крім того, була обчислена очевидна ефективність перетворення для кожного із трьох трансгенних ферментів (Табл. 22). Результати були високою мірою подібними для всіх трьох видів, з високим рівнем перетворення на ЕПК після початкової Аб-десатурації природної АЛК. Деяка міра Д5-елонгації ЕПК до ДПК була відзначена, незважаючи на відсутність специфічної Д5-елонгази. Попередньо Аб-елонгаза Р. согдаїа продемонструвала низький рівень ДО9-елонгазної активності (тобто, перетворення 18:389и12и15 на 20:3А117117), хоча в дріжджовому аналізі Д5-елонгазної активності виявлено не було.
Приклад 10. Тестування варіацій генів А12-десатурази
Конструкція бінарного вектора
У спробі протестувати і порівняти серії химерних генів А12-десатурази, було сконструйовано декілька бінарних векторів, які використовуються для трансформації А. (Наійапа і В. парихв.
Кожний з бінарних векторів руР3365, роОРЗ3366, руР3367, руР3368 і руР3369 містить гени, що кодують ферменти о3-десатуразу Р. равзіогі5 (ЗЕО ІЮ МО: 12) і Аб-десатуразу М. ризіїа (ЗЕО ІЮ
МО: 16), ії одну з серії Д12-десатураз. А12-десатурази одержані з Стгуріососси5 пеоїогтап5 (номер доступу ХР 570226 у руРЗ3365), версії Д12-десатурази Стуріососси5 пеоїоптап5, що містить мутацію І 151М, мета якої полягає у збільшенні активності гена (у рОР3366), І аспапсеа
Кіснухеті (ЗЕО ІО МО: 10 в руРЗ367), Зупеспосувзіїхї РСОСб6803 (номер доступу ВАА18169 в рУгРЗ3368) і Стері5 раіаезііпа (номер доступу САА76157, І ее еї аї., 1998, в руР3369). Десатураза
Стеріз є єдиною рослинною десатуразою в серії; інші є грибковими ферментами. Вектори одержані за допомогою вставки рослинної кодон-оптимізованої ділянки кодування білка, за винятком Д12-десатурази Стгеріб5 раїевіїпа, яка була ділянкою дикого типу, для кожної А12- десатурази в сайт Мої! вектора руР3364 (див. Фіг. 12), в орієнтації, функціонально пов'язаній з промотором ЕРІ, щоб забезпечити специфічну для насіння експресію кожної десатурази.
Вектор руР3364 вже містить химерні гени, що кодують омгаЗ-десатуразу Р. равіогі5 і дб- десатуразу М. ризійа, кожна під контролем специфічних для насіння промоторів (Фіг. 12).
Комбінація трьох ферментів біосинтезу жирних кислот, а саме А12-десатурази, ю3-десатурази і
Дб-десатурази, була розроблена таким чином, щоб здійснити збирання біохімічного шляху перетворення олеїнової кислоти (18:129У на СДК (18:4269и1215)3, Далі проводять аналізи для вимірювання рівня утворення СДК в трансформованому насінні.
Трансформація і аналіз А. ІПаїїапа і В. пари
Зо Химерні бінарні вектори вводять в А. ішптеїасіеп5, штам АСІ11, і клітини з культур трансформованої Адгобрасієгійт використовують для трансформації рослин мутантів Тад2 А.
ІНнаііапа, застосовуючи для трансформації спосіб занурення квіток (Сіоцдп апа Вепі, 1998). Після дозрівання, урожай насіння Ті оброблених рослин збирають і здійснюють скринінг на планшетах
М5, що містять канаміцин для селекції саджанців, які несуть ген селекційного маркера Мр, присутній на Т-ДНК кожного химерного вектора. Саджанці Ті, що вижили, переносять в грунт.
Після того, як рослинам дозволяють самозапліднитися і вирощують їх до стану зрілості, врожай насіння Т2 вказаних рослин збирають, і склад жирних кислот ліпідів насіння аналізують методом
ГХ.
Химерний вектор руР3367 також використовували для трансформації В. пари5 за способом, розкритим у Прикладі 4, з одержанням 12 трансгенних подій. Вміст СДК був знайдений в інтервалі від 0,6 95 до 2,295 в пулі насіння рослин, і 9 індивідуальних насінин трансгенної рослини з найвищим рівнем СДК були проаналізовані щодо складу жирних кислот. Одержані в результаті такого аналізу дані щодо складу жирних кислот наведені в Табл. 24.
Дані продемонстрували, що активність АІ12-десатурази, експресованої з кожної із Т-ДНК в А.
ІШайапа і В. парих була несподівано низкою, забезпечуючи ефективність ферментного перетворення приблизно 20 95 замість 70-80 95, спостережуваних для такої ж касети експресії в конструкції ЗА7 (Приклади 2 і 3). Причина такої відносно слабкої експресії генів Д12-десатурази із вказаних векторів є не до кінця зрозумілою, але може бути пов'язана з положенням генів у конструкції в цілому.
Ї навпаки, аналіз експресії методом ЗТ-ПЛР продемонстрував, що гени од3-десатурази Р. равіогіз і Аб-десатурази М. ризійа она Т-ДНК відносно добре експресувалися у трансформованому насінні. Табл. 24 включає ефективність перетворення під дією Дб- десатурази в трансформованому насінні, яка варіює від приблизно 11 95 до приблизно 25 95 в одній трансформованій лінії В. пари5. Це значно вище, ніж ефективність перетворення під дією
Аб-десатурази приблизно 795, яка спостерігалася в насінні В. пари5, трансформованому конструкцією СА? (Приклад 4).
Таблиця 24
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння, одержаному з одиничного насіння рослини Т/: Вгазвіса пари5, трансформованої Т-ДНК з рОРєРЗ367. СДК (18:403) позначена напівжирним зображенням шрифту.
Ст110-|СТ110-|СТ110-|СТ110-|СТ110-ІСТ110-|СТ110-|СТ110- лвла7 777710 | о | о | о | о00 | о | о | о | о с18303 | 82 | 90 | М | 86 | 75 | 02 | 98 | 93 | 98
Сгоо 7/1 105 | 05 | 04 | 05 | 06 | 05 | 06 | 07 | 06 п я Я Я ПОЯ ПОЛНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ КОХАННЯ
Таким чином, для одержання переваги вищої ефективності перетворення під дією Дб- десатурази, що надається Т-ДНК із руР3367, рослини В. пари5, трансформовані даною Т-ДНК, схрещують з рослинами, трансформованими Т-ДНК із руРЗ416-ЗА7 (Приклад 4), з метою одержання рослин-нащадків і насіння, що несе обидві Т-ДНК. Склад жирних кислот олії, екстрагованої з насіння Е1, аналізують методом ГХ щодо вмісту ДГК та вмісту інших жирних кислот. Спостерігаються підвищені рівні ДГК, як наслідок збільшеної експресії Дб-десатурази.
Рослини, що є гомозиготними по обом Т-ДНК, одержані і повинні продукувати вищі рівні ДГК.
Приклад 11. Збільшення акумуляції жирних кислот з використанням білків-супресорів сайленсинга
Конструкція бінарного вектора
У УМО 2010/057246 розкрито використання білків-супресорів сайленсинга (БСС) для збільшення експресії трансгена в насінні рослин. Для демонстрації того, що використання таких білків може збільшити і стабілізувати продукування ДЛ-ПНЖК в олійних культурах протягом декількох поколінь, декілька БСС були вибрані з метою тестування, а саме М2 (номер доступу
И178820.1), р19 (номер доступу Ау288943.1), р38 (номер доступу 0О286869.1) і РОРЕ (номер доступу І 04573.1). рі9 являє собою білок-супресор з вірусу кущистої карликовості томатів (ВККТ), який зв'язується з міРНК завдовжки 21 нуклеотид перед тим, як вони будуть контролювати спрямоване Агдопаше розщеплення гомологічної РНК (Моїіппеї еї аї., 2003). М2, білок-супресор з вірусу жовтої кучерявості листя томату (ВЖКЛТ), зв'язується з рослинним білком 5553 (С1ЇСК еї а!І., 2008), тобто білком, який вважається необхідним для одержання проміжних сполук двохланцюгових РНК із субстрату олРНК (Весіїп еї аї., 2002), або зв'язується із структурами длРНК, що містять 5' виступ (ГиКипада еї аї., 2009). р3в8 являє собою білок- супресор з вірусу складчастості ріпи (ВСР), який створює перешкоди в механізмі сайленсинга рослини шляхом зв'язуванні з білками Оісег і Агдопаціє (Алемедо еї аїЇ., 2010). Білки РО, наприклад, РОРЕ і ЕРМ-РО, із полеровірусів, націлюють на білки Агдопаціє, щоб підсилити розкладання (Ваштбегодег еї аї., 2007; Вопоїатіої! еї аї., 2007, Ризаго еї аї!., 2012). Генетичні конструкції були? таким чином? підготовлені для експресії даних БСС в зерні рослини, в комбінації з набором генів біосинтезу жирних кислот для одержання АРК (20:4258,1115) з ЛК (18:129и12), як вказано нижче.
Гени біосинтезу жирних кислот, кодуючі ЛУ-елонгазу Ізоспгузіз даірапа та А48- і дБ- десатурази Раміома заїїпа і бактеріальний селекційний маркер, одержані на єдиному фрагменті
ДНК з роР3010 шляхом розщеплення Ртвеї ії Амгії, що дає фрагмент розміром 9560 пар основ.
Ділянку, що кодує Д9У-елонгазу, на цьому фрагменті сполучають з промотором ЕАЕТ А. ІПаїїапа (рАГЕРАЕЇТ) і ділянкою термінації транскрипції/поліаденілювання конлініну (СиСпі2-3). Кожну з ділянок, що кодують десатуразу, приєднують до вкороченого промотору напіну ЕР1 (рВпЕР'Ї) і ділянки термінації транскрипції/поліаденілювання по53'. Три гени біосинтезу жирних кислот на цьому фрагменті орієнтовані і розміщені таким же чином, як у руР107 (Реїгіє еї аї., 2012) і кодують такі ж білки, як рОР107. Фрагмент ДНК також містить ген рЕР1:ОБгІіР:по53' з рСМ/141 (див. МО 2010/057246), який кодує зелений флуоресцентний білок (З3ФБ). Даний ген скринінгового маркера використовується як специфічний для насіння візуальний маркер, що дає можливість простої і неруйнівної ідентифікації, і таким чином селекції трансгенного насіння, що несе та експресує ген.
Фрагмент Ріте!-Амії! вставляють у сайт РіпеІ-АмтїІ кожної із серій по 5 векторів, кожен з яких містить інший ген БСС (УМО 2010/057246), з одержанням генетичних конструкцій, позначених рЕМО45, рЕМО46, рЕМО47, рЕМО48 і рЕМО49. Вони містять гени, які кодують БСС РОРЕ, р38, р19, 355:М2 і М2, відповідно. Кожен з генів БСС знаходиться під контролем промотору ЕР'І і ділянки термінації транскрипції/поліаденілювання ос53", за винятком конструкції РЕМО48, в якій ділянка, що кодує М2, знаходиться під контролем конститутивного промотору Самм 355. Ген БОС у кожному випадку знаходиться в межах ділянки Т-ДНК конструкцій, суміжної з правою межею (ПГ) Т-ДНК. Шоста конструкція, рЕМО50О, в якій відсутні послідовності, що кодують БСС, одержана за допомогою розщеплення рЕМО45 Апаї ї Мпеї, з подальшою рециркуляризації ДНК для видалення гену ЕР1:РОРЕ, Кожна з 6 конструкцій містить ген селекційного маркера Мр в межах Т-ДНК, суміжно з лівою межею Т-ДНК. Всі конструкції містять джерела реплікації КК2 для підтримки плазмід в Адгобасіегійт.
Зо Трансформація А. ІПаіапа векторами експресії АРК в комбінації з БСС
Для трансформації генотипу МС49 Агабідорзі5, що являє собою подвійний мутант Тад2/Лає1 з високими рівнями лінолевої кислоти в ліпіді насіння, рослини, обробляють за способом занурення квіток (Сіоцді апа Вепі, 1998) з використанням А. ішптеїгасіеп5, штам 5МУ3101, окремо трансформованої кожною із шести конструкцій РЕМО45-рРЕМО50. Оброблені рослини вирощують до стану зрілості, і зібраний з них урожай насіння Т: вміщують на планшети із середовищем М5, що містить канаміцин, для селекції трансформованих рослин Ті. Скринінг щодо експресії ЗФБ в насінні також застосовують як візуальний маркер для трансформованого насіння Ті. Саджанці, які вижили на планшетах М5/Кап, або які були одержані із ЗФБ-позитивного насіння, переносять в грунт і вирощують до стану зрілості для одержання насіння Т». Кількість одержаних трансформованих рослин становила 5, 14, 32, 8, 23 і 24 для трансформації реМО45, рЕМО46, рЕМО47, рЕМО48, рЕМО49 і реЕМО50, відповідно. На даній стадії було виявлено, що ген, який кодує р38 в рЕМО46, був нефункціональним і, таким чином, рослини, трансформовані вектором рЕМО46б розглядалися як додатковий контроль, тобто по суті такий же, як і РЕМО50.
Пул чисельністю близько 100 насінин Т»2 одержаний від кожної трансформованої рослини для визначення складу жирних кислот в ліпіді насіння шляхом одержання МЕЖК і аналізу методом ГХ. Крім того, 6 саджанців Т2 з кожної трансгенної лінії були вирощені для одержання насіння ТЗ.
Склад жирних кислот в загальному ліпіді, екстрагованому з насіння Т2, визначають за допомогою ГХ. Аналіз продемонстрував інтервал рівнів АРК і проміжних сполук ЕДК (20:206) і
ДГЛК (20:306) в популяціях Т». Дані для АРК проілюстровані на Фіг. 13 і 14.
Фіг. 13 ілюструє аналіз методом коробчатої діаграми рівня АРК в ліпіді популяцій насіння Т».
Очевидно, що медіанний рівень (50-й процентиль) АРК в популяціях насіння, які містили гени
ЕР'1:р19 і 355:М2, на додаток до генів біосинтезу АРК, є значно вищим, ніж у насінні, що містить дефектний ген ЕР1:р38 або контрольну Т-ДНК із рЕРО5БО, що не містить гена БСС. Середні рівні
АРК для насіння, трансформованого генами, які кодують р19 і М2, є вищими, ніж для насіння, що трансформоване геном р38 або не містить БСС (Фіг. 14). Одна лінія ЕР'1:р19 і дві лінії ЕР1:М2 продемонстрували близько 19 95, 20 95 і 23 95 АРК, відповідно. Вони представляють значення, що різко відхиляються, і таким чином не входили до обчислення для аналізу методом коробчатої діаграми. Вижила менша кількість рослин, трансформованих Т-ДНК, що містять гени
ЕРІ:РОРЕ ї 355:М2, в порівнянні з іншими конструкціями; вважається, що ці гени можуть шкодити здоров'ю рослини на фоні МС49.
Не тільки рівні АРК значно відрізнялися для різних конструкцій, але і спостережувані рівні в ліпіді насіння першої проміжної сполуки біохімічного шляху від ЛК до АРК, а саме ЕДК (20:206) були нижчими в лініях, що експресують МУ2 або р19, ніж у насінні, що не містить БСС або що містить конструкцію р38 (Фіг. 15). Серед насіння Тз, одна популяція, що містить конструкцію, яка експресує р19, продемонструвала рівень АРК 38 95, як відсоток від загальних жирних кислот в ліпіді насіння.
Ряд трансгенних ліній Тз прогресував до покоління Та. Рівні АРК в насінні Та, що експресує
М2, є такими ж, як і в попередньому поколінні, або дійсно демонструють підвищені рівні, в порівнянні з їх батьками Тз (Фіг. 16). Лінії що експресують р19, продемонстрували більш різноманітні рівні АРК. Рівень АРК був зниженим у деяких лініях, тоді як в інших він був таким же або вищим, в порівнянні з батьками 13. | навпаки, лінії, що містять дефектний ген р38 або не містять БСС, загалом продемонстрували зниження рівня АРК і підвищення рівнів проміжних сполук (Фіг. 18). У деяких із цих ліній, вміст АРК був зменшений приблизно до 1 95, і рівні ЕДК зросли приблизно до 2095. Середній рівень АРК в насінні Та був вищим для ліній, що експресують р19 і М2, в порівнянні з лініями, що експресують р38 або що не містять БСС (фіг. 17).
Даний експеримент проілюстрував, що експресія БСС у насінні трансгенної рослини, разом з додатковими генами для біосинтетичного шляху ДЛ-ПНЖК, не тільки підвищує рівень продукування бажаної жирної кислоти в першому поколінні нащадків, але і стабілізує рівень продукування жирної кислоти в більш пізніх поколіннях, наприклад, третьому або четвертому поколінні нащадків. Збільшене продукування жирних кислот супроводжується зниженням рівнів проміжних жирних кислот в біосинтетичному шляху. БСС р1іЗ і М2, що експресуються із специфічних для насіння промоторів, є переважними. Конструкція, розроблена для експресії
БСС рз8, виявилася дефектною, і придатні дані не були одержані при використанні даної конструкції. БСС М2 і його гомологи з інших вірусів вважаються особливо переважними, оскільки вони дозволяють максимальну експресію генів біосинтетичного шляху і одночасний сайленсинг інших генів в тих же клітинах насіння, що розвивається.
Зо Приклад 12. Аналіз вмісту і складу стеролів в оліях
Фітостерини з 12 зразків рослинної олії, придбаних із комерційних джерел в Австралії, охарактеризовані за методами ГХ і ГХ-МС. як похідні О-триметилсилілового ефіру (ОТМ5І- ефір), як розкрито у Прикладі 1. Стероли ідентифікували за даними утримання, інтерпретацією мас-спектрів і порівнянням з літературними даними та даними мас-спектроскопії лабораторних стандартів. Кількість стеролів визначають з використанням внутрішнього стандарту 5|(Н)-холан- 24-олу. Базова структура фітостерину і хімічна структура деяких з ідентифікованих стеролів проілюстровані на Фіг. 19 і в Табл. 25.
Аналізували рослинні олії: кунжуту (зезатит іпаісит), оливи (ОЇІеа епгораєа), соняшнику (Неїїапіпи5 аппих), рицини (Кісіпи5 соттипів), каноли (Вгаззіса пари5), сафлору (Сапнатив
Ппсюгіцв), арахісу (Агаспіз пуродаєа), льону (Гіпит ивіаїіввітит) ї сої (Сіусіпе тах). У порядку зниження по відношенню відносного вмісту, у всіх зразках олії основними фітостеринами були:
В-ситостерол (інтервал 28-55905 від загального вмісту стеролів), Дд5-авенастерол (ізофукостерол) (3-24 90), кампестерол (2-33 90), Д5-стигмастерол (0,7-18 95), Д7-стигмастерол (1-18 95) ї Д7-авенастерол (0,1-5 90). Були ідентифіковані декілька інших мінорних стеролів: холестерин, брасікастерол, чалінастерол, кампестанол та ебурикол. Додатково, були знайдені чотири С29:2 і два С30:2 стероли, але необхідне подальше дослідження для остаточної ідентифікації цих мінорних компонентів. Крім того, в деяких з олій присутні декілька інших неідентифікованих стеролів, але через дуже низький їх вміст, мас-спектри не були достатньо інтенсивними, щоб дозволити ідентифікацію їх структури.
Вміст стеролів, виражений як мг/г олії, у порядку зниження: олія каноли (6,8 мг/г), кунжутна олія (5,8 мг/г), льняна олія (4,8-5,2 мг/г), олія соняшнику (3,7-4,1 мг/г), арахісова олія (3,2 мг/г), сафлорова олія (3,0 мг/г), соєва олія (3,0 мг/г), оливкова олія (2,4 мг/г), рицинова олія (1,9 мг/г). до стеролів в складі і загальний вміст стеролів наведені у Табл. 26.
Таблиця 25
Назви за ІЮПАК / систематичні назви ідентифікованих стеролів
ІЮПАК/систематична назва 24-метилхолеста-5,22Е-дієн-3р-ол чалінастерол / 24- 24-метилхолеста-5,24(28)Е-дієн-38-ол метиленхолестерин кампестерол / 24- 24-метилхолест-5-ен-38-ол метилхолестерин метилхолестанол 24-етилхолеста-5,22Е-дієн-З3р-ол 11119 |ергост/-енЗвол.././:/:/ССГО| 24-метилхолест-7-ен-Зр-ол 4,4. 14-триметилергоста-8,24(28)-дієн-ЗВ-ол
В-ситостерол / 24- 24-етилхолест-5-ен-3Д-ол етилхолестерин ро-авенастерол / . 19 р7-стигмастерол / стигмаст-7- 24-етилхолест-7-ен-38-ол ен-Зр-ол 24-етилхолеста-7,24(28)-дієн-3р-ол
Загалом, серед усіх зразків олії з насіння основним фітостерином був ВДВ-ситостерол (інтервал 30-57 95 від загального вмісту стеролів). Для олій спостерігався широкий інтервал частки інших основних стеролів: кампестерол (2-17 90), Д5-стигмастерол (0,7-18 905), Д5Ь- авенастерол (4-23 905), Д7-стигмастерол (1-18 90). Олії різних видів містили інший профіль стеролів, причому деякі профілі були досить відмінними. У випадку олії каноли, вона містило найвищу частку кампестеролу (33,6 95), тоді як зразки інших видів загалом містили нижчі рівні, наприклад, до 17 95 в арахісовій олії. Сафлорова олія містила відносно високу частку Д7- стигмастеролу (18 95), тоді як вміст цього стеролу звичайно був низьким в оліях інших видів, до 9 95 в олії соняшнику. Оскільки вони є характерними для кожного виду, профілі стеролів можуть, таким чином, використовуватися як допоміжні для ідентифікації конкретних овочевих або рослинних олій та перевірки їх непідробленості або підробки іншими оліями.
Таблиця 26
Вміст і склад стеролів у проаналізованих рослинних оліях
Льон | Льон
Номер Загальна назва Кун- Соня-|Соня-|Рици-|Кано-| Саф-| Саф-!|, . Кнасін-(насін- стеролу" стеролу жут Олива шник| шник| на ла | лор | лор рахі ня ня Соя льонуульону)
Холо- Холо- дне дне пре- пре- сува- сува- ння ння 1 |холестверин.// 02108102 00 01103021 011|02|04|04|02 2 |брасікастерол.ї /011001|00|00 03|011|001|001|00 02/02 |00 чалінастерол / 24-
З метиленхолестерин 1,5 | 01 0,3 | 01 11124102 01 1,5 1,4 метилхолестерин кампестанол / 24- 5 мелимолетаня | 0709 03 01009 02 09 ов/09|02 ого 6 (|С292" 000001 021001|011|05105100|12| 13 | 0 (7 |Аб-стигмастеролї |64| 12 | 74 72 |1861071|70/ 46169 | 51 | 58 | 17,6
Льон | Льон
Номер Загальна назва Кун- Олива Соня-|Соня- Рици-|Кано-| Саф- | Саф- драхі (насін-(насін- Соя стеролу стеролу жут шник| шник| на ла | лор | лор ня ня льонуульону)
Холо- Холо- дне дне пре- пре- сува- сува- ння ння 8 Ц|невідомийї |051|1310,71 06 081071|071/7131|04|07|06| 1 9 |ергост7ензвол | 011 01|7,9/ 18 02104|27140| 14 | 14 | 14 | ТО 10 |невідомий.ї 100131 09/|08 12/09/1181 07|12 1 07105107 11 |ебурикл..//// | 16/18/4144 15110/|19/29| 1235) 3309 -ситостерол / 24- д5-авенастерол / дет |в || те| кю яв|ла|та|вв| ве вво| те ва. тритерпеновийи мот |00|г2я се м/оо оо т тео оо ооо тритерпеновийи 5 | 00 00|07 06 ооо ав тв о0|о00|09 00 16 |С2го" 1001051 07107 15112|281791|20|10|07|05 17 |Сго" 10109123 24 061|04| 131791 09| 10 | 10 | о 18 0302" 1001|00|001|00191|001|001|001|00 0010000 оз дет |» м вв меоз|овюв во м те| вт не 19 стигмаст-7-ен-3р- 22 | 7 9,3 10,9) 2,3 10,51 18,3| 11 7,9 | 8,7 | 5,6 ол 20 |А7-авенастерол.ї | 1301140 36 06102/|201471|07|04|04 | 06 21 |невідомийї 1071711 09/|08 00/|041|031|041|00 30 36 | 00 22 |невдомий 03100103 09 00100|12/731|02|01/|00 03 ) 24 |невідомий. | 001|31109/ 13 06104|02104/|07|17| 1908 25 |невдомий 09104103 05 031011|05107|03|о01|о01 06 28 |0302 /221|60|46|57 14|06|10|т12| 12 12 | 11 | 52 27 |невдомий 00104104 03 03102|011021|031|011|00 103 ) // |Сума (100,0 1100,01100,01100,0 100,01100,01100,01100,01100,01100,0|100,01100,0) те вв са Ге вт ее | вв|вг| во зе | «в | ве | во мг/г олії
С29:27 ї С630:27 позначають стерол С29 з двома подвійними зв'язками і стерол С30 з двома подвійними зв'язками, відповідно. 5 Порівнювали по два зразки соняшнику і сафлору, у кожному випадку один був одержаний холодним пресуванням насіння і був нерафінованим, тоді як інший не був одержаний холодним пресуванням і був рафінованим. Хоча спостерігалися деякі відмінності, два джерела олії містили подібний склад стеролів і загальний вміст стеролів, наводячи на думку про те, що обробка і рафінування здійснюють незначний вплив на два вказаних параметри. Вміст стеролів серед зразків відрізнявся в З рази і варіював від 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. В олії каноли він був найвищий, а в рициновій олії -- найнижчий вміст стеролів.
Приклад 13. Збільшення акумуляції ДГК в положенні 5п-2 ТАГ
Автори цього винаходу припускали, що акумуляція ДГК в положенні 5п-2 ТАГ може бути збільшена шляхом співекспресії І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази (ЛФКАТ) із шляхом біосинтезу ДГК, наприклад, наданим конструкцією БА? або її варіантами. Переважними ЛФКАТ
Є такі, які можуть впливати на поліненасичений С22 жирний ацил-КоА як субстрат, що приводить до збільшення вставки поліненасиченого ланцюга С22 в положенні 5п-2 ЛФК з утворенням ФК, відносно ендогенного ЛФКАТ. Цитоплазматичні ферменти ЛФКАТ часто демонструють варіюючі переваги по відношенню до субстрату, особливо, якщо вид синтезує і акумулює в ТАГ незвичайні жирні кислоти. Продемонстровано, що ЛФКАТ2 з Гітпапіпев5 доцдіаєі може використовувати ерукоїл-КоА (С22:1-КоА) як субстрат для синтезу ФК, на протилежність ЛФКАТІ з того ж виду, яка не може утилізувати субстрат С22 (Вгомп еї а!., 2002).
Розглядалися відомі ЛФКАТ, і багато з них були вибрані для тестування, зокрема, ті, від яких не очікувалося збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2, як контроль. Відомі ЛФКАТ включали: ЛФКАТ2: Агабрідорзів (пайапа (5ЕО ІЮ МО: 63, номер доступу АВО48392, Кіт еї аї., 2005), ЛФКАТ І ітпапіпех аіІра (ЗЕО ІЮО МО: 64, номер доступу ААС49185, І аззпег еї аї., 1995),
Зіс1р Засспаготусев сегемізіае (ЗЕО ІО МО: 65, номер доступу МР 010231, 701 еї аї., 1997),
ЛФКАТ 1 МогііегеПа аїІріпа (ЗЕО ІЮ МО: 67, номер доступу АЕЮОЗ33305; патент США Ме 7879591) і
ЛФКАТ Вг'газвзіса пари (З5ЕО ІО МО: 68 ії БЕО ІЮ МО: 69, номери доступу АЮС97479 ії АОС97478, відповідно). Вони були вибрані таким чином, щоб охопити три групи ферментів ЛФКАТ: 1) контрольні рослинні ЛФКАТ насіння, звичайно з низькою активністю по відношенню до незвичайних довголанцюгових поліненасичених жирних кислот (зокрема, ЛФКАТ Агабідорзвів і
Вгазвзіса); 2. ЛФКАТ, які раніше продемонстрували дію на жирні кислоти С22 і використовування
С22 ацил-КоА як субстрат, в цьому випадку, ерукової кислоти С22:1 (зокрема, ЛФКАТ
І Ітпапіпез і Засспаготусев); 3. ЛФКАТ, які винахідники вважали найбільш ймовірна здатними утилізувати довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, такі як ЕПК і ДГК, як субстрати (зокрема, ЛФКАТ МопгііегеПа).
ЛФКАТ2 Агарідорзіз (також позначена як ЛФАТ2) являє собою локалізований в ендоплазматичному ретикулумі фермент, що продемонстрував активність по відношенню до субстратів С1б і С18, однак активність по відношенню до субстратів С20 або С22 не тестувалася (Кіт еї аї., 2005). ЛФКАТаО І ітпапіпе5х анІра продемонструвала вставку ацильного ланцюга С22:1 в положення 5п-2 ФК, хоча здатність використовувати ДГК як субстрат не тестувалася (Газзпег еї аїЇ,, 1995). Вибрана ЛФКАТ 5. сегемізіае 5Ісїтр продемонструвала активність у вигляді використання 22:1-КоА на додаток до 18:1-КоА як субстратів, указуючи на широку специфічність по відношенню до субстратів з урахуванням довжини ланцюга (70и еї аї., 1997). Знову, ДГК-КоОА та інші ДЛ-ПНЖК не тестувалися як субстрати. Раніше було продемонстровано, що ЛФКАТ МопієгеїІа володіє активністю по відношенню до жирнокислотних субстратів ЕПК і ДГК в трансгенному Маїтоула Ігроїуїїса (05 7879591).
Додаткові ЛФКАТ були ідентифіковані винахідниками. Місготопах рибійа являє собою мікроводорость, що продукує та акумулює ДГК в олії, хоча позиційний розподіл ДГК на ТАГ у цьому виді не було підтверджено. ЛФКАТ Місготопах ризійа (ЗЕО ІЮ МО: 66, номер доступу
Зо ХР 002501997) була ідентифікована шляхом пошуку серед геномних послідовностей
Містотопабз ризійа з використанням ЛФКАТ2 Агабрідорзіз як послідовності запиту ВГАЗ5Т.
З'явилися декілька послідовностей-кандидатів, і послідовність ХР. 002501997 була синтезована для тестування як вірогідний фермент ЛФКАТ з активністю по відношенню до С22 ДЛ-ПНЖК.
ЛФКАТ Кісіпи5 соттипіх була анотована як передбачувана ЛФКАТ в послідовності геному рицини (СВпап еї аї., 2010). Чотири кандидати на ЛФКАТ з геному рицини були синтезовані і протестовані на неочищених лізатах листя інфільтрованої тканини листа М. репіпатіапа.
Розкрита в цьому документі послідовність-кандидат продемонструвала активність ЛФКАТ.
Ряд кандидатів на ЛФКАТ був вирівняний з відомим ЛФКАТ на філогенетичному дереві (Фіг. 20). Слід зазначити, що передбачувана ЛФКАТ Місготопах не групується з передбачуваними
С22 ЛФКАТ, але має дивергуючу послідовність.
Як первинний аналіз різних ЛФКАТ щодо їх здатності використовувати ДГК-КоА як субстрат, одержують химерні генетичні конструкції для конститутивної експресії екзогенних ЛФКАТ в листі
М. репіпатіапа, кожна під контролем промотору 355, як розкрито нижче: 355:Ага(й-ЛФАТ2 (Агабідорзіз ЕК ЛФКАТ); 355:Кіссо-ЛФКАТ2; 355: іта-ЛФКАТ (ЛФКАТ Іітпапіпез аї.ра);
З55:бЗассе-5ісїр (ЛФКАТ 5. сегемізіає); З355:Місри-ЛФКАТ (ЛФКАТ Місготопав ризіПа); 355:Могаі-ЛФКАТІ (ЛФКАТ Могііегейа аїріпа). Конструкції 355:р1і9, що не містять екзогенної
ЛФКАТ, використовуються в експерименті як контроль. Кожну із вказаних конструкцій вводять за допомогою Адгобасіегішт в листя М. Бепіпатіапа, як розкрито у Прикладі 1, і через 5 днів після інфільтрації оброблені зони листя вирізують і подрібнюють для одержання лізату листя. Кожен лізат містить екзогенну ЛФКАТ, а також ендогенні ферменти для синтезу ЛФК. Реакційні суміші одержують іп міо, окремо додаючи до лізатів мічені "С ОК, ЛК або АЛК (субстрати С18), АРК (субстрат С20) і ДГК (С22), в трьох повтореннях. Реакційні суміші інкубують при 25 "С, і рівень інкорпорації мічених "С жирних кислот у ФК визначають за методом ТСХ. Обчислюють здатність кожної ЛФКАТ використовувати ДГК відносно АРК і жирних кислот С18. Знайдено, що
ЛФКАТ пінника лугового, МогііегеМПа і засспаготусев5 володіють активністю по відношенню до субстрату ДГК, причому радіомічена ФК виникає у випадку цих, але не інших ЛФКАТ. Активність всіх ЛФКАТ була підтверджена подібним споживанням олеїнової кислоти.
Для тестування активності ЛФКАТ в насінні, деяку кількість кодуючих білок послідовностей або ЛФКАТ вставляють в бінарний вектор під контролем промотору конлініну (рі иСпі!). бо Одержані в результаті генетичні конструкції, що містять химерні гени СпітАга(й-ЛФКАТ
(негативний контроль), Спі1:І ітаІ-ЛФКАТ, Сп1:Зассе-5іІс1р, і СпіїМогаІ-ЛФКАТ, відповідно, далі використовують для трансформації рослин В. пари5 і А. Ійаійапа, щоб одержати стабільні трансформанти, які експресують ЛФКАТ в специфічній для насіння формі. Трансформовані рослини, що містять конструкції Спі1-ЛФКАТ, схрещують з рослинами, які експресують конструкцію (ЗА7 або її варіанти (Приклад 5), які продукують ДГК в насінні, щоб досягти збільшення інкорпорації ДГК у положенні 5п-2 ТАГ. Крім того, конструкції використовуються для трансформації рослин В. парив, С. займа і А. ІПаїїапа, які вже містять конструкцію 5А?7 та її варіанти (Приклади 2-5), з метою одержання потомства, що несе материнські і ЛФКАТ генетичні конструкції. Очікується збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2 ТАГ відносно інкорпорації в рослинах без кодуючих ЛФКАТ трансгенів. Вміст олії також підвищується в насінні, особливо у випадку насіння, що продукує вищі рівні ДГК, нейтралізуючи тенденцію, спостережувану в насінні Агарідорвзі5, як розкрито у Прикладі 2.
Кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки буде зрозуміло, що численні варіації та/або модифікації винаходу можуть бути здійснені, як розкрито в конкретних варіантах, без відходу від духу або контексту винаходу в його широкому значенні. Представлені варіанти, таким чином, слід розглядати в усіх відношеннях як ілюстративні, але не обмежуючі.
У цій заявці заявлений пріоритет по 05 61/660392, поданій 15 червня 2012 року, 05 61/663344, поданій 22 червня 2012 року, 5 61/697676, поданій б вересня 2012 року, і 05 61/782680, поданій 14 березня 2013 року, кожна з яких включена до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
Всі публікації, що обговорювалися, та/або на які присутнє посилання в цьому документі, включені до цього документу в повному обсязі.
Ця заявка включає до цього документу шляхом посилання 05 61/660392, подану 15 червня 2012 року, 5 61/663344, подану 22 червня 2012 року, 05 61/697676, подану 6 вересня 2012 року.
Будь-яке обговорення документів, дій, матеріалів, пристроїв, виробів, тощо, яке включено до цього документу, призначене виключно для цілей забезпечення контексту цього винаходу. Не слід робити припущення, що будь-які або всі ці питання утворюють частину відомого рівня техніки або являли собою загальнодоступне знання в галузі техніки, до якої відноситься це
Зо винахід, в тому вигляді, в якому воно існувало до дати пріоритету кожного з пунктів формули цієї заявки.
ПОСИЛАННЯ
Арбасді еї а!. (2004) Ріапі Сеї! 16: 2734-2748.
АРррбої! вї а!. (1998) Зсієпсе 282:2012-2018.
Арашпан еї а!. (1986) Віоїесн. 41087.
Адаба еї а!. (2004) Магіпе Віоїесппої. (ММ) 6:251-261.
АЇмаге? єї а. (2000) Тнеог Аррі Сепеї 100:319-327.
Агптьгиві єї а!. (2004) Зсієпсе 306:79-86.
АцНіа Кегебз71і єї а!. (2007) Маїштгте Ргоїосої!5 2:948-952.
Ваштрегодег" єї аї. (2007) Сит. Віої!. 17:1609-1614.
Вайтівіп єї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 225:459-467.
Вайтівїп сеї а!. (1992) Ріапі 3. 2:233-239.
Веацаоіп еї а!. (2000) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. О.5.А. 97:6421-6426.
Весіїйп евї аї. (2002) Ситт. Віої. 12:684-688.
Вегбетгісн. еї аї. (1998) Ріапі Мо!. Вісої. 36:297-306.
Вопоїатіої! еї аї. (2007) Сит. Віої. 17:1615-1621.
Вгошп еї а. (1998) Ріапі 9. 13:201-210.
Вгомлп еї аї. (2002) Віоспет 4). 364:795-805.
СНнартаг еї а!. (2004) Сеп. Оєм. 18:1179-1186.
СнНеп еї а!. (2004) Тне Ріапі Сеї! 16:1302-1313.
Снепа еї а)ї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657.
Снепа єї аї. (2010) Тгапздепіс Вез 19: 221-229.
Спікуатра еї а!. (2003) Ргос. Маї!. Асад. сі. О.5.А. 100:11127-11132.
Сно еї а!. (1999а) У. Віої. Спет. 274:471-477.
Сно еї а!. (199960) . Віої. Снет. 274:37335-37339.
Сіоцой апа Вепі (1998) Ріапі 9. 16:735-43.
Соши єї аї. (2007) Тгапздепіс Вев. 16: 771-781.
Ратиае еї аї. (2006). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 103: 9446-9451.
Оепіс апа М/еізвтап (2007) Сеї! 130:663-677. 60 Ротегаше еї а! (2002) Єигк. у. Віоспет. 269:4105-4113.
Ботегаце евї а. (2002) Єиг. У. Віоспет. 269:4105-4113.
Ротегаце еї аї. (2003) 9. Віої. Спет. 278: 35115-35126.
Ботегаце евї а!. (2005) Віоспет. .). 1 389: 483-490.
Рипоуеєг еї а. (2004) Те Ріапі Сеї! 16:11235-1250.
ЕІегтот еї а. (1996) Ріапі Мої. Віої. 32:1019-1027.
Ецітига еї а!. (1985) Ріапі Тізвиє Сийиге І ей. 2:74.
ЕиКипада (2009) ЕМВО 3. 28:545-55.
Сате? єї а!. (2003) Роса Рез Іпіегпайопаї! 36: 721-727.
Сагсіа-Магоїй еї а. (2002) Ііріав 37:417-426.
СіїКе еї а!. (1998) Ріапі 9. 15:39-48.
СІсК єї а. (2008) Ргос. Маї!. Асад. 5сі 0.5.А. 105-157-161.
Стапі єї а!. (1995) Ріапі Сеї! Вер. 15:254-258.
Наї єї а. (1991) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 88:9320-9324
Натіюп апа Вацісотрбе (1999) Зсієпсе 286:950-952.
Натійгп еї а!. (1997) Сепе 200:107-16.
Нагауата (1998). Тгтепаз Віоїтесппої. 16: 76-82.
Назвіїпоз вї а!. (2001) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. 0О.5.А. 98:14304-14309.
Ніпснеєе еї а!. (1988) ВіотесппоІоду 6:915-922.
Нойтанпт ес! а. (2008) У Віої. Снет. 283:22352-22362.
Нопоа ев! а!. (200г2а) Ііріаз 37:863-868.
Ногідисні єї а!. (1998) Ріапі СеїІ Рпузіої. 39:540-544.
Ногуаїн в! а!. (2000) Ргос. Маї). Асад. 5сі. 0.5.А. 97:1914-1919.
Ниапа еї а. (1999) І іріа5 34:649-659.
Іпадакі еї а. (2002) Віовсі. Віоїтесппої!. Віоспет. 66:613-621.
Удонапзеп апа Саттіпоаїюп (2001) Ріапі Рнузіої. 126-930-938.
Ка|Кама еї аї. (2004) Ріапі Мої. Віої. 54:335-52.
Каїїкама єї а!. (2006) РЕВ5 І ен 580:149-154.
Кіт еї а. (2005) Ріапі СеїІ. 2005 1073-89.
Кпиїгоп еї а. (1998) 9. Віо! Спет. 273:29360-6.
Ко) Ко?іє! еї а. (1996) Ріапі Мої. Віої. 32:393-405.
Ї аззпег (1995) Ріапі Рпузіої. 109:1389-94.
Ї еопага еї а!. (2000) Віоспет. 9. 347:719-724.
Ї еопага еї аї. (20005) Віоспет. 9. 350:765-770.
Ї еопага еї а. (2002) Ііріаз 37:733-740.
Ї емувеу єї аї. (2007) Ріапі 7. 50:240-252.
Г о вї а. (2003) Сепоте Нез. 13:455-466.
Ги апа Кап (2008) Ріап:! Сеї! Нер. 27:273-8.
Маїогу еї а!. (2002) Маї. Віотесі. 20:622-625.
Магаподопі еї а!. (1995) Тгепав іп Роса 5сі. Тесппої. 6: 329-335.
Меезаруоа3зик еї аї. (2007) У Віої Снет 282: 20191-20199.
Мепоа еї аї. (2008) 9. Сеп. Мігої. 89:2349-2358.
Меуєег еї а!. (2003) Віоспет. 42:9779-9788.
Меуег еї аї. (2004) Ііріа Вез 45:1899-1909.
Міснає!5оп еї аї. (1998а) у. Віої. Снет. 273:19055-19059.
Міснає!зоп евї аї. (199860) ЕРЕВЗ І еїї. 439:215-218.
Митгазніде апа 5Косяд (1962) Рпузіоіодіа Ріапіагит 15:473-497.
Марієг еї а. (1998) Віоспет. 9. 330:611-614.
Меєаієтап апа УУипвспй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453.
Мієд?2 єї а. (1995) Ріапі Сеї! Берогів 14:403.
Ом єїа!. (1986) Зсієпсе 234:856-859.
РаїКегї-Ватез еї а. (2000) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 97:8284-8289.
Регеїга єї а. (2004а) Віоснет. У). 378:665-671.
Регеїга єї а!. (20045) Віоспет. У). 384:357-366.
Реттіп еї аї. (2000) Мої! Вгеєа 6:345-352.
Реїні еїа!. (2010а) Меїаб. Епду. 12:233-240.
Реїпіє еї а. (20100) Ріапі Меїносдвз 11:6:8.
Реїніє еї а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147.
Роїеп?ла вї а!. (2004) Іп Міїго Сеї! Оєм ВіоІ-РіІапі 40:1-22.
Ргазнег еї а! (1985) Віоспет. Віорпуз. Не5. Соттип. 127:31-36. (510) ОЇ еї а. (2002) РЕВЗ І ей. 510:159-165.
ОЇ еї а. (2004) Маї. Віоїесн. 22: 739-745.
Ом еї а!. (2001) 9. Віої. Спет. 276:31561-31566.
Ведау апа Тротазх (1996) Маї. Віоїесп. 14:639-642.
Ведау еї а. (1993) Ріапі Мої. Вісі. 22:293-300.
Вобет! еї а. (2005) Рипс. Ріапі Віої. 32:473-479.
Вобет! еї а. (2009) Магіпе Віоїесй 11:410-418.
Виї2-І оре? еї а. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147. зага еї аї. (2006) Ріапі Рпузіо!. 141:1533-1543. зЗаїю еї а!. (2000) Єик. У. Віоснет. 267:1813-1818. зЗакигтадапі єї аї. (1999) Сепе 238:445-453. зай єї а. (2004) Стор 5сі. 44: 646-652. зЗакигтадапі єї аї. (2005) Аррі. Містобріої!. ВіоїесНнпої. 66:648-654.
Зауапома єї а!. (2006) У Віої Снет 281: 36533-36541.
Зауапома вї а!. (1997) Ргос. Майї. Асад. 5сі. 0О.5.А. 94:4211-4216.
Зауапома єї а. (2003) РЕВ5 І ейї. 542:100-104.
Зауапома єї а!. (2006) Ріапіа 224:1269-1277.
Зауапома єї а!. (2007) Ріапі Рнузіо! 144:455-467. зіпой еїаї. (2005) Сит. Оріп. іп Ріапі Віої. 8:197-203. зЗрегапла еї а!. (2012) Ргосев5 Віоспетівігу (Іп Ргев5). зЗретінпа єї аї. (2000) Єиг. 9. Віоснет. 267:3801-3811. зЗренпіпа еї аї. (2001) Агсйм. Віоспт. Віорпувз. 388:293-8.
Зргеснег єї а!. (1995) 9. Гіріа Вез. 36:2471-2477. зруспаїа єї аї. (1997) Ргос. Маї)!. Асад. бсі. О.5.А. 94:1142-1147. «аїКег єї а. (1998) 9. ВіоІ. Спет. 263:6310-6314.
Тпйеї еї а. (1988) 9. Віої. Спет 263:12500-12508.
Топоп єї а. (2003) РЕВЗ5 І еїї. 553:440-444.
Топуата еї а. (1986) Тнеог. Аррі. Сепеї. 205:34.
Ткгашймувїп (2001) Еигореап У. ІГіріа 5сі. апа Тесн. 103:45-55.
Тмгаїк (2000) 9. Сеї! Вісі. 149:707-718.
Зо Мепедаз-Саїегоп еї а!. (2010) Ргсоад. І ірід Бевз. 49:108-119.
Моіппеї еї а. (2003) Ріапі У. 33:949-956. маїї5 апа Вгому5е (1999) Агсп. Віоспет. Віорпу5. 365:307-316.
Манз апа Вгом/зе (19996) Агсп. Віоспет. Віорпувз. 362:175-182.
Меїів5 еї а. (2003) Іпі. 9. Меа. Містобріої!. 293:95:106.
М/піїпеу сеї а. (2003) Ріапіа 217:983-992.
М/іпапз (1988) 9. Васіеєгіо!. 170:4047-54. моса (2009) Ріапі Віоїтеснпої у. 7:914-24.
Ми еї а. (2005) Маї. Віоїєсй. 23:1013-1017.
Уапа еї а. (2003) Ріапіа 216:597-603. 7атк еї а!. (2002) Ріапі 9. 31:255-268. 7апк еїаї. (2005) МО 2005/012316 «папа еїгаї. (2004) РЕВ5 І ей. 556:81-85. папа еїаї. (2006) 20:3255-3268. папа еїгаї. (2007а) РЕВЗ І ецеїв 581: 315-319. «пап єї а. (2008) Уєаві 25: 21-27. 2пои еї а. (2007) Рнуїоспет. 68:785-796. 2пои еї а. (2008) Інзесі Мої! Віо! 1 7: 667-676. 7ои еї а. (1997) Ріапі СеїІ. 9:909-23.
ПЕВЕЛІК ТЕКПІДОВНОСТЕВ
«ау Мехвей вку СТ ; І диата Вихоакск зво Беуєїдюювевах сагсромактза й сокола кВ зе ЕХ а На ЖКРіВІ Кажееея пироавікатісв «АЖ ПпРиРОДУКУВАННЯ ДОВГОЛОУЧЦЮТОВИХ ПОВХНИНАСИЧЕНИХ ЖЕКНИХ КИСЛОТ У РОСЛИННИХ
КЛЕТИНАХ
«Ме ЧА «іх их 5156550, 355 «МЕ ХОМ епенЯя «Ка ух БУ, ЗА «Кай І-й «ЩО» ме ВІЗОВІ еАіх ФП ОБДВ хім ме 835785. «Ех МКУ Я «МЕ т «вах Вахавеви явпсія 5.5 еВ Я «кім СЛ5ІУ хі ДНК хаїїх щтУчНа поклідовнійте «аа й «ККУ БІРЗЯЗВ-ОАХ Муклибтивна пслідевністьк. «НЕЮ 1
М лзиЗвр. загасосата сгзсазакоца созасазата ааВехлікив ста ЩО звіаккнивЕ їакхсівака засщевккЕЕ Топка ХкассФеока веажкахкка 1 стсвзвакаєто зіазктсзаа «кова озаамсва кехаствоєі ЗаееекКни ї5о теку кх зежаадкияу скло лавЗсвкчка цес сснцекаа КЕ зпакавсвс вхзсвсоаіз збххахксїа ект озсзсах хаіаКЕккУ МКК 30 шахта їахвастса носа сахвавааст свтстсакяа заасутсВх ЗВО зевітавака ттзактвїта київ зезаххуказс зпавастака сцафаахках БУ касвадаскоа Ффезасазове кпазтстає оаааекЕкат состава жук кто За слосухзксете акЕВаЗавк став КК касова сок 543 театсвВнНн тазове Восстісква Зеаскасац зновооєне сем схя щі апкссссакх ссттавсцяз зопавсовак стїстоуккиз ссхсавасто коса ева ГУ фата а зоравамн зала ас ай зах асссах зацскацее УЗ весшеатисхс тадазашатс ззІзїсаалЗ зах сва саке: зак ация МЕН ак ах сзоатнезае засаоцеу кезатамне ззомаснзва зкзиасоа ай ваеакакака: зала тека зЗівссвааВ смак зпкзаасанк шврааНва М кніковакав сазосхсаВї заиацх ківаскасах запааакаа гасксваова ЗБ кс загс хх зсЗозаст Коста: Ззазаасека дахксицява кеВ;
Зсссоваева зазомслаіа зитаасаооа зсцанауєеє аазеккцаноа скло сва ЗИВИ зстстазауа азслехнцв стає месинсвасаа пектвааваа авссвоЗоса. ха зазасозсах саавакссве згорає ва ассотсетоао оакавкака зерттцева БВ розм хесаєвистс звсоааавки завицтссоа ака свеаостоа ХА застосу к сеакоувзво заатесовка заховав так дхккахеккс зтохтцаасх УЗ «зїссакакх хапктксЗВа саавосакке євазсВасво даренвіцах зага косса іхща зсасасатай зЗадхавстсс запасних зсвЗевазай кіс геть аацося Ба вс оЗатя тачнааЗсх дхаззатсся сс яЯ пстсВосагО сома МН заааксстусвя зсвхвацаає зкссссвовс тсазавкист созессоває аби цая в: часайицсхо бзаосатУми хсвацест) здазавкоасв тера кки зма юе ЗвоВ хкаскносвет свосвссаукх зстасваос зтухалавав созсвоаксх акоВоакЄ ЗАВ сиза твИ созсзжсока сосвзсоїсс ВеалкжкКВа сссазоацх пекла вука їм ивасвнасї сзтдаоцкіс зацазса апихелясав вазсадтаца ацизи ка 1805 певссавнао сстсвокаци позеттаоає соус виоо Задана япазаате ІБ сесвтсацесх зазоаннсв сажки акне канссщеваа свкаассвкВ ЗЕ ТОЕКИ Ма стати та схе кза стосухала ацаксстсов зхатЯсЕЕКх ваТецихЕ 1558 зІжснчсза Зх пз анову сЗазасах Зах твате ЗАДОМ що задамви:х зга сапаатняят затоками сосвоотовт сакхам на їМщюЮ крою діяти заз то зацоаЗазхиз сзазасвина звазайнкай ЗО аск стфовтоста сзкзкавсої отадккантв ссср аву каже хкнеа Ти? закциккткт ссвзайака вими ававе фтамекксВх заазітялаха дайнайвкає ТВО кжактнЗиКе Зпїстадааи Зоо ацкацниО ЗОМ ККККЯХЗЕВХ ре казанок ї зсосстактай «снів аластттавЕ пгожаєтсва тиха Еа БЕЖ хихзаахуса гвакна зсусаваа авозтваєве зталакаєх воачиаеціх НО кеІкоаЗасса ЗІооахя зузоасвваяє МевацаятаВу Зам ника ядвасоВх БІ упав жо бещцуМикоа яісстяЕте) азаатяхите гуТтлайвах досчдсеевії 58 кхпанссвва Заааасаких аавзваяжсВа КаксевастІй статева захациаВИуЄ БМ пиахкхацовЕ ставав ква ЕКЕНОВеТТ заходах тещадаєх ЗМИстцЦеКИ ЯКІ какакзавах сзсзватзах ватажка стакктоцсс стзаевааас Крскалтках ХТО так тактви: зесхвозома кацакхкзсо заїааакаха сссссВааза зжакткахий ВІВ тесеакааих захсвозу кат нес зозтотааее св ете совкааак БВ зам есах зивахсаєаЗ твиадесовя ттсзаааата кеВ здааасащаа За зас мк ккв соігааааца яовстаук васасетВКа ЕКЗ БНО ззкхзаазває суаааккткк свтсоааата хахвазисхв згагажакак минали ка ЗО хаствттему стаж австттскацх зЗактасеве Фттзстасаа ками ЗУ осв: Коаусатаха свтзгетала хикакчкКтї дгзааасвка ахпласевов Іво завЗавосазжх сакасачцики сафстсвакад «кксскксВЇ фам ха касназснця За чия яса аканутнсся воавсааєня всявслзаея асхммаєаах ак сВ Ум зітмгсатас сахуавактс дессашесис тестах остова саВеасцетО ХО статесватас каска стусЕ сом кех тобетостак ММК хаие дозах 3950 зезабкетах сЕККБстаЄт вскадюннст сосстсвКОк КАС ЕссТ возостема 5355
МЕЖ ЕКЖХ БсхЕЗсТІВс бхКОкІВтсЬ стацаВсвОу ЗК возах 355 кссскайайс сзізваоЗца саацассеВї ссстТЕдай цк же О сті кака ЗО зоакахтккх гато пехкісжеВ пОМнлияя ЯКттЗсатає аа сктаки ЗБ мижакавнцюз сестства бавнвсооК асааєскияс то аи аквосхняци ЗУ киаксхоаве стає ззсввозесх акдавктсве фоажацекє азсвищетоє ХУ ккаацомЗа Тобізаскав КЗ сВкК ККакуККІВ ссзісясоЗа хКкяКсКсКВ ЗВ заакстресо за какх кассвастс сток СОеВТВсКМК ХК КцСКе ню ткнвсїкста заїїсакеки суб Буваєи сегнствІ БаМНилесх зу кеска ЗО звозвсовова аакташнирвь вамраскксї зво ваз ахаклжкнох свзазтосаца ад тестову кихкахаве сттскокВнО стае Всет Котстясешт Веафетосвх ке зссстацкхх хашокхсва стоскошеме сщївеаі саКтсжЕекк Віа тоВ ня звазсмиика стакисвааа сапсаєеста сам аа есосса аогоуленех зго ідіцакаця ссоивооаа) але тзат зазасваєскс ховстастс ах ацка За айкомсо статавтатайа казка кове сВїсоеаа кацуюмнає Яео хаказкихат тзаессмх ссзтвеза каамамккес ссожіттава зп ККВ БАН ака: зізщрЕс сиза Кх хлахзавних саїматааах ках що как зв зЇїзстааке аква мх зЗакткайанах Зеасттакає саке нцЕє ам чВазкиназт звіїзозкк хата пепиухусвав соезасттаяе зазор Е АБ «кктжкнаКх стадах зач стук Ісхїа заааВачьося скпахвЗщаЄ БЕ зккаскива звоетавсї засво тася патацивтос зусеВсвоао зах 4580 пишщеххат сабозсфсомх хесвивеак: Казазстіс сомлемеаа спасає Ятща сааткахака сзсзсвтоса стахкВсВсо кЗатовкках щас ухахацкке Я80о зузаамтайс ссвтсссве кахескттвс бсааасаци тив впадин З85О ттзавазсах псасуадоде стукивеввс забеасеааю всивсваво загадках ЗО вктисааїта сакктасвай свссапнося цес аа данстетиве а ЦТО ЗК сЕсстссіВе ОкЕкаНеКЕ сзсоаацкс вів тех аЗацоисцях неза даце м статку зщаїаОцЯх хасовсавеа сжаасккєсвх калу є сспоцтоцаа НЕ ливтсяссгох тозссаак ЗдаастуВко стасезакцє тясвацеаа Моска У пвхстостаа ЗЗсагала ас ті СКоКкшекОк Хе сзсааОНах яко хсхстсстзЗва заооах стві рто Вл кааця ЗО певкккпаВ Бае сени кнаАх ах котстЕсстих аКЗККНСЕЕВ сВодоКеКх сечо БИ ствтЦсатажх кс сх ЗстсттаВех боса сВосжКесЯкк жен ссхя ОО чектммкаає сохкказоав ззасзісозах пасів епоха сВеКВКе зво тсвсвмаааа сактцроекс звозаавета сс ЗМО а СссОЗВВ 5525 заацуст такхтзеза ста ссази вузов ссакастАсє сет 5550 ман сокхоа і Зам оикх сс масок за тО У тла ай Зхстслеое аа иХ са ТеТак ння сек З сЕВккаккак сохестец дев ж оса ка сКхтовтсст здасакакух КЕ ккайцактав зсастасорах задкккаств фостсодаєх сазвевенра сухих козах ЗВО зсссхоккох хлвстВвовух ЗЕхоВакаоВ ТО СКОЯ ХЕВСОЕВ асцит оацє ка зонти х песо кК голи сІжсва МН КККСВ ТВеТІЗОККе ска КЯ ОА зацествасов сиза стаєск сзоцстовах асвукасквя ссасастаєх ааптцессе ЕН «акстсвщоо стохваккоа сзивеавсвх ак оннв созоасав какао ЗВО несстмеа? доска зовевосоюа возтсостки Зазазкхани сито БУ ззвхосасца аськсактвс за аово света зоихаКУчех ака іщо стаз кзасцІтосос сами ско зоаовазах казка тЗа заст кай Бе маска зклавоттесх хаавакхав атескаєках сус аБаактакна цю татка посазаттас казино баааккай сехцеватОс зво хках ЯН ткакдацата сист мо асазачсс сосайкката свтттаатає одаказлни ЯЗ зсаааакахиа зсВсЗсваає казцакаваї замовляє ее акахкастяц ап зкепиккаах слав аакхатахеї поко мааКкх веб масляне НІ заз аах саннрссаваа фасадна сата МАННЯ ВІЙТВЕщСКВ МЕЛЕНИХ ВО ттзтаоаахх стскксвааа вакахкіна алла я Все сама кАх паКО жтсокхадах зі спакктутаАх сатани Хата каспамеАКх ВІТИ тсткатав сезЕсвстаа затв МЛК Х СІТКА Е сакацуай тн звжсжкаттаа зако ахккиктсс звана хпиважжткв ака ллака ня зіїздатаза асихахсвтж замах сзтавтаахк кхінтасктв збтзсвавах ЖК тен тавик міна ннок зок ааєев злаеаєтаакк зайкоактая затзааеааа ково хассвтатаї байбанняй кет стах зазазЕатт база сани лк залаззаттз вет хакти зсвовтатах хеасжівтев зааюмаояє зааткаВаах Та5О тазиатаиеа тфоажетнвх абзазазааа стацаааоса сецваааесс засада Іо зассзатсса аассовтвія че тда указ еху зтвтааасто закладах ОВ зссацє вапсєпілнес ЗсЗЗеаас кавових св заатавтаки лавхтансие "35 тона стабяваттх тусаааатоа ахсляцеста ато вка атвхяавХхХ МАНІ захацевцєх соки о піка тума пІхтвстеда Бестааивя зІяжхсссВАХ Така каїкайтаак кіжкастзої зада ЗсеЗсоЗх зказкавє свозвізева та звозассатаа забор дсїсорагаха квоЗааацаа сазактатект тввазваЗеа ТМ сайтах коцизсвзаза зам заки ВІ КехтвивВкЗа зсаоосев ТК тазацвасов кизЕееоь МКК кнВ еВ сек сама ГЕО сааптаиках спиріваєтє сини зЗЗакавай сссововоем сатана що леви хтваХх стааааасса ззавсвтвс звісакааєвй кессвтовє СМ тт зиххніІсасу зесзаакх сишасвсвж сммаккакес свтссттаає акекайках ЩО
ЗестттятвВс Часте ВссВсКВстЕ слазаютасо сзозсїамхто кіс 78553 заскзаснтс застав ЗУ Ве пухка ска цк ННІ НКККх тах озутовтдо зссаскітес паВожеотОє коствтссст соток х десстесе ТОД зугтВсхоа спусасестс сао КВТ сок мккаВ тот БУ тсамвезє абсхассох Мости ССС СВе секевчне ооо Во арка ках какао смак Х сесосах дпоссоват зале кай що заєсакакца кави свои тнЕеЕ таазайлеяи звазевеаса тавкакттк КІ медики тс стор КК сКХсЕстофо КекскужКкс ето КК ХИЖКХИКККХ ЗК ктнсвястЯт сзсозставхх савизезеве касах вїтартаєка кквхскитоє БЕК киласноств ЗеЗоїеЕКх КУєВоЗВтєВ аканта є сесткха хевоцтяхех СУБ хЕвзасттсВ стссзаих чіхоовста суцанунеою ЗВеаслаке зтЯуххстся а акцезсєню ззаакяеккся заеїстксваа адпстянете ЗСаакКскє ВсОЗтЧгоЕ ага сова Зсї стсссативх тітсліВава спосо стек княс вхо озах БМ чаозтссет замогвно зпюзасаса колпусстсоа сзЗахксако зво ЕК «тизацактс соваписесї Зісотадіяй ЗсяЗсвосво ска и ЗабсесВес ди свасвісаї зам очисних зававса зІчсостоа пуаазшин ззававоЗВас Ж казсзЗЗкїЗв свзадоахсла зЗовсзвас ситу роз заакавокхВ двахосаЗВВ КйлО аскксщкаво соатахайнк зоваЗтуацО Зал тег леваняяся Вадо ашисженаї заїсстмЕк пісувазвса зопсхазави сссаЗпаске засто ВО айсккнохав свссауЗика мкс ссв зхацкикияи засада дапацалаце ВІВ спхковацех зухдааакай Фнезкозаа зказацкх кава спадеоаха чо зеакцаацах сппрхнаств зосстетест гтоааммєскх саЗслотота ззвазсовай чо зкслтвтстс Таусатуміа кссзатазсс товсте тазсакаацв звасхесу що ктдавотяво сазесвізас «аа зузасссвтс саасоотакс зухавсссах За ссдятватуво задавав акукккасях ксзїзсссва звазсесасхк тост З30о пвасвиоя глоцаасас зказомачас свзвасвасоа аскааоваз сесугваоа ЗВО вир тоб каце кспаленхва ЗсЗаевасвВа адакаикках ЗВО ІВ нюсисцІана зсатаЗаєть асан сет таас аокшкткацое пасма За назисассст змі ката акстзасвес теза. кІссцанцої зксоааосЯ зад фекКк І ткана касаВоЯетЕ созміасоєє сайсщіске забазайсек За тка свзпратскаца саке теаощса КВорреааеК дкааацуваа ЕН
ОЦЕ ЗВТ К сеККНККЗЕ сФотааккаукх Зсванасеех тофу РІО чаті ттта зимова зад ката Зо ваков сЗВоасетоаЕ Фаза ЗК аішчнннї сататаохцо авасхнацуа аодатеух застав ВЕЕОсаНВ чо ствсВостцО пока Япехасасах Ван песизакає мм хаха жов таезсМмгВт гетааснкя сасозовата сазхатцеся ззкажекттає казник КЗ ззізсзаву фоакассуза зстатсттак сек кхстс т таах крики чий ззквствек какиххоЗсо зстсзтаккк зпахсккЕЗВ зодсвацака зазкеВаа ода згосставах закханавсов топа маєс стасвезит) Фзопаккайх хнасоссоВа ЕВ здазаакаки: застстста зда нЗи свиню взда задсакацьс звссвоааеаї КО затадасааа алотосвоза зсадоаєскав зааааствоає заковасвхх свозетстата Мк ккзоаааакх хахтзтсста зе е сВТсстсес пекло КвВ СТИХ за кедоцаххай созуваавея згхЗуЗаєк саЗявесека кс ас еокод Не какхтсацви КсбтодВаох ЗИХИХКтвКя ВСТА КЕЛОуКСтОВ ЗВАТИ Х МНЯй кеакаскивс часта зх ніс балет аци сут яВЕВиЄ Мен мРНК капихоачацс вісоасЯ зсоаххвУ асмня водо Наня НН «цкхкссяцт оз пастхеаї пера стосу КК МО месаттев воски тіацаА пт сте ХвахосстО згоааих мо сихацнияяя покра акстставої згадати знососвсвх МЛК Х 15 смисл Ах сватссвсза аслакцкнов заМмацааа хескесятах какао маш «ака вхаЗІ стевссутся косахаатаа самих схссвловоа Зате х ев свмасасзає бакссовацо спсакоаняЗ сзжщваа заакткккцю ТЕСТ МИ «сах ати котсв фосоаокку кові КККОахКувЄе КосЗевазах ІК зттсодаас каско зсбчмхахх зевавевссве Зукаккаюк воцасствВтЕ нен зва ами св зстткзааах чсЗщеХНхся файасоаак часу внА те Ме ч«ассвсвтза соддасхеса зе озавсзаанс заз КаКеККхсяя 1.53 зак кчане кесясагкЗа Зо єВа стяКоКекО бога оКсЗКВеВа Мага риніт задавав аісткаєса «тс свав кабпацанхх ЗЕЕКеКа МІВ ха КХХОсІ натстстсО саакуахни «те ТОВ дкАакоцтзкО цтсжстоЗВ КЕ пс Ккх ЗсоВестоВЕ ЗМеКаКовВт гема стає КОСИ ВИЄ ОсКуКОССВ ЖБКюЮ айкхккссвнн катсзтосз: Зскаанктод тост бсхсоста тота НЯ крах засто суфікс сосоосоаке ЗОНИ асом му 1550 хахЗочсозв «ас саахтсвстї сітОсттсза зеккжетаЗс зоаааакааих ке кснтхвазКї заастосаа дксноваєва тозааевнх са сваВЕ БМесавкац; 1щмО схвсвЕсЕст таззодаавкаа сЯТВасоЄВ Міаааекиха ТІВ ЗкКхававния 1КМчЗ каВтуттанст тттаЗатмк зхвсВетва лакааєта вобтсаееа сксваретвух зі твІвтсцааа стакскохах чести кайахааест тощо ккхасвуВае їхаха ствІзатсза зхаахказта стсззстава сту нева ттаактовав ав асо БЕдяа сксваваєса стадах сзвссозавса дахіткактикт зм ах кессаКсЗВХ Ура зам леса ктситскисе згесвсаках ссссксіова зсідання свссхщВх ї2кю мами есх матхночкуЕ сасзазакан засссзгока зковкєвня стозавааВ КІ зсзадаас сотксосстс самжекеве зсздсовсса ткхамехсовес сзфетоссоє дю ткатаааакаєс соссжесзсв всасккаав сзтсвтсаск акт екаї сеажескава мо
Захакксякх бттвгазсвза гтассянсова сзаасаваєна саазозаса МасаакинВся ЕТ тухасвяхев севтІаехам севсстяцсо сток хаось зад анх хкхахкаКа МЕНЮ миснтасхою Іа актдає коттотстх пеайпконУв зоатовеах асан остВ та зхехсвссят сусошасах кстоасттасо аехавє ТЕТОЖЦатКЕ бвшссето ї292о
Фосастса вето х кові тосоао даанаваєос саєттацокх стояках 0 35585 зесвІзозаа пса паВтстазаа сБІстяНЕВ сеапмкцуВ готи. їй «кастовоої ЗастЗсквсх дстЗатовцв ЧатнсстЕсКа ЗХ КНКЩИЕ ВодзЕсВЕКа ЗЕ визкзуїасс БМК сота схостежЕс паса вас іх
Інк ссітов ЗТстцскаКх КН птхнсахеит їтасокоЗЗя ввозЗеЗсвК 1750 сит Ве сект хукома мл ялня стсттЗІсЗО МК ханевсе смак ідо схавссавов митне зада их стЯствасеВ Хе кОЗя СТЕ ХА акснатеоо зиаистахи вто стсзвойоса хазховкаєв сассвесво МК акаствзсоа мионкану звжосідакх два той саціасксхх возом ХиНюЮ кхаківеое Ода ВОВК ссрацкакою МКМ сетуціоВОВ КНУ «тастатвсвс Фтїсаавекк ХеЧЕТосвсВ Как З ЄМЕ кове кх ною кв запасне ато етааа ссхоаснм агскеиах зостфевм Ка НОХ Іо тезскЕшкт пестзЗато пт еи СМ аєсск хостес зма хаєку За
«Екщема: состокаєх пкхатавста Заїестійера ситеккеке мета зд тскжсснова сттсдадовж схтасхссво Зіафассвоа копахккнсо зобов 13320 «хви сВестекикк задховозао смааааєтько стстявсЦЕї дозах 13156 тЕКХКОстас теттзасовк спакхсяВсВ еоаваттоа Зсвусясжкв ЗМосемадая їла хіт ЗТТстакких зоасетост сук кай засшчвинлі засостадая НЕ ззахсокв сзадеаскак скхвотвтсок октави кастестаск скидодлака 13 тет ВООаяонННнНІ «схо ста вок КЗЗ ках НЕ зваакавтва соутааника ївтстватаа їаахлахних завмресвсва зубниханка МБО зеФеоззсоз заазатвтя зтозосеаух ааспаВхВиє ост хе 1740 тсзаїаззтсх асдааксска хОдтеткАак зх х заатсараа сих ВааЕ Маю ствізвазтва сстескантооа фвозасаає атіксвтнтс гавкати сцтттсЕ ІЗ85О) сссзаатста ставав зз3вгсаазка ссвссуавев стлстокаає свтссстсва хазхО звастттзаа акдаакаясв мрирасаж казок замаачкккав зеоазаасавма еру там аваєс равтвктзсвя їтатізактха ства дадієленаї состава Ва тела иай селсващєс зада сЗцс сама тва зсадевсзос завада 1 пфастснеоаа сан ЗЗаазаксто затсозасво олово ак Я схцакшккває срсстаса стахуказат сабатссахи зКкКЕЗаВх «кдцккакка ве КИ ккд кКхкоа ста поні ЗеВа акатоаакій сс зна тавннй іа твасссаннт аа а знассваа аашакаксс заафоакає КеВссВІТО З4333 саннивтсвиЕ зааатастка зсвезЇтОка кісссасяся ттзекааавк ВссЗВТЗТа Ка квІсчнисцс засл зхвзІзскак ха сс звазарааккх сщсщавсс Жако свізсзазаУї тазгактунс ззссссаккя кіст с асфатахава коша оВее ВУЗ созатстсвс садакхквкс зсясзвскса кавсксвкХе зсасасекка ваЗадекаВй ї585 свссвссзва зах сзаїзссва пидсизсваа саасаднсний СТА, ВУ вевстївсва грассвхвсс ВІК сеЗссціає За иставх сотазоаака вою сваовісттс засада сясс ЗаЗезацазюя сессяззаО Бекассавт всосзаєзова Ба саке МНК ббоассися ЗОВ ВЕСК ООН КХИТе СОВА ВАВХ 385 чЧеЕхзсозаво запахи Вщлетоких зетнощЕцЕ смкшаАТаХе ТОБ ВО тезксвосво засуха с свтаадакоє ХЕтНсУстИй СОТОК сасВеота 340 аклзсвтсве сзавехкнех стоком хітасакЕта сісалоЗа схттесода АМУЮ педа сКо соби свІшаотово дахи Ве ах ХЯХОаЕКВ БО змен ехт соптасасЗ зоссстсвИх сккакхкКВкх заст как КЕХНЯККОХВ Мов зочсактитка соззаазак свтввачта стацабаках звсезоахх акта УКНД те чижак саавЗащнаа скпавнинває стафцааеьи сеча КОМАХ з акхстанеВ ктстесастт заайксясхеЕ Зк к куккллакай соток 5303 раси жня сетстесах мас асва воза соках Ех кеКтоттоа КК замниасив стсвимт асккккссве КСО са западахцєх стствоВе ще
Химия Ксттооаае КЕсакскноо ак КАКЕеХУКОця Грав аааа ВМО теп ака ЗесссЇвкк акоаакхУаЕ спека сВЕКОццІх ЗвссаеТдох тую хспстжтсат свеафТсОсттЕ габкасвств атсстактах зостснохво засос ІВ вахадасттт «зстазоцек зкІЗкечста ставспакац але ксЗаа тісаксовах МІУБЕО сЕсЯсвІсЕЕ сао вледакле аВажцскхиа соВссВскУЕ отак МИ сзстстясвЗ састадаєксх псстстооо стамєвавна зок зоаЗа засво хася їв зЗахсквосиз соззааката кщозаотеає МІН Жс тет ЗЦЄсВНхВКУ іч845 ткщнщотоа тазу Ех сЕснВтщЕвс майки хав сзастсооа хост МКиш скхрхзвазВ змазвох звхсвветах дазаххеквс заздасасто ставав ІІ вачвкнщиса зжхакзаахаа казок) гаї КУї звесізавеє даказкеІв їБ0гО зе аВаВай Зони заз злацвцвива зоаопаааа цист 1508 зтохзатаМх: асвкоетт СЦКК Х влавхааао аадесасава сток НЕ тека кахесВосЗа сжостоуме пзввзовсса зазооуккоє се акх зам з скадста зиоссзав сао пав: зовцссаага песня свого мае звмствазока зла пабхокасвя за аех Чан ОЗтясА СЕСІЙ Мо зажив ци сахссаеав самнневзає засо сгонрвостоЗ себоатснЗх 333 сиааасанах соствзодаах скксннве зок ає ссвосствас саке Мн ткказажив дово каса: азс ссоатозоз схил Оя ОВ касувеказа сестзацоах Збунхаатаа дае ЕЕ хадїсаїтая сосна тВаЗ ії аазависвав зосімЗа яхта ава пише хе цмИліта хавастаЗаеу АБУ зал нкВе (Кока; зхЕскаех захснаваат смааїтата хххофестаа 1555 хЕххаНЕЕїЗО світила завоваЗса дахтлавсся заататааак Кат ВУЕЕКЕ ІБУ8И тасзсвкхиса состава ст катада дтсттстткх аа мав еЗ ЗБ
Ясаакксес коЗсакина свсттсОм пажаковаОх СХЕМ КаХеВВеТеК їбае занхаастЗа ста онАКИ веттжтах сааЗхдство базаатоєк каВестовКЕ ВЗН
Зк ВІВ пивна тах сВдаяКХиІ ЗАТ И ВК т еВ і6958г зацкцайакх сова Е дазаківаах амнвасатвкс ЗАТ ОВ Маха же зе ктатах ктнВІЇзста захскзцЕїЗ зстжкоааац ЗІЗ тсвая свзлааатта іт давваєс свиваЇззат зайхатсвто тагтамкааия фичкксвос забаадавка Ін
ІІІ КиНтВЖОВтЇ тамнннва ТТ ЖКта станка сниВ Вже каккха ІБН тсвзвваЇ Її одкапнохва зааавитя ахаєтсгам заказахахВ звассзоаая ДІВО акеаавя ссср заай ссзилосяве ссазмовах зсвзсторе за щакх Уч кжкватасалвна ссозвсгаах коЗптссяее фосаесеКка ЗЕсЗтВатаО ками пУяда ккайихгвст зегзаЗ ах скескЗтсвае зсосЗвавз ст сзаза таамавих Тай штхахахацет стазазкатава кс ззаа стат ев чеочезатак зхазхккатх 1852 «хвасххствзва зазакакких азцїаїїзай заякуст зпозаолату Кук каКЬ 157580 ств свОсва зоссззаатв сзваЗаасся Казав инкеї Зазнвспна зтахнкца ха чнасизатах змі таавани візова зскезпннса задав яснсвЕеЕЕ ХАН хдтхстїзаа сзадсатссс стгтааауаа зенснцстех скммекаюз сввстаттЗх 1775 цетсссттсв змапавниивт тттодактає пастЗЗозас ках кучаВ ззЕВоТсста ВУКщй своФстваха паккчассоа кока сзкассвова пшхжххасксх зоба МУК застовааих КОМ тссста скрайкксх Вс ВТотаа ВІДІ Х збдтаами ЕВ тгзтзааасвх азксттваа коаскнцяЗ КОС сВкеВ зассовтоаО звахооиає МН зозастааии везвеасаї авесхязчяа: пази ивя ФК мЕ Нас БО змсзЗацавї зе таїса завіз ю сзаккккова сосзавозааа сВккканияа 5Б2о дккахкаксс сосок вкцсЗЗагао зааптввесх Зате х как 15155 цакхсвизоаа сбстоєставу нпетсвзатсєй сосках зазаєтаєва вхяатаеауЕ.
Іл хІвцлстаЄЕ форт тянс таааекеса сесветавЖх ЗНМ З Звозатааає 1500 теоФсоватах зсасастссс зЗазааахасх сзсовїссса хазЕкацесв зви оє Зо сзаїсазакх кзозваовоез саїтисстов ва тахтя свезжоєаах сакацмтеку ЗК сзвсзахккни плвхватаїа ЗсасІзаааа сзаааакеко стае тЕвкє МЛЕБЕНЕКВ ЗВ зазпаацисх ззцїктаїах цсясатттва тази ззазсорава кексу і заатакахця втІгтзатата свхВсттсто сзасукаскя зіва шви 10 «кавтнязст встзстеках сзоватаух зкощакукає залах акаснКВЕцЄ їі5550 стазвахоасвї сота везсвасова сповпаназОа акекактає вату 1572 касет тсос тссвекакик сосовсаєза зпацицевтт міасааєаях уВссВасаЗЕ ІВТВо заклавсвзас зазггарахе зеватіаєаь какая хжаєх сакасттуу сеЖсТВТгОК ІВя хакксстоцсї зсвожхакта авеню акасоітве асан схаасестов Б хаскссвоєй кокозцаано ставка пішснізсао Бак Зрфровестае 155 хаїкизасї зеМммавале тост саВ стаскссоза зашеокаєса куснцВаеВе Ми О зкккхацост Ттсдоаекка вве аї скл ткас аа смак аОВесттстЕ МОВО гайєовіствс госзтетакт кЕбтеВЕїас фтсзрахача Зевс ккаачОКеКе М задазнкатс сстозтатоуах стнствасте годна сс веїс8ваьа Бехоцкикка МО «іасзаранс яадеВсае аЗКхТстсоя сао ЕКс зтодеово зулацазокх ІЕБО сківесавккк кеКК КВ асаустакКая сова кикх стоЗесТОоЄ сам Ух ЗІ куккакзава стхазесска ккпеавету соц Зоо кка ВоЗосСттсВЕ х5ава псасокУнхс втсасветокх асхвснкх НЛО стеї дозуккаакї Зх схоова 13423 пааукакикс йвсссвоатс абатаєсЕхка зстстааіс загс зетсоВесеВ. ЗУ гаксассевсе згсвозака «сесккесто ссмесає сттеваккї ЗВО ТЗ
ЗавсвжцЕхс ЗО тТеткоо кова хотв сома васванкста пато стаа РТМ сизасачтаа сао сиксасусза сзпассогав заавазнато аа цаєо ЗО аКустсяееВ стос лох зттактаках акаакаатих саке кКах 18755 закствтсот захосатуюі хвастаєаве всваакск хапхезесвЕ збаакаасах ЗБ
ХКТКсссЗЕЖК г3аазасткКЕ тІсВнЕКтаа Зак амааца хісКсКЗЗах паскаааада мо заїнтаттвт зааксвакс нстсстаста атаках настнктать кактдаккаа іч зава5зузетт зтзстахккх зо9їгстозхва заашнн тва весскацеє поза ІЗ «тосацчатссе зірках австсозаа аабваххсв вснодааетев созхааацах кН тек фаасво гфсвтакаца зестстїзсо заккканкцис звоззозааай хкЕкоцКеВИа з23цю сіє аа сесовсаєсвх сам сайавахаку зввувеасаю СОН Н ам ссзхаззаса зтаацастт Сезам збінаснссс пузавестех соц соВ 2324 тсстазех атечуксяст ста аковаа зЗніІзасЗчАа зазЗавВаВкя сет 2О2ВО зтіпссаккак сокдакааво сааминлхак сусхцаназе сосок зезаБнсе Кам савасанаца покткисков смкнчкак сесопуваааз саазакоике савсезсх Мк айлнека зяцаКЕ фас смізаа запах свсзатесоа НК саксстуся свичвстотк сКуствтяха зозааотєа МеКпакхтЗО адаоаасак Око поаЗпастаня Кене а весскааово оецсеахх пав овца ЄМО зони токах нко ЗсхостцеКх как ихсВе сазекаєкал амчннвете кеаєсвккав й пххсвевахх звускстсзаа скссксиваВ феммтсЗак даккксовоа Застккаава ДОТОВ хацахяскку соуесмро кішок ева зоотохевхх вехназвКсо пехакасков РЗК, хисттоца зсснзваасе кекс пастка КОВО ЕЕ ККаКа ДІВЕО. сацакексац ново єс ке сеВзс сстттакакх сахлссстса здхккахова ме засхлац ска цТсвО сітка КВТ асКХ кожааКУВтс СЕКККОККАВ КНО зекткасрви кет оцак запаска зоасзастовк аваБхкасто забасзацеа я сквоБахои «какао зак есь зве Задеткиско стостоста жо зесстуккаця «ксашехветх дозах ство За све грн аатаа ЗО заштттесттай бакмодассс кОкОєсеях сттосоавуа статевааєвВ зт 2318 звітна щкакахаве замамам саахасяїаа сах вах пад ВІН кві ватсз ззагсссока нетто Е таахасичоа сЗниззвсаа захахашх Кая цказаствЗо зва Іїакх есе о гсайетахвкЕ тастицяхса стада тух ІБ акашктнина ссасссовиаї зсзтїаааа сесссясвас сс аттав засн ВАК сокезихУхтя сттясвссвас зататакикх зссвссвцсс зесаасаци сесссцла зщаЗ
Зсасхсцас зсвазааає самлеватах нрезоссоа кода ЗІ «ЕМ «ие 53515 коїіх ДНК «КАХ» о вштучня послідовність «ОП й
Хей» ВшАЇ-ЧОЗ. В нукВеЗтидвІа послідеВНісте» «Ке ї ких х звсезеоусака закайвкхзав сЗааевзата ааксстттса осел а щ захахксчах квзисставка дакцкккккт тстоміщЦук ттахссоссв Зак 1 тканихясту вовЗЕхайа «храпоесВа Фазаслахаа КхКНстВОвО пафос 155 їсясрвскї ЗсвазвасцЗа сассскзевоа заз зкооевавс саскеуккии 48 встсвоцвВІКї сек сехстКоца Мел ох сус пахову Є КЕ тесдсксосса всааавссхоа кзУххвлІав Зайккакксв Ззозассааа псспцсВу КЕ зо ттза сзатакаикв схвасвІвца казни кхх соттедЗЗак ска Вся ча схЗстстсх ссткоккшк свххктааао піт О Віват тосав зак оВ Б вв тса босхлскавз вста ткх поча зова зсаестаках зе КО У зацитовки зкксцахкЗа аа атику ятззазтта ааатикахиай туга ахаа БОЮ сзагатазазаа скаснвзаев сатоаикоех созсзагасу акахааиихе зосзссалей щ петаєкцаєх кахкзсезеак стек сс сотсавжек ахехквеОце Текагтакха ТО каски ак ах твЕтЕКа «кох тактзе фісводтеах ахллоееваЕ кааткаахося тай схазтнних кЕКЕсВвосоВ КЕссОХКивс ціа ВІСК ЗАЗ ИХ КЗ хдацеавацта вхстссезац саооохацка зви манк ТУТ Ца КК еНИХх Ева кхтансцава зоавасоааке стскакхває сзолсках стозаао ха какевов п зхвовцохци грот аасск пасаутсвао Зкмеитахи зоссацетка кекс сх КН здайвццахсо віатсазотоі суха абсосавков зсссваоааа шко МО зпахоцвих вузах ЗаЗсвІза азказазазВ сема ааа екс ахуха. їн мнлахссац сттссдавай Мнасснсса акааєлати зуссазаах ахикациню КЕ зашктака зклцсцщоим. майснясаико авааасоак пессалоаав еле За сх ЕСЕКАа соус птоз оєа Завадсакна яссозозаай еккавини ЗЕ зазткказав візова сблааахека веіаааок стйасскваО КТКТаАИА із3кО тестекаОцх КЕЗККВТссВ садом: пітоааоава похяквуєво заффоваке 135 зада иаїа зкатасстаа сс добзосавуюу хоКхкккВе оте ТаКх ву «сВІЗІсссвя сСолоднціво Зазокссакя Хосвсзасоте акаде зкехстТау їз какохчнакя ФфессВуаа Заовавтнев тсхаосстох кеккЗайкк, пХосвсВесЕ ЗИ ауктєскуво ззацсасс» задсеапиця ваза НКИ сЗКЗсВІЗВО ЗИ ашкаикхсхв замрновато хадсахавно стави сихааоссй свкВООї З пуск КО ззозатесат сткжеккзва стос кає сауссяпеца зажоктсВай Коза тиха сестсацатх кадакткстт засво єа поту нувни пови, ІВЖО завкаксткс сзадссткоа даасосвї дфеооасвих кколизоссх глотка оо зкакхсВ стзЗсззцса кохана зВе сзсадатска сказав ечсх токах 1550 шптаксахочквс ссезасовосх сайсткевас состав ковизВосЗо смусааоких що зхзвиосїса Заст кав пахова засзомазай зовЕсстеВа сзбсладавх ВО песаосяцва вагттааоск сдохаавеоО ЗО аоВа Чала самок є ще нан рмвс зеза ав зястятазах фдіааивна ук ах мрлаахкох КУ хЯххлотявІ тотема сувВхтяаа поакаткихх го зла сяце ТейО час: сзаамеанчх ЗВО осоао та хазся созоаатоаа аапкчовооо ТИ тсоссвсзїа зпааакоу ЗООЗЗцокх ХЕКоКИссВЕ Вектеанкхх бек ууаоє ЮЮ зцпющтттсз зкокхаася сїавїаау асаихонаае позик сЕсВяВі Т955 ззваасоата Зучюаисвах вахаавасоу севіовентх фаскнаяху чесзеотадх вхо зідаамтак ксоацхтцниа аасїзакс Вт ттоосеВ ККлахсссту сват аакко дУВО «асзайсккк аоссовштае хваттаккко зіїзеаоох ск щевсве затаскаих ке зак азай шказвсвка сазатацкх созїзіазах засзовБаєЗа їхати ау ххаєтайзас спас свтаза тпхалвиаї їзазнтаккх тет щє зазкинива РЕД звіктаааив ззІтвсатка кіски зОа дамалакіс токтцоватє зак ВВс Іо каста їкА сЕсТВЦМКЄ сивстствак єкайкаанее фе коке винесе о ЗБЛО задслацани завемх звсдесзтста абккакаксв зассоскаж ккаствосвї з кове вессссаанс коваостега спхакося зозвосасац хаус це НЯ ав ника века сасодасвс ак сао зок ЗВ) шицканитю всопдоамакс зоазтдвсау аа савауаєтах нвхикаєаоя а зсакцяцестс вссвімааси позавстазоа адааккнсви ззазкасаак ху ВаТ. що зЗкатцявос свезааа хстосстсай дакнккхств зкасосцай усктоковаВ 325 капохавхс ссозаавсся зІдсвоваєх сахцастстя заазахацуй вик БНюЮ сп ЖКНМХ кисссВотд нецхєсовея Макса кацах Феспосакх пекЕКастоВ НМ сазссасахх ківивооїс: ахпдаиховО беоттєоавт вес пазхакеахо о змитакаих косаветсса сааптхкоко ттспаатахх КЗ ОЦаВеє аумпочисне ЗНО заастовева пстсвостоа сасвтакизв соска ядазоваеся ваапккяхтє вки ссхааХаст боасцнисї топос е зіоозсотс даже севозацеа заоа кзвеветіка ктатокасав сютвамнет атаствахх здізкаваса гозазааа ЗЕ «КХОССТЕСВ елек соовттЗа зпасасакту влязааваата госамева ЗО тстсзщЕасх сазавакоВ сстосекек сттасіаах віжсовтсва Ффмакавка 3750 тодом ставки зване ка саазовалес това савбамаикх зна; завстизаах совацксаня совсссааєс пОцавкткув затомиаа сасиюкскх Бе совгаататт слаккаксоук Зевса скадаіакка сваассацах аскакааоюх зав мими Мачазакстх зазвоЗїсаих зраз обозжекка ааскцниоа хо зозтацаце ке сонср зе сЗалакасев зазна КО каВ 4 ос еа вепЕаНсхея ссЛЮТИКА клккавцОє стововаска зас иОВа ЯК зма асанезсхва спатаатааки! сутосано Зазвлах ЯК 42 затеетккка дкккистто тости ВКХЕВссякО Іс оає сНТЦтЕЕ ЗА зсссткоккх вкатосттов срок ккй зонної ОМВК КХ совтуївсея 3523 ззадиекмах сосаксвцет ззааакклах всежЕтатссх кіакхкавих состава 3855 їзаєтотата каса змуахтаная сугБухааїе днакцакаа зас режне тааовеспцих ЗвиБитаЗа всоммаків зловкоза патанссянО заКава У заавахтскх зобеттоаах сехастсяво затаєтика совавозевУ зЗааакиих ЗУБИ застав завсабттаа ааанкеваїа гос таха стсвтосааа садайацхой 4525 кхкжхацевестї звітували схвивосттва зМмегвстккЕ аааяттсоавх ссхоцпхоко Я сасавазска сзазіаатях вестїазаєт аздтоцесте заіааасвк ссаспсатевВ: Я ккхтастуВуО стаозолахВ Фастова каласисае сссфазааах охо ява ствсватєаа срабавозив соссааткай аеххавоваєс аеавактких ковазетеа аж зхдсвсзву. згахсаказех саосзсвате саанивІваЄ зкацтактах краса ма хеЗІвсозожх «хв стзазазааи ассваУсеа сахухасахе сеаТштмаве ЗО криза ааатккессв гсозаатата КОДИ КЕТВИМ Жхахатахек соска о севтеттасх ах сетвсзасно яса ЕВиМЕ Хасовснита Та Е ЗюЮ сахозсїтта абтатасвов тато вазас сакшоскЕу ананкитаве Фаасоасааа ЗЕ звизавЇсса касалатнсв сефсатацит їссжесаЕВа кусуссцясВ свавсадаВє УЗ ат Евсіас заскакхизс ззсзасаайх васааЗшВає аххнпвАххя «ВХТЕВВАК 5аБО какквізсса КОресккКтВЕ сзстахекех яке секс є ОХ 5350 асгізсзата Застаассс тозтахккиа пеккккувом аапкхсккк КОКСУ ню паціктолоє мета тветвжсоца зехакеЗИВт акт КаЖК хаксіВое ко чспмаацкчеа маса сиодитстеаа сема Зве тоаадааевє ах ксщех ЗАЙ тасаакжкхх вссвуВом: сухсввеаЩє Маса ЗссЛЯТьеук МАХ КЕХСНХ ТРАВИ застати засттвацИ кмпинемево абоссваатя сала слой НІ вкскетсеВоцУ БІС НКТ вовсхасаво звезаажфаєо Мем КИЕ сода УМ кткакоотва кзхацасаа Фртозаєсв сстФсевоє сткакакека ссвссвеВеї 5753 хЕКетсятек ЗВО спркекевтО ааосттовмує скота соостВ 5Б5У мету тето тра сплата збевтщіех екактаєі зсттостх 388 «Еко воста ЗеТОк дааалячее абсасссвза хкланаккх соми У) акскхатастг стгаккЄкат склсзксосх сасутієсаца знос х СД х виЗКІ хаксктсвас фоцКюКає ббховасато КОЮ: Кодссявсте стдесокаку «о зозкасвнцї стзажниоєх пав восаа соакайвоха срозодсесоє соску Сея «ках сзгсовацза аа оа зсзазаєває кехсвстает сзатевекай БА іцехещесаї Миїакачах дахові та кстКкхкакай сксвесатва каса каа оно нихахазІве зттазтскта скхкКВІВЕ Закаасактк КссссВЕЕов заакксККцЕ ее сввхехаіаО аїзизанаєк состава мкаханалняв са ІїВеВя аКжкаатках БІБ сосхвсекза заааиах КтнтЕжЕтМа ЗММпакхАняй вежа заставка ща хстуватзаа зкаактаває кствотетеа косссхекта зассаастта бкнансоттх ЯВИ тттттттЇза хккхаюна стВаОоБжкКи ЗсККЕМЕХТт тазазаззах састсВТВВО а зедссаттск адазхаків ствезсука «асакновЕ десзаскосоо заз етх БІНЯ кмтІсасста хккрікасик сеттсзваака скхвауВсЕ Кекекетсак засво КАХ ізсзамаєса ссдхосяхв саїтакснся сага асевавтст сема 5І2О статваааикв зстсвтссв сісаєтстто зстоааєка аансксве зкакааакай БУЩЕ замгаааайс зхзсвсозоо зстккЕвсВ зсзаттаска ахавсанова зеаакадака У зсактахавт свсзсттзеа аткахевтве смуг єска зЗцУзитКЕї зскектатоє НК межи е вето е кккакавеще Тозжасеєкх сао зсаацняци Ве ста Етакс Зоо сехвхОВае БассзасЕх ЗесВаувоВе аск соОКце те задати к: зсаесаво «топи велаа ЗМ КеВиї ставах ЗБТУССВсЦЕ Как тадаткхясх фзаостовса аЗиснсктва ЩЕККСВКККТ тет ЕССВВ ККсеВВЗЧО ТА зкасжкткса заазаоста ахстхвжє заакктссва озаттосса псаВсетай Тег сосках Зі ваає екс Кежм Брак ХВсЗоЗсеву СКЗ ЄВХ Тай саскахакиї зас Ммеа пис етаВ сздогакуця ВОЗ скуІаВссе МАУ захи; Зх своє схазасао звістка пахова Засактиске Р зетсакхои звовещтЕ вебапноеає аїмстааЯіх ЗТ атІКВ аСИсОЧЯХу ТЯ тФозататех захЗсссЗас Фасони дезтзаєвайф сассностя стсстевана Тк остктавени пдв трвтс БеЗатчкест ТостотТсукк ВЖЕ КККВКЬ кизааакоце То тасезвоаВЕ зацкстоска статванцає ери ака зосееевоє МО хклкцххвсос ЗМК КОС КОВ понят ее яко ктвцВКВаЕ ТВО
Зкхсвачист вацсвсвасо акцацкктнх зіЗстеоца азсаданхаєв дасте УТ акаєтутаст зсоааевасо сх одвих саскстеооик самтасеикс ство І декана ст ВЕК К ВсеЗсВНККЕ «ОКО ВКК сакаєткако сссстдевої Ба кдабсставс сохосатцєта сккЗаякоВ ЗКВеВевБКк агаскахаєскв ство вада хоКаКектО ТосптОвщАМ дотоцахятс КЕЗсКТТВаХх КассацакиО засвссвесх га уЖхакстКст зтоссткаах килизснссс їаазавоях пехацицтка заозасмН каза коза вс зазсттсасх ахоазкассва восааєткх зас сикоа судавас 10 крсхвасскї затаасахха сесакЗстссо фозазазані зхшсвисвзах зара ВІБО внасвхтзу сазтазацхх хІхтазовВеї Ффіаксмкхахх зссЗзВесстО соаахоамах ЕКО свтахаажжт ста аозсхазаса сохаакааєх зисякосах подкоакакх я вуттвтозВа СОМ тя татка сспдсвахев МОЗ тізах зеЗкЗахаца ЩО зансвазака аа спсан аківсозеаа зїбакоцяос зач тса скат хакЕ КЕ нанссФатсо ака ссзажезкає макс хнає тут ховали Ада всвзатгїсза зхкхаайхсив звозтзаата хакизке заеаасх «иховвазсх ха тЕтОЗЇзава КІЖКеКККиз ззазтатска пазакзесто созсвеккх зосиоВезаЕ ВУД зеттсоза атахуавика сосЯВВКиЕ акезастета зажадати Зб сВ Ве «тітка заяв звааОКцих пНжстКТеВО ЗЛ жКАКА Фев акаМ Ю заазкетакс зваавсхстІа сататикихх ссозатетва азни тет созаактта яко ззаткайака чеисвсатез ктатккаєує всезеаккна кЕхктихасо фааккаєкаа вазо зморшки ка: сессзваза зхасихсаве Зазазаттву ссваасовеь аайакнляти Най закахкатих зісвстаазаа давттскссо атааваахах тав ат сахАХВІХ ва тзвазалиах тай ває хнйсвовІВ ЗМ ЕКАХ свзааааеекиа вениНяяе хх) змхвзазіва сагтоамскв всязааааіаа айглзциваа бреахааєк хКоЗКЗааВе БЕ зхзадихкантс свааеспама хист: Зо чакте смтатахак сани Зі пане дев ескай совїватак КККаВХВОЖЕ савоакакка сени їЗВе 150 акхассавта остова х стбосзааах зазтсвнясє тата сек кцає За пкавваЧелд стан ходеватамо паакктнсте озреокадає зав коков З30 закахтзавка зм маст» дозованих сабхсвсЗаЕ баса секс З заацанксвх зааасвави пнастсозаа пазациност засзащеакк КЕКВ НиВа заго капасаніоз «сітацаасни писвалатаа захажетете збЕектадак азс сссс Ва ттзаазнах зааає схтосяхот заетактахо стесстеоук каси Е ЗУ твпрактаци зтбацоааєх хктхкізава зіашихає ЗЗККоеВеЗ МК ЮНОВИХ ЗО туссазлтаз стТсваващах кована сВі зсайасатав саке ЩОСТеМИКИХ ЗИ «ТтлІтамта сроасхявхЗа схаанаєсвс звесттатках кссакхккєв зсвсставса ЗРО піакКхкках акзасстсах сзабсасас стсваявссв сЗезоас хакі ЗИ позика коси токах пстОхсесоЗ заруесска зкоахккке ЗИ тхоактоахо пеаксвестс води стос туїсе стос о ВІК КЮ ЗВО тгакикоЗкк захкцевсос фегсаденк рн ога стедсвеєкс заутостува В затсатезка касі со зав скицих сої ЦоСс Вот аєва Сет що аМизахацкк песо фтстоадЗакке стїсссзсаз заасозкоза ЗІзатгсоа ЗНО ацаалтисни цацивессє впав киах ста асс зазааанасв сВтЗВсаежх їз саксвките ХК Бек ЕКЕК КОКО Во пеки ткКо ВО ВОМ Ко хаккасиех четлясзсваа стхаааакис вттеатса МкахкастВЕ СКЗ КОКВ МОНО ткжниНО тВЗсаОбуМе ККТШКНСВяЇ стоавдамої зкснессстх саттадемах мих
КН свотсесаасо мокко свої гзсздаас: Ясасвевоєа мал зачно каасдинста дезвоасскк сеукеттсс заздактааих ссвсвВоцтее Мао х мно пихкдувУта стстогеаха актсткттозЗ фосакжкозх зВсстстева какая МК закис свазасовай коса сатоляхихх ЗатаВТса кОчлАца хо ТахБО тісної Босзавскех стві Маденяєвоє заст заядтссасЕ їЗ52В. сттозсавс Згаазанцс згзовзозах со: састо задзазоука зофнанева шаБеу ссезацю: засаводзвос сззомсаде ассвтової пазаухавне свое ЯК зазссттава адкодкзкаа зсзозаот пуск восаао пахексниця ство ЛО сааатаєста зкидкссЕке їтакопаняа сн воа осла у Бузаасткоа МОЖЕ зозасттяа зааслесзуЗу паза касс сивих: ника Казазадайа цик іссттиая схастооааах забава зсяя вазсазавка засне кскакакяй ТОВ така зссдотазех ско ст ст тоазикх ско садядалсои Хо зааксихешс сет ххх нЗсВО ссттатвсз сесвоасавца Зицчнаскакє 1.3о айс хв зозвззссака ака аЕ спдапаакяика ссозвеца КеБІханик КЕН аккециКЕ зовузадоаса пазекстве зостсахцхх плову ВКУКоДНВеХ ХТО спайс звІзозЗайх зсЗеаиЗсеВа зссаавлаце ЗаКІстзав анкету ЕВ завалів звізізуха звіссвасзї запсзасяс ваза асцихасст МАО хкакиномув зоавсзкаиак кЕсВсуаЗВо аБсКЕуКНЕВ зеащетьа ЧуцихаВсяЕ 1430 тадомасакс сттзвчкма мнихкнцев сот анак ско дхахлдатня Зк соди скки стостігдаан жекуснасве Фтссазвасу кктаЗецес Мкаохацахе 12) чани х схбвовтсса паса хнав сеттадаках ззівхЗуЗсва кеухааахук ІМ заілоасвасн кІнсскЗоа Мі такту те ааеко КкНтзавних ТОНЯ НО зівмнлекЕ кайункзеоз сапозацткв сова пасзоацтсто зов Ммлю зФвтоомюо момиахає зозозстоау пеекавовеє фроамумика ВЕЖУ ка
ЗОкКаснех ОУЕН З тасвх езЕВееВЕ гстатомалах зсащссянхя. ВМО какакастух зіхтівасза куму оювя хаскі тос сдаотавику зсуву МБО щшераатевя ЗІчсВсевЕкее Зцакнажске асхкуссте БОЄМ пехтудатЕВ 1.
СКЕКЕВЕКИХ стхВссКтВа СОТ КСВХВЕ ЖсНсЯоест зааркалох сапоВХтояВ ІА. хаус мкнсв» виведе Закаисахо весжехай здхавпатса зетаЗсото ха задоалнасв стовІтсте садвсахувся сзсзаЗцата заканкахав товосважає ІЗ зкайхаванив ззваУїоса) гадмкацазст зваааатла декасячноя бої 13155 каххдонаас вссвстатсх кахлі куто восафоккхк сксекцстст заго 12355 пЕКтцОЧах вВкззозаЯе спухсоЗОВї зосзоажекх кахостоуве тал а30д певОКІхау нзЕсттсаво сек сеЗ свбобавск сахкаОсеє падав 12385 пихенсаскв ас етаХ кутках сстасткекха екс зсвоВ сем кає лего закис Фсаксоївса счихоЯастоО Заст оци сват х воскааих МАЯ жк тссса ссср аах кезасттеЗа мала чес та зала МИ прессясхуї дааосстета стос гг жткках ства аєех мули ка ме секс хвоваа зак юаави зах стстоа іаттвааех сзазебогай акт ККЄ ке: захисцсессяв атоваскках захсавааа Зайфщахавх затсттжеакх аккакаску Зо нсзацтвзаса мале свещоа ах засаткусах сі тсааця Пи ЕКиК ЯЗЕТВО чвсатссака асуатсскння фстоатваа сах ооа дадаастккх зате АХ есзкацесх ххакаюотах сзопссоацкх свв: сумки зстссосаа ке зтажтгковак ЗисансівІ дош кав сів зсзатассх Ззсзадвоса ЗАЗ ттсотогацаєк тиакхссоиха запо ккаца вес ЗщУ сацианькоя зсрссоаая іно тсезісасах залоовсЗЕс саміт» зга асзаа апаччивчЗ сеБаБеВкх ІОВ защми да зп тс ВМІВ кОацесю ее МА воасахахОї спасає сенсхатас сала таєа нехвсоаО МОЛ ЗОВ твіпахиики пінцет змови веетеакамх сквсвесщеа МОДТТЛНВ Ма вІайсакки: кін ВІсі змашсссціс ДК ВСЯ СОС ЗО самка зпуцісатае всшкенннях пам саяастео зе 1338 зссдамин: зпапчстуа МНН ос ВОєва сти таФа теза 134 зи сойх Заявок акоазхххве тест мав тотеТтО позааавеа 13505 вЕтсатузца ссаовисіза зазвсосанивх сво аплацієви зе ІЗ вхзсатст стане с звізфааккх сети ЕЕ їаБаваккти свита ІЗ звтивтттаа стада сх стзезїакац кккклаказе газами кіаах каска ЗІ кЕтхахаєсов вата ЗеЦЕСТКЕХ МК иВя ства МКК НИ ЗІР акккхакнакс ззвтзатсзаа хасжсваства азам сЗс аасЕваєтЗа апа тад зЗКОв диссаваззата састастакт віуснасоаа садавткака кевоитецеє зло І дХнтсяхеве ВТМ схацксвове амоссвеке аааскховуа овсетоса 338 схтсвттте смак каєух Яукаканааї бзазсссаке сасссвтдев застодавай ТУ хІасцеВаоМ шекжЕКекоя рах жсТ Замах ХАКІ во ЗОВ Її щшетитававвс века са сухсвестава засакгакки «свсткоссв зжссатокай ее зимсвссся стек какаас застосо ає засаасдайк заєзадсизо Зттагаатка зо сВКЕтВсЗВЕ баспакакки соВсстав соків салакЗаЗав слой МЕ тс ЕЗеВ доагукхакто зстсетсстоє кскКастів задо смаакацяся ЖЩО сне тсзсо збоку атЕстоавтка кзатектаЗа Ястетоааах сіасвкос що секс: саттксекк схе аозавве похасеаав КМ за зна хзаа мкм ткойх сова сотад захокскнов сосок Зах ща кс а вазсвіукк сс таеЗа зучакакиї свастецуо соми ИЙ сао сет тт кОдах состссЕцкв М ЗИКОЦИ Іа ОО 14588
ЗсТЕаТеХк кох Яств тости ця досттасВев сумно двааааах щі
Зевс ахкасхсххо за оаКкксх состстсАжК зак ккаасВ Зсевакай лю митзастак зок стої стазахккас стос їтеаакх ккох ско дасвувуєка ТО чсяемоцакк дуаоуестя фазу Зсттсяаокц САКЕ ТуСВССаИ 13859 ссзсзханк пахнітцята зоаместЗа збазаацаєст сакчевосек тавакксив 14ЖНО чсстаскову дотідаває симевето зкхкказсах сттсвсоткк как ОК ОВ. Мащ застасасвс спеттетайви кеткЗебссх куакаккисї заФсткакка саке еа ХНИ
Зеннекова сетасскста аесткастов ах хЕЕ Ві СЄМИ ХсЖЕстсВа. Іа ш-кхасстто тоодутазак соціа ЯсеЕсІсІве СТИСК сЕШЕВЕ хх хакхвкЗкУх зфодстшека СЕК каОаИ сон ЕВ ха КИ Со ІЗ «все заст ПІК Кх хек Ваша тост ЕсВаХ Важ чактзау: стае сккс гтззваааса настановск теж кааеЯ сор саоє їн ххх ксттОс Встектнни сФтодастева ствссязаже Зазкаксакх таттссстай 15359 авехласк аа тисх стлоашкмщЄ состсттаевВ задаекаацк това ха апусвксоза васзацклних зсссваках стодеставе Ск ктскя состовмака ха хамивкзсї сіойаацев дес саван рвм) заатваламі ставте їз іщазакиве ззспоуствана ХВХБСЦАаЕ заахнитявтх зтазадтоах зннотоваА. не тудацезавзо сосаакахя сеБізваєса зкнникоцта Зм хаХВхсОЗХ КІВ чзаккантнив тсзтоаанткх сем акухекккеї кізазїсава вакхесаних те я мрамваних васстссвак кацахцавса скахкккакхв сссомосам зацнжкскх ІВ тессазаки каш скЇтоЗ сасозтанна сао даз свястстося аетамикки 15545 званщетІїв зазідааєаа саозоиззсву зоасаасоких кавнувтссс заакваааєи ЗУ твІхаестВЕ фстазкаєкиа хихтвіхвай фаекастцкх скуЗааксвоВ аск кІцаах ІБ
ЧестсствеЕ фастаслаЗе сто пспоаазнх засос оо ЗоЗадайцки МОХ зерюастооа заасоаозсе сховає збазтспавс своє дека МОВО схсззсоста астваккска сзствтовад вксасихося торта кохтОДссяХ іа «вІтсзастс кам ккасх свое сОх пак авас осо фзоазнсвА ікла звІззтссвза атаки звозоссхаа хаос вВЕ ссаватаках песто Іва зссзззаїта скаазаївст сзосзбтакто сви ссссвса савтахтана веВссЧІВЗ зго зр дасх осахтєцевт зазеаатаєх встав ссазаднвиє ссаоцтоіа 1538 мІдтосваа ЗитавсВсВе векрассссвх тестова пеасмахатя зале, Б ткоссдавх псевавнссса ссакасазвсх свозастеваєт кокоасвсст твадцаакй ЛЕ5ОЮ аксаксакка адавсттїЇзс закааккасс ззозасаака аасваснине звгаєтакай Ме ккасаккках вестзссзта ссахаавоЗс соттассиЕ аску ста зеестаазай пи спацаннахих тсхзвсааса спина заа зОБассаааи зесцКхВук айапиаатоі іо пахові с жожОускску вкстсвссаВ свадоасахє сетоовасва кесокоякця За позутвсзза зозадатту сквсстстсв сіакхасзтв Ттсозозоата тххксКосвВІ За шк вссвсс соатакккк стос ккхкквсї сбоссавсх сккБаВаКе ї555о івдкацсвтс арсоанцется сах соте засумтсаая ЯВсТУТ ЗВ ЗБ зассзвазте зодостстсз стат ходвсатова ее ткЗ вотзсодаах ка змзаасзах клен повели ккся стсттассккх атак зесттеацето ІМ пазакаских свецузазах зспатайох шастддахах ахвассацяв ам МК силжекаик вссваащм закиаацаяа Зіставозак ес жсниа весло оа мив скаслитана вежею КиВОвНиККї ста х сте сВЯХх ДИНА Ге атшаатецих свсстєа кивнсоастао збасанесх снессвдвку Ме ТТОЩО чазаи:ниаяс свсттстОфює МК ХСТес ЗМК ахВ саллововта сетекаках Нет стжттккєх двесстодаа зссхсвссся зЗваавееех стхвсфетее зукаєаацаи мя аксонів сходтссекКки кспсквнсто ема х свсятснК стазккакио зу
Зскнльке втсасаткмх кксвоснсво тЗаткктаєсх зкосстсвтЕ зсаакоккца 1К35О зааазмнаєсх хссоустааза кас тос татам: завннртса за аеву ВТО зспетозсаки пОсвтЗата педа цнс со сасеастяся ЕТО кю ската дар сяцає снеки бцсеаєсаая завацикахци Чаааеаста г ю с«воФестзас дасежевисв сема зсжкщцрааа вокЕссмя сКсОсиВВІВ ігр «сцасоах зЗахаахозка ссстсакакх «Коко: засадами задово З752О тгастпаояво таммрвннинв зсозтсх апа вссое зезавоакає песто Х ЗРЩО казвзщямнІ баатаахаах звІязтзаза поза Вех гізаалаае пззасацики чо хавувалцяо ваазацаея зовозовазав поліно ззазхоазай зоадазао че. тоассазато как сах сс о3М а ккаодисияа сфаайосака ск сЗсОК іо зктстатоза змактовс застосо зЗаапаннзтс сазан бхсзсадетя їх стастасззс садка зво зсноащесВе саскккнак потостсоВ. їх тзассттза) слакозвоуза зсозамуках зсзсазаЗоз стопах сваха сся МА вас сасаккснЗе асаака яклусячуаа сехцаяачяЕ ик свеКа ІВ змізазоза зику За зт яка асконксха ех кща 15350 пе спосо схвкакцних сепзяЗвацх беховяхова зеспеатава 15430 заастоєта паса) аі5оОисянї возах кувуссВте зосругаата зано зайасарани знодетако заахвсснтя сага юх косо така На зуааанесас зсвстсоу зх ксевтс гсозааай зссссваєта банних 18503 заккаціст загЗїтовУх аавикизвтж созасгацах сввазіяїВа збакакавкх 18553 ккххахакака БОсствтаав ВЖЕ даайкктехе Євазаваиах спаохнахне ІДЕ вЕцсдаккиХ СТО сСЯУї зятя стссОї їзазвмаквня Брак МКК КиВСя іт. ктавихниих Заказ хевстттоех аклаааовот зстаааакох бксанесвсх ІВ «ткхЗзстсттсс фтакткасвх збозваатех аква тс фкапакахккх кектхудасх 1855 рвогозва сиза каах стаззааккай акзуавивта кспттитттй че ЕЕВМА 18550 таза: акухааЕтвс зазазккавх слі тВаа кр хвсвтс засоззаавах МО засісзазсі збиває айааакнтся Того такка ниназатееВ сстатзадаа МЕЖ зак жаака чиссвжау сЕшквизЗаа заттайжкик КвстваоВсх Каса ЕВИХ Ма таксказааат сон свазах зазаксзаза сзаїавткат «т5їкаваза зазазккиций Мой «ана пвсссофасва засовимов зфосаваляо затв на Му ця їз «ккхщакати звссоаазасса зсхевОксся Бівеасвоких свактатках ас жняха їз «ккказніака ковстаацЕх засчетвтса збаїсекоаця зайітвках закладення за
Зккхакакча стзсзавака заттквааа смилезаєи ТЗ аах зма аукхВ ЕК кЕханкткха звзавасакк ххллаенеїа звазиктстй сезуЗазах веххасве НМ цакккасюз заассвцайа сЗсазацавс саван сов таза ааакаснсВя АБ зацдазкааах ех тстаааа айпхисева ОСИ сваха ДАК Х ЗЗАс ткали пасавосаки кекс азо ззівизхх кіс еа баіааокакх Ре зле: прохвсазаа акхккхЗцист зстамоцоа якіс то заватациек ІТИ милом стапнетое: заз кус света алаастквео стае Миху і58що зазилозаг СХКкОКттсє Тасесваттє стзаттуках апихаувтОї ЗВТ їз тоїзтазаас заклав заїоаскація аусОстст дазасоЗихо зизовтзщаа ім зсвазастаа зрахлакове зізаттзаза асзааткков вата паскхдавех МеВ свои ах каХ сзварважкавх зокзакккео зассзаайаа закакктвий ко заатсзарах слофксвсозх ссзсосаайк апазацкааї стома зміаханхе щщю тваодасттава Забткісттв зазштсзахх хіЗВктчКЗї зсзааакас авахяйхвій. МН) тлжтавняя сток Еї ставаскхх сисклаккВЕ ФфаскадоВЕ канава КИ тає заах заасвсаВесс ссоавааахта сехасуасх сахзайкацх сазиЗо9аЕ мя
Зксзатеаци кствнуаса сасафуесст саавттстеаа циасвьВхя весзевобІЕ 23 зпсакаакикс пБланізае гадтаєкааа ззслдваахт музи тиЕ БО деВЕ МУК кхазадааци ства зсухахисст сзтсетзва зоаадассця вітка мн сцпазататах зх кахахакЕкс сасзвбоатак хтаессзста тестова 25525 имсзаухзва сс тВсоте: зкхакезк ЗІзгвщаток акчаККкЗа поза саках мВ вгканикох які мра адасихнвзса Зассзсзава паоовесеах зсаватаках МНмО гасне Е сита вохссннсве зазсзиаула стіттзожжуа ЗМкалкаака ЕВ аиюхасийнсвВ відазеазка Зівсввтїтає азттаєаакх весатасгсгаї болакикНях ІЦУВИ кайхсесксо тектаюк кезізвосаа кагостоаста ксзатостах Вк сКХ ОВО цкхатсхест сістассва кескаквоа Мом аєткя васстафсвк кКлжакхасХ ЗВО зацивхсксс сет кця ВЕСТ ТаЄК поле ФЕТТЕКОКХ ПКЕЕ лава
Зствтсцева дивне согттасевк вне тсс стабааксву сваоцовоз3 Вих чатсстееке ІК анащс ста Кх песо КУКА КЕКах сООЗсТоВОК Ю сттІвсатак зккхкасї ск ассаз всхквовіоа зкавнтасхо стосу зІхО ввесзсттаста асо аасссдацвкЗ етан м петечнуск совеунох 21 ззазтскаки зихтсатаоа свспихсвЕс Заст зоЯуваасо Бас ТИ зежллинлес вІттТевсса са втст атстстООайа ксхЗасоцву Зазжахктах МОЮ целелесво дув аВеує аск тстсх фест мкка встстнчкиМм: саше КІ азщтаєснксх зстзежтсат зт сттспкаано всеовзаарах Каминнннеа ВМКО масони х Ффоувацата сектсссва зсзстааких ссосвЗстсТж сахааакикх 2МАЩО їм авеска ХхІТасстосх пакт СВ жеТспКтамх соВБВЗшТсаК ВК ХКаДХ ТУ сжкцммекмих всасозкеак сехсктсвто сис всхостзста сакоааохах ІБ тассиєки нусовЇззУ зеахецеса табозсацеах сзнизазааа запкакааа ТО змщастсх свстастеЗА пекли еоя ФТИгсасКех хахахВеВВЕж зас атик ЗКТЕО тжхвсаасих зусесваїЗо збо нивет зтазземакх анксстветх отоакатвах АТО ввсвеїмек пкаххєвава сістроассиа ттхвавлозта заацахистх тааакоаа ІВ пвзизазеат актах свати квсхааЕЗаа Зав гааєссо ТЕН ЕККаВІ ізо аххавазваа баслакасх звестаакех паахашнисв зба ас сяоо ша щрРОНУСЕСВКОВ ЯКККСВІЦОВ сісЗаавакх бали всстзасаЗа аскоЗссра Р ззезстоЗкО пакащхтсвх возом стлсастсВ зм азоаа пани топа зчесвакато: кзааасяси сМмомлаукс хасхсківаа згазсзааза саке згїа чааодассана кат хяВ ФМ ста слнноцаєва сатссаая «етос захо ттссаттокя «ласк вІсто гсаетикахе зечнвозеав тодзазацояЗ зовтасе ТвоУ їзсздатик аіхакоров тзамннниа зссаесам аараманоске осо ав 2232 затсспааав зезцассссс зсссзсни взсатсокЗО азадазааза соток ЛЕЗО асватескІкаа зисаячсоча гтозкОках вес ахкаацеза тозсосакаа Кк тек якхАтІ стосу КоСТКЕКХКХ дівтзаццаа цкклакккта ТИКИ М зання сіпвахтзах таня зачин ІКОНА т сало Х ее асівстниха вівшннє мин х зтатоваки вктихаїхсва заськекакя Тех зкхазсхсся Фвястоазе псааастсст сахаавкеця ссопвінисх МоацацьсхЄ г2вао каацзхнавї зссстмих такса Зо ссЗанка схоссастод аск сееве ТИР іа тї здоззафстаз вавкскеве закмннека стазасотає сс ТЕО кхсикзсаЗае зБеВвоаєх точно кош Зоаеовосу Тотем ТЕВКО зе: з)аоаскена Честі ЗосхЯссвЕсв зас сах ливо зесвадетех азвазесксх соозкасахе зсхвомиива ска тостмахак МеВ звасаиниЯ вені сон срЗсзаацай пУКМЗННМ МОЗКЩИКОИХ що ссїацаєстя стацисиЗах їастсвцвхс аа тцсЯ хоЗлІсЗттста ааслкууццє щ чзатазлачихї стхлноВтта ааїкихкуїто сс е зах сажх асВиВхХЄ З замтоанкхя сатІвж ат фкайкизста зга каася свховсогва их уаВЕ Заг
Заатккехвх звІтвахавс сспелистве апакктаасв созрвіая захваБахВЕ 2828О засвксава сонроаза кіасхцсзсо сухо ктахс свіоствета пасквстяує ХУ захахасоцї свзазссаст соацевовеї заааакокос Зсаатасомх птезкух Аню пжхайнсЗсв зеставетак аксасааеаї аск хвккає садна Ве що зЗаскисає ссздсзсала авісиссвет дакжониа дессатавх се З35: ел її хо: БТ сєкій ДНК й й хау: о щтТучнв послідовні стВ «йо й «ЕКА» роді вод дл нукнеотидна пра здавнєть «хр З тосола Здсатосзся тасаалюзая созаєоцуакя пассктетов сука БО авкятссоах пахтссваєа аа лехкх соток имУчзнримя атакахккке РА. кквивезету ахаоахккааа стремниуо зваводаоха ВОСКУ тИ ам еае що кививУТ «езааасуєу суссссвикс свзсяасвка дакеалнсою сасокцвеня 340 хЕхаккккВа сттососЗех акатектнекЕ тестаїсосу хактаанкат зтввехцсоу з цчакускунахс зтзазаасск аксісвівиВ казсвбоваа базхасатет сива ттях ІБ пуск канов сваттсавка Балавинтях овеватсямх зказлвассюа сввсевоЧнеє ах канускхною Заст дслайакт каско поскоцаавк офссЯВетоо З
ВилахЖннХ саду КОКС Т свасКТтех пухавовхаа сет сваес З савсттжоес ца мНУ зазвхашест гссзаасаек пкаатавояо зосаоствОї Б пЯххНацтсХ ста кола созажсвжих каснсохея стосу БЕ жи вницеву вуса адатовкшЗе свассмика якуааЗасвт сссзузае Т7В здствисата тстасваоиа ЗцахспасЗх сззеой зесаловасо аа Бак 75о щиловнюєт сте ах Зааасавиза заз ЗсеуаЗУса доза - сопазноЗся сатотазоа аксони сохааОзона ссвксваєВа дозасмокє щк янахнЕсс соізосзавл кезиснзсАЗ сот авс засоба Зм саее чо аврецектс стсоптавккх зестксстох екс исх зоозтоуаа асбкайатоя Мо шен та звссзовацк сома сва сзддваков: Заїссвафех худа Ж сссннщетет ададавхксях «іш стаяж пахкжтскни зер лацазацска їв свасвоовУх Закаксиаця состав писувнстт ствазоодка захв ісх ІЩЕ тасІВжосВЕ соби кссВо зЕстеВсеВе Зара ао косВавтося сввассвева ї8ва сссмасвех сітакссвсо Фасзсазвсх созсвазада зхтвквесВ состав 1325 спаззсссзвск акахожхвусї ссозазазаз свої асвє аакцуківоися ауто пох 1355 звгссвзосама лахазаа пМтссааце) са ацк надивосткє зва и МО ззасазсака Засовеваа ОК лНнИя ВСЕ СУСВВОЄТОА ЩОТЕТКАЄЄ м таза схсснилосата поаоєсвтсст сзазстсаше сстеттовте ведакацеює жа таза пустставає амсквссвво ссттоауєк зсцевтфер дат кков МБ дав мах аосихсваса см аУхво сваха звзавтсзео стхккакках ОЗ затаіваз зссдутовсо масова сабсомєвах сставессях статева Мч азагзасази ажзхтезїЗа Зк ааЗця ФсттаацахХ пасаЗцвосе втаддадках МО тет ассакс ззозассвта зсарахозст тзазсктавЕ ззазоозовх стлодацау 155 ами ак: зассттаза шмекасисво сососспакх кссозозтоа бзактвкала мм тзівалава кот ЕтеВ КМмИиЛляЯсстя тісті єЗдтаа КоЗсхЯсввА ЗАКО 1550 пев тосо попа стсоЗ Ваза кік гав УК: мерасецахе ЗОТТЕоощ. яю та: здалека газетах кахвУцітах задозацахи хека ЗМ хсастЗхаїва таза зсдсвтохЗа ммасе миска волос 2і15О пилпутихе сззоЗааиа нсзйочсща аанниьсв ЗжжеТесО ВИКО еХ що асзхчіявсЗ єцтацєтаах зухскоосВе засатсттакє дазчебаткекх кеекайцаЗе Тена заЗЗсваана стевастіся слазвехаав зааааазакв ККкастаацх НБК ЕниЗВ. ТїщИ
ЗОЗ зсасссою палннсїсО стзоссзаех добоєсссалєе пхтстсциУЕ КЕН хкжхЕсувоВа сФзаааєтова сонна звсозвфстак хавхецакосх ее НІХ о асиктВезва зссс ссудян стае ох двхвскаохс зстоаа ЗУ
ЧаеКттссва Осо КеВкУк Ко ТсоВО БО пОкНККННКс ЗСФЕСТКОЄ ЗВО тосезасави спеттокацзтк пехзоозавх зттеаввднх сажа засо аава а застязсвата гаттаккави віка хака сумкаккт заересеєва ззас У «ІЕЕ ТОВ ВСаккх сиБНЗСЕЖТВ дао сЗсвовастО сс Оаа рес стІжсВісккс тсазаоваихка звхткопоеа зазааакакх свтосвтоах аказааму: ре таятхстїссЗ зії вес кЗїзаз згетадааих свховетева заадакаках ЛЕВ пвллйлясстма завітсакза тіхяскваса аїлецакаса везссваева саскцохках Я хе тЕх сажки ке стІтсссстека ЗСУ ХЕ бота ВАХТА КЕНКЕ щи цххвсатзжа сотаккоак: зствтЕккак зікакакаво стрла аахсаттвцх ЩЕ щвесттсвс аск совасоках абхахтвксо свосттатка зва аОщ АЙ звзізесстж скегавкакку сзщівацаа Зкаксекзов зба «аКхстхВО КА соажааадавс платехкска ства стояа зсІвестеаа глолдомаха хклоциака За пеатавзавах аесстовсвоа сказав каЕс ссвоваоста фрези х сстствааа3 3355 спатеЗактакс з ссоа ксаахазсЗх зуїоззесска плен еве его о 338 зазасаакаци пис ога лаз ВО зозяатозає дилизоаціве зботзаагов захи зе х сиза ас спон савовадесв визотсатска зіва зе таки ааєацс сихтстзасєа всаихчнозза сзааесатссв зиааестстея мевкацимти ЗО їстівна пасе аста засо аа сзгаватмсв звааосттоуа зсаацазчке зва садацітннс: зазааеоааа Зессяаоаскх Задщкктаче ссаантска цена ксеке ЗВО зазацстцив ажсствааха ВсВаТОвеЗа зпайашккис восннак вилка аХ ЗТ сеатихсоата їсте КВУ сатаіясхо Зїравневкк хВшкисасВ ІРО зсженссноа загзаазавк сспззІісстас айткасазе стозаакк хкохККа ВХ ЗЕ4О зааснянксс сота кеЗеЗсстах спеккаюков звсссатсста какехацеко БД сваазавацс зхсспезазса зсвшвнасаа вуатаввесв сессаестаМх абпаававиая ЗУБ зіхезацадх паста аЗнаЗстсоз дазутетаєв зассвсатоЗ едакавтю зага зіва аа сесае Во спис тсво сасекатсх носите веаааєкакає БО звасзксикх асиксовоаВе скосу итсе садах шини яйа мама о хсхтссадає ким ва сосакохнм акт шІва зуккжкацтв чес ЧАК сиро тзає задеанкеєн воза акксвссваа скхоаав кекс оВХ ЗА
«зкахтсхве дтссвоааих скапкосвтІс ЗаБотсоаЗа захаосацки вустсвтоВа зага ставу стзазатта НЕННЯ є гЗоаааеао «смМоазкакхи вувоостоу БЕЗ кацалажстт зозссткозта аск тс гаоазаава микпоакиа зга 4 цкасакєве зфоотаасо каз тваЄ татам мляухоеех зотастаа ю хазжуусто тзазажтаак капи вес дах шаптвнцсвА згас ватоа зве хакхсеВОуЕ заЗотоаОО ЗИ СсТЗ асо кааканивеО ака а псовхвжцваа содвзоозодаа зе депактткіх ас то папках І хттеаетт їзасасочхая таавоодсвах оаацтноснн сус стеза зхккканади 4740 чани зсзааазане засос ате апасковхоо ззахаЗсеаь «пн що кствтїсва: соаїаахаєх зватОсаек ше ане состксаВ аАЄХВеНИоНА «ВО дпиттсетто зданих астцритах абцстотатв ззезеаакає сени х о квозсовоаЗ зсатаєлавх ящгстсоака кекианива зобспостааай ско Ве що аззстата аіадавккв ззааїтааакх кахексії згтосадака ката ВОВсх БІ зазасосатза кахаккихт свзовдаках вазу заамемиих ках УЮ квтсзаека ххх свико сіаавокних зак смокканяя Веста ЗІБ заааугазах хпихсявІщс саксаахсся сасоаватито копаскевВст важку ЕД свати яс садастоває піжкасксВвЕ сзоптаздаав саке сесокалене «НО гаскааткта зсцтосзеоа кахстнуЗаа семи наков даси дес Є я заакао Зевса асиццаваса аесамідацня весзіасЗак зво ахва ШМН «кукси кскАт сзасдапала ства аак сасаллавна ЗзоаастежККИ АВК ж зосзсва зба стсвзасатак сіставтвот Фопааоєкхв косе 552О заихесгоЗа амдас ка двестсакуа хокснваом ще СЕТ 5555 кедетежкос ам ЗЕс согоЗеУкца ск соо ВОЗККЦНКХХ зетаасааке ЗБ аспттсовай роках зтозакских пз мио Метки х сцгОЦакЕ А нта за вести гогоукккна ЗМО пацссядхся заспаБаяих У засос покщасиост абзалоуцєся туезааама захсияяной спеки Б хастткката апихктсЗЗО бМопккатаеа сЗзсооваая пяксхсттох зБааховоа ЗВО саїтвІїзсо какає вомкакхае сізбсзатах затясовяа Фаткакекух Кия сттотас мл тен Е созтоЗаса сасїзаваза ахнтахеве тео кКа що ххвстсзааа зібоаскЕсс СФЕ КОКААЯ зу воЯ аксвАНЯЄВе ВаАеАТООУВА ОБО свавостсаа сан а сттсагавтя павсстоваа затекеанея фета БІ пвавесахво фїоазатецюк сзассооуцан схсхзвзтеа дсазакакко сема 5І5О зкахссвитс зісщмвасе яідстосаце квусвсввес смак ннктВацая БО тазсизснавоа вссттаааня КОСИМ. оааовоссвВе сттеацасех зехоЗВоЗУя ЧЕНІ печинься фекекасваа ожскскоаа; сассвозаао зола звхваоовІх БК чужахссов верх силлутсес янаЗсстстс засада зва ща кууккисиВо зстзоаваєаа батут укс васвеваасс баасвккив свастае ЗВО
ХЕКХАВЕХКт ЗстТотНКаК КККККЗКсТЯ ттЗЕЗВсо опа аїнЕ ВІТ но їпукквІаха стр нвиа кхеазхноая сеть окис аов аосзода3аю ЩЕ кхкакссЕВї сзоїгтоаааО сайте зем ласх сааткоктва суцгамаа, и цтахихзсвї зсззбутуха хаззахеквоа сзстеаааа астанннюко от щаца ОК сидзеяуза зсзЗЗаацело захкадзве затсоесакаа кквжннеда акекВаааци ГО стпЕеаУНЯєЕ сама сопававеВе ТЕНи сала пахнатцасм ЗК 5- звицвааяса ттдалааах сиЯхвтсКОВ СЕС КИХ Ясна ВаАя ОХ КН НИ звІстовста бат кхаця сусла смліаацаї аа СБУ ЯКия 55 звствсаватх зага кх воазствтето дехіканеха вастесгаиЕ сакквхтеВе УПА тдизоаствоз дадтацаккх зсозаїзаас асаммксккоав даазеастка коаксссвтя. Топ всвавоз маски зусовазтста афаахасвов стосстовав скхкеся ті сатутаатса кадтхсзуся сзабтісаваа сне уСВаї зттавацани ше те двом Мацсахтзаа храадасина зії БІБеОї абамихунтж теща оваа хІБО загсцпазакт: кКтссвтсова зкатакмнавх стзовааиа захкустса злаках ТЯ ск азкЕЕ Фасваесекк авковакевс свстекакка саке Фзахокахоя ТВ ци кпазках зсзсвтових зазхохаещ сттоваанак сна сукє асаАНВННЯЄ У зкецатакав ахвсавовоа хаскі саттаМикЕє солезеваакх СВК ЕЕ Кк збадкаахев сама сийвсавеаа зоааєснксяс вата аснисхвося ТУ снлсвтоцес статок тя сссстоєк похо хщоя Земна вхзсвсста Тео савеатвт засто сосок тання сстоскасх сна оцх ЩО кахЗтЗстоо Засккаств софта хвваклостТе сгстмкаксє встбедоааа о зсзсвтсвто сздвахацеї стсавсстик созисксзва ззепскакоє їсовісеева аю сЕХСТВссВо ЗсстКсКІсВ Возастасьу КаККЕНВКОТЕ ТНК сего ТВО тспзоовотї зако Звазсатекк кВаихахиЗсЇ зстазКх Ана НО ккваассвІс ек кНКх вохзсваасва пкакЗЕкЗаа СтТЄМКЦИКЯ СТЕК МОВ щас зазаавкосо зссоздофк хЕшоЖЕКеВо Зо х ВЕНСЖТМК віх тамсклчсса ток кхІвзтоЗс ХВаВККЕЗЕХ Зап еЕ пс есцае Об
Зам зихаве ВІслреес воЗсоВесак Ва ККВс ХВоФоВОвКо КІЗ КЕО ВІ зимаастк тестзозаай хасвсяжсвсе сезонне поет КЕ АКсКВ БІО теж откакх ста Коввеа соті ссоаваакаки ПИЖІЖСВЕОК ЗМК щ2до тІззстав сис копвох акахокех есте аадтКое ВАННА ЖИ свнасстзаа застами аохацковев зрос сзепогозає сусовссяеВ КЕ кувезезтси хазцазцнаа зууканкваа веретскса скаовжее песто яви кет Фата КОККаККЖЕЕ сзсззесттах стазьосят печваасеах 852О заасвсвтства вста гахаковіяа свсбсїсст акккажаасх сттцесВаЕх 5 хаахЗвовІз зозеес а амузаствна завааажах хатазавктєса ВтсЗстестх КУ «твисза5тт зегза ак акккастцАх казана сккатактйв КСВ УЖЕ смт ааї таожткскав кихсовІсссо стктазаєта аскхвихава ЗИМ 50
ІсхаВІХта тозаускаав КЕКС ВссЇВ декана яадвниссккх таза БЕ аксона с зіїзастака хзккзсвсяе аосаказе сасоцаяцвая ук кеккх БО тс ТЕО сзстсссмКК заасасствВа зас екек сІсноносяо зеакатасах о тпВкаЕцКЗе Зевса ка ккал тооссакака звтстсстїВ збазкеката КО зваттзастса се вкесвє хека зассвааадхх свтсЗвІвВса аасаацикка що заавсатзса соло стасязсВа памсааєсанк явкЗавсзвсо звасканвкх КУ всазбїзсМе піасааас свівссакОє спкспажааця сот кмек кашею ЗІ сессттови скаасккЗс ззвзоттцата сткктсаяов осзсзасааю аазчиасто За стІзсчнасоа кацонкссас звеастаєса ахктсзеква зазасасккх ах ЗЗвиЗО Зх товстоєтих спадуконіх астазєта сецнхзсктв саадсми ки сах тядах з3О сте тайовс сохсавовеа стзаадксксе стосттсвоВ Мескаетсяе ЗВводОВНХ ва стсевацзааз ссхзаесте зе ковЕх тесваамх кассанцсва ста Зако задачах саасстсст стек КкнКО стосттзсав асктКхЗВа зако та ке тзгахеккк сист й скасує взіЗЗаеасак кекс КкУуВ ВІСК ЗО «хоЗанЕхах ксзЗЗцазза тах Кце стае акай у ивина заскштихей ЗО подавав ЗЕ дак панк ЕВісє вах св Его ЕЕ ВХ НЦЯЙ ЧУВ просто Чеве СЕ ОВС пвссяцсвеа аеваєатов тост сне КТЄ ЗУйИ манасявсоє азЕстаак всесттссво сю тхх ссатововаа ак кцеКА. ЗІ заацпитннцес Ісаї киЧциКК ЕМО акя вастаЗащх ММК КВ КН миаєсквскет сте св сххоцятеоЗе аВетіаєксх тевтссеваа пакатаєков ж заалстняцив стзсопатаВо питаствтес ейЗаамеха птасоцасжь са ка ккчстясхва сеВсоО Звасасотег безсмммий ссжтстевмх жави МК ззпскихухя свеейкстає залткиНокО блю танає хедксіской МНИХ зо сізвосжека смаків схов кВсо сте таясса састахкнах тре ЗОЗ стеки хсаткчУсо аптек какк стааствеса даткцуаках свсстттасх Ми стттгтатакк меаамисндв сассслааца коцстссева адхтаакав кекс ща щнясдоавеї моасізозах сібзазоавах асттсєдни апр тдаак астксостя МН зЗесоттоцатха саткомхкоих зстсстуаВа зоазакукх зенлеівоаах сахккадака що їн аама зазкткєскю зозстоаакє скаміняв: соксзсузеа зкхахкаках вени
ЗАЕТВСТВОКЕ соаатєкаквккх заасвсоуаа тайсхлаєвх зівнеуксва девукахкий КО тами ксттатакх нозассссЗк аа снсвх їсавтасЗсВ акапаанана НО заатакає) сосаайкоцчв ззІззаекак скоса десята красияаує РТВ саунах захкскхаає єВІЗстКОух стаасхкиЗе стоФфеавтОа Бен 137 теспазскаа зссаанихве заматаваз кікхсаквкв сЗбассткка вис кткеВ заБоо їзр'раамилх зккааннинве зтставаанх зусхквсцнс сттотодсаї ств їОВав сеітзааха зацтасоссв тав сххтналІЗа світає світе: ї032о жЕажкказутв скастаниЗе осоки сот еТстІ сова сах вет х МБО стізкеаайах лакнтве сек сдай кохав але акв Веста ЗаЕх їиМю ззатацайка хахкактвет смкмакнах зехавтЇтеттв зтакекаакху встаааеттО ню цітзактхка зааацтвкнсв тсзасзааих втїзВссЗА содставанах завтааатах її таїакахтві свицназзе слати вата тах вазаткатиї зі авааай БЕЖ зацастявтї сттвстазга сахиснттеа сиамезана піхсясзаа вка УМО захавзтнстс вестагзаай жа нвсса пазаазокка хвавсссвох пса хм хайкссзивс совсзтацих зак: атххкцасх сваввссоаал савежк ЧЕ мою касссвсвсс сстзафвсака хвата захткхкнвоВ хаІжта ттаЗсоттоЄ 11253 ставжхасето Заатитис вазаєЗаамо заасствтае зай това хІ5хО задсзестда суха ся зжатоухааке свсхтазево кайаладака гссоваата БАК чвагзаских коктавзази азам кацкт все їовна псааервсно закаєваада НЕО зссзжаааух застане: смаахахах завоЗазсаа акаххкктай заваатакує ІВ заіасккоО закагиуаа заппахихах СОТ ВОМ савасняцем МКК Кай МБО зізавоамсай хек ккса сатдхвниха тато Кхлосхтасна заакукковй ТІ света ЗааскесЕс Боаааатяох звізавссх попсовосах Кк а МБО тжжаатикта павассазоа айпатновта сдтааамк спос севК КЕ ХО таті лашщистува засаснхосте атак спххиновоє хакавцкх МВ ткхакаовах стпахсозжє ассасктсяа здаесазаєсав асеМсщастО коки хОБаНх ОБО имамоде задуху осоасвехяє сесозазам ссстнедве ККОккацак 12 хавімавсх апехжксн шМвоєтве кас пескцшехЯЕе сук кеаєх МІК В тазсеодавка сасускссе) осока х візи Мена сттааатка 15345 хсдсвосаос кассаааев стома Кекс еККЕВо сваспосихк За 2305 сацехоссє соски ФЕВ теК еенонивиВес Фесозакаах се за цасаноавика СУК тоВ кетаттТІаа азаповнрв зсозтзсатав кактус В емо
ПЕТ ЕТЕВСК СКККК КЕКС СЕКТ ТСВК СКЛЕХЕККСЮ СТОК ЕВИ СКоБЕКАЕКИ ЗЯ8О тацдстоттас хстанккхав шзевсвежкса бука вста та кожатокуха МО
Масіався зЗкзикккКУЄ зсовтстсах ааклеавкхсвс сссттсатка сщклтлескя Ба
Ше ЕВСВСТЄ савжчухцЕЄ ЗоВасТасоу закасЗсвсв свссзтсака ВККС Рея застав акстссвиче іс свамю пізаскноя вста пока ОЗ
ВЕК селЕнНстЕЕ стос КкоБЕЗНеВЕ ства ЕНН 15750 зтсстзаай скоказечяся паса ева зхкІснЗеЗа буїмоамима явка кекка 128550 звозжетксза апккествто сага авея Зсвшевсосе Сава к село Клен) здсезтсакаах ЗаЗписзІвоае зозабсовкО сЗссЗазаоЗ душа зВсеВссВа ха
ЗІ каакза сззвесовао засадах Зсозеслазай кадоскиоиа тссозаа 33555 мога сзезазсвв Зоо ЗсавЗоаекИ садацакскЗа ззозвсоа а ї305о тассадхАЗХ кекс ттс оахаакави свое зх ствах іа ттадаааснс списцтзаЗа вир ссацтя зощсащМ саацутннна азам НЕРЯНО ккаацихаку раса адбоанинся зазтаватаз жито касова 13760 «ази кЗв саастмиа схо скето затв сао аасодаааакх 332 акахижксв свв азхадскхтя мюасЕмна ких спека ТУч5о І хавЗсваорвА смоаівасала зЗачтоиаЗа зссогатссвя сохне аалесвений З «кисузовми зазсаванка сссвсвстета зкоовнчоаВ гссвоамвеє далткеяйай НЕ сзвозсатао звазкаккв здовозссай золесааажс тамжратих ЗееВоцевоа їз ав атух запуски засоба клея тараса х ВЕстсссВсЄ КАК зсзтвазаха Маплоихкузу ЗазазавУкхк хек доебкаціцах зас саоВ ТО зе Коцоніаак пдсВесьси налакОТКх. сдааокатє чат оО зум їтЕтЗзстаик сами тас аа ся звасоестава силах завести З38В0О зопатетсав акссзувсвс пусааєекив пасатоотат закааккноя ваше З35БО статок МмЗКсЗестуЄ тост явІтоєтева займали орга етоЗ 1332 тестгзацО какао Восо заст сухо Земан века І3З80 зеквшиттах аклокоцвоя стома Заассотаама умах зсвгосха зок свесптоцак кекс т тасзсотави зстаттсакО гааатекаєєс свасвВсятах іо зссафеаткк ааразкас сода хахоссе злаках Кот яВЕ 1315 знсянзтдта самих аестх мл Зсеклжсхта ста пив КЕКЕ І8-ІО алі сло сисвсїсвея ВсСКскайНоО слвавсвова екоааНе МБО зскайавакх ззазасмишо ахахиакктЗ смаках пахсизетвя сосезайзда 14540 заактаккнакх фстстсааоик атака сва Ффозвайках сахнзсвос зазасамх ї3а306 заасзазайя хЗзславамма щритаия вавітааетак дпвапактсну чу 15955 азвзсатсвВк сахккхавіх ствах пхКхлКжксЄ состава записка 18555 змія зак К зво каз ахлкксове каса сккскЗацх Ме песзаавісх Кекс ЗістаЄВеЕ акихекакеа сома как ксв. МО спатссвакоааєх ЗІтЕВааЕе бетатсскає сети саван Кука нихае МАЮ сіре аки зсосвсовто ЗехОВакасх ЗуоувичноЮ ЗИЛаєк звик МБО кессомихув ЗсЧнКсервс кксЗаккеси асо х ев косаосЕКох їЯдиВ акекзааек сот мвесе соадккксх кссвтотгтаа ох икваки чисте ІБ люзаанаа: заз сдатс фвскоаохЗЕе зав соваАв хВКахакикЕ ккетсвасах їж прллевссяя кссзкваааеа заЗсациза сжеЗсатесх кксвтасика свстозсЗаа МКК хаєазксхт всоржатю зааснясоЄ сети канав х сетссоасах їн «камня с скан ЗК НеаК саван стЕІтіК Хо АХ во пекккккася загоїсаЗес дике Всем пассцеєтоє севаватал; Іо кизахиЗева оахтзковахх хказссвеа встає е зстовосяцй зак ма аа назаккожес озбозацих сову КУбо пгтоксаюхв ззссзВсоВе соааакках 15303 сахихша маса конс аях зсоаааснви ЗВаСОССЕВЕ сн за сезвоастеє асаскадихх ссоосама миокцачос за двайказася ве хвеЗетозад саваксивкс сасосовее дтасааттве запах тхкехохця за ххітсстаук кХстхОЕКаВ сфтожакхк акакксівса Беата кххсВВсое ЗУ
Зстовес вікова кЗКо совок каксосяаеці сбодсаокех сехуссввах УМХ пташине свв зааттоаасяч печі аЗас вокостНЕя Тека і5БЕО топом оБаса стозотттоЗ ВОК пос вова зчкЗоак иа Яостеаах 15725
За мнню сатоозтсва скхаккхстт зсттсаааки сх заасаактиа ЗО ктацахказв зссздааасє зразка заениекай зксовзккке звезамуха ї583О саксккикай зазасаавУк «акккккктВ Звстттаках аск инеХ звазазатай ЗМК ктжаакхкх завстттата сахакссїв зтзастаавх КК КВсКх ФВТТЗВКах ТУМЕ зесстазакі КІХЗсВеЦІс ост жКіва ІВЗЗсевО Кая ЗсВцЗЗесх ВО тзатсаааки зтсзвезстс ааккпаачех хе а асоаицчниа Кована 1-80 зазтокакта зсаксВтсзв ссомакацех ссезсзстаца коуихаккх свесвакаКх ОЗ звести кесетстаТ сакатакке стстуваакх ники «кеВ Та тТеотсгттах квозЕцсесвВе заааєцаас ссвецевтск акдеаааєте пвацазіщосо ІБ сазцаветеь кспестссвт маки цсазссатсє амееєаєсак кроссостве їв заввсмлос сптєвехтка состава: свисасхаст баса а зесдниацих іїваВ зкккастстї зсзасаатса «свасвясвза сзвхсааєаа кеязкЗеЕВе зва Каккк МИ акаактнссв фассатуєка хсхизЗсцсто сазана ЗОВ сККсї зем БЮ
ЗеКОцкуХ Хахкозесст бецеіккка ссноваваоаа УМОВ ааскНх 1555 їсвесатеОх кора сет камня сКННОастК сад стояа сихеккочВ 15520 зЗідсткакки суткистев) стгоцазоаа заваитостИ МОН Кс всватнкх ЗББНО зезогазоЗх кховБсстяВоа тстадаатвЕ скнувттсса СВМЧМКММХ сішБКиКя зи стозодавкк хоухкостост паса ах вссхесаВск сОкдеха Вусостазоа ї15ВОЮ
ТЦК ХНЕЖЖсТТсВ ЗоаехкискХ сце ка сепоБкннІ декрет ІБ тесехмаЗакс состав СК ННевОКЕ зоатОсма коимепелвва ВоазсжТотес іа тілекатиозх сеттоЗата скхкусНехс СЕТИ х увасвіссва свтозтоста МБО аспакднсяс сттаестваав секстсто так Хосе ВЕ суто я зЗцатсванод зІстзІЗах сестоасттс заааВеанк сДссярае сасгтеєвох ТУ кізасазкЗс совїзавЗах сотовхсава зудстеакоеЗ кЗсссттааа ставах МІВ «хЗакВсЕка десзсстато сзсхщост зосакиккки сет х Звкдадаєтх го китасцстКт сзвоасжикхя сссстсЗЗоЗ Бокс хвВацКх ЗОЗ оЗ ОКО О ЗОВ пхшищсствї стстаацехх сскдавеас Векктатасю ЦНС КК «кайвкики ЗУ пехтксзис кашку хх ож остх масо хяє МОМ сатаєскоєхя МиЯОО «аІвісає щастя кх втозстацах схо тВосж сОслли КестусАщох 7550 сссзеащст саме зе емо Захсховсоа авоаккакк св ВсВ іт застосо скхлккхзна зомсаам та зизкстсттс тТаасустяч; усе зва хм х салепетуЗа стоадетасс ваастоВаса КОМСКОЯЄ соло УК зксвеалаих птвссстааа смцхкехе став место остова У Оо тецаукахая цевствсотт аскатстоацт стазсстках хкКтвссст замка цух ІТТБО аескикуВ анцлаодеє МзкстниЗа стомат асанусттаж збзасутова ІВІВ хата сваваазтатах штавквихаа їзагзатлав зеквсоваааї папкакодау МО ззаасцозовв засос ако закхачкм ско кукх песто а суха тка МО зказахсвку ззесїтоасоав кКсівтаа СБ Ускава тсажщаяй калаккихах МІДО хадакаиксх ссввІсорова засво ссатаскках Усика вкскткаєко ЗВОБО зайтктзчсх сттоваааза ставав ісв ссовасацік скушкзотак соптсаавао МІВ сказати ззсззсазав айсвовосва сатфсталав зісссзааса заасакаєта МИ теожатастаз свствіакка ккаактаств стосссудай сова тазагаае за семантики свидссттах тушку Зая зазабахко шозкеЗсаза звосаасоца і5500 ктходанаєз аЗдесттоза ацаеккєвн созвсозака пааковмеве тежтсствсва зв35О «квгтзакщи ксскакнкта мм лах ВТссВхс ах Міда иКути ПЕЖО І8а2О аЗеТетаИ хусекхккаЗа сами аата хонвеозцкоа зотакцаца нена ї5а5о хсслваттвах аЗсаацннн; есавотаао атдакссвва тобто пеаткоккна ТЕ аанкаусвиа зсзстсаЗа какхатаєес ссзсзсафта кхазаакає дезтагасах і855О че тосзїт тка ха акастакУса бззосссзай запаски Кв сота 18 цкачзастяа состав ове сспаккжккс зоатсетссзех ахахаааюкс зссзтссх 38756 ашсвссяз асссвссвса саасккакаа стозстстса кактуканно засос 18755 какканязит стізславеа сасинахаа свасваасва сааакалках воза 35545 хкхасватта созтаскато заооскцієх советаєтац вістнахссє ззавасацай ЗО зчаккетство сззсвсммо «аа стс саазацітмах сатсзахснес засдезааго ЗО хекістствї тост кк аскаксввоюд асатеккмаа ствкссст сах Ах арена ВТтЗОстаєк сік ЕхЕВсї ЗсдбаКкКай зн еВксВте Ва коа УЖЕ ткассозІЗ ссттвсссах аа стй всех СКС Дек пания З
Зсакхкзтива Зіссзоис холст е акакстаєих квас тж сукаваакка Уа
Чанісмюу сеча х пиву ке НВІККЕ сЕсЕЗНЕЕВС подих ЗчЕБо вер тку бадааакК стхсвеж зпекахоєе Же адктнННх Її зстстозко) завосастах заозствско басасвтавс сватати зкссксце їаЗ8О «свссзскаа ацазузахкс звоззоатеса зате сте соптзасек ЗствчсВся мМ стриМмаккс кесаестаде зссстезсц азкккккечЕ созасвакех дова Там тсзсзасих спитав засад оиє ваисжтвесс Здав юєх тету аааХ ЗУБ сзазепасьх ствестІвсс фоМмеаеих ссовосзааз ааїуєкске ОА 15555 земних куОаВтссте ассеасоВа Тсобтежтах тла ВЕве зацаааккко М сапаакасс ск тсвВтс: ааеховккО стос касах сонруюхаас сабо 15748 звккжаккво ВККС тсВа сапакхзатс сфтаєматаки їсахіножає фомпацианх МН сазсхексс саваЗааст дих хакта бодамапава ясккацитЕх атсоалкке іч зеакккїссв схе саМо падзехсятО Тострсаски стясецеее сяк оВХ Ка тежкакаВкцх зас МеІДНввКОсЯ Тсалемааях хяхоцоааааз бахтаслуух В сктацсивсзв зви звяхсвет оаабккктт свудесте сайхаєахкЯ ІН асоптшатаа сце е асассссоа асакеанова ство Яцика Елен зазавіняс зозааь сяастаства амаакляв) звсастоста зима ОО зтазатанхі візи кавтаай пласт ЗТ Мккана ссвцоаеває ЗВ еВ западацаце заувоазааіа панна аа Запазаняа Злпнпаоваа ЗаБОСКОНи ОВО ззакцткасу глізЕКтс пами тхаиЗ Збааатаайа ЗсВпАХцеТх ВІМЦЛИХ зачщИ втсдайткаж схов спина ВУвесаа (НН ВЩОТСВЯЄ МНЕ в«сазагкайзе «кохана сздсаасациа ЗеовОсасте сЗатадитнх СКОВ за тхайцсваті вабобадсщер оса єка сопозсомм сстогавкх сс сва года цасвоКасат сома зозовциаає зуувиосков зас ес свхсннтстА. АВ пАглАНтКИХ СВК сопобасВах еоосаетса оКстацккий сцсоВоєтес ОБО зночасвока пезафетака зн сява дтзотаасв зав ххох зевавОеЗе гм кцстаочхих сезодатоу хаосу зав Зевстаакоо саакаВааа пк рних СЗЗ ак МЕНЕ ХаХ ЗТ МКК тнняй гтнхатОдая това
Вцуєакнхцкх сок скахкЕкиВх сазааатсск захтахакту заст ТОВ жилка свзевазає зайхлиис свазссзааа така нисв тафти тах ОН) акиахесст тгзщааикх ктяхадеаяке хТстттааай дасиствоав заеЗКеОКо ХНОЮ аежжкускаа свіціааках ктсахтнаах захованих кате кевВе сзаскада ин хажікоЗсхо тасоакиайх Кксххнісаа З таєманй папства Бо таЕх 23О кікккнкаКт са исах вессквусяа зам жаєси сатстееевс зам аму РЕК И ках кксо атак иаах астнзнІвея закатати ахттОка сала их ма кхжахахекв зтїзстазах ксшчЕснаст ттзадацтх нсвтсззезй аааакиаие ЗІ наакрахкая загзвахаай кзесетаТОх фажкааваля аетебостаж дадаатаких ЗАВ хивівцвіса са сІЯха звазаяіїя Зверкжаєсхв зсзсвравак скакккнекя з42о ваагзсттза замиазнах тазааїваа гусаксувас зваавазава сСкацйаннко за стозваассос оаальссо зассваттма аассзвІвта зв соц сеО зі зкенхзазассо зактадсксз згссажекак ат стазіс збайахазекх соатвтЇса ЗУ зЗаВЕВІтажЕ завкхазвкуї сабозакахх кецоваВеВх кослазакша Зксзаосста зм тан лака хсатоаатт зазавсацех созіотаЗ змалтвучеа зало ри тустаазааи ахнсссгааа Маисаакнях тЕстОстаце зеЗвЗефееа фетакцах дО мавсаааює саьцявезова аваассакзв зобозеааа зкксцвааїх басзаацваа лАщаО пхазакакткк гзаавааата «квкзакианої рр акааав заззарваеа Важке кикцЕ мВ зметтадакаа зевросссте ха Оа своих КкцсВсоїВа стаккахокх МНЕ ссстКсЦа Ки КеХ паста борода ККЗ ЗаКОСсИВ ЩЕ змениавзак кас мтко акххххВеаї вссзааазцт кет засну зщова тозамсксв стосстзевс захо кнУХ саідїазатя сзжцсВтВІа балок сВХ ЗЕ зазасокаокх встав ой ставачеЗУ СіСгоацяс коБіаОая МОЮ еца ЗЕ зстзаацати зсзвсвтзає капоаасува ставала кстеЗцащек давали х ЗЕ созоаатахх ксхоссзаао ака БІ тозаєка зацзаавсат зфазавникх ЯКО засзтсмн касастсато сазатацень зкоФфістави аск закладе ЗБЕ ттнпдозоте тккенидатт сам: Косотасааа аскаснинЕВ За ВЕККа вро что скставства ЗК аєки ЗхОЗтттаКх асо зВеаоетй ЗЖМ свазвісавнсза са жокоцав заасВктсах дихоссвеаа ЗИМ В ЗасяхОся зи чкацаксЕва зазсакаках Косстсвааж КхтаакчиВе Зіотахксах АпККХЯЦКЯх Вика звЕксавава гавоцхацхя сехавазсад ааанкЗВ зстттттх прова 55 тахщастана тттакасока света х капминазі зссоваатТ моамоплая ХО їзсатвакт: тастатихих зежтстосла сухакіактх сорстатетО Зсалкккся ЗІНІ
ФМС вилястих звІцеВтако Засохахиза сетовотака сашиоккя ЗК замах міфталниси газу веса плавав ссзжзсзаа хахацках ЗВ застккстск акхахккхсс пасвозайся задклхстта сзвасзаетає каахнасвие соЗШО ззасаасаза сайсактнся зсезсаа свветяссвє зсожтоддаах ККокісннх кеВ тестсоєккост акоВккни зосзатає: кОсевІсоае тою скекеосхах за стесвескост аккЗахксхВ стоФаКОВОЗ ВетсвНасст ЗБЕ сенотвацих 3153 вес екеме укоуаакстс сгзсссекик КЗКОСЕЕССВ сКесККДККК псетсостВЕ БЕ «ав ни с: зцасхкчккх вссогаваняк зсіссствов сука) звсвЗцажех ЗАКО сс: зас састеотка «вас Хеево скаккувах оевцсетеа 23 сататостте аздехишкту засос хи сосцевкава асткккккХ вузов се 3 тіасадсвсх доссввасса аа ссвя сус ак кятнсо устав пуща маса: амивсвсст макахЗст тстовапова аасукхвасо зааМлХх 235 тхкжххкатУкХ сассвсозсу засжаксес соззастув таза товВ спа ІЧ ккказвінве заст еВек МехякокЗс Всповасикх соц еесяв вка ХО хапихасхвк хісЗкаава пуск Екис талосакоцвя пада сгаяа заливка ВУ сЕпцтсооов пезтщежтвв сссидатоса ааклттуксва ттсттгаква ахктЕскоса ТИ засхаттгсвс стестекакк сктсттежкх КЕакикхиВа сток к застосо ЗІНХо хасттвсятоа діжа ВоВТСТВКХ поаасКос тастдеаіВа ну ВссВКВЄ 2388 хжхсхззасуЗ гззозОахкях сцссоВіавоа каві сцаВаВ вахоааацхя талЕЗа о 23330 вижстсзста стсоакивкх зВІЗаФмМУх Зк аіжаахНх Ха ТЕТЕВ М застЕзесЗї азіасаквоз вавстакаця ЯКЕ аВЕК ПАСТКУ КеНХ ХО ЕААЄА ВчОБО кстксссвсї гззазскккх зссязіїїаай зоасяіяаа Берк каних звітах ааа ЕВ засасвссзї зазтесайкх зсссстасва зеязняїТхвії замтайтавхх тветощтаа 2155 зизизсвсет зізствакхх засстоаана злахивІїав аетаносх Зевс дяка сзкоувіссе віФфізоаккаа звітах змививестя асададется севБізааає Я30у козсзвасва стсзтакаци зт змісаасцве вапаацаяяй сежесОгІа паз сакмнучзюнмао свсозсаках тсВестВетс салазахатс зазпайахав скссвуухвоа хг ссланццсв поток хеснвовааИ Звкаакаксе оовааескосє хКичВЕКЕВ 4453
Знхкацчих атсхцКеВе МКвутцтова Замах звик Зекклкакая ІК зіассатоах кокоетваао паваццесвї саїтВааоях зсстстосе саке ЗОВ сзазратаза спкмхкасссв словах саїнвааха зада саассаовкя За скхланши и зЕЗовзІсе Зкоахвксс састовога анонс сзоадтетиа ага тхаклКки сЗвуВесест сехскахвоВ зозазостта зкисвххтци зохомаєаєв БОБ цпозцаскнай ссВзаТата ЗК оЗнУВО соте айва є сеустаєкух ЗВО тконитахО ЗсхВстаеВ осика Фавссзесває зккзвовете стассакква ро сттхсвоцяних зааестезах пуссісваЗа обозатспах чех ктоааа мих кадцй дао твуахнскеЄ сао стапочесВа бооМмУкх ставав суха ЩО зссттоозас стазазака сесвсоех паски: сту пак еенея.
ОО свозсзїсво заст кове как сккккатних свесалтлка песскНЕ р: аа засссзмноа ссзазкска Кс каски кс сстааеВахх «ККсКОЕОВО За зектсевтово Фо овах зозстоастав ин ке зом закхквщся.
ЗІ «ЗІЗ сабцакукхх зеесстфука вазацакткс звасткектв кекс вва 253 хкстЗтїзаз созаухкахкх взвссцнах сек вівакс дб сваннах ска гУ3йО щит їїза аква сс ВІ Ірак стаксвхаха ЗСУ М У звіівсрІз засатцтянх зактайсвхо схзатосятаа сБктакххвх дак ХО зкізізатта паписоссзсв згтакакаст саасзсосоа тадиовзсва закаказкух щу ами тади каста жс саке ха тсатставух касувОвіоя оБАдЕЗатОХ чо аспосхаада кснсосссау зсахкалвая соїсспсозах пече ства фе ХНя ЗВО пркзасхт ссізсвссас аахижАжеех бекаєскс зессаасамх кокосове Уа пса хкцоах веааавтеас сасхсоятак авукавкика совок 25287 «ФМ «Я ДАВЛЯ «ех ДНК й й «КІ» шБтузна пали сть «Кидх Й . кофе ВОВК Х мухавотиннх пасЛІідДеВніКт» «НК Й ки меха жнкакквкя тзезакозоаа соски жка азшесухтов ск БУ пасвтссодат каїхиханев засескескхє їстстїзащк скасссрвев ажакаккхо 12 тсвиввсзето аказкккзив сізЗааозовоа саззсовгаай ксхостваха пам ми хсхасзвсЯхт зстзавакоиз сосен ї лздзазессса актвувкхуи атетадкета 4 чекезЗїЗет озвався затсванос влассвазат акалаквхвх зате ката ще тахащосстт гзазакктт: кзтавдаххх ссїїтазааа амдусквоня зтаБекукий З сЕсхсстцце зекаакакх хсрбтахАта суаавещчеЕе ЄДКЕКЕКиХХУ звететадах Зло зах тххце всЗаМсаскх ТсхЇЗесаай сво кава абосукеяах стежу ЗВО «ескаїахтх веВтфсозак асстатовай аїхктасне акоКеккаєв дасещаВ ще пааасктева сеасїсвааа ктазвізцаз сааеєлкта сттаЗтавх ака етх В ккакаххтва стзстааакх Мурітаастх тодавусоїа сакоаакоаа зовтхвОсся БА засцикхива зсазвтаах атсами чих вжевзцваза вускеската захвЕВтКеу Уха хахасиссвт зсосттосза азазааткна сек твастаз сасавакакк ен есва УКВ заакхкзисв ззосваоагх зазазайсих схсвіставсва зааааааа: снінавиЗо а копазнкско зозааагсов ассдзаксосна зсувів Зону х Кеди ЕтЕтоВ ОО замазаккоа вссавстево сс кехе сссстазета тайіаакьсх вих Еткаа ЗО йакастяжІ встає зкгазкакк соозазтттх зЗкааааковя теме сеае З05о змецсхнчтва тзкуавта азадкацктс замов каакакакаа сессетО Зоо
Земпиннаная свісстазак актааканкЕ Естостаоба зване кевиа Сеат зо кайесвзивосс зоааемевах павскакана зр оааО сххоаиаках зсаазпозає їі зачхнІтттЕ зак атах фоваховеКе Зоаасааало ана Мч Мк мазвсявоа сс азацантос ВОК сВсахнта Тата ЗЕ кекксоствс заз бабтзствтє додав хссовзаааеа ЗхОсККе ЗВО коза ааст тастаоккай стае ссЗ аск оВ ЗеХеТсст3О заадакка що засво асоаслахих яко сесскаяехв состава аааковиках ЗУ хихосвозаа зспєЯцєх зосивіста фкайсисвів каз оОу ооо хаае їі550 хахкктаМ ЗМО стВЕ ЗХЕЕЖКЦИ ТК птВслЯсОєх Тезааткає витеосоцаВ ї52О стстайтсає алайасосвт стсзтааата асоассвсвса Єтасаєнкка зесзссвер ї556 зеттзакцта акххансвов азетаката сзВтсвтссце задиккоуцся зона теВ зуяа зесткаацай асктсаїтос сзватоакхто ззсоатсоцає зспсстся ку ваза Зо стоЗадККК состав зам КО тості гсввувІтВа азадавтадє ЗК симданка состава задо ке зеаділмиух соссветтсо хадсвавацо ЗАВ заспаатск сені пазаєснвтст заатеваввк зувхсвоооа авазитноха о ззезаскиза сватів мопсахнне ссоваттиака какссустаа зада ккоуах ЗО зісаминиз созтсвзасав смаектаво ссаавааана се сВтевУ акадвахадя ЗО адопацитца езсововав кава насе зосзааавео свсвецтаа сзатикацкх 5150 їссдааацив висовссаВЕх аа вою ссзазавхах ссвЗсвосєва зекхЗакадх КУ зцсцекіска неваквівав заасцуацсве ссааааацки кЕхжоцОБи екв ккаєу ЗЕВО звозасттаї сівоогова зазкацят ссзваааех рвисзвоза фксавацх З пзощкнали вазчсскааО ска киї засеаНх соня соках ККеНІ зссвесєа аслоиснаї бозафзахах свовасаа ЗсаахнссвА патемааке жа
Зкшсстазки ксКНОНа гЗосаМНИ КЕКСІВ КОКО ВІЖТЕКЕ Зо адазотадаа уми кевасс сзсвавкак нако яаце СКОККОККка сус ЛУК кккостааа ПЗ сассК КОТ ККОННКееВт совет сЕсоция ак засвссцевя зсзасацяняа саахчвевца згасає хахлезвово саке реж звисоззІвцтв осадуанцех совазвиксї зіааассака сова заз АК завІсезест споккайцст сзосвсосса гстадодана хссїсваасох гадає ХВ стсзузстса саке кцВ сстовосзЗО ставав завоссстав мазка В аассевоз саасакихУх Фіз Здаацсоския чесати паса МНЕ ззезвосзт садазвиаксв свозтссек ан какскоа ввоаттацтєя самувакки що ввсзссссса зстстааоск зЕСІЗоТожх Зазазіаоєя зсазесвсах паспевая зов зумстзаца бсзаслоучна сзвізоааоас акккккавев сова хавкафния ЗІ чІтазассто птах) зсставцаза забахкттков овоксктаух вазон ае Кая.
Зіка ставки заствтїааву сток хкто гТБІакта ОБ ККВ 3940 тпогзазааа гсстісатвса БУМ ттвах схжвІстВЕВ созкОйцхХ КЕ ККТУВ ЗБя зза3звогаа васпзвхоа заст вака зцкхаізава Заавитоаси хоцеЧаке 3350 фізгавтвах саке: сива зОрасоеае БЕОаНБІ заст КУ шунта дюозсвзсза зак даух звазсааєжс кхехшЗссо сажеосвавух їа5о зас а земне копкахоциа косовтозас захкскеККє звзазсазоу зо тзавагкка акхксвІзах зктваванай дзаведтішиа ставити сазан Б зипазаєтац книзі пехеваск: сатутассва хвощ вако смак ЗНО заззишнвай стстоцтесх твсховашео ставках зввсотакУую акаккаака ЩО кахакаазас дтзотакхка звтавствоЗ зом кеКк звозсозаму авазакччнв с ОЗ7БО пенонаскви зозакас зЕвасїзаЗа зкуавкктУя заадеткоха пИсехОНКх 3840 «хнхссЯЗа зок ЕУх сзвазатас: зовн їїа заспанична ввезжттааа ІЗ завхсухзе ссопктакзє говір авах здлляціччє станах сха зт 3355 хазисхтвза двагскстїа за еваМо сощеїчіЗ асайаекскнс зватзнезеа рію тЕКіловоств Іо тсВ Зстааасти: вести такое сота Б асхтзЗсЗивї ззасалаккх ссцацааати сісятозесе какааххнЗх свомнмжах ЕЕО песизтсвца вобаашнова гака сих сваатеееаа хакхасекчев зок я ззсзсввкбс вазадтзатоЗ татакьалая звсвоаах хеКавесеЕ ЕТО ЗЕ талона ставоїттае арраєаєки ситет ЗБанавесци ЗАЕТККсаХ о
КхпахаснкЗе зак аеа таїататтиє кудслитдевт акккізстя сстгреаає БЕ зихсвцв стізекактек збізсааве: зтахаоахе зошиту дтатаеВсах зата
ФугканикОс вхо ІЕ зввсезтаВоу аксона За еВХ всязахасях Се сіжакацєетт сстгтактво сттссовзеас зааслонисв ТТ Касавса яхкнпиВНОх Зв зоваакадаєса всзаасазия ствсвятЇта азхтаєнаке зссвеасттак акне Я таро кис не: совядачеаВ ВМО КЯ ХеоЗБЗКУК рих БІ щотатстож скосхаккнв ктствесоЗа зон етя зоссваееє Брока оВеХ Ах запасів скИкхОЕКОВ ЗТСТссСтТама сКксЕКсс ХТТСКМЄ заст кастЕ Яще четатсиу закххоиасх сзсттвсаба заз тхсс стзовассох пахзпуасяя За датееніься ктхтНаБООс ссттЗтоккх зЗсісвсввсов ТОбтссеКак смисктвсї ах
ЛЛЯНА пелена ус спАаф ЗсКЕсВЕсВ зозаЯкаяхк КККсЕЗЗЗОЗ дед аасдкхтака ассоскосіся звстовоатоу ястзазаета тстадаккх «сівсороває МКУ вазакстзка аасхсягсов встик о вес тогтеа здповавтях тизсовЗЕ УЮ ацккжккткк: акоксхвсся тощо сх втстотодая Бекон Е ЧВЕтастКає УМО щем сво Віто еВс Іа сх щеТастстта аслеиювВЕ вес 5225 акштаксакки актЗЕжеВЗх зас а сттсстаавО зсваизаає таза аайе Зо какжжкхних ЗцозавозЇв сеткаски» збасзозак ска сет свтдаакикх 36 ккккацекхи КЕКС ТеВ стаєтекесв сеТсеаКк хаазскеВе свстсацкхх КУ кине х аква кевкеккв сіБеоова акхжсаєв савани ВН сноцдеснаса осв товОв сососляуас соссосахя саясяоаксв заочна 320 зкахвахане веозскетка ссакксоВтс зара хх зтсажтама хахахавевя УМ куттвтсттт свсавсвакх «слово ЗзкдайакУує заезсаееаа ха КЕТОХ Біне «вівтозІза сзетскклох зкскзвааь сккуєсВаїе сзаацатяка ввела 525 звхЗаїтаа ззазакитах свіззатіса птсвстсстя стакани пута еках БЖ зитагщатє таазанявха стає тах ства стоа зхадайкивт свозттекад щі
ТЕМ ке Мк авасса ЗсбКакааа СОФТ «кхавкктсв Бузок ККЗ тела віки сваЗа Ззсозатсукес збтазвамс асан є зЕТадємиса З силасасах авхакцсвВс соссоацаах БИЛИ писсовехеую самомсЕке ВО зайсакикаа засо спапасвє асзсавасая селевоЗ вкахакиххя ВО тгзгапакза кекс лтвеа вакоместкЕ зБавистата заттвастся ех сВЄ а тек таєктка зассвваст сзмпонхвса засаввна ананвсатаса суавоакссх БІО
Укзсазкіак касказвсвас засаввсвво ааасаасакх сан тещкак папа Ве Ве сатаккакак кіксавоава стсхкаєтех тами лектх сусстестає веааккксве ВОЮ чазажїщакха кістка дозсдасваоа заазашенія стятсоваоа БаБОцкке Віва
Фах хаєка акжхсцткза сапжоснясся фун севетоаства сеаав ваг всхлатиита ккоакассївз сзадсацієс сама соствзоазе: асани НЕЖеВІ сттзадтеес жест ов состав клах зВаОцаасВ стгсвазанО БТ БЕБІ вес агловІї зхдадязхт свсслзадкаи сеовоцсто запахи кЕ саЗцссекк що «ЕК КІкнка ХІОСттакнв Вста ЗІїВТоОста гугатомц ВВС «НЕО кЕкассісс здуває кто тОва хост Вевк БІЗауМх зи аох жа твід ТОВс пхахЯсякоВ заз аках хаххкіскеа стофаааках соКжКККЗВе БІВ зааитатсс ант кЦсЕтЗ ста Ояскх ячатяхцова кажхскоавхяк хоче БВ звхсаВивіа асавосясся хостах саван айсзсоавхах ховхоссОЕ Ба зессЖЖх МЕНІ НетІЕ ссзіЗаиоа вІсешкта аддхиаяцхк тосту МБО зле кутссатаса Ззагтаацекх стос тсстВ КЕасоВоТеТ ТеЕЕОКЕЦЕХ о сиза ас стзсст гсакекЕаая свсвїосвка ссивася сема ОЗ ки хакше ссЗаватсаЗ атасовасст зстодатакк созствства стасодаКх УЯВ сфоазїзасзккк сс соста сот ХкевВе ЗТІсВасТко пасе СаО КеКЦЕ Те засткенеху тк тсЗеВе тсакяхкссі ЗУБ тааЯк ксхззсуааса АЛЕ КОВ Тео чспзашкаке «із твасса саскнихаВе сли ска В МОДУ Тай зМигетхале сізастасса датсЯВсак КАС КаЄс сеТСВаКОЄЄ ЗМ ЛеВЦЯ. т738а сзассаеця став асо ста зосзеЗщакк змаххдлаУ КН чпкациаЗве зосмссразех сехаЗссоат акхкжкактв зоссткуакай кккковЕ ТУ
Чехесуциае зоаааатоха пЕзхтоВах кдхкхкавися фттоазсаата ваше ТО аликспивтТе стастуєє тк Освакоа аххахсятак авкттстцхх зва ТБ звисвсвтаа каяукансвих стакана всястястта зачати сег гамх ТО зозозтсссо заскесвсвт стззгасиси зсзоавяазса ааптахвас сзсааастаа о сагзваїтат сзссреоцтї палки сувставакс ззксовттва азамсоадх ЖИ тзїаккацх стаття: мм сястза ЗУаааасазв сесоаекай арка акАУє ТВО ззатататна тттктатата зпхЗсстева аастикккВ твоаатккки ккал х ТВО актінкнки: втетвасх секскозрсак дхахкакксс здстзаажкакиу сах ТВО купка ккаа стттазакаа кс тає паткаєкике їтатсзацки ккясхладяих ВІКНО пкаменнксї СТЕК кевевжвсає зхйкканаве сфаттванвх ткттВжЯВЕ ЕЩю
Ехо за ТтЗаазкна застава аїкклинаех азагацанка свт ІБ хаписаксВї зак кЕ зов закх акхаввтІета дфікалжуути аачеЕа ях чяказкизизв зіїаксайй спасевавит аваханнхвЕ самих каВовнаяЕЕ дО кхсктасизЗа забакжкхна свої атак зх хлввА хвааакиаАтх ТЕТясТВВІА ВМ кахтатахккв сттаксааза вухо сааа Зтваацихіза затазнакто яссхвянсзаА щю зхазайааакив дззадюків звавссаю алайлловво Сеаатсосаааи супах нцЕЄ 5455
ОТ ЕБНХКХ ззжетекцака кааассцяве сезексоукх свіже пекхаахкаха ЕВ акація не сзІтїсзаза застала кзаиа тбазсукхас сзвІЗТсевО дфавакккІце КМ зазатшаатя ввосктаках фімкесавта тозакттаза зсвостсоа ника ВО зсвтсіааки сВстеОакІЄ їзаалиниха тсссаацках снахВАтте тоастацоай ЗК ввафетзосх аклаксхзсв довазоссва васвкаваса пекасвавої дазіцаЗвсї, Іо тоазавІаеає Звпадсянова акабтткхня дізаакзсе вахпвекто засаваазцай БЕ загзатават сети тазаланока. бсссстктаа зцласоЗсво ТО 558о гакавазсси сеатостеоє ихастисяв дата сеанс За Во ззазаназ: чзаІвоваесе аспсЯвОсяе зас ека став стста аадашкаа щи засаиаксаха саідаезете хасевоссте обов к свсхвоЗате захоакихаа ОБО засакатххт зІтвтісссак ккскивовсс басаахвЕс кіс хвсЯаж стек чо апхакхттва звссзбвсао аск ссготоцаце сузоеває сацоскценх ЗО песопасоаї сесубааах состава МиЗухуниВе ЗОЗ аСК ВосеККкнях. ча песлЕеКЦЕ пап НКХ СТОК пющоКхсВК ОЦК снофсесВа Нюх ктссостоеае Зідсастсо тсстезанвтю секаницяєса сфе хВесоаВоІ ща ктдастста МаЕККТКККс сЗзеоЗсств ктхнєВо садок соссстесто зада шестттттсс сасавцааке зосозакаах кеоисловас сасасоаака сет ТсВ. зада кктзттеай ааассавияв зсакасакав сахЕвсВтоВ ЄВИ АМАЕ СЕСТОТОВСЕ За
ТЕКЛалЛевоМ СТИК ЖсЕсВ совок КХКЖТтВІа схпеоВосвсе вет ааотая З звозсахтсй МетевІсвЕЕ амакастя сссвїссєа асапихацев зах ЗБЕ зсохтсксак пихсдвесовс скеткинксВ фреска шиткксвастс саакекхОих 33
Фарскеа висвтФезев кхасксассвто ссїстсвгахо авскзцевао киска я/вО тмлткавнавоа суззиссаса снхтстКВо зва сауєчижАе ссвхалхх ака киховсосве тофу ааки: стссвосатО хана Зессстозай сохвоасчихи БО здацкасвкоз дтстораєуа сзссовтоЗаз Захоаткосюв возом астсксхвке НИ цакацтзоаса согсзогакких свосодавацк ккакхстко ссозтсоїаах сНсвеВОх ї02о ацевксоЗеа застозазза зодтвасоах аква сва Тоді ааслає зве ссеЗцу ТОЩО аснцвавссв пат олани їЗаассвоай ХНН ПІДНЯВ хитЗаБиВцВ 13щ-О аоихнацоЗса аа цаххи: сао вазвасовЗ їасозакаЗе сюктткВЕВКх. ТО чинавсаза сізаавчкс асо поснниАВе Стас сад еаЗо МОЕБО ттдсссаута о тазтно сазана сова ста поззсаУ век воаспазласа задтапасая заці аосзихяехо тан стаз Ко МО сукикскека ваіїссрсзЗ соЗОїаао звсдайваех ЗОВ КсЯХоКОВКх ТБ) макавкскса Отцем какозовоза сткссазсха завхзааа ссяхааквай МОЮ миохззази зсосзтссаа соком: закстаккхи хазеевовах заклику 55 їогакасЕси коаїссзааза ККснаЗІтес оазкссоань сану НИ МНН засавалечи дсЗЗсеаАвх Каменя сте знеоатоє ку аавх УВО ззкутавсв пхаЗсловца кафтеаснцях яТеввиасх ока иася ВОАС. ХО
Зазвовтсвс бсзкаасвне ставах ака ває Хоч МОВ зузкакскко заавсооккк спазоукаес давазсоцко сЕХесКОК сіаайцУВ 1085 закокккхка заасосскаа созесскВиї заакикетВ Зно воВ МКосацакає мкма закаасксеа засамааках пуснаттата ааїухнвоко тазКаетОМ КВК одХшЦЕ ка казка: засуха авт ітО Міка ненв: сісттаза кЗкавеВНсе Зх писхціава тома сне птттавтоав зккЗяочаа асааатак засво КаКгу сховоопзато зоба тагеааеих зкаеоодека сах сот ВНКх Ме ствсвсдмае актахксовсо сзазатоукацк сазевозіах зспухакких засво ЩО йаззатасаа такси: ЗВТ кАстав «ска ВсЗах засалцквтй СВБ Іо зІсетасткя описи сі акехя пат мих аКксдектасє СТОК мя сатавісаси хссстааацо сла нняя теза пессвнаваже аладекца МВ згаіцассхя слІвотосав баксаиства соксоаавіа зазсвстааж токах НЕБУ зкасоцисва зозсватаа саке тсвсс зраакакавх зизевававеа ЗЧазаавха МІВ здаскавазя заісвостах заасаєссва собака заизсвесаж хахкккавкх. Ма сети т соток хх посісечст апа сг дизстазова зах свВЯхх ХХІ пицееваа віссрхвксє Тцостадее МетстаОеаК СтоЗаааМХ хоцтвссцоє ХЕ постах аібшеєнсхя зобстовава конвстстеса сзсвазкцає земне МУ кствжтсетак хккхавсеко сзаїзссков хессватає стае ахо зеусасві 3 зетзазїзЕх зказаццаза вики х пакетах моло зсааеВає ЗІЯщО ісаткяя астсаюосет укази тх стсзаих МУ кцияає стттацацех 3159 тзавсттєссх хосвтоттаа тапектЗвес пааеаккосх вкрав! зааакевакх Маша
Ммтвазкаих ззазеспале кехаикихетх ФеКкайкик ска ксва века. ІЗО5О зацкацааця сзоцсаавмих сксвжвсєта таскуасвно «авта тя вссцмсвкцє МАО зкайжквакиї стЗстесСкк сановоуЗуї ЇвтсоНаКаХ «оно є подааСКЄ 1-0 зізайзукаї саоздаавма сети ВКСКоцскЯх усе фрдокацєє ХІКЯИ закис ВІТИ паветннє псававтнтт соЗаоцаа ЗККаЕХОцАКХ іа ма авссвІа встсса ах яхта чсВОа асскасувт звчасвоевє маку ацех їхав ткацазхяс зпщленя пассватаве сбалихссях свсзсозсцо аоБосаВха ї2аха щициоусниа моорзаасаца пеЧооссее СУМКИ яЯХ СОСОК КК ЦЕх. іза8е ска акі ЗИМИ поцихІлосх Ота КАЦННИ Тая САША іл тотклаКх Зінсваттае ацеНсвх ЇТВКИкОтТце хтКЕмКЕащЕ ТВО ККЦЯ БО
Тооуквацктх віз сстївса хкохаковЕс сожсайесвк песккКхЕс афощіаках ї26650 ссоцкавткц свтссвеова соком кос соїгоссвацх кектацоюзє свтдевске ї127хо зазхтдамн мис зове сОссекос Ктсттасева сапотоцаєа сового 1575 шинка нах а знає зе стоЧеах ча чнечЗ састозяхсяя 1853
ВЕК Млини сЕВООсаа вадснахІса ство таца вккзпанахе МЕНЮ зазасояза асцанттяв зеслаавсс засаяннхк свістсттаа Зазихаякоє. МБО засос ла заст стнтяї мета савих звайлаанува зітавсюк ацасххтнех ї302о тамада аканстявеє стадгтаєскс сахквхтхак абдаваєста снах іо касах акаапстоао гато кис пснзааоста хвакоаааки вссватястх век заказ кх ик васеа хеЗаааза: стнзсоцссї айдахикасхв зсвІтатсва ХХХ ссозахацах ххахассваа топках к свісаЗсВКс аКНККНКиК ЕОсТТОЕ ЛО тпасахихкксх сетЕааВе козЗапасвс сідеаєттха скік сват ї3ще заажшаанс ссвуасє агосвааско затв с сазнаавсске ссеосстссах 1335 миєксвоов реак аМІКоВисяЕ ст зааНсВешсИ САТСВКОВ мя кстааазсве сатовестакх засн тсга тсгдазадас зосслєтЕех зсаакаюви КЕ койисизсвя сзазсаакай асаасвстас заскакатке зонаеЇвсса сажа ЗБ «стацсЗссо сіззасадах спос амсоцпіВкх зма хастнаєккх Мвт хЕЕЕТКкя ссозоавацуи ЗТ; зовсетщакс овес зуЗицахХкх ш3Б5БО петеагозг) сіааоцекот сяовтствав савгехоазі Зк аВ сопхускКа З сего Задакасевс соми амнввевсс згазааоовк ощестВВа ІЗ) тстзлааах стаднкксся согтодатих сет кста стдадоаахе КОС ЯК затапооат акжхтса сс ето я Би еКЕКЕЄ обох 13Бо
ІМ лветк стцетестха стооуксвяе смс ста кокесяцихо саоватеде. 1353 кккОацзсоккх зевеастета сосна зоазсжевек скксЕвтсЯє теттоаВатв за ккихсксККс сІВТсокЕх казсакссвзо сзеданжка зксвтчатас тека тацо за
Хкхцхкекк ссвВсстецє КеКіОиВссо Фобоса нт еЗаВас ЗзкекаєВаЕ 13 сЕхтоОЦкКЕс звоаосаках кВЕсВеорсЗе сасотстанса сквжсвВтої Фоакамчнах зА25О киховЕкада зе сас КВК КіЗаа сфісаайсєха секс Фесакскаку 14588 сакхоукіки азс вика сКЕХКЕК зосцаласта хвЕБоЗс КЕ Сава 12340 паж Ес ас БЕХА сИх кВЕха СІ сонна пек сов стставцяхх зо
Зсгбцатаск КЕ Кавасе КХеХІКОКХт стсвавекта ккхтсецаце саанехк НеБІсВ
ЧККтЦИКХс КЕКС СОбХТКЕОЄВ свжаєтиско ХЕ КкОЄ рТАЄВЦИХ іч ж зицаскоцак сексі асс пкт Ко шлаки КИСНКВНсК сам ЗА соми кіщкка баксів зкосхаткних стат зста забокккив схфсосттааа КОЖ здасааоктв азисетствс гхасякхкое ЗоЗсстсвко ик Х савсома тами стае зайти КОМИ ссхвонаттх щесатецакх севссствої 1475 стос: ЕК иняцс КОВКА пкукаяияа опабтаєва дпастяссКХ МВВ стат сівасцЕкни КЕсІзсеомО зйахахакає зсозстствох задаациких 14853 ацакктвицу сенкан зсазасктях Ззгувсософаа заакаахаз ваза їз щуіаахяатяз сззсзатака зогасанаях даозатаау ори вова зер їМиЮ авксзаони зкнизЗе митна смт ахтазаксав зве ББО ктккхнІдта ЖЖ ттавйа їкаканкіх базатїтетак ааазкааке ссзаесоцай ХУ пазйсвнсЗтт сезІВжесКає сама вм тасст ваахктаЕе сетазааоа МЕ хоивосВхсЗ ссоваставіх скБкевстат ссстєаазаЗ стсїванату засадсвад Бе засво сва соїтсстадав аксскваавс) закатати кствтастаа милакарка 15 скаассвстя стосссоцай кхаханісссх соаакуатки скистааста каадекккох 15553 преса замисзахка сс о задказкуми стсоЗоЗазсу ОБ ТОЕ МЕ нт«стцВВЕ: созасопцка пах КЕТепЕккяа сват ссехакАКІХ Ман) тшцевцц асп хуУ ся а дппйккаххс вас хаскі МО звоттаазта сбадсвося зозсвазаца зкаалайхаа сова вусввоваа МІВ чссза)каав аказхесвна зоїзсоаекка ссистассда заплавах вевстсодев 1555 їзітокамхк клоаки ов стаззаакакх зсневтЗеВе тоазссвкакт Зевеоавев. їЗ7ха зізсмасоука хлацкксзав воазсскахе крунОсссвї осааацткав озстсвер ТУ метати ус захстсоезов аіатаавскк яті Вкладка Зиссассвоа З55 каактснсвя сссвстстса сасвтаняЗ зассааеах сассннизах гттагаасва з5800 ткакхннсви сваозвасаа касахавкве гзсзактака кетасввтЇВ ссакаккаті ЗБ лоснстчика ссвством асехяатост засзагасац паст ЕВа садпакуЗай мВ сапрвоцеух саааважМучи твуспнЕакс засдодая ХОЧЕ М МпІЦВуХХЄ МОВО пссивтсвною щеЗТегліоа вЯсхвтот саке Ех неозозхрав але ноЄ зв кстстетзс агат кЕсач Зевса жоккх соках ктв созосоцата сеБЕВессяХ За надвтсстже асссткжккк сВтстТескак аклкскайсв осатсозекай зккхакккоЄ За вместе зсаскхасх ссБЗОваКкК коси ассе сазЕсаОВи КК сВЕ зво засо годас звсаацкітк сістоВЕкак пшлвссвкцВ ВсоЗКиВх сиву КН сЕЖсВсТсТВ зосткахашх БОсЕІВсКхх актуа Не зсвстсзкоу папках ви заззстзсі засесактах свазцатато зккхккакс стоссзосаа апапОаиККЕ МКНИЮ зипизасстЗ зак кАкх смезвссте Зккуацтахх совок хкхаккхаоа 16553 аплюстовсті зосжтехкУк ксЕЗсВВсвх замах сс соК СКК ККаЯК ТБ шпихасвоадяе звссттакух сах сст меоходааах звЗссвсх сок кЕаКх Ми
Мпжсевсхте Їсозасааза завкщетеве басавимкос хутстовеех бдаамилях Ме асспазчНайи хоста Мото щеВс заст ЗаоЗВХоцє Ле ЗЕ застцихима ккклктвсаї спи ВК свое КЕЕКИаЖКаК ЗТ ТоВО ВЕК свсзекаахєх «тапкнхосс ве такайт зставщвт зас ткис синус зач чека ссоатацнвя зЕтсОцає КОН КСВК ВІВ ЄВ ХЯВХВКОМЕ Х5З8О своем Зло СТВ вав сеВи асан цє ТВОЄ ХМ тстаззЗта мказзавнаї татоазааавні састасое спасає дваслтаа ХМ заатсакекк Знак стее смс саатаевтка зсуОан со Е ее ї17155 згіФфттссога асакснвсва ссмоцайик Ччозостасто здала зафшогоах ДУКЛО созккакзав зви всвзва зпасастакки заго ахаЗакааа зсзаєзакаа. БЛИВО тами х зізкестаВа ау танс заетотаава заоапацжаа ззпадавах 1 зазоизица овоча за пзозоаавов зала му кнаснстака Таких МУЗИ
Які кххвнн взІЗааЕБааа боках Зі нтсцявтжах еко Хе ЗЕ писк аи нвотосауаа зеоснесоо афтастаєсе зсввесзаоаа сотня ЗБЕ побкнннів десвосаєт» сКакацетоє сасоуахцакс стявасваек забула МН чхахасисвся зоазоазстаЗа пеки с ска хча зЗуевоаззеакх сила аНся МБО зЗизхаисевс зараза завикзавсс сахквиккхя звевзатсов хазцоскт ТОВ спеседвевщи Зрада зосівцеаа есе ацОвиаатя деле ТУР
Мвіссто зок ся зтозоаксВК асазазасас госказуюае сваха УВІ зтззтзазат Кк ктвва тсзттаакко хзатвзааао зпазацавУс созтоодаєу ХВО хх тавух атак ссо зі таааа стара засакахнст суто ща стати маиававікос застава ктх заготаам. взумкхезеах туахававе ОО зайткєааєс снипссзааа зааааквся тапеткиках акхакншреск ккаааакккх ВО схасжнниЕ «оестїтазаа захасктвоз аакахккуко віко тсау кахехавтих НН гІ
Уккактаавї зба ккасхетваї фай хвай саВеКОщУ касояакоаху 318 зтскхаквв ЗІЗ аахепуєсаа векстхкахх стек сахихексяя зТа2а вахстнісня ВЗЕСТКаКЕ тИТсТХЕ уаихЕхЯВи спиваТТісО аКЯВуктяяА їЩюЮ акхтвннтнмВ ВеВІаТеВХ пссттнооЕа спас тоВІЕ ТТсВІаоА ХКХАСТВННХ їй места т стома зсвссявсз)а аазаххвахс взасааетай здаханахнвия зня захспяхціці Тастааваха зессохсстат айплаитастї вата закис кцхя Та запизливхсВ ВІЖЕтжкаєт зсасятвтак капот вися ззаасттаас занзсаЗану 185 зайдласвнха ТЕТ сталх заннйалааа сосповинахО стовааВеКи Фохааансся З запсаахкка зассзавата Зк пла кекта втлтвааєа ааккааской УКВ щілсвшр: нежхкставт акаакаците баакамивой зпитвекаи ааозїдасох ІЖУщ таксаататк «ховав масадаянтов звеааегкя каска ак іІЖКЖ ззазацсазих как ЗмвМа зг3азахяси зожтасїкаа Кккхаанива зізжсссааа Іжа хатІаааа" ха сснос заозааВки ЗстасоЗУК згзокааизс своззтзеза еУ пціансхзЕза висахедаяй зсїсоаака хасозаова савакаттих синанайята. ІДИБО спжнизхцасї годасвиаа двязасвака састткккує фсгтраадеаа своп есТЕ З5О0ЕО хаанозаеВа сухих КОСА СтактякНКХ соска садавВуЕх ї5а5О чості кадоваккс ЕТ аааах вотсстцевО показах суто З
ФЕттстатвї асевунлоУє СЕЗ МаКх Заст цаваЦ МОпАВстсКВ СУСосТаК ї322 зак тацт застава зазчиакцакоа сзатосвтакх жвеасвон зеетзааєна 3256 ставав кЕсстомве сзатЗавав соозуаосава стаз) збозсаах за каапхасоаа Кеховза кКхкавнкку заатсстакк сома Іов есалАй Уч аказкоцкца сеттазасса задааляові ттзаазайкх сс Ми каАхте ія савакидала зас аце пускав заммазвк ттзаааадти тека ся Ди пакета: сааіасайа схасняажка азакавмити оба кехканккия. ЗВ аюмижжники втталлаєи ЗзВассвоза аакацаєтисо сузатайака казкову заго зашастсовх ззмекакня ссвуссвозо Змащаксвв тсадатетаай заасакнсве За тккксвзве гттаакс зЕцсваВсах аоххівВе закткааайа хвахцевута Іа ств за заахккцкву хоТтТТКе здаецІкваяа паяцаєтвав ххтвувса та50О
ТАЖ В Зайцева евдаакких сссяїсоааа квхихЯаВсх сзотатаках 13550 зе оєза сутасжаЕК тах кко Зсзветткка бсцовстасх ЗотТтТщкках 15826 закокохатв двоє мхЗавхакв своюмориха авто щсь за авакя Ії тазсозакка сзвазоваоа хскахасваа паса зушеБестеє ЗК СОЦ свсзасааакса цесі ммма саасвнетВо садсаасаяс заасааеааа каасакснсв 23 заєтткти саабкзптак звссихаассв схаскаккВЕ сепЕЦКМНЕ АК В ТИН кІкхжсвааев стакккас звтасозцвева аклсквакзЕ спа х запанує. Т2В2?О кЕхкЕВстт сатокашнсЕ ЗВО ОЧа ЗК АКеї сопайлхАкх ЧОВХВеКЕ ТОК
Кк ЕссВ ск вавиЗ ВЕК здяясаЗВІє БесаасскткК ЗаЗстсвада да) зскшстатзсе соммкакняс сої ссаца сехтсттса сбаЗоссвсує вВустВео ХОМИН тКНЕкВетЕс фол о сЗщщВекоса ЗОЧтттоЗО адасатсоссх ЗвтВТоВстО важ кевакїстто садах кст са амсх остова спйсансляв своє па5хВ тт овсВе сихекІсВЕЗ пезат оса зоааастсЗа ссищееттое стсствсаса ЗЗБО їтствссВвоса Смт ЗЕсТЦНВСЯХ Зате Канн СС ХП цицаксцсєв ствсоцахк соте тааєса ссусснира сеахсяку сасосттвек КНТ зкшшаскіс бас кка пксаетаМ сспющазава касах садаткеяса ВО кВА ксиУЕХ ставах ШК КТсВСВ сСтахакаєМ ча палата оа ато тиж ост: каНКЕстЦОд кеахаОкцоВ СВИТИ СТСЕКЕЦККА ДОВЖО зскеннокя сазана вести зеоєкааова Зсзотаеаа сук ох що свідка зЕсЗваадая педа такса сХ СТЕ ЗСУ Ве заскукакх шикахитвЕв акзатккат стстсасвасх сІаБоцааЕ Ка ЕКВаВ.
ЩОБ статаасчаєса куаатсстяє статева квхВ війвВсястетТ сесоамисивй ВАсКсККК ЗО загктазаца заханавевсо тавакцах саавниВнАж вбамраєван тус. ті5О «сстаствакта аажкиссват сатахксих хунстязяяа захасесвсв стзатстВщх ВИЗ стплатацаз казктвовек схаккоасв перс оцссос Зпаккесвто сота 13535 зтсзадхаце поасссвззса аа сзазазесої соаасиЗес зем ло теккахцахЕ казховсваст зазааанксЕ сзсоввсаВ зухЯаеВе засЗсаТу ЗАЛІК зЗекакуккни вавхвесаза члхасивксе сзааацаса аакив папа ЕКЕх ЗУ засааацнх нитажосвов дапотсстка загс поса мукеМма ТЕО ткшквинаВи засооаааао захо созст сстасааакі севтсВіОє дахзазовха РЕК заоЗссвест. тозззакшек сстоссовса ЗБ екай зезтадасск каски Ме цевусиесус дозавадацеаа звсозсессаа ссакВкккх вавосазах захкаОмя УКЖО ахасстксвс свзссокааво знтзвссроас забсккакжа кесттовсав ахккеккх 2375О гхлтзІвавВоу звати гахее зов созкаєоюу застозакка засасцацоє ЗІ стоззоса млаккцаа зтезава скасує тах песто ЗА) зІвїсотоаз сеастасятс озааскема ссаЕхнВсте саЗааєкаоа сстовааете зх стсззозово дахах стпоцецах ксхаБоесВа ЗБадяккКсуЗ сесаТс запа за мвоза хехізЕсЕ аа всім ккуЗавиасе зфаааеа; 22055 зедакмає сустодаєех агоцстсяся стома скав асвссвовоа ставай з14а зЗаскалехи фснсвстовх «ккстсвВаЄ стазтдовак ксазаовтх задо еще злвканенах срувстсскх аасзвусстт стибацахе совсомКкх скховакаєа лІБО пимжасази засссттаца ст шсмвВе зсзажеасяй сне щнакх зак кувах Ка) кккодкааяо пов вовау КЕксстцКс смовацаєк сокевозева пЕкаКксаци ка хехванеххц стати свист обзатаанх хЕстІМаВаХ КАН СсКЯХ Аа пух зго хКНЕЗЕаЯ мому: ас ваде зняв ЕниХ ха кахкахухай сцсвтоааєЯх хахттвтояО ЗБИВ Х ато ВоКеЦИаВиХ зо чкхвпаххтай свсисоакац нийзсвавях азадсовоцся азутвобава саккахоцив ТО пахоВіахка сажа акх садаесвста зівакштвасв піїзаварма спа снияй ІТК зЗахааасях ока кхакеЗаЗК згстазаснх савхестО асасєакдах ЗЕТАЄ звати нкхазссасоє пайкачеккс соузссооєх косе зазковисає ЕВ тсозтасацо папоссавоа щкКх ЗА824 «ЛА 5 «вії ЗАВ хТїїе ДНК й теі35 штучна попнідаваіете
«ае се возі а нуклегтидня песлідавнікт» нях тести ЗасихщсВсв Тасааатои созвосдовка асо сассстееа І заїактскцих сассскаа а засос ксссоттЗук такса ЗІВТаТссгО ке тсзадивихЗ везцсхеваа старо Звааспасав Хек ка Вест 355 тсасовспЕх зеззазеова сбогтечасх зааазтссса ахкахакккз хоста о
Вилзчцтвсх саізаааа аамусонасс завссаааях ахалахаких зіва ЗЕ захкаквсстя сао ката тЕВ саван ВІяшИсноа кис ца ЗА кхкдкххстоос Зв кавт КБУ виата азот хо светкеевте ам ЕВ зактзиссцї зсазтсзах хакі свва баккаєкашь зещозсоввх се ай хексвІвстс агат сааа пекеВІсваа аххкккаквеи зестетттеу ааххюнннх я
Заавхїс оз база: тазаи хкнивіЗоаа сахахкаккв стаз девех ахихкнаккх м ством таз зіастаааку рт авсхе кцаляЗхяха ссср вавххацЕК БО зассастааа азкаааканах втсвтосаих зстнвовааа вста ха дозатажеех БАН звіззаєткак акихккукав ззавааттай кстстзстаа сапататати свстжатев Бе зааіжжцака заЗуацяхЕх зазатааках кс стався зазазайвах сжозваятоє ВК тазазаскси зснаввссоа щссваазмоскни воша Мк соя кі щаиалаюсо) вссзасто косах св сстетаака тазтазсттх замикаа ЗО патакквитв заставок зхкаакахсс вп шелак вя Веди ах МО зхкзцихтЗева гато та Хвадсавево оз тако сазтвкцеВа Кккахтквах мне пЕтвазаваа тапотецУує вутважВь МерЗсхвна Зоо седецяххха. ха садслзауєт адлазаксааи цвассжтаза зкцеставае стсоваатах асонннває І заневтттЕт зазазавнає зснизІоВех Ффоеснивао зазутозтах акткксхОтх а сиїзазсааз сатесстхікс зввовзатєок ацксстссте восзтогаає пасеЗсосте НЕ сте втах азалакккюа зВоїаетаАкК ее вст бота а косо їде спузЗвааасх зктаЗкхай кое ска ахежкксссва зт стаа зада сто КЕ сш мна зсоасайтих зКеЗоїоах «Екс иокся совсцевма зало ое КН кикЗссозаа зак уякх ЗКУ КК КкиЗсх своазосваомх зашскЕсцх ЗИ сЕкхоВосе поч Зсув сеВА Как ЕККсо ера х арк кині ї52о ткалсвора тозеаоув ака судукавкна «вні свнсвя акад й БК птасловзева ато КОНЗаНстК спайс кто схстцехсст МУКЕОККСЯХ ВЕ чайне Сомюзка змузснцявс тумани сескслвхсо сстоааіааєх ЗОВ ївракихяо сазвцавашя ТосаКОкасо заамНюАкх Мк зас ІА
Ттзтккххака ааахктниЗаВ бесасакЕє зазаваасас аблазадкка ква евх ка атака свасвсозта саазаккацо зссвессозх вишщлосвх тво 3а8о посла Х сВІТеТсВо стук х зетВтЕзКка ккахватаха татеквссВ ММ кжахкахкєс зсоісзсата адмітшиквя стзатІЗека зиск Хс тез ВАХ пахурикяха зОзаТОсвах кохнкКтсВе сазооттавВа неза со втсосааках РУ соххахавца заасасемкио кабісвнисс сосзсЕкитх апсоааноЗа зо КиКО
Кузик сто Зако ниххдацоса саксмНКН зас Заа мавки ЕВ васкзнозеа всссаїаавк свутсясок зханя везе еа мекасеях БО зЗиксавонн Зак каакк свое Затв сооввсозаса заау ще кову звиах: зозхоззавкзе дсозззааоах асакиааце ово ккщаУдя Я вкжзссавія Мина сао с сацтлцказа сттоаеаана винкс 252 свззІдтза капа наивіс саванах сухснхвяех стмлтасац нина аее 25 точ аВаЗ засЗслзяЇх сарай завсвачяаВ тес пеВцаа ВН даотсеаащи педа зНІста зсссаациикх каозиважсе Мавка сеВіссВа БРАВ! сазсацкакх Знезаив акабсаинуа свотвІісзаю ахккаквико товста ЛЕ екс ує ас ос ттуттатиєю сти еска катлюснксв зазотапада ВА зкеєцантсс воза ка зекезланес су я тних оця ЗАВ сокхахцаксс зссотгактякх сЗазессВфс сасазеканс сгосовзазаа деле ааи Рв кавова вс ззбоатацув касосвусаї зсакаащавх ззгсссвзах дквБадккая щНх савчахостє даздаавцтстя кивоссваа дузпонтяваи зе ваад авта сех КІ тстсвааите адхасцесят стзаговайх сктслядевт зЗаацеавеє севоавсхсяе КН зІстсеттдах скхащиаоат сваха ааасествав саммеав чесно КН аасосатоки ваз КІст замок кпесвІсвОс заскавквхка дсазосатох за зтавривавсах мікс ммс хоа яЗсзассас ас ороаксв зообсстева за стствасски хехнреЕсесо вазотациай слизова зопоссиваце есе ЗО савсасцацє ачізовзВа фосктацках сазозассВс аокацавциє сет вМио таза сствозвааа замках сачестеао заовєснов зезсзащав 338о щщизазцуа асхоїнваст слави ах січе Бобхвакмик тохазакя 3540 зіБааавачя хассхкеї3О зада вааяс вача: засне зцезвзатааЕ ЗМІЮ зо Катя Защщтовай кові еса ссасакваця вто ЗВО ааццУїтсв збцскаккке теза сх сади ата заток сиханКУх о зяхвасоозса асезикики зага дазштксвоВ Фа аах не Уии УРЕО зиннзкиза коатаккцах зоаватодес зма ваістатес ака ка 3535 сЕадсясатт фас атососссяа ТАТО аЄ павстІсВОї Бурка ЗкюЮ пидксхае зо са сниаясасвах вссазваєиха стетащНнюоаа ву асаях ЗК зІзтсої катазатвво зммемвшемта заскевоаств ттзаааккає акихаваассе Яд їзазаумтаа зктакксте за тосааа хасххВааої стазацовок свезехасе ка стітззамрЕ птааккстВх боодзаЗвстЗа кххвакесотї стощжхкаєки закис ж
Тести зБуавксУеї бесздссава дав ЕхОЗВо сазодавхаВ ВЕКуВтсВаХ ве цпесавкавс сапакуваВо смезаскки ствоссабовео Єдбоцичнех сесааста що акекссаток акпочтвава засасавцно васссбеаєє аскассавих пазах з355 пакакккаце заккак зназосеас пезсахаЗах всаавсоавзоЗ зазасакаца 3550 «дисазіааи «застав зпахсахвсо зіогтадаака кзнастовех зпогакоаца БЕЕК закЕмвав вссвозаааа задсаактст сосзахкока совет засо БУ ксксввКак БЕсТстайка сс с фОсссааках зоЗаЕммхц дався БЕН ривка х истстоави ЯвояпОсК ЗссМиКтяя КЕКВ СОМИ ННВ ЯКО хссоггЗтог озкааакккс Фут Мис свови ссакатиєка аассссата зава возтоацест залах гостостсаа касову стату кос засво зу січе нс соматактеов зммоссаох зва змив сце за стзїзамним сага знуа зфаассзава пек осот завасттхка гей ЗЕ замчнтама сах ооаза аа хх чащкнасва астенія зоагзеаснй я казала кЕ всех зіазукасяв зво бЕКЕссЦеК СКК БУ акхкааккцви сесастпайа заинакукцо ВеккклахЕЕ савЕВссаа за киЯасІХ ОА пИХЕЕККИЖОІ тнщеИтакХ спцятсвноЗе ВеаасВкНє вадодацекхє аску а ЗІ зисхжсзсяя тозааскиЗ) зазаатттстай сазцсостива стодаакков жахсхавеса ЗІ сесаассооо зостетанвт свдсваакак ккктсстссв садкахикав Вір 5220 сезгоастссз сотаккасва ес акх везе твоу зоагацвахав вах 528 сатсцтм стоаавжаес зтсттоздак кхазкзуаца запатоаслнх со ЗБ звозсмєоз засакиниаа ааізаккс возвеаваца збізктятсє садетеекх мо сісМмізаь сома маастазия своапаЗааав баку свсох мита У затозтатм: ссаатлтааа ссміааттс сатаатаа БЕЖ ХЕВа: ВЕСТИ КОх 5520 зоМжаії зафтакете мисках цеТВЕтевих СМС сота ТОсВТВ 5580 тассстадта дз стоаа РОТ ттссаА хогзсовааа ВОК тВсост Згещоєтода Ба заіцмазстї медок смак паста заа ання зга УлюЮ хвтззазостї зофакссвая застава Зв хЗа паспцвсра заз озааа УРЕ вази ствазо зтсакшисви заз Зааттїсваа ЗОМОМХАНЕ ТІТОВА ЕК. 5В2И зкїсявазаї Фет максв звозеза) коахескза созаззазаа саке кааЗаа 583 зссвдтахсс деєтаєВехс втосвазтаа аанокацеех звозвечн хека КЕКЕВ УВО цасктнааса пістетаня ветсвяєсеї дсп саинс звазетасав ами кЕ ВОЮ втадассакх соцссттаВє Фзаалеткся стві ТахВх аснивнїх дав дає що зн оаитав ЯсВсВсТес дазеаатаст сао хавхтвосса зашотаах вм саатсацихс сзнозаєвса сатисеєткв За аава слевтякиях сала аа такайттсна ванезатУта дтаккавасз схЗааамла сазавстжеек моемка ЕІ аавнненинт заатетавак шкасихетеЗ секкааухо пназссофюа КУХНЯ ЗОЄ згазійкхатуЗ астаниака касі ктота гаасатакха хсЕтцсаеК перо аакХх ЗІБ хевцечавот ЗстЗзсвкках кастазкЗтав ахозахякає зазетозах аква ОЙ тхВнатТце ІД каая ассіявеаа совпадявив доз аїає вата сЕ ща свІзцетіде зжаккасхх сссовіаеаа зсадвцсясх їтасаасаас сНссЯнсВяЕ БМ щвсвавасазе завсайкихх ясяаткакак коаонвосяс сзкаскавю посох МБО таЕсосТОст теле паЗстожеця зкасЗехвес тзеаакка севВссстоВ БІ ствтсссвось хокацнана осоки хІКсниЗсВО сто кахх Зевс стяе ВК таїна: ахкоЗасакс тост ках кетоз заасохакв хВсеЗоВЗсВа ВЗ дтдісаатих КтІєцплетеа зоааасаєтувх паст Обітяс заскоствсє закис ке саатазстах касове техно тестова осв геаааОВ КК задакакєс ксковтвтоа соакхацссо іх юодатх секс ета кесовО ле БО стахаакавх зако тт арккххтсов сассттеккк зкоЗсаЗсоа зоуаазаацх ве полону тІ Тс жте асвхсувося севсаевКхх стснжсташМ Зако БЕЗ кокос цаяа стек созднвавека екаскЕсНИи сосБсКукка асасеокас та певстоаес зтожаккикк всовосроаек хуАжОсКстх позовах ВККС. запа пеннусвевес зсссацаткх ззассутса ск рес веКскаЕКеВ ТБ касове Зттсацааха соку вос пити кВе стВсаВККиХ пошеККОуЕ Та пазевіщтм Зітсмокіко ската со азвовЗа ссааЗка пока 38 дизиаатаа зааоецкЯє КО сео фссцисакх гусака х сова ТВ виросазта азасонескст сзстаелева соцсхвцеда віках ххх яХ УМ заст тсх мсаснаксс яссзїаатає атзсЗазасе зтаасасакх натостнос Т5БО зІсвІзтзат азсалтссес севістаааа стстіІоЗтсяЗ Тітаалохки хана КтссЕ.
КБУ канву зваааватах ств зааик спвсслстес Євсїаатаза ствЕхаВетхВ.
ТВО веАдКжхвжко зсїваладая хисткатаєт ааплазиї зввевазата акпашаккик ТТ зухкккахкх сет азає кайсккваїа зага жкх ХЕЖКтааЕкх хахцааокка МО захи тіаки хат таа даазавтса бозкамнив хсвсзссаоа зсахкацика БЕ «сасзитакик вхвцсатоса ссоосЗВОЗ ЗТ ЕК оВееЕ Коса то тсзаасасх ааицеКТстТ сет аєає вевселевеає аатсовкоє зІсВЕщеЕ ТОВ хакІвсвсдї омесникато сазаафсвсих кхнїВОссївВ ФвазржаакХ паї ВО акхкжсІзсї сзазссадна пткахсцаїа саадсвничВЄ тзвааасава сасцаихе ЕВ
ТЕтІЗгязеа ВІЗ асКаВся вкаясваасх зсвавсявсВ Тевгаамає акктдсвнвІХ а зссвтассайв посбкссааоо заежеткаєх стат БК МКК походи хе ха зсозазаида засксстова Фвосвоваха зоававоззся томах спахааццете НАЖНИ зсовевеумаєт саасутецет здщоавоашкакс стазссозаа датах хассаве 843 ззасжоаких тассзасост гзсзаоказх сссзбостаа аск єноЇ Зотова зва тоасткайакя ксеККссттст соростВкеК зсзаводака сткхксвнЗ Бест ака мкавсцикци кткссваЗаО мласснвох аастіваех меня Сол ЯЗ сзизазикия соттртаєс аатитостоа акта хкяк свецсвтову сота Сан квпсксвтєста псазтаЗатає астттсостоа Зайтсветах зстсЗозаєе зстсавоаа жа чЧасскочисо зсттакаках верес ахкаккинсх светодааах ака КІ асхдаизвстве ссзаохккЕ хихксовас ккнакУКкЧаЗ вата сосух похо ЯУ8о чкнассвусв гзасвацкис свхистаек: сесвванисх созасасоах как ї553 ведете МелиитасЕ тІссВтбаза ЗзааІсестас сани кайц кртсстстя ЗВО «т9двзозству мк ксхао сваостаах кетхсоротес тоткаккакк скжккхцеся ща свсазка зказхккВс сттозксеста ЗвсвоВіЗсе симкмотавв сна зику ззссвасах зкІсизЗаакс зве асоааао соціа святих засто Зоо
Ілованнх ксехеусжеа Бак КХЕ ВДТ ЗООНСтЯХИ ТВ, Зо самолжес сзттеках асхкахстсс ор ква бухільсовеа сабо каких Зо шен ки сзстстзак сакаківсоса вЕтоакиеких ех жаЗЗИа Об кОцх ЗІЗ звахеккксх ссттвзатає сапаткуаао алеакссктй состава сстевавкка же чЧаисассства оабармилох война аЗлКуутсЯВ фага стає таєц ще акхвохвннин зіветкооаа Зстнтота ахаскткецде таассетОа засади е Ко ахвстсстов зЗайодаалата свухзЗзеЗав ассЗЕхсава свеетовЗсаа зайацюсксх ЗВ «вачвтїцва тестом чск ЗассттокЗа кчихевтсвт зга кек кЕцааксАКу Ні ктроадсзсог затаактавк зкдтватака колоски тх твтозааой ЗК оВ ЗА кхназаїссс оса: зЕссвзІасе «овснаниза сзаавжаєав сах Зав ззМасвавтт зок зкцстсВеска кзксаскнаа соток завади ВУ юМлатвскто стстаамиса Чек дащшненоВ зветсааас аазвоєани: ЗРК зиадихаунЕ ваттаква захихасст маашактКех воза тЕе зептаанах КА застава зузтттасах скктхсрс азутаатаєх кояствазка топа вк сазижкикахх заст їааа: замах зесоамоасми мохтвісвяа раса Зоо зжзсахкавки «Екс таЦео зБМссахаттх зіаБвсзаа акскасснвз жетстевЗї АК зістстев аакксцязої сааатхкко: гаї тззаа стазатанай сатахсВххВ. ЩО сттводезжс ахацтявкї стаїастаа ххаставиїх Боодітавеке созазащиа 3 свесзассаа заахтазеса заспаккиай пхавлІжаа азпазоатахЕ згтааоаава МОЮ шстостака полатикттт звтаоаимках зтотттЗеаа ззазаатсня фУТтеветайх ЗО сасвзтатаки сассхаттва азахккцяся зачІвацаки залазити и веакетазка Мо зазазалааас свозваВтс Манн ссо зсзвааккии яссовакссова зкковкахав 538 чинили т сова касенсоз зссааскква кисаКосаса скла акка Мав тааускхт ззсзтеккай захваті а забтадячеї зссзвавеєт уЯцваВакХКх иа зказаххавя ссазоссках зо ва тами заацсащевми ЯЗВОущхОе НОМ кхаахахзсна сіїЗевезах кота Баммосвноє зттазеааве косстацоя ха заз еВ спаси савгазавсх апа квсвава Зааесаваав Зевса по «тс» аспахязивс заакаих азаеззатах Зсватвахих заззсзаааа цу залатоазтах аккуктхвххт сттвазеаав лакхсткстск хазцаахцях заст ссеїї що из аах хакхатастс сстсякхах вази еттто застактакх зуваас, НИ тстогазаха язику сбаопсюни віце кс сасусвахех ааалаєкай МиНО заазлатаки таснуаеах косажоВЯсе ФОТОК ККХ КоІЗХхВсо сКааКаККХ що аамасиситс сага вхссстазса себацкавку жстстВіВсу ЗЕКККаККоЕ МН
ХкакснКккс ззазссатах аозс жа це астокОв схо ЗСеВОетОк каже ікс дісвсоцана Іс тазсв аскквесоза ЗпОмОц ссзссєстся Хна всеж смс сха сема ві киКеЗсстса КсТОЗКеВАХ ОсВсосто ща зватсстсм ахвквсвотс зсссккаак Коста паккоукадев зсетатсозао ЕКО тасеех вккхсстсс фосасоцккХ Смс ачк ока ССС, ВО цап Ех сскиквавая сосни вессЗатаца зссасвова Саух: мац сажкматихЕ вавивсхаав азасвевсят ззодеткат саясехсхсв СЕККАКИУХ мав самих стоки СсЕсТстсТсТ соках свезастаєх зкадканх ВО зазагапаст свтстова схвссвттвт татстахст квасвоства ках ки: МБ зіасоьстє втявтсоавмх ассесххсят свооватеих КапасктсовВе секаакоу НУК чідсацссвс доезвсавуха сасвосвтсв Мюмевеккав сзазсехоачса азахежккаа М ці скайа дфостаагєка скахцЕтетсв Уч акх сасврастс всхкакавкх МБ змов кас встсоціаве ККстсхвУся зртадзайкоа заахосото закохавкоа МІВ хповосясах цичсстоцаї Чан вве амкх сих осо зак а 115 хсозтїзавац садки сихадкокай яти КЕ Задсанксяха зов ДИН зЗзвнозассЗО снів кдваа бамилахки ааасах замах анс зада ая ЗО щевсзюзаек ака зосаодккаю аакосовааа ссскатавоє сутусвавов зако цавстозвачзо тафсаноцях тосаацатеа файавассоа тобассаака пессетсктя ї2І2 тсозаваасай Ябхафнния ссмиацта сесхтзвааа зсекадавах ВКоЗБщОгаа іхі8е заст акксх пабкуктвах Васко хава кових хмксаадкка сода т ляе зівосдакаа садацхвчве зоозуккхх кенЗсВаЇВх сумуаавехх зутаасве 300
Тс КККЖХ холнжкссво посодхяхни пузодвяаа спахахкккє зла МечаЕ ссзамхацккт свІЧокастт ацеатвнива ззеттесаци салутннясЗ аакпакаася ЕСЕ ззапацтцця пввссеаве аисцутятсЗ ста камс саснцетвоа Зайаае ЕВ
ЗаккквсвВет сзтотстаай ЗвОссВОаЕЕ ссоаакккввВ ззсваовеах адацавкнха 1253о таавсвцясс заасзосааа ставом ах сазана завозооа казни аю ксайсутизо созїзосапа звІвщссасо зкакиккхсв созсоїаада пах БО зкиззвозсе ссмообтайли ЗВТ аООО абацкптсвАа ЗАМ дво а Щ575о хитоЗсасс бзозазаєцих осока седнзхяеО Ма єта сего Ето зесвасоїтє сацааєнкиї засо а пенцвтссок аауОавемк ватеслеах ЗВО встик каБасатеас зБатайкмо сеоатоїЗак кума ссТаеТам Ж еще біле ктотто айва кх ЗЗТоВйх Зухкккскв пато ВчЕв така ЗА віко Зах ікЗ зЗветадаца сце ази КНКе пастви сосок заст ВЗКЕ СефА свсвсптоц МЛН ЗИ гтласнсзев зсатталека касазверва зссаакаких везсезЗатавйх сани каш пісна свс зататоскоа Че вати цнка ЗбОвсаааМО ХВсЗХЖКНИА 152
Екс щих МТМ БодахевееК КАТКИ востгоКсО ї13к5о тесвжВіїе а сало стива ЗЗавалаз застава) реа тувазвсааю 33550 зпасвтцвек тахаевакат мюкаскаакх засос спаадатакт весстетея іх певІзсдоЗах задооюниве засатазкха севозвеВва зкадакацав зуїпевоаа ек сват таай зивахсвОст акоуцасахЕх нОшттозвах стуцазажако ват сстаа мин ствах Закх зкссжЕссТо Зк уктВаХ аанопеєх судцастяВе затв М тнатнх оз стеав пехЯцаствО кети ЗЕ хеншНЦЄ етКмН мя ссоатстаках ктахетссві капкан пато Ми сакалявнов ММА 13880 тстстактшек звихоксваст копаятнссх ост свеаах зак хрннА Мало Не хозгкацаха схрзваЗа зоаанІятека ставі тайя охо заамла НЕ зсеттсвахЕ сви ксМмв МлЯсІцявах сеттсваааке спахецинни ВСЕ Мадах МБО стхдаатки піхскВЕчеї Зам кхсва ко аастх Єкавацайння доза І13УО кстстааата сицрааахсов зазБасасахх кеЕхжттсзае птавскаахх заосасава А Узка свиноцсазаа фаафутааЕ стек кахакк катаствсеї загааказкх сквссреовї КЕ зкахазІаас оз кос стезадавов бтхкхссах зессвкакм зессоаЗящес жан зкаковавое зіїзоодао ВасшТевУ ВТК ЗЕД МЕД ТсНИ ї315 троухцетове сзаітессук сецистоцет ссосвазаки кЕсувихоує замети 153 сутасивсся гавстессзоі зЗкаххозаса даассайкя хпинцастеА фефозкация ЗАЖНО сІссвоЗзЇЗ ага саз сависсвата асспадаєкс втсвсатоаєс словесне ія хаосом о зайсдаласа здалось акескктскця зтсоеакь соповесоуа Не тхссоосзВи аск Зо ККО ска овтатактоа псНнсося ЗА зстобосеак ксакаснякКх пери єта ЖЕК ЕКЦЄ Фен а пк ие ззіоаецазк ссасаскскв сзтсрвахов кекс соваса босом хв соаїсщаа 1а58о зссрсакх маки сасо сзссоспех сесуємова зБосстаНцх чес КЗсаВ 15558 тиваавтшнх пусті чев зе кхях ост ЗВОНКА я ЗаКацх его
Зак тся ЗконозатеЗ сао хто век їтоаз тових яВе щас за завжтакикс кецесксява Єва сЯ дазавсааж. сакначнхсв чаастоЗааа еВ скавашкуах звахсовсзеє заказ ссазовау хакасктссе заозаакамх 14580 пкайкхсуКт сзуБсттаМ аКахтсцсав сфзазаавакх паххс є радий ткта РЕБНЕ хахихацект єзвіаастаа ОКЕтВакоВо МАМ каких піаткЗааає аККуЯХЯсИ МОВ кпхскссест вааізавеок засто: міасазаасс хасзатсааа заданих Ве МН кхсвастозаа собака сзвутезаза дакіаасє сзаааеоках казках ЗВ звссозабаа збосакаєко зе ахк кухаксиаеВ сеВфсаесцх КККЕсХТсВ УВО щевсзтави сестєтцава «ето ацамх посхаснекх світо сх ВК ї5285о зсахайтнахй зсстахчеви са майас тозвазатов сумааннос стесеКеКх 3530 зктжсккхака ксавссвж ссахкксвос зтетеосаєх МіааадсВес сесвіжаєтх о сзикхаваає акснксветя сттокткакс сзїссзазаф акаклхаске сбаезакаах іхАга зижаасаас паси зсаас заакаасВЕе зсваїїасах кхасвасто сама жакц МВ какешнияс сзстивева засо сфземнЯх кеатостОще кмасканох КИ
ОСЕКЕКЦКЕКЕ сисслЗваао пахло зі сіа ХихКНеЕВТ ММА ЕХ ТІБОЄ схокктякця састааЦЦЄх Купацнесто ацеаМОа КОцоесає МКК ї5БЕВ зок тсяцЧаиз пава запору озвався скнсвоваоа екз екя зт оте хацввх зе сакцхсцає смаки мнпиринаа сек МЕЩО смакнову вся аа ситах зрамеоєтаа патОуест МИЛИ 15ЖаО стодакісяк КК КОКО фаст звостааахи Махосттоая ТК ОВ УМО стек кцацик ке асВсеВ ваг тов зОдадасек соски ко ЗІЛИВВОАХ БУК
Іст акох зкккакскаЗе сттаакатск ховав галекацих зони ЕІ витІжаекис Мекки сстт после: сехассовова Теза заВестая ІК
ЕНН толаннсВе Фата зюсвостоса сзстаасцах ЗстаВТяЗоО ТЕ зксстввтса занос кх песто а дасибняацек аск еК рудтснестя Гн им козака жеКе ЗесотвЕК Кіа сВаас фФатцтаєоцих сксЗацустх зво тат ьоза свІстстаа сттоввахцх рос мвщоа сао Зацкк зестстащ ага
ТЕОСТОДаМа пехсХЕТаКО КОСИ ЕВК КЕКВ аЦЄВ Ва ХОЮ ІВЦ 538 тека с КстттВссВК ЗЕТеСККеКо стсватаєтає КахоахатАто КТС СТВ ЩЕ ттакдасхва нтстттсвак ее ККся тека СКсеснеяНЄ ВОговОЦа 15505 вн жекхшЕ СааВсстоах Вахта сеткатак казазатаст заеека ЗБ5О запали сзавВстксх хохайхеесу сапоакиких кс сттазсоа МО здастєсваєта ссазваао сатснссеух соссказазх овес Беата зеБКО чапккцехсе тосту мкааЗ Зо срижеО засно язесоаає аапасиня МУ чткиаствтстоа збетаакких зстсстЗссс ппаЗаснЕВЕ чес папа наЗце за ккацзхства Часта хавсавасм аіченозе; заатазеаах пон нкВх ЗВИИ акзкззезажх загайтанка ззоассвсзаа зіспазнхоВ Ффмзазаво аа сва Ре кас сваїВ песо ствЗиТУ віхи хкЗх саавтзаакка ха КекщЕ ТИ сет ттатТа БОС КІА Вста ЕТ ЕКХ зваааклих КТК 75 ззохаєсааса Миссвувжсс (КИМ ЯЕТТсТТ ее гоаанохно ТЕСТ щОО лю ззгсазаках кассозвова вес азкх зфосстсзаа адцемт Виза оз ва МК созасазавкх зиск сссза зак кайх созаасатах хаествкВОї язтастакає зт таїтаактнх сВвтефсссВо акповкинсх сстуаамих ХеКІнЕОмм. паса ГРУ
Зілачкоциє певна садово аааосааєо знстсваа ваш ВУ пазлоизесков цісозакхове сзазнетоває акккклстес звсотоаакк паском ЗУ кахекжцасс зізбесакки сети ВІшЕВ Корихасяк кеВ сусокиККа іо
Чапек това свісдзакцих саззуаава данхнавивх засобах вия ВцяЗ їТ5ЕО ацоуссаваоа зоатаасся фата: СДЕСЯЖТОсс аа В ВАВ хУ5ВО сатвтхукЗе бесозсасву свЕтаааата ссосясатуї ета Хуста ТУ тввхдствоЗ оїаазссса зазцааесса сетцевосес азраавааєх звеастсясО МТВ апесснЕтоє бозаавстсся статаеаайх ссовссвтссє сайатжткакк зввсссвсев ТТ савсявстсае аа свсЕсЕ свсВсстаа апазсозатс зссакеаааВЗ ЗЕТТтВсВВе ІТ авуххвссзаг забзаєсавіс заовавсаас всхвсаатеа сакктакаах свссвтвося ІТК мнцечск асо КаАСх ЧовтстЦв стапцайсва Зак аасаяснсся ТІ мназиноое бссвзаацих ссізевта спласочааа сах ЗкхКсхЗасх зва тсаскаесиа уВоЗТсськ Здацкхаєкс смпахоааі сего бака ДОВ сотки ЕВ стзсусцикх лолпахаКст фотукакцяк аск СасЕВЕАКОЄ Іо атадшатсик кхйсссттК ска ссТ вгаткхтай саЗсвусвею аадикаких ІІВО тоне: Консасктаєх фртоаацеани ЕТО Сак Фе ке азни ов зсатевает сьстЄєхЗакХ зецОЗВіУух блакчакккх Зк Ха
КЕЖКККАХКе сІВсстТаа ке скинсЕ БЕЗОСТООЯа ОКАККККЯКХ сЗВаЗцеВс їІВз5а амаасістас топодвсясата ассавачніІя Сех ссекОккникх пазозоцсаах їх хкавшайчкс тводаасткх кткайсиВсс Бер оаа сксханврЕх со оВса Іще чЧавххжхткв созастккх ВхклайсвЗс туда ЗВКсЗстеВе гео Х ІВ зкихкастІВ зсвасеттах скаче сет тозаа ВеВоввссВе Тека 10 ккхкжссноХ сітсрмнза звашеаксто Котасатекк скксхстовт стеВаааиє ЗВО хлакссвцу ЗаеспиМсКК зе КНУ зсазцазаке «зва с всссКкЕКка ЗВО їпвасеачі смс ккає вісті впкаплжвї «ас еао зсаккккикх НЕК вцслсвзкжеа елахстата ссжсвтхаса аполшонжива збут зспвацевх МВ5ЯО сцен тве: Баватазя зашЕтсовах козксдювос еще саспахахся, Та тсозоастса КотОЄкЕснс сВствсвоав: сежоЗвІссе Збестасаає аскианоств ій «ттсевнишеас бахкаацизв зстзтозоал засво твева огстаосоає падляевсоЕ КН
Зоо БЕН ІОН ХЕ кВ Конан жн зику ЗО кевіщіїссоа гаасахснах застецчаи сібояусЕЗе таж таа ХхОзиНУЗОО 3 звис ата аахсЗснся заЗасактяс смриовеза зоакцоасао стеаеЗатавї КІ «акпазата азкзиЗшета зуБтазкзив зона таа ХНН звозсазаа Іл зазацазаза зе вовох задазаоеоа заозоцеви ХазиЕУккВ гусак ЗІ ню жухка палка ааоикате поді х стптсаааЕЕ ВБопокоцх їз шипирчнн наваатесао паадечекосо бабка тея ствсвассаа ОВС сукОцав ІЗАЯИ заЗцуснасв звосоаеає сЕсуВІВНСМ ЗХ сота КБЛЕВИОСВ ИН ачичзсвсасе сао Захка зе осаа поахкниє икрммрах ахшсаЗКВоє ІЗ зазоазсвчев дозозаавхх зага кисні снасс Тзвасааціх зАкжшНиМНОЄ 13520 к-хзЗоавсз деле кахх свасствасе чека совно казав МБО кикаЗсстКо ззогоЗках «Звсоацакк вілхзаове ВС ККУ За взнхзвтиза атотоккика зозссвіїаає кехазенняа зааааоао зба; ЗО хакхВхЗІЗЕ Чеки СЗТ а зах зааОО за ккККцУа ІБ скЕкінестсо Ззфїзааайхх сова Ках сор Іл: аККцаневАяХ їЗ32а ака стсЗв звссафаккай песвевзаака хахинеКЕЕї везеатавцх сЕКЕаННеХ 18 мужі свонв ЕТО каа дазахЗЇста цайакахкукЗ сцвосеї ет докахних ев сн еїав зізтозаців скссасттІ ахтайктхев ззвозветоаце гаїасавиа щи св сіхако вач іаех завнтаее зам тхсххесвЕа Те, УК зазакиктатк айлискстта такаксккеу тезі ша аухпанатхх «ковВта ох зааткадата зааклквіся ткавкхайУх зтсеаєтоа МкОсхацаксх кхазсхЗсЕЗВ зп
ЗЕ сект стасахен зЗаниазетвоа скайасваєх адавснаахВ ща заетакгахик чекВксВвВщоВ зааткетскх зсазуввтве стаатадах сакнхатїто МЬНя зззазхайаак хиахксттВс гавсакахах вЕсхвсттвт садазвамтта поливу тяво ХР заітадаахаа хатка еста абаахзанай висаЗваа коктоаааах кино сВааЗе МИ тсдааспаац свлассцата ап кЕх Усе катахааак суввосазЗсх го
КІшкєссатхх певсссостваа їбатанснцо ЕКЗ свацахаска теза ІНК
Зак хаакя хестоовак Кс ЗааАх Фата х КатаАс:ти тиву аї. лою схашннивоа стсозтаму хоЗхазхвто аа ЗвехстяаАЗА ЗзЗаека ло звкахтайкв втссстоєта вата тзастасцеах сквовоасиза зссзуаатає ОВ ззацззссит зззатоаеа аазсксззаа гзтасоаа завсвеаувее тттдаааааа дОБНО какцказізв сттодаасаа аа табатткеке зкуссеВвЗе заашакеКих ДІ кохана: зас кки скссосу: застамакх сесссїтсзЗЕ тасзавайкх ЕМО стоянку ЗітЦцонинх хостес тзааа зад засів Мих Іо стЗасттссах Зтассазани зсттвссека теацкканва Федак мускссство ХІІ тсзветсска татка сем ата хухазкчкаї зказзасмвма вхасксвиае щи зЗвствоех дикхккхуна зссоааава заюшничса паасткадаца хевхиаевея їачи згтавозасЗ литих звва зсоткацаях ссцявтсста зисоанаса ТЕТ а ІМ ззаиасвтацях чвутхтозс сазабаливсо зсттзааала зсацтакосаЗ згас а хі раза пзасозаїеа Зак кзВеї зіва зкхкваяуна сстоткащоа КА ктхазтксІЗ зстасаїзеа айаскнуваа багата тус ЕВЕЕЕ Фусоткавих мав зкакхіккас кові ка кине таЗ здаатаоаєх сусциеваа са иихі 25 зхааніастс зІзатсосах лдаххвціса) азот атаєс пахова Еск ааддлєвках ТІ яимипсксна Вітттааціє зсвечеватє акайткен зсзастсваа захаднакі Бей капстлнаово зазааткичх зунетевткк квас киЗ Ззвоззавста мука єь. ЩО каспттствІ садна зввссовайь комекавка) застава ЕКацЮВЧ Не зкахстстос ваатаєках кттестаткекх пакаахкех сзетоовста стакан 21540 асаакцхчиа таза еако вто та хасасакасс гззагосата скхкак ана ОО пекан сзгазазоае зисссатака аахакахекс зтзасетеск скаккаюкик КАСХеНИ педасасива сзаааеа: хасявсадее зссавсааєсв зсваасазея вакамкакта РІО пажткакате зІЗатіаєє асвссвтоца вітав сстстоотта статева БЛОК завоасаахас чес апстосецї ТасТеЛмх аХоХшстстоа се зв тзеовзами: пзастеваде стакктсжех цеха етаау Захокесесо тека ВЕД тестових КЕКС стик КВК тсосх ахкухкуВих кет КРУК теза пак сссІв Заассцмсни ЗОЗасВОЦаЖХ сек коноЗеКсХ ке твхастмни сасаасникх тесстсвтефі зстевасмикЕ свовеВссо вовк 2235 ттвсоваЗеи халекуласа вогветесіь скодоовани ЗссївсВВос спосккааах ялача совавсаасх закищншї зо єва «(погони весіЗсуЗЕ воатобаках ИН сттсзссакО сих сназа зва віаа сспцфутекеє кесоВюсята Кекаккакла дО ср тстаке пекан тКЕ За сага каєх осхсовВата аа КМ сТБсСтоКасх пк хКнисх стиха Бус те гас етаст фпишсихцух ЧНІ тс кх кохавЗисв вазазаскай башиниве стук во оалцакяссї ВУЗИ кв чсапака савахакесс вубтсктиках вас сЕстс сад КЕ КсТста ЗВ стих ссхквссста ЗВУ Ксахких сказ оВо Мих кака сут евоссх сай5У такси Іс азсх Стас тасах азс Фо хкхавох пас с 2252
Зссчнсакях Звснозтсов аВааАнни хисзнхзаЗа сЗастицкаи сви со 22ОМО сатани совет зкакаатянх дЕтаесттвх зозасккахи птаха гра козайскака зсзовттзат скжахутатс втзтовЕаає алистокосв ттеааааєтх УЮ кутка нкек ззвЗататза цакксккоВВ зго аайа задав евкт зтааажкккаа З тпвсткстнс батВааика ВсНВЕТВЕтВ СОТ ЕТОВИХ задазавЕВе Така АаХ ЕКЗ кхсвпестова адаазаю азвттстаВе СОДА Я песо соц Їх запуаттсва акадавнахс кзвеозозаєх списукавза зотоосоває аркхсвхнся їхищИ жест а судака пово азаа аахкЕхнке заеамиа авхасавкає ЕІ зЗсжхтІщмествс впоелавлиха хоавацайай апхсхенцив Зассааасио Клакуацие ВН тет саагаз пццщснятву ссубайахкх сстсвевеке сазкоссюу ствжстка 23526 стезкмукОа в хвосацє заайованце третсстве: ааакокиакк зсгсааах 23580 зага х вес ссоваа зі КОс совоВасх кеканацеає часссссвсх Кан сзспавцаЗх сс аа заЗасцахчх сосвзсесвс) кежкканаця За Та зо зтотдакаки вс чрсо тайоцювков сусвсватск касивЕскх ссзвоашсх ЗУ жісетекака свласазаоєт саккклаєКх Зовазвааса коцоулахо) звсезааває 23Бху зафесккоаю зосєссса кала зсстстаск зсефствата ВЗОстВемИ 003 кіхтоакасх збзасовет апахорЖне сСТВОСЮМХ Захехсацав Струс 0 ЗМК застссккаа чафсоовісі зупитстков за ееах забазакатх сум ах тастозаакх чинне Босха: са арх оцасихцща засво БЕЗ сопсствгзах соцасехуЗ яебстаккок ксБсехтса сагадакахе здана гЯї2и зсттзюатк аскететвся стае тнсе свиществта Заадесадиа застоввоесе тяїда хоаххахт ас дкхаксзаие тестами зпехестНеє завокс ази сци 4240 атвкистасї збадпзаєхи келоааетах невзквозно со Зае сосахзатах зам хлраттстви свой КОВО ОСС КИХ пуск паска кках га36О зезовхехоа псккЗсЗеЗа Фокса ВЕстоЗсзах гаокттккх звоазбодах ХО сставекки Зісжесаа пвхкаккакх засто каахтхасяс сама ката за зідакталка Зх сзсЗкхаксх ховав Как ТВО Й ЖАН паакмаснов стузакасвс пакацинаас вавакатаци цсцевааста Зцакааяхка ЗВ зсдпссясяа са гстах дфукаствове саставтвцах тав тва дапевоссюв З4БвЕ пкиксасхваа аасдтстака жакета зак ив восатсваєк КЕКВ сВОоЄ ТаТІо зхаакататс сцмсеаесав сесацссваса псБкКкКас невостоу зхаКННиХ ЗЕ вкивстсЗВї зсаоцкацеях сао 25503 ха 5 «11 СБ «Віл» ДВК «ЯМ» омуучна песвідов тк
У КЯ
«КАЗ» ОБАХ Ой К вул тИиДиа ПОКЛіДОВНІКтВ
Кк й й
ТеСТОТОХЕ шесВкцевеВ Тзсалатоя сзазжсооака закежкстс спек кка щі затсакиєсцвх сатсстзата засну иЕе темах ктІнпссвеся ЗМІЯ КССКИ іга ткнласнстоа зими лїтааа сиве ччсЗВ Заазсласав стос ЗакКЕсссве ї5о
ВЕтВОсВтВа КАЖЕ Х поста каствакХаа савітата чзхядоватаа Мю тішча кет закакакихх секта: сттвяндяяЕх тата пазвттазгаа 353 садекттааа кезцнє сетачеанех звсвасосвод затв ка: свізавима зд свізсатлах заказу тВх ззазатавс зетвсїЗЇаМ хбайкзакои сввтсастау Зк сзаїсзацта зсухзвахся фотках хасв сЕетсетТск Кепатсхс вовку Б песссякцак сасувтВаеЕ стадо СМС Тосвек сІвКсосоВ СВК АЯКИ ЩЕ секс х сеЗЕсКсзВЕ бодичнасВс сассттссва зивисніявХ ауОасасне що хатах аасксшсс мото заВ срорасааак спосцеехся «ЕТ то зсозаавскох носа сц сомаснІа ЗОВаТцаеєс сади сВ ДАТИ що гахосацктх воза псонсаоа дазувссве зентаасоа СКМ о патсацкхя аЗфтасеВ сонної. зассоуцоаов трос сос тедкоищих БУ стасосоаай азасзсвіЗ: зоднахсса зсцнеааа Зсцавеснсх АСКОЕ ще посол їЗссссзссо соацтххаве сзсщрашьс седаєоасях дарами оо свїссвсдак псктсстоВт ЗБК ЖХ оровасвсс ЩроЗсеЦНх ВеВОВАсСЯ а Ка патссдаає соска сявВ ссаокскее засос асоаакоукке воЗсестоа ЩО «кидка Осанна ЗоКтжктВ сс татес Могасацкою хесхввашах ца сс са пк сахах соло ессах ЗссЗуЯсетс Ве ЗеЗхеосот ТИ черв гасатикОах сосасвеЕжє сексксото сзсацесева авссозсВоце ВО свтсосмоз зазсасккаІ сузсотавах пас ссео зага как зссеЗоссте хо часте сааствкисс Фососсцаа ВансЗсвссо гасасоакна песо а чкнтамса куки коз мон зезУЗсОаза сс Вазиа зсхсЗзагаа ІБ зсакасів кокс еЗ гсозооихх пазувоессв МозхухІКох Кос ЦсКИ І15КО семан алахсстеса асом чеше списи чЕЕ Аме 1-Щ-О песця посячецете пуабкаюете сода аосцвтсоцох палоЗаае 1555 смс кессвоозсОх сок кесоаї зміс сВавх аЕЗхеВуВах Каси ет хлкковотие сер ЗОгехо кеакнесцеВ стедакуких косвсоЗсвпеа секахкцкох МО ккхшивсвіс вссзсоацех кекс пасок кох зовЕсвасоу зсОКОБЕкоа їЕБО сясНККстКа ЗеуТсвАцу сехекосВоя (ие тямхв сусБроВеєа ЗецахКНКоа щаВ розі ссавсезких соя пато сасОсваскх завсенякой КН сказ засстосияс розта саптхцнеце зас кекак КЕДсОтооцА ДОМУ здлатаасвв зоаавскаа зозгесаккх основи тобтккука косостВец ЗНЗ тсчмзааза зако зов хак асесаансото Зішастиах аеасаехщеВ зм зІвазоваий зок кця заЗїщскла насоса бафеклявохя стада аа ре тасасиажмах кпатнсВттх санки тет скасковиая тва РУ фоакааакки: ацкстссстх каакохкав зЗззащувека кацикксста тетекайтах 2350 хакасквикх ксзнЗетово схайахкака зібасамука сассваааех зфмкюаахя за ках есікв затоку Ясахвссєто зав акки зво ака Я сірі тчЕ ІТ ЧссхВЕссте хаапхккаЗх заазтаєуав мйааЗиххВ За зІхввсоуссв затацсеках автвеаетах скит збзеакацкх араакеанах аа стхваовавзс гост тадит сзаззетака аючнаекот зазсмайких «ках ЕкщсВ? з зваоттаасс зоатактах ХсїттЗаака кккхсКККЗВ стсзазахк «как ЕаксКЇ аю кзвсззаазс зетотежн зЗаастсааа ккхннуаасс тЕтсадахкя ЯЕККЕЕНВКХ ТТБО пхцсесзтсвт стттазккхї зстсссатих «хна ссаааапий ЧХККЕРКСВ З82О0 техвЗоїЗст зсоїтккакВ ссзствсах асакнілкиЕ ТіЗсапайкх адоанккЗВа 2580 сшекющзасва зоттксваси стсззсізах афруанчеи сІстОохакла права кева 2350 «сзиссввтс гзстацква сссссагсо поахккЕК сваоєакскк хаККК КА ОО жззуствясс ссозаВакхх заовссЇвах хахвхктак зсїасзазак хаакткКаЗЄ КНю аихстнвисї сазана леовееветза калина х астетсваакк саке отах ЗМ зах та стІВЕжтІа тивннтиваа здвадааайк паетвІїтаа всздазцека УЖ фуваакцака віхсвеїВа: збахохокиВ за сае: сахаВЗясО ЗедКе Бе базах зе сосен кЕх вевоВааве КуконНчКо сеотсвсоо зщк десесвсм хх кемкосовсе сосок сксересасс засадами: зсаоукаятя За зазатсатик мини стусо зосозОка пейатватта акаатахаек абкяосвЕне 3а2О зЕхзажаткх сквкхсуцця соте имаає Екс КЦе КСВ ККНИ Софа яя зако зе ай закавссосв даси сеБсЗсее зксстєккай зааскацитх За свв агаца захакссвто сзтодатати сваха тайк скхокоато ЗамаВеасхх КІ татвалахткх лизактсаса згттїзаадаа асвевтвава апсаєсавнах Ххсвхцаеха Б евастивтвс знтасвават замемсс осла ссВехВсясВ сш 372о
ТЕКТКаККсХ сВстеТООО СМ НЕХ Вжвасатна свтятВжЕеє зсмижаа ЗУКО хихжасвксв свтзвоасктв сазекаятс зккадтщави сетсстоваси ее ЗБ кразтазеу стотссгакх касах газазаааве нассЕїсеВа сах ЗО задаинюзве сота ав всї тобказиЗай взузвсозає сере тай КЕН хтЕхснЗцссО гстззактза цисатвесва солацазціЗ зграї кодах кай 402 цеутвтссса» аврссацихх зов КаЯлацавІс затателата зиукцакиня за5а свосотавєх айсссаняйя вустах «аавеоФфаах какаду хана хово з зврсзозааа здав задізсятах ака ссв ожтккедайа она нее Зк насззосзас аодсказане сатссзатав клас тУх засаду скававовх аа звзовазство сахккайзаа пес еЯх ваЕжеТс ВсчиЗнясх сс тЯцВх З320 ззазазсии зЗасссязаа зсмипдаасия Фазатсстава сомюм всех З зак кстІвессха ЗсткуаниЗв аесевсвави схе ВозВеВОаВ За саккцайцав звзссвзсхоса збабілвіве смаках весла мила щи зу зквса зстосетавта хпезкккЗЗІ бопагбатстє зсосауаавія паза ця З ашикисши свт таа зніс ІКтжО сбакцтвивс Зам евака ацаашеунх ЗВиЙ кхсассскс ато оааси сатскВощ КИЧЄКосова спаааЗкакка каахкансну ЗА зацтватаа зуба текя чсчезсеатваа хх щапакиаак ячна ЗУ цехова мот анчес Вова ване соааодаккиа кУККККККиВ Ва цсхевзасаса сеатскиЗся звавесстеаа сенувоавоє авссккацак тоаоикКксх Зк панхстсвог зодеазав здезавасие аа ксте севацекккхо адасафхциа 2 змекцоваето отуаавнсє ссзогвасах сапсдосаат отдела ахдкацаниа ЗВО тпасвивісе Все Ни стояв АСК ОуВ стаж е сказ киа МІ стОДІСК ставай Яевасяяоєь сахайовсте замнкскка авахкайкаа ІЩюЮ спади засажсскма зсвтснааав сбкснааз зозбжвацає соукалика БА чапассєсвза заззаатомх соасснаки запозодцся саше сватати БЖ тактика нсястокк такі СмМи а тна хост їаа сао ЗеЩо їзЗавтатих: кспазецах аафеаайтна совок ска еОВ ЗВТ УАД
ФЕтавщ ФМмацаоВх запзтооаьо Змеспаках зааавикоза зоодаанни Бе тет Ецсяа фЕсКкиаухх КЗсВічнитО сатупажкис асхксеснвє зсозкхакаай За звІдацаає вопацнхцік кктсВацикх капаоооивх вхахозаево запаацваки щі зо татаї воліцялнну дссатстац ккааакики Кксодетовх закасхвотй хоКа саттстодсс дмкажхясях коБВЕТааєсх зкасааакех сазесавова сдакувеке ЗНА цпавттаеацак сспомаласа салаєзссава кктасусаий зоуЗзавсВх акааакиеЕ Б
ТтТссакакаай каажхазлехо чегаааккив зутнїтяваа схатВаїаа ага О БО ттвааткакх МиккхавЕтЗ сазатакать завчсствнао сотка: петусетяВа ІБЕВ за амх сстектиае стозсккнах сскотовтс Вежотудккх ев есеа 1853 тетаакцакх кикхккскЗс овзаоаНкХ дензсвиЗВа Фезаастаакх свасрссрее КІВІ азвцнсараєк дапсхоковв сссзекнкся ксзссосозоз зсссекааз стсваестх Мю асссакецех ацланшсвся Заосзєск свссзссвес ЗЗЕЕКОЗКВХ ЗоВТОоВог КЕ казаоатмі зевснющавоз сзвсЗкновї созтзсваат засоплахає своуатозсао ща зазаакоавких созазувссоз басоасаево загзтоамасх сассакснає сазааастай ВІВ цацезхсзсея пвазваасаа соку ай фотасомние иаиазисяа Яка БИ акахтаиссї ватасцдасоа мнисізсосса зсасзсавке пикоуанкоо дохо що усаснвстсЕ де аатаво сект Му жези хкасссвсва пак хх «ще зкнсцвІя тетсОтеах казан о асааесаках Хосхавасве саховцяхия БАтО щфесттсзсза са кисох Ксвавтасеях порах Зо стосззакек ато е вад згсовасат гос цавх сао ся заніс зесссодско асвсстаеза УНІ ззассзовс зазваааансс ззажаккихх ссстватнт стовіоаоє сегООусВЕ БОЮ тато оте сохне сяс ста я ЗсоноЯзеТеє ЗІтатєву нео еАВх АБО тата: сацхнхинит зхзааняст всстогсте муллаи зга: БІВ таза саалинязах стсахктсо всттсватас сазан зеее М КУБ тстстадцаад актсзикся вежа ккаве зтФаваева Фсткааікке сват КУ зсззтоуак стала гсвзвсааусс савастовзаа опаавхкав зтовсссва КК ссозартех заайтсазсвав зсастккксс ссосвсвзовае ссааткатоя сага НКУ тссзуЗакЕ фани сню гака сводваїзаЗ збазаваєсе ваз таха тост овад авоккаксткс зозсстанс) зааствовтоа возсВаеєВа свсоваозся ТОВ сІчаиасзсос зБалавтеска зессавака зодатекаст всего аестстсоКЕ ха зціссосааО ссмллавку вища зллчцвуне свозаааста ЗЗВІВВІцВ УВА тІтсссаата щазествза хоіссакане КаахохуттЕ вес етт скрснКхЕКХ ТІК «пххкникіВІ ХХ воа сан КасосхЕакк сохнксхта задо аских ЇВ зпуацехкзи КеЗцтХщогх Бела Зсс здазааскка саке сразавктва УВО
ЗВСтТЕОЕКЕ сстаєтосавх хесхзУсти? сбазахтуках зсвкахрива иа КЗ: зсфозосзст Кааамцаскя зелосаціїсо кмадассовя сзнцезасао омогацаа. ТУ завааїсако акахайтква звасозатев дадмннлх свЗаеищва тес кква ТУ
Заст зкрааанися зсЯеоих здаасгадни пазвсяттти зва анЕ КО
Жсксороаттас зкткакзсв) зовевааат пись кет гадає кха Те
Зав стсЕ Жаазакксозв кесмростОх пкасанивсї зозазктаата заткккацає о татЕтоцссЕ Жаастанасх Жссветсакх аккасхвва «гака засмни Тк ха яЕ Кессцацея ЄЗобозфОак ккхаканхв Фтозозасах ахкеєв ТВО засмстахааа снжтакитІсс скани х звівкакато Фзагсааак кхащкакаВе яка едвааааз мсаЗхяте ззааеааааа ххх ацасВ Мао пхказазааВ -й ага акакясяВкят Кая Ззсврзявсє заз входах ОО «застав засасвтвее сома зствтессас зайладаєв зскжтсвоєа що пастастакх ктакквсвах ссратоех зсвораг Зав акає звсстстваах що пезтсжкЕкщ хавивсозсва соозскахав звозоаозесс акакааатає зестовещЕ вла мин жаккх вікккссоао зсзаалацяв сзітїїзсза сазаствкссия сзвезвсзаа діда палсавасна сатІЗеаавк асакитасях Бомаавапє винесе та МИ БЖ чі взстскІ детодааких ство твсоє касетах зн тааст стдакаткех 5405 векксстЗВа зазомхкАки «екс са зсаоуухкаа света спактахкоа ща наствЕтоЗВ асстоктиЕ сок сападасове віце асадехк ха Іо з«схкксзЗа стсааоаалсо стояти уунявисткс Тассаакх пехХоВЯсяа Іо сте тасВЕс васКитттсв тво отса КНВоадетсяЗ ока сехЯЗщоЗВА я гвтссстоах азмаскоств зсфтстлове авхсестсва зате кавк кссзствсва ВРЮ зззсваоваєс Бімшиацвсттс бсовсасккх ссхсвОниМ: ховав встсцвсса ВО дет птккАсВест Зссзссаках ВСЖЕСТсВКИх подккакаак сещеЗЕ ЗВО чавасстао секоккчаво ЗТ АЄСКЕ сЗЗНЕсТс цехдакаких соска сої. ВВВИ
Фата иаг секта ствсо пастви ска дастуккиме повнова 53 свтсзсссай зкхкизЗВІОе сах КУ СЕСІЙ КИишШаКІКкА ВсКВКВКВЄ ЗП
ТтІзсцджтсад закасоЗсее їефадитЕсх сеЗссттсВа спот Сруаасяї ЗО аетсоцтетсте ККОксВВсї сеїзссхай зву євсзаа Вокал скаловВся АВ децатавоє соєошсчев ссомессокк екв сВтавс зааксааою зазна Зо захазоасоа стслевсхве сервіс шкааксаеся ба тавака хаос зе вжиті снсв вВсїжамаЯхя воімзатаіа аасиатиннов сатеаатек али си З кдахзасасх стссосаккх званктоі мохи хана сві Ме аникВ Б акааахачйх зсвтазтакта захккзатсВ сМмеаєкаа хаянЕЕВЕка аБаєрамех аг аа тяна зазахяетЕВ таскааккка тсказвІву затааттава кекжацккхх ах
ММС ЮЬКЕ пИжСКАБСКЇ звусааакомх ккксттття з атаа пккалвкккЕ о
ХАССЕ КХ ттдалиВОВВ форкксааа засассвсос сазана пекакаєцхх КО зоатайався кесаяссосв дак кпк тсресе ЗОМ ссокукавцї КУ згстаацявк кутстсестсВ саноалакакх зіаказкове зуиоакак понвсхяхуає ЗЕ зкутсватсвк знав ее пеемовкая сохасазат зара сЕХсВеБотЕ За касккадакс вадастсвзес Закаєсанаєсн зпахтазааа сакасаєваюй чаксккееВе ЗВ засзаккаих засавсввсх закаакан висясевсаа гас кае аастассака З ссажовкхкк зачояветет пакхеккаку сунетсекКе МКшКЩЄтеЖА стфсяЕцВКа ЗО ккзахнктях фсевавосвс асо звсетаїтак см остео а ї302о злскаастх св зааца сахкаквУко Заазаатсяк хукккаюсзВ ФЕтодаасЗ 13585 зішствосця феттзеавао сацхЕКсахЗ сохаатевак хлацикхове зва ка іа лКЕКеКККЕ Фет цтЕтсВсЯНцО ОКО Є Вени застав іще ккажкухссВ везе тсагх серия стІто вза я питав селелее пе пюкахоткЗс гТасВоЗасккх песоводета морлаксі асхоссаах зима мя хисрзУкнОЗО ЗзїзозИскЕКх пехЗЗаавсо статок есте тсво ЗЗазааккИ Мих
Чис тах сараях сова аст смововктоз вазсатяної сксдахаций ца севссозаох Кос кВКЕЗс омоовах диво КОН тОМ КопсцтвнеЄ зав засзкаасза йхахевкЗсе зсехкхкада звккссвосха сах сЕтоЗЇЗссе За тс коКхККсКЗЕ падацаахко кіцс ша кайохкхикхк Зетсдааоа ОС У стідосвикя хасровацсї ааоскекко МТА сабуєкххсеЕ Зцне жа загоцеацих ххасстіІВї сбтлациснся хво савасяство дата щу статиеткиа ззІсвозеає ооаокхвето пвІяестках ШКХяВстВо Ват 1О505 зник хтостастт скхтасястс зесттодайт кахусвсвто ва МБО теща хеВтВстодеК скссстВухо стовоасскаа сунсвКост МОВ Заа2о рана хвассвясаст абкаастЗЕх стосатекщ вх цуове ки ВО стівесткай ствссвозжох дабсаєсасс КТТІВсвИКкИ КажВКсхсВи това ім тлащцаткце ссесувоваєх азцслесут ссфвнаака смс тово таспакаєа Ам зазаамакхих сопоЗстае пехааснсхЇ шхсостаакек КЦНЕНаСЯеЄ сссеВе іо ктцацазваи писпсвтва запа хкЗех свявеаттй бсааКенН ТестТаво ізо хоааесск сопецеесЕї фесакавика хкхахаЕааюх Бекекоцнях Фвецекаах кон аичЕзаІЗажх саагакикав госамозеух хатка ЗМ Укх вх ЩО тнхцсявІж зкасаккхаз твспсоатад дадлаканвях зізФовсоса аакхницака МА засхитсасо сзгоаотетси тстазжотеає: тадазетасс звітах секааитака Мая зі тоцистаа ккхабкхкЗВ сзттохокаай засайнсксо ззссаааса звахаханих зУТЕВ зтатацикх Хахахататиу сстттзавах кЕККтвВсВИВ ВЕК ка взайитносЕ МН заз Зедахткккх хОВсВтухаа ках кщКхя ЗатЗтоа пеКогКІХЕ їн
Тата ззахазктво скВІзовакх ВЖК ВХ сзаотажеає кала сях ззУпа
ТАКТИ ЗиткхксаК ЗЕтсВТаКОК калайкстве сзазаетк атаках ів тгалаттта пидхнайахк ссбвіаахкх зазахснавх зразсататх ахжакЕтЗов заго татоавахкЗ зхттттасяс тещатьаска зве ми та асттьолана ск ВоОКха ЗІЗ тзаадайхки ЗтсаввсЯцвс бащааманні нааеажоЗтО ЗБаачни: заазЕКое Тра татайваака стскнвІвца гсатазвссїЇ зізаавзазаа зажткта стазкдгата 2505 масскактка тсхивватІт Загсааззевза заЇтвзазата атак кст звсззаваха зло з«васкацаав подстовиаа соска ссозвссваах скаже здат 1-3 заз кхниакх ксрзтвевва сопаахкиВс соопеопакх ясно ств зесзгатав КО сЕккаахвих евзоавІЗе зктаниксва сдітотовах нісскудзав Зк освлада і мовассявис ската сь оклатятцва іїаадайксая ЗстсдаА ци вний авта зи клакухнст тозітстана завасяхуссс завітай т звхттетог азваавануй ЗВО зкайсхвсоа гетазоаа асовізака сазазаакхи кзазасоаех Заацесних кеВ: атлхзсодис сбззсааатах ксттцззааа зхасомаака зсетодаата зазцаанчеу Ії) акти теої вегтоттада кала пустаанцях ще ацМьик ситкхциЗЗ 12545 твастВІтав оспесов схЗсзаазах сусяствЕ тако схстестпа за звізцгаана цаапжлнонс смиатаис кттссвстта аКККХанаВ ссвзовавея МАО твІВІасата псавтссяте ВАК КС стеж ЗИх Зк схВВКЗ зетезалата КА сатстмаиа сросихостт засакхк засатстека хахеаксссв соратодека Мун сттгааазкх позсицВстоа сао е щира пісок хЗоВ сова я ЗЖЯй сміх звизасссет захв стівза8етщах Зоо елес скали Кя ЗАВ тата ссхоотосто саке ккае сісоввевеця совттосасв смаки є ве стагакокох ВстоцсТссв сеахтостта зцатсакивс восвоетаве зав аккцу ЗО срок акх кихстссвсВ пОеСКХННККО Хата сОсессос СТЕ ОКАХ ІЗОНО ттЇтссстака залассассоа затаакксв свовассвов спяВсВОа с газа ІЗ
Ттгттазааах сапизновВї зсажаакихх ВеВТоВеСк ЄТСКеВеЕВС ше 13
СЕеТОИМКЕ КВК КсККТ ШТОК КХ КІВ твозак хпутноасея Зсжтааааоа НЕ свт Вкрастаутя Фтажтаксия ксстїваеае стакан ук ста БУ кіл хВаато Замодиокех оф тазеся хостес кпакієкани зх І133КО тссззазса бахакакаккх аккваеке кхсивсуаает обеаашакх: ссялУстее НЕЕНО сазаццсхва совет КесВтоФЦКО кдкміцкае Стос еВК даси 359 застуд Макс ісх вфсахацево засо ссдхвасова казав 13550 зсакцуавткх совка зовано ахКозннУ сода асех Миска 133
ФЧіапсоацеао какссктвнс саваокссво ККкхрацках «ухва сахадалови 135ЩО чани Зазоняоце засовлаааса ацекннівих салсавовах скадоуаака 1375 засстакцнизча празачовоч совок анизссЕхцх зас ова ааплад МО запетадеаа звахкксвво збсзозаава фсавутвес вазах оскх «укаккцадя ТБ «сами стаі запоксаакв заз стко завис взасос хау МачЖИ пеаакацеЯх кадсаЗсв дізазозав аассстссаа ста мна свиня 35 хазасловх зоахасенах стссссозасо асвісосзва досто коцахасте ЗЛ мем коазек соток: Зтзааоаася ававссвтае сістодккає ЗКУ ТВ зак зими сис кака хуааасмкя слово замикає Були рнИ МК чздабадекс писенвсоЗе аа аася сажссціаї. звпаслазнх знак есВ Іза «астсатакк сазсавтсса абз ссозавезав ззаїазаваз сова а28о зассамнав скузакствао засто Зоозоззаг3 зЗатуазає ззоссевмЗ 55 казок; канидаем сасратаксх стовессмух зацасатвоам сттезсзаца вн
ОАВЕКИККЦХ вахВаКоеВ Зодоглацкоа сова ак секкцикОВх пав 1лАКо асеккуаавя сухткссозва сообатсоавів ув дехеєсктова авабосхаєя І хЕХссядино Чет Х соКашУВоВЕ склтсаавВ хстовоавек Вила лаЗеВ. 1:58 апсткицасв состава піхоти свахтскааї зкотеукх кота ккКХ жк кхпахвахї чссптаалах кіста й ЗахтячкиКХ Ста зцаОвих АН позизтсЗсИ остов х ЗКУ ЗпункуЧкуа щеттатакає тпузчактОХ ІБ совно сота заВоКстцеВЕ оса сясО ЗВУК Х ТОВ 452 сихвзсвека ісаволаня сокзоссвак свІзжзкоЗ гака вто 158555 зкаказїака ссодаомаскт тастаажетк дося мроумаєие сире сх із ївсхтВЦКсВ СЕЛ кКЕ Зако МТФ Ее вот каскеки зссоеееаа зако ттснсатсссх гзазодлвяо зозизаєтва сан са зазахкааев сзвеочатах а чаксстзсвса дози те ваеевасатх феннрзааж зсбцаккике теввасВІВе ТУ О чопвсамке: азакахсятв отосзссаан свтзатазас заааавксв зве іхіщИ чхванивавсї Мам авоЗис вттсяолях птвшоооава сага каке севосстеоЕ ІА цахкатккко сстсстоккх івУстовзВа пКеххеУЗВе азс оВааа сеВчтхВ ха хапхацсс ІЗ ця КІВЧККЕЕЄ копхясЕтиа МИТ десоседтсх ВІК зкатскснтст ссвттазицих кино Божккасас асо аопдеєтстя ІВ
ТеХЛЯСКЕСХ рос токаах пежтикто слахаєвхою вохвесоіє сумну а чегасня зни таата мент фафафмуєєх бккуроутсеа кет щу аекхсвцтто зодссмхаЗ хвистттвга ЗітОосакто ранок сКеЕ завосттоав ЗО хЕтссттссвз фогтааксх схонхсовак асісстацво яаанодунва тооаест 5 адхвстазаа товки свекеттте саземк явхсаакссв сзвзсзааає 4575 ааннвозсвов тав кккия кесКтНІКе баслацханх вцістевосоа сао аа 15785 хавсстсо ттсскУкаао ще суаєакксні засво аасева ТУЯ ззикВтсзао сазаамткх КЗЗЕТсЕВКК сОккакисс ство иО масова МУК скота е септскоакх ЗУстссосма закаккковв свкзааєва зватися Уч зскзіаас санках смруасск асом стсатстсах зако МиКИ зажхоамчнито ссайсавахс захувесола ахжссвесаса сзасосоасУух канви ЗКО МБО зосзазаєва аасаацинис соти снаноссота асжесвояк садах оо Мо гасла кібоенавс стос снайцасвеЗ стЗадвгва пока таеу 15 ссастеокає аакиасовоа етос иЕ сКеОсЯВЕеек сехаркьюиєх схов сх іБІВО чазасттаак кита тсот згадок аВсцссоТвК птахи ЗнеВтсссої ЇМО самкжщшкахтк кахвисЗсс спсстсскухі сова ака ккака сзсоссваах 15383
ККУ: ЗкОцуктусс стерекких жасооачнк; мая стох ЗКУЧЕНКщЕ їв стос хв а ціла прив мисЗЯсвІ пава я І5Б5О се ккцекЕ сваВтТсМх збкасайвве засккаттах нкхнзаасто свдассацай МО вами ззухвадтка закксхавев оаакхакакх кскївозаа гаатекайих МО пКхккицисх севтаТакккх зкавксвааа задкалкктв ме лазає Бккасахики ХВО их іаа стввуМмуцай «ссасжсввт акусихвусо заатамиа ракекятссе Ха писк ніва жоЇТдахакх феотттасаб айссснсяяат сзаатаатса акасксВнсх Не цаацЕттоє) саатавско вас таа сечссвазах осастаюцак саксивеорх ява зевозттсзг мадатдо сзжетесакк аВіЗссожс соки тКЕ Коб Са Ва твїстестсї Зазаккхзвоу зозсассхох сто ссекахінов ства а ТОВ тпвазссхат закис заастодава зсзЗсвсаалп адспетхккх сЕссВКЕ НЬЮ свІчен ОХ саме хт сзосажуках кесозенааа саспткмжаки ЯсКХІВсеста Те чавсзстафс атак хаст фЗїссаккка нивовтасст васекЕтаєсва «ажеевесва МУ сазсзасзаз сайкаазова сзттасзакх світ яєва миассахувсх НОВ ИЙ цЧеостостаа зсааасозав зеттстактв зеасесває МКНОукхасЕ пасіеЕето То схттсвссда ладавахасе зстозтацах ска стове самота пакккКНіКх МК акцисзстав залксадв їстовасате сказ сос фОаВЕКОакк хежКтаККосв ТАН
Запахи сзстзскзау ксттсат ща ахкассвтва зада соКАдехеха ЗК зааклюски вІсосасаух ОН ХЕТІВ сутствєхоВ Фест девстдату МО хдосакаиссх коваЗсфикак всхаоЗВесв ставчатувх КК Сех ВИТВО
ХК кКСТВЄ ФЕСЕЕАСМОК ЯстааввстО ОЗсЕтВТссВ ЗБК хОКт Вторес ї753 аку вовВт Ффоттеаею аплаязове ЄТекскестє хахкатхове фр МиюЮ ккшкжеткВт сооїстаає акксхцєВк зіоссвассх сИЦКОКЕЕКВ сотввотеТо Х775а кЕкттххВа сет дексу тчЕЕ зас таЗах сини ЗКсї ВбаЗТсс іт посккснива дезтоккакк ахекасовсо гетЗеВетаа сулвтнктовї ЗВО во зуханнвивс своем сксаЗасїсов зоссваетва сесттцаеа сля ВиМО поесхксжка тоттжанихх кезсстВаа зоаскакцка сзсоветова Кк ККо 15 хсувеатжже Таж х ве: спало Веста феВИХ Мак кОкКе ЗюЮ питво аїцесутАх Есе сея ЗоасккаскЕЕ сОпнетада ЗКБОКВККК МО тахккежееа сте ККлХ ста смХНиНОІ СМС сТаЄВ алтаскахой 15ІО
СІВ ЕЕ СМАК ЦЯХ ТЕС ВИК ККоа «ав ева датах 548 стЧетодасс оазис ятевста мезссаи сВгжакми стхвиоавоВх. Іа звостозсас кет таВс чітсозоЗак зткккхисце таких досодвешеВ. іа встзссоават хдацкахсве Фк ха папка кодах хак остова їла сис хадзоктва сімка звана Фіасаачсах сво твота Ки тотастотаа соте впостлазнк пече коханих За 155940 стаз ЗіваІоасзаа зеккакоВя сотозаакай сезсясптааа (хататоекай 10: таатаакзах заІззацеска слазвковЗя згомккнаа ззоаааатаї зказкзацкк ЦО закавксУЗх заст сЕчКаКсщТа Вл аквАа зтсатВааМи ТВЕЦеШиХ іно такое кх стжазаксях чизітстааа ккткатянояв тахтевскай содою їк?ао авхахЕскАт ВІссатсВи ФОЗЖОЕЕККК КЕКВ ссаБКЕКККЗ жна. зач цсвхсассаа асарюметос аастатскккх саженжет задахиаака зеваводазеВ аю цаясвасстт стазавнюсс сзазсоваак акактахскв таскаакахх зВеВЕКстВа. ЗВОАЮ ттвстястогк скодайтовс затссстоааа ск тай тааккасна сКхЕУс Оце і1302О шросаЗааз спасе ниас босЗазаанкх зако Зали сотоцвацах за стоздтссаа собхацнаї сезакакеккк деки заккчахссх зезекеВа ха забсзтакск ахоеккххва ТЕО са кове ЕТ стриж кцсх тттзЗОВага Ки кивзсятова содскааче заозозакаа авяснякоса закхадацчия нповизацекя щи вО хцтвновтаа ссказакотя састмиках хрсканиакї апхалаахтвх Корсак 48320 цовісссєзг зкаїтактва заїзссутах акзситкЗає зиаккика свині е 1338 кагсахнузац ссгазаков) ссовсотока зкхсакнкав зовкаакакк сашносев 3 кипсхкас тссастахит ЗаассоВста МсККИаНкст сассаадкКє ЗСКаКНсНВЄ вен ткакайкив сія акж хека завиасснис заазаииа сала КАи ЗНО саакавснис назсзасааа саван ов зіфасавька саатевссве зесвтомка іа тІцттасеух касЖуЗаКсХ зВїссханоа нев аВТе стаз саах ВссОВОКаВО НВ азам ссааа зоххосевве загассааку Омез ЕЕ сотки ЗВуттсВсся. іЇЗУЯа тталосаснх сстхруацес а кяхо зЗкасхясоа озазаакюз Зевс стете зад утаскасах зстсвозаае ав тенна ст езосао скакати зсссзевавЗ ТВ каси Ккаєсе ХетсстоВе бМеллаєисся стааксзцеаї сммоваякик ЗК 15839 сих кЕнквс совсЗттоза зако омассзааат спис остсатовї 1305 кава вастттстее захкнхнума тоовБавева секс хоця ТО мюаЄ аЕкексВКс хЗсОЗетсст какккклоаст созаотаєкх какао сзескадов ОО птвсточнсв с3козесвоа ЗахаХоУЕеЕ тозЕжсстах касхвававо Фзахсадоа кН хахсЕзоцяа сет теах аноетеоец миска дивхісекка секадааких НЯ хЕстлЗрнир толІдіеВа спйсттаЗа) аикоцатмсях ска ЗКадсякта що схов тестах ЗКХсствеМ. сода сеястіств пак А сасхттгсоаа згааацацах зстстстака кекиєсиктс созестБвма ахлсоксвссе МО зЗзозассах коскаккккк сущевеваца захтсомаЗа зефросоєк мене саВсх за частсоїтсс кахакктв зетвассвкх зОсКкОККех сатсзодикк ккскацкВеВ 2В52Ю тат стає какокстсне аеваєдоссв врахо ппмоеталя ЗубОсЕОТО ТОВ севстатмеоа ваза тс оЗамеахся остова т самих зтсатодаца Не сесхакамих ссассвствс та таззв всссаттста сзаквссвав сексу ОК зазгкакхкав чиазусіащці ананас заветав саисцяцзве зад нацх ЗОВ пасиктоция ЧістттсвавО Мпохуюссаах зов даєсви саванах ке сахОх тОита ссенсвнсяє сзагаастах ЗЗаЧсО ск ЗкВвІсааО ЗВкоВКК ТОКЖО тахоазоазссо) тзсааадаки сквстзото кклацилка зоззеватаа папках 20943 зхшизтасої ггзаакка) сзсввсВИхх дхайхазнвав Звововава зач вща ІОВ пон вовоЗ озоазацава вав «хпацнннх ЗетаБовав Ехо ККЕ НЯ ккжхиззатаз згозаайкак зсаетсках ДЯктскакКО вветатесу сацтхсскщє ВО поча: ссзіажоачак Усач зпІВстасяа ковзає ЗНО Ох СН васлуаассз дезсткоцих засжОстосоа Зепаустхна оз аа ачсуВоКчКя БІ с«асзсваа зсмнмаках свв осваке апаІоВуука пава сецсВосВх.
ЗУ зиказсназа зиломици соуескеаве авлхохнайнся зусеЗстаце засос ЗО веацзхасавз сзоссзаенх аЗскзвтасс заказ зсазевмва млинах гА8о тікав тоа тзвссозтва даксхвіза здасаскщих фак зсваа паса кіяве таацахикут ство КайкоЗІзах завада азс доаакОукках КІ зтатахасаї стстто мкжннехтаа згЗуаааока «акасксвсо токах АаБОЮ стсощстайна автоклав аМаМЕКНВЕ ТІ ТаЦ МИ хНяй сидазса ХАВБИ чкаасовав ссзааакакта латакаевих стттаваках ахнкхкккав зВсттсттях ЗаУХа адазктуккст тТтаазаайка кетаухаажв ББОсВаЄскх КЕКІНКИКВ овВІВтотсВ ІТ ххавихнсЗа зогостскак ккхтасхаве тттааакаве Нитка збо аж хАукаачеЗЄ їЗстаааату СЗХсЯНКсТЄ ФЕРМ ЕКЄ сихихесвка КЗфсЗВаВе гм кахспзавзтт сттакакаех хек нрвве: сеозацми ЗтІтоцихня Тут аВаева вах латацаясвт атсавкакіх явеаксзхя тТтоУККка СЗсХхиахіа «еко ре
КХнастжтоз аафутнсих савспниза сфзоксазах застиЗаВеа здат РР асІчкаХтЗж забазанткя хсстнінаЗа вфаткихаих авт оВІвто ета аа ХУ заакхвнете міайсканове пхатунееее стажсвнина кепка За ааа ЕВ зхлитвтєса кежкаасизаВ зЗааазссад аааансссз заасссовса заассоаакх ЕВ ввжхссвазсс дахахннссі зе аа сях ззассавао засн Как ахккцЗевсст схаатжасв) свостетаайх аккмсанове втезетаво заалке ТОНЕ «зхасхсство аадккккка звався аск свІЗ зетоаата дазллааа ТКА невистсЗах цу шкня хВІЗеВаиМЕ акттязикст зааазааках кскехзацзіакх 850 звІвщТтТкх дико вов Васко сдрасттзсав сзазпссаца пхасадацаа ТЕ5БО ссвІвзаців акханносес пз заловвсвах тазику таза заватасукя 23523 зт тнва асани возаа зтдатакакх ктхтЯтсве азакаааких сосстстяяа ТИВ ззасдеах ХесКсттсс зтатзастах сетОстТссск скпитаквав звтссФе ЗУ твстахкоця заскссіїст плазахазкх слрмаоогха хвоя кучє ето ве созіїумаюся чааоОстіас стався завамшня ЯСТТЕЧЕТсЮ Сов сВ ЗІЗ та ВсЯ газами рахасасяВе оідмианва «сагвоезст заатваєтав ЛІВ афікс т тоздакквак жнишеиоо згадай к звезтозжоа сахаавтаау ЕКО засвалкктоЗ ззаазккккк заст схазае сотахтккоУ) жвтастТета адавакай НВ «иа ст спзассазаца аа акссвв заааткавія сссозЗбеач гегакасада Ен казааазкЗа ссїзаЗатих паски фтацаккне вЗВасстеТВ задаккедах КО «випасти гзсзадакта сазакВатВе зіфтказах втсізЗасстх ззстаааккк ЕІ зкасжкахси стїзсвцац кінних я пзсткокова сЗааеасаєй сесспацанах ЕЖХВО асхеанцикс созтааккав ков еВ боесслаккв вуствзовас зсасх Же тгазаниккв зіосзсатах адткатаЗет таосахаакх сввизвІВве варт кам а зЗасаозазх сота асти как са ггзааааю осн асо КА ща ллаза хаовваасто зазиккксса хсезаатаха хнакххяВх затв КУ сезсзатана ствхжстас аілтайсяя секта астдетастх свехнеаВу 355 кхисезазга сахразітсЗ зцізезсваса кихсквзата сазотьцх анаакекаях ЗО похксвсваа азабоахссв свсззатаса метати аст сестосовма кмхкевака КЕ сааваєсацаця зктесасзах затїзсевак ааказсивас зазслязсває автдкавктй ЗБ «атммаєзат гасодхакка сезатекук ссадсктстс грат скан 83553 ав ДеК Зоо КОККО ОЗНОБ КСК коКхитсттс ТстстееО ВКтитаккоі ЖІ за с аадепкахкх сТТстскак хар стс остео детссюстни яко сщЕВеККаМж см кекес БОБ Каєткх сисхвтсех Затстодає Кого тассо ЗАКК кааавкаккк сехловносо хааооонсв позеестЕто сСіТстозаз СтссХВКЦе яка посккакаак БіКккссетв сКоваккова соте тосестезацх ссЗЕсхВооВ. зад пост какокхи засанусвсв «ким ваасостває дасте е пазссууах згаа поскпазахя зів вехакакак сваевтстає заимлеккаю вестися гам сакоулткикх пива всо бтааєкаУє ХТсстВосМк Кататькаво всегда. газ тактхсхЗа аікхявіЗаа Маха ків зорі сса пуховик стае газо зщетцктстк анстежтаЗа Зипатяхнео сага пайкакккся ММ ща зЗжЕксстаноа засяавваоаа схаацинциява Ом лЛлІца Зодоцлацяє зсстватека ХА зЗакзсвааса стссвоткох кспоцввест вотсказуих зкекнсетсю Зако НО хЕдкссттВс сстввостся Ес КсВВст сстокакк сасВсООеТа КОТИК я
ЗкхІкксю пс стах зсяїаасм сеаОКЕхкх заЗкавІаВО пак шо пхпезсзаВ сова одазо вазототаах зааасяникх кове ВстЯ пис саОКа ЗАТВ
ІТТ ІЗ аай сЗатовтахи кктснсяВст татсоеаі сВтусоВаах КЕ УК свІзагасВе зажсстаєх собсазтатва хайсастоте сессажетазв дотстещвся ХЯя шесІзамике зтзапакккх сїззаахх зва та зЗгтатадах ковасезеве а ствставгва зав тавк: вітафтккатх заксзааааа ана атак ва зазна тзазехозахї заїтазактк сад лоєсва же свов замка хяа затедваво зна їсваатазаа пассзвасва аастєвкозх зааащетавих базах васадаць Я5ОКО «сіжаєциж гахцасяваа адалантсте саайсаті зицацевсяз зсахасккек ша тхаскксахи заклхслаза акахавесте зозауаскай вчив ста зак кккй БЕЗ зсазасооика миакксоова абкискжсво аежскаккимх ккацскнхст екакккхак ЗІБ тдаідазвана сиза лявза ние то стасдавтих сасактЗся азкааааай 53 зага сеннееоєкт КІджлеНИ боптсттава замша ссоє сакккахоау «ЗЗНО задеатеамо паааневва асахихкиВс свсеткттка аайкаазкЗо ажхпахеква РЕ тат каст спасовашнк аїаєанлися вессоветах осмос Зегеглекте г55 тахїзава воттсаккє Зі ледаЗя звсвсоазаЗа асан заток "5 хаповоссої сотої койав сгаааомхє свохостокт Зааевасьв сів ОїЗа ІБКОУ хпхсоївас свствсаткв завсттскас соххиакекх здавемноИс піхва З5БВИ кв рзотро втсовтадт ковБовоаск ска хвосстних КоЗжмеКша ЗБЕ
НІХ ОЄ ВІТ бвахсосстя состодаєсх капниаУстя двавкостІВ 35 солттзцї ЗіБ хиха «схкЕнсВЕ тсакасаоа савтснвовавс сЕЗЗВсІО гУАка
ВТстТНКТеЕВЕ ТЗсаЄвиакКх їкКІханВОс ато ВаЗех снів Бах га хостес Застсмека зкоаххсКо ТОЄкацаккх сах ОсТе грец свое уза тастлозоа зстстказни сеоссзаеа саадсаєзех пузкзосата ЗОВ ЛЕ сказав зас одаце сісстосжео Тебкадаке цехзавссВа веасоаах ЕОЮ сховатттос обдатеакко заисвтТІОа сахтаваатх ставах дао ЖЕО песзотстеа сао акках свІнтВатех скатічватЕ ас тзазсва боїаавадех В пвсвтстаат осзкваласх зосовтоваа зобекокстя хозгтзцавь спа кка ІВ тасаїїїза: зоусЗакз) дваовизака качклоцове зстмцкмтаа з едици ЗНАЙ з«езасаїсаЕ статахкасе завтсвстав сок асце Фезаааскає сеопацнх ТВА хвваззсаіс сосаакнеЗс ства ку кхтвиЗКаїс зафетокхка кахкаканея УМ віск стоасса ссацемацех зо сск конс оццояВ сфодипсаєвце ака Кася ЗБАВИ «зам ас айлесвісва їх МУМІЗ «ОХ «аку ІТИ «КіХ» ДВК й . «йЩЯ» штучна писпідОВн сю
Же «ойіМ взАЇ-жа юю нукдаотизиа пеппідавиЯ ть
ЗОНИ щллчсесх сви аха сапайихчаз суаакобахе ззесстттвса соска 5 заїахссзвт твттстаака ааликустте секта Зх хтвсососста акакакккку 323 тсалисвохо всвоеекава «мес Зааахцацая ссОстаму ЗахккклКВу що теакавоВех здсвзаасовв спсскорево заавхіхесо Вес кає порскасео Бе зкххвтст сссозазаких сескккова кекиКІцеК ЕД ИИ ОК ХЕХ БВ кекс ссов зсвзопокися газі таАзЕВао Заахсяхтса ца квия клон а ЗБ тайсзвїхвв сввтакацта сстачЕвевА авта КЕ сумах скхтоцанео ЕВ тЕйкЕсоЗет ссттомтакх сист аза сектор атака аапоаехкоа Ада тцчатасттсв тостоккайе заххизиЕ: зуохааацва зате Випав ККЗ закаєствастс стссоакххцв аоакжаеЕ акадантета завіт театаа сбкаавания. 5 тасаствнивв ссвсзадахе «ака кЕїаЕ бодеватисоя зва: ззбвесалоо 5 зЗсасхацсх саттвсвках кЕкееЄКЕтсс певжахККжх воблщцМе векаккаххи ТТ їізїкакиас всвтазта сих тах Їтсзхакках везе гахееаакка ТВО теми кхадсвсссї задакттнтя сслектає спра їт созвоацах Я завозу кс аккахвнсосе зими повацааає садазвасо кат саВе ЗО качка кацахазаЗх змразосака захаканани хана Всх дохо кооах ЗЕ цар иаськк кеккяввс заттаасккх азницсацея ваЕссцУ: кападкаках 1820 фегаспвх зкпалезкох гвзсзозаза сссзкви саажетесва сами сдав Зп5О см атвааса асгранссвко вссвозтзав асозаслеВоЗа сеуєааапаї озаповавда ну засни аахтхекЕти ковІсвссах Заапааоко сеовааех саасомаєкх КУЗНЯ кто: кЗааяскЗа» сзвсстоаЗа пато сва ЗвобеОай кодкаєкаці ЗІБ вати сеапскІїже збо Ккхнінонвв Зсвассоайаа затих и Мо окайстему аазиночесе пора них зівйзснс Зевс ХО; що зуп цавах хист ак хесовачкжО ЗіпаааЗЗа песо НО зкккозта вт есссс зоуастеаж: сецсвеунаЗ тзадсханаай секс своВ що заз аЗата нн твиа соски пехввецках. Іа: сна БО засзодудака зни ссато:аюі зсввствсва зба: аахвснт 1558
ЧЕК Зк збуту кай звтсзассва кодах сота ї58а заапсалоака зтовезату гсвзоутия затв ниМ сах кака суфуам їх зомаксяках Зексоссяоз сааоалатою ЗВО ВЕКІХДККЮ ВЕК КУ кхиіекасаах зсясчющМ самка хва сама позкаучях зас ТВО кискснанЕх ЗслозаВоа кащевся дазоаавах обсчвтозка мор вааа РКО кишки вхств Ззотозатик атесочсв саатактацх ссаЕеТми сахкаакких Мо паса твас сцсовзсдайкх хкацЕтааВЗї акуЗатакЕ хата отак айнк що всззивоаз З'кахстви ккриаааса паслпянтлві аа аках аклаАсВоНцЄ Ка зоїтвазсет азккастнняя встзїатата анцксхнава еееазакнак кистссаВвтЄ аМх зсялвІЇтви заацісхння ее акак кижКЕскХВа Фаакекаах КСеЩЕКВОВВ. ад хстовсттва есе товт свсТсфозех кокиЗКтсевВ зтстаахваа ткоткстсто За ссвзав3аатт хпазуєснзо) зоїаааттна кеваевссае савсксаках саваосассв га зестсвствсс алею возсссссай зстсавссвс сзсссак казахаВеве гщю защркаоесс Зкаклассве сВастмервя ската е стаоучакхх песо Бе сс с) сце свва сфмчмммеа кову Фраааєцако коуБаЗВве ї5ТО зевсаатута заатаковцс севссаткай смунеев Фохааакких низи Зааев 258 зотстооіва втакасояцх зодсзсвоахе БеасКтЯКсКс засатаккк каахасВиК Ще кашстосес засасотицх крос СК Нио стоасоакткх кВаАлаМеКу їТО5
ВОК КО ле КУкАв сТсВсстгВ баках сват акти утея ТБ сошки жо х Васваєстана кусає сбсатцазакия несете аса атаки КО секадтасюа сові каєв зкмкааакс секааєвУ: сукхоВяата ЗМОВИ ЗА сива аа За СХ вести ка задшесвков виразах БАЗ свазачтВ хека атцК тЕКНсВМІ спосо скакоцихах сова КНУ сесттоООЗ засвацасцх таххнсЗоВж даспохаава сиастакіхо сват зтаза БИК тзтаамкак пакет СТІК: катода кеоозсясеє зЗазавааза зма
Тасастеє дакктезися стововЗам засто ССсВсвнюа ЗЛУ: зі заассаєтаа сакооавЗцВ зостсваєх сказане споззорраа сохваадих з246 їтїсззсааук стааасхона зссоваатеа зампаликаи ссзаЗаЗстс їзайекавка ЗО звсветесжк сескаказев тссзатеатх фебпаєас: сессловїаи хасааоккай ХО чіастосвва скадунчева зва зуажйнецчтся соки ва ван нхиЕх КОКО «вом стаах (них ичях ЗсвазсецкО бкаковс сстовавевє казнахацех ха аутссаецаг зазпатстк гзбсссааих паКхжКкКВХ свого КК КсияЄ З тазазезацм ФфаацатоЗ севсззааєх здцахаакув сесттсосавк аа сеоя зо ака счЕав ЄТЛАКЕЖЕКЕ ЗВО МИХ ЕІ ТВОЯ КЕККК КК ЗВО
Веста тав виакссттЕ са К вра ис тзаевВоата ВХ ЕНуЕ Уго теггатаває сааесте зогстамиаз кора Іта завмолааве ссствессвх ЯН ккгсхазрика кас натета суутатакикв зсозаїаеаа захутацтає стане Зв задазівуси «ета зкоазацаєЗ завосзовах хваазпасЗае звсатайека за хрваєсвайсх сода скацактхца зсоставтся залах К сомозаацах У ждекаЗсяахт схтоззстааа цазннсВеЕе хааааа хвуссоцеО КОКОС БІО заказиаияах обста скозесвтаа сскаваккх ззвовететх ккдацакіса ЗО викктяцссо соізсвалах сжезазевзае зкаххккама севтстодеєх хкайктаннх 35 кекс встсвеЇ аб тасх; З Звааа сазаихР всааВовеа ВККС соВоВА. ЗВ вІвсесххоаВ геставанте вассвОщВи татясканжс застав псВсвовВТ ча сеЕсиВиКтї взазаєвсяї пев ав ККЕаосясва Сбгдаааая зх ВОтаЕ зада заачисівува Віка цяк ТЕСЛЯ сухсввалоВ за авцик хзтзсцевеВ вав їктсасхсхЗ зобдоанвиве коза свхсавнята табтдаамиа зквевея тах з стін тата кітто стат. засткЇсноє доаветаєьає ткхвутасаа зЗУю се зтоа фапашааогт вззапатака свсасстваа пасакоккко Ффеззавсова за зксоцассвсяа азанннмрс сзгагавата свостсвзтац сбхмекккак хаттетосоа За сихзазсвЗа са стнся замка зовнсвасна зсавсаааєа асвсовсааЕ я хахастхасЗ зібасстатвх сзкпоааи исоликстс ЕуттОК: пусхсВаоВо ЯКІ каджхаснсхоа са а ск еВ сни хахек кт вас кЗвстствЕс БУ пдашкнавс ставках сксЕхстмет астдацоахї Коток ОцаохеКосх БІ запис тий Хости вуккнКїеае Крсфетакя сецавесмру ех кає Бе звазааминкх косствуааєх сепіановоа саацекакх спектра сротовтако З8КО сікаєсккака зеусуєтсст заходах сстстттвса куме ккаа чктхохутве ща зазакккаки кхизсвауся ск) оаневсосКе зкаакокьук ссявЗстоВО цю значну ска ткеВуВЕ сх хакека писазазтс асавткках завІвосее 38 змеахлкккх єна кКоххаахлав ЗехЗасжеес ЄЕкакокка ссвтсвся ЗалО кокс кк ко застосо пахви хаКЕ сс КОН оЧе сс е ЗВ мин стае стта засхсаснк сататоїака сехастнеке тарас УЗА
УквкктссІя ще Зазаа сасІЗааних зауїассьосх заиннвфщчяниа ЗзвЕаесвьа У казасцдевця тс ссхсвсЗаасе ство СТЯСКТаесЄ тота СК «каксхостт зссстааЗкх ахсоастсво стома соасвсвтаФЕ пас ЗУ азмщксхсїсо сфзазсета ккхсвтавво сассакаєки зсвзасозто зЗщсВКОсКо ЗУБ пиккоссЗсс зіссоасава ссз5зо3аао зазасвкавк звозсоастс коактакЕку що віхчсхвУта зе тсакка ссвтвІВїза баках с сттсевсАаей КаккЯсаяОу Ва «вкрав ас фатзасаках сват сй токах ахв саме лекахТ ха. ЖИВ) яхесттоїса зитайацих ЗІ Малинове х хазааааама хВУХВсВВАХ. КУ хкяисквово ствсїдакєна атЕщтаа Зах хВЖЕ даттваавай хЕВсСтХВЕВе За тнаІктаЗжс звазтазавт важтазамих хадшстсвже свт ккааа совет УЗ звасускких зим киВох тбахзайвкх ак ссттве сутЯхЕтткй ЗВваааЗАТОВ щОцО ттсзгаацах вкхакссва загахтацкх вкЗсвітаса свтяцсятає зссакоцах що ззкмухкжк «стхсосове зетсвкуссе ттсаааєкале хввоазосетс мк иакая БІТ сасакакика «азісвожт срасвхося ттастахахо ставте кави що закасадсст вівзвикайлт сспоссоцетЕ састиккІВе ссавассава дХсаККЧВЕ БЕ азсадалазия їтавааасах вслеоврве сте кхахалх вабтассаає капанканне ВНх засазвсвас втІзсвакта света сзаж бахтахнсса усетекав аувстесгВК Б хажіЗтоста стостсиккх КкЗстоВастК сасцвачЕкО ЗАКО Кя зОлосясоВе ЧА зацанимрвос стаїтаксои ЗуЗаВщЦось пахові та гак: хевовВоВевх ва кекс ооза зозїсаккак КіЗсоВастх ант гтасевахВЕ тЕВсяВасВа АН хкжевхохтЇВ озагстоккаа За сЗао зх каВц «ЕК тес КЕЕ каш «ака: зсвскаи За токх сита ам скамн дхтсвсевва еки каакттри стовощнаакх пскстОЗает феСКИКХлоКІ ВТС «ас тоцеє вуха зЗацшкивссв статосаках сс сосках щрацрюата спсххЕснст УК зЗдаатоцста состтЗавх пржовмиюоз закоханих застацня супах оча Ва свіжа к їсвсіЗаайа СВХхОстІЇс сасацациси сесвеаее еуккакцца ЕЗУННУ сттозатоахя салкексто Босхкоокоц «куїааесак іннова ех ссВкОККаКЕ я сстсазадшк зікадевсоа куска кк Чавес стстсетІях еросадав ТОхО хухактциха кілок сВВ зфсотссвх ака ВцЯсТе света х спазцєкади ВК
ЕТО МИ СН КАККВС ССЦ ВЕК КХНОВХ соя пеКЕоВКККХ хід засасамцє ссацонссва зсзстасЗак вашскощстя тосту Капасаооца ха пІтакказих асиххщкес азот ЗсКОНсВсЯ СЕТ схакекткіх ТИВ тасрмчєвок ктпдацкках зОсатектк ХІН есККсО стека КВоКсносте 32 стоку зкхтя анлехавкоав зсачтакх сової всостостав ссвовствсх Уа застекткс ситсхтозот закона совет фссттааека соус О тю кастаєкккх зсссттстат дсстраастс зозсвссета аа киє сао ТМ сатин хиесЗсоЗа Зк аково датоттадав Заваєккоа пса ТУ чатактсксто стзассттоза тако ккокс сатцстосто адзайааиах Фсвобава БЕХ ак вкскаи зезжктооса ахаааекктс стазаавтоа азжоюзетвє атому мно закпаккакхв сахаЗттВсВ зххдайкуас Ззсозамназсо кайхайкева сага вох тя зкзакщіївВЕ сів ма Зах хКиса зіїаоМайикх камнихевІв сакекаакАЙ УВІ чЧЕчаївоваз зеззаатата зечпцсниа бводапазях сао ака кКЕ ТК акцствства зу евах санезнІсст заккакакох дасте МК КК ОНКаХ ТО панутазазс заагковас свазссяаа такадатахв зба зеніт Ксх 7З8О ктнзоастте тата кк скстствааа затасктвоЗ зкЗеТтосИ Зк ттсЗУ ВО чат їаакат мкеоставях зїЗааатаєсх сситесттаВ зайсммтния тату БИ твсдамаєх зклжсвхсва дсаеасах лятосотода соте Е сттсовтаКЕ ВМО саталютай аиккквтсва дакккттака ХаЇстТЕек: олакскувво боааавекв аа за ткааи заставу зкахакхаке зом сахахецяке Зкрамаках КО вітаєсхайах кучеєхаасв кідайазхах всзтсзаєв ававсівцеє заасцаєсках Не закайахяни сассзтофо: хасхидоваа збаемтах внпцаВеаКеК КАХ КСя НН такт ки пазизаатта акустики сВ всакакамах сстасттатова заазиктває ВА чаанканіХ салвасавта схсвустиае зааааалаля сововааате скани Во сагажнв со адссаахсст авсезихвІв ЗІЗ МкіЗа КехоВетттО акакаааляа ЗІ запаси цес длосствнтс ЗИ аККЕ ХВНЕВТЇТса вима Х Б зацкхазицї ква ви сепунвинЕХя зеаанев носивоссва катки РОЮ зкакзаккх запах попхухоаото зпаахтакаки ястквстЕЗа ккстаадааа Мт зеаккокаац Веста ає ктскОлкв запаадамий Зехасозеее засадах Но свозатакай азйааккзеза зжчахкцав чеведазава касова сааакакит БЕ тазазазака соках гЗдаакайвна зазаофозта зате ккичє Ботааасаа ка зате талазивЕ саке ктосВтоаа скан состоцНІв жкк саазактї» фіастакхих кЗоавтех мтссяваняя згадав сесвоВсоВЯ и свт созтккааккЕ севинивсся звВазасатає акасакансв гтссвесво КА сХстсЕсККЕ ФЕТА акИ БУТ Т тазаасясик сехаткаксс свжесстгаве іо зсстваусаює щссккжаках звІстсвтоЯ ЗеаесясЕХ бсаанаесвко сзозстасеа па стос сіЗО зоскавкаку рон обкоседевх спіккозяа ЗОгоссстВах ЗМ двсттмеєх зам нсооа весвсстстс вас сасхчесесї СМС Тодах За сс зістеуєева среащетс садком сих яе ект ова хо тн сзв3а вссосвас воссясоваа мастик пстасесжк сєасовке Зако сховав гадтазктає срок стопах кх хоссвсвоох асо дкца. зу шщвтхсозІво засеаєснся дезхоеще бесятстахтк каанавосва даадкакака що савсвтттся тоацеККККК Тест БИК ТЄ ЕКЕКЖСТСВО МЗиЛилНКх ЗБ ксххстстїта геаеавиКХ свовстЗаЄ самарнсну ся стсВї мив окахка ЧУ хкхихссятсс ттхакакств зсвасассв кахасзаксх своввесдах песежикука ЧУВ склу сс тапок ся стссвВее: Зккахазкта содвасаах вхакаксаке Знає ахоачЕїстов зсалліоус задатетссз автштсссзв здосіааєки зов ЗО вісь скохнотаск стека таня Ктжсттцатв сво каю «СКТОУЄ За зіспосаваак зоЗаесстео зазоехаа зсносзса коаатекоця точок 15302 спажсатвакх козам спопаккиксх зтсоазеаава зкаснсве себтвослаа Ме замстасккх хсплцкаїса дамниоках вЗавазаєсо зкокескзва сама мая двавжєсдацк свт аа сааоонхсся воааеааєс спіоцісніца аву МН заюооцани весттзтааа сцооаснаяс взаазтвацяа зсвосвяоза сексвацаве зов аа втобвеказк аасссттсїт аскоаавака засто Яке каОкУ Зо аваскучиза засетацава сзссомнниа зміс ЗСВЯсогка ХВИсЯНИухЙ мВ айшипанищк ссотославкх дехоовева Задиухонав зовозатаця хапчвНкхе МО сжкасикаисв гостсаанях саціЗаса ЗЕНИХІСЖТКХ сто Е сені МИ апваасзазв зссатактяхх саке плани СВІ сВосахоноя.
ЦБ зааккксква стціаацхасні паза ааєс зацацичо заааоссаке снасЯцтвХх МБ ціхавсссві собача їхво ааесаоа ахашовкве Беата фр есовщрХ ІПеБИ кисневі ссо зазсануния гзаааааєах Зх рвУунриє сзазсаоів вествноуаа.
МО кхіквксваЗо заз нивВи З аа а зссавсосва Фоми аапа аоатницесню МВ закакстстс вссвсотани возіновсїї сапоавачак скоса пОХДКХтаЦИ иа затацисцксв подозїатик кави заставка скозззаск МНН Н МО шудасавса зІсстммнх чок зов тоасааєуххх «спасає ваду МЕН заіааателс совок сами саЗя сазсоуфутаакх кказасвтоо аа ЗО зЗізааниа «сокнвт шмат х ОТ пмазсжхняке базах зе хо іаЄ састсккка адохакувоз зго та затв; косе Іа чЯвзахсвоО санки сахатавево зозстозааа віза зазтусівас мам тестова сізеЗсовОуд ОККО ста езев: заїавкаккс зедсевас га вопссвасвся кхаїчсвивах сххвактазсо тав їа сатани нижнє еве ЗК тазу Етішос затоасааох зхахакееца аттавовкак кацелиєске гг кктав Що
ТВА ТІНЕЕ СТАТОК саскххцее ЗгбеЗжаеке аеакокства водсзаа За) зЗввутозатй чмеєааал актававсоа соозбатрак схакатаеко своозсаах 45 хвасстовя сажа сахтстстся зосатасооа саазозевия гвасаваке 11553 десвовасвВе ааезаасвай апокасвиха зсзадастаа «ладан аа іо смастсвся гтсФозаакак сактахсста ато СаЕлккККиЕ ОСТІ їїмК кеш авозсс гтоодоаккаа козацтва опа цатав сайнхкетеа мтОватя ІТКО чес стЗо свт саЗав сктессцсс псом аєса конс ксся ВКадукето МАЕ азасзвсокст ссвсзсгаак пас КтхЗво сток таКЕсствоає вкОкаакаМ: МІЖЩо тащс кВ свасстодаох зісчезсВсо збаастваах асо азза задатки МЕЧ зо за засїспоаЗх сов ек цастхиоаих света серця а МВ
ТІ ащах тевавкчуця васстткаца зЗпхтвидсеЕ сожтогамук саВуЦесеву ІЗХОБ3 зкгпаатаєтт сстадвциза ов аукк зссЕстнеї зжтощайткв ззцецск Жах тжЕжЕк сла сОухвкксвае сзатссаках псвазщсвов зоавзсвуукай сіток ї2о ттатактодакх запхннхзЗу сттассахся стае ва сабскгахЕК стека ла зак кесда пахоеснЕЗє дана с стор ав сазана й АК ММ ОВ 2 зма сехоцесже атайлкахса оса всо ссадктсоосв осо кох МН зесосаваєи: зЕксЗааса сааоксвив зссегазки акаасессве пфокаххваух Аа задаєсстави пезвзозове ахккликоов осттсавзах тка тсв освайккнях ІА цассзанаке сзесвсатза спвакесся Бааоспадх аалкованє заяв МАЄ хакскиртеі Зо ЇИВок ххкакаксва Ветссоурсай ктахшЕВеОВ дОсаоцске ЗА песатаккаєс занївтогка апбоазиссе абетка сковквкияі забвацнЯкх МЕ кит хукО товтжжесвк ЗиКЕКсхосї Мрій сесВіВЕВс асахицТНИ 1УМ
Зк лусак Зоо иКх песик стах всех ХК нКсесВ ЗИ ісУ тест катсв пЗсссстЗОО хвісаЗсВо бсгадакКоЮ ХеусОЧЕсВ КІВИКсХВ іх тастисткає сЗихчодеЗ зок ЗиУїе топових сохошкасе пак ТЕО зам а сиве тЗа спосахкаве саатееаех сикцккхсюа ЗЕВБОКЕКОВХ За ззазаасзай кпахкацякї зоаасвая вссзозшева пуапаєчнях смак їкКа тослдозаза тасгахсксх сазовадкуаа хшкажКксКх сіаасвихВ ХВО АЗОВ нЕхавазвив саажкхкаакх СТІК акасаКнеКх стзатаасви зоХЕКаая ХВ
ТТЕТаККаКХ хвеЗєсвВава стае кхетяХ зЕКЕККссто тааахадакх куту ТЯ маєм сілїнатсаа зкааккантя сіхнастава зх ккаю скиЗстоаво ЕН завіталков сславнатаса сіапкактих садсхозаїа Захткакайх захо севЕ вчаИ ми актажх зссяссасс пси ох Каса ТаАВ «Ек кквай ВЕК НВОВ КЕН пастка кевттексет тактасвІч сасвааатуа аакссакака косе и 1535 пвіхаваака зсосзааає Кс стс сабттсжвак ЗеЯцодакти ВООЗ ІЗ казжсккв сзгззазасак кекси коЗее созссобаЗай свусвтовст ЗО їЗУО ксатеклява звіасссакх хека гтЗсвакав сзвоевавсяв савакааках 35 каєсаветний стЗсВВека кенхвосвВта ссзестацко сестваосв Ззакодоаех 1355 сЕКАстІуцЗ іс аєти Кох ВККОАЄ ТСТТЄ Ок ссВссВуВВа ДОЗ ОКОКХ 13790 чихазвсста МБ ассах соток Маси вес КУБИ ІЗ на тсста ПОВ ККтя КІТецеВКМ Мило аа Васко х КІВ ткснЕЗоза: аккатажнн зуссмммесх зайштаова тагсеаах скакЗккове зе
ХКЕКТвМУк пклкхОацуВ ЗосТаЕтОхх ЗкхдаІЗНЗа сабассвка акжккВКх Мч ва цета арк ВТеВОМитяу ткотНасксВ СЕС: ХСН що задастоває сунтссттоз зсстоєтихо зротсхтоваа смхасахцют статис цОх МЦюЮ заМацакикх ксссттстаК самка ХУСТ Кс СИЯ ССЗ ІЗ смратяаха стаассвавр КОКЕКкНтет БаетОсМк сизкканкКЕ ВаСТоТОХ аАлО лах саЗи зітоЗазеза ацявусІвка СК тес цка Тала таке капсасстсс зозстааква каставІвВаЗ замках заааостка КОВЕЛЯ 1340 задасюениЗс стату кцюрсвсст зрос стсовосажек каш й т18300 ската скакукасак стос ЕКОКкККЖКО зсвтсвсвца ЯКЕ МВ тов ТУЯ ау авес КЗКштстаац Кто ЗесТоТТВаК пек ККІя ме ЯНИ сжескдааВє КиАппсІсКО стае вкищКккХме СТОК КдлІсАЖХАХ МАО пкхсауста ско ах сага а хаНсхО ЗаеМева покоях 145 кхохЕстТеа МемлссвоВЗ сессозаВак ЗИ морраестоа пакетах 10 зекхпіатца сізаазяхях хядкте ик азни жсвао стоааасітс Кота 15756 зап вссве пл ющеких стежу доапкєнаєх зссааавтЗа да КОВеКко ічяхО куизжізоа їзодссвтр зжсктасех змоги стеттцтЇза засидацекх ізо зЗайуктвива зазна ха савшквемає ссфаєтаких закствавесї мікс касе за птсацисневВ суб их спуннезаВа сстзаавока веВставОся зма іже зних ззазтаакаа сок анивсВ сазтцїзЗаЕаа кайхнвоу зазоссасгаа КОВО заавенати позов Зааатася зідвосевах аоссоомочх стае НЕж тзхсцтамм ссвисиваке атака сота ФфІИЛЛЯЛВ пивсснецай МЕ тлттазаккт сасаваааа їМомессаатко зазцааєваєс атшпжахніш сама ЗИ тата жехока сесвидтста мок тнної Зах ааадеа спагеданся За аах ЗК таматии знуєхстааа амозасився здає сеакустссв звуках 5353 агааашкаки схахсеакас пафмакхвтй схттаава пишетоЯсссв заажевесаУ 542 теля гесствІїаа сіасанНося ТОК ННЯ Осоя Тебе з155КИ
ЗавнесиЄ Зовстоав асист дзазааккиЗ ззксзавем Зеадаеєні Ма хакктекссет срок аах сзаїсстзса статохавк свтктссввк зккктаКх НИ кинкхзкоа стсзЗйски СКК СВМХ коудахвзи зі пеавеоєа МБО зоансзааз тзатссавих квавусами Задуєеавие зак заахохВеВЕ їЇТетО тирса сзавзактавї ваза ЗсатнхсяеА слоссаспосв стат аах ЇЗУ5О вссататана зага тох вісти ахлатвстяс Збатваацеся пвааовасее і15555 зсотзлазєх «асани ацї газеаккки зассссвет сткацЕккос зстататада ЗА сесзаткаткх кхаакоссвс савасккасс зсвовастса кайккканеє Фововоккка їв заозаєкайх саксассваа фааькккасвя сватізесаа гадсвасявя сзасзааєва КН «аїтасвакх вкахккзсва Теассакяси везе скассясуве Тара ТЕОКИ сстзацчнаса Запис тє фааскнсвсх дес ааво КЕсслНаВаВ пух Ває 183 зсгадсніяа зсатдстоМм МаККССтОВК Бас АККА надвоВосеВ куда аКК МБО хухеахаат етвсзазавд аашасеВ сети кКкХ Вход кари хВЕх ІБ хапхякВице ттассдокци вівкоттяасх пазавонусс тт сежсаеесх Хо хасасктста асвосатевх сааВімаєх схстаярссх вбЕеакаскха соте ІБІВО стетттвааа пердазтсхя сам свтчеУсУто пасахлайиє Кетстотоах нен твсооваткв сраасцаутт сзбкадака зссстбеВеж сккаклктих Зафтосткає З ттсзоастоВа зохаткссся бодааашесвс свівщвюста сСбуркасве зассзаацах 1
Зі кикккв тки хссВс сададавони сс ааоМ Сенда аеЖе сТТевакає М сісастоавх алое ца фЕСКККаКЕХ Завести. лепляктесх пррксзасях ЗОВ сттозЗаззах опти соткхснЕЕ зас асама цаснНостеа СКСТДАМИЛ. ПЕР сс коЗа затваиисов спека цкте веж жкє Мвкукцацев зацеась ЗЕ сІстаЕажкх хто ВОВЕОВааКХ СТИХ САД МК ІЕЕ твсазиадаах соЗавцасв сок весаЗКаці Мозкова СЗЗ ЩО пзссовстадк Мол ксвх сасакккеК савсвсвсото афсекаєтах оостезТае ТО нписзстоаое аавенкисх состаавови всхстВ стажедахаю зненросоца жтоаа стсихІцаає сісвокх сеВтаВкаНє випа аНото ЗфофОсТкка совстВоуЕ ща ккд ВЕкс сзісвасай соска сВ ЧомкстНицо старо аоаа захи ОКИ КТ задвсастжсв охота конзавсава Мюаазксає кскцОтє ВКтезОНтяХ ЩУшХа кхдесявізса зіпасояхна казки сбсасвкисс зсвзсвтсза кайккасени Кен етос стдапалока ВуцеЗнВ даткЗакивх ззввтсавах дазуакнккЗ ун ствачцита аспазоцвса вхззїіватаа зада са васусаЕекх задтхацкУХ ТБ звсвостита акааацизня зоазозаваи мезанааа воавазаам зано ЕМ завоазащеса атбаазсатх ВІЧЕ спо КхК зазатааава лнвосЗиЯКВ ХЕБИЮ стсЗтаукх ккхаксаВх сВттсо зЗлссувІОЗ Базаацісся ЗВО 175505 «раси актакансев звсоссокова схозосвас загс сто ІТК різ зако аккахниЗсв зтбовоЗавк ЗаЗкЗсвеВЕ сао звасогоса МТУ аесвщссяоя клацехазуз сатссацсав «азаЗвовас засацва сущим НКУ тхамаат стайвсва: чні кет онвКас зав оомах сера ТА тазпасгацс ссхвяюозея псзосаЯкях ВІВ КОВІЕВ сгацкоокоя ОВТ ВІКО тата сасувствоЗ сікяадзах побзізасаа зачукаїиї зація пи ссптаакаав зназазозаа Зак зтпстатата маси аа ла ЗВО аайтканако звзавосзсат Зк Згтстамс вакхавняВж ссклахкаха ІВОБО тккзНссІвВ сіЇво ОЗ хахіаневв ззсзаайткмУ жимсизвоса саахакннах 18323 акахввестї татататакц кктхксаазас стуткаканя зЕжЕтстета данних ВКсХ КО -звавтВетт са кис хозсвеотаа варки ха яаевезавах Зх ттЕ їй «квхтвасттї ааатадткев тторхвсоее аскккстхву сазаеаттах кизавеОсЕ ік сайхстсст ие каАх зІссвізкох саадасстат сзаааскокЕ ЗЕЗТаВс ТАКО тхсвзатет запали бсоатзаккх апдивехцжай зоаасатахи ЗТ таВа Ва тахсзхаїто зхткккахас бтаятталка звіт ацла асзекавань тота Іва скопазеааїта зЗіІкаавсозо бвазаїааах зваІвтсам) Ммилактана заааеМмлах 15543 ївтізхваяха МухЕлвІнех БациаУуМх зеівваааааа їхати ьсв ставеатата ЗБОЮ твжжІтаса пспзанваттї дагадазках зветаааака авнилепхот азсаваадада ІБ зазссаваат акаскдявах сссоубсаан ссозассааї сбаааєкне зеапехнакх зву жає кЕцаєвтява «свааєкаак кооаутссах босаєксокв зтоараата зї57БО стттзакаккЕ козавзенее збтаавткаа сховає абзац теттасваа 1554 хпзатстазак спи асачст засакдаа сеснааааса Зетевацака зга і цеватттагх МОМ иствиа заааатехх азот ат аамжеих здо їдаво щивр вза мігасацсай з сзааата палачвасса сзаазаїаами ЗВО Ого пахвова даасааатах ксткззазаа акасоханоЗ встав ВВВоаВВеєО ічОо5о акакасткет согтсктала каносвтссс стсхааацни сОЦоВЦЕЕВК СКК КоКНХо МЕН тайкиххае «стссствкО кінсевнивт сттоцЗаккак квт КЕ КОНа МН затщусскяа свозстаата пасе я се вема Кехасонцва ЗаскаєеКх зош ака ма зованих стос та сткавктсст ач отав авагахмнях ТІВ зіЗкзатпсу катавансозе зотзсттава сВаскЕВацрО ЗОМ Ви пасе іч здзкезоааох золахивнм) зтсозтоасах авставовас Зааттоваа босу стхн ча тетоваамк акккодчнає ЗзтЕтмутта аазаквамюм сзахехкоааа сени ояиВа. ізн слтттазаха акладтнесе ЗВіїаспихх зіва зага подат х За тотсЗаІва Часта взаа екс хана зхЕсиаККсї застахотак заооссвояа їзЗща зтазтатакк стнчастаЕе аг смияно ХааисуТосх сппактакктх зскозацета ї363О спзозакацах сгезсаввІвза асаакксис зиезаВаАЄаЄК Зак ка хата аю
Фиммиштамех сеисвовте тазозакнов свтхсостка аактктннко сват. 13505 «зіва хаЗ сакахстсзЗза згалхаакЗкз Зсвттааана садах Ко га ЗБЕ зрхкнхкв позу вазей варти ве ЗевоЗеекхИа кЕкхзацІЗОо звазскоааа зва звик нляххтатов акктяихЗки СЗТ «ак ВсКа ТТКеПКкахХ 185 зЗзамранике сажа встик тхЕВх Квзсааивх Все касаї падках ще акаєсасвхце стзаатаеак Зстттосваа зовтааєЗця совозааваа дае сяциє м заахасвтст сабацскткх кссвтеаем сссоЗасасзВ зсзозосааа КЕсхЦея ТО хкжккссцІї гїзсзакайк сзссзвозає засладксвас заасааєакх акинккНеВЕ Ого ктасаВтас самосслАнх сурсвовсса КОсНескткКх Запаси ОВ ЗИЕКтХ Лов стсттащатмх: мескотсвсє зофтазак сахехоства вста х деку ха сетстаскВх МиХІщсхоВЕ сттаавакик хковосстка ммеектахх зстаесеков Безе зоавстацати покказаасе дао пзІвсзасук паска застосу вес зіосдзгакоОк овес ссівс акокхІвсєв воза кох санках зам аЗа Мо ззазакктка свт ссання сее сузааамсх сВцацсхее см що ста ацчих сваоааате оацссхоВой Вже скаХ ЗсттоВОВе есе ек зз3ацанхав всстсолЗаВО созКечиХшсе оладки ке твтсовсссВя Дема Как ОВ
Зісттаав псттсттаєь апххюсосте года с соттВтвтвое дека ОТО клаїовкоде твесчетаа пасоахетс Фсжтсовачс Зотова будка ТОКІО вази всвсваслоь скоєне стБумаках зазтвавенва смаки ОБО тав; ветсрх кетасоньКа два цЗакака звассовозта сахаакалях КО дуитатоахиає спстслозаа змхлдслсо воатоВаххх совсвссвеж сосках ци «ЕЕ оха писсосхукоа садпахантя чвестаавоЗ згтсуствця щелоєа НУО зва кошик тс пами та скхсеаааск скхпехкєаи чеБітеца рИЗН хпшосцетех сах хиЗв свзощтйакика зона аа стасзацоаа чес тода ЕКЗ кЗстсоттке маски Ех зразок саксвВаскх Бустассаа Хассе ща поВЕкоКІєВ стани все ааа застава хсос АСК шМКХВСВССЄ ТУ зкжжхстстве гтстсакавк свостоссто ММ лосвакх хбаконаако сао 33
Хенистяеце тобедатках псесостова сецатсоотки хкбкцивсас аітааеодх 2342 хЕвІцМишава ссртаактвК свестта. вставте сескоихнка сожккааккка ЛЗ песвасстїза ги салов ззястоутих смеаския чання спсдаєтака 1545 зоусвеве ткАстаєцвк зсутФозазо саєкккоза свасстоває заазКтмя ЗЕ зосвстаста с кавсцна звущстохца атака зтозетазих зак споаце ЗЗ8О тсозассоуи гзоуацєснацюе тато Коразакзахв зоре ака ТУ зеззеаааа зазайсснсв зву: запооаєзи зааЗВТотех зако З3ЗЩИ тхвоссаао пеекаасткт пост Бксвахайвх сЗТуЗЗЕКх хоч МІ чне х хазахкакав зеЕкашних пкатананів вес пцанцавкай щи с«вЕжссатах скаскахза зак к асссялитее асо аа иВаое ЗІЗ зтсвседаак афікси стзсесетха аапцсхтсва забоаасаах внюввеЗця КУ девасаттск залоахкссв звсзалаках зкхвестатз стаакаєтак зктзетаате ХЛ ставок Зцпатевсиа їосплоЗавхв зхккотнхта зстзсваанкх ХВО Кене «асалавии зусчЗсмаВ свлуливсяв саозетовва оса х Зоя за теща зс засезсошах сесихноаває са тса за цядуне стааесадаає лоза ккоккЗкВаУВ звстацсааа саке вс возах поЗнсксВвЕ Забазцалой шЕЗІ заатикккї самота часов састекха «жсквававт аисалацаха зх ЗО спацдтстсозова зассзааво зсазстцада смлеаася звопаєвата косозааясє Я тпстиоавже ссабтєкка дстзесвокк асткаєтт злаозеацев ення ЗО сзсчетсста садках светосоата аовалазчс сатсогтома чес схо ЗИ св свота всгсаданах Зувссескак кмакоачиве свіча пниенвк за кЕксВаВсоВе ВЕС сваваФахх Че каї стсоВопокк ХВО ЗЕБНИ зсзсвсазво пбаскахкої бсрсзаапасєс єкжссхсївї збазадааах сспЕТКВКЕ ТЕТ хочзззааас зем аиї зааттааалта стоп сесхаа ЗацОсаісх зе аїхА ВЕУ цискшщретво Ммиласкцих збацетось скхахнахих сусааасеває тися хеаЗця. З285а. кткскассої вадгменця ВЕжоЗопьк пнастсктсв зада ВЕ а Зав зизчастсса зЗаказатнс СЛ крізь таза петосЕошна. ЗІЗВО ткцскІвсВс опа єсккои ЗВО аваа запакктасца тКООВСТВМ НИКІВ Іо кикасаїЕтсо зсмавасах сзоаааетку засхходакс сзосстттзс абхсаскКЕх щЮ ккааитстхї рев сав шезеесаЗа сек КЕ ЗЕсоца ЕКО хадки жЗІБИ атпееикстВт свозеттсах ваЗщстсттО оагтасаєтих тачнЗааист сбхадацо ВЕУ сим ласив дово та мекзхчаТо сода скхазаяее ема 2325 сережок хацвсктшк зЗовпсвахха сссваЗкета зага ЗЕ САЖІ
«акккоусвя сваяаясттсх ааЗактсня тсстцстОсс поса тонке аКсхх 22900 зізахкккиво стовзстасо мазокакх заозаттаас аміак товсцЕЕКЕ ВНУ зам неви ЗсІстта3а ттазавиткс дезажтатає акккаахаєи созтвуах й сахазситза сосЗсваасх адбатайакх зтсосоєаео вес ка тота 2358 зеасхячкав васвововка зааккакосє встасикаай адакекссєс звтогатх Мен заачікнесї заказ тсВак тетдххтасле сасаакакак сехосснссв Ффосавесадх з3лю аветсссм ссзщсааскА пцкаканяя саспакпва ХхаснузсаЗс сеавсацее ЕК іме й «кім мя «ее ДНК «Я жжучхна послідвиніст» «ай щх й :
Еш ДОБКОВКІЗАВОВЕС соваа ІА. нуклЕОтТидНа послідовність хай 8 хКК Кі зЗасахакахи кзсвза не слину звесзтвка СЕК Бо пВуатсах кахетннихв вашЦеМУММи ЩетсттВаЦх біассецики вУдтВІсста 42а тсааамаєка зкапсстних стозавцоза зЗвазсзеаа епос ка часте 18 тод Зоивоеою соска ботзатеаик ехакккачьо сват о тззакасккХ схе свЗаї адакаатавх сватаатєкха стацханеза теаЕтова ке Б тзтансахАє СЕКТ пахкхваноз аТсвкаках ХтІнватаВа сах тв зажим сно загигтагеа хахсноваок аБшнккнасо сдесВтаовк ккаклкцКих ЕВ тактовно тогоззазак аекастаета сакаканова сзвсвзвісєак хакнаккни з кача сором такк зВсзКжшеВеВЕ ссктожесх зов ооу ЗууСОСКеОя ща ахжстсатса стіадаавхо сут са Кдтнсізиаа ЗІосцааа пОсВХцяцВХ БАЗ зЗацхсзссах деасаллиса застава созтваястї зоатаадех язаазновах Ва заз ка сасховесюм зовано спваФавсоу Завсакмє зусхУдах ХВ
Зуквесжст сппдінонинкІ ТТ КВОТ МКС засос ЇВ тивжаазаака жала снк зва асах ЗсвсссваВа бмаєаниЗ зсвФеоазазт БТ зашсвтєвсх мит оцався зав хсзтсгаста Захкекасу везузтсссї пов питодеасає смачних сосок КоВсВТЕВеК споцавОлес нсОоЗеЗващО ска такхксаідва своптазате себе прав жося ато ВОосВТехоцО їпхо «схивосзос сстохааохия СКК сВОа ННІ ак Зетозкцукав ЗпсукцхНся ТОовп схзайпсетзво зсзсзкахая ззеаваа савхязчаа сага зпБисВ соя ХА запесттуло сзвозатоца тссхиксссї Ксалавихкок зорове ВКХлХОХВИЙй МО сааахссноа тсссвевата цефен зво суаеацаце сознаахзвох пика МБО зібскасваз ворзвцаксс мазка свио зафенлаЗа сксааЗхеео сама ІК часах апацазазїа зказсавики савовосажсх затаденоса свт ї383 зккахацк клю хВазказнвсх сова сумку ТаО МОХ НО зтумаасхцаці еко кока вустВуЗІах атаках зсватозааах їм пазли ця зБізассооа Чопа; свовтозважх ссавців тзозатотає ІБ зкпускцних сЕЕуЯОіМі захвхуктК ЗщОстаатетя сассхочеяя соопссагада ІБлУ ччусствяцця чвацеЗізора чзассктЕЗіс Заетовзахк коника Басов ТВО зацахяяХхс сятоватесв ско схнсЕ зпоавтдааа МоЯтЯсоВтО ДНОМ Не
ЗКккастсВІ тТІВсТКкК КЗЗХоЯВсВЕ КК КВ фнКва Мих їЖоО зКххвстЗхВ ЗзЗостекКак зостттЕеКВ Каскукаоих хвоста пак ТО тиктсЗстоз зізаазахое ззааесте м) закккхакаст зстззатка казок кАча ЗВ2о тоахзстаоЗ ззвезкакає «сТТКосВЕ Кайопжнхаци ЗЕТІЗСсЕВх хактаннясх 1853 акхазізсва ззззакаках звсаїесзаа Казазакцвя свіавааасх ххананяє ща здивствоЗ: їізавокв заЗасевме посаснісвяа Бета сала За тазвсзащеса каадеессвяс зайцітавсв сесствзЗаиа застане тссзодаай ха тата сатзацссся агаааакмах совссзвзвах зазайдакоє ссазевазцє ЗХ їааакадайх кхалазазаа сих стссвтсвее сбхкаховає зтзаааєь Ева зкзкакаайа каацксвозк авахихиКкЕ став скксосянех Тогласамєа зї5а сл КВЕХ Ячиктовава стен тОї екю скчоВатоак аХКОВКНОКА ЗОЗ за:кспхааа застнлтава ЗКоввсяВес аа ВИК УКНЕЕ суиккавця ню ккхсссовоаВ Ффоттвскави зованоассоз Ккаєслацааа КЕхвстаокма аайжайахс Ка спи ттнОе стсвакнх ЗсОссвав кайснсникх ЗВО ма сттсваатОВ 3553 зисоїзЗсоз збеткакснЗ сзазоомоа захво ах саааааааки стае ЗА тахЕснветт їззазакісо зма засто сасяа За А хосЗстатаї в зкнЕзІзкО скани словами Хтсхрврвев стЗоаакикх хватстзеае зУва зІжсв о есакастасс валове х соватоєват аокковахКх сссзза БЕЖ забої тсої Фтакакттох аказааамих стстовмсеа збакакакао везе БИ зіхжзІакат агзїкаІвеа гсатогвемт сХВВоебТоЗаа заахаакаки свсзтвтата ЗМІ зезеЗІІ їстажсявст ката ла содветозест Фсааааахає саствозоа Зк зкцизазиЇа їзавскнихЗ сіЗазаат стсвовтоее задати сявзасЗЗЕ зов сстттсвЗЗЇ таза хнав Заст БаМай Хийстзниуа зїаатакахи вустсазсев ЕКе тези ЗЗ зсасатайкя зве сбслнн КІВІ духкяцетя ЗІ закктносвтв зоб ст сваїсватаа ахаатвакки зкБаТТТаВХ дахи е ЕК зккзвасття тивжамантт сттттааїся симнецдант суха хааакконкя КН апашкхххня звивин ово сщствтсВІа беасааоюио захват мхахавккхх ХО зсакухакки суикавоето тузахоакай света тазайсхасв акавжхвоса зна сах екс бета кие ВестеРКК МНК КК сисвтовеЗа НО содсскцкою сксксвеся отак Ксааестех паккеаста пов у ЗНУ сесаккктах сзаБекїсоз даззакацкс стссзафай сухавкайуа насоса ЗО
ЗАНККННОЕК «КН КСТЕ врнцааацяв зсазафесвкк сходах аКККо Зуцстосу З амкдічся сасссзОоза сао Веста захопив сессзтзак ЗК сачсхсвВкоє здкхссстада аа нихаА тесвасЗаках ЗитссвсВас ЗВ саКЕ ККЗ капозаасе сстезесаоа пОдсалевст За В тв розо за За
ЧецизозооЕ зсзтотааах паесоснаетк ссзааонея зссвсезата адсааєслее щю канузаїатс созоусоаз ска свавса збпекКксв сзвсстовала сасцаценес заа кахоззаест сттоохацнтє сехстстоМу адкасккукс своззбоохо закехазвоє нм «вдааамнс» осзсдацааи ссонаваовЄ зсацоазозя завіса ска сеВ ща ссссвамнмлє кзпакаахе сова КхнтсевовВа сах ЗаапвааОсе жо зсвасвнав па ксово зкссатамов осот МІН рес з тилом а меми тссв савстеася зррзозва сбсспаакхх чснвутсвеа БУЗее чЧестовазкх схткакссвс зІзсвсазах Корм озава актів їцяКе весотох ЕХ змиакисах сакакстнос їсспаазазв Зезссоутаєв ссвквдавоє зала Бео тами всвтоваацє чилесонах осбааанкая сввозвосто завааакика аа такзссясят фрисовіаоа ззкссозво заккеакоте встсазосіх ак ае чНюЮ скацодзаве сітосвокак звоаусвісс Ккавахккаа зсстетмаах скказк Ку 550 килззавофся ззоассстази саккстссза зскххувуяа еле апа ЗО пааззсстсво ззосвслях носка іва ЗсолосвіЗ ауаацаккає пввссвста ЗБ сззіщева заз анк всій зсвесстсва птсжкалкка ссхвоатсту А зизатацеза ссаастснуу возів Зотова ссакасннс заромридка ЗУ ета созпацссІс зфеааатває хтвзовсстЗо аааочков сствадвма ЗВО пвтсілак самим скхов яоааеасака сопдссшевух кехКкЕКЕе ото ОКО ЧЕ зктоваах ризи тедосгакх снвтвтЗеЗак атайкайнса зсовузасах яко зіва заїсцойзво сстамоатах птовозттса ката) звтствеех Бе чесати запо зтототааю кезвоетеас скоукааєз ссвовааове Зк пуніздевад зм зачнс сет стрвссее певмахавтех сасухщааа МНК ажканстссвВі дааїсткахо с естама зов гуаоВта ех ке хеККсВестЕ зей Ховесв сбсІшкхжа бзааЗаакк акаттеаКЕ ЗАВИ тасквтзоаво сеттсатакх КЕсКЕКІТас сепнрнккк зе атак захоутатяя. ща зкгахизат) валах зЗдаа амктсхеаваях бешхахссх зеБІЗсаїаа паска М запонки сахвія: їзтсатЕїяа зам зааят: КоскткККнє ВОЗ зав аататазах захвІятадє азтсалатяя яви товават запаактккс зваЗавевоВ ЗАКО асхацикка зхзузжаай звоачкизеа свісааоа Мекка ЗВ оЗа У сайти зсессявекай фітацевсок стазатааає кадвдячккє «дата. За часааихсвї звасетаака азикаттох кезхаазааааа звавсоссеа веаазевая ЗРО вказацкски звизиаветЕ еккааексте савстесккх касоааезек заазаєтата З касвавнсляЗ зссзоасааа хх сТа бусскакек сссхвестек хасаккаких ЕЕ. ккжтхахсо стзачкукхх хасхтщевсеє МЕЖКССуХХ саБхцяжакх дата хахех ЗЕБО хкшінайайх сВажВОИХх пасаассЗаа Фсакоцеах неза спинацакЕХ ща хлоп ЄтстаоваАца пакет еаМ бодовнакех Вста ааха ХЕнНКХаАХИя ща
ЗХ ЕТЕс КІЗ сслядЕєгах катавекиха озцаамнх севахЯВниВ ОБ сдезтозафо статева зтотстацх аецреонсова зааайаккиска сусовавтях віха ксазотттаа зааксуасс ззсумкмах «масива гтсозцахкх схе а иа свІзамКїї хасаахнккт Ват ЕХ Керн пад хкня еТВеВЕВІ КА кни: амнаксває соток тя беціааевех зІпаскееОї сзаааата ЗО хагтсопіБиа ках та здзавмкетт товосасиа сасвсвсаса захататаха 535 татвіазака зіасвезеа закккктя зстозааааа саахвихЗжаж збакакацу Баш хатки к дасвзссата сахвкка їтоавовока заз астах стачаокаатя 3 заалахахай космос хя ааахтажстс зада каня века Вахижиххсх ща кткАнахуЕХ зоскававях ссхцсявкаа сиза везгасааке КОВО ВИКО аввананися сзтвамнеах спмреосОк Кука Ка стаоаомкаве ке шНн ТО чесиовчсяс озсзскитсоа сствзстссай баках саяз патасацзику своя 2 вводостяЇї засто звсзазадовх зиск аа ЗасеКИсЕЄВ ОК сККО ТВО поснаствТс тогкакхксв сова: пихадазяза Яащкеоцся сс ЕО БВ ссвссветос озгаавцова зопзстаксцх слові МОпоевеа стоки БОЮ здат весс сеозсихасоя здвосавсох зцизаазава Загаксссва сезсаге о слзсазото Фета зсзасазох ни ясове абтСкоцтест зефесявова ло квтсзиЗЗаї зсадксксВу звовссааая зцсхиттуа ЗБЕ сВНо зва ТПдО диня Во стестхусвї сссоЗЕТКК нестаккКуї сабфковхсВ заодаоВоЕ ща заплава Фу какеї зсвзватоска хоахїукиях зазраввицо стаж яю адакцкстст формант ссссвзада модакоцеєа сосзедацця девхиноя 7250 зазацницас пусто сохсстсзва зоааовакх казати скхкканкна ТО сизашюах песзсасавт кужкаехатсх тсфаадає сттсстетах ахлаввазв ТУ тЕВЕКХКаКХ марне ЗКОкЦнНат сасоВесто Ххегсудвеаае МКАС ТО ТЯ спвісуса сомоскячеУ аКжоствева касок ссхссзТеа ска ЩЕ тата х асттсусяно вес таа зайвих ззатсода акавоикха Ба сота аастксчтвя пезвовеки Хрокеона ЗЕТаТсВеМх ДКЗ ТБ застав ассватучсхї зІВЗОсВаеМх сенс ЕуааВ стос кепка ТИ петедацеек єкт стя жала садцицяхах готова пока ТО татсоствак ккскавое єсаскдацкяи зсттомюсе зазаозамах собак 7500 кстесстках ЗКОЦУККВсВ застосо ЗастВЕоКу зеатака сопе тоє ТЯМ сстсавсми касах стісокко зассостзеа соц еиОа стсводФозаа ВІВ змичка сххзісахоа звонка ствстосстс зссувайакв ссостеесо ТЗ зви амк сазвізаеВе фотавозчаке розта ах кока сова НО завеаасят хасавосвкс ами аснкє ква см нквака Заст як такт кх птусзтЗаи моеагдацяч за анласм запзхцявиах стос ах ХІдо зазвоскин стстстатоє аббсканяст сел завстяст ММЛааЄ СУ ккхктомамаа сзастсваск коза лктва зсдакатеких азЗВссваВоє зстаквахиа БІБ зЗкихшетаяка схсодМакса захзкоцвеь сохоцатає стостаста ккхакоцих ща куцажасоет «лесі пссхХсЕеа си циКо свт апахихусо а сареттсст зи ккаси сеовтстекх козсоЗесонА. сстаасдаює осхНсХ Зав застава свс зок квахх зсвствссваа хевсксксся ФсТтОуМВх Как ВОхО заці стедястасх зако ома сс ас сом какою «кс та ВУ зсасссіаає аполесста задтуаанли това ааденсиове сет аков БЕ тчазазавца састттозоав слава гасом» ааксесовтв зготазстка яко стека нава то: асан засос біксвввсВх гтодсаатай 8УБО зале аа спккавабсс пускакееН: ства ва зкаковівЇа ЗЕВС ВЕдо затсасики поасвтстзат захкзахкиха тзасзкахоа хист тат пзаакацНхх яаЩо тттатвата зазкссмярка зміакакате сазкасвезЗа сазваинова зага ко зсаайкхавя асан ато песика ТоаксМакцх хастуашоє сао ще таж тай апсаастає салату адеасоаса уста стеосавадах БИ зісазаацата качестсзоа збассазау) Зстамупяза стххтсвлка ам аака КІ хсесдозааки ккхесщазЕХ ссайжуєкси ставок аскЕслксва ззаавсака що паззазааав зісбсвоств сазажоаклах сзіїосзата зай сЗтсЗїтса зе часа соуасвасоє гсспсзаавих Зозсесвсає пкакоацяза свтеатоцаа Же завосзадаєд пвмопавссве песттгааан сявотоааех затуєдатцнь своуєнма Б сасивІВе топфрстхнєс савазатавх ниновезсза телсадавоя ссадизоосе а акхциистт стсазсааай похнахатсо цайвсехКх КО МКАС Х ЧаВо зістамахх кспссваваа засавтазня вафраоа зоаєскасва зізсеаках З545 тзааахі звизцостат суккканват зсстстосия апаякаоксє сзаазакоюа ЗБОС свескаккка «ааооВосаЕ пекоцаниЗа дае Ех «звиссновес тесааавеаа ЯКО зтззаковах зічвсвтстх паста сахв зоазпатоахя сасиассКоВ скати ЗЕ с«аацалкхкх ссстзтазтаа пойацексВї іс УОюЯ осв МааяВхкакх ЗВО захсхктстс ївиааайсиа псЕстсттОа Затіактвяа сззааакаВах масово ЗА мило ство ЯЯ весна сеизеахяЯве бзаоасасаак паБеВя Кс Кк педетсеовт сгсзссомех сссзпевовк аБсенио зопссумюх косе есВя ЗО сно ста босодеєс зоззеоавкк ххазвакаВа Зоздсосоух ВТО ВООасї що звссзссо ска хе цезсвастах яка баки суцааова ню «хзЗЗсста коззвконва мевемщака рем поамитсвее МИЛІ МмиЗо сзвозазуа кегахкаєва сідатанних децисєв сестясясхтю ЗМК КИЄ МОЮ сон сех зассвкснва сзазаликся свісомакла зспсухасто саван МЕНЕ чина звоІсниата ами зозасаккай заасксосве сазкяонакх Ні ксвккаво схозавовсє касок скоа сопсоаоцих сесвсКосва мив МЕ какехякЕКо сгозаїакка скросааа тодом ето кеоВесчЕа Ву пен спас оЗакк ЗсевтсзоаЗа сакавквито пса пуветостов Б нінзсетзес Фасваакозо сідасодикх дККОКсТВ Басдоукатле ссцстесеа ЗОЗ хІсЗомнаос ак жКк Віа ких скол: зано супах 132 «вазсаїїва псадтанваяає зайця совет сЯссуцостх зсфащшквАа ТО ататаакки кстзстозат ха кавас втігаатаах сзвсовтатВа воКа ще Я тамлатзаз ахоазатееее ахоахкзава госсосааки зкзсзктЕВа засуха нє зааакаааах зівзсососа захтизувхв азітавоЗс сус скла Х це тадххкоахи кІсщсх сазвасеаес созоіаснї завІасцтюх План ВКЦЕХ ЦК зикаанккМк «ствавцсовсй пІтОщЕжтВе зсбозеаатяї ЗЕ аЄ паса ЦЕ зеважкжккс часкЗасаох скпукасваа згозссасх пзізоВса осевхениХ МИ ге МОоЯх
Фах З хом А сАа» ДНК й Й «Щі» ощучна песлідовність «Ех й й «ВИЯ» ходов'оптемілвиияа зідкОета Вакна зчитування дж висизесії звали
КішУуНЯ ло дасазудалк в воевимах «ех З захо вівса тає со тстоа сетааася Заооаеовтх кадеансВоЄ ва чЧассвзоаиу сессвазадх ссср Е зсеаасоЗаа везти кати кицах ХВ тЕсНККВтсВ БОцВеВЕККХ Козака ссттахцаце ство дах 35 ах сссх зстзеОхаке саазаатайс схсхцкас сома жияхкр хатка Ха свиззаасе ТЕасИлисЕ се Хасвлихста зракативх сваокеснся КУ тЕсеЗВЦеКе Бікаєвеста сої ксаасвя кетсторваа ссвоаакскщ Фото ЗО сзкдаумУв засатсввоцє мок твах свсОодаатсЗ соаахОВКее состав ЗЕ зссетмкасх ккхакстсай зу хЕвс стсвостада аокахесссв зодззаає БЕ сзізазиска схцоахвсвВї сассацазих зхзассесу кекси свазазацах АД зтгаздвацх стаєте сихедахвас стссбацх зстІстоВача ТВСТес о алаєкокиї асцит зактсвасвв «сітваавцах Завтсфевка села ВО адкастаєтн Зисластмка хоствтвеє сим звіфраска смс ТО апсксхссве сІстсОаомха ЗВеБаВТОсК Кттакаксх тестова КОН ННКЕ В:
Кжсвсссав Звассмхк квотстїУур касаананвх емо хо ЕК ККЕКЕ Б зекслвст: соаттсокикв свинина ааскаскиЗо соки х син ЕККККх ОВ «восвснска вжсстасхве яса с авноцосоавоЗ ЗаМАКЕКХ спот БО ем тота стае аеВо заапе сова стояти стасакссх ссатовеВе ДАО втспаваске збути сВ сезскакке кствЗоЗесе Сак кноВВ соствоВсеї МО зстстаоа статказзаа затоках засос пяхстаасЗа сааасака Мо заацє кутя ваВт Зкхснотст сс акаєсв ссавсмиЗа казкове ке тажкакаше Зкинсезтаа каасквсноа зЗіззвазєтя сввозаака ака ке хіМх «ваКк ЗЕ «КК» БТ яок «РІ3» аснапева Кізукагі «ВМ ОО мит йек Аз Уві рйгб ха) тт міу пиг аар ргоОо їУ5 АЖ бра БІ Заг ї Х М 15
ЗикожаК йчи ТНК овіз ій іш маї рей їж ха Аа Ук ар о твг ази а -х зо
Зі хни жді ВиБ пис МАї вто дар РМя ТНе ЯЗ уз ад ж1а вяю Ту
Ку С 55 аїй Зі веб віх фін бує Жук (РИ Ага аа Кая оАІВ ОТВЕ пак оуям о тТуг
Ощ І ща
ТУк УщІ Ме ага аз» ів ве сю» меж рем ТнКоїнкК ЗУ Тут сви ТАЄ
КЕ т5 ща віз муз хів Би ТУЄ рр ве раз Кія Заг оїугє ТВК о жег Ай Заг Щ1Е
Ж ЗЕ За ї12 рух Кл ОТКК РМ тур дів іже тує тик отут УдЬ цій віє бує зва
Ммю Те ХО
З отит ау Хі тга ові зв) АТа віз 51 ух (у ніх бів Ка вве зх Мо 125
Зег ар Тут Зі їЇ1з У5і йхмп абр вве тв! Бі Ттро їв реа ні дек 335 ЗУ їАо хе бен маяк маї бра Те БВа Бек Тер обу Ту бек ОНіЗ ТУ бук нія 185 іа 455 150
Ніж Куб БІ ЧИг о су мі МЕЖ їйк Агу аха Мешко оні ре Уаї га зів 355 ї7е Зк
ТР Кух іч ШІ Ре цу Куб Хег АР Аяа РКЯ Ве фіу дБлобяв А1Е
Іво ІК З
Зі ту Зв ІН дев бяє РІЗ; дю ди ТА ве бує Фів яв вес ув 135 У Ра вів ші май піу бік тега 128 Аа Зуб фев Ре маз ай Уві Те оту
КУ 2ТУ хо хів обто Ту річ Ахо» оці вка Бак тро ої ГТ дей ВІЗ ВВЕ ОТ ва 535 й З3 Ж 343 225 ТІВ ді а
Увг от орг фе Ва и бій бго Авр Аа Бк тує іа ВЕ Бяц ЗеК
Кк шо жи ах вн вію ків ви тп бів ЗРу їі маї яр Тек Бей о ТРО Туб бух а щу р
УЖ БМ; Ві ФТу Тгробжт Кл о БВе Хіб аАБА тТгр бе ха Ра Туг Ха 2Тх тв 755 ттв ул! жи ніз ТР дви Маф Бе о їія те вРБЕ о веу ій нія ТВР Але
КаЗ з кю
Бгто Ук омею ве) Мі Туг ай Аа Є1Я Бі) тгротве вв Ах УЗ му їду що хі КК діа АТа Він тТВге зле Зв ага мух ВПЕ О Бі Мня Хі БіУ бебі та 32 335 ЗК вне ніш ака (14 Щі у Гб ові ма) ів М3а Нік Тег уз ек Аге
ШУ 3 їщМ
Хе вто р: Чуг ави ліз де вм Ав хегобів 515 218 уз Був уд
КК КИ ЩБх
Ме пі суз Мі5 туго ага зигзаг АВ Бім ай МОЖ тт вує Хек о цец 370 ху 35
ТгроБук Зевс ва ак олег пув Бій Туг уд! зво ік Ав Ажа БіЖ ма! 555 що ха Ой
Ми мех Рйе Аг ахе хін бий Аза Су Фу Ма1 ФіТу АТХ АТа бів вув ване важ Я хо ЩА «КК Те хаіте ДНК ; «ЕМ ОМіЄВія вата «А Ії пхрисхавЗО гтасидвхвес оз мео атлсхІчица палає кая вес цВ КУ соахтстоова асчктясвтс тттсаавеао сапличцясов сіахоасас сттсоааах 125 зЗУттссзмрю ес своссатсаа захист акексасссс тваасаскУух ще твсовозаах «кестсатоЗа сбстатОАЕ слеЗеаЗа Зав еЯе ЗасвакеКих хо
Зстассекх асскоосї фїзескапаїх «сжсКТсвоик сілзисоВаех ссмацакке Бе цтцсїмНух сект вВоВЕь Мк хс КОТОВ Заехсщивах стопах тео зазааїзазе зом звіт свсс застава Фо асооа пакевккоца Зо хааахКкк зесвоткикОух ас Ксст тасжжКацсх дозаствсве КВІТИ чо тассахнаву стастоцака сахоассвва датами Е мама спхсосса 5 ааккклава зЗоазажаєка виххвусаВе СКМ КННХА ПТО паКЕОКЕКХ ЗО
ТАКЕ тВиЕЕ тре КХ чів асав СКК МЕТКИ сехтсІЗКЕ 5БО ккспстаста Загаасетев сестодеОт мачо секааокки севстмсу Кк кетацлсста МКмещНясВя даВооВстає зоцтаевтсо РІК тКТОоВКЕ тва сюхветассс басмсстах хІвсвссВе хахайуаетх ткоакккиа зостЗвсте ща висисвуЗЦх ккІшкхсккО ЗВшсствасх пак ІБК ЕЕКУХ Хассе Во ВЕ Ж пн зсвссоз амкжуксквх зсстсажтак здат сваа авхевакккк сах з чехлстаств стакезикві завчетсоЗа аїжксцова ккакктккка КВТ е Там чацаєстенто рлссвіиса ствочестсга апдаксссвж сетаєсакх казна ща зсжазатася тедацалацх свІцВовзоаЗ сасластове асассвата вас цо їх здізадекиЕ зааааси зацвхстн са кто азааесакца зач сяс РЕК звтшттспака звер ах соххнляціЗ взпсставно віта а кЯсечну «ве їх ха1ла щІ «ВЕЖ Біда
«й13» БІКНіВ орав «нн їх
Мат зак іух УаР твеочаї Заб іу дяб офі хів ви (іш бі ЗееотВе 1 5 30 М
Муз Тит Узі Аг Ага як хіх АЖ Уді жія Зек вве бук бій ій вух що 5 За
Те аа Зів дах УМГ оре «ТУ аб Укі ре фух маї га оз тує УЖ 3А я 45
Хв вух зо ХіБ бен Ав Вій Жів бго муж Ні Су ТукК із де бег
ЗВ 55 Я їви Уді бух бер мат зве Тут ха) хв! Ак3 до Хік мяї АЇД ХА Баг 7 ТУ хо «ра між аїа туго узі Ту ван їв отук їій вто ма; мезо Рто АБН Віз що ВЗ ях рве ря Агу ме Ата Аа тки Зв віх тує уді вве Заг Кія ат сих
КЕ Не о
Бе ту ре «Ту Кі ТР Хіш ви цію ній Бі су цім віз ет Аа
МІ що 325 не Звг ази ТЖК бі їбга ож! лай ана оїМг Уві бі ТкрочаАі Бе нія 3 35 ВЕУ зав ви Уа! вв ожаі Бгто туго РВе баг тт Буд РН бяб о н' Аа вух 135 ха 155 ї153
Мі ніх вух 814 ТНг щу міх Мет Тйг Аго др Ве УБі РИ Ма! вка
Зв З 17 туг Твг о аїта бі; біз ба ік віз ру із шій маї твае о 5вт бян мів
Іо 5 та зро іі АТа ін бів ТйгоБее 10 Тут бас Уа БКе А1я зем омяю вне зх ВО т з жів де пі Б1У ес деко омез тує їв Аа ТК ЯМ АТа тв оту
КНУ Кия Ка
ІЙ Бгто тує ВеФфу ді Заг вух РН Бйе Куф Як онік Туб ТРрОВтб її ЩО 235 КЗ
Зак заг овга УР вве аа уж вуя вва ту тки Ту хів Ві рей аг ар БНи Піу ЖіБ без АТа Та Бл ЇВРоЗег ма) ТУ ТБРОБІя Тук вух опо чих 7 хи й й и «85 ТУ
Уаї вне осі ВВ Тер Бгто Таб Без її ТвЕ тео Ва сук ВРО ТуроїхіВ
Ух ЗО 5 ів сві вай Ві тТетв їв аф Ре Уві Тйг ов цеу обі Віз ТИ? АЗр ке Я що
Черобек мет го Між тут я АТа са шій тра ТА рве Та уз б1у
Зх ЯК з за
АТЖ аїЗ АТ тТйг Х3іе зар оМгу Біб вав сіу Кі мом Ту МВ КІВ вве
ЗЕ 336 335 нів азв їі Кі (ім УВК Між УЗ іве ні ніх Туг УВІ Бак овгу Хі 3 Зх ї5Е ре о Бне тує ні АЇз ак о З1й Аа те обів бух 118 ух ух хаї МЕЖ
ЗУ УБО ЗХ
Зіу ій Ніз тУук дра 338 ТК дай пів ща мет тТкй Уді паб орав тер
У БУ: зда
ВЕ ОТГ Тер аг Зак Ку» Чіп вп ха За ази нта дер пі уві Ту? ї55 Вед. 135 Б мат ме ага зи буз Аза захи хі 51Уу Ж гук Те Бк Ав отак
ЗИ ща зх хІіїО» З «а М
ХЕ» ДНИ «1 фсмюпає вина «Ох Її зва х кзавувсва сУцссоа бестпухях са тах почлацевай щі спис вес сассавааає Зеакоаєсе состава мала вий М смак снх сао х ЗасЗвемЕК Запасоєсовх зд єНеВ ппазецх ЕК зпадуакваку сслозавове саалевсссЯ зрацеєлеля салхвіеа самилеоця ЗА заєвсннна сфасзесас зазоасоєєс задвацикос звсвтосоає псзканиеєя КУ тбпозацахцх конс аеї оскдтсеКНс сссОсоцаЗаА хевивсЗсвО умах КУ здавешкеЗа кажххова фс кНсоВ ОЦК поко СЗТ БЕ сттззакскк соакаакцсз солодка тах сздітастсоа абскгяксве дзесвтсосе ва стсннассо песксакася соссооютак содвтсзесв суще кках зеВсфоКо ща тЕсЕТедОК ОВ СНИ ВО стека СВО пусагаанто зотевсподо вай кякуікхзка сововадєв поосааве асваоптцсо ЗВО: ЗтссвоНаце 55 мозок даизосзоак дозсвакава свесвсосЗа сспуєвоха авуцвочеве 723 часазмадакх касвсовх сосок Зсасеетева асаккксах япацивсває 75 с сооЗО пеКостсссо сс Зсх соосттовВ СОХНЕ соску 5 зсстссовЗОх кЗстсоїсса оосукККОЗВ ЗТсеВсовек КВКЛККсЗов СА З ВА: созаадахва зскхзсоаова досл зТосвсавКх Кекс Х свеВсецгу Бо шва талах сс скактясЗа сесасох ВХ КУВе сВостгО КО зажмзацихкя сОгасавава спестхсосоа сала срижжзезе фозостссеу щоку пи сст содатаадєа сскаавстЗа Зідаастаєсв спотсуава сама то зежеасссях сососовома секаавстоЗ мхратовову зестоааста сов що хаткаксках гсссоВакак зккасвате сугтавеккЗ зоотоеса аск Ма скшжкксав заааохооо ксдевстває зазукакОях секта КОКО МО зкасвикст созакхковв тазик какахтасї зотодаєву кааоуюзау МО звачєцной па ІЗ «ВМ 18 «лі» ЧЕ «ие ДЕ й «вам щтУчна песВідоваеть чих «Ва3 меданооптиміннина відкрита ака зчитування для вкспвекії
Містопеях дизРііа б десатураза в боснинах (верея че ІА зІякцессте сини схяв соозааакях скоса сКокахккяс сведессааа жа тсттстоско ЗК сттоаВ состава КЕ охВева пкукскцкоВ Косів Ха сттозасе асневжтоє востастсес ззоБотааах ЗО ОЗа аа. АЖ зпзоїзеплако хипстаасст сааділкссх у ал уатсттстя СТО да засзстошкоа ссовЕЗетас зоаошехтхс зазпайеткк нозееате мг ааощих ЗО
Ттозазоакує тезу ескиствоа кону оаза совзазааве ката ЗО заасмска состава место туда засто ауакодаткх ЗІ тісазасскх стаееастта мист Івс замет кЯ Наст: ага ЗО «івана стсттатата сеспоцевс семан сКхсФТОсТоВ засо Кцєх ее іс сооая сів атао ану сва сатоаооцка (все ек кеа ЩЕ їсте таса срвсзазав аскксаннвре акааехнака Звутсвоасв СОКАХ БО заівоввах поазхсада» земвмазсвноа своей соссстсвааа зага ХО захаіооами ків жассвзо ес тцІш КТ лса зонстостаЄ таза То здвесстзааа саккссство зміни кк занос сис Ек «аск в зестстодає МускхцІвоВ востей пекти Всбасккхам вени се ЗНУ коханні астаєовнуаа СТО НВЕЗКХСЕЕ сТсаКВККАМ кашинососх ЗИ
Чкжкаккакех кКуствотоа акасхежечВ сет е ММ астамаах саВккескоЗа. кеВ) ааліцнахет «скВсафва сопе саеттотета скмитєланс тевссвосї 305 чекати Х скузевасса сскКоехков ЯеїзастаеВ СКЛІ Захся СВК НЕК, з акеалтякхХ «клюзасоата сумнмакеуо стома х закохана гово ЕВ: сллесиких КссстуааЕ асссзаткс завсзвсета записка вазах Я сстктксяств ваз апстпшннсХВес вдо ккх «каска Ма Вае 3325 декастуХст стазгтлтра санЗзЗУниша садсаєтаєх зспіталсва запаска 1585 зазшстсясї заз з каЩОк 15. «іх УК «ЯК ЧЕ «213» щтузна послідиЕНність «ВІК» «МЕЛЕ КОД т Зона відкинута раика зчитування йза зкспраєії хітгтажопах ит! 18 В дела гурази в посанвах гверін 2 З хх 5 заішкшккКкс стваозетва кобазенест вомставеах сксстстсвсо саке кая - хкахккн кв заастосетва хескавоювт ссттекакло сктсстаза века З пххравктКс веЗзЗеКеак хека кЕтс дадаскацех зачсеввОч зало МО засно каассвасхх сринсяхсе замнмачио єр а сапки 4 звсастоЗТа статок ХУ ажнаетес змакоав сксавоцсх ЩЕ та зазсстс ттаданхккх зестестзаа сктккув тесхаеоати сацесва Зо звІзсетсста гот ацеи са стаци Омнзвста засос нка чай еЕсавцестВ ската хасасьеає соска асо к ХО ЕВх Зо «ттвЗаассо стиха састацаває сет сват х тяга БО тат свааа зтуацахякца ЗООщмЕквя сзтроЗМов засаханихк тоже кца ще хостес оїае коацахилова Велес т ато ттоео засто анех ТС ОО зво поавассвове фата сассатаета хесскевува зага ЕХ ззозтщцатс ктпатассве сс КО фест сттга дос аХ Фадоцаах ХВО завслаацо аж стне КТС Затесадо СКК Х сек В зсктЕлацас вистоаЕЕся ВЕСТ Уа ЯсстасцЕ ВК Бе НВ ВСЯКЕ пк ззазновваа астакоацци насе віцстоцЕ СОКУ ВК Сас ЕЦКх ака
ЗекаксваиЗс їБаскаккох ЗЕМЛІ сохоастосЕ атак: свстхесоца хО7 заакхезакса ствацатота сект сактклКсКа сте овово хиаКоККККХ 1053 зви сссвт стоастазома пекхищсеоо казках сто тса акхвккних мя. зкгахксскІ стизЗава сактинотоа стане зосттввсто семи 1 сассахикик тосстоаїае дека сЄ ВоВсВЗсКТо мі сня ЗВаЗТТоото 1-5 ссотЕккоєка засни акісазстве вааатаом скхвехаєюа со ХХ сстаккккка Зсивсстсоа подат кЗЗа свесагеа ясопгсвасв зва За змішсткаку зак 335 «ех «ке МІ кою БІЛОК й «КАЛ» Міетоаная пий «ме
ЗаЖ кул га РО БУХ ТР ОАЗЮ МІУ АБО о цеЕР оЗеак о Вуа АБ чек бро ре ї 5 за 3
Тк ага Бег іх шаг лак МІВ шій фа Кен азр Аа бух аж ід Заг за ХВ 30
ТВ АТВ Бга УМ дер сем УЖ ТК рве бів Бра ків біз мен 815 дів в як тТвговБла дів їйг ага тгроуд) ага уві 51в др оуаі бів туго ахв У
І З ще
ЗвВе аа ВНя ру Ніх бго Бім бі Зак узі рів вне тТук мМеф семи Аа
Тв 75 ша
Ажха уУнгОБІЖ «і5 АЗР Аза ТНК ОБ: АТа РВЕ Су» З1в оре міх мех 58 85 за 55 це обл; муж Вів Тер бує Меб ізи йго АЇА Без бга Зее зга вт АВ
КО Не по
Зін ЖХ16 вуз ага ав овів Зак Чі Ажроаїд вто мат ви сів аз вне хх 1265 125
Зі АгО тте о дга АТ із ву ПІ Ага ав Бу НВК ОБМИ вуз рго Заг в 13 КЕН хів тВгоМміз У) Аа туг Ага бен БЕ піз зем вжи Аїа тр орне АТХ з: мо 35 М вецозіу тйгоАЇа вай мех Тук АТа піу Жуг бго Б) ЗБ АТ Зеб ма! 155 їхо ТТ
Уві ТУР Му АТ Ве раж 5іУ АХ ака сухо Ту тром ща вів вів їй 155 з5О
ФБР У Ні бжи Хег іви ТНК БТ» ЗвКоУВі Ту ма? АХЕ Туз АР во це В 80 цій ій мет тик сук йім вла піу зз) Бас Тл Зв 1 бі меж отвВ о іх ща І
Ай вій мет міз Ахй іме нів нів АЇЗ Те бгО бій Бех Ма АТа міх 535 235 ха що
АЖ щих АЗИ ів АВ ТР ОТВРорго АТа Ууді зія Ка ке Ай Тл АЇа гу 230 255 таї із ЗВ Аза АгЦ Бр ага ЗТу БВ Бак о аАгГО АТя ТЕ АТа Ага ме зо за5 Ки бія вів ттвозве ве уді врж Зі тТве БЕК З1у ев ве ат Бій віх ля 28 285 вва тки охів Зуб мві зсь міх Бго Аг зів Ма еп аб рух ух ВхВ ча БУ І З: ІННИ
Туб ми «й вій Зегоїтр мет сабо ухі зоб нів Уаї уд! бра ТК АїЗ
ЖІ БЖ 315 ЗВ
Уві ле бує мин Ан їйг фі тут Заротїрв Бгто Ка аїа Туг ТгЕ о їтр
ЗЕ З 335
Бере тва РМе Біу йзп ота хів АїЗ тує мат туго зла рве Аза ніж вна що 135 355
Хег ТВБОЗаК Мі5 ТЕО НІЯ во Ббо У Уа орг З8К АБ бух Віз Мав
З ї5О З пет тив ма Аа стук Зі хЯЇ АЖВ НІ ТНК ОХВІ АО сів АВ орга зак їй Зх 353 лк ОЗіЖ Буг жа ад те ве) Має пір туб зеу дза су Бій овр ге
ЗО У Б
Нік нів де КпВ Бгто Аква мет го бій во дга бів бго ців ув ет вн а що
Аг аг Ре Узі Вго вне Мін іуз фу Тр ощіу Сенодяа тТукК ж УВІ
БУ зх Б
КВ баг оТуг Туг Фіу АТБ їгВ ву Афа Те оБбеа его жаа Без АБИ Су з що ях аг ципів ій нт Ту Туг о УВі азпошіУу Бук вів ЗИ уз дів віх зх 455 о ек Уй «ех» АВ шидЕ» ВК й хЕХх петгезсовссив Биків ниЗ ох и
Медея пзаскзассова облас сазаспакаа калино сао 0 їх поухсвх Хозаоааа сучасно Мора сно хсзуевеЗЗа звасонацак ве зсвааца заст вЗааа сосЯшнчкс ЗсоЗсома соанаоВцКх доасово 159 зЗесаккясяя воза а зодчі ЗзБасОаиКа звик а засо ТЯ зни хЕхя зосвфсскою знзвссочЕВ амктаккася схостогецах салони БЕ; заквецикоа вона хозотетстах ато заз соки санок КІ зконхкВе срезканикх усе змшакикоуЗ звссозкоа вин сУУВКВ Бе. акцстзицо ЗВО цкВ ЗОсцева Чинки ос ЗБОЗОООаЕ КеТІлящесе «ВО хкцескоцес всцтоцєвтя ссзастовскх ЗаВихочЗа суамукеЯк еко о 53 екз аспсатнієв песни х кссоКовесЗ мата те БОБ попсоанно лена тоса ссавці зоосвсаа смс хЯє вагу ГУ сера ан ссявох СКК всЯ За е ЗмоБкеККУВа хорах ЩО таозасаака свхасввсза сгаскакоюв зсвсссосааа здох оєзнсоя сваканмоцає то стсопазгаска пуском запах хкЕке засвоєнню хтовнаааая зе АК заамнаєха ноххокО Чобссстсва соках софеосссх уаоиссах щу зммюмкщх хетестозак зетоцестто сасесєокаха вето есе ЗА кжкЗаалава состава х зеЕсессосо сакухкахКс Зевсу как нВх м3аЗ зксакскоНКу вотостуЗВх сосстсотас пасгкяттсО содрсоаєсдах зга ма завснттавст кума св стек таєсй тсхсвовсос асктаБаках сагдссощох ща звсннасвсг сток: ссозкасуєк Іс тсВех спакоцакаЄ сзатсопазе КАК квещионса хкаахкаЗеї бакаопктах стозвстосє зайхкатоса бозсотаммх 1 «сззаавог пукавсксс ссзацсизаа тет: пасуквІссе земна 13 зващрааст таланту сва Факс Зм ацним сен дасее 13 змі тозасоа асотлядоаая сасиасхно сорока: схснисосоє гааатеаале за тек 1545 хай В «ек ВЕ «іл» ДЕК «21їУ жтучна послідовність хойфе КОшинопитТеиМмізонана нідкдита ранка зчитування для коні пзфігзосокица фшстжагійня бБ-десатуУВаЗМ в пОоспИинаХ «Ми» 18 зтотохакки ачиствстіЗа Зпинасстст возастхкцу ска сЗаа пасЕвКЕкКЕ щ тоезтслеває ххх таВоОа вай зстоїтаско попе коца Зотова Ме зсехдоаааза засно КщсКсМеКО зеТосетуа сни нІх ТОД тТех 158 фекахаека здасстісаз Задааовхвс фесассакхЗ ззЗзкветоаа дкаєзация 240 засо двсзссстод пах кУа зБстастахи кустстсотва аску що засоккаккз апосттестаа авадткксво бзсосовкєта азу ство задати З цекфкикЕкс схоЗсвасо Ко ЕЗеО фластацзи зу ва дало х ях зізкаквнЗ зеттсосіа ЗіпОацааВа сома оз зу ава секкааЗКсЕ Б текс е ВКобтоастта якесь палке НотО СТО тех ццяНКх А цетстізтоах заставити ясясотквек ак хвесо века КТС ще зЗствозтета закис зсзІсацзайх зйсвоввож стсктаккаЗ взвсВтсю а за езаа пахне стос зоВеКцрає ВТК ЕК ВОсцасаО УКВ сзузасваата «наказасв; Зсзссахякх псссстсвоах запхцазакв заявах ТО сттопатасса екмкідкецх ОСТ КК аВСбсТОСО кода сВОВесСта я ваажветка прихтсвЗсх сацаскусая ЗістОааесех КоЯттостаЕ СМ о ану сх хекесЕЗааї лек хсте сабсставая зсортстеса МмОкаях ЗО «кксоавцаза стосттозах зику се сасомакся завссостах хахкалосх Ого змкаккопах зстстфмат самку соску скоса е зи кККХ МО зЗаакектакх сестсоодетса КЕККККЕВСВ МожовВико веслтаух ЕК ЖК ХА чахннценос гтВасТоФак снах Мк нся ссатКааКах са пстВАХ. ке влстостоста фазах сятосФоакак хктивсхцес за каккий совостстте Ха ссхзатавоа: стаактсна возвретЗай зічссвааа захи кс хстодстава НЕ звасопавсх ккгайстновиа З ткакх кас оцОМ пЕсЗаивНис ВКЛ 15 зассімаасі аташе а зсвастаєтас зетезещох покарає заазаогаво 14 заг НУ «щу ІЗ ке: 88Х «Кай Бідок «БІ: бегаососсив ікішагіну: «яОцпе ІЗ
Мас бух Уаї вів їйг тат пін Бі» тТйг хаб дгу їне меж ХізЗ Ажп щи 1 КЕ: та ЇХ
Ага оТВе Чак Бак ек фак хаб в) бог іа «(Фу 61Ж ТНК орто тат УФ
Ко 85 КІ
ТкгожВЬ бі Мк біу Зак ЗР йо АЇЯ ЗУ хх бух Тг аку дяк дів
З 45
Зако зд тТвг діа теротнуе из «и ен він вго ніх діа УТ 1 вух чо ТЕ ЩІ
Тк Рйе «фіш Агау Ага туК Уа т ХЕ 51у У Я туго взв ха! то 73 а твгоаАзо о вале бук Нік Бра шіу ЗІ БиКомаі їі Туг Тук МИХ вом Заг цї чо БЕЗ
Ажи твЕ оіу аїй р АТ ТР ОБін від Бе уз іш ВН нії Тук дгх цк Ме Й М Й хат бук із вій дк ух Вій меш ат АЇа би орга Вів зїужх вра ХА 33 ЗИ їх дер яІій а1х тв Аг сія вкз жі Бім АхР 18 ЗВ Мет ік Бук МеВ мо ке ТІ
Бве 18 ів три Аг фуб 10 іви Фі ага піз ЗУ вва бле рук Вга їх 15 їщ МБ
Шеторко Аз ніз ма! 55 Ту» дгО вве аїз З ів Аза АЇв мех вне 155 125 т
За вев сік тт йіа ев ме? ія дій ага їтроміз Уа? Аїд Зег хз ще 155 їщО 18 а тує цег сСує вка в обі вів АБ сух Є1у тевомаї зи ків з Як к зів шіУ ПІУу віп ван его іве ТНе Зі ази рів тт о тгВ зв цу АТО ха Кая З
КК КІ ЗО
Зтїе шівп зія ВН АЇїв та Зік Ре Зіу ізн аіз Зам ЗК зу дав мех 225 250 зах КАК
Тер лей 58 Меї міх дей МУЗ З міз діа трорго бід імж мі йгЯ
БЕ раху Тих ніх зв мет Аз обац ав ОТиге ТРК Бгто їВгохі АТя вБиФ БР лив Заг
З ВУ ре
АВ Ві Вів 835 дай Ага вуз аге Ту па Яр обу ою теробев ага т75 ! зва Твх і сем цій ій теротве ва уд) рго ма тву явб Зі мех Мак реве пе
ВИ - КК
ТК. тТгроЖмн:О не Уді рев Мі Бго дгя вв КІЗ іа Ага Яга Муз Заг
ЩА що жу ЗИ
Ме Зіш іш АЇЗ Аа тив меж вве пегоАта віз мі Віа ол тВг одія 325 330 35
ВІ Кі бух Зід хв: тпгобіу тур зак тт ів віз ваг отує Ж Бе
Б КЕ 353
Ре діа дів ХМК меж тр дів перо віу сук тк ме Ве дЗ3а нія ВМ
УБ5 УВО яка
Жег Те Зак ніх ТВг Вік ву аа ха жа) без ває АВ Сук Ні ке
Зо ЗиХ о ве тев о МВі Аку Туг аія маї ази Мі ТАК хів Аз) ої ай вгя дай
З У В Яд
АЖИ БигоМаР Ма Аа ТР мим Меб шіу ТУР квз ди сух пів зді 1 ще Са З ніч віз ке пе БтЗ жив Мат Рто Пі обМе ЗБе Фів вРО о б1в Ущі баг вра 355 ЯЗ ге Ага віпе УДІ рт Бе Аї5 бух бУБ тв оджа во дшя Ту жк хв 4335 за зах ве о твг о уук тук Ру Аа Тго Бук ТЯ Те гак і 5 рай Ал ай
З що БІС
УЗ У мух Кі» Тук Тут уд) ніх БРу ет бій яка уд ме ЗякК вух зо ЕЯ Бе
Чат ЗІ «апа «ших У хаї2» Вілок ше яка» НисчНКЛи их снбпидтійня «ВОю 23 мат же маі Зі їнеоЗіч аб оавй АЖ о ціу ія реє тнг од бін хів їх 5 їй 15
Аїва вра зв бі ій АР ШІ АгБеф ОАТА ЖИ АЛа ак Ві зук бенопяр ке Кз 33
АТа хі ж мя діб вга ЩіЗ Аїд зву діз жк ТР ОРНЯ Дія АК Аг яз с 7 Кк й й зх БІ ра туго заї Уа їі Дів У зві ші: ту ав УДі ТИг ода БВ ру Та
З Б щі
Кг) о)іу щіу тв омді Хій ра Ту АБа ішіродиг дзи гак Опі 8іп АЗИ возоБіу Зіу таб ома! Хі вНя Ту Аа вен одхиг АЗИ отак пів вів Аз 5 Та їй що дів твг біз вія бле бух Щі: БНя вів чіз га Яег Агу рух 13 дов 85 З Зх
СУуЗ АіВ ЯН КАТЯ лі Бе го Бик одгУ Бге Аа бух ТК АТЗ сук УДІ що 5 Ме
АхроАЖи Він Зію Мак оби бій аброене АТа Бжя Ттр Аг був сін івц ке зга її
Тв ага Аа Зіу ББе вве рух РКО заг вто яій віз ха АТа туго га
Ме 55 Не
КБе аїа у сва ді Зіз шек тує да ве бі ВР отТук вен ває тТук 155 Мк МУ 153 ій аге тує УХЕ Уді зяк Зак УАК їв уві Тук Аа бує Ени БНе З1У
ЕЕ І ХЕ від зга сСхз «іу тега охні М Мія сі: бБіу 5Ту ніх ча ощае мер тТвЕ 155 18 М зУБу жхи Кі ТРО ТКроАХВ муз ага Хі» ів а вав їн АЇВ Біу пе 135 з Зх у ви ві Бі зав у АЕ Мек тем Ахй цеє о щях Міз да бук НІВ «ЩО ра Ка
Ні Ав тТКг ов З) бух уді яку ні5 азо Ми ЖхвВ іви АВВОТНК ТНЕ 2У 2 МУ ча
Бке лід ма) Аа вва орав оася Тк Аївсха| ЗУ АЖ АЖа АБ рив йге т45 5 кож
Піу вне баг офуз Тук їв сша ага ів пів 51 тероТАК вМе їв ро а «НУ дЕВ
Уа ункК фюе ШІУ баб ожа! ми овен КБ Тга) Ме ре Ббе бе віх рга 275 ВЕ КЕ
Шаг рук АЇБ ем кук йІУ ТУ КуЗ ТукК Піно Я1В Бема! ТР ОВК Оу жо ЩЕ ЗИ
АЇХ Ала нів Уві їіа ака їМготТгр ост хі ве ав Уа Тк біш Ба мо ЗМ 523
Тртодіа вах бів бат Ту піж мяз ве сви діа їВроЗаг ТетроУуді дет 335 335 «іЖ суз Тув іви вна АТЗ ніх ББе бик ТВроЗве Нів ТАг ові узи АЗр за М Зо
Уаі хні рга Ат Аа Бій вів ву зве ггр Ома! АКО Тек Віз маї Атв ча ЗБ Ще й тв їМг іа Азв об ахвВ реа бат ХР ПІУ тУВ о маЗ АЖИ ТЕБ обу МЯХ
ЗО й КК пі Тук рез дзпосСув Бій хі Іа Ніж НА Ваз те гу Чиг мих рі
КІ що УВУ СІ зів вне аку шій бебі: же Зав аб Аг вне узі АЗа ВМе 815 мух
БЯ Ам 415
У Ттр ал ви зай Тук кух Уа! Вт Вс тТук Аза щі ія ТКвВ Ух хх 7 7 КОТУ й 7 ай т
ЗД Уя БУ
Мід тт гав су Аа вес дев ах зді ЗРу уз Ніж Туг туго МЕР ніх
З 550 ях «і Шів мі бек о піу уз тик від
ЯМ ЗХ
«ЕМ» кій» 855 хежее НЕ й «3» Бутавювюпай сага «нюх їх знах тля ств ек сені Зоо зЗВЕцосоє ВК аКиК 53 пртадхнцуссс стосааткк стсзастатє закавкакся сгцюащсх канясекяКе МВ азиказсасза сзазозатик костстсовх застав сема теах ота ссто ХВ кешщокитае сіро Е «остов КЕКС ссгавакахх ссстсоЗся а
ЧІЗяАЦщМ запаписсте стастоаа ЗкостсвВЕце БМмоиакай херес Б втсчннстса Зілтакнсвт вн лтвао стІтствевВ Вагу какцх сгпвлеЗще З хссттсмию дазасцкств сао ма сафрассувах таасозаццх сатстОца БЕ тхствсптст стазоатсхв том олсасаттсея меми кх зало ЗБ зЗксзвсса ЕМ сст поета свтсВеК ска оков ТВЕсТЗаОМ У штозтсассь асстассос Мина шепсвсстсе свое х сват вЗО Б зкцсвссттт сеатакикве зфастаскикх акоаснод реак завесозаа. Б зссазасоси зокмасскска зго севк сассканосс зуатуєанак ЗУХссВо ее ТВ кккакозасс гостссасвк Затстасшє сМпЕНКХОСТ стат Еа спос та аксцсссвцс мита ЗІЗсатих ВОНИ КОВ Це паска Х 84 засаснивцє вссзосеваЗ савоваасав заока селпвовацся Чай ЩЕ «бю хай ВТО «Ай ДВК
«КіЗ» щтучна послідовність І коту Кодоновнтнвізавана відкрита озвка змитуванни йла зксаретії й вуграх спінЧїінтя об оВАОНгаХе я фкхлянах свкойоченя ма З кінці ії кодеюча дуккціомайьну зломуааи) бавосїя 1)
Юре Ха й зковаттсв) сесадекткх кестостат есехсавв аакаєсвкиек ВЕК 5
Зесостоске стае ке стстоктакх звЕксхЗссЯ Закони сваосотатх ще міне жа стайню зестосмкОк заці тсста кахихкжкає софітевека що
КЕ Кевктиїках гоозкессооВ сссцествса ЗаНауВкЕКЄ состава КО ціцаазззак зизихкевев сс кталва зстставає схе сВсвА МИХ ЛККХ в аксооаєтху сусттїлзез ЗК сяВО сТТосВіаея ваЯсттясої тадовадхає БІ тест хос Заансустта саассстоаст сзазстзава куцстВаеце мае ай ткетассіва Зсзвовтста суаохксЗо паєасстких ковтостссв сааоох Зо пгхаакаву кІвостсск ккакокхїас савоасозах ссВІстТотоЯ дахикяВКа 5 аск яхкх зсостастск ЗуцхоаВ пеккаєккки сецетасмо класткттоЗ БОЮ скшжасЧкае ЗсВсоївеає Кая Втт ЗнОаЄтНико От Стах ЗаасоцвОЗа БО зсхиноав зоба зквмоаава хаскеенежтт. заатакаає дутссваЕх НУ хксвсощасо те кавеК ХхеТЕТасККЕ КЕКС ОТК сакккккхкв вестаауєкх БЕ зЕсОстсзок Кекс К ЗозсаБоцик Встсексвса куккехтов ВаМллеотає Ж тзсатозацк аккаквктаа сазрщатях що «ЗА 23 «аву ВИ «Кл» дих й хефйх ошруУчНЕ ВЗСсліВОВНІКтТЕ ка й Й с.
ТАЖ» Кодовн-опунміжевиза в'дкрита рзакх ачитування для зов 00,
Бугищіжоваа: собака й озлонеааи в рослянах вкорочення на о З кінці т кодуюча шукуціанайину зионгаау) Їверпія 2 «щих ТЗ зодаакІко сссвассвх засос таа псзозаннмх. завер касок Е БИ ік: состав Кекс тВст дашок сао шен сТаЕе ї25а
ІК КЕчЧИКВ стВВОЦасВ ЧИКЕЕТО бас пЗОБТСМОДК сОХТКсЖЕЯ Кт сттаххжамх созстВтсоа тоахскОаа смаражкака вах сскхацинее БЕЗ стазазоває аазисссате петкхсцаав см авах хізсвовева пемоттисхх щк встає: стсхтсвсВТ фінан сітотовасе абс сВи таакаацюн 50 кетхтстава ланок саасеккиох сзаЗстоавВа сеускеаЗе такса а стестзсовда зайва са вкяха чВевсстта Зоо Косх свой ЗБ сЕхнзссво сапки к сКВодДівхає свтсвсцоах ство хщяЯ звхстОщ В Мю змааттястт зсцстостсс кох ЗЕЗае Фета кож жстсВ гадети ав що прссвсясоах ік асас схасхвктст втоостоссв КНсККссеваА пзасзадааа Ж зсаняцнцва аа тетоу фОоннимни свсефталкх зазідевовт пах ТІ
Жтсакаинсс стеж свєс кутктасеК стетзсвокк кахктосттв состав 75 акжаитююв соти Зсасвснчех зетсвметка ск кксве здат так ЗО чтакасрвас сег саветозоа КО хаМиє га калі ВТО «МАЙ ДЕ хаі3» реузкна покліданність «ВО» «БЕЖ» кОдоновйтимізовама відкрити рзмха знитування дея екслвасії шо
Вугатіжснах дигИаЕВ б вломеазн в досввнах свкоеченх ни 3" зни ї КкОодуВкча февхцтомальну зжхвгвзу саврктя 33 «Я 24 зІвчаав сталися х себе тако зчктсваняОє вата хаус жа зевресасех ска ссхв ста акК истотятко Заминнаох сво о хсттстаска стада ст соски ЗВахстссва СКК ЕКаХ соте 155 сЕСОСТІЗИЮ Крах Ми жстпай сеЕсосттвсс казав ссотзоасх -- зктааспомях лввахтксжех сома петсетат: велася сфе сок Мк ас ея песто аї пес хсава стає настав О пак Бо ттскккхОЗО ЗЗвасогІта сааккстост савастоаи Застава аксканако 20 ткеказхОквЗІ ссвзаатеква сопозсксвсо сдапавккксх ковІЇщствИтх калини я
Ффекаахказа КоссстІсх ккхлсЕЕїЗс саскаковах соВїстстоО дак що зкдаккаєтх зіщстастск МРрОорНеаЕ фектайкких сеусТВсТех пане и тс Зозіцїасає стасеакЕс ЗБабстцкті Оса пвасуаанах БО зсганова звіасстива зомозаааа мм кхассх. зате ааах писк снщ УР ідентоЗасс Тс ВК КОСТІВ син сТоЖЕ стека состав 5 ажкаєстїсвво тестах ствсвмир асссксстоя ЗІ заасІїстВх ж засакоян зссасцлля сваотовтаа 87 «в ія «ай «діла БРВ «ВІ» ругатіюнах сомінтя «Нике 25 меж шій вне Аз ЗІй Бгто інф Уві тва Мет Адфа дій щі ів ТУК АТа ї їх 10 ІВ
Віз жі8 Ахв аїя Уа! уві Ай Бтоб віз жів Не хве АТХ ТНК АХА ОЗВЕ м КІ з ме, БУ Я хів Біу ттр ау ви оїуз Кго ІЇ8 (его шве АЇТЯ ТК рух де рей Вга
Ко За я
Бан Ма! Бу баг овте нг Бгто ща ХТБовБем озак ред за Я1А тТук БНЕ ща З 5
ІБ жі у у ЩАгОЗІЖ ме хаф Тук згО руЗ Уа) пав бря де Те
То т3 5а
МВ сук піу Біб б5р о вба БП Баян Ман ої А13 ви МЕЖ вза ді Ніж ща За в ази та! Ве ве Же СТУ БЕ ОПеК ве; Тук ЕК Сук Мне мух сем У
МК М що
Тут іш Аза ТуУг ові Аза бух Ту Заг о бба ткропіу ЗБ АТа тує жа
МО 25 го лід Зія тк он: бек вів хух маї їТе ткрожіх На ту хі дек хі З 145 їук Х1із їук біз еп мех АЗВ ОТВг га Хі мот без сви Бу Ту дай та5 150 Ук МН мні жа ща омаї хає ра ів міх хаф тек міх ЯЗ Ту бигб ї15 5аг 145 17 У
ОУїУ 18 тво їт» чеЕ фі8 тт Тугк бів Мія Вго піуУ У ззо д3а Тут 385 ще що вМе зхег аїд їх мя да цк тТгромні мів Уаі був Мах Тут Таб ОтТук іх ме Ми туб вве мя віх АТ ОУДЬ ан орга туз дЖА БІВ ву5 ЇВг обУух РА БжВ гів й шад тук це три тгВ (Ту ага тукК ме тат ія ет 5іЗ мет аа о Бів РВа 235 238 ях 2 сна меж ас ме) ваз сій 814 хв) Туг івморкц Тур баб бек обер вра
ТА І ТУ
Тут та жа бе 12 Аза пів зе хе) жа); уаі тур Мах ма) Тома
ЗО за а
Мо мет рев впе бік Ах БНе Уже тб Меб бух НІЖ Ніб 51 Мат вух
ТУ І Ва тЖЕ тем ой че воу Аїх хор оіхх іме КІ
Бухоївівйп зу сеу Аза Баг ім Су сія
У 235
«ВА ТЕ хау НА хаїл» Білох «ді» Бугера согча «Я» ІВ
Мет ОЇ: вне Аїв іп Бгто сви Уді Зів мех діа пій бів Бій тут дій 3. Кі за 15 діа хіх вв вів ма Уді аа рез А1з тів вве зе о щіх ТИ АзЗр ее то 5 ЗО хів Му туВ ІМ Кан ук Бр Хі ак зе З1ій ТБ груз Аз оБаЕ вва їх с 45 рим Оу дії БЕК Бгто ТК БЕ ге) тїфе бли бер фе) зеу АТа тТук ББе щ БЕЗ ГЕН зів жів мі ЗУ хає бі вер жі Гуго ага вух уві Ре ре дк ТК їй То їх Що
Маі Ку «у Бай яхв Бра РВе сво Бен вух АЛІ ву Ме яв АТБ Мія в чИ щі деп ЖАР Юа іс Хі іу сви Жак Ба тут Мей См фр бух ва жа ою 155 КО
Тут він зіа Тук уві Ажа Бук Тур 5ет ка Тга 5ІУ ап АЇа тує АщЕ
МАХ ї-а 2 вто а'а тн Уго ШТ; век Аза мух жаі Х16 тТкрої1в вве гук жаї Бик
М цх М
Бук жів ту" бі Бе щем яка БР о Вне Хі Ват рес см Бук цію вай їх 150 За вЕЯ
Уаї во й заі чав вне рено нія ді туго віз міз фу Чек Хі Баг 155 МЕ М5 су хів т отер Має хів тс ожуг діа Аз вл ЗУ Фу дж Аа тує
М 155 І
Ве ие вій вів іа Аа сег о їгрожаї нік он) суз Мах туго ук отТук її ЕН п
Чуб Бпе Мек Аа дів Уа? фе бро БЖ АБВОбІМ уз ТИ" ух Агро уує
ЕВ 25 г
Тк іду тгроткгр яті За туго каб пк обі» ек біб Мих рне щі» вве зи Ії зІй 235 2 г: и кл ее вне меї Ази Сем омль Зів Аа Уа) ТУР рвц фер тук бе Жвг шаг о вга рез о а
ТуК оБко муз па хі віх Бій ви вен оУаі Уві туго меж ді ТР огвец
ЗЕ зК5 Й рах хм 255 а ши Мет сен влте О1у ай рйа Тув Тут МЕ вуз Ніз між діа небо Був т яка 55 ооо І тай» ТІВ хеЩек ДНК , «Алое Бастома ЗаРНа
НК ОТ зеостостх кола ув стома зоссспссяе свасссациех зовконоцее БО
Фпагзсссових аоЗазукатоВ сво) сссотсвІсо Зіааессокце ЗІВсаВсУЗ 3 зсозастту коапшкуссв сессооотнух ззузесвсо сахаєснове сдсвсвозх 150
Зовасвоноу сухисввиса астссаеаїв сок Осся зафннав чесососзЗа КВ
МЕЧА КК сОсЯест пезсаацуВХ Тс ВеЦКККо ЗплКНКТиВ ЕТО З засккксвуз аЗстсасеа всенлодва осока сах ховцеє Зоо за така є зесретових Ззазеоавес соспатсату садсосоовгоє НВ Зо муках зсзссттсос пЗбкастаес застосо Кс сеК Зоо ЗО тавстсвтяс зсзазаасве сеасуветскВ спасе ка воВІтасТ аа иЦКВИх. КБ зимно сота сстооацевок похахокоо сс зонлемяй ва таки свавс зссамсухвак посзововао ххохахаху зве акик сне ЄВИ секс сеттекасц зсІчиеВцеє пККиянокоЗ зозаакккОх акне ТВ їащсттавса сопгаоцечвя Зохсттовся ссяченскв свое КацЕ сс КООЄ ТЩИ точи Єтаї аепбкаєвсс сука таюр ствеокнеся азасаскахуа сулцквевка щ зник а кове квсЯє соте тВсстсКЗ саалккаєтя ср ЗО зміс ската ст ФевІкаВ стофусюеса КАСЕТ стОсВасТЕ ЗВО
Фев омог хкапасвосст сс звосстзисе абсагасаяє Оу 102О тес зесасаконе савастщкк сестсотаце замаснЯ зи Ка 18 хнесксзааст зво кКсОя зсВсКгККК КасспцуКА Тс ссВсеВссК Кене ваЯВиК СОВОК из ЗІЗЦеККМК ЗаиаценоОЯ ЗеСТЛОЄСИй сут моб
ЧистнстІсго ЗссаКНИ ЯЦИК стани за ЯиВоНеНИКУ 1253 чадааваяцв сосауца МТВ кі» 38 «ее ЛОВІ «Кай ДОК й хек» штучна пзслідовнЗ тк сах,
М ходон-оптиміжовава відкпКта рамах ззитування али сковреєтї вауіуа чхаїївз З десазувазки з рослинах саФрикі і «ВИ» ХВ зІзсстсгза зппщаккскка стотеааєк пиїоттссте смижкаакк хеВсуааЕ 5 звтвстсосто задавкас сзвозаазав «кс каеоа сзаатацаах «ес З8Й зссазствоо ктайцацакв состава заавекнева сікаєтанух кзцазев Ки
Зв соава схтясяацсв зіїссакахє вас оа аостовова цеху РЕ теВІЛЛи Вк стодтоссеї Маса тастстгеай енер: бета з замнюємааа зустсзссза затв сто аай стос КЕСКАЕССЕ ЗБ саме: всвовсттос сЗавукквтс фетзтасако кІЗсщОчсВе ВОЄАККаКХ Зо ззагказовах зсвстттсос: хоБааксаст зфоствоай скзсесмще зазатукчВ зо хдагккатви зІіфнми о акаккактет стозомуаа везе сука що писеаацкта стоїки акти подамо ЗК СН Ау щюЮ сахансвице вссааєтає коктовааав срмеаокасо ЗК ООакик куВтВесх М семи села ван есак зас хя зассесекВи сах одсх Тха тЯцекІїсїІв мраашстаа ЗсгстТсКх Кк кассвВ сфоККККках КСТсТвцОа тва тосЗастех акт снекс хзопвсзсахе сссвузнета адеаєтасня ур Я вир тсооза пкацвсмуЗ зе кицня Тс сопасхясфа ТАК в
Зітстсдєтх цетиссвесї ака кксВО ства кка КЗсафетВ сранкккх 5 щещиллеве асвстовес сесКукеЗше даосстаако ВщеВОСтВС Кук чЯЯ це загасити а зссвевстає каактвктеї ссатостковх оз Міцча Ки що засстузаккх дсовозеева зкаєхвоств фассоттиха сг аае сацисяхеКя МАВ зазасускки ство: таа зказесеи апа асо омана сухо ТІЗ3а пес закаккт заастасцає вто тк бстаасекто збаасВьцх совет за шен мосавтчаки є ня екю Я «Фе ОХ «кійм ДНК й й «Же шручна послідовність кое ейХ3» кОдоноснтммізована відкрита рзжкх ЗчИТУВИННЯ для Зкодрнкії бБе13хВ хаіїпа Я десатуразв в рослинах героя 5) «ню о вишестссев судак кка сестовсцик екс кь «сМмнлнасх ховав 5 часаєстестс зазадєасав сзвовзаазав ккснкінксо самє ссасЗве5а ї2о мифаккссо) ктаавацвах соссвава аазикнехе сттаєкалах пев кеВ петаккцахи сттвсзаама пкжсквкЗиа ммютя зодсеуаєха даксхсяЗа їй
ТМЕМеЛС КЕ КЕйцВККТО зсагааощов їасжовеска звацацкіця тоББаБео КЕ засттткази воттсястща всласхтвяс сстоавадая сасхсцавсо Тесля КМХ У камрлликх зссчслІЗи пазухах ота ка сор с олелаки я масах Вест етеВ МНИХ ЗВО На тот овв зало заг таб татас воза аснсКастея слав ня ВСЗТТОСЕеЄ свахацацох Кз атхккавціко сттпттасци ассховвтос доаатекито засто данні я катазйсийас всозвогках кКЕсвааао сккконкасо Зоо вок хузхНоКсе БЕХ техсхечкта ство паовніе псхайнекта ам хвЕцялц ТВ казсхстссвВ сосзаагсіва веж сСпххтяКжа СМОЛ М хоста 755 при нассЕе востієвхис свое сава стусицаяста аеаєтаєоя соцеетех ща зхзеткЗаса боаоамахав волі мине Касстем сказав чеках що чІТсЕКаст петассхист стаю стола секакаккке стосадоккх ОВ зе ахакіснкст ссстуткк: Звосстадкау апхлівктяє водах ав МОХ вар ха ахсахаствс таастакккк соЗОскКОНЕ ОВО коза аНе Та тзвкстскавих акхаовісЗа цеси кК ЗА ВМИКЯ ЩрОСТеВФЕЕ сацуМашсу ва; зазатсцекк ків тцаа псзажкстІс зазааскасе звстхсвева сс асх Зю зазатаєксив вості саахасттІтс зстдаєттсв зтзаеаї ххх тссї Зо
Ти у мех ух УМ УХ 3251 задлазнавя тосзакоатО а ЗХ «а ЩО «ах БУ «Ж1йм Білик «РІЗ» ваУтоха «їй: «Не ЗО
Мат вра его ай во) ЗВ Ту Заг отУк А1з аін вБгя Бго Звг вії бій 3 5 10 Ко тївовоміх ін Уа! ви Тйг ово дій Зіз Мія а5рогуз уз Би без А 5 35 зе су вів зго вів Туг ав ми! Те оахо бе уд уз Ага нів реа 3 4 пл ків єм ут тім» дів тма ма щі ТВ о АВ Аїд ТЕ Аа міх
Бім щі жк Ха Хіх АТа Тут Пів Уві Ру ТА ОАброКія тег АЖ Мід
КЗ. 55 БЕ
Тут мух дій Пе нія УЗ! АгО его віз Куз діа вар БУБ Меб ев бух
НЕ т лх а
Щег гар бго Заг ага вто щі міх був Зіх ТуУК чего Бгто зга ага АТа
Ж ОВ щЕ дай Кен Те АТЗ дай ЮВе ЗІ Зі Ка» тйо рух 15 зав пів діз с
КІ 135 Й її
Піж мех вве ші: бо дар озев рго ніх маї 53іа тук аку мех Аа (и
Ко ха ї25 чаї ів Аа Мет Мія хі 5із у діа дій ве ів ткеочіх БУ Тув
Тю чу їди так вна лів Щіу Хі АТа меж ве) оту уаї УБІ Бій іу дув пу У
ТА НУ М У
ТР ово МЕ ОНР ів вту «Ку М35 Тут Шиг окзв ТВ ошіу дай ЗТ 8іВ
І Ех Й 7 уза У
КВ: АК ех
Бне Аахр АРІЯ Аа Хія ій Узі Аза бух тус ЗУ вжи біх бу піх Мек
ЗО 15 М щвк щі віз Тр тТРВ Ага Аза Фів ніх зап вує ніх ніх БІЯ ТИК Рг 135 Кт РУКУ
Ура рух кян бів ніх дах жа! аеро ни АБИ ТТ ви Вгя бзо Уа дів
ЗІ ЗІЗ з реа нік Бін ага ще діа авіа вух ві гук кг вра вій Мах бух Ав 225 23 35 во
Тер Мец Бек мех фа АЇй БЖ ее вне дія рт ха1 ТВ ОТВР фл ев з ке
УМ Ав ме «фу Те Бій зр отрук ідв Біб ргОо аг ніх Зах мезо АФ я 255 ря
УКР муз ВІЗ Тут АК ЗІЗ ев діа Мах ва ЗК З1е дев тує ЗТУ мев 75 зва ХЕ маї шіу Туг кем АТа дів ав Ту шіу АТ щу тТуг Ма? фшн ові из
У БІ
ТУуг мезо мез Туг жа! бій ізз Бі дій мех ту Бе РОБ Сух хи ВНе 505 Її МУ що діа чні Заг оміЗ ТК ОМНі» фев Бго Уа! хаї Зі вто два 01 віх Мій
БУ 530 ЕВ тве тра кВ) м1Ю тук зі 3їд язи ніх ТВКОТВе Ай бух жк вра аг
ЗО 1-5 З5Е тре о тТтв дуб Аж оба Ттв о Мек Зв Жук івм аб Тук і їв ші БЕ
КЗ МЕ І міх ву Тук рез Зак омеї вто ЗІЯ ве аку Віз вто бух Х1е хів о
Зо ЗУ 353
АгФфОУДІ КУБ ЗІВА ксу БВ. Кік у5 НІХ 41; цем Кіз Туг АВ ОЗАЇ Ага
ЗВ 330 Зв ЕН
ЩІК тує вне Бін кіз Мах АТа в нг ббе Аїа аб мяй АхИ Ай мВ
З Я Ки діа нів Аіа вт. зів бух рук мех 518 430 яз каЦт З «вдів ЗВ каз ДЯК «йІ3» Букащжішенпах когда «НЕ ТУ аМмнимакчя Янпцсааа баЗеЗкуссЕ етос оааса а ОЗ зако БО задтмикалие зІдтсвстуа стос е сс сдахкахква фо мо щук стувесссає сцресккствс сс ст зсЯхтяезеє афсодацаса зе цахайшттст тозврасакх ясостсссос Заабекаккк сссзооаак сенс гЯй хх ЕКкт ссзаастелиа кссЗсестсс сопававко ссїстоцеккк «ета сВВе Зо схтхоастазЗЗ пооаавсЗсх залоза КтсзиННиХ вста аася есте ЗЕ вант тсх сіаазсссва х3щссКак схазксязос сеатсаєоав вот тоВа доб зхзатниса адек сєВ озтоасокі сацассввсо столик чЕ осот Бе жетстаавсс ЗкоудкакоЗе зем кяЗ Зоо гтатакакоа звосдосоає а твІвщієтТьа сіпоЗааає сіосамхчах насе стоє заз Вега НУ ща оїпва мухкжнчкє сіапбациях звотсзЗсвсва апавцхаскА гВпааетоя на «вах ок зпкасиакає сао аа вести Монте тех саасаакоих ТО згтаессцака Заспсвлезе Зааесскоах вотстосацо слав садакаккай 73
СС НК КСКтсссоЕ ЗВИК КЕ соте зе сруак каску КН свестуацвк асвсттчсв сахсвацюво татетеващє МУ хНсяК ФО ККВХ Б їлсжкОаух пес тЦешсю ТМЖОуЄМсос вацтасдаає МісвнНВО БОсеОВще що
Іво са с снссае сосна савтатеЕЕга ЗеВвасккоте КОС МАК щи
Зевс тОх мне сюх гусуацєену хВестосае дощ ЧеВ ТЕО 1050 сакассаста зсзксааахс са тумиЯ ходсавесоЗ Заавоахе соте еЕ То кацессцавас збозсскахх состтсаако скокадкхс: зсозезаих ВІСКІ КУН хакі вица ссттовжкхОа зЗзвоасвоссоЯх сек ака зер «века зо пфеканзасхо всзсстттай зааетирае Заст Оєя суспедеавк КЕДИ Зо зма скай Мо
«аа ЗУ кує 445 хол БІВВЕ хжіже Бугай сопе хаще 3
Меж ПіМ БУЄ ПіУ Зі йзп діа Як їз го стае іа гук без Ти ді ї 5 їй Ка
Бен Хі бів пію уз ба тує ар оУщі Те ав вне ага ЗіЗ бго Фу
КІ Й 75 Й З І ее ях Н вн пу ваг орі Ж1: ї1у5 ЕЙ бен оо щі» сего біу Ж3а АЗОВ АТХ ВР ОВІй 3х А І ЗА
Шаг УуУК АРІ вів аа нік уз! го аг АТМ вух 418 Ар ОБУ ВН без ща зуб ТВК рецовго хаб о дгоа ЯН АТ ТК обте піз зів оїви був ПіК АВ
ЕсБ у т 5 чтаї м рнЕ Заг осую мяз Аби КО Бго Зак за (ій де ій Зах АХ ях за ще га ве; тат дав ей ів куз УВІ Зі АТЗ бо дей ух Аве БИ и 158 35 Що
А вве ага бій бік сви Ме бів оби «у вМе рме вуз ета ака хів 5 МЕ Т25 зго очі жі а ку Ага зів тве бін уд? уаї 51 Меф ЯК АТА УВІ 130 155 ми діа лаг оттв вит мес) сій тТВг од АЇа бе Ме за! ток ну 345 іх В КУ чУаі іі хів ага ші Зі іа Зв біУ яка пух Зх троян мет Ні
ЗА 136 ї75 сін піж іх віз Туг бат ни о тТВе іх ву Те Зек 318 а5б АгО Агу
ЩО Ах у сви Пів сів чек ожте тує іх Бе щі Суб Пі меж жає Бу ід тр
У ме М 7 7 ЗАМАХ 7 5 І 235 ттв Аве Ажи Бій Ні Ази бух ні» НІ АЇа ТвК Без Бій ув Бан ояів що 3 РИ мів азвромаї дзвін вій тк їв» ре і5ц мет 315 БНа да джа Ай
ЗУ Й т 235 5 ко сяк шо» ТКУ.
Ві Тит аву ага Вге омуз УВі уз Ро 0іх дю івчл обій дій ів їтв сЯо те 255 аз уз Ту бів АТв бе сво Ме рВа Ра У8і ТВгоег іно рен ХВ о ТЕ я
Зіж дес сту Тгроїйг тт УЩ) ви нів рев дуф нів щає вн яку ТВе ях я АХ їУБ Ні Тук вка За вза без бух меж ів АЇА ага тує зій Заг вив що 235 00 діа АТа ян рНе АЇЗ га рух тк ТУ їз аа піЖ 8ій 815 БІ1у іш в З З БЖ
Ту ва піз те Баа діз Уа! бін сСух Ажа Ту ХР ВК Хв АБВОБНе
КЗ Й за 555 ак оУді чек віз ТВКОМіз ви вгз маі зак оту вій зяК ой у Ту ви
Б 333 5
Міх тер УВІ УВаф тує Бег АТа їз НІЗ Те ОТКУ й5а Ї18 вух БАК ЯЖК
КЗ ІБ ЗКУ ей ін суз дБ Уго тр Мих 5еб ве Бен оавл зве зів Біб бін Віз
З ХУ ЗВО
Ні св ре вко ЗикКомек вга бід Ба Ага Віз їцуа Кв Зк его Бго 355 В 5 щЮ вАгдомаії цу вів з; БК ід же Ві Біу ів кві ту двв Уяі Ага
Б їй ЯІ ря тТук тетв о йію Кл МЕТ АТ АЖо о ТВе РН Ух ей зни ва ЗШ жщі
З ях Б о її Баку
Зі тв міх дій бер мїз ЗР Бук 5іВ Вів що «дк 5 «ФМУх В «й1йх ДНК хТІЛю Бугашійсопах пагВака «як 3 астацєвіскя ВІОоцаткиє досто осв Засве ЗНИК ПСО ЕВсВаХ Ва пекан х сваамамиюс саснхскоа миє еЯ Стаса сауна 123 тактова є свазсозмтау паскисКоуї газове гозфстВотї сопкависио М зтетатоєаає зсзФфрєса песик стозауааки статастоц птасайккке дай тассзаастр востІсВдете фата сВсеЕееа хсасЯхсосв сет аа Зю зесстовада киснева катсслозеих ахоадстчсов возах оцОя забстсвсва За чесзких миасквсва сайта зиснКує зоозсвкахк «сховок я аташесогадна зиКжкдвсса КАК ЕКе схсВеВІ аспамсакає «схзккаНее я
ТЗ сКеЗях ссохосааЕ Залаккеваа сссзсоеа асммлаєих тус ксЕВОЄ о
Зкеаасаєнх ХсеБкцежеВТ сактаквкак ссатвстакО деко еко М атак дип сактакссов асссзвагас свкавктсто сс ЦсЕ БО ксВеалкеця тттвтвссВс спакОхкау ВНИБОСНЕ Хижак сон а Ух
ДМК КОДУ АВ ФИКАЗІЦІКІ ЕКО С пктаскцкав зсопстЗсваа БЕЗ засазсцики ссавовавста вкаа дог ев ой КОХ
ЗЕМЕх ДНК . . хай ШуУЧНа песлідонНніки «йАЦе І «ЖЇЗ» коденовнтинізованма відкрита пики) Ззилунання див експресії рута вонах снчікх. 5 ваайвтази в рослянах верхів 1У «ро З зводкекккя козсЕвтссс пехтокстсст зсстрраастк КтдоВІВеВВ багета. що піс тавкх «сувувтссх: заккхсхВе заваастосх «хх ссВВ садка дО хасьзцучаве сІВстаї а авствжеЗОВ ССО КсХ ТЗОВ соцакаух 18 амжакцєвоз звозавтекиа песхттсваа гтовавансо стат каснпсухе -Яй хаксновсст всттсаакав стастасаве какескккксо тва теа снивщетсяе ня аску Ооє ФітиЗООаа свтссстЗах ахцакечста зовБсвходОв Ватстстсво за вехассщви їісастаказ саасзаатат земне Зеодалхаккхх «ето зо ахпиЗовасоя зоМксцакся Зі вккК сотка зесеасКакак КОЖ ЗВО хостес: Кекс зазитваай сота оодав аккасовосе са тх БУ пктІнвиаих ЗеВкОснсяЄ зазсоатакає Ксхтвствса фаслеєкє тота Бе ваствктвсВ фраза тв саїеасесав хкссаЗахЗс мвхапикскя Вс Бо хетснитета пемасаксвс стос аатасецрете ммс стТЗссІТВх 75 птрісораїта ходкбавхвх смт кх вродесваех кевасскав зош 75а к:тнлзцЗата стаадайасв збаай Бе «ЕМІх 35 «ВЕБ» КБУ «ках ДНК : ; «Же уча послідави сть «а
АРХ» кодонеменніовзнма зідкрнта прави) зчитування зна зислрестї регріишітовва соТеха 5 алонгазм в сосвизах Ве г
«ОО» 35 й всзоааткто сккаайсскосх сестостаті зстснпицвах чес сасеоаех в зе оскк стдєскахекх стстостаєх пасхесис звезаЗоавсх санцкккате зго сстоскоета стоасуаксх сосботеамк заакстссВ сКСЕТоТВаК КеККККиКХХ ї5О
ТСЦ педа х ОД ТООВа стсахттВос сілааУ ак секхацаНих г зстзазаає вних ссттстсаац оте ствІос оо масав пат ссї а хмаржнлхка пккххкнсвВе Зфасотив схсЗсттаса зак аках зас Зо тест кяхцаи Чааасзкхсв свати свзвссозаа мета зас ах че тако уух ссааавхска сцаспкхжвхв част еа беакциииКх сваопозаах ко щеасрсвоу сехостет стахаксве света. пмакккссво замов ка зданих Зідстоекох. звщкОноях ссттаКк смесхЯстс сао ще спеткасвеах Зснесвеве скакскаскто зно коптссства Здасваааав «І асеаасвоа; засасстм зр ваа фасок акхкх авакасвавай ака тт
Змсаховаек вЕсЕссзаас покути е стскакткке сек сстта пехшннНях що зхуакесяас КСЕОЦТВИК КеВсВЄОВЕВ ДсспкситкВ фрсКККксВО ав КНх 540 хасатсовяа: сс сан я «2» і «Аж ЩЕ «ВАХ ДНК хйіЗ» фтучма послідоцкігк
Жах «ЗХ кодпизоитиИмізевн відкрита вам ззвтуванка дяк зкспреасії
Кугащішопа: серлата 5 звангази з ромямнах сере 13) «оре ЗВ акне тїста феостатккх СКС хна нете ство їасох БАКсЕВсяе а пив таасс стіовіаекик каст стова аиБКтКсВВ сттасіовх еВ і20 квест ааодао стаскаткяс застатеах твсстсеТе зеаерасує суще. 155 зхіхатасзах зозодацися сет стаз спасе ПЕДІааЕ 235 хвоста меїсавсно стала асс ХАССЕ Маслов тва 3
Чцасттваво мітосозавя самє х згрвесцета асмлооа важсте З
Зихажстзас їссвекаєая са ЗВО зераасккт ста Б ах зЗавца ватісоашна оС МККо Стоп ОВЕеВ ЗЕВС ХНИ ХЕ во коцковеоВі гемо сво петоаесооаа злдєтаєскх своем МН зЗктавсвссї созгасапах цист ає кеххнотно) ат єтоє пек х Я заскесткст зовзозавта кассвсссво абсо сеоБОїсму кас вКчКХ БО тет кеся Шотнсясодм кас стсЗа дакакнккк тскаЗсетсс Кале кикай ЕД стсводуЗа козсжваеах кхечвее тесравеск зехиссятва заутакаай ТЖО засво стааданося зіцитяй Й І ЦІ «Ва 3 «їм їБ; «ай Бі «1їх оБугсащівопах совкдеВ «Ех У мот АРа чек сів жів їіш орга аа Аїд се вів шік г оБан б1у Туг 1 ї 1 її
У ТЕО Туг пи МВТ АТХ АЖа РО Вбротів ББо Аїа БК дій вух УВІ т т КИ
Вго Аа ту БМя Меб іп У) Фів їує тв ому Бте тне Ха су вк їх ЗВ Б
Ке біх Тук ей ваз пе їз ТУГО Рбе С1у іме де Хі МЕЖ Та Ал ях 5 о дей оБягобія рез ВВе ніх іве ім дха АРХ Ма Мяв Ми ТР Акп зл
БУ 76 то що
ТУК Зі» ТВробйе Ба ал баг тує Сук ЗіБ Туг маю БВ оуДі ТВКоЗав ях чо ж
Ні Агу АВ ЩО У інвогух Уа тРб 8іу ха Іа Бгто Бо ТЕ
ЗО НЯ ТКХ вів Язи ет Тгробір її Зегобія мЖжР же то ів нії ту Азов да
КО Зк вух Туг ма! Бім рез ів3 АВ ТР БНе не Ме каї мех аг ух ух щю 135 їяо вав о ави Бій іяу Зег ве бер нів 1 Тує нів НіЗ НК сви же Х15 15 155 МЕ тее не тт орнеа ма) УР ке Бу меш «и го УВІ у АВ Сук тує 55 КК 375
Ба Чіу аг обаб маі Аза УВК ОВКе Уві Мі Уа! Хі мет туго жегоТуг
ЗК Зо іч жу сіж бен зів АТЗ реа ФУ УЖР АЗИ сСух ВВЕ ОТГ дев ВУЖ ТУК КІВ 155 Ра в
Те охівй їв Бій меж їв фр ВН Суб жіз Су іа Хеє Щі ЗК ів
ІВ ЗЕ 2
Ттук ТВгоаїв туго УВІ іп ази ТВг Аза ве тРрораь вто Тут Кн Вій
Зх о т Я
Кервотер о маі мях УЗ ап озек рвіне ха зву ав АТа ях РИе Тут Аг 5 23
БУЛ Ага тур зув чат цик Бім вія зу у
БЕ 755 «ах ЗВ «ваме НЕ «422 ДВК
ЗЖІЖ» Мауса ва1їва нка 35 зушесЕстох зернова села дсдазкаха зсптосакох зум Бо звіт стала салситам. Зсспасавчи суцассводе зві 120
Звсвледтає зозатни сосок мссцицеяес сао есте тОО 355 їзвтаттса зснниеЗя сессаспоай дочктсвсоа дтаєєсаисв зсосзестоВ ад сссваамос зсзкаксцев сттссасамє созстстотоз сама зааосссомх Мк зЗссосст затих т сосок пексЗсВес ссаацаєе сот ве аценнтню ссакикКуце Чопа ЕНН о Зк хнакКк сррехссося Аа ака уза см алвсм часа кдКтІсссНк ак ККе «ВО
ОБ Кезсустоще ес хавас акосавоака зубфосяасоа соска З ксказЗкса соц ева сохне си сакахх ваЗВеїнах суосоциоє МюЮ пюяхссхсе Часта сах а. акосаккаку тссагокя суВеУЄКО БО шерврессои зосацамє зсвснвницє смс зассдассов саснааг ТО «вро твс Фепацаксова сова зеЗКЗОсяаї дало зсссатсаве що заріесі сптасекокх сатесскку кокс Ктсв ака кове З та масок сера восуєиаеа соепоцОи АТО За зезцізац сздодацекх стасстодеи Ес тодів аа едав ца шасі оа пс ос ЗаасЗцевє віснсжваса Зодсцсоцеа СОМ ло сісвавігоде аацесчаави стещієсвяє зернах мм сну ї-ю чочераеа аетаєснниве соаусасеає стсстстста вався зв млає 1 сестро сассаков озна стозвоспсє ЗсБасахкаА пев аЗеах 120 квссссзиса гато сая кехвОкамо: писку всозмакакас фев 4320 зЗоцекквоВ поза оца ЗВ їіум
ЕД, З. веж 1347
ЖАХ ОАДКУ евіїм НК І «ВАТ» втуЧНЕ ПОСЛІДОВНІСТЬ
«ох Ії «ву» Кодон-оптвмізовава відкрита пачка зчитування дя експавкії взетдуУв па1їів) Ж десатуважи в росяннах гавретя І «НИ: За зкссзсска зсактекса зовзатоЗва сстсваєсся Фета є Боді каєх БО
ЦаСТЕТВСВО спткткахсво ваза тк псхаснаас стоаеетиакх сао іо
ЯВжТТОТк: асцасдехав заст стсаца Ксбнеако сіток Меси Х їщо саке Зачцлзаовоа сстасиозва остсксвіЗИ закаєсакав зас етоо 3 ктаавккка даихасства века ов сЕКО СММскаєтцй чено тоеї Зо детоехваху ав сяссє кказехкеВє сФетасозтов сія х чксетстц Зо зе схцак кпк стує Кб кактЗа Чттавоосто дасте сроВжеецех ЗВ звсасхекхв зок кквеВт пстткакцст зозвазазаас кекс ккс вто Ва чЧаакцсикх секс Во софсхтавс атссвасаво ахоктансов садера М зехайатста ста спек позі авизкхвов соозодатех оо акщакссткт фесту пет Єх яовссвск тесВКаАККВа ско що зашолтсске зісазаааає оплат Сас ВОсствстцВ БаСТВаМиА Ів кккаксякх Зоасттсацка кежЕкВосТЕ Осока Завстатата солена ща сІсЕхЗЕЕкс сОЗеЗскК хоаОк ств: акокщОсакЕ Нева а ВКСКаКиКХ що пишеш ЗК КНВЕСсЕО Кт а ЗОСТЕВСС скддОк ха. а
Тесс ВК ЕяЯ сетер теюк потаухсаха смт ХвХсК Ос ЗБ зстчстаєда статку ствесстокх стосу кст КеаТЕКЖККа СВВСЕТСеоВа ца часоетаеви скани созоакхх ЗсснсттсевВ Кодкхавен) сова тд сЕтзамвхи: заз: сТттетдас ЗХ СТОК ЕХНЯК КВТ ка зас тсв аптдисанає хвасансяс кції ка хі касся таз етах ї20о кита сппяссттзї таззастано стримана сцен свя зеовазевах оо такса ЕсхецІстаа сем Вст Встає зКихатВсОє мтЗаава Іо зойеставаєт скваЗцстої Зк З «Ка У «ВМ» 1347 «алла ДНХ Й «ЗАМ УЧНІ пНЕВІДОЗни Те «ум «МО3е кодон-оптнМіаовахни н'йдкавта памаа считування дай еаппзнрії Вата
Заітвпа 5 десатувазя й послюних (версти хі «Нюх Я зБистосах сенлстая апатія щстістасто ЗУЄ МАХ о спати кскхсВссвзо заавзасноз зстазїаавс КХВаЕсКЕАс сві 1-5 сзстетвавокх ассаннтвя зосекена сотовдевто смцирезе совтстечих Кен каст сомкмавава хескастова еле хкакоВ патвссвсва Васко ад ктхадавтжта супах ПХУссВТОКО зватклека сте паз Зоо яке кНаКО аоеатаких копЗссЕТОї детащаксо ство таа десткеско ще їкахстоВаї фепекскавх КЕстКВсто Зезайесви Звестеа сво Ках ак ах КВ Ве ктакак шсксквсосе Звазанававс стстосеювє хакоувкики ящ
Іра тоеМ бецексухих сешисковзве акхккавсВвКВ зсостааека ше ли Бе тсХВВОКстО сах НА сет Бо сн ххх ЗОВ НК що
ХО тТесжКк сна дя пеВтустОМ: акасВссВос бссасаєсваа КОВЕНККОИХ БО звоздавссст акхааанзус сао питваавстсх вуса КаКЕКОКиА УТ
Сех ТОсЗКЖК ЗШККККНОСВ СОТ ЕТ сисестЗцта заатама серби т5 сІссТоМКЕК кла КВІстс ом Вега по ниа весеВевех я «вас Зикахкісї св ст стса апкхквихЕх стощКіаз Ве те ХЕ КВ соток ЕКХОСТОВВА пЕфХВКНКВ ІВЇК ТЕ за стат тавв сера ет штассвкцкЕ жтсВеЄМх Ккахслускв газо сцВа 120 их стаєте сВатоцацее весасеемі мевссвенм) ЗЛИМИ 10К3 гттзадани: зуостомоає смлєвиве стооодаодах стстсстток астевиаах мя щмищдактка зстІвссааах срака ксвВо сте ткескха пепстсзссв содакектах МОВ ствах ха «ух пайок тзаа стос ха сеЗаааса ЗкасаНВКИ М кастествкса май сеохеесттвет асповснзве зтасаматр: сховав я Хала паасєтяот сзайеескВ зов у хв З «аа 4? хім» Віва «213» рРажібхУа за1іна «Ме мет вто га Зник дії Аїж рух Бій мет «Ту АЇа его Твг окіу уаї КІ ї З їй 15 кла і Уаі тТВгожзрозак зве лі Бйе тт аг Бук зво діа АхВ то т за
Ага обга адв фян тий? За Уа пік азрозаг уа! Туб кв аа бух дій
С я
Ка акц его бім нів вто ур; шіу вів ні вве Уді Заг омец ва Фу що 55 КО
СТу зго АЗОВ АЗа ТК БІВ ЗВ Баа важ дій тУБ Мі дРО АБ АЛНОТКВ «5 ме 7 СВІ вто пух Зк заго Мах Бик ага кпа міх у) бі зок ово АЇа Чек тк я Зо З із ів та УМ! Б1Я АТ Ахв о1іО б1у Туб меу Бій ео сук Вій вго цю м що їв діз бух Бак ха! го Зве Узі бюетбощек біт Ре діз га дій заг 315 ща 325
Тмгоїгвожаї Бук лід Бім ім ків вКеи Бім Зек АТа Кіа ад бе ЗІЗ
КЗ 35 | ЩО ів тус Меф Кви Туг А1В СТУ іук ага Без озфер вт хег Хія хі 18 455 ка З ї15а
ЗУ ТР жи вне дія вез ЇЇ Пі вв в Щ1е са ніх 35 АТЗ АХА ї55 їт УА
І у ід зям ВОК рух бе" ій ЗК Ух АБи зво аза мо ЕТУ ви вжи ї85 ІЗ гуг сів ане їгв орі «ФУ ПіЖ Бегомеж іа си тр зов бів Фів Ні
М що Ран чаї уаї мех ніх нів пи нії тТве аз» азо за аа Ух Ар ВгБ вн а 5 з3а
Ак хх ОКУ бій вуз КІВ міз «ПУ Ві Ме) Арій вух Ба ТТ Аза Ала тур оет зх 53 35 КЕ
Вуж Мат Мі Тео фев Зі ніз вв туго рем ва КРО Бі п3в о тТВг меж
Бе я 255 тк АЇВ бе фу Мен ЦО ВАВ іже вар ЖІЗ ЗБ ошіМ зви чаї Мах ТВ
РЕ -К Ка
АР оте осів Ту ЗІ леа БІВ ЧвР ому Бриз АТа фу туго меу За Ех 275 ВЕ 25 то ЗвК оси ра мя бух іа БР Овна тгВ Аза дга Бе тв дія сви ща 5 зво вет оцец тує беєи Бій Бгто Зак оУяі нів тнк дія Уві пух сфе АВ АТЕ
ЗО Ів 315 320 їМгоуаі мет їйг бі Бек вве тує дво дід без вав ве Бк ЖХ1в Зве 32 хо Не ніх али свв ол: ШіУу ба! 515 бег ущі «Бу вмз азр ЗУ бак Хі тТвк
За 345 ІМ
ВКОВеХ ТВгоАгеф чРУ АВ дає ВН Це) вуз Ага ція від БТ ТНК озае
ЖЕ 350 зв аг ом; чаї ЗУ «ТУ БРФ вам ве) АВ Вт во Ах Бі З1у ам дей хо Я КК тує зів К16 біб Мі ніх вм вне вго даго ма) Нік ніх Б1у ве тук
ЗХ З з ЩЕ
Вго авг заз АіЗ то іви Узі Би 413 с се бі; віз дра ші» хів го АГО МяЗ мів кгО ву тоб хіх ра без біб вів дра шт ТК ах С 5
Зіфи тук вух ніж Ту вто ТВК Ж) го Заг АЯЙ оз АЇВ ЗВЕР ОБ й 25 455 ага віх мех ТУб віз ім ПІіУ дру аго Ро Аг Заг оруз дТа си
Зх СКЗ я «АК о «ММ ТЗ «Мій ДНК «бТЖе ЗжоасігУтіВ М ввЙий хх» 43 зецвесстсо саадесцалих брова зіктвЗецо стокаакков сссзцаааве що «ера спккехсцка «тка еке аласесеве Мопокаантто учета їж затсззавоа зооокесята садоасцкся яеднестоВ зсваоюкиє потовк м тест К зесттстЗ суоаєдека зссассстсо всхоавиств боеакоовх 40 зсотозсхак шсацзосваве сопсцакася содовоссоє сект ссваво сосок сскки Зоо зІтісоацаск ксанус сасаковасх Зссаааасях схе са вск 5 зЗаційсккся зсасоуета ач за осваця поет еок ЗК сияцеЄ ях зеесжпрасЕ КІОСК Ке пня бассмкоцсв ттсоостоса садтенацвє З здатних ксвтотх сайлюксасто аттеасаста хевтоїасвк схаккасццЄ за смгастйссЗа сови таа зкххавоцсс завести севссомх зкацасссве НН сазтвчневІ сао поніс озетавакси зсотссссву скокаакиоо в зааанми» зашсатаз пови залах век зак а ТИ сш жлисє вої еєка ссавувсвас бхадсазко» зоззавок саавикУЗує ТО заЗсаапКсх ЗО й «Оз 3 «ІМ: БІ «172 Ві «їх фдеЕослгуБія патоава «мн ЯЗ мех ліз ау я)іа вв Аза Аа ші» ін ага Жіз ТО Аза вів Уві ТВг х х т їх
Ах Рг О1нН ж1в зо 8 Щі ТВР ОБО (Ве ТУР Мяб ме і уз ВгО
КО 35 5 іес баб ага вла має Фу вм уді азр оби Було іже у АТ Туг Ага 35 З ях
ТТ Бик меж 12 тТгротуе дха Уаі ви сви АЯа рови рле зве АЛІ бай
Бу Ех БО чего вне тТук УБі тТвгоАіа тк Жія іво бі тб Аве тує біт ТК Опіу
ЕК 75 що 5іх їгвоу Аг ага дій тб оаТУ Азвотн га («іа вто мав рів дій ще за За
Кук рго Зак Бго ма тгп ові Заг губ цнВ РАФОЇВг ОТРЕ ОТВг вій Муз
Кю ТО МО зів ВВе тут Тут Яр огух Тк УЗІ дів ТУК дей дер ТМК АВ Терокех ко жо ЕКЗ
Ні сзмн вух Шіу мух вка уві За рНе сеи Рій зіц рБа мів нії вве
І їх 140
Угу Аїа во тгр оазр узі Ту ія БІу ів аку ем ом ват дій Я1у 1 ї13а Ма 150
УВІ Тер жів пе меф пе рве Аа вт вМя Хе онтї КК Хі мож тує ко ЗМ 375
Тнестує тус фіу вжнотг 415 АТа піу Тук уз БЖ КУБ АЗЯ мув та їх ЗО ХВО вжи Жіз тт Ата меж бів 118 сже дів вив Уущі Ту п1у ве іва еф
Її мк КУ
Зі РЕ Ар тує Зв мч Б) вто бух ме Ап его зр оцих ЗРУ вух ме тї5 ЗО ївц оре баб тгр АТМ КМе акм Тук ій Турко уаї Ціу Баг Мі Бе ува ках о 535 а іви Бче Куз Мі5 ВВ ОБ Ту Уа дар АВ мем АТа ТР омуУХ бух Заг 245 з 25Е
Аа же Ан ту жк Цій В «ак «Ві В
«лій ДВх й пт кох Ви Ріантіх Нихічуї ха а аксксдике фс сге сала зтстагемр коник оза сесдааако Бо хизаккузев стксссста сетдктвскс звусссостуєк сакшеваско зааасмк не закоачкочи зицочсзсска ссочиссесо збо стоах ака сосок ї58
Хккхсоя сома сеанс весосостку печу ева завкакевох РУ
Зашсзасксс Зсветотеає вопозвсаос ссрмадсаце соток сспахицауа БІБ певхеаихї ссвзостах ск зюасо дстаавоєтх сстасеастх заацтасцв ЗО чаркаккссв зсвсопосокО бхесзессте зазозаази зацтетесв ссхцсаяцує ра хЕссвксякЕ та сочКЕ Вс иВеО фасекоЗаси КІ стоза зазсцвяцОс ЗО
Зх цякиЕ кеВ сах ЖкВео зкссакако сезіЗсЗсве Зкакти се ЗО сісвзссвЗ сзодстасда зве запас ссвеБмоах дона авцЄ мо сит асВаЕТІчух сс пахудкакся зі ссоко «кксовооо ЗБ) часосзкни миМмімаз сне айсіатиех мае срок тва стасжсссс зма сзіооасвах аксасавенм ссааоВссаа зва Тв зЗсінсссцов зоасЗкКаха й ЗЕ «РН 5 «ії «ик» дих «Бе опручна послідовнікте «Ох ейй3» КОДОМ оптиміжнива відкрита павхй зчитування для експресії КЖРРіатів
Вихінуї б еломгини х вослинах «ню 5 зецкссЗВІа пастка (зач ляаки зт статти хая Котова реВ «екз сЗааа ска КОЛУ ЯавроЄтежКо ЗеННННХЄ сащаеми КУ защазЗазах зоппаясіта спекакттсу втозетацх асапсухе МОХ ке тиетслта сехскихствя заст яст весело Засн сва заоаасииУк жа сао а вамиксххвс тОфуаскст сстевасває кююесносв состав ЗО честозааса дсааастстЕ стане дотаЗадес ска касЕс сзадтаєцкх зБО чадтвссттв актами ко ості вира аяаа авохексних состава СУ теКсНЕга соооєсхокх неЗаВакякх снссхтщдна краватка фасаоуа За кети без кохх сао пхссвсвсжа мказсас тт таєова ха кихастщеа стопа асна овікжааоца шмикетахкя Тева еЗаЗСТ щк «кайжксчска згода хссхВІамк даккакакиь зоря ккккцУК БО йпаміскааас звустттє зкаЗасЯвее застасоких ЗВО авс пек кКссХ мо сміє васхжстЕств сакооавсяде зт сетзвоцетва зазацекаке То прстасоама аадсхкок З во «А» ЗВ «МУ ОБ «кій» так «3» КВіііавій Бихівух ек Б
Мек орви Ан Яга Кіз зви зЗвк АЖ Від Аа 12 Ттробет 18 ВІ бе ї й то 35 зар веб Бін хіа мев їі (фу Те орВо Заг о тук пна о пян ми ух ВВ
І 2 з іже Бем вки вен его (1У іво Укі зр Бій Ат ух ЗІЖ 513 тує АТЕ яЕ ВЕУ 45
Тк Бек мех Ж ТРВ Ге да хі Ухі ви аа ржноБне щвк 414 Тв ща 55 бо
ЯкгоБНе туго УЗІ ТВ ОАТа тн ОХІВ жо ПТУ ТСВ АЗВ СУ «У ТЕ ЗУ 55 о Р Ки
Зі тгроува дго бат рн їВКоЗіу аже пак бро щий Фоми і Ту З1В
Ех з 5
Кув рга аг ака Уві їгоб о азЗв Зак пу тим БНаовем тт оте ІЗ Су
НюЮ НЯ 130 із га Тут Туг бвроБуз Тук ма! біз тує іеи дир оїнк 1 тт Кеу
ЕС Шо й НКУ чі рем уз діу мух їж чаї бяб бе сви іа Зі Ре вів тіж вх
К35 ія ціх Аа его та Азр уд Туг мя Зі 1ЇБ Ага зе уз Аза ЧИ у 155 150 155 Ми ча гео Хі рве мет важ обКе азй Зає вае Жів в3з Ве Ущі Мах ТуК
І 155 Ша 5 чт оту Тук біу ем зйг Віа ів Бу ТР був із АРО ЩІУ БУВ ВТО ук ї85 Її 128 Іа ге дів мет Ра ктів чер бій ен уві вію ЗК рве худі свй
КЗ З -
Уді тро дев ТУ та дхап ді вт) се ВЕ міс зів з5з від їх іх
Уві тгвроажа Ту Хі Аа щі вбО су вва МР зів АБ БІР ху «НИ
Щи 2ї5 ЗТ
Уві рРйе Баг ттроУуді Бпо аз) тут діа тур ХВ фу чат уд! вче кеу зах 25 тах ЗА маш ВК бух НІЖ ВМ Бе Туг МАК дер вв Хе АТЗ Ух Ах вуз дід ях ке кет їх м ки
Муз фук аїз уві АТ тн дк вуз ад вно ве сах хау Я хау» ВІВ «ТЯ» ДНК шк «гі3» орЗУТОхи Біпдніх «НН 47 заток ух кахккатсвс зсткЗавке стасеттсох свазоуєкова доза що тісозтодоВ ин осеста сбпкетекае Чествсстух Мово сама М сасвскксВх снкоцвсвс ссодлавовс зпечсвтзаза вхпукахаВе ссвркаєааєх ВО зимктакух очко остс остоаха стсасстокк авжкхксВце соках що звсачаасх аккснсвЗа пунк ків мну вн КУЕ сожскеках ЩЕ «аалахцх плопоціккес спот їТсс яЗеаащеох ПОВИ ЕВЕКК фМЛЕВМЯ КЕ зкевсхВех ссвдожамОх Зо хвсВто дасзкевеєвх есе папоцсева аа кккотртссх сосхссВоде сстссвсоМ ФК вІка сетудасах сіаскххус о аккассетсс зоваеомю катка ЗсохиЗкак сеВасаесКЕ Как сВеО я ахкасотвсв своотаках часове оса аапасх зас ще ажхсисастса посада ткве сезгтслааєс зхаозосттсз аа ея фест вЕ о весстоацї щлтуєдева стезстОай сто Осттск валик КХт сзаесвачну т твсатстоса спите сексвхкак сВаКссеМх акакцеаова стхкальаай ТЯ пвозааассв Іа оцс сопла паца іх хом 4 «ду й «асо Вілає й «Дії» Бауїота пінні «Ох В мет Уаї Аїд Вкш ге БІВ ТР мо ЗТ ТТИ Би Ме его вга орУє Кан 3 Я 15 15 хуй Азо дій у! наз ші біх бір ма? ви тує рБа ЗаКогів Аа тТуг
І І и ши ря І КУ їз; Впа сва АТа г фі ів фу ага тн Бгто ска ді АЗВ ОТ Ат
БУ З зже ЗУ АТ Тук бук Зак ціу МК ОХІє ів Тут Аха уді Хі Мет суз а й Бі 5 уаі! рНя Бек без Уа) бує КН Хі» суз сій іве аля дід зва щіу Тут
М У 75 а
Зк МеК 0ІУ Тук рем Фі Тед мазі ге др оівиа ТВгобЗіу АзВ ощів її 85 ВЗ 35 чаї вгя зу Туг їйіб барв омаі дер Бго Заг овкй 8ій Рйе Зак АХА Бук ке зо що
Мен вне Муз Ту хво Зк Хія АТХ БВе нів Ту Зак уз тує УВІ
ЩО 1250 25
ТУБ Ми Ав ОТВт Аза їгВ мав; Ма Мей Бук 1У вух вра Уді век рес
МО ЕЯ ІЗ ів пів 1» ре НАХ НІХ Ре 5Ту Аза Ата та А5ротйк тує вне іє
Но М Зк їв
Хід те вве (ій за 51: ОТУу їЇТе Тук уді Без за! Уді Бец 35 ВІЗ їб55 зх її
Рве хів ніх Те ХТй меб тує Аїа Тук ту дж АТа тк АВ АЇВ ЗУ їх Та
Мац о фу Бе ба" рез вуз пе узі Хв Вр оре Межх дів хе таб осів 8 20 З : вве ази УВІ Ч1у Ваз омаї ак о уді тує міз ТжЖе Хів Твен Віз Тує
ЗІ Е ЗУ Я ощуд Е я 2 го
Мав ага ал Заг вка сій іще ві вва хве тук ме) ра дат уУг ій 27У 250 ра 25
Тут Уді Куб ТВт Уа Баб овчи ме) Бе Мах цій фВе бле тТук Мах Ахв зах я5а ЗЕ два вне біт буз сує« Куй А1Б із дід Аа ТЯ ТК Кує бух ух УЗ зи вх о хе З скайх 550 кодах ДНК . «Кіїх РаУуїоуа цаїівза «ау» 5 зтдасоуаєсь пеинртоск Зукцатаеня стооастодх кзсшстевех пнщрмкпац ва замки стос а бони Не ВЕЖ ОВО СТЦК ВККАЦИНИХ За зхсстсва зЗсккахиВкї сама свай соус сакасхосяа са ТааКо Зк сенклсвавса БосккахНКО СИС ТсКс пені Марка пато соЗс Ка кисазсстта ВМ состав Зх Фезсдацєь скота і83 стазсхскасс вес сесаксосот зоаккодсвих зве попка КоВ За чозасрв ах кссзстаевх гаабхисоїа омиеакоу вовоНо нккхяхус Б, пиуцеваВе себе сехВКАНще БкКЕаККЩеХ КуШСЦеСМ ВХоовасВОЄ ща
ХхисЕтІоНив їсти ста занкалЗаЗце зпиктвкцисеХ СКЗ сх сива Вее що атпевснсва хода ак стнстВсаВе зпепакоячиВа сс явІсхсцео Ма хвцососІдв света слава саоскесі тре Ястсаеваєх БО ссцтвсзтсо зсстсвОскВ сетосоваєа ксасосоВоє КОКОН остео сич зветзеосВЕ зсубактах зе текхк схов сек ссвсоакаце ТО ххтз3сазоас зсазакиаах ссзрсасх песіссвЗеях зесцкасцив звссохихай жа ха» 5) ежвіх дУЗ «ей» Би ШЩЕ «її Взхізуа ваТТИХ «Вк що
Мет аїа унгоБіз Зі має вга із їш7а гг оіжс ази трроівно ко 3Зве ї їх з в кео іх ен вуж азр діа Уа! Хіз ші бі Бір ха сви Тук бле ат
ТО 25 З ува 51у їуг сви їжи без ів то ів во муз аед баг обро Бе сма! хх ж їх
АБИ ву Аг уз ОЇ АТЕ туго ага зп щіу ме. іє Бін тую аж Хіє
З 55 що іви ме Сук пію виз Зве Бе) УВІ сСух вав уаї суб Зій мех аїй ів щу ТВ 75 КО ївиа сіуУ їж АВ БР ау Нік вез дій вав оуа! зго зв бен ТНК СТУ
Кк Ве зі зай ак ма! ма а іа Тут бів дю ді шк Бум Заг обге бід сне
Мк за в діз дп іжкх Бен Ва Ата ТУК пер одіа жа АЇя Бе Вів Тут ЗЯк Кух
М . їїх
Чук Уді іш Туг Вже зр Мб АТБ Тр їди уд! раб ву ТУ Вуд ВЕ
ІВ 35 150
Уді дек вне ен Бій бі вйе нів ніх ва фу діа аїв что АБИ Те
МІ ХЕ ХУ Ка тур рна оту ї1а так обме Біз ази сіб піф тн тує ха? вве хі дво
ІВ: ех МЕ ме о ази КАТА вве Хія ні Те Те Же тує ТЕ Туг Туг ОЇїУ АТЕОТНЕ
ХВО ІЗХ М
ЗІБ АВ су Тв Бу 18 Заг мер рух Бго іви Хів Твгогбяу Мех ЗВ 135 МН хе
Ще твгосів ве без гер біу БР ві5 мем оуаі ТУР Бра туг 519 АВ з 35 2 ів ЗУ ТуР вня Акц дів Зб го бін зви Ма! ТТрОЗеК Тек ред вив дза ту лід тук ущі ец век хві (су Ве рн; БКе Мат ака впа гає
Бк ТУ 255 тТуК Нік Бр баз Спа Явг Бук Ніз цу вра Хіє Заг о дга тів о ажа ЗяК
КІ 5 ХУ
Жак аа вка Мей цу ТК ЗУ;
З75 «ФА» 5 «ех 84 «Мала дих І «ЕХ» Кахівчея здітваа се і ка иЕЗацВассІ ЗОЗ Ва сзатацасни есе соуси Зак щі засазссасу солі ав сазсахоцис вогахавесє сасвсвесву зстакаха зо зазсвеіу зізсизрисаа зикесавсос всосаснкза зевсаа ака 18о зе савиі пососоатс Закодисво стоцадккхх зссзетосрах ср укякх за звозтваца паоашсвчх сазан т заовахаккх ссссваєяє попе сКх КН тесоаюукак сзихчсопоаа звакіссиза сода васзвсасвь коукацкоцих 353 тзстасщакс свІосссаих кпахзаасто шфтохацика ЗЕМ пОХКЛИЧаКе З
НУК а КЗКВеВх сапрстюче чес е сома соках ка чали кЗ зссоаЗаох сов тОаО смасцинов Мпа пит 55 ттсзавоцву ссрососзсу саксоекоЗа ммакаясз Зак ута сМмшяже щю хтсотвсацо Бека хОсоах судо спос сВИх везБОЗОщОВ ссасцухцкцк КО вессзаїааці засхсооа ссскамакс заавссдснх сЗККЗОїї збасококах ТО звезацссва веаковссва саке Зсеттекацх Яскнвася фезскавках тво здешскоата мив сст сеанс кооецостев вахканжоВе стлеотеосі що зенкзсст соло завше скат НЯНИ ХА сок оо
ЕЕ рост вто сІЗосВескОу ККККЗКККВ МУКИ ОКХ ЗО юкаскааВ ссвссумтхк сусозсосак кабоомаца Веселе ва са ссво цКо ілкшкснсвВ мреостках сзвзсвоаасо Знжлаєсх смосавесах сссуцосоое ЦЕ хпосхсатоВ всстостках озасттеак как УвкаЗВ сааска кехогтессо 1340 зхшакчоєха ссопсдаєке сабовстахк кадксниа тосососекх сетсвЗодяа Не: свхЗовстка ваізссзсях зосаассккх аканта ссодтавай сзбссотоса її схо со висасскакЕ СО КУ «а 42 «одіх У «ій ВОК «ВІЗ» каміоуУа кава хх 5 ет шіу Ага пі іх др баг лег 1 ів Аа ні вро діа діа пін
Х ї ке їх їв дід Уа! р Зак азр аго віз За Уа! Зеб Ачи Тв дж ЗяК Куб
БО ТУ За зіа ев ній же УР Бан тує БТу бух дк маі аЗрожаВ уМг ху ре 35 а ах
Ці агш тТВК о міЗ вто Я1у Зіу хавг обу Ма) вка ага хія Кке зів дже т З БМ вага вав АТ Ме Бі бій вва піч вер отує нта цеговуз Ага оафа їв
З У 5 ха муз Уж Ма ПІН Зі1у меж ец ух цух 3оК ші Ар оАіВ го зів в5в
КІ З з
ТВк вто ви вро жеи Шію зве о бко Ме у бух дер важ Бук зія мох що 135 ще 18 ші: деа Вів Б) Ала бів бу Тук Тук Акй Рго суб веб оБеВ ЗА ре шли аг КО Е Е З ме ї1ха 155
Щій іви вв ве бви пет мяз ха ів іа Бк тТвг бе діа 1 вах 3 зх з
Ту меж ін вує Аіз ціу хв ві зак ово щи; су З3у АЇй вано Вех
Що 155 Бо
УВІ Заг рве Щіу ТгвотТук без зар ок бра їв Він віз Аве тує ву
Це їх 1755 віз віз баг уді ВНи вуз СТУ бЯягоха! 5і5 Ага тб Уві Зіу тгродей 155 НО 13 вав Аїв ді (у Тук вка вяз Ту вве уві біл Ту тек АТХ ЗАТ и
Її ЗОЗ 295
ЖК) оттв аа Ах ага Ві за таб нів Ніб ха) бух тав дав Зіб яза суч у за КІ хи 21 Ху 51у ев акр РР БЯр лів рих ТАК овіВ Рге зер і2о КІВ Тугк 98) дка
ЗІ КК 235 рЕти
Ав дув га де ХТЯ ія ух аго ібн ака АВ бе бій дкй тую фй
Зах ЗО З
Зій о тук тук тус тні кго Уві мак дід ї1о Цзи Ар Бей тТуг тгВ АК
ДК в та вмеу «Пи бек Хі ія Туг Узі Ат Мет АТО ЦВи БРО Бук Моє Кеш ве жу го ТВ
Зіий діа бец від Без Уві Аїа Нія туго діа їв жа! від тк о вна пода хе хі З ЩІ НІХ ТЕГ одІЇ ів ма Ві ТККвОждЬ КОХ аку 283 ЗО
Аа Віу вп тук мів рем цен о рго ів оУді Ве омні веб Ага обід рие
БО ЗІ УМ я
Фу їбе ЗУ ї1е ТВ Уа? Ме 813 ТВКОніх Ту» Бім ШТ дер їв ва
ЗКУ ще 35 дев АТ АМа шій Маї ре Мі мем тк ве) (Я (Ра пі твг о АТА Сен
БА Я ЗО
ХвВк век АТО Ап Хіє Баг Фу піу ТРроцео МОЗ АБ ба Без те ФІ 355 ЗО ЗХ рве хів ак Мей бів їВгеоФію НІЖ нНіЗ ви Ва веб оМеХ Ммеї вго ТВг
КЕ 375 ко
Зім дза ви Мах ТНК їТа ій го ЗІЗ УЗ аву аа вне РВе Бук і ув зК5 95 Зх Б піз іу во ПТН ТУК ага Фі бу АХА вве Кія 5БНосух УДР ага бів
Я З 5 захи хі Ата та Бен АТЗ бе ОТ нів евовен
БУ в «аа 5 «Ві» 172 хаіде МРлЮЖ й і сЕжУх Зійбує кущистої кзИликониоті томату «МАО З
Ех Фіц Аа Аа ХВ дів бік ЖЗИ Аз» Аа аРЯ БЮ Ти Аза до баг 3 У Бе їх
ПВ: аго тк» од БІК бі Зак Ту Ту ВК ОТИрг ЗеБ й ВМЕ рух Мих за їх 30 вра авіа Же Бгто бер тра тТВгошій тей зга мам Кіз дж аяй Бів їнге дай Зак Аа Бі АЗВ ази Ста ів фу Бе рух Бін дек тр оУ у ще 55 що рне Зіу муз Уа) УВІ Ре вуз Аг Туг пБб ота Туг зкр о мгУ ТВе хі
ТО 75 БУ ів баг зву міш зго жа кам ЧУ З ТеВ Аг пі Ме заг ма) Аа
КІ ЗІ З
Тк діа віз Баг Ага БИ бе біб ве ар іа ЗК ЗУ су ЗР Хук
Ме ще що хв охів ага Бе Ага опію УЖ веб жіФ так оуаі Зягофіу (РУ Заг зга 1Х КІ У ен Ка ЖК
Твг о бвц бія віз іва бух бін ме АТа Кік вга Зек бук Дів Я 3183 330 ще щі ін БІВ Бер Аїа Бга жів 15 уд) «и лик да уйі баг оБга шу Суз їх щі ї ії.) вра Зі) зу Вк об1З тв Бе біб Буб 1 хеб ої 155 їта
Кен М ха ЛІК сек» Білок «Кі» ОВіруУЄ жеатої кучернності листя тОКатТуУ «Не 58
Ме та ах Ве) би ря АТА ІН БВ Бро Зно зак жаі Віз Бу не ї 5 НУ ї3
Ага Сує МОЖ ів Аза ІТ вух Ту ван бій зегохаї ін обі Твг о тТук 2 53 За «То Бке вши ТВг ово біу ніз Ав оїеи хін абЗ АЗроБан хів Зегоха!
Ку 3 з5 зві де аїй вга АЗВОТуК чаї біз АЇВ ОТГ о АгО ака Ту АВА Вій вне 53 55 щ ні» із да цви біз 5іУ аб вка бже АТМ РН ов АгО БІ Вга Хв ща В І я а
Фів сій ве бук суз су Бго мів суз вбе Ага ніх Був бів вів Ті вх и 35
Ії мех ахв хі МІЙ АТ ніх жі го ота АЇа іа ан Ж1в дій дей що ци мо
УЩР шВЕ рує ККО їх «Вій 35 «із ХХ м, 53 яв как ЯВИ , . хЖі3У Вірус складевстоєть іпи «Ре 5
Мет хи Аа Аа реа АгО У аб був бНе Аза чек бін Зі АЇа в 1 5 та 15
Ттв діа хів рух УгЕ ШТЙй іж8 вух Зіу Тгрожвк ак ого) їйт хвбоагий
КУ її З
Пій бух ція Тне кіз ага Аїа із меї зРу Хій мух сем ожеР рі мА їх «а Ж
Аа бін вта я «Та рух уві ївг одягу сви де дій сто а! 818 ек 50 55 5 «іа стук вра ЗМ жаі Зк оТве ів веб овгоа Уа хве того Зі3 Ага ЖК к то 75 У
Зі Щі те Ава бер оБіу Заб і ме) їі ТАБ УВК ке) мух ув ай
І ж ЗО ЗУ
ЧВк о азр їйе цін Рг Без тує те о Тне аЇ8 жа св ах» Бо Заг ОБ НІ
Щк що ії
Вгя «Ту те ввЖ дам БІЙ сей Зів куж ЗТ Аа АТа біх Туг бін ву же КО ХЕ
Чуг дез Ба Вк Зпг оре два Бе Ага тує Шеф її; Ме Мвт го Баг 35 130 тк ожнк «Ту (ТУ БУ УВІ АТа ве Вів ббе зо Ас АНІ АТЯ АТІ БЖЕ зах Ме ТУ зо
Бгто Бра бго Ах ав мим дії ве ори тег ВА ІВ ін Ту гу Уй вич ти чл
ЩО ге КУ
Ек обиг ові Рга о Тге ТНК ОО1у ВБФ ї16Б яв їке ВР вто таб озер АВ що ід ке
Твг АБро аку вне Уві кіз АВ Оу 18 Зех ар Вго ух Кеи уві ап пк КК Те
Яну ТЕ 05
Же бі ух вБи її ме? Аа те ту зу щі» біу 8іа жхв азр АВ
КІ 5 ЗО ків Піп об) ЗБЕ а УЩі Ат УВІ З тут ївВк У: Бі Мед рук АБ яДУ ВІ х35 НІ
АГ ОТГ ОБіІЖ Заготик Зегоазо аа ЗВ І18 «ПУ Акй вне тя ах ма 245 ї їх бух Аж БІК Рг др івм УЖ Зекотев ве Бук тн ому Зіу те яїа зво ВУ ТО су тт обі: віз зро сСух ніх Бе ізо (1уУ ТрРоБ3іу дай ее охае Ки
ЯТІ ще зах
Тв офяц Не тує ЗІ фує від вго ж3і Бет ПТУ мер обій Ада а1а ев «ЧИ щщк ЕН дід Бяк бр вие хв уз! Ме бу БТ Аїа вія Ав РУ бек оуаї Я 505 З т Зх тТтв Вів БУ ЯЗ фує« Уа! ів ій АГе бі Вій заг Уа? вуз мет Уаї
Б КК 35
Тв же За ІН біЗ Бкб Ага щіу вуз тр ощів АТа яв Ка 118 33 АВ з5В «лій ХЕ «ам 303 «іл» жівак й «ЖІ» БіврЄ мозаїхи гуру «Нние 38 мах ніз еіу ІФ Фій Пій веб бів Каб вге ве АзвОТук каї ніх ага
КЯ 5 щ І ще сухо ал бог ТВг Заг Важ Бен гемо ай Бек цен йзроФіу ви орец Заг
І Ко хх ха «іп Аа ва З їв Баг ОЯТу Бгто ви Аїд це Же ТР оБиК Зак тую їх Б ра
ТУуг ім обям Миї Зак РІР8 дій Ме) ку ТЕРОАЇВ 18 вго ім цекорна ща 55 що тки тує ага веб бі су Гр обнв бій Бета Уді паб З1У Ага АхИ Бен
ТВ Ме Суб піу вгЗ Тйг Фій Від вав овій де ВВЕ ага їв Туг ді 85 СН І че
Хів ага вч пів ів жа цей Бегобів Аллоєух Вбо Аго Ніз Ту дій
Ма МЕ З
Заг Аза вій ХІЯ Вк без ФІЙ Бек ТУ Тр діа ва Би) зи яз Щ3в ма 155 135 тер оЖат ав Мях ЛІЗІ З веб вер мем сем Те пак бек ощеб бБго Хв 135 135 ви
АЇВ АВ ТР о РНЯ АІЗ Ту їжи вій жзв СУ Бі: аій я Ве вБо РУ ї4х 153 35 За те Уа бін біу ма? Фу кає ВІВ Тук тує ма! рев твг свй Свв біх 170 175 їзи Так оніж ій Аз Бго Ага мезо Тут ів Бій ке) АгО ДО АК Ах ї5о ї85 КБ ів Ази вжи ек ШІУ Біо Ба міз ага хаї гу вга оЗ'ю А! ев Ж
МЕ ТОЮ 205 пакомет Ал іви рено су; Зарозатб Уа! ЗгОУ Баг тТВг о Чат Аг Заг дго о 2 хХВ дію лі пи мтс з ми ТУЮ ші» ша пд ої тео ціє паї ри ще пі офі Бгто рго и ца су КОЖ сем оміх Мі жаї ЖИ мліу цвч 285 РЕНІ 235 о вія щи ато аяр суз 115 вн ББя ЗО таб вар пяР АЗА БУК Нео
Ку ХУ 255
Чут тав ніш ага узі ів Шіб 613 Аз Аг вай зга КЇВ дер обтя Зак
ІВ ака Ух мам ейа пек Хія дзроіва (Фа тег хз: Мі бер ва Зі вен Хі А1В
ЗХЕ щі ! З55 ягУ їж «У мя; Фіу Тугк пер оАзр бі: Ах» зла ЗУ дв іди Зав Зх БИВ МНя мю ДУ Бе «Я «ие У
Роз жілюк «ШУМ НВівуєк жовта харпихоності злакових еще пе мат жпа їж аіх Зі рго Суб пту дга узі бен Уа! вв АЗИ УЛі БІВ ї з їй їх
ПпвЕгоаго ТР ОБР Зак БНе ва ТК ве тТуб Зег Ома? ів вн Зак омеу
Кх - 0 зга чаі ен Ази бра бле ве ТК хРа вів маї Те ах Не АКУ Тег 3 віх а таг Фру Ах бів Хі А5роїем БК Кує хі Бегоєви Ту вНЯ вер зво
ЗО 53 5
Кге хз ває пев ОТАК ФР Шію Баг тує щек тю Ага су Ві ме Аха 55 ТВ 75 8
Св вт ви ЯК туго тТве ЧЕ о вец бив Ма! Ага Тео іх зи віз ма
В ЗО З
ПУ Туг ВМ БРВ ОТйК вве сег ТВ Аве (1у Ажроїхів 5 ій Аза бго що ЩЕ Мо ім ву АГУ ХІН АЗЮ СВО ЯекОТМе Меї Звг ТАК зи Зек РАВ Тув фін
М ЗО ТЕЗ іа орав ся обнц о дед Тує ваш ТКрР бе» БТУ бе Аїд уз АТ Хв о Ущі
Що м а
Зіж вів бій зів сук Ме бій Зак офі» мех пін За ав рух аг рни 155 150 ря за вен оні: Туг Ак іти їМК осух ВВЕ ім са бух ів ото ага Бга Мод їх їт6 МЕ тре обід же Бу яз АІВ вра ТМ рей туго Кей АЖв ар 515 Бве и
МК в ків Тк орви сви БіУ Ага Мет УХІ Біу віз да сія вну реу ва стВе
ХО5 лоб ЗО:
Зту ве) ек зак зла фе ТВ Аг тує ТуУг Ази Ці Бай охв' Уа Щі й ЕІ ККИ іх мя! Бгто Уві дій рРНе то дар віх 818 БІУ Хі МК ви мі Ніз ті ай «3 за
АТ У1у ів Фій Тук рве зве дв пег тур ї1е бій бух 118 фе са
Зах ЩО 255 чаще 58 «кім ща «ої» ДНК й й «Кії» Вірус кисті кзрлиховомті тату «МК» 55 збепазасиаа саксзауЗ ааакиаєсаст возазасаао сктаневосох зов що позозалсва ноу хнекак Фест дивсттоста вет зазкквоВкх. З2о зазінеоцх сасахвасов сзвозсовак коником звався макси 10 паці Зххкооцая ЗуссціактЕ звувавоатс тсадакаєва слцлєоцях 250 пежткВвиток асацасксх кас кОю са сзаккаакта сосяцкате щю ати кктка Зиухсазкса засо атОЕ ЗссоВіВОва ВесООЄКК пан тяае ЗБ зас ккх стячацеЗтх саке Е КАК КККСВ одадатоЗк Зако сее КІ звасазюванс састасзаст госсссаихс палзоєЗааа маакотахх звану ое ЗБ5 сстдадпска сепжвсстт сззаааацня восозота 5 «еще 55 хЕЖЕе ЗВ «ак» ДНК «ВІЇ» ВІВук вжтаї хузернескті впвотя томату ху За зізсзцозте састтстааа кхзаЗЕтсск запескЩсто зов ееткО ккЗхасВІВ. о сежзетавайх мтоасазтх сни а зиххвсуВОс соакаєакх уз 13 тЕзастоза зма тост дсссотовех акоакканиає засезЗасаа 1 хвтаатовек Хепасцкссв сстсозаає копссовао) стдааекиха псвоессата роки свосаЗсеВх Окис с совет здосзсваах задеоахак свеодасока ЗО своФскката хахсоуааце ссвазатака сзааЗЇаЕах ср Ку «а» БО кі» ЗБ «вій» дек хХіЯ» вірує сивавизстакті віпи
Я» Б зоофааатв акхсказих ссозаааккс зЗсабссоаво Заст ззсоратаао БИ хвосволавза аппиккчке зо жаакс раса аНсВОВссоо сце ї2а зеорвеахка аж сус мня сслюмаця пиЗховстсЗ аелаавких ів сс ннк сн таккоа сузасиксх Весгацескс дат сж Туга Бе засвїаакка мн: ааскчис: за зЗазуавеЗзе зуаесаскцаВ ЩЕ ссІзаатака пкдпанвктиї зсттавссса зоасодактевя завасвсссза ската Зо звані сккацтиков авазтессва їттасвукак севозоттва касти кике зай зване скх спассахкоз азасасояса зе веах хедаесовех галакеаав ЗВ сестссосека ака кице стос мекве ззозтацасі зУхвІвІвІс МК ЕЕ коапзсаооах статтукщис сфтоссааия звсїстаєту асецккттоє осв ВЕ висаусцатє савадеєктвх свастесовк авостсатса ходпкакоха кацсозаца БЕ зЗесватаатв софогсяаєх сротоаав ховаїсоие зслєсухнка питво ме заазккзасЇ сзвсовоаєоа сосссватх зощоавстссо сао ккаа певсадвссе Її задане секоокссова дассзацв аснзссовОх Зобавсвсвя сука мих що кстщцаассу пан тісте Фкжцасаххоа коствсвава аюдеКссце сткоВОвеа ЗО чавжастсац асекссстоаа сежсксВВсс схоззова секс гак ккаа ЗНО сквзетоцає змнаізис апазадосех сззвоскОа ааасзнесве закхвазцай МН гвссааооЯ палавтЗася зосзсткаоє асо МБ «ва «Те «кад» дк хеїїе Вірус мозаїки гоазахж ха ві зкзсвссова сібавенасс ссааекаккоа сензвтеако сккаскцеоа соусаккаакх БО касет ствах кхлхассвсх вазах ст стовав пакокаетх спла х Кк «Езастетка скажи ВЗа стаккаєхтв «ІЗ Мвеха ТіК оВ стае вахи їка «стзЗщякескх сховав адек оцихос света с севщЕсеКаВа позна ТсІЄ ща вка доскжвІсда доска сабо тато писк хцОЯ я тус кцт свозозаєта ссеспзовсве зсаахсвоа свосзатках скттсзвеся ЗО таскоркве стсстадкай ДИСК ЦОВТО пасмздкеє ЗаечКаАккЕ ЗКтоВОосее а коаахчесва ттостааких Втома МкпщиВЧВОї ЗТазадєнню зт з алестцявО задівацеке тост ках зивссвасє сіє х гас ча чЧассссвух кхтаксттае дстксдеаву лузавсстму КК ЕНЗО содавстках ВО зоБзЗетокеЕ конст позакскасх ШКТ МЛеХ ЗхтпівцеВй зок аня ІБ ваосатвса оса тспткувтве зусаВсМкх ТОН КихЯцалИху "АВ песдазасая вста еест смт Всо озеабхааєсх зстосвостка састсакова за чим ттазмас заовссоааа зон уссеаЕ садках созсаккоа УКХ ННеВЕ вза чФесакаасєс седвасттат хикессоЗаї гасжкхцакО заааесоаноаа айв хх БІ зашкксткст за щІ2 «ВОМ Б кеМе ТКА «їй» ДНК Я комі» ОБіруУЄ БоВТОї карпнковоасть злакових «Ве ВХ зивЕссзесу кекааксксО сема ЕК сВЕЕсИу асохеНиКк емо 5 зкаетсттса мок а У тоамекк ткостосатО кхихацакки зевовтево ще «зазсвоєла сазатиикка зізсвсссаа азкозавеса апакахикка ЗТ їж састстсжаї тасозатест сстсясноВа даакехтвст спаде коВЗ ховестевАе Ка сли КІ сао ТТН КЗЕ СОТ Е ТЗОВ ТВИО ЗиВсХтсКсї зга зп и стЗЗІатЗа кахксЗновВа засспацвих осо да ІК Іа ахвксввссс Зстстткска соапцєваетк сіажкксваяе зтаасасцаю спос ся Зло заавсхвісоя ссодасазка аонасоасткх сапевася тодзатектх гзвазвовекх БУМ ткакиствсс зестсакоти сектЗлазк окт ссВс зассжсакиЗ Здав 540 тлявстссто Фессткахих дювсвооакх сктаацзева стовжстко сспбамюх щи зцесатазсс застає свссЗосткО сті ссовЕа тсзстадокв статзатого ще
Кен кІЧіЧи зас акчях ЗЕВС Х сову ссопеаккак ТІТаКаЯє ТЗ зстовтаваз аатазилихс садесетіаєс зіссазаава зеиснате а ТТХ «ме 83 «алі ЗО «Аме Бі ДО Й що «кЛ3х ака вариї» спатіаиа «0бх 55
Мет жа! Кік вія АТХ АТЗ Уді З1із ма! Бгто ін й1у цец фешм вна на
З З НУ ї5
Ма ця" біш змо) Та УЗ ака зво вве пів ів МВ су тук УЖ сво те 75 З
Між Ага рго ву Заг Бук Вей ТК ТуК АгУ МУЗ КІФ Аха АгОр ма! У а Я Зх ій іш те реа тр ме ТМ вен ома! кротів ді зав тер Уа МІВ щі КЗ що
ТУ жа! сук Зі бів уз: Ве Аіз а5р ази сін ТНК ОБНе де ага мех
Ні ях У ва
ЗУ кує Вій Мі Аїв фак уа! Ма) Суб аж НІЗ Аг Заг Аж ут Ар
Зо З теробян Ма? БІ Тер ХЕ іс Вів МІ АГО ВОК Ту Суз БЕН об5ІУ т
ЗО 5 Ме
Аа ен Вік Уві УТ БУХ суб Біг зак овух БВе зем рго щі ї19 ЕТуУ п 32 5
ТевВ Чег вях їгВ вва Чак оБів тує ів ВНе мем ів Ага Ащи ТКв ДІЯ 130 135 30 сх АЖО Бін Зяг їйК о іду Бук веб Ту ви бів аг без бак АВМ Ре ху 355 1 іо враз АРа КРО БИБ ТК о зез АТ ів вве УВІ Фібі ТК А рН ТВ і Ко 175
Бін А! суб сви вух ЗІБ АВ Та ОБ Тук АТХ АЗа бек сег б Мах
Іа 15 а ж У -З Мухи 355 п У г ьше є те що х Ф о і 7. іч Х1а й го Ага ан Ма (ви сів ргЗ Ага тк вухо віу рве уві Мак їз РЕБО що дів хі Маг аа мак зго Заг овпе узі рго Аа хі тує З5Б Має Те 230 га 0
З З не ТвВготшТе вк Ку» Те Жег ве га РКО ТВгОМеХ без Ак Се вв
ЗІ КУ 35 кто з сі Має ках хх чн х ч х ку «1 Бій ро БЕК маг уУді нів хві ніх хів муз сузх М'Жх чаб ощах
КУ 756 35 туя А ВН вго и пвгозщиа ЗВ дів Хі вів «іп тто Сук ЗгО ОМщ
ІВ 55 о лій В чУпі1 5ї1х У ЗНИЧНИЧЧ - ї ка хо БУ піп КВЕ У Бій вже АЗИ АТЖ зе) фе дер вух МІ КІВ АТа й15 АХА кг Х 5О тА тик ще Без Зі зів ія вів ща ака хів сіу аг орга Та сух хаб
КЗ КН що і В ЬКАЧН - Рома рих ч у. кх Я
Свв ій хі УВУ бай Бог їгр Аза сук УЗ) бац ТК ори ЗУ АТа ТВ 305 БЖ; 315 о цу Бе ем М3і5 ТК АТа шій Бе вне хаб пег тгв дкз «Ту ХК ОТНе
КК 338 7585 ті ла їжі ЩО зУО ка жд ;. сх
ЖІ жеє АТа ів ТУ цен сім хів жі так овец сух МЕЖ СІЯ Хі їви за 345 хе ін тт Якхк о йдю о шли шк 1: дви ї У 18 Аг 5 ар ші вк обію ка ет тнг орга діа жк хні мя вга ва БО Б іа фу бге Куж дер АЖА Мі МіБ вро бів Заг сего вни дів тв «Ти
МО їх 35О твЕ он гу З БУХ «КМ Же Ба «Іі ВХ хаб» Вінок «23» змійвавхлвх 8105 нм» С
МАК АТЬ мух Ти Аг їне заг ох ря) дгу де га Ага Бій сво Бук
З 5 Ні: 15 ри почи Ще ч тх ХЕ дек - ки ї Фо - ц
Тве ів жі щи Аза їв АТВ АЗВ пар ахи Кух дер оВіу ї18 вне мет
За л5 за
Уві шва ли Бег буз вве вух Хіс Ре уві бух ня віз ів уд мен
Зх БА 85 тів тк аійв Уві Аз тер бі мем 12 Мат ха? гово вес сви вка ОтТрВ
Ко 55 5
Бго тук мех АкЗ Ж1е де Ме Оу дп ів тук біу Віз КР КТК обіУ 55 та КВ ЩО пі кви ха! 118 стер оюви Ту ЗРу Зїя Кко Хі «| ів Пій сту Зак з й у К й ТУ
За ча пін нів тик вух бух аб оАТА МІВ ТР Хв Заг Аа НІХ бій Заковуд цю у МЕ утв Зб Аїд РН Бе ха) Мет тер овжи аїа Бго Ів дію ТВгохаї іх
Її ло 5 хаї ІЗ вуз су Пів уні 316 тер оту Без ме осям Бі Я1Й вх ту 33 ЕЗУ зо
Тк вец Аїа Кі Ні Хі ага Х1я АЗр Аг Звб ах Рго Ад1а Ата вій
ЩІ: їі х55 Бо тів зіва нм век вуз іш Аїй Уві дата та Кі ТНРОЗІй Бу авт маи 33 їта МЕ
Хеаг ікни із Мох Бе мго Вів ЗУ ТР Ага Баг У АВ ООіК Ага Во ї5о 155 ї9о
Бец го ре ух їж пік РНе уді ніх веб Вів Км Філ бе Мі Бех ща юЮ КЗ
Бгто Хій мазі вто мак хі мау Те о ліу Тк міз бен ай Тгродгу бук
ЩІ 23 ке піу твгобве яр Уа) агеорга ма) вто Х1я ТВроУЗІ Суб Тук іва Вге
ЛУ 230 35 В вта хів дзв ТТ Ав ахв Тер таб МИ! Ач Бу Х1в аб АВ Тук ма! ях их. В 7 Ук
КЗЗ «о УХ їуз Мак жів МІ5 Аки Хіє Туг УДі ЗРу айй рев вто Аїд Зв ох Кух
БАЗ у ТО
Вгору Пі Зк ЗВе Ав зга ее Бук
КЗ Тоха шк МмІУМО «1йм В «аМе В «ЗР» Кілйк
«Вій» Бапоанзуєох сегевівіне в «Ае ВУ
Мет хаб уді ЖТЯ ФУ де БФ Мец Туг ТуУК ви АК Зве ВТ ви уд 3 5 Щ 35
УМ вн овій ме ді Між ук Блу вве тує Фіу ма1 18 Аа хв ЖІя за 75 БІ фви сСух ТЗК оса; КІВ пі Бук та Ніж Бен ові Бий те Хв твР ОМ
Я Ж
Ага Су ВНе туго Мія Уа! мех вуз аб МЖК пз) о дту СБВи А МАТ му о Кен о чар очі Зх Бі: ів вай кни діа Був руд вра тут їів мех хів АТЗ й т їх о вва ніх ща аб ТНговбче Аз ОМіЄ ББа Меї іви Щіу 5ре Ж вве го ях ча з5 рег Зі суз Вт охді ВК дів гу руб Веб фей ВУЖ ТУК УВІ Бгто БЕ мо ЗО Ка шву Ту Тго КН ОМає АТ ви Ми" ЩІ ТВРОгугє На іо АЗВ ОР ОБГ
М ЕЕ їхХ цУуз лі вів Зі; ді ЗВ ай Твг Бай ша Вуз ШІУ ей 1 Ах еВ 135 І55 ве їУуз Сук вх вуз Ага вій їни Тгрожаі рРНя вта «ік Бі тк ага ща зх хо ї155 155
Тїук ЇКк Звк БІВ цен ТНК Ома веб вро рВе су бух БІМ Ат Спа міх ща іт 175 іви ЗТд ів Бір іх вуз їТа кт хів хв) вето Уві і 81 БТ АЖА ве М З те оби їнК овен Ук! Би" орто (ух туго 51 Ма) БЕ але ага БУ Сух
Ме ВЕ Кая
Мет хів мяї Ага Кі м вуз Вт хів бар тТйт цій а гям Тйг їж й й зі КІ
ЕН З Ам
Аз іже Хі 51у ім КВе жі ів гу ВІ АГО АХРОПТК Вях ка хр
ІЗ їі -35 за тав оіївн вух і; жа сік туго беє бто діа Тіз АБИ АВ От ТВ Бенц "4 хв ЗЕ
БЕЗ ха Как
Бго кро фін Кіа їі Фін Тук вів діа ва Тай вів язрорує ух жа 25 53 ЕЕГ
АВП КУМ Сук ЖІВ СУБ АКА ІВ БК МД) Бгто зве обаі Зак ї38 Хей дей
ЖІ ЩО ке жав Ма! ап Тне мів дай сін Зфу его заг уді руб муз меж онтя
М ж З «Мю 5 кеую їх
ЗЕКХе БиуЮи с. «ем» міста о во іа «Не ВЕ
Мет тат Бра туг бій тер о вав АХА хВі Ма бве Бегбовяю Ту Тук Угі 1 З за 15 іФш Бва так аід їВг тВе бак тн Зі їв век ви м) Бгто АТа хів о 25 Зо тів бе ін кг кро таї бек АТ Аа рен Ту КІВ АРО Шуй ТК ОЗЯе їх ЕІ 45 їбв хів юна їв о сух Тр оте тТнк о хає сухо бе; БИ сів Таб обі Яга
З 55 Ко ік вапоУру Уві їх ха ага жа таРООіУ жи А Баш вт с) дей
Я т їх БІ
Віа різ; ви ви ій мат зоб Ах Ні без Су ай без БВ о ткромах щ І па рве уеу тер оКаг пер І а ага ЇМ ЗРу Заг вже вне віз УЖ Ту
ЩЕ ще ще та Бре із дій хві 18 їуз Бак оЗ1іц ї1в ато мі 1 ве Ків вия
КУ г 7 Я В ко
Мо КУ зіж тТтв ошіу Суб бух цев аз бі вМе Аїя Буг оюаї яку Ага ага того
Ко 135 Те
Зигб охо, ЗВ Аа диг оніз ем ТАК оби ЖуЮ 18 Бій бик бів гів аг
М ї5 У мо вага ага рем до діа вл тРв ответ Сан Хі Бне го біб піфю те ато 7 пжх Ул Як 7
Тл Тл тТуг Тег вай вка Аа ГУБ Піз АК ВЕ АЖ Мн 5егосух дій обме МН 83 155 ую
Міу сві піц вк мет ді у 41 Ж1е рев ду ге яка Тв обу О1У
Ії ЩЕ 7 205 вжи Вія ки ва Бе аРО БІ 5 АЇЗ зу Їж БІУ ЩІіх ТуУкК Уук ЗгУ
Зі ЗЕ 220 вух ХВ УЗ! Ар омеї те жіз ів тує ТК Ах Аїа АВ ШІ ух БК 235 з ТІ ЕІ
МИ цу чіу Аа Віа без му ТВгоАга суз Ба ОпіЖ Вів веб АВ хх ща5 ОЖв 255
ЗУ ій іецш орто за! 15 ТйгосСує із УВІ) Ні Ве А УВІ Бе шаг
ЗЕ 7 чи Б хі ка ТО
Між кУ5 др Уа! Бий ВІЗ ФР Фін дер Зіз дав вів Ж Зі АТ Тер 27ь З і ЗВ зві тев ку ага тк Ак вух БЖа АТЯ Аха Мах меб о АТа був Зі в: КЗ ЗО
Заг Аіа бі 5ів Бе (і ві хі др РО ТКВ о Зеготиг баб обі ТВе
ЗІЗ що 52
Кіа уд вка сви рих ТРОБін ТМРОАЇа Без АБО СУ ВВЕ ОРВЯ мя! ви 325 зо 335 «іп оБіж їз У Суд уд) віх Уфі дід Су» Зег бак ТНг АЗЯ вне іо зав зах 355
Аза стук щі АТа пуб іа ата уді Оу дія діа зві же Аа ФК Тег
ЗУ З КІ в овга АТа ТжВ Тр
КН. Й Ії «вай ВУ «вії» З яАдйк ВАВ «йЖО» Магтіегетій атрвійа «НМ» БУ маком ж1в біу 5вгобек аа то хаф Бен ке лів одів ї1в Вей ква ї Х 15 15 «Щі туг зяб са Уа Ба о бга до ді Бенц ла бив ви реа ів дя й КЕ ко ЗО дів шій Ба ся; Аа їх пуб Хів жа Уа рез ре Аа ТК ев Ще
КІ щі КЗ мит зегоуді АТ бі кує РФ фік Ого Щіе жі се Вій ев о бви ЕВ
КІ У що уж АгО Тук зні іа дз тТук та! хаі зве дого рве ВНа ве Ве ве р ТИ 5 Б яіз аа АКи Бра уз ТУ Ууді ТВК оту ух їі хаї «1 513 БІВ Нік
Щ М 55
Щем Азр ім Тур га АВ 1ів Уві УВІ су5 Ахи Ні зі Заг 5ее Я
МЕ ЩЕ хІЗ ахроМеж мах ХВ мевз (Ту ага Ві Во то суч Ній суз УЩі Уді вик віх Мо й ї25
Аа БУЄ УЗ ЗІ цвМ їжи тТУРб пев о БгО БВа зво О1У Ме Бе мех БУ» 135 13 зо вві ше БВ АТ 18 пе хів Ів Аг Ук зви міх бух Був АТ 338
ЗЖУ 155 ЦІ ІЗ сій Чак тве отвгошіп діа УЖ ТА Ар оМАх КУБ вуз Мі5 ап вег іу з ме Зг5 їів їер ХВ вйе Бгто Бі О1у ТВе ба Бяг о АГу ем ВоВ Рух АТ АхВ 18 ЕІ ще мое БгО БК БУХ Муз ЗУ дій Бе нів вец ай Щі БІБ АТ СТ зх що 235 ман Бе Кі рян Кт 118 їі бяг офіа З7У тб Зак Мі МІВ тує Аз 230 25 о
Звк жає цих ва тує спа ве зу ТУ Сім шин оЗів Те де У! зе
ЗХ ха вх 85 яв вта Хі рез Тс Тйт сфЖ цез тт ТВ Ахв аз Уа! Ах век МеВ 283 зх КЕ: уст др буй ТБг оАгое АБа Бан мет беру бух Ні сви вух біз мех Аве 655 зт
Зек шій Тук бар обег о Зег ТК о аів Фім ліп бі ве Бо оНів Ї15 АВ
Мих 8 ВУ 818 ар МІК ій муз бог тв о Ж1іВ Твг обЗег Хі 51 Ази ТЕ дію Ази
Ку їх ЕЕ
ХХ ЖТя ВК рух дРІ га твор БУб У
ХК ЕК
«ДЖ» БА «аз ЗХ
«їж» Білок хі» свбакиїхж пари ха» ва
Мек АТа Мет Вій АТЗ АТа вій маї вів маї Бге Без БІК КТК Шев рН
Х 5 Б 15
Вик Хі ЗЕ бу рек жа) Мун! АВ ім івн ПІН 818 МВ Суд отук ЗВ
І 23 зу
ВН ОЖін ака вто ій Хеб овее Аха ТйТ Ту АТО сух Кіа дай ага МВ
КК 33 35 31 від ів Тит і ви тп зв о Зін вБвн о а) тт Ів Ущі вв оїтв ото що чо В
ЗіБ у чаї вуз КІ бій зі кое іх вв Зо іо ТН бйе АВ АгО щ їй 73 що век ЗРу муз ші: Мій 815 фез ма! Ма1 Куз ази МІВ Яги Зег йщр ХЕ шт У Ух хх ЗО У
Азв отри роз маї біж їв ої бе) вій іл Ага Не бі сухо веновію
ВО ід 3 дае аа сої хі м іме і ох Хр ша ії ум МЕщоО ВР отаї Ії
Зег дій ми вій пі Ме бух бух ет щат іш БМе сви Бео жЖі жа 355 12 125
ЗАЗ шк АЙ
ЩіУ тт ЗикК жаж Тте БВе зб ЗО туго сви Ре ре «й яка ди тер
Ухо їх їі 814 фуб зв ві Маг отвг Ме) сук лего БіУ уву ТО АРО Ком Аз Ажо 445 І50 455 в тва реа бга рго пе тт мез Аа бен Кне Уві ім бі ТВе олгу бе
Зне ЗИ кв
Бк Бін дія ут ів бул ЗІБ АТ ій піц Туб Ата віз Зв одеє Бій ї8о і ХЙ
Кви орг мВі рбо дго днк Уаф фео жін вго Ак Тк вує ЗУ Ве од
Її аю М
Чет дів Уві бог дай Мах га его Бе Маї Без дія Кі Туг АхроМех в 85 320 тве жі діз хів ста вух їнгозег ва ргбБоРгО ТВгоМеж еп Ага і ец гу 23 Ка 30 ве хуз Чу (ій орга 5ег Уві уві нів Ущі віє ї1я вуз сук нів Бак й й зай 252 пе
Ель о ки
Ма Ух Арон ка шТМ аб дер аб 513 КіЖ АТ Вій ТкКросуз ту кш з чих вач їй
ТВ Ге «ТИ д5р Ой Рпе Ві Аїх ух ар аїщ сЯй мез Ар гук Ніх ї1е Аїз АВ 275 РЕщУ ТВ
АХ оТйг Бра Рг Зїу ІБ рух Вів ніх адхв Кік ді Ага о вго гів ух яв ван Ще
Маг осв аіа ці ма) Уді ваг тер дів сук ви мер Тйт сеновіх вів
Зб 335 Б,
Мет рух БНА із Мміз Тр ОБГ АБИ ке Ба Яер бек фем БУ ПІУ ХІЄ
БЖ 355 діз сви бак 4із ги піу вки бу 12 хів тек рев СУК Мак Я ї1е
З Кк зи їм Хі Аг Зак оЖеє Зій Зяк фра АК хаб тТвб Ре АТ мув Ммаї АЗЕ
КЗ 85 35
Вт вія муз во рук В5р був МІ «(іа бЕгОБТУ вк очеК баг ФІ Тит
Б ЕЗЯ ЗВО піц хі зів біз Куй ЗТА щуз
ЕІ З
«іх «а «КМ: 530 «адм БЖ каїЯ» овейссі5а пане «аю БВ нехай мат дії вія 43 УЗ Кі УЖ йо бен біу 16 дей Бе вче 1 5 т і15 уїй зер йТу івм ха! МЕР зба БЕН мя ЗІЗ АТХ Хфій хуз туго У яв
Ка Тк 35 уів вгЗ рг3 іам о ЗаКоіж5 Аза ТНРОТЖР Ага Бук Хі Аза дк оУДЕ уд!
Ки Зо Я діа бій Вк бе Тгрозцва ЗБ ав омаЗ тгрогіж ді доро тгвоттр АВ 5 У що
ФУ Укі Без іа опій щі Бе діа Ар АН ІМ ТИЙ РНЯ Аже Ак МЕЖ і й СО їй я с т 5 БІ щі куз Чіц ні АїВ Мви ні ві бух дк віз де чек акти ї15 Аз ши 85 З 5
ТРБокев уві ЗРе тт Хі Беу жів бій го хек обіу суз ее і йее що М КК
Бій без АТ Ві Мак бує куб Звге Жег бук ВМ вою бго ді 5 Бім ца 120 о:
Хв Зак Меє ТтВ о ВКе Зак обБін тує їв Ве рен ЗІЗ Аг дай тги 15 їі їй КЕ
КЖо аЗр обі: Бак оТВпР дян вуз ВК Ту Мвнобій ко ем баня в5р ви» му ще ічх 153
Без ага рго бле Уго каз 51З сви БЕ о укі Бін «Бу те обра ре тйт
ЗЕ ве 375
Зіч АВ МУЗ ів іу віх Аїз іп пін тТуК 83в Аїз бек бог БІВ кг 150 ї55 МЕ
ВР ОУВІ ВеО ав вея УД1 ува тів ва АКФ ОТВК вуз Піт вне суді ет 85 жк п кв оУщі ав аха мес де зве ве УВІ го АВ Хі чуб Аза меж отвг
ІЗ хі5 РІЗУ заз Аза хів га вух Тк ошет вез Вко бго тТле меж рев ага ке вна ау 3 ра за бух Біу біб Рг хек уза! Уві віз Уа нія хів вух сух ія Бер мет 7 ак 5 хх се; ЖСУМ ГУ цу вив мезо Бго сі) Чек Ах Ар аа хів АЇБ ШІ» То бух Ага АВ зай ЩЕ ЗВ ія вве уві АТЗ Був ж Аа сечо сво ЯЗ Муз НРЖ Хі ЖІЯ АТЗ ДЕЙ 275 зва з:
Тв Бе зго Ру Біб бів бім осіб ба дів у Ага БР ЖЕ Му ВЕ
КУ ЗУ Мю ви окія Уві Уа вжноБиР о їБр жа був мем вед сів рен вік діз кає ще хе ЩІ КУ.
Гух Ре це НІ ТгБ ОБ АЗИ ВН оВНЯ Баг Заг ТТ вул ЗУ ХТ8 АТ
ЗУ Б Зх вве дяк вій пен ШІУ ів біх 18 гів таб об Су» МЕЖ іа Ха зяу
З 345 їха
Кіа Агд пер овне вій Жак сіб аб бег ТВО ОВРО віх Му У УК Овка 355 Бо зах
Хв звук ка іх зр Ач Мі АБО АБр Олек ЗТУ ФР КекоЗег ЗТй Тв
КУ. КУ ЗВО зЗіз ма та Ух Бі мул
ЗУ З
«Кік то ха ЗВ скфюх БІдОК й хЕіЗ» овнукорволога ілтівикайа «мн а
Ве Аа ТКт о цу ШіМ КАТА Те МУ Рйя Бі Тне уза ТВг Піч Со уз ї 5 га Ух зга Зак зви вта ух айв сух КВеобім аін Звк УР ве мео ве св
КІ 5 щі
Тук тує тих узі дра Куб мово жа Хі Бій св А1а Бен тв» Ре у 3 5 ми ази Тук дій ага аіз фер окт дів Уві БІВ фФР о вНИи Тгроаїх і ки
ЗО хо ща
АЗв о АТа діа ран пу тк оіу жк 15 сви вм пів віх тів уд! вве
Ба 7 У КО
ТРр ошіу ВВЕ ОБНЕ ТВг о хзі 03у ніз азроаїа сту нів 51ТУ АТа ке Зак
З ЗЕ хе їж Віб рей цем йо КМя ві Ууаї біу тс орна меї ів Зако кає м 5 М уів ма; тв ру вве бін Заг тео бух мап їВгоВІЗ Ак Ні віз МіЗ г Іа їх вух зів тв оБІМ да її ахв ага дар пін уні вне тує вра бій АБ
Нео ще ІВ їук Вів а5В БІЙ Мій Кт би Зак АК АЗИ вву їТа бо АТ ува У 335 ще М ї5о дій аїй тки вв діа ТУ Бяи УВІ Бім біх вне вка вто Акф вух УВІ ї55 170 ща дзпоніх рН ацй го Бе ОПіц бро іду Вр о уді дга бів ді бек діа 1 155 Ка
Уві чаї Кі хек іє) сво АТа Вів бе баз Уа! ді бі івц яв ів
Но ай зах
Ії) КО тат їжК Ме бег іє сій зе ЗТу іди ух ТНК Мет віз Ті тТук оТує Туг
218 Кажу й оз
Піу го уд! 8Вз Узі РБж 01 Бек меж сви Уді ХТЗ ТАйг Отак ВВЕ ік 225 23 235 КК
Нік ніх а5А Аз хі шім ТНК веЗ їКротуг АТа ав Зеб зи тк Тве 255 зу РЕ
ТУ ДІ Му Бі Акха ев о пяг Зак ущі Азов яку зве ОТуУк Щіу дій моу в 55 ке
Їів ахр 55 ісгу Баг ній фаз їїа іх ївт оНі» «іп їв нія Ніб Кей 55 ЗВО ЗА
Її 283 ХХ
Вня вго ЇТз Ха Кто Ні тур вуз бац бук муз Аі Таб АТ АТ ва
Ка 5 М ціх Зія аа вве его біз сем Уущ? асу ух Зевс ахр дім Бго ЇТе фе ще Ме щу 320 мих БІВ БВЖ ба зга МВ) Ту Ай ОБец тТуг АР ади Тр о ВІіу Ущі УЩ х хх 7 ще ТЕХ, Бач 35 БЕ І55
Ав ощів Тр Аїа мух уеу БЕ тяК вко муз Бім Аа Кух Аа АЯа ВК 45 Я 55 іш Ліз дій від Муз ТВ ОБУ Як ТВг 355 ЗО «Це ТЕ «ії 8 ам» Білюк «ЙІ3- ВЗ овігв взвцовайя «НН
Ух Тук Аа ве ЯН Зак ОТ ня баб гів АІя ви КІВ Баа кро 1 І КІ ха їУ
Заг жів джа віз Бйи зак вра дів зга вто Бе бара тТве фа вк вух
З т ща
Зак озуз ав бій Ме Яйх ма? кова а вге те гу АЗБ ОА ря 35 З З зей вне рам пів РгО Бій їви вче піз ай дар обен Тук вом Ах вик ху Ку ЩО чаї Ап уВг вка Бгто ага АТЯ Зі тс хід мет фу Маж вяц ро їх
У 5 ЕВ шій ВК овне зов пла дев ТР АЇВ ТвтТ жав ба зу Туг ЕК ПТУ меж а па ЗУ
Аз Мет Аа Аа Ві ма Зак г омях ЖБК реа ту дал вій Ха хі 00 ях ХО
Твг жег дхр бій Тук Віз їз фен орто ме Бка іву 014 вій вів Те ії 125 зх
Уві де вто вла біз мем зву лій 51іу ре Аа МЕ ТРУ су5 меж їРо
КК 45 що сух МІВ іх вів ах АЇВ шІТУу НІХ Заг ТВ о Маї бак буд ТИР оз ух Тер
Ко ї53 135 їБО
Хі Аха та хаї Уді БіУ Зір ми! Аз нів Зак У УВІ суз ве о ТВЕ м ТТ 73 «те пе ма! ве Жгроаіа мет сиг ніх ага бух Ні віє зви аз нів 155 ха 5
Аза Міз Кій дій цуб ар о ТуЄ ик нів Муз тей Туг 5аг АГРО АЖЕ бін 155 КН М
Ме азр АшО Хі бБга шій іец жує вуз ТОВ Зі Туг Ап ге АгУ що іх 228
Ме ек ЗіЗ ме КО ВМ сем тук Ва мм тег сви дій іжновіх Та 225 23 хИУ БОМ
Вге АБИ ЗІУ ТУ Мія чаї Ма) БАБ Тук піу АРО Меж тво пін хх УВІ дат КБ 755
Заг БАН ОВіІй уз фжЕ ВН о дха А від їв ЗЕБОУЩІі бій ма! ЗВ пух
БО УК Кв аїа їв їз Шу Бегогблз ТО Мер аа мес щРу ТК ОБія АЗр она пе зи в КИ ДІЯ каї ми! сбуз чат жі рго їка ме; ві мех баб уми їкй ув ва Мах
Ка ЩЕ ЗО та! ЖНеотуК ів бів Віз Між его 5іЗ Бр оші вух Мр отуг ТИЖ АХ хх за 35 З іш тт вна Те Бйе бін муз сіфу від БвеобТв ТВ о уаї ав ар ще 32У У Не
Туг іу Мух із) її АБ дго Ме 58г Ні Віз Ммеї Мет ав обіК ніх
Б 345 355 ха уні міз НЕ Бям бе Кв бі) Аг уд КО Ні ТебоАГЧ СВО В
Б В діа іа ТНК бів Аза сем ха! мух Ту Мет Авроптв ТВеоЗі1у «іа 15 7 Зх БЕ
Ще Мей Жук мух ТУР Кі Ар ТВ Бо АЖ Бе бай 813 Шк 118 58 385 3 355 М ввп Зі Рнх ака Ар АЖА Тр ОБбе сво УЗ ФІН 51; ЗІ АЖи ів ух
Зх з 5 ага Зі «ак ТЕ хіх ЗБ «Ки БійЗЕ «ДАХ» Буєвіци іггодфоїаге
КТ Я ет АТ Заг й Бек віщш АТа сів ЗВ АТЗ Аа Бе Туб БИ вВа гу 3 5 10 15
Хек беи Те біз Хіз цух Ага ай зи овга баг ОБ сух ве бі: Ка ра 25 3 аг УВІ Бтб ман Баг ба о їую їУг ТйРТ дія дб баг фа АТ Бі ів
Кк Ж а іх мет оман Ат чаї АЇа бен зве Тує дід ага Афд о беи Бго бе ув ке т М між Ки дет алу щі гом дер діа уУМК сіні ув ТК СУ тут Мдї Бех
Бій від АЗИ дІВЗ БжН осем кава тики муз Тих ЦІіЖ туго жві собу та т й жи вів ту ща Уаї рне тро о шТМ Вір ове ТВе УЗ пі ніз ар су
І щ 5 сі віл Ві дів ва цегодка жаб нів мя ува аа вБя ЗвБоущТ ТУ
ЩІ 05 ща їй спи мех із ЯК із ї3із бай УНК ой Бае ші БЕК ОТтр гу ви цех а 125 кет нік га Віз Ні нії цу бал Твг опіх АХА Кіа яв ух АВ Оу 1 ЩІ ща їв вв тує рго дів ака обін 415 джр дає ві рро Уаф Бек ага Ні м 155 ТУ5 ще цен Узі Беж сег сцен Зіу хаб обід ко о све Аіа Ту воо ВВЕ ОАТА ЦІЮ цЕ М 323 Й хх 155 їй Кей
КН ОВрО Юч В увг омах Аза Мі реа вка Бех тта ім зЗід мах ту 183 ще мк
УХі ага авта Уа Аїй мів оУяі їіїв Хі м о уби (Оу Уа марке Аа ща яВО 205 вна АТЗ міх Бен тує Бе? Тук фев тмгб рве та фве б1у вве отит ТК гів 5 ко мет Ала хів ТУК тТук Бі іЖ Був ізо ве ків йне 3 Тк ВЕК рн му 238 235 за хі Ві тйг те рве іа нік Ні да АБВ пів зів отит жу Ти тує 245 255 355 ді АхИ цег бів їтр Б ОУук Уа уз фу Аа вер Зак Бк баі АБр
Тйо У КЕ ака чек ту 5ІУ Аа Мей Хі Ар дяй бу Зве муж зва Хі Бу ТНК нів бій Хе мів нів мив ре вба хів Хфв вто Між Тук муз мем Акя ті 293 3 кі а13 ТР? АТа щІ5 вйе АТа ух КЗ вве вто бів взи Ві АВ БУХ
Е ща Й Зх ха
Аа Аза АЇа вго Щі Хв БгБотНе Бе как ага Мет діа АТ МеК Туг 325 336 КК дів ув ту ЗІу маї Уві АВК ОТВг о дхо Аїд Бе ТВ Бра ТКК веп ух
Зо Зах У «ін аа іх АЇТа АТа Мій ву Твору виг Зах щі З5О

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 006 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить 7-20 Об, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95.
2. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що має одну або більше, або всі з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 15 95, і) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від З до 30 9, ії) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 35 95, ім) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 40 95, м) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 965, мі) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95, мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95, їх) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95, х) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95,
хі) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 11 до Ор, хії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 25 95, хії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 35 95, хім) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20 до 75 95, хм) рівень загальних б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 20 95, хмі) рівень нових 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 10 95, хмії) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 40 до 60 95, хмії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 9 до 33 95, хіх) співвідношення загальних 0б жирних кислот:загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0, хх) співвідношення нових 0б жирних кислот:нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0, ххі) склад жирних кислот ліпіду грунтується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше 10 95, ххії) склад жирних кислот ліпіду грунтується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше 15 95, ххії) склад жирних кислот ліпіду грунтується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше 17 95, ххім) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менш ніж 1 95 С2071, ххм) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 9бо, ххмії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ), ххмії) ліпід містить менш ніж 1095 вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, ххмії) щонайменше 70 95 етерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п- З ТАГ, і ххіх) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
З. Ліпід за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що додатково містить один або більше стеролів іабо знаходиться у формі олії, причому вказаний ліпід містить менш ніж 10 мг стеролів/г олії, менш ніж 7 мг стеролів/г олії, від 1,5 мг до 10 мг стеролів/г олії або від 1,5 мг до 7 мг стеролів/г олії.
4. Ліпід за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що ліпід є олією виду Вгазвзіса або олією Сатвеїна заїїма.
5. Спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, притому, що жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, ш0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають са-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), та одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, в частині рослини становить 7-20 9бо, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, становить від 2 до 1695, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, становить менше 1 95, |і і) екстракцію ліпіду з частини рослини, притому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить 7- 2095, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95.
6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що екстрагований ліпід має одну або більше ознак, визначених у пп. 2-4.
7. Спосіб за п. 5 або б, який відрізняється тим, що частина рослини містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують Д12-десатуразу, 03-десатуразу або Д15-десатуразу, Дб- десатуразу, Д5-десатуразу, Д4-десатуразу, Аб-елонгазу і Д5-елонгазу, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторів, здатних спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що частина рослини має одну або більше, або всі з наступних ознак: ї) А12-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 60 95, ії) »3-десатураза перетворює 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 65 95, ії) ДАб-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 30 95, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітин рослини з ефективністю менш ніж 5 95, м) Дб-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 60 95, мі) Д5-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 60 95, мії) Д5-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 80 95, мії) Д4-десатураза перетворює ДПК на ДГК в одній або більше клітин рослини з ефективністю щонайменше 80 95, їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК в одній або більше клітин частини рослини становить щонайменше 10 95, х) ефективність перетворення ЛК на ДГК в одній або більше клітин частини рослини становить щонайменше 15 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДГК в одній або більше клітин частини рослини становить щонайменше 17 95, хії) одна або більше клітин частини рослини містять щонайменше на 15 95 більше 03 жирних кислот, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Аб-десатураза переважно здійснює десатурацію а-ліноленової кислоти (АЛК) відносно лінолевої кислоти (ЛК), хім) Аб-елонгаза також має активність Л9-елонгази, хм) Д12-десатураза також має активність А15-десатурази, хмі) Аб-десатураза також має активність Ав8-десатурази, хмії) Ф3-десатураза також має активність Д15-десатурази десатурацію ЛК, хмії) о3-десатураза здійснює десатурацію ЛК і/або ГЛК, хіх) Фо3-десатураза переважно здійснює десатурацію ГЛК щодо ЛК, хх) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК в частині рослини щонайменше 10 95, ххі) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК в частині рослини щонайменше 15 95, ххії) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК в частині рослини щонайменше 17 95, ххії) одна або більше, або всі десатурази мають вищу активність на субстраті ацил-КоА, ніж на відповідному субстраті ацил-ФХ (адилфосфатидилхолін), ххім) Дб-десатураза має вищу активність ДЛб-десатурази відносно АЛК, ніж ЛК як жирнокислотного субстрату, ххм) Аб-десатураза має вищу активність Дб-десатурази відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 51-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмі) Аб-десатураза має щонайменше в 2 рази вищу активність Аб-десатурази, щонайменше в З рази вищу активність, щонайменше в 4 рази вищу активність або щонайменше в 5 разів вищу активність відносно АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК, ххмії) Дб-десатураза має вищу активність відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) Аб-десатураза має щонайменше в 5 разів вищу активність лб-десатурази, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххіх) десатураза є Попі-епа десатуразою,
ххх) Дб-десатураза не має активність Д5-десатурази, яка могла б бути виявленою, відносно
ЕТК.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 5-8, де одна або більше з наступних ознак; ї) екзогенні полінуклеотиди ковалентно сполучені в молекулу ДНК, переважно молекулу Т-ДНК, інтегровану в геном клітин частини рослини, причому кількість таких молекул ДНК, інтегрованих в геном клітин частини рослини переважно становить не більше однієї, двох або трьох, або становить дві або три, і) загальний вміст олії в частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше 40 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, у якій відсутні екзогенні полінуклеотиди, ії) ліпід знаходиться у формі олії, переважно олії з насіння олійної культури, причому щонайменше 90 мас. 95 ліпіду складають триацилгліцероли, їм) який додатково включає обробку ліпіду для підвищення рівня ДГК у відсотковому вираженні від загального вмісту жирних кислот, переважно обробка являє собою переетерифікацію.
10. Клітина рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують один з наступних наборів ферментів: ї) | А12-десатураза, о3-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ім) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, ДЛ4-десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ДЛо9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) А12-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9У-елонгаза і Д5-елонгаза, або мії) Д12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, і, при цьому, кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторів, які здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині, де ліпід визначений в будь- якому з пп. 1-4.
11. Трансгенна рослина, яка містить клітину за п. 10.
12. Рослина олійної культури, що містить: а) ліпід в насінні, причому ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один з наступних наборів ферментів: ї) А12-десатураза, грибкова 03-десатураза та/або грибкова Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5- десатураза, Л4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або її) Д12-десатураза, грибкова ю03-десатураза та/або грибкова Л15-десатураза, Дв-десатураза, Д5- десатураза, Л4-десатураза, Ло9-елонгаза і Д5-елонгаза, притому, що кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше специфічних для насіння промоторів, здатних спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК),, і ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить 7-20 9о, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить від 2 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить менше 1 95.
13. Рослина за п. 12, яка відрізняється тим, що одна або більше наступних ознак стосуються ї) рослина є рослиною рапсу, Сіусіпе тах, Сатеїїнпа заїїма або Агабідорвзізв ІНаїЇапа, ії) одна або більше десатураз здатні використовувати субстрат ацил-КоА, ії) зібране в процесі збору урожаю, зріле насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше 28 мг на грам насіння.
14. Частина рослини, яка походить з рослини за будь-яким з пп. 11-13, яка містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують один з наступних наборів ферментів: її А12-десатураза, о3З-десатураза або А15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, А4- десатураза, Аб-елонгаза і А5-елонгаза, ії) оз-десатураза, Аб-десатураза, Ад5-десатураза, л4-десатураза, Аб-елонгаза і А5-елонгаза, ії) АТ5-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, л4-десатураза, Аб-елонгаза і А5-елонгаза, їм) А12-десатураза, Аб- десатураза, Ал5-десатураза, л4-десатураза, Аб-елонгаза і А5-елонгаза,
м) о3-десатураза, лв-десатураза, А5-десатураза, л4-десатураза, Л9У-елонгаза і Ал5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Ав-десатураза, л5-десатураза, л4-десатураза, д9У-елонгаза і А5-елонгаза, мії) А12-десатураза, Ав-десатураза, А5-десатураза, л4-десатураза, ЛУ-елонгаза і А5-елонгаза, або мії) А12-десатураза, о3-десатураза або А15-десатураза, А8-десатураза, А5-десатураза, А4- десатураза, д9-елонгаза і А5-елонгаза, і, при цьому, кожний полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторів, які здатні направляти експресію вказаних полінуклеотидів в клітині.
15. Частина рослини за п. 14, яка являє собою насіння.
16. Спосіб одержання насіння, який включає: а) вирощування рослини, яке продукує частину рослини за п. 14 або 15, або рослина за будь- яким з пп. 11-13, б) збір урожаю насіння рослини або рослин.
17. Макуха, одержана з насіння за п. 15, де макуха містить ліпід, який містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, об жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 53 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше зі стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) ії ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить 7-20 905, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95, з отриманням таким чином етилових ефірів.
18. Спосіб одержання корму, який включає змішування одного або більше з ліпіду або олії за будь-яким з пп. 1-4 щонайменше з ще одним поживним інгредієнтом.
19. Спосіб одержання корму, який включає змішування насіннєвої макухи за п. 17 щонайменше з одним іншим поживним інгредієнтом.
20. Спосіб лікування або попередження стану, при якому ПНЖК чинять сприятливу дію, причому вказаний спосіб включає введення суб'єкту ліпіду або олії за будь-яким з пп. 1-4, в якому стан являє собою серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, каміння в нирках, СНІД, розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плідний алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіцит уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодистрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легень, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втому після вірусних інфекцій або захворювання очей.
21. Спосіб одержання етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає переетерифікацію триацилгліцеролів в екстрагованому рослинному ліпіді, який відрізняється тим, що екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти в етерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 006 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить 7-20 9б, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95, з одержанням в такий спосіб етилових ефірів.
ЗЦетилеКаА ге сдлжфжнннк ВА що ння мапонеькоА пики я, ! 1: 12 дес І І : я ! дення УКОКОДЯІВКІ ян, ! н 0 нн Ва ВАІ ЛЮ / лазделайвіклю ти
( . І бе : в х Ав део | п : зу що : зозАТьМ ЗОЗАВЛЯДНЮ 000 йду Ялевзазияодю о оОзАТЕЯТЯ це ! рак : дво | не ши ОМА ЯЛІТИАРЮ подав ТЛад яю ж Ме в В, я БАБА ЛАДИ ВИЮ я ше І ськ ело І ди вла ЗЗБКЛІВЗЕЛОДИКІ яння зала що да дес | | ! | дес збо ЗВО ДСК е-- два е ВВ Ва зб зхиємення Н Русов Роже ГМО ВАК Я Маша оо йаю | Вдуе- МАО | Ріс | і 1 ї і / 1 Й щі ТЕ» МОЄ Квант об сей сив у ся! Ме і ЩО РО» РОБИ І ой о СИН МИ ОЗ ФІГ 2
НО Руйо- аб РриеаеЕ Боб а12О. Міль РіфечоЗо Рдуча ОЇ Рама ВАЯ 8 І Її Н І і ев яв зі арії іх хі ще ще ня їе я лі ог лі. : ве З я ЗВ ЗР; тех їх ож її ее я Ов, і, Тв-ж лоб со 0705 Я ов, МО А с 05 105 ВО ОРРІ ТА ЩА БАБІ ОРІ КАЕЇ БОМ
ФІГ. З зв аск АЮ ВіграчазО МРТ ! | Міери-А6О | | ї В Я х ін Б Б я КУ г гу т хх У ТЕ МО / Пій / ; МО5 А МО | МО Он М АБО еИТСОРО ВІ
ФІГ. 4
Жов дО а ОО : ж ЩЕ ш : . г ж ж Косі Н г. 7 а : з гЯ « б ві» і и не зн нення о : Е, ЕЗ ї
Б. 5 і - : і ад п Б. і пав : м г: З ШЕ о і | 4 04 - ря У с : й їй : ж ТЗ то «у ва б йо. ва, й жа ВІВ, са тріа Табу Ту Свідтвіа т ві Покоління Агабіаорзів То і 3 Вміст опи (мас/мас.) проти вмісту ДГК у транстевному: насінні Агабідорзів пайапа «їз Її -- їм Б : ше ЩЕ ШЕ. ши ше ще Ж ж щ ше шишше сли що ще шк ще шк нн ше в щої ве я Я І Св ші щі що що ші я шк щі шк ші що ше сжш ше шк що же шк ши ше шк ше й того у й 75 В КУ Я 3 ті 35 «хх гл за ГК від загальних жирних кислоті ко ОВ п КК ОК В ВО о о о ов в во в но сов па БО ПО М ВН я ПО в М ОО КО ОО В ОО ОО ОК КО М жан В пе о о в в я Ме ОБ ОМ А п ОО о М а я шх ОО ОБО ОХ ОО В В М М І МОХ ща ОО п. МОХ ОХ м ОО оо ов о я М В їх о а о о ЕМО В Ко БМ а М М МО о с Ми по Я я ші Мо М М МОМ М М НН я З Ох ОО с о в в М о ОО в ек ОО п о
ФІГ. 7 нн нн а а а а тя по. 1 Щ дк
Бк. -" я В : о ї ! т : Ех ї яко я в . ї х ие як «й ФОсіягі Площа піху Коож щи їж шк ВХ зо ж ке я Й І й пе Ше: чу «ца во саязнз| Площа піку З Я ве - Ф Е є ші Ше - Діняна (сля Є рев ос пі Є А в с н 3 я ЗД дня Я ПАЙ рт шення тн ння Площа піку 8 ! йо а, щі і я- : що ек - Лінійна (ст ЗАЗ і ЕЕ 5 бе» МПлощеасліку. ; і В но Я : х. Ї : а Я й ку ! ще зь Я з А ї 7 а З у ї5 б з 16 ва ТВ: 199 (олеїнова кислоти у загальних жирних кислотах) З
ЧІГ. 8
Кок А і т Ж. Дгбальфа ДІЄесета : й щ 4 й ті з - І і : А ще ГАНОООЗ щи і тА ва ня й Мая кадети ки прти Мн ут тя Ї кер милюнй Й Ї ї ! - З нн нн нн нн в 1 їгІй ах яд 375 ТЕАя. в З503х 114 ші 8 Й (пропроміле) Н ДК альфа доні 1 А ДЕК бета й й 4 СД ТоокикейчА, ча х : ; з - ре сх х ПачЙ Е со: НАИЧННИ А х 54 ; 7 Канн Ми им У очей сті Туди і питне ветян ор і - з. зкук 179 1525; ТА У Кл ЗЖАК т тя те (пропроміле)
ФІГ. 9 ! І Е. ВО0О0 005 фентттттятттттттенттттяття в. птн нн п ! в : І. й й АС й ав НІЙ Я й Я Мейо сей Й сосю сю о ст. побое ж я б от ою дов обо З В ою тов о жоФфОя р: нов я НК ІК ЛИ В я Вт сх З Есе ВУ Де В се Я с НИ чи се ВК ні сої у с) сс сеї б ка й со я Я в ши чн пн с п о п о У п п о С он ИН с п и о р а ж З п З м З п р В з м С В Я йо шо оз що о о в-во я я ща ом оо с Ве с І с Я ес
ФІГ. 10
ВВ 0 РугеабЕ Місро-АБО раза МРТ ІВ ши шу Ба щі ! У і , "Ід Тед іеоій х 1аціо Ма я РО З ОН З 35552 ФІГ, 11 ЗОБ-М-кіндеяни в а ікстрон са З ЗФфБ-М-кінцевий ї ї сималсекреції Х інтрон каталавия к ї ВК термінатюю БизцеЙРІ прометар ХО ї РОД ЕДНК ліва межа МОВ Термінатор ОХ ла ів о ВОВИХ насміцин фосфетранофервав й о с ейеуфапрометх го т бе небміцин-канвійсин фосфотранеферазия тиру Й; У Ко Моб термінатор ої. й ще на ріРОЯ чор ку ш-о СЕ ча 14551 пера зонию і Яся як піде сват ДОМ чи В сх Т-ДЕК права: маже ша Я Й кош -х ух "МОВ термінатор сте ШАХ ЖвавенУ у ХХ ТАМ лідер Чим лідвю АГА і; У ВИ промотор 1 У х ї х совзурнал ВІЗУ ва УТА обернезий (спейсер) : АКТ. МЕоССМтва БО (необов'язкавий).
ФІГ. 12
2 о Ой в насінні ТО : " ч Значення, й | Н жо щерізко відхиляються ТОБ Я . Шк І ; ЗРООСВФх процентийь ї. 195 ЩІ | | вк кое 71еВ прецентиль. Бе | | - ня ї т я Медіана в 5 ї І : І ПН бдпрацентиль Е- я | - ї. ії Ка я ! , , . 1. Зб-й процентиль о во. ра рів ЗВЕЛИ БРІМО без УВЕ Середнє значення для 20:43 насіння Т2 14 в. 2 Б їо Ф ва І х . т с ч я ? - -е 5 хх роті Е з м с - 2 о Й й 7 ро 938 аз ЗБ? ЕВБУЗ Без уба ту. 20:2 в. насінні т Із й в Й зи В : Е : тоЯ - в ши ншш ї пише ши ши ше пише ши а Ще кВ ши ше і і ся . й : о " х й во роя от З55У5 ЕР? Без УР
ФІГ. 15 За 4 в насінні ТА во ст пеня чне ооннн інн 40 ЕЕ | ! к є я Кві В зо , Е х й й Ж ж Н Ж В: ї й 8 : : ! ї Ї шою шт! 5. Н в. шини З пи, пи і: з Я . : ї во рав вта З5БЛа БРІМЬ вва удР
ФІГ. 16
Середне значення для 204 в насінні Та Що м їм в. їі ї . Ф я а в Фе 8 СВЙ ї В ле З а і 0-х й малини мит го 238 вш ЗБ КРЕМУ Безуде
ФІГ. 17 чо ще в насінні Т4 30 - ще і - й Ж о8О суя т І : ж щ : ло ! і ш 5 і І ! Ф | -Е. «З і є шк що рення і : ; ІВ з ж я РО рзв різ ЗБ Ма ЕР'Ме Ббезувр
ФІГ. 18
А) 18 І ше і тв ! у 2 ї5 щи д ї1 б фр яв «АВ и р но ї Е брде хопестан ЯВеоОто у В) син ря як т і 4 | | Г я дет Ж ит - ' в нн а я І дО «КА хампестерой - ситостерся : ; 7 й і ; В хе т ре ка ри | Ки ще т й ! ВКА і Клея каш й брасікастероя 3274 стигмастервя 270 авенастероя !
ФІГ. 19 тиенціх ї х В т й у Зх Б ї щі ї х Ся З г У Е си з. Сл іч З ї Ж З я В х в) Я сх Ж 7 й з й Її Я я щі я, у я Я й . е - «Е Кай од ря й з с й Я З, : я Б й й й со 7 й й і т І й с Бей й и яке ПИ т й . і / р й ка века ооо і д й ет . сама НЕ 25 лоні то кА х в и З ще и її т т у. і Кость, сн М Н Шин дян х Уж ше вант ра Мей охо Ша ен й р р с ин йо Шк «Кк: й " - ук й ? га ке м я й те НИ . Ж а, рої о Я: ж Й й | х ще и сві, Щи г й ! І х У т Те, ке й і І у х ше й й Я : х Б І Що з й й Н : у х ки Ж / і А х ї ; ; ! Я х, те й й І ї З - й до / : " Е ть 2 і ї : Б чу, щ ж У з 7 4 гЯ з З я Є їж ї Х м З Є У з І З 4 їй т К У х їх 5 з Е у і 5 х х КЯ з,
ФІГ. 20
: й ї о - кій лях З з г кова же как ФЛ Фуко у, В НЕК т Канеді ї ; ЯК І щ- зкевожийсюкию п А рек Ме ких ; ій й КВ пий . Я х ТедАгі х я с . г | Й Ферменти) шк и Я сшшее ОА
UAA201500277A 2012-06-15 2013-06-14 Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині UA117223C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261660392P 2012-06-15 2012-06-15
US201261663344P 2012-06-22 2012-06-22
US201261697676P 2012-09-06 2012-09-06
US201361782680P 2013-03-14 2013-03-14
PCT/AU2013/000639 WO2013185184A2 (en) 2012-06-15 2013-06-14 Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA117223C2 true UA117223C2 (uk) 2018-07-10

Family

ID=49756497

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201803576A UA127917C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот
UAA201500277A UA117223C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201803576A UA127917C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот

Country Status (26)

Country Link
US (16) US8816111B2 (uk)
EP (2) EP2861059B1 (uk)
JP (3) JP6242882B2 (uk)
KR (2) KR102197208B1 (uk)
CN (2) CN104853596B (uk)
AU (4) AU2013273934B2 (uk)
BR (2) BR122019026149A8 (uk)
CA (2) CA2876519C (uk)
CL (2) CL2014003402A1 (uk)
DK (1) DK2861059T3 (uk)
EA (1) EA036786B1 (uk)
ES (1) ES2636487T3 (uk)
HK (2) HK1209581A1 (uk)
HU (1) HUE033766T2 (uk)
IL (1) IL236288A (uk)
MX (1) MX349678B (uk)
MY (1) MY187101A (uk)
NZ (1) NZ631702A (uk)
PE (2) PE20150769A1 (uk)
PH (1) PH12014502795A1 (uk)
PL (1) PL2861059T3 (uk)
PT (1) PT2861059T (uk)
SG (2) SG11201408362SA (uk)
UA (2) UA127917C2 (uk)
WO (1) WO2013185184A2 (uk)
ZA (1) ZA201500015B (uk)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
BR122019013200B1 (pt) 2004-04-22 2022-04-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polinucleotídeo isolado, vetor, célula microbiana recombinante capaz de sintetizar ácido (s) graxo(s) poliinsaturado(s) de cadeia longa, método para produção da referida célula microbiana recombinante, método para produção de ácido(s) graxo(s) poliinsaturado(s) de cadeia longa, método para produção de óleo, método para produção de semente oleaginosa, extrato de semente transgênica, composição, ração e uso da referida célula recombinante, vetor ou extrato
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
US20110126325A1 (en) * 2008-04-25 2011-05-26 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CA3015426C (en) 2008-11-18 2020-01-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant cells comprising exogenous .delta.5 and .delta.6 desaturases, .delta.5 and .delta.6 elongases, and .delta.4 desaturases
AU2010272536B2 (en) 2009-07-17 2016-09-08 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
CN104853596B (zh) * 2012-06-15 2018-10-09 联邦科学技术研究组织 在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸
JP2016502852A (ja) * 2012-12-21 2016-02-01 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 乾燥細胞重量で少なくとも２８％のエイコサペンタエン酸を産生する組換え微生物細胞
KR102535223B1 (ko) * 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
US11718577B2 (en) * 2013-12-18 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids
US9752165B2 (en) * 2014-02-10 2017-09-05 Cellulosic Ethanol Technologies, Llc Processes and systems for recovering oil from fermentation products
CN113980730A (zh) * 2014-06-27 2022-01-28 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
EA037184B1 (ru) * 2014-06-27 2021-02-16 Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн Липид, содержащий докозапентаеновую кислоту
AU2015281791A1 (en) 2014-06-27 2017-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
WO2016004473A1 (en) 2014-07-07 2016-01-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing industrial products from plant lipids
WO2016075313A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Basf Plant Science Company Gmbh Materials and methods for increasing the tocopherol content in seed oil
CN105029096B (zh) * 2015-08-27 2018-08-17 广州市优百特饲料科技有限公司 一种幼禽脂肪粉及其制备方法
CN105053569B (zh) * 2015-08-27 2018-12-18 广州市优百特饲料科技有限公司 一种功能性脂肪饲料添加剂及其制备方法
AR109245A1 (es) * 2016-05-12 2018-11-14 Basf Plant Science Co Gmbh Métodos para optimizar la producción de metabolitos en plantas genéticamente modificadas y para procesar estas plantas
JP7125934B2 (ja) * 2016-06-16 2022-08-25 ニューシード ニュートリショナル オーストラリア ピーティーワイ リミテッド 同系交配の遺伝子導入キャノーラ系統ｎｓ－ｂ５００２７－４及びその種子
AU2017286800B2 (en) * 2016-06-16 2022-07-14 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Elite event canola NS-B50027-4
MX2019002483A (es) 2016-09-02 2019-09-09 Commw Scient Ind Res Org Plantas con rasgos modificados.
US10951422B2 (en) 2017-02-22 2021-03-16 CTIA—The Wireless Association Mobile message source authentication
CN107114369B (zh) * 2017-03-24 2020-01-21 浙江大学 植物磺肽素-α在提高植物灰霉病抗性中的应用
KR101976468B1 (ko) * 2017-11-30 2019-05-10 주식회사이맥솔루션 요소수 점적 결정법을 이용한 고산가 유지 폐자원 활용 고순도 불포화 지방산 메틸 에스테르의 제조방법
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
CN108315394A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 沈阳师范大学 甜高粱蔗糖合成酶基因的表达检测方法及扩增引物
ES2816008T3 (es) 2018-04-25 2021-03-31 Nuseed Pty Ltd Composiciones de ácidos grasos poliinsaturados enriquecidas en DHA
CN112165864A (zh) * 2018-04-25 2021-01-01 纽希得私人有限公司 Dha富集的多不饱和脂肪酸组合物
CN108452156A (zh) * 2018-05-02 2018-08-28 郭书安 一种治疗冠心病的口服液
EP3586642A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Ala enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586643A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586640A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586641A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
US12037652B2 (en) 2018-09-11 2024-07-16 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Methods of identifying DHA Canola NS-B50027-4
EP3850106B1 (en) * 2018-09-11 2024-05-29 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Methods of identifying dha canola ns-b50027-4
KR102216753B1 (ko) * 2018-11-27 2021-02-17 주식회사이맥솔루션 팜유 또는 동물성 폐유지를 이용한 고순도 불포화 지방산 메틸 에스테르 제조방법
CN109796328B (zh) * 2019-03-14 2022-03-25 浙江工业大学 一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法
CN114599224B (zh) * 2019-08-26 2023-12-08 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 芥菜品系nubj1207
CN110476816B (zh) * 2019-09-29 2022-10-14 西南大学 一种快速获得葡萄桐幼苗的方法
AR122331A1 (es) 2019-10-25 2022-08-31 Nuseed Pty Ltd Composiciones enriquecidas de ácidos grasos poliinsaturados
CN111235170A (zh) * 2020-01-17 2020-06-05 华中农业大学 qMYR2基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用
WO2021159036A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods of producing insect pheromones
US20240100168A1 (en) * 2020-04-17 2024-03-28 Wake Forest University Lipid compositions and methods of preparation thereof
JP7162352B2 (ja) * 2020-05-01 2022-10-28 株式会社東洋発酵 外用組成物
WO2021226242A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Nuseed Pty Ltd Aquafeed for improved fish health
IL301072B2 (en) * 2020-09-01 2024-12-01 The State Of Israel Ministry Of Agriculture & Rural Development Agricultural Res Organization Aro Vo Compositions isolated from date palm tree
CA3202599A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Johnathan Andrew Napier Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
CN112816635B (zh) * 2020-12-31 2023-08-18 绿城农科检测技术有限公司 一种黑木耳中测定脂肪酸的方法
CN114208843A (zh) * 2021-12-03 2022-03-22 浙江万里学院 一种植物生长调节剂、提高香蕉果实耐冷性的处理方法及验证方法
GB202217740D0 (en) 2022-11-25 2023-01-11 No Regrets 2050 Ltd Modified plants and plant cells

Family Cites Families (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3484155A (en) 1966-02-07 1969-12-16 Donald L Praeger Head mounted electric squint light
FR1564863A (uk) 1968-03-12 1969-04-25
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
WO1984002913A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
EP0154204B1 (en) 1984-03-06 1994-01-12 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
CA1338902C (en) 1986-02-27 1997-02-11 Howard M. Goodman Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
MA20977A1 (fr) 1986-05-19 1987-12-31 Ciba Geigy Ag Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
JPH05501352A (ja) 1989-08-09 1993-03-18 ディカルブ　ジェネティクス　コーポレイション 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物
ES2163392T3 (es) 1990-03-16 2002-02-01 Calgene Llc Nuevas secuencias expresadas preferentemente en el desarrollo de semillas precoces, y procedimientos relacionados con las mismas.
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US7135614B1 (en) 1990-08-30 2006-11-14 Cargill, Incorporated Brassica or helianthus plants having mutant delta-12 or delta-15 sequences
US5861187A (en) 1990-08-30 1999-01-19 Cargill, Incorporated Oil from canola seed with altered fatty acid profiles and a method of producing oil
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US6355861B1 (en) 1991-10-10 2002-03-12 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6683232B1 (en) 1991-10-10 2004-01-27 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
JPH07501701A (ja) 1991-12-04 1995-02-23 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
AU673359B2 (en) 1992-05-15 1996-11-07 Sagami Chemical Research Center Gene which codes for eicosapentaenoic acid synthetase group and process for producing eicosapentaenoic acid
US5798259A (en) 1992-05-15 1998-08-25 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US5683898A (en) 1992-05-15 1997-11-04 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
WO1994019930A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 National Research Council Of Canada Enhanced regeneration system for cereals
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
DE4435392B4 (de) 1994-10-04 2008-02-07 Immuno Ag Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
AU6547496A (en) 1995-07-28 1997-02-26 Henkel Corporation Polyester oligomer acrylates
AU750363B2 (en) 1997-06-12 2002-07-18 Cargill Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
US7541519B2 (en) 1995-12-14 2009-06-02 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
US6342658B1 (en) 1995-12-14 2002-01-29 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
WO1997021340A1 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Cargill, Incorporated Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles
HUP9902123A3 (en) 1996-06-21 2002-01-28 Monsanto Technology Llc St Louis Methods for the production of stably-transformed, fertile wheat employing agrobacterium-mediated transformation
EP0913473A4 (en) 1996-07-10 2000-12-06 Sagami Chem Res METHOD FOR PRODUCING EICOSAPENTIC ACID BY GENETIC RECOMBINATION
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
WO1998018952A1 (fr) 1996-10-30 1998-05-07 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Procede de production de matieres grasses contenant des acides gras hautement insatures contenant eux-memes un acide docosahexaenoique a concentration selective
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
AT406373B (de) 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
DE69840022D1 (de) 1997-03-04 2008-10-30 Suntory Ltd Verfahren zur herstellung von hochungesättigten fettsäuren und hochungesättigte fettsäuren enthaltendes lipid
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6075183A (en) 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
PT1598422E (pt) 1997-04-11 2013-04-03 Abbott Lab Métodos e composições para síntese de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa em plantas
US6051754A (en) 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
WO1998055625A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Calgene, Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
WO1999005265A2 (en) 1997-07-23 1999-02-04 Sanford Scientific, Inc. Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance
US5912416A (en) 1997-08-05 1999-06-15 California Oils Corporation Safflower products with very high levels of unsaturated fatty acids
WO1999014314A1 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulation of gene expression in plants
CA2305628C (en) 1997-09-30 2008-08-26 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
US20030152983A1 (en) 1997-12-23 2003-08-14 University Of Bristol Desaturase
CN1283230A (zh) 1997-12-23 2001-02-07 布利斯脱大学 去饱和酶
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
US6838594B1 (en) 1998-03-20 2005-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
EP2006385A3 (en) 1998-03-20 2008-12-31 E.I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
US6492108B1 (en) 1998-03-26 2002-12-10 Incyte Genomics, Inc. Delta-6 desaturase homologs
AU4544799A (en) 1998-05-29 1999-12-13 Ohio University Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
AU4564399A (en) 1998-06-12 1999-12-30 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
DE69937050T2 (de) 1998-06-12 2008-05-29 Calgene Llc, Davis Polyungesättigte fettsäuren in pflanzen
JP2002523048A (ja) 1998-08-20 2002-07-30 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素の遺伝子
WO2000011012A1 (en) 1998-08-24 2000-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Synthetic fatty acid desaturase gene for expression in plants
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
WO2000020603A1 (en) 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
WO2000020602A2 (en) 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
US6609661B1 (en) 1998-10-06 2003-08-26 Kabushiki Kaisha Nippon Conlux Bank-note processing device
WO2000021557A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Merck & Co., Inc. Delta 6 fatty acid desaturase
JP4182192B2 (ja) 1998-11-26 2008-11-19 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子
US6864077B1 (en) 1998-12-03 2005-03-08 Edgar B. Cahoon Membrane-bound desaturases
JP2001095588A (ja) 1998-12-04 2001-04-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth 緑藻のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びその利用
US6825017B1 (en) 1998-12-07 2004-11-30 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7271315B2 (en) 1999-01-14 2007-09-18 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US20070244192A1 (en) 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
WO2000052183A1 (en) 1999-03-05 2000-09-08 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
EP1035207A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 MultiGene Biotech GmbH cDNA molecules of the members of gene family encoding human fatty acid desaturases and their use in diagnosis and therapy
CA2365096A1 (en) 1999-03-18 2000-09-21 The University Of Bristol Polyunsaturated fatty acid (pufa) elongase from caenorhabditis elegans
AU776447B2 (en) 1999-06-07 2004-09-09 Basf Plant Science Gmbh Delta6-acetylenase and delta6-desaturase from ceratodon purpureus
CA2378423A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Basf Plant Science Gmbh Plants expressing .delta.6-desaturase genes and oils from these plants containing pufas and method for producing unsaturated fatty acids
AU6091600A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Ohio University Mammalian cells expressing desaturases and elongases
JP3648134B2 (ja) 1999-07-13 2005-05-18 Ａｂｂ株式会社 自動塗装装置
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
ATE383433T1 (de) 1999-08-26 2008-01-15 Calgene Llc Pflanzen mit veränderten mehrfachungesättigten fettsäuren
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
EP1214418B1 (de) 1999-09-10 2008-03-05 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients GmbH Nukleinsäure aus tetrahymena kodierend fuer eine delta 6-desaturase, ihre herstellung und verwendung
FR2798391B1 (fr) 1999-09-15 2001-12-14 Inst Nat Sante Rech Med Enzyme thyroidienne nadph oxydase, acide nucleique codant pour cette enzyme et leurs applications
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
JP4221476B2 (ja) 1999-11-19 2009-02-12 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻
EP1232274B1 (en) 1999-11-22 2010-03-10 Plant Bioscience Limited Enhanced transgene expression by co-expression with a suppressor of post-transcriptional gene silencing (ptgs)
US6620986B1 (en) 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
AU1499601A (en) 1999-11-25 2001-06-04 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patents encoding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids
JP2001169780A (ja) 1999-12-15 2001-06-26 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti ドコサヘキサエン酸生産細菌の遺伝子
GB9929681D0 (en) 1999-12-15 2000-02-09 Implyx Ltd Transgenic insect
GB9929897D0 (en) 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
US20030172398A1 (en) 1999-12-21 2003-09-11 Browse John A. Novel delta-12 desaturase and methods of using it for synthesis of polyunsaturated fatty acids
WO2001059128A2 (de) 2000-02-09 2001-08-16 Basf Aktiengesellschaft Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
US6686185B1 (en) 2000-03-07 2004-02-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25934, a novel fatty acid desaturase and uses therefor
US7411054B2 (en) 2000-03-07 2008-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US20040157221A9 (en) 2000-03-07 2004-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US6492577B1 (en) 2000-03-16 2002-12-10 The Regents Of The University Of California Leafy cotyledon2 genes and their uses
WO2002000859A2 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 46508, a novel human peptidyl-trna hydrolase family member and uses thereof
WO2001073060A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18221, dual specificity phosphatase and uses thereof
CA2301158A1 (en) 2000-03-24 2001-09-24 Stephen J. Allen Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease
WO2001075069A1 (fr) 2000-03-31 2001-10-11 Idemitsu Petrochemical Co., Ltd. Procede de production de lipides et micro-organismes secretant des lipides
ES2349892T3 (es) 2000-04-18 2011-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Procedimiento de modificación del contenido de aceite de semilla de algodón.
US7091005B2 (en) 2000-05-16 2006-08-15 Merck & Co., Inc. Gene responsible for Stargardt-like dominant macular dystrophy
WO2001087140A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Crosetto Dario B Method and apparatus for anatomical and functional medical imaging
AU2001263360A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 50365, a hexokinase family member and uses thereof
AU2001263473A1 (en) 2000-05-26 2001-12-11 Washington State University Research Foundation Palmitate desaturase gene
WO2001096363A1 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Boyce Thompson Institute For Plant Research Fatty acid desaturase gene and protein for modulating activation of defense signaling pathways in plants
EP1297155A2 (en) 2000-06-29 2003-04-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof
EP1354049A2 (en) 2000-07-17 2003-10-22 Millenium Pharmaceuticals, Inc. 16816 and 16839, human phospholipase c molecules and uses therefor
GB0316629D0 (en) 2003-07-16 2003-08-20 Univ York Transgenic cell
EP1339839A2 (en) 2000-08-21 2003-09-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human transporter family members and uses thereof
WO2002026944A2 (en) 2000-09-26 2002-04-04 Xenon Genetics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS EMPLOYING A NOVEL STEAROYL-CoA DESATURASE-hSCD5
WO2002026946A2 (en) 2000-09-28 2002-04-04 Bioriginal Food & Science Corporation Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
EP1435000A2 (en) 2000-11-27 2004-07-07 Focus Technologies, Inc. Functional protein expression for rapid cell-free phenotyping
EP1341920A2 (en) 2000-11-29 2003-09-10 Xenon Genetics, Inc. Human elongase genes and uses thereof
DE10102338A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
CA2435685C (en) 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10106660A1 (de) 2001-02-12 2002-08-29 Celanese Ventures Gmbh Verfahren zur Herstellung von gamma-Linolensäure aus einer Ciliaten-Kultur durch Zusatz geeigneter Vorläufermoleküle zu dem Kulturmedium
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
WO2002081702A1 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Idemitsu Technofine Co., Ltd. Fatty acid δ6-position desaturase genes and plasmids and tra nsformant containing these genes
TWI324181B (en) 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
TWI426126B (zh) 2001-04-16 2014-02-11 Dsm Ip Assets Bv 多不飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）聚乙醯合成酶系統及其用途（二）
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
US20030082754A1 (en) 2001-05-04 2003-05-01 Pradip Mukerji Delta4 - desaturase genes and uses thereof
WO2002092540A1 (en) 2001-05-14 2002-11-21 Martek Biosciences Corporation Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsatruated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
CA2680376C (en) 2001-06-06 2016-11-15 Bioriginal Food & Science Corporation Flax (linum usitatissimum l.) seed-specific promoters
DE10134660A1 (de) 2001-07-20 2003-02-06 Basf Plant Science Gmbh Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
US20050089879A1 (en) 2001-07-31 2005-04-28 Ivo Feussner Method for producing arachidonic acid in transgenic organisms
US6875595B2 (en) 2001-09-13 2005-04-05 Divergence, Inc. Nematode fatty acid desaturase-like sequences
JP2003116566A (ja) 2001-10-12 2003-04-22 Osamu Suzuki ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法
CA2474163C (en) 2002-01-30 2012-04-17 Basf Plant Science Gmbh Novel elongase gene and method for producing polyunsaturated fatty acids
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
US7700833B2 (en) 2002-03-01 2010-04-20 Cornell University Process for the production of unsaturated fatty acids
AU2003224236A1 (en) 2002-03-16 2003-09-29 The University Of York Transgenic plants expressing enzymes involved in fatty acid biosynthesis
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
WO2003099216A2 (en) 2002-05-22 2003-12-04 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from fungi
CA2490771A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods
WO2004005442A1 (de) 2002-07-03 2004-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten fettsäuren mit mindestens zwei doppelbindungen in pflanzen
IL166241A0 (en) 2002-07-29 2006-01-15 Rigel Pharmaceuticals Inc Method of treating or preventing autoimmune diseases with 2,4-pyrimidinedinediamine compounds
MXPA05001829A (es) 2002-08-12 2005-05-27 Monsanto Technology Llc Metodos para aumentar el contenido de aceite de las plantas.
AU2003259930A1 (en) 2002-08-19 2004-03-03 Anderson Power Products A handle locking system for electrical connectors and methods thereof
DE10246125A1 (de) 2002-10-01 2004-04-15 Aventis Behring Gmbh Konzentrat eines Faktor VIII:C-haltigen von-Willebrand-Faktors und das dazu gehörige Verfahren
ES2525212T3 (es) 2002-12-19 2014-12-19 University Of Bristol Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
ATE517984T1 (de) 2003-02-27 2011-08-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
CA2520795C (en) 2003-03-31 2015-06-23 University Of Bristol Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids
DE10315026A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Bioplanta Arzneimittel Gmbh Zusammensetzungen enthaltend omega-3-fettsäurehaltige Öle und Pflanzenextrakte
MXPA05010571A (es) 2003-04-08 2005-11-23 Basf Plant Science Gmbh Delta-4-desaturasas a partir de euglena gracilis, que expresan plantas y aceites que comprenden pufa
US20060206961A1 (en) 2003-04-16 2006-09-14 Basf Plant Science Gmbh Use of genes for increasing the oil content in plants
US8313911B2 (en) 2003-05-07 2012-11-20 E I Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) * 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US20110059496A1 (en) 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
US7208590B2 (en) 2003-07-15 2007-04-24 Abbott Laboratories Genes involved in polyketide synthase pathways and uses thereof
PT2172536T (pt) 2003-08-01 2016-08-17 Basf Plant Science Gmbh Processo para a produção de ácidos gordos poli-insaturados em organismos transgénicos
ATE430802T1 (de) 2003-08-21 2009-05-15 Monsanto Technology Llc Fettsäuredesaturasen aus primula
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
WO2005047479A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
MY140210A (en) 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
US7572464B2 (en) * 2004-01-30 2009-08-11 Bionovate Limited Solvent extraction of lipids such as essential fatty acids
ATE515567T1 (de) 2004-02-17 2011-07-15 Univ York Desaturase-enzyme
EP4219670A3 (de) 2004-02-27 2023-08-09 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen pflanzen
ES2375363T3 (es) 2004-02-27 2012-02-29 Basf Plant Science Gmbh Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos.
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
DE102004017369A1 (de) 2004-04-08 2005-11-03 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Screeningverfahren zur Identifizierung von PUFA-PKS in Proben
ES2541537T3 (es) 2004-04-16 2015-07-21 Monsanto Technology, Llc Expresión de desaturasas de ácido graso en maíz
CN103451246B (zh) * 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
CN101018862B (zh) * 2004-04-22 2013-10-09 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
AU2005235627B2 (en) 2004-04-22 2011-07-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
BR122019013200B1 (pt) 2004-04-22 2022-04-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polinucleotídeo isolado, vetor, célula microbiana recombinante capaz de sintetizar ácido (s) graxo(s) poliinsaturado(s) de cadeia longa, método para produção da referida célula microbiana recombinante, método para produção de ácido(s) graxo(s) poliinsaturado(s) de cadeia longa, método para produção de óleo, método para produção de semente oleaginosa, extrato de semente transgênica, composição, ração e uso da referida célula recombinante, vetor ou extrato
AU2005250074B2 (en) 2004-06-04 2011-04-14 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
BRPI0512481A (pt) 2004-06-25 2008-03-11 Du Pont polinucleotìdeo isolado, polipeptìdeo, construção recombinante, célula, yarrowia sp.transformada, métodos para transformar uma célula, produzir uma planta transformada, produzir levedura, produzir ácidos graxos poliinsaturados e produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturados, sementes, óleos, plantas de sementes oleaginosa e alimentos ou rações
DE102004060340A1 (de) 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
JP4587451B2 (ja) 2004-08-20 2010-11-24 サントリーホールディングス株式会社 ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの利用
DE102004044421B4 (de) 2004-09-14 2010-06-24 Biotest Ag Verfahren zur Trennung eines von Willebrand Faktors mit einer spezifischen VWF-Aktivität von wenigstens 50 E/mg VWF-Antigen von einem von Willebrand Faktor mit niedriger Aktivität und Verwendung von Hydroxylapatit dafür
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20060094102A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7192762B2 (en) 2004-11-04 2007-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina glycerol-3-phosphate o-acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
AU2005315358A1 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Avesthagen Limited Recombinant production docosahexaenoic acid (DHA) in yeast
DE102004063326A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102004062294A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
NZ563676A (en) 2005-05-23 2011-01-28 Arcadia Biosciences Inc Safflower with elevated gamma-linolenic acid
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
WO2007005882A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 North Carolina State University Methods and compositions for expressing proteins in plants
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
US7645604B2 (en) 2005-11-23 2010-01-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8222488B2 (en) 2006-02-03 2012-07-17 Texas A&M University System Enhancing expression of value-added genes by transgenic expression of tombusvirus-based P19 gene mutants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
MX339812B (es) 2006-03-15 2016-06-08 Dsm Ip Assets B V * Produccion de acido graso poli-insaturado en organismos heterologos usando sistemas de sintasa de policetido pufa.
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
EP2013335A2 (en) 2006-05-01 2009-01-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fungal delta12 desaturase and delta15 desaturase motifs
CA2648886C (en) 2006-05-29 2015-10-20 Icon Genetics Gmbh Plant virus-based inducible expression system
AU2007265434B2 (en) * 2006-06-28 2012-08-02 Cibus Europe B.V. Fatty acid blends and uses therefor
DE102006034313A1 (de) 2006-07-21 2008-01-24 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure
EP2500420B1 (en) 2006-08-24 2016-06-22 BASF Plant Science GmbH Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
ES2531391T3 (es) 2006-10-06 2015-03-13 Basf Plant Science Gmbh Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos
US8916361B2 (en) 2006-11-17 2014-12-23 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US7709239B2 (en) 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
RS20090413A (en) 2007-04-03 2010-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7794701B2 (en) 2007-04-16 2010-09-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2176433B1 (de) 2007-07-31 2011-10-12 BASF Plant Science GmbH Desaturasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
EP2176416B1 (de) 2007-07-31 2016-03-16 BASF Plant Science GmbH Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
WO2009017821A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Bioglow Inc. Bioluminescent plants comprising bacterial lux operon and methods of making same
US8119784B2 (en) 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
CA2722275A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
JP2011519552A (ja) * 2008-04-25 2011-07-14 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 植物種子油
EP2281051B1 (en) 2008-04-30 2015-03-11 Rothamsted Research Limited Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP2285967B1 (en) 2008-06-03 2016-12-21 BASF Plant Science GmbH Fatty acid dehydratases and uses thereof
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2318533A2 (en) 2008-07-01 2011-05-11 BASF Plant Science GmbH Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
AU2009273754B2 (en) 2008-07-21 2016-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
CA2768737A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
EP2156744A1 (en) * 2008-08-11 2010-02-24 Nestec S.A. Oil containing one or more long-chain polyunsaturated fatty acids phospholipids derived from biomass
CA2734810C (en) 2008-08-26 2018-06-19 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
CN103756972B (zh) 2008-10-14 2019-05-10 孟山都技术公司 来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用
CA3015426C (en) 2008-11-18 2020-01-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant cells comprising exogenous .delta.5 and .delta.6 desaturases, .delta.5 and .delta.6 elongases, and .delta.4 desaturases
DE112009003708T5 (de) 2008-12-12 2012-09-13 Basf Plant Science Gmbh Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
EP2443248B1 (en) 2009-06-16 2017-12-27 E. I. du Pont de Nemours and Company IMPROVEMENT OF LONG CHAIN OMEGA-3 AND OMEGA-6 POLYUNSATURATED FATTY ACID BIOSYNTHESIS BY EXPRESSION OF ACYL-CoA LYSOPHOSPHOLIPID ACYLTRANSFERASES
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
AU2010272536B2 (en) 2009-07-17 2016-09-08 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
AU2010288482A1 (en) 2009-08-31 2012-04-12 Basf Plant Science Company Gmbh Regulatory nucleic acid molecules for enhancing seed-specific gene expression in plants promoting enhanced polyunsaturated fatty acid synthesis
EP2504438A1 (en) 2009-11-24 2012-10-03 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid elongase and uses thereof
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
EP2576765A4 (en) * 2010-05-25 2013-12-18 Cargill Inc KOHLPFLANZEN FOR OBTAINING OILS WITH LOW CONTENT ON ALPHA-LINOLENIC ACID
AR083323A1 (es) 2010-06-28 2013-02-21 Commw Scient Ind Res Org Metodos para producir lipidos
CA2823678A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Kyushu University, National University Corporation Transformation of a stramenopile for production of a microbial oil
US9458477B2 (en) 2010-10-21 2016-10-04 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses thereof
JP5150814B2 (ja) * 2010-10-29 2013-02-27 オプテックス株式会社 三角測距方式の距離検出回路
TW201307553A (zh) * 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
AU2013246661B2 (en) 2012-04-12 2018-12-20 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
CN104853596B (zh) 2012-06-15 2018-10-09 联邦科学技术研究组织 在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸
CA2879154A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
AU2015281791A1 (en) 2014-06-27 2017-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid

Also Published As

Publication number Publication date
US20170349526A1 (en) 2017-12-07
PT2861059T (pt) 2017-08-08
US20180008568A1 (en) 2018-01-11
CA3082388A1 (en) 2013-12-19
CA2876519A1 (en) 2013-12-19
PL2861059T3 (pl) 2017-10-31
EP2861059B1 (en) 2017-05-03
US20170320806A1 (en) 2017-11-09
MY187101A (en) 2021-08-31
US20220356414A1 (en) 2022-11-10
MX349678B (es) 2017-08-08
JP6242882B2 (ja) 2017-12-06
JP7254744B2 (ja) 2023-04-10
US20170349527A1 (en) 2017-12-07
BR122019026149A8 (pt) 2022-06-28
CN109294730A (zh) 2019-02-01
BR112014031362A2 (pt) 2017-07-25
IL236288A0 (en) 2015-02-26
EP3266316A1 (en) 2018-01-10
CN104853596B (zh) 2018-10-09
US9999607B2 (en) 2018-06-19
WO2013185184A3 (en) 2014-02-13
CL2014003402A1 (es) 2015-12-11
ZA201500015B (en) 2016-04-28
US9556102B2 (en) 2017-01-31
AU2021269427B2 (en) 2024-08-22
SG11201408362SA (en) 2015-01-29
ES2636487T3 (es) 2017-10-05
US20200369980A1 (en) 2020-11-26
EA201590026A1 (ru) 2015-05-29
US20150045569A1 (en) 2015-02-12
CN109294730B (zh) 2021-09-21
CL2019002477A1 (es) 2019-12-06
NZ631702A (en) 2017-01-27
US20170334826A1 (en) 2017-11-23
HK1209581A1 (en) 2016-04-08
KR20200083595A (ko) 2020-07-08
SG10201810439SA (en) 2018-12-28
US20170349528A1 (en) 2017-12-07
US8816111B2 (en) 2014-08-26
HUE033766T2 (en) 2018-01-29
AU2013273934B2 (en) 2016-12-01
US9932289B2 (en) 2018-04-03
US10335386B2 (en) 2019-07-02
JP2015528027A (ja) 2015-09-24
US11834621B2 (en) 2023-12-05
KR20150037771A (ko) 2015-04-08
WO2013185184A2 (en) 2013-12-19
AU2013273934A1 (en) 2015-01-22
AU2017201411A1 (en) 2017-03-23
CA2876519C (en) 2020-09-15
MX2014015375A (es) 2016-02-18
US20130338388A1 (en) 2013-12-19
US9969954B2 (en) 2018-05-15
US20130338387A1 (en) 2013-12-19
US20210139809A1 (en) 2021-05-13
HK1248989A1 (zh) 2018-10-26
IL236288A (en) 2016-06-30
US10899992B2 (en) 2021-01-26
US9932541B2 (en) 2018-04-03
JP6784656B2 (ja) 2020-11-11
UA127917C2 (uk) 2024-02-14
US10655082B2 (en) 2020-05-19
PE20150769A1 (es) 2015-06-11
PH12014502795A1 (en) 2015-02-09
US9932290B2 (en) 2018-04-03
KR102197208B1 (ko) 2021-01-04
US20180258026A1 (en) 2018-09-13
EA036786B1 (ru) 2020-12-21
US9550718B2 (en) 2017-01-24
BR122019026149A2 (uk) 2017-07-25
US8946460B2 (en) 2015-02-03
US20240084214A1 (en) 2024-03-14
AU2017201411B2 (en) 2018-07-12
US20180311200A1 (en) 2018-11-01
US11306271B2 (en) 2022-04-19
PE20200448A1 (es) 2020-02-28
EP2861059A4 (en) 2016-03-09
AU2018247287A1 (en) 2018-11-01
DK2861059T3 (en) 2017-08-28
JP2018075003A (ja) 2018-05-17
CN104853596A (zh) 2015-08-19
BR112014031362A8 (pt) 2022-06-28
EP2861059A2 (en) 2015-04-22
US20150203788A1 (en) 2015-07-23
AU2018247287B2 (en) 2021-08-19
JP2020172643A (ja) 2020-10-22
AU2021269427A1 (en) 2021-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA117223C2 (uk) Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині
UA122768C2 (uk) Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти
JP6068800B2 (ja) オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法
UA119739C2 (uk) Метод отримання ліпідів
UA116526C2 (uk) Генетично модифікована рослина сої та олія, отримана з неї
UA116538C2 (uk) Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти
US20100064381A1 (en) Increased Phytosterol Content Through Overexpression of an Acyl-CoA Sterol Acyl-Transferase
BRPI0413786B1 (pt) vetor recombinante com atividade dessaturase e métodos de produzir óleo de semente com ácidos graxos ômega-3, de produzir ácido graxo ômega-3 e de produzir planta compreendendo óleo de semente com níveis alterados de ácidos graxos ômega-3
EA029904B1 (ru) Уменьшение содержания насыщенных жирных кислот в семенах растений
Liu et al. Cotton seed development: opportunities to add value to a byproduct of fiber production
US20120036593A1 (en) Plant Promoter Operable in Endosperm and Uses Thereof
UA120172C2 (uk) Одержання омега 3 довголанцюжкових поліненасичених жирних кислот з олійних культур при використанні синтаз pufa траустохідридів
ES2645787T3 (es) Ciertas plantas con niveles reducidos de ácidos grasos saturados o sin ácidos grasos saturados en las semillas, y aceite que se obtiene a partir de las semillas
Nitnaware et al. Genetic engineering in safflower (Carthamus tinctorius L.): Retrospect and prospect
UA73267C2 (en) Recombinant gastric lipases of dog (lgc) and human (lgh), polypeptide derivatives thereof, method for producing by plants tranformation and use thereof
US9273323B2 (en) Composition containing gene encoding ABC transporter proteins for increasing size of plant seed and content of fat stored within seed
JP6966040B2 (ja) 微細藻類中でのオメガ−３多価不飽和脂肪酸産生を増加させる方法
UA122770C2 (uk) Ліпід, що містить докозапентаєнову кислоту
US20240254500A1 (en) Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
JP2020036591A (ja) コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物、及びその製造方法、並びに植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性の判定方法
Elahi The potential of using the BnLEC1 and BnFUSCA3 genes to manipulate oil content in Brassica napus L.
Nitnaware et al. Genetic Engineering in Safflower (Carthamus tinctorius L.): Retrospect
Qi Using genetic transformation to produce enhanced levels of erucic acid and novel wax esters in Crambe abyssinica
BR112012033692A2 (pt) Métodos para produzir lipídios
Jeppsson Evaluation of two transformation protocols for Crambe hispanica subsp. abyssinica