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ES2636487T3 - Producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en células vegetales - Google Patents

Producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en células vegetales Download PDF

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ES2636487T3
ES2636487T3 ES13803782.5T ES13803782T ES2636487T3 ES 2636487 T3 ES2636487 T3 ES 2636487T3 ES 13803782 T ES13803782 T ES 13803782T ES 2636487 T3 ES2636487 T3 ES 2636487T3
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dha
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acid
approximately
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ES13803782.5T
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English (en)
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James Robertson Petrie
Surinder Pal Singh
Robert Charles De Feyter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Grains Research and Development Corp
Nuseed Pty Ltd
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Grains Research and Development Corp
Nuseed Pty Ltd
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Publication date
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Abstract

Lípido vegetal extraído, que comprende ácidos grasos en una forma esterificada, comprendiendo los ácidos grasos ácido oleico, ácido palmítico, ácidos grasos ω6 que comprenden ácido linoleico (LA), ácidos grasos ω3 que comprenden ácido α-linoleico (ALA) y ácido docosahexaenoico (DHA), y opcionalmente uno o más de ácido estearidónico (SDA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA) y ácido eicosatetraenoico (ETA), en donde el nivel de DHA en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es del 7 % al 20 % y en donde el nivel de ácido palmítico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 2 % y el 16 %, y en donde el nivel de ácido mirístico (C14:0) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 1 %.

Description

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entre el 7 % y el 20 %, (ii) el nivel de ácido palmítico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 2 % y el 16 %, (iii) el nivel de ácido mirístico (C14:0) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 6 %, (iv) el nivel de ácido oleico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 1 % y el 30 % o entre el 30 % y el 60 %, (v) el nivel de ácido linoleico (LA) en el contenido total de ácidos grasos del
5 lípido extraído es de entre 4 % y y el 35 %, (vi) el nivel de ácido α-linolénico (ALA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 4 % y el 40 %, (vii) el nivel de ácido eicosatrienoico (ETrA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 4 %, (viii) el nivel de ácidos grasos saturados totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 4 % y el 25 %, (ix) la relación de ácidos grasos ω6 totales:ácidos grasos ω3 totales en el contenido de ácidos grasos del lípido extraído es de entre 1,0 y 3,0 o entre 0,1 y 1, (x) el contenido de triacilglicerol (TAG) del lípido es de al menos el 70 %, y (xi) al menos el 70 % del DHA esterificado en forma de TAG se encuentra en la posición sn-1o sn-3 del TAG. En un aspecto, una o más o todas de las siguientes características
i) el nivel de ácido palmítico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 2 % y el 15 %,
15 ii) el nivel de ácido mirístico (C14:0) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 1 %, iii) el nivel de ácido oleico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 30 %, entre aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 30 %, entre el 1 % y aproximadamente el 20 %, entre aproximadamente el 45 % y aproximadamente el 60 % o es de aproximadamente el 30 %. iv) el nivel de ácido linoleico (LA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 20 %, o entre aproximadamente el 4 % y el 17 %, v) el nivel de ácido α-linolénico (ALA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 7 % y aproximadamente el 40 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 35 %, entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 35 %, o entre aproximadamente el 4 % y el 16 %,
25 vi) el nivel de ácido γ-linolénico (GLA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 4 %, inferior a aproximadamente el 3 %, inferior a aproximadamente el 2 %, inferior a aproximadamente el 1 %, inferior a aproximadamente el 0,5 %, entre el 0,05 % y el 7 %, entre el 0,05 % y el 4 %, o de entre el 0,05 % y aproximadamente el 3 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, vii) el nivel de ácido estearidónico (SDA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior a aproximadamente el 4 %, inferior a aproximadamente el 3 %, entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 7 %, entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 4 %, entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 3 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, viii) el nivel de ácido eicosatetraenoico (ETA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior a aproximadamente el 4 %, inferior a aproximadamente el 1 %, inferior a aproximadamente el 0,5 %, entre
35 aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 5 %, entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 4 %, entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 3 %, o entre aproximadamente el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, ix) el nivel de ácido eicosatrienoico (ETrA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior a aproximadamente el 2 %, inferior a aproximadamente el 1 %, entre el 0,05 % y el 4 %, entre el 0,05 % y el 3 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 1 %, x) el nivel de ácido eicosapentaenoico (EPA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior a 4 %, inferior a aproximadamente el 3 %, inferior a aproximadamente el 2 %, entre el 0,05 % y el 10 %, entre el 0,05 % y 5 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 3 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, xi) el nivel de ácido docosapentaenoico (DPA) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior
45 a 4 %, inferior a aproximadamente el 3 %, inferior a aproximadamente el 2 %, entre el 0,05 % y el 8 %, entre el 0,05 % y 5 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 3 %, o entre el 0,05 % y aproximadamente el 2 %, xii) el nivel de DHA en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de aproximadamente el 8 %, aproximadamente el 9 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 11 %, aproximadamente el 12 %, aproximadamente el 13 %, aproximadamente el 14 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 16 %, aproximadamente el 17 %, aproximadamente el 18 %, entre aproximadamente el 8 % y el 20 %, entre aproximadamente el 10 % y el 20 %, entre aproximadamente el 11 % y el 20 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 16 %, o entre aproximadamente el 14 % y el 20 %, xiii) el lípido comprende ácido ω6-docosapentaenoico (22:5∆4,7,10,13,16) en su contenido de ácido graso, xiv) el lípido carece esencialmente de ácido ω6-docosapentaenoico (22:5∆4,7,10,13,16) en su contenido de
55 ácido graso, xv) el lípido carece esencialmente de SDA, EPA y ETA en su contenido de ácidos grasos, xvi) el nivel de ácidos grasos saturados totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 20 %, o entre aproximadamente el 6 % y aproximadamente el 20%, xvii) el nivel de ácidos grasos monoinsaturados totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 35 %, entre aproximadamente el 8 % y aproximadamente el 25 %, o entre aproximadamente el 8 % y aproximadamente el 22 %. xviii) el nivel de ácidos grasos poliinsaturados totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 75 %, entre aproximadamente el 50 % y
65 aproximadamente el 75 %, o entre aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 75 %. xix) el nivel de ácidos grasos ω6 totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre
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una parte de planta de tipo silvestre correspondiente.
En otra realización, el lípido está en forma de aceite, preferentemente un aceite de semilla de una oleaginosa, y donde al menos el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o entre 5 aproximadamente el 95 % y aproximadamente el 98 %, en peso del lípido es triacilglicerol.
En una realización adicional, el proceso comprende adicionalmente tratar el lípido para aumentar el nivel de DHA como un porcentaje del contenido total de ácido graso. Por ejemplo, el tratamiento es transesterificación. Por ejemplo, el lípido tal como aceite de colza se puede tratar para convertir los ácidos grasos en el aceite en ésteres de alquilo como metilo o ésteres de etilo, que luego se pueden fraccionar para enriquecer el lípido o aceite para el DHA.
Además, se describe un proceso para producir un lípido vegetal extraído que comprende las siguientes etapas:
i) obtener una parte de una planta, preferentemente semilla de colza, que comprende lípidos que comprende
15 ácidos grasos en una forma esterificada, los ácidos grasos comprenden ácido oleico, ácido palmítico, ácidos grasos ω6 que comprenden ácido linoleico (LA), ácidos grasos ω3 que comprenden ácido α linolénico (ALA) y ácido docosahexaenoico (DHA), y opcionalmente uno o más de ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido estearidónico (SDA), ácido docosapentaenoico (DPA) y ácido eicosatetraenoico (ETA), donde el nivel de DHA en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraíble en la parte de la planta es de aproximadamente el 3 % aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 6 % o aproximadamente el 7 %, y ii) la extracción de lípido de la parte de la planta,
donde el lípido extraído tiene las siguientes características en el contenido total de ácidos grasos del lípido;
25 i) el nivel de DHA es de aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 6 % o aproximadamente el 7 %, ii) el nivel de ácido palmítico es de entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 16 %, iii) el nivel de ácido mirístico es inferior a aproximadamente el 2 %, iv) el nivel de ácido oleico es de entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 60 %, preferentemente aproximadamente el 45 % y aproximadamente el 60 %, v) el nivel de LA es de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 20 %, vi) el nivel de ALA es de entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 16 %, vii) el nivel de GLA es inferior a aproximadamente el 4 %, viii) el nivel de SDA es inferior a aproximadamente el 6 %, o inferior a aproximadamente el 4 %,
35 ix) el nivel de ETA es inferior a aproximadamente el 6 %, o inferior a aproximadamente el 4 %, x) el nivel de ETrA es inferior a aproximadamente el 1 %, xi) el nivel de EPA es inferior a aproximadamente el 10 % y/o el nivel de EPA es 0,5-2,0 veces el nivel de DHA, xii) el nivel de DPA es inferior a aproximadamente el 4 %, xiii) el nivel de ácidos grasos saturados totales en el contenido de ácidos grasos de lípido extraído es de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 25 %, xiv) el nivel de ácidos grasos monoinsaturados totales en el contenido total de ácidos grasos de lípido extraído es de entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 70 %, xv) el nivel de ácidos grasos poliinsaturados totales en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 15 % y aproximadamente el 75 %, o preferentemente entre aproximadamente el
45 15 % y aproximadamente el 30 %, xvi) el nivel de ácidos grasos ω6 nuevos en el contenido de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 10 %, xvii) el nivel de ácidos grasos ω3 totales en el contenido de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 20 %, xviii) el nivel de ácidos grasos ω3 nuevos en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 20 %, xix) la relación de ácidos grasos ω6 totales: ácidos grasos ω3 totales en el contenido de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 3,0, preferentemente menos que aproximadamente 0,50,
55 xx) la relación de ácidos grasos ω6 nuevos: ácidos grasos ω3 nuevos en el contenido de ácidos grasos del lípido extraído es de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 3,0, xxi) el contenido de triacilglicerol (TAG) del lípido es al menos aproximadamente el 70 %, y xxii) el lípido carece esencialmente de colesterol. En un aspecto, el lípido comprende tri-DHA TAG (TAG 66:18). Más preferentemente, el lípido carece esencialmente de SDA y ETA y/o no ha sido tratado con un proceso de transesterificación después de que se extrajo de la planta o parte de la planta.
También se describe un proceso para producir un lípido vegetal extraído que comprende las siguientes etapas:
i) obtener una parte de planta que comprende un lípido, donde el lípido comprende ácidos grasos en forma 65 esterificada, donde los ácidos grasos comprenden ácido oleico, ácido palmítico, ácidos grasos ω6 que comprenden ácido linoleico (LA), ácidos grasos ω3 que comprenden ácido α-linolénico (ALA) y ácido
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expresión de dichos polinucleótidos en la célula, y donde la célula comprende un lípido como se define en la presente invención. En una realización, una o más o todas las desaturasas o elongasas tiene una o más de las características definidas anteriormente.
5 En otro aspecto, la presente solicitud describe una célula hospedadora que comprende
i) un primer polinucleótido exógeno que codifica una ∆12-desaturasa que comprende aminoácidos que tienen la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:10, un fragmento biológicamente activo de estos, o una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 50 % idéntica a la SEQ ID NO:10, ii) un segundo polinucleótido exógeno que codifica una ω3-desaturasa que comprende aminoácidos que tienen la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:12, un fragmento biológicamente activo de estos, o una secuencia de aminoácidos que es al menos en un 50 % idéntica a la SEQ ID NO:12,
15 donde cada polinucleótido se enlaza operativamente a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula.
En un aspecto adicional, la presente solicitud describe una célula hospedadora que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención, la construcción genética de la invención, o el vector o construcción genética como se describe en la presente solicitud.
En una realización, la célula está en una planta, en una parte de planta y/o es una célula de semilla vegetal madura.
En una realización, la planta o la semilla vegetal es una planta oleaginosa o una semilla oleaginosa, respectivamente.
25 También se proporciona una planta transgénica que comprende una célula de la invención. Preferentemente, la planta es una planta oleaginosa o Arabidopsis thaliana. En una realización, la planta es una planta Brassica, preferentemente B. napus o B. juncea, o una planta diferente de Arabidopsis thaliana.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una planta oleaginosa que comprende
a) un lípido en su semilla, el lípido comprende ácidos grasos en una forma esterificada, y
b) polinucleótidos exógenos que codifican uno o más de los siguientes conjuntos de enzimas:
35 i) una ∆12-desaturasa, una ω3-desaturasa fúngica o una ∆15-desaturasa fúngica, una ∆6-desaturasa, una ∆5-desaturasa, una ∆4-desaturasa, una ∆6-elongasa y una ∆5-elongasa, o ii) una ∆12-desaturasa, una ω3-desaturasa fúngica o una ∆15-desaturasa fúngica, una ∆8-desaturasa, una ∆5-desaturasa, una ∆4-desaturasa, una ∆9-elongasa y una ∆5-elongasa,
donde cada polinucleótido se enlaza operativamente a uno o más promotores específicos de las semillas que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en las semillas de la planta en desarrollo, donde los ácidos grasos comprenden ácido oleico, ácido palmítico, ácidos grasos ω6 que comprenden ácido linoleico (LA) y ácido γlinolénico (GLA), ácidos grasos ω3 que comprenden ácido α-linolénico (ALA), ácido estearidónico (SDA), ácido docosapentaenoico (DPA) y ácido docosahexaenoico (DHA), y opcionalmente uno o más de ácido
45 eicosapentaenoico (EPA) y ácido eicosatetraenoico (ETA), y donde el nivel de DHA en el contenido total de ácidos grasos del lípido es del 7 % al 20 %, y donde el nivel de ácido palmítico en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es de entre el 2 % y el 16 %, y donde el nivel de ácido mirístico (C14:0) en el contenido total de ácidos grasos del lípido extraído es inferior al 1 %.
Los ejemplos de plantas oleaginosas incluyen, pero sin limitación, Brassica sp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus sp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium sp., Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa,o Crambe abyssinica. En una realización, la planta oleaginosa es una planta de colza, Glycine max, Camelina sativa o Arabidopsis thaliana. En una realización
55 alternativa, la planta oleaginosa es diferente de A. thaliana.
En una realización, una o más de las desaturasas es capaz de usar un sustrato de acil-CoA. En una realización preferida, una o más de ∆6-desaturasa, ∆5-desaturasa, ∆4-desaturasa y ∆8-desaturasa, si están presentes, son capaces de usar un sustrato de acil-CoA, preferentemente cada una de las i) ∆6-desaturasa, ∆5-desaturasa y ∆4desaturasa o ii) ∆5-desaturasa, ∆4-desaturasa y ∆8-desaturasa es capaz de usar un sustrato de acil-CoA. En una realización, una ∆12-desaturasa y/o una ω3-desaturasa es capaz de usar un sustrato de acil-CoA. El sustrato de acil-CoA es preferentemente un ALA-CoA, ETA-CoA, DPA-CoA, ETrA-CoA, LA-CoA, GLA-CoA, o ARA-CoA.
En una realización, la semilla madura cosechada de la planta tiene un contenido de DHA de al menos 28 mg por
65 gramo de semilla, preferentemente al menos aproximadamente 32 mg por gramo de semilla, al menos aproximadamente 36 mg por gramo de semilla, al menos aproximadamente 40 mg por gramo de semilla, más
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preferentemente al menos aproximadamente 44 mg por gramo de semilla o al menos aproximadamente 48 mg por gramo de semilla. El contenido máximo de DHA puede ser de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 mg por gramo de semilla, o aproximadamente 80 mg o aproximadamente 100 mg por gramo de semilla.
5 En un aspecto adicional, la presente invención describe una planta Brassica napus, B. juncea o Camelina sativa que es capaz de producir semillas que comprendan DHA, donde la semilla madura cosechada de la planta tiene un contenido de DHA de al menos aproximadamente 28 mg por gramo de semilla, preferentemente al menos aproximadamente 32 mg por gramo de semilla, al menos aproximadamente 36 mg por gramo de semilla, al menos aproximadamente 40 mg por gramo de semilla, más preferentemente al menos aproximadamente 44 mg por gramo
10 de semilla o al menos aproximadamente 48 mg por gramo de semilla. El contenido máximo de DHA puede ser de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 mg por gramo de semilla, o aproximadamente 80 mg o aproximadamente 100 mg por gramo de semilla.
En otro aspecto, la presente solicitud describe una célula vegetal de una planta de la invención que comprende los 15 polinucleótidos exógenos.
También se proporciona una parte de planta, preferentemente una semilla, que tiene una o más de las siguientes características:
20 i) es de una planta de la invención, ii) comprende lípidos tal como se definen en el presente documento, iii) se puede usar en un proceso de la invención, iv) comprende una construcción genética de la invención, o v) comprende un conjunto de polinucleótidos exógenos tal como se definen en el presente documento.
25 En otro aspecto más, la presente solicitud describe una semilla madura cosechada Brassica napus, B. juncea o Camelina sativa que comprende DHA y un contenido de humedad de entre aproximadamente el 4 % y aproximadamente el 15 % en peso, donde el contenido de DHA de la semilla es de al menos aproximadamente 28 mg por gramo de semilla, preferentemente al menos aproximadamente 32 mg por gramo de semilla, al menos
30 aproximadamente 36 mg por gramo de semilla, al menos aproximadamente 40 mg por gramo de semilla, más preferentemente al menos aproximadamente 44 mg por gramo de semilla o al menos aproximadamente 48 mg por gramo de semilla. El contenido máximo de DHA puede ser de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 mg por gramo de semilla, o aproximadamente 80 mg o aproximadamente 100 mg por gramo de semilla.
35 En una realización, la célula de la invención, la planta transgénica de la invención, la planta oleaginosa de la invención, la planta Brassica napus, B. juncea o Camelina sativa de la invención, la parte de planta de la invención, o la semilla de la invención, se puede usar para producir lípido extraído que comprende una o más o todas las características definidas en el presente documento.
40 En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un método para producir una célula de la invención, donde el método comprende
a) introducir en la célula, preferentemente una célula que no es capaz de sintetiza un LC-PUFA, la construcción génica de la invención, el polinucleótido aislado y/o exógeno de la invención, el vector o la construcción genética
45 de la invención, una o más de las combinaciones de polinucleótidos exógenos que se definen en el presente documento, b) opcionalmente, expresar los genes o polinucleótido o polinucleótidos en la célula: c) opcionalmente, analizar la composición de ácido graso de la célula, y d) opcionalmente, seleccionar una célula que exprese los genes o polinucleótido o polinucleótidos.
50 En un aspecto, el lípido en la célula tiene una o más de las características definidas en el presente documento.
En un aspecto, la construcción génica, el polinucleótido exógeno y/o aislado, el vector, la construcción genética o las combinaciones de polinucleótidos exógenos, se integran de manera estable al genoma de la célula.
55 En un aspecto adicional, la célula en una célula vegetal, y el método comprende adicionalmente la etapa de regenerar una planta transformada a partir de la célula de la etapa a).
En otro aspecto, los genes y/o polinucleótido o polinucleótidos exógenos se expresan de manera temporal en la 60 célula.
También se describe una célula producida usando un método de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una semilla, donde el método 65 comprende,
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vegetal o preferentemente en embriones somáticos o plantas transgénicas y la determinación de si la célula, el embrión o la planta posee una capacidad incrementada para producir LC-PUFA en comparación con una célula, un embrión o una planta comparables en los que la enzima no se expresa.
5 En una realización, una o más de las desaturasas y/o elongasas para su uso en la invención pueden purificarse a partir de una microalga, es decir, son idénticas en cuanto a la secuencia de aminoácido con respecto a un polipéptido que puede purificarse a partir de una microalga.
Mientras que determinadas enzimas son descritas específicamente como "bifuncionales" en el presente documento,
10 la ausencia de dicho término no implica necesariamente que una enzima en particular no posea una actividad distinta a aquella definida específicamente.
Desaturasas
15 Como se usa en el presente documento, el término "desaturasa" se refiere a una enzima capaz de introducir un enlace doble carbono-carbono en un grupo acilo de un sustrato de ácido graso que normalmente se encuentra en forma esterificada, tal como ésteres de acil-CoA. El grupo acilo puede esterificarse para formar un fosfolípido, tal como fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés), o una proteína transportadora de acilo (ACP, por sus siglas en inglés) o, en una realización preferida, CoA. De acuerdo con lo anterior, las desaturasas pueden categorizarse
20 generalmente en tres grupos. En una realización, la desaturasa es una desaturasa del extremo frontal.
Como se usa en el presente documento, una "∆4-desaturasa" se refiere a una proteína que realiza una reacción desaturasa que introduce un enlace doble carbono-carbono en el 4.o enlace carbono-carbono desde el extremo carboxilo de un sustrato de ácido graso. La "∆4-desaturasa" es capaz por lo menos de convertir DPA en DHA. La 25 etapa de desaturación para producir DHA a partir de DPA se cataliza mediante una ∆4-desaturasa en organismos no mamíferos, y un gen que codifica esta enzima se ha aislado de la especie protista de agua dulce Euglena gracilis y la especie marina Thraustochytrium sp. (Qui et al., 2001; Meyer et al., 2003). En una realización, la ∆4-desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:41 o una Thraustochytrium sp. ∆4-desaturasa o un fragmento biológicamente activo de esta, o una secuencia de aminoácido que es idéntica al
30 menos en un 80 % a la SEQ ID NO:41.
Tabla 1. Genes clonados que participan de la biosíntesis de LC-PUFA
Enzima
Tipo de organismo Especie N.º de muestreo Tamaño de la proteína (aminoácidos) Referencias
∆4desaturasa
Protista Euglena gracilis AY278558 541 Meyer et al., 2003
Algas
Pavlova lutherii AY332747 445 Tonon et al., 2003
Isochrysis galbana
AAV33631 433 Pereira et al., 2004b
Pavlova salina
AAY15136 447 Zhou et al., 2007
Traustocitrid o
Thraustochytrium aureum AAN75707 AAN75708 AAN75709 AAN75710 515 N/A
Thraustochytrium sp. ATCC21685
AAM09688 519 Qiu et al. 2001
∆5desaturasa
Mamífero Homo sapiens AF199596 444 Cho et al., 1999b Leonard et al., 2000b
Nematodo
Caenorhabditis elegans AF11440, NM_069350 447 Michaelson et al., 1998b; Watts and Browse, 1999b
Hongos
Mortierella alpina AF067654 446 Michaelson et al., 1998a; Knutzon et al., 1998
Pythium irregulare
AF419297 456 Hong et al., 2002a
Dictyostelium discoideum
AB022097 467 Saito et al., 2000
Saprolegnia diclina
470 WO02081668
Diatomea
Phaeodactylum tricornutum AY082392 469 Domergue et al., 2002
29
Algas
Thraustochytrium sp AF489588 439 Qiu et al., 2001
Thraustochytrium aureum
439 WO02081668
Isochrysis galbana
442 WO02081668
Musgo
Marchantia polymorpha AY583465 484 Kajikawa et al., 2004
∆6desaturasa
Mamíferos Homo sapiens NM_013402 444 Cho et al., 1999a; Leonard et al., 2000
Mus musculus
NM_019699 444 Cho et al., 1999a
Nematodo
Caenorhabditis elegans Z70271 443 Napier et al., 1998
Plantas
Borago officinalis U79010 448 Sayanova et al., 1997
Echium
AY055117 AY055118 Garcia-Maroto et al., 2002
Primula vialii
AY234127 453 Sayanova et al., 2003
Anemone leveillei
AF536525 446 Whitney et al., 2003
Musgos
Ceratodon purpureus AJ250735 520 Sperling et al., 2000
Marchantia polymorpha
AY583463 481 Kajikawa et al., 2004
Physcomi-trella patens
CAA11033 525 Girke et al., 1998
Hongos
Mortierella alpina AF110510 AB020032 457 Huang et al., 1999; Sakura-dani et al., 1999
Pythium irregulare
AF419296 459 Hong et al., 2002a
Mucor circinelloides
AB052086 467 NCBI (Centro Nacional para la Informa-ción Biotecnológi-ca)*
Rhizopus sp.
AY320288 458 Zhang et al., 2004
Saprolegnia diclina
453 WO02081668
Diatomea
Phaeodactylum tricornutum AY082393 477 Domergue et al., 2002
Bacteria
Synechocystis L11421 359 Reddy et al., 1993
Alga
Thraustochytrium aureum 456 WO02081668
∆5/∆6desaturasa bifuncional
Pescado Danio rerio AF309556 444 Hastings et al., 2001
C20 ∆8desaturasa
Alga Euglena gracilis AF139720 419 Wallis y Browse, 1999
Planta
Borago officinalis AAG43277 446 Sperling et al., 2001
∆6-elongasa
Nematodo Caenorhabditis elegans NM_069288 288 Beaudoin et al., 2000
Musgos
Physcomitrella patens AF428243 290 Zank et al., 2002
Marchantia polymorpha
AY583464 290 Kajikawa et al., 2004
Hongo
Mortierella alpina AF206662 318 Parker-Barnes et al., 2000
Algas
Pavlova lutheri** 501 WO 03078639
Thraustochytrium
AX951565 271 WO 03093482
Thraustochytrium sp**
AX214454 271 WO 0159128
PUFAelongasa
Mamíferos Homo sapiens AF231981 299 Leonard et al., 2000b; Leonard et al., 2002
Rattus norvegicus
AB071985 299 Inagaki et al., 2002
30
Rattus norvegicus**
AB071986 267 Inagaki et al., 2002
Mus musculus
AF170907 279 Tvrdik et al., 2000
Mus musculus
AF170908 292 Tvrdik et al., 2000
Peces
Danio rerio AF532782 291 (282) Agaba et al., 2004
Danio rerio**
NM_199532 266 Lo et al., 2003
Gusano
Caenorhabditis elegans Z68749 309 Abbott et al., 1998 Beaudoin et al., 2000
Algas
Thraustochytrium aureum** AX464802 272 WO 0208401-A2
Pavlova lutheri**
320 WO 03078639
∆9-elongasa
Algas Isochrysis galbana AF390174 263 Qi et al., 2002
Euglena gracilis
258 WO 08/128241
∆5-elongasa
Algas Ostreococcus tauri AAV67798 300 Meyer et al., 2004
Pyramimonas cordata
268 WO 2010/057246
Pavlova sp. CCMP459
AAV33630 277 Pereira et al., 2004b
Pavlova salina
AAY15135 302 Robert et al., 2009
Diatomea
Thalassiosira pseudonana AAV67800 358 Meyer et al., 2004
Pez
Oncorhynchus mykiss CAM55862 295 WO 06/008099
Musgo
Marchantia polymorpha BAE71129 348 Kajikawa et al., 2006
* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ** Función no probada/no demostrada
Como se usa en el presente documento, una "∆5-desaturasa" se refiere a una proteína que realiza una reacción desaturasa que introduce un enlace doble carbono-carbono en el 5.o enlace carbono-carbono desde el extremo carboxilo de un sustrato de ácido graso. Se enumeran ejemplos de ∆5-desaturasas en Ruiz-López et al. (2012) y 5 Petrie et al. (2010a) y en la Tabla 1 del presente documento. En una realización, la ∆5-desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:30, un fragmento biológicamente activo de estos o una secuencia de aminoácido que es idéntica al menos en un 80 % a la SEQ ID NO:30. En otra realización, la ∆5-desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:32, un fragmento biológicamente activo de estos o una secuencia de aminoácido que es idéntica al menos en un
10 53 % a la SEQ ID NO:32. En otra realización, la ∆5-desaturasa proviene de Thraustochytrium sp o Emiliania huxleyi.
Como se usa en el presente documento, una "∆6-desaturasa" se refiere a una proteína que realiza una reacción desaturasa que introduce un enlace doble carbono-carbono en el 6.o enlace carbono-carbono desde el extremo carboxilo de un sustrato de ácido graso. Se enumeran ejemplos de ∆6-desaturasas en Ruiz-López et al. (2012) y
15 Petrie et al. (2010a) y en la Tabla 1 del presente documento. Las ∆6-desaturasas preferidas provienen de Micromonas pusilla, Pythium irregulare o Ostreococcus taurii.
En una realización, la ∆6-desaturasa se caracteriza también por tener al menos dos, preferentemente las tres y preferentemente en una célula vegetal, de las siguientes: i) mayor actividad de ∆6-desaturasa en ácido α-linolénico
20 (ALA, 18:3∆9,12,15, ω3) que ácido linoleico (LA, 18:2∆9,12, ω6) como sustrato de ácido graso; ii) mayor actividad de ∆6-desaturasa en ALA-CoA como sustrato de ácido graso que en ALA ligado a la posición sn-2 de PC como sustrato de ácido graso; y iii) actividad de ∆6-desaturasa en ETrA. Se proporcionan ejemplos de dichas ∆6desaturasas en la Tabla 2.
25 En una realización, la desaturasa tiene mayor actividad en un sustrato de ω3 que el correspondiente sustrato de ω6 y tiene actividad en ALA para producir ácido octadecatetraenoico (ácido estearidónico, SDA (por sus siglas en inglés), 18:4∆6,9,12, 15, ω3) con una eficacia de al menos el 30 %, más preferentemente de al menos el 40 % o más preferentemente de al menos el 50 % cuando se expresa a partir de un polinucleótido exógeno en una célula recombinante tal como una célula vegetal, o de al menos el 35 % cuando se expresa en una célula de levadura. En
30 una realización, la ∆6-desaturasa tiene mayor actividad, por ejemplo, al menos una actividad de ∆6-desaturasa aproximadamente 2 veces mayor, en ALA que LA como sustrato de ácido graso. En otra realización, la ∆6desaturasa tiene mayor actividad, por ejemplo, al menos actividad de ∆6-desaturasa aproximadamente 5 veces mayor o al menos actividad 10 veces mayor, en ALA-CoA como sustrato de ácido graso que en ALA ligado a la posición sn-2 de PC como sustrato de ácido graso. En una realización adicional, la ∆6-desaturasa tiene actividad
35 tanto en sustratos de ácido graso ALA-CoA como en ALA ligado a la posición sn-2 de PC.
31
Tabla 2. Desaturasas que demostraron tener actividad en un sustrato de acil-CoA
Enzima
Tipo de organismo Especie N.º de muestreo Tamaño de la proteína (aminoácidos) Referen-cias
∆6desaturasa
Algas Mantoniella squamata CAQ30479 449 Hoffmann et al., 2008
Ostreococcus tauri
AAW70159 456 Domergue et al., 2005
Micromonas
EEH58637 Petrie et al.,
pusilla
2010a (SEQ ID NO: 13)
∆5desaturasa
Alga Mantoniella squamata CAQ30478 482 Hoffmann et al., 2008
Planta
Anemone leveillei N/A Sayanova et al., 2007
ω3-
Hongo Pythium FW362186.1 359 Xue et al.,
desaturasa
aphanidermatum 2012; WO2008/05456 5
Hongo
Phytophthora FW362214.1 363 Xue et al.,
(oomiceto)
sojae 2012; WO2008/05456 5
Hongo
Phytophthora FW362213.1 361 Xue et al.,
(oomiceto)
ramorum 2012; WO2008/05456 5
En una realización, la ∆6-desaturasa no tiene actividad de ∆5-desaturasa detectable en ETA. En otra realización, la ∆6-desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:16, SEQ ID 5 NO:19 o SEQ ID NO:20, un fragmento biológicamente activo de estos o una secuencia de aminoácido que es idéntica al menos en un 77 % a la SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO:20 En otra realización, la ∆6desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO:20, un fragmento biológicamente activo de estos o una secuencia de aminoácido que es idéntica al menos en un 67 % a una o ambas de la SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO:20. La ∆6-desaturasa también puede tener actividad de ∆8
10 desaturasa.
Como se usa en el presente documento, una "∆8-desaturasa" se refiere a una proteína que realiza una reacción desaturasa que introduce un enlace doble carbono-carbono en el 8.o enlace carbono-carbono desde el extremo carboxilo de un sustrato de ácido graso. La ∆8-desaturasa es capaz por lo menos de convertir ETrA en ETA. Se
15 enumeran ejemplos de ∆8-desaturasas en la Tabla 1. En una realización, la ∆8-desaturasa comprende aminoácidos que tienen una secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:52, un fragmento biológicamente activo de estos o una secuencia de aminoácido que es idéntica al menos en un 80 % a la SEQ ID NO:52.
Como se usa en el presente documento, una "ω3-desaturasa" se refiere a una proteína que realiza una reacción
20 desaturasa que introduce un enlace doble carbono-carbono en el 3.º enlace carbono-carbono desde el extremo metilo de un sustrato de ácido graso. Por tanto, una ω3-desaturasa puede convertir LA en ALA y GLA en SDA (todos ácidos grasos C18) o DGLA en ETA y/o ARA en EPA (ácidos grasos C20). Algunas ω3-desaturasas (grupo I) tienen actividad únicamente en sustratos C18, tales como ω3-desaturasas vegetales y cianobacterianas. Dichas ω3desaturasas también son ∆15-desaturasas. Otras ω3-desaturasas tienen actividad en sustratos C20 sin actividad
25 (grupo II) o algo de actividad (grupo III) en sustratos C18. Dichas ω3-desaturasas también son ∆17-desaturasas. Las ω3-desaturasas preferidas pertenecen al tipo del grupo III que convierte LA en ALA, GLA en SDA, DGLA en ETA y ARA en EPA, tal como la ω3-desaturasa de Pichia pastoris (SEQ ID NO: 12). Los ejemplos de ω3-desaturasas
32
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pJP3404_Col_#1
pJP3404_FAD2_#31 GA7_Col_#7 GA7_Col_#34 GA7_Col_#2 GA7_Col_#10 GA7_Col_#22 GA7_Col_#14 GA7_FAD2_#25 GA7_FAD2_#21 GA7_FAD2_#18
16:0
9,6 7,8 8,7 8,2 8,7 8,6 8,3 9,7 7,2 8,5 7,5
18:0
2,9 3,9 3,7 3,9 3,6 3,3 3,4 3,6 3,2 3,9 3,0
18:1d11
2,2 1,8 2,0 1,9 2,0 2,3 2,3 2,7 1,9 2,0 1,8
20:0
1,6 2,3 2,0 2,0 2,1 1,6 1,6 1,8 1,6 2,2 1,5
20:1d13
2,2 1,8 1,6 1,5 1,7 1,6 1,5 1,7 1,5 1,7 1,4
20:1d9/d11
13,0 15,9 16,1 16,1 16,3 15,0 13,9 13,5 18,3 15,9 17,0
22:1d13
1,1 1,2 1,1 1,1 1,3 1,0 1,0 1,0 1,0 1,3 1,2
Otros menores
1,9 1,5 1,5 1,4 1,5 1,3 1,6 1,7 1,6 1,4 1,6
18:1d9
10,8 14,0 10,6 10,6 10,1 11,1 10,0 7,7 26,0 8,2 20,9
18:2ω6
28,9 28,3 16,4 16,1 18,2 13,7 13,7 11,4 6,6 16,6 4,3
18:3ω3
16,6 14,9 29,6 29,6 27,5 32,4 30,4 32,8 21,9 27,7 30,1
18:3ω6
0,7 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,2 0,1
20:2ω6
1,6 1,5 1,1 1,2 1,3 1,0 1,0 1,0 0,4 1,4 0,4
20:3ω6
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
20:4ω6
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
22:4ω6
1,6 0,6 0,3 0,3 0,3 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,4
22:5ω6
0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
18:4ω3
1,0 0,5 1,2 1,1 1,1 1,5 2,7 2,7 1,9 1,8 1,7
20:3ω3
0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 0,0 0,6 0,7 0,0 0,8 0,6
20:4ω3
0,4 0,6 0,6 0,7 0,5 0,8 0,8 0,4 1,0 0,8 0,8
20:5ω3
0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,7 0,5 0,6 0,4 0,5
22:5ω3
0,0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3
22:6ω3
3,6 2,4 3,0 3,1 3,3 3,9 5,5 6,2 4,3 4,4 4,8
Tabla 5. Eficacia de conversión de las etapas enzimáticas individuales para la producción de DHA del ácido oleico, observada en el lípido total de la semilla de semillas transgénicas independientes como para la Tabla 4.
pJP3404_Col_#1
pJP3404_FAD2_#31 GA7_Col_#7 GA7_Col_#34 GA7_Col_#2 GA7_Col_#10 GA7_Col_#22 GA7_Col_#14 GA7_FAD2_#25 GA7_FAD2_#21 GA7_FAD2_#18
d12 -des
69,6 % 62,5 % 66,4 % 66,6 % 66,7 % 67,5 % 70,2 % 72,7 % 45,9 % 69,5 % 53,7 %
d15
39,8 % 37,8 % 66,1 % 66,8 % 62,3 % 72,1 % 72,7 % 77,2 % 79,7 % 66,0 % 88,1 %
58
-des
Omega-6
d6des 4,5 % 2,5 % 0,7 % 0,7 % 0,7 % 0,9 % 1,3 % 1,0 % 1,6 % 1,1 % 1,1 %
(d9elo)
3,1 % 3,1 % 2,2 % 2,3 % 2,4 % 1,8 % 1,8 % 1,7 % 1,2 % 2,7 % 0,9 %
d6elo
71,4 % 56,9 % 83,3 % 83,4 % 83,0 % 84,7 % 70,3 % 74,5 % 85,5 % 66,1 % 88,0 %
d5des
100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 %
d5elo
100,0 % 97,8 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 100,0 %
d4des
6,2 % 13,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 % 0,0 %
Omega-3
d6des 23,9 % 21,0 % 15,2 % 15,4 % 16,4 % 17,1 % 24,7 % 23,6 % 27,1 % 21,9 % 21,0 %
(d9elo)
0,0 % 0,0 % 0,0 % 1,8 % 0,0 % 0,0 % 2,0 % 2,2 % 0,0 % 2,6 % 2,1 %
d6elo
80,6 % 86,6 % 77,7 % 79,6 % 79,4 % 77,5 % 72,7 % 73,0 % 76,7 % 77,4 % 79,2 %
d5des
93,7 % 92,1 % 91,7 % 91,4 % 91,5 % 92,6 % 89,6 % 92,4 % 88,0 % 91,8 % 91,0 %
d5elo
93,7 % 92,1 % 91,7 % 91,4 % 91,5 % 92,6 % 89,6 % 92,4 % 88,0 % 91,8 % 91,0 %
d4des
100,0 % 90,6 % 94,8 % 94,0 % 95,3 % 94,4 % 95,8 % 96,9 % 93,1 % 92,9 % 94,2 %
Tabla 6. Los datos compilados del total de los perfiles de lípidos de las semillas de semillas transgénicas independientes se muestran en la Tabla 2. Los cálculos no incluyen los "ácidos grasos menores" en la Tabla 4.
Parámetro
pJP3404_Col_#1 pJP3404_FAD2_#31 GA7_Col_#7 GA7_Col_#34 GA7_Col_#2 GA7_Col_#10 GA7_Col_#22 GA7_Col_#14 GA7_FAD2_#25 GA7_FAD2_#21 GA7_FAD2_#18
w3 total (% del total de FA)
21,8 18,8 34,9 35,6 32,9 39,1 40,9 43,5 30,0 36,2 38,8
w6 total (% del total de FA)
32,9 31,0 17,9 17,7 19,9 15,2 15,4 12,9 7,6 18,6 5,2
relación w3 / w6
0,66 0,61 1,95 2,01 1,65 2,57 2,66 3,37 3,95 1,95 7,46
relación w6 / w3
1,51 1,65 0,51 0,50 0,60 0,39 0,38 0,30 0,25 0,51 0,13
w3 nuevo total (% del total de FA)
5,2 3,9 5,3 6,0 5,4 6,7 10,5 10,7 8,1 8,5 8,7
w6 nuevo total (% del total de FA)
4,0 2,7 1,5 1,6 1,7 1,5 1,7 1,5 1,0 2,0 0,9
relación nuevo w3 / w6
1,30 1,44 3,53 3,75 3,18 4,47 6,18 7,13 8,10 4,25 9,67
relación w6 nuevo / w3
0,77 0,69 0,28 0,27 0,31 0,22 0,16 0,14 0,12 0,24 0,10
Eficacia de OA en EPA
4,8 % 3,5 % 4,3 % 4,4 % 4,7 % 5,4 % 7,9 % 8,8 % 6,3 % 6,4 % 6,7 %
Eficacia de OA en DHA
4,5 % 3,0 % 3,7 % 3,8 % 4,1 % 4,8 % 6,8 % 7,9 % 5,2 % 5,5 % 5,8 %
Eficacia de LA en EPA
6,9 % 5,6 % 6,6 % 6,8 % 7,2 % 8,1 % 11,4 % 12,2 % 13,8 % 9,3 % 12,7 %
Eficacia de LA en DHA
6,6 % 4,8 % 5,7 % 5,8 % 6,3 % 7,2 % 9,8 % 11,0 % 11,4 % 8,0 % 10,9 %
59
Eficacia de ALA en EPA
17,4 % 14,9 % 10,0 % 10,1 % 11,6 % 11,3 % 15,6 % 15,9 % 17,3 % 14,1 % 14,4 %
Eficacia de ALA en DHA
16,5 % 12,8 % 8,6 % 8,7 % 10,0 % 10,0 % 13,4 % 14,3 % 14,3 % 12,2 % 12,4 %
Total de sustratos
14,1 14,0 14,4 14,1 14,4 13,5 13,3 15,1 12,0 14,6 12,0
Total de monoinsaturad os
29,3 34,7 31,4 31,2 31,4 31,0 28,7 26,6 48,7 29,1 42,3
Total de poliinsaturados
54,7 49,8 52,8 53,3 52,8 54,3 56,3 56,4 37,6 54,8 44,0
Total de C20
17,4 20 19,7 20,4 20,1 18,7 18,5 17,8 21,8 21 20,7
Total de C22
6,4 4,5 4,6 4,7 5,1 5,5 7,2 7,8 6,1 6,4 6,7
relación C20/C22
2,72 4,44 4,28 4,34 3,94 3,40 2,57 2,28 3,57 3,28 3,09
Tabla 7. La composición del ácido graso del lípido total de la semilla a partir de semillas progenies transgénicas independientes T3 y T4 Arabidopsis obtenidas a partir de las estirpes vegetales como en la Tabla 3. El error que se muestra en la generación T4 representa el SD de n=10.
GA7_Col_7.2
GA7_Col_34.2 GA7_Col_10.13 GA7_Col_22.2 GA7_Col_14.19 GA7_FAD2-25.10 GA7_FAD2-21.2 GA7_FAD2-18.14 T4 Col_22.2 (promedio±SD) T4 Col_22.2 mejor estirpe
16:0
9,8 9,0 9,5 11,2 10,4 8,1 10,7 7,7 10,6±0,9 12,2
18:0
4,0 3,8 4,2 3,4 3,5 3,5 3,8 3,3 3,5±0,4 3,6
18:1n7
2,0 1,9 2,2 2,9 2,5 1,7 2,2 1,6 2,3±0,2 2,6
20:0
2,2 1,9 1,7 1,4 2,3 1,8 2,0 1,9 1,9±0,3 2,0
20:1d13
1,4 1,3 1,2 1,6 2,5 1,2 1,4 1,3 1,6±0,2 1,9
20:1d9/11
13,6 14,7 12,4 9,5 13,0 15,7 12,4 18,4 11,7±1,7 9,5
22:1d13
1,2 1,2 0,8 0,6 1,6 1,0 1,1 1,5 0,9±0,1 0,8
Otros menores
1,8 1,5 1,5 2,1 2,6 1,7 1,9 1,6 1,9±0,1 2,3
18:1d9
5,5 6,7 6,8 4,6 6,9 11,3 4,2 11,5 4,6±1,0 3,3
18:2ω6
7,5 7,9 7,4 5,6 14,8 5,8 8,9 5,6 5,3±0,9 4,3
18:3ω3
33,7 33,7 36,1 31,5 26,1 28,3 28,9 30,8 31,0±1,1 29,5
18:3ω6
0,2 0,2 0,2 0,4 0,1 0,3 0,6 0,1 0,4±0,1 0,4
20:2ω6
1,0 1,0 0,7 0,7 1,4 0,6 1,2 0,6 0,9±0,1 0,9
20:3ω6
0 0 0 0 0 0 0 0
20:4ω6
0 0 0 0 0 0 0 0
22:4ω6
0 0 0 0 0 0 0 0 0,1±0,0 0,1
22:5ω6
0 0 0 0 0 0 0 0
18:4ω3
3,1 2,6 3,0 5,3 3,3 3,7 5,2 2,6 4,8±0,9 5,5
20:3ω3
1,4 1,3 1,2 1,3 1,2 1,1 1,3 1,3 1,5±0,2 1,7
20:4ω3
0,7 0,6 0,6 0,9 0,2 1,7 0,9 0,9 0,8±0,2 0,8
20:5ω3
0,9 0,9 0,7 1,9 0,8 1,2 1,0 0,8 1,5±0,3 1,8
22:5ω3
0,7 0,6 0,6 1,0 0,4 0,8 0,6 0,5 1,1±0,2 1,5
22:6ω3
9,5 9,2 9,4 13,9 6,6 10,3 11,5 7,9 13,3±1,6 15,1
60
Las eficacias de conversión enzimática para cada etapa enzimática en la vía de producción de DHA a partir de ácido oleico se muestra en la Tabla 8 para las semillas T3 con los niveles de DHA más elevados. La eficacia de conversión de la ∆12-desaturasa en semillas de la estirpe 22,2 fue del 81,6 % y la eficacia de la ω3-desaturasa fue del 89,1 %, 5 ambas son notablemente elevadas e indican que estas enzimas fúngicas (levadura) eran capaces de funcionar bien en las semillas en desarrollo. Las actividades de otras enzimas exógenas en la vía de DHA fueron similarmente altas para los sustratos de ω3 con la ∆6-desaturasa actuando con una eficiencia del 42,2 %, la ∆6-elongasa del 76,8 %, la ∆5-desaturasa del 95,0 %, la ∆5-elongasa del 88,7 % y la ∆4-desaturasa con una eficiencia del 93,3 %. La actividad de la ∆6-desaturasa en el sustrato de LA ω6 fue mucho más baja, con la ∆6-desaturasa actuando con una eficacia 10 de conversión de solo el 0,7 % en LA. GLA estuvo presente solo a un nivel del 0,4 % y fue el único producto de ω6 nuevo aparte del 20:2ω6 detectado en las semillas T3 con el contenido de DHA más elevado. Los datos recopilados de los perfiles del lípido total de la semilla de la semilla transgénica independiente (Tabla 7) se muestran en la Tabla
9. Estos datos para la estirpe con el mejor nivel de DHA incluía una relación del total de FA ω6 (que incluía LA) con respecto a un total de FA ω3 (que incluía ALA) de 0,10. La relación de FA ω6 nuevos (sin incluir LA) con respecto a
15 FA ω3 (sin incluir ALA) en el lípido de esta estirpe fue de 0,05. Los niveles totales de ácido graso poliinsaturado fueron más del 50 % en estas estirpes, y mayores que el 60 % en al menos 4 de las estirpes. Se calculó que las eficacias de conversión generales fueron: OA en EPA = 21,8 %, OA en DHA = 18,0 %, LA en EPA = 26,9 %, LA en DHA = 22,2 %, ALA en EPA = 30,1 %, ALA en DHA = 24,9 %.
20 Tabla 8. Eficacia de conversión de las etapas enzimáticas individuales para la producción de DHA del ácido oleico, observada en el lípido total de la semilla de semillas transgénicas independientes como para la Tabla 7.
GA7_Col_7.2
GA7_Col_34.2 GA7_Col_10.13 GA7_Col_22.2 GA7_Col_14.19 GA7_FAD2-25.10 GA7_FAD2-21.2 GA7_FAD2-18.14 T4 Col_22.2(promedio SD) T4 Col_22.2 mejor estirpe
d12des
75,4 % 73,1 % 75,7 % 81,6 % 73,4 % 66,6 % 78,5 % 63,1 % 67,6 % 82,7 %
d15des
85,3 % 84,4 % 86,2 % 89,1 % 70,2 % 87,5 % 82,2 % 87,6 % 81,0 % 90,9 %
Omega-6
d6des 0,3 % 0,3 % 0,3 % 0,7 % 0,3 % 0,6 % 1,0 % 0,2 % 1,3 % 0,7 %
(d9elo)
1,7 % 1,7 % 1,2 % 1,2 % 2,6 % 1,1 % 2,0 % 1,3 % 1,6 % 1,5 %
d6elo
d5des
d5elo
d4des
Omega-3
d6des 30,7 % 29,3 % 28,2 % 42,2 % 30,2 % 38,5 % 40,0 % 29,2 % 41,0 % 45,7 %
(d9elo)
2,7 % 2,7 % 2,3 % 2,4 % 3,0 % 2,3 % 2,7 % 2,9 % 2,8 % 3,1 %
d6elo
79,0 % 81,1 % 79,0 % 76,8 % 70,9 % 79,2 % 73,2 % 79,1 % 77,5 % 77,7 %
d5des
94,0 % 94,6 % 94,5 % 95,0 % 97,9 % 87,8 % 93,3 % 91,1 % 95,0 % 95,8 %
d5elo
91,9 % 91,7 % 93,6 % 88,7 % 89,5 % 89,9 % 92,2 % 91,6 % 90,8 % 90,2 %
d4des
93,2 % 93,7 % 94,4 % 93,3 % 93,7 % 92,5 % 95,0 % 93,9 % 92,2 % 90,9 %
61
Tabla 9. Los datos compilados del total de los perfiles de lípidos de las semillas de semillas transgénicas independientes se muestran en la Tabla 2. Los cálculos no incluyen los "ácidos grasos menores" en la Tabla 7.
Parámetro
GA7-Col_7.2 GA7-Col_34.2 GA7-Col_10.13 GA7-Col_22.2 GA7-Col_14.19 GA7-FAD2-25.10 GA7-FAD2-21.2 GA7-FAD2-18.14 T4 Col_22.2(promedio±SD) T4 Col_22.2 mejor estirpe
w3 total (% del total de FA)
50,0 48,9 51,6 55,8 38,6 47,1 49,4 44,8 54,0 55,9
w6 total (% del total de FA)
8,7 9,1 8,3 6,7 16,3 6,7 10,7 6,3 6,7 5,7
relación w3 / w6
5,75 5,37 6,22 8,33 2,37 7,03 4,62 7,11 8,06 9,81
relación w6 / w3
0,17 0,19 0,16 0,12 0,42 0,14 0,22 0,14 0,12 0,10
w3 nuevo total (% del total de FA)
16,3 15,2 15,5 24,3 12,5 18,8 20,5 14,0 23,0 26,4
w6 nuevo total (% del total de FA)
1,2 1,2 0,9 1,1 1,5 0,9 1,8 0,7 1,4 1,4
relación nuevo w3 / w6
13,58 12,67 17,22 22,09 8,33 20,89 11,39 20,00 16,43 18,86
relación w6 nuevo / w3
0,07 0,08 0,06 0,05 0,12 0,05 0,09 0,05 0,06 0,05
Eficacia de OA en EPA
14,1 % 13,3 % 13,4 % 21,8 % 10,2 % 15,0 % 16,8 % 11,2 % 20,4 % 24,5 %
Eficacia de OA en DHA
12,0 % 11,4 % 11,8 % 18,0 % 8,6 % 12,6 % 14,8 % 9,6 % 17,1 % 20,1 %
Eficacia de LA en EPA
18,9 % 18,4 % 17,9 % 26,9 % 14,2 % 22,9 % 21,8 % 18,0 % 26,2 % 29,9 %
Eficacia de LA en DHA
16,2 % 15,9 % 15,7 % 22,2 % 12,0 % 19,1 % 19,1 % 15,5 % 21,9 % 24,5 %
Eficacia de ALA en EPA
22,2 % 21,9 % 20,7 % 30,1 % 20,2 % 26,1 % 26,5 % 20,5 % 29,4 % 32,9 %
Eficacia de ALA en DHA
19,0 % 18,8 % 18,2 % 24,9 % 17,1 % 21,9 % 23,3 % 17,6 % 24,6 % 27,0 %
Total de sustratos
16,0 14,7 15,4 16,0 16,2 13,4 16,5 12,9 16,0 17,8
Total de monoinsaturados
23,7 25,8 23,4 19,2 26,5 30,9 21,3 34,3 21,1 18,1
Total de poliinsaturados
58,7 58,0 59,9 62,5 54,9 53,8 60,1 51,1 60,7 61,6
Total de C20
19 19,8 16,8 15,9 19,1 21,5 18,2 23,3 18 16,6
total de C22
11,4 11 10,8 15,5 8,6 12,1 13,2 9,9 15,4 17,5
relación C20/C22
1,67 1,80 1,56 1,03 2,22 1,78 1,38 2,35 1,17 0,95
5 Las semillas T3 de la estirpe 22.2 de pJP3416-GA7 en el fondo genético Columbia, que eran progenie de la estirpe 22 T2, se sembraron directamente en el suelo y la composición del ácido graso de la semilla madura de las plantas T3 se analizaron mediante CG. El nivel de DHA promedio de estas semillas fue del 13,3 % ± 1,6 (n=10) como un porcentaje del total de ácidos grasos en el lípido de la semilla. Como se muestra en la Tabla 6 (columna de la derecha), la estirpe con el nivel más elevado de DHA contenía el 15,1 % de DHA en el total de ácidos grasos del
10 lípido de la semilla. Las eficacias de conversión enzimática se muestran en la Tabla 8 para cada etapa de la producción de DHA a partir de ácido oleico.
La relación total de FA ω6 (que incluye LA) con respecto a FA ω3 (que incluye ALA) en la estirpe con el nivel de DHA más elevado fue de 0,102. La relación total de FA ω6 (sin incluir LA) con respecto a FA ω3 (sin incluir ALA) en 15 la estirpe con el nivel de DHA más elevado fue de 0,053. El nivel del total de ácidos grasos saturados fue de aproximadamente el 17,8 % y el nivel de ácidos grasos monoinsaturados fue de aproximadamente el 18,1 %. El
62
imagen49
16:3
0,3 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
18:0
3,7 3,3 3,2 3,2 3,0 3,1 3,2 3,3 3,1 3,2 3,2
18:1
10,8 8,0 8,0 8,6 8,5 9,4 11,0 10,2 8,3 9,4 8,6
18:1d11
1,7 1,3 1,4 1,4 1,7 1,4 1,5 1,3 1,3 1,3 1,3
18:2
24,7 18,2 19,5 19,2 18,5 20,1 23,8 32,2 30,3 29,8 31,6
18:3ω3
27,4 26,7 26,6 27,3 28,9 28,2 27,4 28,3 29,2 29,5 28,2
18:3ω6
0,2 1,4 0,3 0,3 0,4 0,2 0,5 0,0 0,5 0,4 0,6
20:0
1,6 1,4 1,3 1,4 1,2 1,4 1,4 1,8 2,1 1,9 2,0
18:4ω3
2,2 6,8 6,4 5,7 7,2 5,7 4,1 0,0 0,0 0,0 0,0
20:1d11
5,3 4,4 4,6 4,8 3,3 4,1 3,5 4,4 6,1 5,8 5,5
20:1iso
0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,0 0,5 0,6 0,5 0,5
20:2ω6
0,8 0,8 0,9 0,8 0,6 0,8 0,7 1,3 1,5 1,4 1,4
20:3ω3
0,6 0,8 0,8 0,8 0,7 0,8 0,7 0,6 0,7 0,7 0,6
22:0
0,4 0,5 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6
20:4ω3
0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0
22:1
1,1 1,1 1,2 1,1 0,5 0,9 0,8 1,6 2,2 1,9 2,0
20:5ω3
0,7 1,3 1,6 1,5 1,6 1,1 1,7 0,0 0,0 0,0 0,1
22:2ω6
0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,3 0,2 0,2
22:4ω6+22:3ω3
0,3 0,2 0,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,4 0,6 0,5 0,5
24:0
0,3 0,3 0,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,4 0,4 0,4 0,4
24:1
0,3 0,4 0,4 0,3 0,0 0,3 0,0 0,5 0,6 0,5 0,5
22:5ω3
0,3 1,1 1,2 1,1 1,1 0,9 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0
22:6ω3
4,7 9,0 8,5 8,3 8,3 7,1 4,9 0,0 0,0 0,0 0,0
64
imagen50
imagen51
durante 2-3 semanas. Los brotes bien establecidos con raíces se transfirieron a recipientes que contenían una mezcla para la cría de plántulas y se cultivaron en un gabinete de crecimiento durante dos semanas y posteriormente se transfirieron a un invernadero. Se obtuvieron aproximadamente 40 plantas (T0) con la construcción GA7 por este método.
5 Las plantas se cultivaron hasta la madurez luego se permitírseles la autofertilización. Las semillas obtenidas de las plantas transformadas se analizaron para obtener la composición del ácido graso en su aceite de semilla tal como se describe en el Ejemplo 1. Los datos para una estirpe transformada con el nivel de DHA más elevado se muestran en la Tabla 13. Los niveles de DHA en promedio fueron significativamente menores en el aceite de semilla de las
10 semillas de B. napus transformadas con el ADN-T a partir de pJP3416-GA7 que en las semillas de A. thaliana (Ejemplo 2) o las semillas de Camelina (Ejemplo 3) transformada con la misma construcción. Se encontró que el nivel más elevado de DHA en aproximadamente 40 estirpes era del 1,52 % con la mayoría de las estirpes transgénicas con DHA detectable. Se notó que había una acumulación sustancial de ALA, aproximadamente el 35 % del total de los ácidos grasos, en estas semillas que no se convertía eficazmente en SDA o los productos que
15 seguían en la vía.
Se realizó el análisis del perfil del ácido graso de las semillas de B. napus simple a partir de un evento T1, CT125-2, para determinar mejor la cantidad de DHA producido en las semillas transgénicas. Se encontró que las semillas contenían entre el 0 % (semillas nulas) y el 8,5 % de DHA (Tabla 13).
20 Algunas de las semillas de la estirpe vegetal CT116 así como de otras estirpes transgénicas que mostraban producción de DHA se sembraron para producir plantas progenie. Se realizó TI-PCR en el ARN total aislado a partir de embriones en desarrollo de estas plantas para determinar por qué la construcción GA7 tuvo un rendimiento pobre en cuanto a producción de DHA en relación con A. thaliana y C. sativa transgénicas que tenían la misma
25 construcción, y pobre en relación con la combinación de los genes en pJP3115 y pJP3116 (a continuación). Se realizó TI-PCR en el ARN total usando un kit de TI-PCR de una etapa (Invitrogén) y cebadores específicos de los genes que dirigían cada gen. Esto confirmó que cada uno de los genes en la construcción GA7 se expresaba bien en los transformantes de B. napus excepto la ∆6-desaturasa que se expresó de manera pobre en la mayoría de las semillas transformadas. Los otros genes de esta construcción funcionaron bien en ambas, las semillas de B. napus y
30 A. thaliana, por ejemplo las ∆12-y ∆15-desaturasas que funcionaron para producir niveles aumentados de LA y ALA en las semillas mientras que los niveles de ácido oleico disminuyeron. Un gel de TI-PCR representativo se muestra en la figura 7, la que muestra claramente la baja expresión de la ∆6-desaturasaen relación con los otros transgenes de pJP3416-GA7.
35 Las plantas y semillas transgénicas que son homocigotas por los transgenes se generan plantando progenies de las estirpes con el DHA más elevado.
Tabla 13. Composición del ácido graso como un porcentaje del total de ácidos grasos en el aceite de semilla de la semilla independiente Brassica napus transformada con pJP3416-GA7, las estirpes CT116-11 y CT-125-2 se 40 compararon con el control de tipo silvestre (sin transformar). 22:6ω3 es DHA. Se refiere a los datos de las semillas B. napus CT125-2 simples mediante "SS".
Control
CT116-11 CT125-2 CT125-2 n.º 2 SS CT125-2 n.º 3 SS CT125-2 n.º 10 SS
14:0
0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1
16:0
4,3 7,2 5,2 6,5 4,7 7,7
16:1
0,2 0,5 0,4 0,3 0,3 0,8
16:3
0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2
18:0
2,1 2,2 2,4 2,3 2,3 2,8
18:1d9
59,1 27,0 38,1 34,0 19,3 14,8
18:1d11
3,7 6,6 4,2 4,4 4,3 9,6
18:2
19,7 14,1 16,6 13,9 10,2 10,2
18:3ω3
8,3 35,2 27,7 34,1 49,5 37,9
20:0
0,6 0,5 0,6 0,4 0,3 0,7
18:4ω3
0,0 0,9 0,3 0,5 0,6 2,6
20:1d11
1,2 1,1 1,0 1,0 0,8 0,6
20:1is0
0,2 0,1 0,2
20:2ω6
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
20:3ω3
1,3 0,7 0,8 1,6 0,9
22:0
0,3 0,4 0,3 0,1 0,1 0,4
20:4ω3
0,1 0,3 0,4 0,6 0,5
22:1
20:5ω3
0,1 0,3
22:3ω3
0,1
24:0
0,2 0,4 0,3 0,1 0,1 0,3
24:1
0,1 0,3 0,1 0,1 0,2 0,1
67
22:5ω3
0,1 0,1 0,1 0,1 0,5
22:6ω3
1,52 1,2 1,3 2,7 8,5
Transformación de B. napus y análisis de la composición del ácido graso usando dos vectores
En otro experimento, en B. napus y como un formato alternativo para introducir los transgenes, se usaron los
5 vectores binarios pJP3115 y pJP3116 tal como se describe en el documento WO 2010/057246 para generar de manera separada plantas de B. napus transformadas y se obtuvieron semillas transformadas a partir de las plantas. El ADN-T en pJP3115 comprendía genes quiméricos que codificaban la Crepis palestina ∆12-desaturasa, Micromonas pusilla ∆6-desaturasa, Pyramimonas cordata ∆6-elongasa y Pavlova salina ∆5-desaturasa y el ADN-T en pJP3116 contenía genes quiméricos que codificaban la Perilla frutescens ∆15-desaturasa, Pyramimonas cordata
10 ∆5-elongasa y Pavlova salina ∆4-desaturasa. Los dos ADN-T, cuando se presentaban juntos y se expresaban en semillas en desarrollo, formaban una vía de 7 genes para producir DHA a partir de ácido oleico producido de manera endógena. Los vectores se introdujeron en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciensmediante procedimientos de electroporación convencionales y las células transformadas se usaron de manera independiente para transformar B. napus usando el método descrito anteriormente para generar plantas de T0 transformadas de manera estable. Se
15 obtuvieron 29 transformantes pJP3115 y 19 pJP3116 y estas plantas se cultivaron hasta la madurez y las semillas obtenidas después de la autofertilización se analizaron para obtener la composición del ácido graso en el aceite de semilla. Se esperaba que la transformación con el ADN-T de pJP3115 resultara en la producción de EPA a partir de ALA producido de manera endógena mientras que se esperaba que la transformación con el ADN-T de pJP3116 resultara en el aumento de la producción de ALA a partir de LA. Se identificaron varias plantas que exhibían este
20 fenotipo. La mayoría de los eventos exhibieron un fenotipo de disminución de OA/aumento de LA debido a la desaturación de 12 con un bajo nivel de producción de EPA. Se observó hasta un 2,6 % de EPA en la semilla transgénica agrupada pJP31115. De manera similar, se encontró que la mayoría de los eventos pJP3116 tenían un fenotipo de ALA elevado debido a la actividad de la 15-desaturasa. Se encontró hasta un 18,5 % de ALA en la semilla transformada agrupada con el ADN-T de pJP3116.
25 Las plantas T1 de las estirpes con los niveles más elevados de EPA y ALA se cruzaron y la semilla progenie (F1) de 24 eventos recuperados se analizaron para obtener el contenido de DHA. Se encontró DHA en 17 de estos eventos con hasta el 1,9 % de DHA encontrado en las semillas agrupadas de estos eventos. Se realizó el análisis de la semilla simple para determinar el intervalo de la producción de DHA -los datos se muestran en la Tabla 14. Se
30 observó un gran intervalo de niveles de DHA en la progenie cruzada, probablemente debido a la naturaleza homocigota de los ADN-T en las plantas parentales, de modo que algunas semillas no recibieron ambos ADN-T. Se observó hasta un 6,7 % de DHA en el total del lípido de la semilla.
Tabla 14. Composición del ácido graso como un porcentaje del total de ácidos grasos en el aceite de semilla de las 35 semillas simples F1 B. napus que se obtuvieron de una cruza de plantas transgénicas por el ADN-T de pJP3115 con plantas transgénicas por el ADN-T de pJP3116. B1, B2 y B4 designan los eventos. 0,0 = no detectable mediante el método CG.
B1.1
B1.2 B1.3 B1.4-g B1.5-g B2.1 B2.2 B2.3g B2.4g B2.5g B3.1 B3.2
14:0
0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1
16:0
6,6 6,4 4,5 12,3 7,9 5,1 5,0 10,1 8,5 6,8 5,3 7,2
16:1
0,4 0,5 0,2 1,0 0,6 0,4 0,4 0,6 1,1 0,5 0,5 0,6
16:3
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,2
18:0
2,3 2,6 2,2 1,6 2,9 2,9 3,4 2,2 1,8 2,9 3,4 2,4
18:1
34,1 39,3 46,9 14,9 20,7 41,6 46,3 14,4 23,4 38,3 43,6 32,0
18:1d11
4,6 5,8 2,7 6,8 6,2 3,8 4,9 5,9 8,7 4,5 5,5 5,1
18:2
33,6 30,7 30,4 29,2 34,4 31,7 27,7 33,2 23,9 33,3 27,9 33,4
18:3ω6
0,2 0,3 0,1 0,4 0,4 0,2 0,2 0,7 0,1 0,2 0,2 0,3
18:3ω3
10,3 7,1 7,7 18,7 14,9 8,2 5,9 14,8 28,1 6,3 7,3 10,0
20:0
0,6 0,7 0,6 0,5 0,7 0,8 0,9 0,6 0,4 0,7 0,9 0,7
18:4ω3
0,2 0,1 0,1 0,8 0,5 0,2 0,2 0,8 0,0 0,2 0,2 0,2
20:1d11
1,0 1,1 1,1 0,7 0,8 1,1 1,1 0,5 0,9 1,1 1,1 0,9
20:1iso
0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1
20:2ω6
0,4 0,3 0,2 0,5 0,5 0,4 0,3 0,4 0,5 0,5 0,3 0,5
20:3ω6
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
68 69
20:4ω6
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0
20:3ω3
1,8 1,6 1,1 2,8 2,1 1,1 1,0 2,7 0,7 1,4 0,9 1,6
22:0
0,3 0,4 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 0,3 0,3 0,4 0,5 0,4
20:4ω3
0,3 0,2 0,2 0,4 0,4 0,1 0,1 0,5 0,0 0,2 0,1 0,2
22:1
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
20:5ω3
0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0
22:2ω6
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
22:4ω6
0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,4 0,2 0,2 0,1 0,2
24:0
0,3 0,4 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,3
22:5ω6
0,1 0,2 0,1 0,2 0,3 0,1 0,1 0,5 0,0 0,2 0,1 0,2
24:1
0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2
22:5ω3
0,7 0,7 0,3 2,1 1,6 0,3 0,4 3,2 0,0 0,5 0,4 1,2
22:6ω3
1,4 1,0 0,5 5,5 3,9 0,8 0,7 6,7 0,0 1,1 0,8 2,0

Tabla 15. Los datos compilados del total de los perfiles de lípidos de las semillas de semillas transgénicas se muestran en la Tabla 14. Los cálculos no incluyen los "ácidos grasos menores" en la Tabla 14.
Parámetro
B1.1 B1.2 B1.3 B1.4-g B1.5-g B2.1 B2.2 B2.3g B2.4g B2.5g B3.1
w3 total (% del total de FA)
4,6 3,9 2,3 12,1 9 2,7 2,6 14,8 0,8 3,6 2,6
w6 total (% del total de FA)
44,5 38,5 38,5 48,8 50,3 40,5 34,1 49,4 52,7 40,5 35,7
relación w3 / w6
0,10 0,10 0,06 0,25 0,18 0,07 0,08 0,30 0,02 0,09 0,07
relación w6 /w3
9,67 9,87 16,74 4,03 5,59 15,00 13,12 3,34 65,8 8 11,25 13,73
w3 nuevo total (% del total de FA)
2,6 2 1,1 8,9 6,5 1,4 1,4 11,4 0 2 1,5
w6 nuevo total (% del total de FA)
10,5 7,5 7,9 19,1 15,4 8,4 6,1 15,8 28,3 6,7 7,5
relación nuevo w3 / w6
0,25 0,27 0,14 0,47 0,42 0,17 0,23 0,72 0,00 0,30 0,20
relación w6 nuevo / w3
4,04 3,75 7,18 2,15 2,37 6,00 4,36 1,39 3,35 5,00
Eficacia de OA en EPA
2,5 % 2,1 % 0,9 % 10,1 % 6,9 % 1,3 % 1,3 % 12,8 % 1,9 % 1,4 %
Eficacia de OA en DHA
1,7 % 1,2 % 0,6 % 7,2 % 4,8 % 0,9 % 0,8 % 8,5 % 1,3 % 1,0 %
Eficacia de LA en EPA
4,3 % 4,0 % 2,0 % 12,6 % 9,4 % 2,5 % 3,0 % 15,7 % 3,6 % 3,1 %
Eficacia de LA en DHA
2,9 % 2,4 % 1,2 % 9,0 % 6,6 % 1,9 % 1,9 % 10,4 % 2,5 % 2,1 %
Eficacia de ALA en EPA
47,7 % 44,7 % 36,4 % 68,1 % 65,9 % 44,0 % 45,8 % 72,1 % 47,1 % 50,0 %
Eficacia de ALA en DHA
31,8 % 26,3 % 22,7 % 48,7 % 45,9 % 32,0 % 29,2 % 47,9 % 32,4 % 33,3 %
Total de sustratos
10,2 10,6 7,9 15,1 12,4 9,6 10,2 13,7 11,6 11,3 10,6
Total de monoinsaturad os
40,4 47 51,1 23,8 28,7 47,2 53 21,8 34,7 44,7 51
Total de poliinsaturados
49,2 42,5 40,9 61 59,4 43,3 36,8 64,3 53,7 44,2 38,4
Total de C20
4,2 4 3,2 5,1 4,7 3,6 3,5 5,1 2,8 4 3,4
total de C22
2,6 2,5 1,3 8,3 6,4 1,7 1,8 11,1 0,5 2,4 1,9
imagen52
Dado que las semillas T1 agrupadas representaban poblaciones que eran segregantes para los transgenes e incluían cualquier segregante nulo, se espera que las semillas homocigotas de las plantas progenie tendrán niveles de DHA aumentados, de hasta un 20 % del total del contenido de ácido graso en el aceite de la semilla. Las otras construcciones modificadas fueron usadas para transformar la A. thaliana. Aunque se obtuvo un pequeño número de
5 las estirpes transformadas, ninguna produjo niveles de DHA más elevados que la construcción modB.
La construcción pJP3416-GA7-modB también se usó para generar plantas de B. napus transformada de la variedad cultivada Oscar y en una estirpe de fitomejoramiento denominada NX005. Se obtuvieron diez plantas transformadas independientes (T0) hasta ahora para la transformación Oscar, y 20 estirpes independientes para NX005. La semilla 10 (la semilla T1) se cosechó de estas estirpes transgénicas. Se realizaron pruebas a grupos de semillas para obtener los niveles de DHA en el aceite de la semilla, y se seleccionaron las dos estirpes que mostraron los niveles más elevados, estas eran estirpes denominadas CT132.5 (en la variedad cultivada Oscar) y CT133.15 (en NX005). Se embebieron veinte semillas de CT132.5 y 11 semillas de CT133.15, después de dos días, se extrajo el aceite de medio cotiledón de cada semilla individual. La otra mitad de los cotiledones con ejes embrionarios se mantuvieron y 15 cultivaron en un medio para mantener las estirpes de progenie específicas. Se determinó la composición de ácido graso en el aceite; los datos se muestran en la Tabla 16 para CT132.5. El nivel de DHA en diez de las 20 semillas analizadas se ubicó en el intervalo de 7-20 % del contenido total de ácido graso que se determinó mediante el análisis CG. Otras semillas tenían menos de un 7 % de DHA y pudo contener una copia parcial (incmpleta del ADN-T de pJP3416-GA7-modB. La estirpe transgénica parecía contener múltiples inserciones de transgenesque no
20 estaban unidas genéticamente. Las semillas de la estirpe transgénica CT133.15 exhibieron niveles de DHA en el intervalo del 0-5 %. Era probable que las semillas sin DHA fueran segregantes nulas. Estos datos confirmaron que la construcción modB tuvo un buen desempeño en la producción de DHA en las semillas de colza.
Las construcciones pJP3416-GA7-modB y pJP3416-GA7-modF también se usaron para generar plantas de
25 Camelina sativa. Se obtuvieron al menos 24 plantas transformadas independientes (T0) y se examinaron más detalladamente mediante el análisis de progenie. La semilla (la semilla T1) se cosechó de estas estirpes transgénicas. Se realizaron pruebas a grupos de semillas para obtener los niveles de DHA en el aceite de la semilla, y se seleccionaron las 6 estirpes que mostraron los niveles más elevados de DHA (entre el 6 % y el 9 %). Los niveles de DHA en 20 semillas T1 de cada estirpe se analizaron -la mayoría de las semillas exhibieron niveles de
30 DHA en del 6-14 % del contenido total de ácido graso que se determinó mediante el análisis CG. Se determinó la composición de ácido graso en el aceite; los datos se muestran en la Tabla 17 para varias semillas transgénicas. Estos datos confirmaron que las construcciones modB y modF tuvieron un buen desempeño en la producción de DHA en las semillas de Camelina.
35 Tabla 16. Los perfiles de ácido graso de la mitad de los cotiledones de las semillas de B. napus transgénica T1 en germinación contenían la construcción modB. Se observó hasta un 18,1 % de DHA con numerosas muestras que contenían más que 10 % de DHA
Semi imagen53 a
14:0 16:0 16:1d3? 16:1 16:3 18:0 18:1 18:1d11 18:2 18:3n6 18:3n3 20:0 18:4n3 C20:1d11 20:1d13 C20:2n6 C20:3n3 C22:0 20:4n3 20:5n3 22:3n3 C24:0 C24:1 22:5n3 C22:6n3
1
0,1 4,2 0,1 0,1 0,2 1,8 29,9 2,5 9,9 0,1 38,4 0,5 0,8 1,0 0,0 0,1 2,1 0,3 2,8 0,3 0,1 0,2 0,2 0,5 3,9
2
0,1 4,7 0,1 0,1 0,2 4,0 23,0 2,3 7,4 0,3 29,3 1,0 4,3 1,1 0,0 0,1 1,9 0,4 6,9 1,0 0,0 0,3 0,1 1,7 9,5
3
0,1 3,7 0,2 0,1 0,2 1,8 55,1 1,9 4,7 0,2 15,2 0,8 1,8 1,4 0,0 0,1 0,3 0,5 11,3 0,0 0,0 0,3 0,2 0,0 0,0
4
0,1 4,6 0,2 0,2 0,2 2,9 22,1 1,8 6,6 0,4 26,5 1,0 7,2 1,0 0,0 0,1 0,8 0,5 11,2 1,9 0,0 0,2 0,2 1,7 8,7
5
0,1 4,0 0,1 0,1 0,2 1,7 27,4 2,1 8,1 0,3 26,4 0,6 2,8 1,0 0,0 0,1 1,5 0,3 7,6 1,5 0,0 0,1 0,1 1,8 12,2
6
0,1 3,5 0,1 0,1 0,2 1,6 59,8 2,0 4,3 0,1 18,5 0,6 0,5 1,3 0,0 0,0 0,7 0,3 6,0 0,0 0,0 0,2 0,1 0,0 0,0
7
0,1 6,0 0,3 0,3 0,3 1,7 16,6 2,6 23,9 1,0 23,2 0,6 5,4 0,8 0,0 0,2 0,6 0,4 2,6 1,1 0,0 0,3 0,3 1,7 9,9
8
0,1 4,9 0,1 0,1 0,2 2,7 12,9 1,4 11,7 0,3 34,3 0,9 5,0 0,9 0,0 0,2 2,4 0,5 4,1 1,3 0,0 0,2 0,2 1,8 13,8
9
0,1 3,9 0,1 0,1 0,1 2,4 41,6 1,7 21,5 0,0 23,4 0,7 0,0 1,2 0,0 0,1 2,2 0,4 0,0 0,0 0,1 0,3 0,2 0,0 0,0
10
0,1 3,7 0,2 0,1 0,1 2,1 30,9 1,7 19,2 0,4 23,6 0,7 2,1 1,1 0,0 0,1 1,5 0,4 3,6 0,6 0,0 0,2 0,1 0,7 6,9
11
0,1 5,7 0,4 0,3 0,2 3,8 41,2 2,4 26,7 2,1 7,2 1,3 0,3 1,2 0,0 0,2 0,3 0,8 4,8 0,0 0,0 0,6 0,3 0,0 0,0
12
0,1 4,6 0,0 0,1 0,2 2,4 25,5 1,7 16,1 0,3 28,9 0,8 3,9 1,1 0,0 0,1 1,9 0,4 3,9 0,6 0,0 0,2 0,0 1,1 6,2
13
0,1 4,3 0,1 0,1 0,1 4,2 19,4 1,6 9,2 0,1 45,5 1,0 0,2 1,1 0,0 0,1 5,2 0,4 2,6 0,3 0,2 0,2 0,1 0,4 3,4
14
0,1 6,3 0,2 0,2 0,2 4,0 10,5 2,3 8,4 0,3 31,1 1,3 3,9 0,8 0,0 0,1 2,3 0,6 4,6 1,8 0,1 0,3 0,2 2,5 18,1
15
0,1 5,1 0,1 0,2 0,2 3,3 16,8 2,4 11,2 0,3 28,8 1,0 4,5 0,9 0,0 0,1 2,1 0,6 3,2 1,5 0,1 0,3 0,1 1,8 15,1
16
0,1 4,4 0,1 0,1 0,2 4,0 16,2 1,5 11,6 0,2 33,5 0,9 2,8 1,1 0,0 0,2 3,7 0,4 4,6 0,7 0,1 0,3 0,1 1,3 12,1
17
0,2 7,2 0,2 0,2 0,2 4,9 15,0 2,1 8,9 0,3 25,9 1,4 5,1 0,9 0,0 0,0 1,6 0,8 4,9 2,1 0,0 0,6 0,3 2,2 15,0
18
0,1 4,0 0,1 0,1 0,2 2,3 64,8 1,2 7,2 0,1 12,5 1,0 3,5 1,5 0,0 0,1 0,0 0,7 0,0 0,0 0,0 0,5 0,2 0,0 0,0
19
0,1 3,9 0,1 0,1 0,2 4,6 36,9 1,7 7,1 0,2 28,6 1,2 1,8 1,2 0,0 0,1 1,4 0,5 4,3 0,4 0,0 0,4 0,1 0,8 4,3
20
0,1 4,8 0,1 0,1 0,2 6,0 18,5 1,2 12,8 0,2 34,8 1,4 2,4 1,1 0,0 0,1 3,4 0,6 3,2 0,4 0,1 0,3 0,1 0,7 7,6
71
imagen54
imagen55
imagen56
aceite de la semilla producido en las semillas de B. napus, un resultado que refleja los niveles de producción más eficaces observados en A. thaliana. Se espera que la inserción de múltiples T-ADN en el estado homocigoto para elevar el nivel de DHA al 20 % en B. napus.
5 Tabla 20. Composición de ácidos grasos prevista para los ácidos grasos seleccionados como un porcentaje del
contenido total de ácidos grasos en el aceite de la semilla de Brassica napus transformada con una construcción de vía de DHA, basada en las eficiencias enzimáticas observadas en Arabidopsis transgénica. Las enzimas se enumeran en orden en la vía para la producción de DHA a partir de ácido oleico. des = desaturasa, elo = elongasa. Las composiciones de ácidos grasos previstos n.º 1, n.º 2 y n.º 3 se basan en las eficacias en la mitad superior de la
10 Tabla.
Enzima
n.º 1 n.º 2 n.º 3
d12-des
70 % 75 % 80 %
d15-des
70 % 75 % 80 %
d6-des (ω3)
30 % 35 % 40 %
d6-elo
80 % 80 % 90 %
d5-des
80 % 90 % 90 %
d5-elo
80 % 90 % 90 %
d4-des
80 % 90 % 90 %
Ácido graso
Tipo salvaje n.º 1 n.º 2 n.º 3
18:1d9
59 % 26 % 22 % 18 %
18:2ω6
20 % 19 % 17 % 14 %
18:3ω6
1 % 2 % 3 %
18:3ω3
8 % 30 % 32 % 34 %
18:4ω3
3 % 3 % 2 %
20:4ω3
2 % 1 % 2 %
20:5ω3
2 % 1 % 2 %
22:5ω3
1 % 1 % 2 %
22:6ω3
5 % 10 % 15 %
Ejemplo 9. Expresión estable de una vía de EPA transgénico en una hoja de la planta
15 Construcción del vector binario
Un vector binario, pORE04+11ABGBEC_caupí_EPA_inserto (SEQ ID NO:8) fue diseñado para la introducción de un ADN-T en las plantas para la síntesis de EPA en los tejidos de la hoja. Contenía genes quiméricos que codificaban las enzimas: ∆6-desaturasa de M. pusilla (SEQ ID NO:16), ∆6-elongasa de P. cordata (SEQ ID NO:25) y ∆520 desaturasa de P. salina (SEQ ID NO:30), cada una bajo el control de CaMV 35S y promotores de la pequeña subunidad de rubisco deA. thaliana (SSU) (Figure 9). El vector binario se construyó sintetizando la región 199-10878 de SEQ ID 2 en el vector binario receptor pORE04 (Coutu et al., 1997) en los sitios BsiWI y KasI. Los tres genes de biosíntesis de ácidos grasos codificados para las enzimas requeridas para convertir ALA, 18:3∆9,12,15 en EPA,
20:5∆5,8,11,14,17
. 25 Expresión transitoria de la construcción EPA en las células de las hojas de N. benthamiana
Para probar que las construcción era correcta y expresaría los genes eficazmente en los tejidos de las hojas, el vector quimérico pORE04+11ABGBEC_caupí_EPA_insertado se introdujo en la cepa AGL1 de A. tumefaciens. 30 También se introdujo un vector quimérico 35S:p19 a la cepa AGL1 de A. tumefaciens tal como se describe en el Ejemplo 1. Las células de los cultivos de estos infiltrados en los tejidos de las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana en una habitación de cultivo a 24 ºC. Varias comparaciones directas se infiltraron con las muestras que se comparan situadas a ambos lados de la misma hoja. Los experimentos se realizaron por triplicado. Después de la infiltración, las plantas se cultivaron durante otros cinco días antes de que se tomaran discos de hojas para el perfil
35 de ácido graso por análisis de CG como se describe en el Ejemplo 1. El análisis por CG reveló que el vector de EPA estaba funcionando para producir EPA en la hoja de Nicotiana benthamiana (Tabla 21) con el mayor nivel de EPA encontrado del 10,7 % de los lípidos totales de las hojas.
75
Transformación estable de Nicotiana tabacum
El vector quimérico pORE04+11ABGBEC_caupí_EPA_inserto se usó para transformar de manera estable la Nicotiana tabacum. El vector se introdujo a la cepa AGL1 de A. tumefaciens mediante un procedimiento de
5 electroporación convencional. Las células transformadas se cultivaron en un medio LB sólido complementado con kanamicina (50 mg/l) y rifampicina (25 mg/l) y se incubaron a 28 ºC durante dos días. Una sola colonia se usó para iniciar el cultivo fresco. Después de 48 h de cultivo vigoroso, las células se recogieron por centrifugación a 2,000xg y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en solución fresca que contenía un 50 % de LB y un 50 % de un medio de EM en la densidad de DO600 = 0,5.
10 Tabla 21. Composición de ácidos grasos de los lípidos totales de hoja de los eventos de Nicotiana benthamiana (transitoria) y Nicotiana tabacum (transformante primario estable) transgénicas con los más altos niveles de EPA de cada experimento.
N. benthamiana
N. tabacum
14:0
0,1 0,1
16:0
18,5 17,8
16:1w13t
2,2 3,8
16:1d9
0,1 0
16:3
6,2 5,7
18:0
3,4 3,2
18:1d11
0,3 0,3
20:0
0,5 0,5
22:0
0,2 0,3
24:0
0,1 0,4
18:1
2,9 1,6
18:2ω6
12,6 14,5
Omega-6
18:3ω6 2,3 2,9
20:2ω6
0,0 0,0
20:3ω6
0,1 0,0
20:4ω6
0,3 0,7
Omega-3
18:3ω3 37,1 32,4
18:4ω3
1,6 1,9
20:3ω3
0,1 0,3
20:4ω3
0,3 1,1
20:5ω3
10,7 12,1
22:5ω3
0,3 0,4
15 Las muestras de hojas de la variedad N. tabacum W38 cultivada in vitro fueron extirpadas y cortadas en secciones cuadradas de aproximadamente el 0,5-1 cm2 de tamaño con un bisturí afilado mientras estaban inmersas en la solución de A. tumefaciens. Los trozos de hojas de N. tabacum heridos sumergidos en A. tumefaciens se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser secados en un papel de filtro estéril y se transfirieron a placas de EM y sin complemento. Tras un período de cocultivo de dos días a 24 ºC, los explantes se
20 lavaron tres veces con un medio estéril, líquido EM, después se secaron con papel de filtro estéril y se colocaron en el agar de selección EM complementado con 1,0 mg/l de bencilaminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido indolacético (IAA), 50 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de cefotaxima. Las placas se incubaron a 24 ºC durante dos semanas para permitir el desarrollo de los brotes de los trozos de hojas de N. tabacum transformadas.
25 Para establecer plantas transgénicas enraizadas in vitro, brotes verdes saludables se cortaron y se transfirieron a macetas de cultivo de tejidos de 200 ml que contenían un medio agar EM suplementado con 25 g/l de IAA, 50 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de cefotaxima. Brotes transgénicos se transfirieron a suelo después de enraizamiento y se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. Se tomaron discos de hojas uficientemente grandes de 21 plantas
76
imagen57
∆5-elo
3% 4% 10%
Las muestras de hojas de plantas N. tabacum T3 homocigotas se sometieron a análisis bioquímicos adicionales. Los lípidos totales se extrajeron a partir de material de hojas secadas por congelamiento y se fraccionaron mediante cromatografía en capa fina (CCF). Se encontró que EPA estaba presente en el N. tabacum TAG en más de un
5 30,1 % así como en los lípidos polares a en un 6,3 % (Tabla 23). Fue interesante destacar que el EPA producido por la vía transgénica estaba presente en todas las fracciones de lípido evaluadas incluidos TAG, MGDG, DGDG, SQDG, PG, PC, PE, PI y PS. Todos los grupos de lípidos contenían bajos niveles de nuevos intermedios o ácidos grasos LC-PUFA ω6 siendo la relación de TAG de los ácidos grasos ω3 nuevos con respecto a los ω6 10:1.
10 Transformación estable de caupí
El vector quimérico pORE04+11ABGBEC-caupí-EPA-inserto se transformó en caupí (Vigna unguiculata) tal como sigue. Las semillas secas maduras son el material de partida preferido aunque las semillas cosechadas de vainas inmaduras a un peso fresco máximo de las semillas también pueden usarse. Las semillas secas se desgranan a
15 mano para evitar la fractura de la cubierta de las semillas y de esta forma se reduce la contaminación con microorganismos.
Las semillas secas o las vainas inmaduras se sumergen en etanol al 70 % durante 2 min y luego se tratan durante 30 min en lejía comercial al 20 % (8,4 g/l de concentración final de hipoclorito de sodio). Después, estas semillas se 20 lavan varias veces con agua estéril. Las semillas inmaduras se eliminan asépticamente de las vainas mientras que las semillas maduras se embeben durante la noche. Dos explantes diferentes pueden usarse para la producción múltiple de brotes, es decir, el eje embrionario y el cotiledón en sí mismo, preferentemente el cotiledón con el eje embrionario bisecado unido. Las puntas de los brotes y las semillas se eliminan del eje antes de lesionar el nodo de cotiledones, es decir, el punto de unión del eje al cotiledón. A partir de una comparación inicial de 19 cultivos y
25 estirpes, está claro que la mayoría de las estirpes de caupí pueden transformarse, siendo la única salvedad que diferentes condiciones de cultivo de tejido necesitan ser optimizadas para cada estirpe.
polar total (PL), monogalactosildiacilglicerol (MGDG), digalactosildiacilglicerol (DGDG), sulfoquinovosildiacilglicerol
30 (SQDG), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI) y fosfatidilserina (PS) a partir de muestras de hojas de Nicotiana tabacum. Los errores representan la desviación típica de múltiples muestras. Se observó hasta un 30 % de EPA en el TAG de la hoja con EPA también distribuido a través de los lípidos polares. Las diferencias entre los perfiles de las hojas jóvenes y maduras también se observaron por varios ácidos grasos.
35

Tabla 23. Análisis de fracciones del lípido de hojas jóvenes y maduras (joven | madura) de triacilglicerol (TAG), lípido
TAG PL
ClMGDG oroplastídico DGDG SQDG PG Extracloroplastídico PC PE PI PS
16:0 16:1ω1 3t 16:3 18:0 Menor OA LA ALA Omega-6GLA 20:2ω6 DGLA ARA Omega-3SDA 20:3ω3 ETA
9,8 | 18,3 17,8 | 23,8 0 | 0 3,4 | 3,1 0,2 | 0,9 5,6 | 6,4 7,3 | 3,7 2,9 | 3,9 2,5 | 2,9 1,4 | 2,4 5,5 | 0,8 2,8 | 1,1 27,7 | 13,7 17,3 | 12,3 9,6 | 17,2 39,0 | 34,4 2,5 | 3,0 1,5 | 2,1 0 | 0 0,1 | 1,1 0 | 0 0 | 0 0,6 | 0,9 0,1 | 0,2 4,0 | 7,6 1,6 | 2,0 0,2 | 0,3 0,1 | 0,2 0,9 | 0,2 0,2 | 0,3 3,1 | 3,2 0 | 0 14,8 | 19,4 1,1 | 1,2 1,0 | 0,4 0,8 | 0,3 8,0 | 6,8 60,3 | 51,9 2,1 | 3,0 0 | 0 0 | 0 0,2 | 0,4 1,7 | 2,0 0 | 0 0 | 0,2 18,0 | 16,8 48,3 | 50,0 0 | 0 0 | 0 1,2 | 1,8 0,4 | 1,2 3,5 | 3,5 5,4 | 7,1 0,8 | 1,0 1,9 | 2,1 1,8 | 1,0 2,7 | 1,3 9,2 | 10,5 11,7 | 8,9 61,2 | 58,6 23,7 | 21,5 1,1 | 1,8 1,4 | 1,9 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0,6 | 0,7 1,2 | 1,2 0,2 | 0,3 0 | 0 0 | 0,3 0 | 0 21,0 | 26,4 34,0 | 32,0 0 | 0 4,7 | 6,9 1,0 | 1,5 5,3 | 4,9 17,1 | 13,2 15,7 | 14,1 0,2 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0,1 0 | 0 22,9 | 30,0 24,0 | 30,5 38,7 | 43,3 31,9 | 36,2 0 | 0 0 | 0 0 | 0 1,0 | 1,4 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 6,6 | 9,1 11,0 | 11,4 9,4 | 9,3 20,2 | 19,4 1,4 | 1,6 4,9 | 4,1 6,5 | 7,7 2,5 | 3,7 8,1 | 2,9 2,5 | 1,1 2,5 | 0,8 4,9 | 2,3 39,2 | 25,2 37,9 | 28,5 22,0 | 13,4 24,4 | 17,1 7,3 | 18,2 5,5 | 10,5 7,6 | 10,0 4,8 | 10,5 1,8 | 2,5 1,7 | 2,7 0,8 | 0,9 1,1 | 1,3 0 | 0 0,5 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0 | 0 0,3 | 0,3 0,4 | 0,4 0,4 | 0,6 0 | 0,2 2,1 | 3,6 1,3 | 2,0 0,8 | 0,8 0,9 | 1,6 0,2 | 0 0,3 | 0,4 0 | 0 0 | 0 0,2 | 0 0,4 | 0,2 0,1 | 0,2 0 | 0
78
imagen58
imagen59
Muestra
CT110-3n.º 1 CT110-3n.º 2 CT110-3n.º 3 CT110-3n.º 4 CT110-3n.º 5 CT110-3n.º 6 CT110-3n.º 7 CT110-3n.º 8 CT110-3n.º 9
C14:0
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
C16:0
4,3 4,2 4,1 4,5 3,8 4,3 4,0 5,0 4,7
16:1d7
0,1 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1
C16:1d9
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3
16:3
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
C18:0
1,9 1,9 1,3 1,8 2,1 1,8 2,4 3,1 2,2
C18:1
58,1 59,4 55,5 59,1 62,1 56,0 57,2 52,0 53,2
C18:1d11
3,5 3,6 3,0 3,2 2,9 3,6 3,2 4,4 3,5
C18:2
18,4 17,1 19,2 17,3 17,4 18,7 19,0 20,3 20,2
C18:3ω6
0,3 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3
C18:3ω3
8,2 9,0 11,1 8,6 7,5 10,2 9,8 9,3 9,8
C20:0
0,5 0,5 0,4 0,5 0,6 0,5 0,6 0,7 0,6
18:4ω3
2,4 2,0 2,8 2,5 1,4 2,6 1,3 2,4 3,2
C20:1d11
1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 1,1 1,2 1,1 1,1
20:1iso
0,03 0,03 0,03 0,03 0,01 0,03 0,02 0,03 0,02
C20:2ω6
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
C22:0
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2
C24:0
0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,2 0,3 0,2
C24:1
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
% de ∆6-des
22,9 17,9 20,3 22,8 15,8 20,2 11,7 20,9 24,9
Por tanto, para beneficiarse de la ventaja de las eficacias de conversión más elevadas de la ∆6-desaturasa conferidas por el ADN-T a partir de pJP3367, se cruzaron plantas de B. napus transformadas con este ADN-T con plantas transformadas con el ADN-T a partir de pJP3416-GA7 (Ejemplo 4) para producir plantas y semillas progenie
5 que contengan los dos ADN-T. La composición de ácido graso del aceite extraído de las semillas F1 se analiza mediante CG para obtener el contenido de DHA y los contenidos de otros ácidos grasos. Se observa un aumento del nivel de DHA como consecuencia del aumento en la expresión de la ∆6-desaturasa. Se producen plantas que son homocigotas para ambos ADN-T y deberían producir niveles de DHA más elevados.
10 Ejemplo 11 Aumento de la acumulación de ácidos grasos mediante el uso de proteínas supresoras del silenciamiento
Construcción del vector binario:
15 El documento WO 2010/057246 describe el uso de proteínas supresoras del silenciamiento (SSP) para aumentar la expresión del transgén en las semillas de las plantas. Para demostrar que el uso de dichas proteínas puede potenciar y estabilizar la producción de LC-PUFA en las oleaginosas en varias generaciones, se seleccionaron varias SSP para someterlas a prueba, a saber, V2 (N.º de acceso GU178820.1), p19 (N.º de acceso AJ288943.1), p38 (N.º de acceso DQ286869.1) y P0PE (N.º de acceso L04573.1). p19 es una proteína supresora del virus del
20 enanismo arbustivo del tomate (TBSV) que se une a ARNip con una longitud de 21 nucleótidos antes de que guíen la escisión guiada por argonauta de ARN (Voinnet et al., 2003) homólogo. V2, una proteína supresora del virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV), se une a la proteína vegetal SGS3 (Glick et al., 2008), una proteína que se creía necesaria para la producción de intermedios del ARN de cadena doble a partir de sustratos de ARN monocatenario negativo (Beclin et al., 2002), o se une a estructuras de ARN bicatenario que tienen un excedente en el extremo 5’
25 (Fukunaga et al., 2009). p38 es una proteína supresora del virus del arrugado del nabo (TCV) que interfiere con los mecanismos de silenciamiento vegetal uniéndose a las proteínas Dicer and Argonauta (Azevedo et al., 2010). Las proteínas P0 tales como P0PE y RPV-P0, a partir polerovirus, proteínas Argonauta objetivo para la degradación potenciada (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007, Fusaro et al., 2012). Por tanto, las construcciones genéticas se prepararon para la expresión de estas SSP en las semillas vegetales en combinación con un conjunto
30 de genes de la biosíntesis de ácidos grasos para la producción de ARA (20:4∆5,8,11,14) a partir de LA (18:1∆9,12), como sigue.
81
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Claims (1)

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