TWI612137B - 含免疫細胞之組成物的製造方法及癌症治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種使單核細胞非常均衡地分化成NK細胞、NKT細胞和T細胞，並使該等細胞增殖之方法。本發明提供一種含免疫細胞之組成物的製造方法，包含以下步驟：第1步驟，於含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基中培養單核細胞；及，第2步驟，於上述第1步驟後，在使單核細胞優先分化成細胞毒性T細胞之條件下進行培養。於上述第2步驟後亦可包含第3步驟，該第3步驟是於含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基中進行培養。
Description
本發明關於一種含免疫細胞之組成物的製造方法及癌症治療用組成物。
近年來，在癌症治療方面，開發出了各種各樣的方法，尤其，增強患者體內的免疫力之免疫療法備受關注。作為免疫療法，可列舉例如細胞免疫療法等。
細胞免疫療法，是一種使來自患者的免疫細胞，在體外活化及增殖等後，再次回輸至該患者的體內，藉此來提高該患者的免疫力之方法，該方法亦被稱為間接免疫療法(adoptive immunotherapy)等。例如，淋巴球激素活化殺手細胞療法(Lymphokine activated Killer療法，LAK療法)是細胞免疫療法的一種，是如下方法：由從患者採集之血液，分離單核細胞，使該單核細胞主要分化成細胞毒性T細胞等細胞，並回輸至患者體內。另外，作為其他的細胞免疫療法，已知一種使用自然殺手細胞(Natural Killer Cell，NK細胞)等細胞之方法(例如，專利文獻1)。
專利文獻1：日本特表2011-529341號公報
另一方面，本發明人發現以下事項：如以往的細胞免疫療法般，使單核細胞分化成細胞毒性T細胞等單一的免疫細胞，並使該免疫細胞增殖，將如此所獲得之培養物回輸至體內，並非一定能夠增強體內的免疫力。因此，本發明之目的在於：使單核細胞非常均衡地分化成複數種免疫細胞(尤其是NK細胞、NKT細胞和T細胞)，並使該等細胞增殖。
本發明人發現，於免疫細胞的製造方法中，藉由將特定的細胞培養步驟加以組合，可解決上述問題，從而完成本發明。具體而言，本發明提供如下所述的各項。
(1)一種含免疫細胞之組成物的製造方法，包含以下步驟：第1步驟，於含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基中培養單核細胞；及，第2步驟，於上述第1步驟後，在使單核細胞優先分化成細胞毒性T細胞之條件下進行培養。
(2)如(1)所述之含免疫細胞之組成物的製造方法，其中，於上述第2步驟後包含第3步驟，該第3步驟是於含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基中進
行培養。
(3)一種癌症治療用組成物，包含以如(1)或(2)所述之製造方法製造出來的含免疫細胞之組成物。
根據本發明，提供一種使單核細胞非常均衡地分化成NK細胞、NKT細胞和T細胞，並使該等細胞增殖之方法。
第1(A)圖繪示從6名健康人回收之PBMC的細胞數；第1(B-1)圖和第1(B-2)圖繪示關於所獲得之PBMC之螢光激活細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)分析的具代表性的結果。
第2圖繪示關於從健康人回收之PBMC之FACS分析的具代表性的結果。
第3圖繪示關於本發明的實施例中獲得之含免疫細胞之組成物之FACS分析的具代表性的結果。
第4圖繪示關於本發明的實施例中獲得之含免疫細胞之組成物之FACS分析的結果。
第5圖繪示關於本發明的實施例中獲得之含免疫細胞之組成物之細胞毒性的測定結果。
以下，就本發明的實施形態進行說明，但並不意圖限定本發明。
本發明的含免疫細胞之組成物的製造方法，包含於特定條件下進行培養之第1步驟和第2步驟。以下，對各步驟加以說明。再者，本發明中的「含免疫細胞之組成物」，是指至少含有NK細胞、NKT細胞和T細胞之組成物。
<第1步驟(NK細胞增殖步驟)>
本發明中的第1步驟是如下步驟：於後述之培養基中培養單核細胞，使單核細胞分化成NK細胞和NKT細胞等細胞，並且使NK細胞和NKT細胞等細胞增殖。於該步驟中，不只使單核細胞分化成NK細胞和NKT細胞，亦選擇性地分化成γδT細胞等細胞，並使之擴增。NK細胞(自然殺手細胞)、NKT細胞(自然殺手T細胞)、及γδT細胞，分別是淋巴細胞的一種，已知該等細胞具有攻擊癌細胞的作用。再者，於本發明中，「NK細胞等細胞」，至少指NK細胞和NKT細胞。
(單核細胞)
單核細胞，是淋巴細胞和單核白血球的總稱。單核細胞，是使用離心分離、磁珠、流式細胞術(flow cytometry)等公知的方法，從體液(末梢血、骨髓、臍帶血等血液等)來獲得。作為單核細胞，亦可以是從誘導式多能性幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPS細胞)、胚幹細胞(Embryonic Stem Cell，ES細胞)及體細胞幹細胞等幹細胞誘導產生之單核細胞。於本發明中，較佳為使用末梢血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)等來作為單核細胞。
作為以往的用於採集細胞免疫療法中所需的單核細胞之方法，已知下述方法：使用成分採血裝置，分離血液中的白血球(將該方法稱為「分離術捐血(apheresis)」)。但是，血球分離在裝置的運用上耗費成本，並且要求高水準的技術以操作裝置。
進一步，為了利用細胞免疫療法獲得所期望的治療效果，例如在使用淋巴細胞之情況下，回輸至患者體內之免疫細胞總數，較理想為10億個以上。然而，由於血液中所存在之單核細胞的比例較少，因此為了確保多達10億個以上的細胞數，通常，必須從同一對象隔開間隔進行複數次血球分離。但是，複數次的血球分離，在體力方面和時間方面對患者造成非常大的負擔。而且，藉由血球分離可採集之單核細胞的數目會根據患者的血液狀態等而變動。
另一方面，於本發明的製造方法中，由於可使單核細胞有效地分化成免疫細胞，並使免疫細胞增殖，因此，用來獲得單核細胞之血液的量為少量即可(例如，1~100mL，較佳為1~50mL)，並且，1次採血即可足夠。因此，相較於以往所使用的血球分離等方法，本發明可顯著減低為了獲得單核細胞而對患者造成的負擔(費用、時間等)。但是，本發明中的單核細胞，亦可以是藉由血球分離所獲得之單核細胞。
(培養基)
第1步驟中的培養基含有：IL-2(介白素-2，interleukin-2)
及/或IL-15(介白素-15)、和抗CD16單株抗體。含有IL-2、IL-15和抗CD16單株抗體之培養基，可使單核細胞尤其是選擇性地分化成NK細胞、NKT細胞、及γδT細胞等細胞，就這一點而言為較佳。藉由該培養基，可使單核細胞分化成NK細胞、NKT細胞、及γδT細胞等細胞，並使該等免疫細胞增殖。
用於從單核細胞分化成NK細胞等細胞以及使之增殖而較佳之培養基中的IL-2的濃度並無特別限定，可以是1~200000IU/mL，較佳為100~200000IU/mL，最佳為1000~200000IU/mL。另外，用於從單核細胞分化成NK細胞等細胞以及使之增殖而較佳之培養基中的IL-15的濃度並無特別限定，可以是1~100ng/mL，較佳為1~50ng/mL，最佳為1~30ng/mL。另外，用於從單核細胞分化成NK細胞等細胞以及使之增殖而較佳之培養基中的抗CD16單株抗體的濃度並無特別限定，可以是1~100000ng/mL，較佳為10~100000ng/mL，最佳為100~100000ng/mL。IL-2、IL-15和抗CD16單株抗體，能夠以上述濃度範圍調配至第1步驟中的培養基中。
本發明中的培養基中，除了IL-2及/或IL-15、以及抗CD16單株抗體以外，亦可含有公知的NK細胞刺激劑(抗NKp46抗體等)、NKT細胞刺激劑(抗T細胞受體可變區a24抗體(anti-T-Cell Receptor Variable Region a24 antibody，抗
TCRVa24抗體)、抗TCRVb11抗體、α-半乳糖苷基神經醯胺(α-galactosylceramide)等)、γδT細胞刺激劑(抗T細胞受體γ/δ抗體(anti-T-Cell Receptor γ/δ antibody，抗TCRγ/δ抗體)、唑來膦酸(zoledronic acid)等)等。可根據欲獲得之細胞量等，來適宜調整該等成分在培養基中的調配量。
本發明中的培養基中，亦可含有用以使得可培養單核細胞之營養成分、或pH值調節劑等。作為含有該成分之培養基，並無特別限定，可列舉：淋巴細胞用無血清合成培養基(KB550、KB570等)、AIM-V、脫氧膽酸鹽檸檬酸鹽瓊脂(Desoxycholate Citrate medium，DC培養基)、杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)、RPMI-1640(RPMI(Roswell Park Memorial Institute，洛斯維公園紀念研究所)、X-VIVO培養基等。另外，本發明中的培養基的形態並無特別限定，可為製備前的成分混合物(粉體形態等)、製備完成之形態(液體形態等)等。
本發明中的培養基中，亦可含有細胞培養中通常使用之試劑。作為此種試劑，可列舉：抗生素(建它黴素(gentamicin)、康黴素(kanamycin)等)、白蛋白、血清(人血清、胎牛血清等)、2-巰乙醇、丙酮酸鈉、胰島素等增殖因子、L-麩醯胺、運鐵蛋白等。
含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基，可利用公知的培養基的製造方法來製備，例如可藉由下
述方式製備：向上述培養基成分中添加IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體。另外，含有抗CD16單株抗體之培養基，亦可藉由下述方式製備：將抗CD16單株抗體事先預塗於燒瓶中，向該燒瓶中添加抗CD16單株抗體以外的培養基成分，藉此來製備含有抗CD16單株抗體之培養基。
第1步驟中的培養條件並無特別限定，可使用通常的細胞培養中所使用之條件。例如，可於30~38℃、5~10%CO2之條件下進行培養。培養期間只要為足夠的期間來使單核細胞活化及增殖，並分化成NK細胞和NKT細胞等細胞並增殖即可，可以是3日以上，較佳為5日。另外，由於若長時間地培養，單核細胞或NK細胞等細胞的活性有可能降低，因此，培養期間可以是14日以下。但是，進行14日以上的培養，NK細胞和NKT細胞等細胞亦可增殖，因此，藉由例如21日的培養，亦可獲得多達50億以上的細胞數。於培養期間內，藉由利用公知的方法適宜更換培養基，則即便進行長時間(例如21日)的培養，亦可維持細胞的活性。
<第2步驟(T細胞增殖步驟)>
本發明中的第2步驟，是於上述第1步驟之後進行。於第2步驟中，在使單核細胞優先分化成細胞毒性T細胞之條件下進行培養，從而於第1步驟中難以被刺激之(或未被刺激之)單核細胞選擇性地分化成T細胞，進而增殖。另外，於第2步驟中，在第1步驟中分化、進而活化及增殖之NK
細胞、NKT細胞、及γδT細胞等細胞，被在第2步驟中活化後之T細胞，直接或間接地刺激。其結果，第2步驟雖然是在選擇性地刺激T細胞之培養條件下進行，但NK細胞、NKT細胞、及γδT細胞亦能擴增。再者，於本發明中，所謂「使單核細胞優先分化成T細胞之條件」，是指為了從單核細胞分化成T細胞，一般情況下所使用之培養條件(例如，於抗CD3抗體的存在下進行培養；於抗CD3抗體和IL-2的存在下進行培養；於抗CD3抗體、IL-2及IL-15的存在下進行培養；於抗TCR抗體的存在下進行培養等)。
若欲於在使單核細胞優先分化成細胞毒性T細胞之條件下進行培養之後，進行向NK細胞等細胞之分化(亦即，若第2步驟先於第1步驟進行)，則由於T細胞大幅擴增，因此NK細胞等細胞的比例減少，僅能獲得T細胞的比例過多之含免疫細胞之組成物，因此，難以使單核細胞非常均衡地分化成複數種免疫細胞，並使該等免疫細胞增殖。
於第2步驟中，是在第1步驟之後進行培養基更換等操作，於可從單核細胞分化成T細胞且T細胞可增殖之培養基中培養細胞。作為此種培養基，可使用公知的可從單核細胞分化成T細胞，並可使T細胞增殖的培養基。具體而言，可使用下述培養基：於第1步驟中可使用之培養基(淋巴細胞用無血清合成培養基等)中，添加1~100μg/mL的抗CD3抗體(例如，抗CD3ε單株抗體)所成之培養基。
第2步驟中的培養條件並無特別限定，可使用通常的細胞培養中所使用之條件。例如，可於30~38℃、5~10%CO2之條件下進行培養。培養期間只要為足夠的期間來使單核細胞分化成T細胞即可，可以是48小時以上，較佳為3日。另外，若長時間地培養，則有可能T細胞增殖過多，難以獲得非常均衡地含有NK細胞、NKT細胞和T細胞之含免疫細胞之組成物，因此，培養期間可以是7日以下，較佳為5日以下，更佳為3日以下。另外，培養中，可藉由以往公知的方法來適宜更換培養基。
於第2步驟之後，亦可進而設置第3步驟，於含有IL-2及/或IL-15、和抗CD16單株抗體之培養基中進行培養。藉此，可使第1步驟中獲得之NK細胞等細胞增殖，並可調整含免疫細胞之組成物中的NK細胞、NKT細胞及T細胞的比例，因此，更有效地獲得非常均衡地含有複數種免疫細胞之含免疫細胞之組成物。作為第3步驟的條件，可使用上述第1步驟中的條件。
<由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物>
由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物中，非常均衡地含有複數種免疫細胞，而不會如以往的方法般，特定細胞的比例過多。於本發明中，所謂「複數種免疫細胞非常均衡」，是指含免疫細胞之組成物中，各免疫細胞的比例接近於體內的比例。但是，就可有效地增強免疫力之觀點而言，
即便NK細胞在含免疫細胞之組成物中的比例高於體內的通常的比例，亦可謂之為「複數種免疫細胞非常均衡」之狀態。作為複數種免疫細胞非常均衡之狀態，例如，可列舉如下狀態：於全部細胞中，NK細胞為40~60%，NKT細胞為15~25%，γδT細胞為2~5%，T細胞為20~30%，調節型T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)為0.01~0.2%。含免疫細胞之組成物中的各免疫細胞的比例，可藉由流式細胞術來特定。但是，上述中例示之細胞的均衡，可根據患者的治療方針，藉由調整培養條件等方式來適宜變更。作為培養條件的調整內容，例如，可列舉：增加NKT細胞刺激劑的量，使之比培養基中的NK細胞刺激劑的量更多等。
可藉由下述方式，來確認利用本發明的製造方法獲得之細胞是否為NK細胞等細胞：藉由流式細胞術，來分析所獲得之細胞的細胞表面標誌。例如，NK細胞、T細胞、NKT細胞、γδT細胞及Treg細胞，被特定為CD3+CD56+細胞、CD3-CD19+細胞、CD3+CD19-細胞、CD3-CD56+細胞、及CD3+γδTCR+細胞。另外，T細胞及NKT細胞，分別可利用抗TCRα抗體、抗TCRVα24抗體等來特定。
另外，根據本發明，由於可由較少的血液(例如，1~100mL，較佳為1~50mL)獲得足夠量的免疫細胞(例如，106~108個細胞/mL以上)，因此可在不對有機體造成負擔之情況下，簡便地獲得細胞免疫療法中所需之量的免疫細胞。
此處，於本發明中，所謂「免疫細胞的量」，是指至少NK細胞、NKT細胞、和T細胞的合計量(合計細胞數)。另外，根據本發明，可於第1步驟和第2步驟相加為例如合計14日之較短培養期間內，獲得上述足夠量的免疫細胞。
由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物，可直接用於患者的治療，亦可使用以往公知的方法，以冷凍保存等方式保存。由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物中的免疫細胞(NK細胞、NKT細胞、T細胞等)，可於生理鹽水中等條件下進行維持，而維持活性狀態。免疫細胞的活性狀態，可藉由利用流式細胞術，分析所獲得之細胞的細胞表面標誌(CD69等)來確認。另外，於由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物中添加生理鹽水、人血清白蛋白等，可製備癌症治療用組成物。該癌症治療用組成物，可以注射劑等形式投予至患者體內。
由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物中的免疫細胞(NK細胞、NKT細胞、T細胞等細胞)，具有細胞毒性(cytotoxicity activity)，因此可有效地用於癌症治療等。可藉由51Cr釋放法等方法來判斷免疫細胞的細胞毒性。另外，由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物中的免疫細胞，亦可產生具有抗癌活性之γ型干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)。IFN-γ可利用公知的酵素連結免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA法)等方法來測定。
以下，基於實施例來說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
<參考試驗1：健康人的血液中所含之各免疫細胞的比例>
藉由採血器具(商品名「BD Vacutainer CPT cell preparation tube」，必帝公司(Becton,Dickinson and Company)製造)，從6名健康人的上臂採集血液24mL。自各血液回收人末梢血單核細胞(PBMC)，由所獲得之PBMC，獲得人NK細胞。
第1(A)圖，繪示關於6名各健康人之所回收之PBMC的細胞數。第1(B-1)圖，繪示所獲得之PBMC中的具代表性之細胞分佈。第1(B-2)圖，繪示關於所獲得之PBMC之使用螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)標記抗CD19抗體和藻紅素(Phycoerythrin，PE)標記抗CD3抗體之FACS分析的具代表性的結果。第1(B-1)圖中，「FSC」是指前向散射(Forward scatter)，「SSC」是指側向散射(Side scatter)。
另外，表1和表2中，顯示所獲得之PBMC中的各細胞的比例。再者，以下，B細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、及γδT細胞，分別是CD3-CD19+細胞、CD3+CD19-細胞、CD3+CD56+細胞、CD3-CD56+細胞、及CD3+γδTCR+細胞。
<實施例1：含免疫細胞之組成物之製造-1>
(PBMC之回收)
從4名健康人採集24mL血液(將此時間點設為「第0天(Day 0)」)，並回收PBMC。
第2圖，是繪示關於所獲得之PBMC之使用任一下述抗體組合之FACS分析的具代表性的結果。
抗CD3抗體及抗CD19抗體
抗CD3抗體及抗CD56抗體
抗CD3抗體及抗γδTCR抗體
CD56抗體及γδTCR抗體
CD4抗體及CD25抗體
第2(A)圖，是繪示所獲得之PBMC中的淋巴細胞亞群的圖案；第2(B)圖，是繪示所獲得之PBMC中的單核白血球的圖案。
(第1步驟)
繼而，使所獲得之PBMC，懸浮於添加有175IU/mL的人IL-2和25ng/mL的人IL-15之50mL的培養基(KBM550，Kohjin-bio股份有限公司製造)中，並於預塗有抗CD16單株抗體之75cm2燒瓶中培養5日(該步驟相當於「第1步驟」，將最終培養日設為「第5天」)。再者，以下，將添加有175IU/mL的人IL-2和25ng/mL的人IL-15，且接觸預塗之抗CD16單株抗體後之培養基，稱作「NK細胞增殖培養基」。該NK細胞增殖培養基中，含有IL-2、IL-15和抗CD16單株抗體。
(第2步驟)
於第5天，從燒瓶回收細胞，並懸浮於NK細胞增殖培養基中，加入NK細胞增殖培養基(150mL)，於預塗有抗CD3ε單株抗體之完成殺菌之透氣性細胞培養袋(250mL，Kohjin-bio股份有限公司製造)中培養2日(該步驟相當於「第
2步驟」，將最終培養日設為「第7天」)。該培養物，相當於由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物。
(第3步驟)
於第7天，將培養後的細胞培養袋，與加入有NK細胞增殖培養基(1000mL)之完成殺菌之透氣性細胞培養袋(1L，Kohjin-bio股份有限公司製造)連結，進一步於37℃、5%CO2之濕度環境下培養7日(該步驟相當於「第3步驟」)，獲得培養物。該培養物相當於由本發明的製造方法獲得之含免疫細胞之組成物。
第3圖，繪示關於經過上述第1步驟至第3步驟後獲得之含免疫細胞之組成物中的免疫細胞之FACS分析的具代表性的結果。如第3圖所示，培養後的各細胞的比例為：NK細胞=75.1%、NKT細胞=7.7%、γδT細胞=4.9%、T細胞=16.7%、CD56陰性γδT細胞=1.1%、細胞毒性γδT細胞=3.8%、調節型T細胞(Treg)=0.05%、輔助型T細胞=4.2%。亦即，根據本發明，T細胞的比例不會過多，可使NK細胞等細胞非常均衡地增殖。
<實施例2：含免疫細胞之組成物之製造-2>
與實施例1同樣地進行「第1步驟」和「第2步驟」，研究培養前(「第1步驟」之前)及培養後(「第1步驟」及「第2步驟」之後)的各免疫細胞的比例。將其結果顯示於表3至表5中。
[表5]
如表3至表5所示般，根據本發明，T細胞的比例不會過多，獲得非常均衡地含有NK細胞等細胞之含免疫細胞之組成物。
<實施例3：含免疫細胞之組成物中的免疫細胞的活性>
以1L的培養基(KBM550，Kohjin-bio股份有限公司製造)，對與實施例1同樣地獲得之含免疫細胞之組成物進行回收，並再次懸浮於添加有0.2%人血清白蛋白(日本製藥股份有限公司製造)之100mL的藥品等級的生理鹽水(泰爾茂(Terumo)股份有限公司製造)、或單獨的藥品等級的生理鹽水中。繼而，將細胞於4℃維持24小時，藉由FACS進行分析。將其具代表性的結果顯示於第4圖。
如第4(1)圖和第4(2)圖可知，藉由本發明的製造方法所獲得之含免疫細胞之組成物中的各免疫細胞，在生理鹽水中維持24小時之後，仍表現CD69。由於CD69是細胞的活化標誌，因此，可知，藉由本發明的製造方法所獲得之含免疫細胞之組成物中的各免疫細胞可維持活性狀態。此種免疫細胞，即便在製備後，輸送至遙遠地等，有望在輸送過程中有可能產生之活性降低得以被抑制。
<實施例4：含免疫細胞之組成物之製造-3>
使用表6至表8中記載之培養基代替「KBM550」，進行與實施例2相同之試驗。再者，「KBM570」是由Kohjin-bio股份有限公司製造，「AIM-V」是由英傑(Invitrogen)公司製造，「Milteni」是由美天旎生物(Miltenyi Biotec)股份有限公司製造。表6至表8中，顯示所獲得之含免疫細胞之組成物中的各免疫細胞的比例等。再者，表6中，「培養開始時」是指進行「第1步驟」之前，「培養後」是指進行「第1步驟」和「第2步驟」之後。
[表7]
如表6至表8所示，可知，根據本發明，無論使用哪一種類的培養基，T細胞的比例皆不會過多，獲得非常均衡地含有NK細胞等細胞之含免疫細胞之組成物。
<實施例5：含免疫細胞之組成物之製造-4>
使用表9至表11中記載之培養基，代替「KBM550」來進行試驗，並且，使用添加有人IL-2或人IL-15中的任一者之培養基，除此以外，進行與實施例2相同之試驗。表9至表11中，顯示所獲得之含免疫細胞之組成物中的各免疫細胞的比例等。再者，表中，「培養開始時」或「培養前」是指進行「第1步驟」之前，「培養後」是指進行「第1步驟」和「第
2步驟」之後。
如表9至表11所示，在人IL-2或人IL-15中任一者的存在下，根據本發明，T細胞的比例皆不會過多，獲得非常均衡地含有NK細胞等細胞之含免疫細胞之組成物。
<實施例6：細胞毒性的測定>
與實施例2同樣地獲得含免疫細胞之組成物。將所獲得之含免疫細胞之組成物，裝入至15mL離心管中，進行離心分離(1400rpm，5分鐘)，移除上清液後獲得細胞。對所獲
得之細胞，使用人成紅細胞性白血病細胞(K562)，進行51Cr釋放法(作用細胞(含免疫細胞之組成物中的細胞數)與靶細胞(K562的細胞數)的比(E：T)=20：1)，算出細胞毒性。將其結果顯示於第5圖。
再者，細胞毒性是基於下式算出。式中，「cpm(counts per minutes(每分鐘計數)的縮略詞)」，表示每1分鐘的放射線的數量。
((試驗組平均cpm-自然釋放組平均cpm)/(最大釋放組平均cpm-自然釋放組平均cpm))×100
如第5圖所示，可知，根據本發明，獲得細胞毒性較高的免疫細胞。
<參考試驗2：第1步驟及第2步驟的順序的相關研究>
以與實施例1相同的方式獲得PBMC。繼而，向預塗有10μg/mL的抗CD3單株抗體之75cm2燒瓶中，添加50mL的培養基(KBM550，Kohjin-bio股份有限公司製造)，於該培養基中培養7日後(該步驟相當於「第2步驟」)，向預塗有抗CD16單株抗體之75cm2燒瓶中，添加含有IL-2和IL-15之50mL的培養基(KBM550，Kohjin-bio股份有限公司製造)，並於該培養基中培養7日(該步驟相當於「第1步驟」)。表12至表14中，顯示關於培養前(「第2步驟」之前)及培養後(「第2步驟」及「第1步驟」之後)細胞的FACS分析的結果。
[表12]
如表12至表14所示，可知，抗CD3單株抗體的存在下的培養步驟(亦即，第2步驟)，若被設置於IL-2、IL-15和抗CD16單株抗體的存在下的培養步驟(亦即，第1步驟)之前，則T細胞的比例過多，無法獲得非常均衡地含有NK細胞等細胞之含免疫細胞之組成物。
Claims (2)
- 一種含免疫細胞之組成物的製造方法，包含以下步驟：第1步驟，於含有由IL-2及IL-15中選出的一種以上、和抗CD16單株抗體之培養基中培養單核細胞；及，第2步驟，於前述第1步驟後，在使單核細胞優先分化成細胞毒性T細胞之條件下進行培養；並且，相對於該組成物中的全部細胞數量，前述含免疫細胞之組成物包含40~60%NK細胞、15~25%NKT細胞、2~5% γ δ T細胞、20~30%T細胞、0.01~0.2%調節型T細胞。
- 如請求項1所述之含免疫細胞之組成物的製造方法，其中，於前述第2步驟後包含第3步驟，該第3步驟是於含有由IL-2及IL-15中選出的一種以上、和抗CD16單株抗體之培養基中進行培養。
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