CN108220235A - 一种体外活化扩增人自然杀伤（nk）细胞的方法及其专用培养体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法及其专用培养体系。该培养体系包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基细胞激活剂用于NK细胞的活化，NK细胞扩增培养基用于NK细胞的扩增。该体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，是将单个核细胞作为起始细胞，将细胞激活剂加入培养容器中进行铺板，然后向培养容器接种用含自体血浆的NK细胞扩增培养基制成的单个核细胞悬液，常规条件下培养扩增，即可得到高纯度的人自然杀伤(NK)细胞。本发明人自然杀伤(NK)细胞的培养体系及体外活化扩增方法将在肿瘤免疫治疗、免疫细胞的基础研究等领域中发挥重要作用，具有应用前景。

Description

一种体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法及其专用培养 体系

技术领域

本发明属于细胞与组织培养领域中细胞的培养方法和培养体系，特别是涉及一种体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法及其专用培养体系。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cells，简称NK细胞)是指存在于外周血、骨髓、淋巴结及其它组织中的大颗粒淋巴细胞，其表面特征性分子为CD56，不表达CD3(T淋巴细胞的一种特异抗原)。

NK细胞具有独特的免疫调节能力和细胞毒功能，可在未经致敏(priorsensitization)情况下，快速清除恶变细胞和病毒感染细胞。同时，NK细胞对自身细胞不具备细胞毒作用，这主要是由于体内的正常细胞表达自身MHC-I类分子，可以与NK细胞表面的抑制性受体—杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-likereceptors，KIR)结合，从而抑制NK细胞活性，这种现象被称为自身脱靶理论(self-missinghypothesis)。然而，肿瘤细胞以及病毒感染后的细胞通常低表达或不表达MHC-I类分子，这些细胞接触NK细胞后不能抑制NK细胞杀伤活性，从而被活化的NK细胞杀灭。

NK细胞的细胞毒作用强大，一个NK细胞可以通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤一个体积超过NK细胞数倍的肿瘤细胞。由于NK细胞具有强大的肿瘤细胞杀伤活性，人们一直认为NK细胞是免疫监视的重要细胞。2000年，柳叶刀(Lancet)杂志发表了一篇日本学者的文章，他们对3625位居民进行了11年随访，发现NK细胞活性越高癌症发生率越低，而且达到统计学显著差异(ImaiK,et al.Natural cytotoxic activity of peripheral-bloodlymphocytes and cancer incidence:an 11-year follow-up study of a generalpopulation.Lancet(2000)356:1795–9)。

然而，由于多种机制的存在，癌症病人具有严重的NK细胞功能障碍，在肿瘤微环境中更是如此(Platonova S,et al.Profound coordinated alterations of intra-tumoral NK cell phenotype and function in lung carcinoma.Cancer Res 2011；71(16):5412–22)。基于此，研究者们设计了使用NK细胞治疗难治复发肿瘤的临床试验方案。但是，使用自体的NK细胞治疗恶性肿瘤，其效果尚未定论。有研究表明，抽取转移黑色素瘤或肾细胞癌病人的外周血，分离、纯化并扩增NK细胞，活化的NK细胞具有很强的体外肿瘤细胞杀伤能力，静脉输注后NK细胞在体内存活时间超过1周，甚至在48天后仍有大量的NK输注细胞存活。然而，在NK细胞每次剂量达到10¹⁰个以上时，8例病人无1例具有治疗效果(Parkhurst MR,et al.Adoptive transfer of autologous natural killer cellsleads to high levels of circulating natural killer cells but does not mediatetumor regression.Clin Cancer Res.2011；17(19):6287-97)。对骨髓瘤病人自体NK细胞和异体NK细胞进行功能分析，发现自体NK细胞对骨髓瘤细胞的毒作用弱，异体NK细胞对骨髓瘤细胞的毒作用强(Szmania S,et al.Ex Vivo Expanded Natural Killer CellsDemonstrate Robust Proliferation In Vivo In High-Risk Relapsed MultipleMyeloma Patients.J Immunother.2015；38(1):24-36)。对肺癌病人的NK细胞进行临床试验研究，研究结果表明输注NK细胞是安全的，但是，其疗效与历史对照无差别(Yang YJ etal.A trial of autologous ex vivo-expanded NK cell-enriched lymphocytes withdocetaxel in patients with advanced non-small cell lung cancer as second-orthird-line treatment:phase IIa study.Anticancer Res.2013；33(5):2115-22)。对淋巴瘤和乳腺癌病人的NK细胞进行临床试验研究，研究结果也表明使用自体NK细胞治疗，效果远不如预期(Burns LJ,et al.IL-2-based immunotherapy after autologoustransplantation for lymphoma and breast cancer induces immune activation andcytokine release:a phase I/II trial.Bone Marrow Transplantation 2003；32(1):177-186)。出现上述现象的部分原因在于，NK细胞表面的抑制受体可以与肿瘤细胞表面自身HLA分子结合，从而抑制了NK细胞的细胞毒活性，并降低ADCC效应(Szmania S,et al.ExVivo Expanded Natural Killer Cells Demonstrate Robust Proliferation In VivoIn High-Risk Relapsed Multiple Myeloma Patients.J Immunother.2015；38(1):24-36)。更为重要的是，在自体NK细胞的治疗过程中，为达到体内细胞扩增的目的，常在输注NK细胞后使用大剂量的IL-2。然而，在IL-2作用下，NK细胞扩增的同时，具有免疫抑制作用的调节T细胞(T regulatory cells，Tregs)比例明显增高(Littwitz-Salomon E etal.Activated regulatory T cells suppress effector NK cell responses by an IL-2-mediated mechanism during an acute retroviral infection.Retrovirology.2015；12(1):66；Skrombolas D et al.Challenges and developing solutions forincreasing the benefits of IL-2treatment in tumor therapy.Expert Rev ClinImmunol.2014；10(2):207-17；Kerdiles Y,et al.T cell regulation of naturalkiller cells.J Exp Med.2013Jun 3；210(6):1065-8)。NK细胞对调节T细胞产生的细胞因子十分敏感，这些因子包括IL-10和TGF-beta。因此，调节T细胞的增加严重影响甚至抑制了NK细胞的细胞毒作用。这也是单纯使用IL-2治疗肿瘤，在大多数情况下疗效差的主要原因。因此，对于肿瘤的细胞免疫治疗而言，异体NK细胞可能是更好的选择。

异体NK细胞控制肿瘤发展的完整临床证据发表于2002年的《科学》杂志(RuggeriL,et al.Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity inmismatched hematopoietic transplants.Science.2002；295(5562):2097-2100)。通过研究对异基因造血干细胞移植治疗白血病的效果与供受者之间NK细胞KIR相合性的关系分析，作者发现在可评估的92例病人中，KIR不相合病人(34例)，移植排斥发生率为0，II度以上GVHD发生率为0，急性髓系白血病(AML)病人5年无1例复发。然而，在KIR相合的58例病人中，排斥率和II毒以上GVHD发生率均在10％以上，AML病人复发率为75％。此外，两组ALL病人预后无差别。研究结果证明异体反应性NK细胞(allo-reactive NK cells，Allo-NK)可以降低GVHD和移植排斥作用，而其抗AML白血病细胞效应是造血干细胞移植治愈白血病的关键。同时，以上研究结果表明使用Allo-NK细胞治愈某些肿瘤具有可能性。

自Ruggeri等发现NK细胞异源性减低白血病复发现象后，来自明尼苏达大学的Miller等人首先报道了利用单倍体相合NK细胞治疗AML的研究，研究结果发现输注NK细胞是安全的，而且，在19例预后不良AML病人中，5例可达到完全缓解，说明用异体NK细胞治疗AML具有有效性(Miller JS et al.Successful adoptive transfer and in vivoexpansion of human haploidentical NK cells in patients withcancer.Blood.2005；105(8):3051-7)。

在单倍体相合造血干细胞移植2周和3周后，输注供者NK细胞平均剂量达2.0×10⁸/kg体重，未发现任何严重的细胞输注反应，与经相同预处理的历史对照进行比较，发现GVHD发生率、造血植入时间和移植相关死亡率无任何差别，但是，NK细胞输注是一个预测白血病复发的独立因素，可显著减低白血病的复发率(Choi I,et al.Donor-DerivedNatural Killer Cells Infused after Human Leukocyte Antigen-HaploidenticalHematopoietic Cell Transplantation:A Dose-Escalation Study.BBMT 2014；20:696-704)。

那么，在造血干细胞移植中，输注体外活化扩增(激活)的NK细胞或是从供者体内新鲜分离的NK细胞，哪种细胞可以达到较好的治疗效果呢？在一项前瞻性临床试验研究中，有人以接受单倍体相合移植的高危白血病病人为研究对象，病人在移植造血干细胞后的第2、40和100天后，接受供者源纯化的NK细胞输注。研究结果表明与历史对照相比，输注供者源纯化的NK细胞对移植排斥或复发均无任何优势，因此，作者提出输注体外活化扩增的NK细胞可能具有较好的治疗效果(Stern M,et al.Pre-emptive immunotherapy withpurified natural killer cells after haploidentical SCT:a prospective phase IIstudy in two centers.BMT 2013；48:433-8)。有研究表明，输注未经活化的NK细胞对受体外周血细胞和细胞因子无任何影响；然而，输注IL-2活化的NK细胞后，外周血中细胞因子和趋化因子，如IFN-gamma、IL-6、MIP-1b等快速增加，外周血NK细胞数量急剧下降，24小时后恢复正常。研究结果表明输注体外活化扩增的NK细胞可改变外周血细胞的迁移轨迹，促进输注外源和宿主NK细胞穿透通过内皮组织的过程(Brehm C,et al.IL-2 Stimulated butNot Unstimulated NK Cells Induce Selective Disappearance of Peripheral BloodCells:Concomitant Results to a Phase I/II Study.PLoS ONE 2011；6(11):e27351)。对胃癌病人外周血NK细胞进行功能分析也发现，与静止的NK细胞相比，体外活化扩增的NK细胞具有更强的体外细胞毒作用，而且能明显延长荷瘤小鼠的生存时间(Mimura K,etal.Therapeutic potential of highly cytotoxic natural killer cells for gastriccancer.Int.J.Cancer.2014；135:1390-8)。此外，与活化的gamma/delta T细胞和alpha/beta T细胞进行比较，体外活化扩增的NK细胞具有更强的肿瘤杀伤活性(Deng X,et al.Exvivo-expanded natural killer cells kill cancer cells more effectively than exvivo-expanded γ δ T cells or α β T cells.International Immunopharmacology2014；22:486-91)。

综上所述，NK细胞是体内重要的免疫监视细胞，将体外活化扩增的异体NK细胞回输体内，对于治疗某些类型肿瘤具有一定的意义。细胞治疗必须达到一定的数量，而且，细胞产品达到一定纯度，方可保证治疗的有效性和安全性。细胞产品中如果残存较大量的异体T淋巴细胞，将有导致移植物抗宿主病发生的风险(He F,Warlick E,Miller JS,etal.Lymphodepleting chemotherapy with donor lymphocyte infusion post-allogeneic HCT for hematological malignancies is associated with severe,buttherapy-responsive aGvHD.Bone Marrow Transplant.2016；51(8):1107-12)。

为实现NK细胞的有效扩增，并且保障NK细胞扩增产品的临床应用安全性和批次稳定性，人们常使用无血清培养基，添加低浓度的自体血浆以促进NK细胞增殖并维系NK细胞的活性。但是，不同研究者使用的扩增体系不同，实验的可操作性、可重复性和NK细胞扩增的质与量也不同。在最早开展的临床试验中，人们常使用免疫磁珠的方法分离血液中的CD3-/CD56+细胞(NK细胞)，之后利用无血清培养基+自体血浆+IL-2或其它细胞因子，扩增纯化的NK细胞。这种方法获得的NK细胞纯度高，但是，由于没有其它免疫细胞的支撑作用，NK细胞扩增倍数不高。例如，Miller等使用免疫磁珠筛选CD3-/CD5-细胞后，采用流式细胞仪筛选CD56+细胞，以DMEM/F12(2:1)作为基础培养基，添加β巯基乙醇、乙醇胺、维生素C和亚硒酸钠，以自体血浆为营养补充剂，培养35天后NK细胞的数量只扩增了30倍(PiersonBA,McGlave PB,Hu WS,Miller JS.Natural killer cell proliferation is dependenton human serum and markedly increased utilizing an enriched supplementedbasal medium.J Hematother.1995；4(3):149-58)。更需说明的是，免疫磁珠法纯化NK细胞，成本很高，而且需要特殊的仪器设备(Clini-MACS)，不利于NK细胞治疗的临床推广。因此，这种用磁珠或流式细胞仪筛选NK细胞的方法，临床应用价值不大，已经逐渐被生物治疗研究者摈弃。

正因为如此，目前，多数研究者采用单个核细胞作为起始细胞培养NK细胞。NK细胞在其中的比例约为10％，经2-3周培养后NK细胞比例升高。多数研究者使用K562细胞作为滋养层，特异活化并扩增NK细胞。K562细胞是一种白血病细胞，来源于一位慢性髓性白血病急性白血病转变的患者。K562细胞不仅常作为活化NK细胞的杀伤靶细胞，研究也表明，NK细胞可在K562细胞刺激下活化，尤其是转染膜结合型IL-15和41BBL的K562细胞，可刺激NK细胞快速增殖(Shah NN,Baird K,Delbrook CP et al.Acute GVHD in patients receivingIL-15/4-1BBL activated NK cells following T-cell-depleted stem celltransplantation.Blood.2015；125(5):784-92；Kamiya T,Chang YH,Campana D.Expandedand Activated Natural Killer Cells for Immunotherapy of HepatocellularCarcinoma.Cancer Immunol Res.2016；4(7):574-81)。但是，肿瘤细胞在放化疗作用或静态下，可以释放大量的含有肿瘤核酸信息的外泌体(Mineo M,Garfield SH,Taverna S,etal.Exosomes released by K562 chronic myeloid leukemia cells promoteangiogenesis in a Src-dependent fashion.Angiogenesis.2012；15(1):33-45)，这些肿瘤信息可以通过水平转移的形式转移到周围的细胞(Ratajczak MZ,RatajczakJ.Horizontal transfer of RNA and proteins between cells by extracellularmicrovesicles:14 years later.Clin Transl Med.2016；5(1):7)。更为重要的是，有研究表明，K562细胞来源的外泌体可以使正常造血细胞恶性转化(Zhu X,You Y,Li Q,etal.BCR-ABL1–positive microvesicles transform normal hematopoietic transplantsthrough genomic instability:implications for donor cell leukemia.Leukemia2014；28:1666-75)。因此，使用K562细胞作为滋养层，其临床应用的安全性尤其是长期安全性，是一个值得商榷的问题。

也有研究者利用单个核细胞作为起始细胞，培养人外周血NK细胞。在这项技术中，用低剂量的抗人CD3抗体和饱和剂量的抗人CD52抗体铺板，引起单个核细胞群体中NK细胞的活化，之后用日本Kohjin Bio公司生产的NKGM-1培养基扩增，NK细胞数可以在培养的第14天扩增800-1000倍。但是，所获得的细胞群中NK细胞比例平均只占约60％，正因为如此，在效靶比为1:1的情况下，细胞终产品对K562细胞的杀伤率平均只有60％(36.3％-87.3％)(Masuyama J,Murakami T,Iwamoto S,Fujita S.Ex vivo expansion of natural killercells from human peripheral blood mononuclear cells co-stimulated with anti-CD3and anti-CD52 monoclonal antibodies.Cytotherapy.2016；18(1):80-90)。

因此，探索新的培养体系进行NK细胞的活化及扩增，以保证所获得细胞群中NK细胞的高比例，以及NK细胞对肿瘤细胞具有更强的杀伤活性，从而保障NK细胞治疗临床应用的有效性，是一个仍需认真研究的项目。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系。

本发明所提供的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，所述细胞激活剂包括：(1)抗人CD16单克隆抗体、(2)巨噬细胞激活脂肽-2(macrophage activating lipopeptide-2，MALP-2)和(3)溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液；所述NK细胞扩增培养基包括：1)基础培养基、2)无血清培养基添加剂、3)环氧化酶2(COX-2)抑制剂和4)细胞因子。

其中：在细胞激活剂中，所述抗人CD16单克隆抗体的使用浓度为0.5-5mg/L(推荐浓度为1-2mg/L，优选浓度为1mg/L)；所述巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的使用浓度为1-100mg/L(推荐浓度为5-25mg/L，优选浓度为10mg/L)；所述溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-CL-NaCL溶液或其它不含EDTA或其它螯合剂的缓冲液，缓冲液的pH值为7.0-7.5(推荐pH值为7.1-7.3，优选pH值为7.2)。

所述细胞激活剂中的三种组分可分开存放(分别存放于不同的容器中)或混合存放。

在NK细胞扩增培养基中：所述基础培养基选自RPMI1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或其中两种或三种基础培养基的组合(优选RPMI1640培养基)；所述无血清培养基添加剂包括NaHCO₃、人白蛋白、人胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂类混合物(例如亚油酸、亚麻酸、油酸、胆固醇的混合)、生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺、多胺混合物(例如腐胺、尸胺、亚精胺、精胺的混合)、氢化可的松琥珀酸钠、必需氨基酸(如赖氨酸、色氨酸等)和非必需氨基酸(如谷氨酸、丙氨酸等)中的多种或全部；其中白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂类混合物、必需氨基酸和非必需氨基酸为必需成分，生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺和多胺混合物为促进细胞增殖的添加物，氢化可的松琥珀酸钠为培养脐带血来源NK细胞是的专用添加剂；所述环氧化酶2(COX-2)抑制剂为吲哚美辛(indomethacin)、NS-398和塞来昔布(celecoxib)中的一种(优选为吲哚美辛，吲哚美辛的浓度为0.5μM-50μM，推荐浓度为1-20μM，优选浓度为5μM)；所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12和IL-18中的至少两种，优选使用IL-2和IL-15细胞因子组合，IL-2的浓度为2×10⁵-3×10⁶U/L(200U/mL-3000U/mL)，优选为1×10⁶U/L(1000U/mL)，IL-15的浓度为10-100mg/L(10-100ng/mL)，优选为50mg/L(50ng/mL)。

商业化的组合培养基，如EX VIVO系列产品、NKGM-1、AIM-V等，培养基中已经添加了胰岛素、转铁蛋白、硒等NK细胞扩增所需营养物质，也适合于NK细胞的扩增。

通用的NK细胞扩增培养基以RPMI1640培养基作为基础培养基，每升(/L)NK细胞扩增培养基含有：RPMI1640粉剂10.39g，NaHCO₃ 2g，人白蛋白0.5-5g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物1-10mL，乙醇胺1-10×10^-4M，脂类混合物1-10mL，生物素1-20mg，丙酮酸钠55-220mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸1-20mM，L-谷氨酰胺146-730mg，多胺混合物1-10mL，RPMI1640氨基酸溶液1-20mL，吲哚美辛0.5-10μM，IL-2 2×10⁵-3×10⁶U,IL-15 10-100mg。

人外周血NK细胞扩增培养基的配方优选为：每升(/L)培养基含RPMI1640 10.39g，NaHCO₃ 2.04g，人白蛋白2g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物10mL，乙醇胺6×10^-4M，脂类混合物1mL，生物素10mg，丙酮酸钠110mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸2mM，L-谷氨酰胺292mg，多胺混合物1mL，RPMI1640氨基酸溶液20mL，吲哚美辛5μM，IL-2 1×10⁶U,IL-15 50mg。

人脐血NK细胞扩增培养基的配方优选为：每升(/L)培养基含RPMI1640 10.39g，NaHCO₃ 2.04g，人白蛋白2g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物10mL，乙醇胺6×10^-4M，脂类混合物1mL，生物素10mg，丙酮酸钠110mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸2mM，L-谷氨酰胺292mg，多胺混合物1mL，RPMI1640氨基酸溶液20mL，注射用氢化可的松琥珀酸钠1×10^-6M，吲哚美辛5μM，IL-2 1×10⁶U,IL-15 50mg。

本发明的第二个目的是提供一种体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法。

本发明所提供的体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，使用前述的培养体系，是将分离得到的单个核细胞作为起始细胞，先将所述细胞激活剂加入培养容器中进行铺板，然后向培养容器接种用含自体血浆的所述NK细胞扩增培养基制成的单个核细胞悬液，培养细胞，得到经活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。

该方法中：所述NK细胞来源于人骨髓、外周血或脐带静脉血(脐血)的单个核细胞；

所述细胞激活剂中的三种组分可分开使用或混合使用；将三种组分分开铺板方法为：用异丙醇溶解巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2),滴加缓冲液至巨噬细胞激活脂肽-2的浓度为1-100mg/L(推荐1-2mg/L，优选1mg/L)，再将巨噬细胞激活脂肽-2溶液加入培养容器中，使溶液平铺于培养容器底部，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上使用(或非现场使用于4℃储存、3周内使用)，然后吸除巨噬细胞激活脂肽-2溶液，用缓冲液洗涤培养容器底部以去除未吸附于培养容器底部的巨噬细胞激活肽脂-2，再加入抗人CD16单克隆抗体和缓冲液至抗人CD16单克隆抗体的浓度为0.5-5mg/L(推荐5-25mg/L，优选10mg/L)，最低添加量为保证溶液铺满培养容器底部，将培养容器置于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上，非现场使用于4℃储存、3周内使用；

将三种组分混合的细胞激活剂进行铺板的方法为：将NK细胞激活剂加入培养容器中，最低添加量为保证溶液铺满整个培养容器底部，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上，非现场使用于4℃储存、3周内使用；

所述单个核细胞悬液的细胞密度为0.5-10×10⁶/mL，推荐为1-5×10⁶/mL，优选为2×10⁶/mL；自体血浆的添加比例为1-20％(V/V)，优选为10％(V/V)；

所述培养细胞的培养条件为37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度，培养时间为10天-21天，推荐10-18天，优选14天；优选逐步扩大培养规模和增加培养时间，扩大培养规模的方法是添加含1-20％(优选10％，V/V)自体血浆的NK细胞扩增培养基，培养时间根据细胞数量和生长状态进行增加；采用常规离心的方法收获活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。

具体的体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，包括以下步骤：

1)从外周血或脐血中分离得到单个核细胞；

2)将细胞激活剂加入培养容器中进行铺板：

将三种组分分开的细胞激活剂进行铺板或

将三种组分混合的细胞激活剂进行铺板；

3)向培养容器接种用含1-20％(V/V)自体血浆的所述人外周血NK细胞扩增培养基或所述人脐血NK细胞扩增培养基制成的单个核细胞悬液，在37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度条件下培养10天-21天(推荐10-18天，优选14天)，得到高纯度(纯度可达60-94％)的经活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。

用上述方法体外活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞也属于本发明内容。

本发明提供了一种用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系。该培养体系包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，细胞激活剂用于NK细胞的活化，NK细胞扩增培养基用于NK细胞的扩增。该培养体系具有以下优点：

1、化学成分明确清晰(chemically defined)，避免了培养体系批次间的差异，从而保证了批次间的稳定性；

2、不含异种蛋白质成分(动物蛋白质分子，如牛血清、牛血清白蛋白、牛血清脂蛋白等)，从而避免了细胞总产品临床应用中可能的人畜共患病，以及动物蛋白引起的人体免疫反应的风险；

3、不仅适用于人外周血或脐血来源的NK细胞的培养，也适用于其它组织如骨髓或其它动物NK细胞的培养。

本发明还提供了一种用上述培养体系体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，该方法具有以下优点：

1、使用健康人外周血或脐带静脉血的单个核细胞作为起始细胞，无需在培养前纯化NK细胞，即可完成NK细胞的活化扩增过程；

2、培养体系中不加滋养层，获得的NK细胞纯度高、活性好：在一般情况下，经过2周活化扩增后，NK细胞比例可由5％-15％提高到60％以上，因此，NK细胞的活化扩增过程也是NK细胞的纯化过程；

3、经过活化扩增后，NK细胞数量可提高近2000倍或以上；

4、经过活化扩增后的NK细胞具有很强的K562细胞杀伤活性，杀伤率达90％。

综上所述，本发明人自然杀伤(NK)细胞的培养体系及体外活化扩增方法，将在肿瘤治疗及免疫细胞的基础研究等领域中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的技术路线。巨噬细胞激活脂肽-2和NK细胞特异抗体(抗人CD16单克隆抗体)预铺板，两种分子紧密结合于培养瓶(或培养皿亦或培养袋)底面。加入单个核细胞后，单核/巨噬细胞和NK细胞被激活，NK细胞优势扩增，其数量及比例逐渐升高。

图2为人外周血单个核细胞培养48小时的细胞形态。将人外周血单个核细胞培养48小时后，可见贴壁的细胞集落。在集落旁，有大量的梭形细胞(单核/巨噬细胞，箭头所示)。标示大小：100μm。

图3为人外周血单个核细胞培养72小时后形成的集落的形态。标尺：100μm。

图4为人外周血单个核细胞培养前及培养14天NK细胞比例的流式细胞学分析结果。收集人外周血单个核细胞，使用实施例中的NK激活剂活化，使用实施例所描述的培养基培养14天。抗体标记后流式细胞学分析。NK细胞比例从活化扩增前的8.67％升高至84％。

图5为NK细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增(14天)的来自人外周血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率测定结果。单个核细胞培养前(ctr)及培养14天后，按照不同的效靶比测定细胞对K562白血病细胞的杀伤率。纵坐标：杀伤率(％)，横坐标：效靶比。

图6为人脐血单个核细胞培养48小时的细胞形态。将人脐血单个核细胞，按照前述方法培养48小时后，可见贴壁的细胞集落。在集落旁，有大量的梭形细胞(单核/巨噬细胞，星号所示)。标示大小：100μm。

图7为人脐血单个核细胞培养72小时后形成的集落的形态。标尺：100μm。

图8为人脐血单个核细胞培养前及培养14天NK细胞比例的流式细胞学分析结果。收集人脐血单个核细胞，使用实施例中的NK激活剂活化，使用实施例所描述的培养基培养14天。抗体标记后流式细胞学分析。NK细胞比例从活化扩增前的7.22％升高至94.5％。

图9为NK细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增(14天)的来自人脐血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率测定结果。单个核细胞培养前(ctr)及培养14天后，按照不同的效靶比测定细胞对K562白血病细胞的杀伤率。纵坐标：杀伤率(％)，横坐标：效靶比。

具体实施方式

单核/巨噬细胞是一群特殊的免疫细胞，与其它类型的免疫细胞相比，单核/巨噬细胞可接受多种刺激，并分泌功能多样的细胞因子及其它生物活性物质。另外，单核/巨噬细胞的另一个生物学特征是其具有很强的贴壁性能。单个核细胞主要由单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞等组成，在这些细胞中单核/巨噬细胞的贴壁能力最强。

本发明所用的NK细胞来源于人骨髓、外周血或脐血的单个核细胞。

基于此，发明人设计了如下技术路线，以单个核细胞为起始细胞活化扩增NK细胞。(1)在培养初期，特异性地活化单个核细胞中的NK细胞，形成NK细胞的优势活化，亦即，相较于其它细胞，活化的NK细胞对靶细胞非特异性的细胞因子如IL-2的反应性高于其它类型细胞如T淋巴细胞。(2)加入高剂量的细胞因子，使活化的NK细胞进入扩增阶段，形成NK细胞的优势扩增，最终使NK细胞在活化的同时，其比例和数量得到显著提高。

具体的技术路线如图1所示：

第一步：用NK细胞的特异性抗体抗人CD16单克隆抗体铺板(coating)，同时，将激活单核/巨噬细胞的巨噬细胞激活脂肽-2(macrophage activating lipopeptide-2,MALP-2)铺板，两种分子紧密结合于培养瓶(或培养皿亦或培养袋)底面。

第二步：加入单个核细胞，细胞群中的单核/巨噬细胞快速贴壁，并在局部巨噬细胞激活脂肽-2作用下，大量分泌IL-12、IL-15、TNF-alpha等细胞因子。同时，细胞群中的NK细胞与培养瓶底部的抗人CD16单克隆抗体结合。此时，在培养瓶底部形成了一个细胞培养微环境，在这个微环境中，NK细胞与单核/巨噬细胞密切接触，进行细胞间对话(cross-talk)，NK细胞在单核/巨噬细胞分泌的细胞因子与抗人CD16单克隆抗体(NK细胞特异抗体)刺激下活化，最终完成NK细胞的活化过程。

第三步：活化的NK细胞在外源细胞因子IL-15和IL-2刺激下快速扩增，随着培养时间的延长，NK细胞的比例不断提高，NK细胞的总数不断增加，从而完成NK细胞的扩增过程。

本发明用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，细胞激活剂用于NK细胞的活化，NK细胞扩增培养基用于NK细胞的扩增，所述细胞激活剂包括：(1)抗人CD16单克隆抗体、(2)巨噬细胞激活脂肽-2(macrophageactivating lipopeptide-2，MALP-2)和(3)溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2的缓冲液；所述NK细胞扩增培养基包括：1)基础培养基、2)无血清培养基添加剂、3)环氧化酶2(COX-2)抑制剂和4)细胞因子。

细胞激活剂

在细胞激活剂中，每种组分的作用及含量如下：

(1)抗人CD16单克隆抗体：NK细胞是一群特殊的淋巴细胞，其特征性标记为CD3-/CD56+。根据CD56表达水平，NK细胞可分为CD56低表达(CD56^dim)和CD56高表达(CD56^bri)两个亚群。CD56^dim细胞高表达CD16，具有很强的杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞的功能，亦即，具有很强的细胞毒作用。CD56^bri细胞低表达CD16，主要功能是分泌γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子。细胞培养前，使用抗人CD16单克隆抗体铺板，抗体可优势结合CD56^bri细胞，从而使培养过程中活化的细胞具有更强的杀伤活性。单克隆抗体铺板是常规技术，抗人CD16单克隆抗体的使用浓度为0.5-5mg/L(0.5-5μg/mL)，推荐浓度为1-2mg/L(1-2μg/mL)，优选浓度为1mg/L(1μg/mL)。

(2)巨噬细胞激活脂肽-2(macrophage activating lipopeptide-2，MALP-2)：MALP-2是一种支原体外膜物质，可通过单核/巨噬细胞表面的TLR-2(Toll-like receptor-2，Toll样受体2)和TLR-6(Toll样受体6)激活单核/巨噬，促使其分泌IL-12、IL-15、TNF-alpha等细胞因子。其中，IL-15是NK细胞发育必需的细胞因子，敲除IL-15基因小鼠体内无NK细胞。TLR-2信号与单核/巨噬细胞内的含TIR域衔接蛋白(TIR domain–containingadapter protein，TIRAP)有关，后者是激活IL-15基因表达的关键衔接蛋白。MALP-2的另一个生物学特性是高粘附性。本发明正是利用这些特点，在培养人单个核细胞前，将MALP-2预铺板。单个核细胞中的单核/巨噬细胞快速贴壁，受MALP-2刺激分泌IL-12、IL-15、TNF-alpha等细胞因子，单个核细胞中的NK细胞在抗人CD16抗体作用下也沉降于培养瓶/皿/袋底部，从而接受单核/巨噬细胞分泌的多种细胞因子刺激，达到活化NK细胞的目的。巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的使用浓度为1-100mg/L(1-100μg/mL)，推荐浓度为5-25mg/L(5-25μg/mL)，优选浓度为10mg/L(10μg/mL)。

(3)溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液：可以为磷酸盐缓冲液或Tris-CL-NaCL溶液，也可以使用其它不含EDTA或其它螯合剂的缓冲液。不同的缓冲液不影响人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的粘附效应，但是缓冲液的pH值影响蛋白质分子粘附于培养瓶/皿/袋的过程，因此，缓冲液的pH值为7.0-7.5，推荐pH值为7.1-7.3，优选pH值为7.2。抗人CD16单克隆抗体可直接溶解于缓冲液中，巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)可以先溶解于异丙醇中，再用缓冲液稀释。

细胞激活剂中的三种组分可分开存放(分别存放于不同的容器中)或混合存放。可现配现用也可配制好后储存备用。

NK细胞扩增培养基

在NK细胞扩增培养基中，每种组分的作用及含量如下：

1)基础培养基：用于NK细胞的扩增，如RPMI1640培养基、IMDM培养基或DMEM/F12培养基等，也可以使用上述两种或三种基础培养基的组合培养NK细胞。所述基础培养基优选为RPMI1640培养基。

2)使用上述基础培养基时，本发明中还添加胰岛素、转铁蛋白、硒等NK细胞扩增所需营养物质，从而达到较好的扩增效果。无血清培养基添加剂为NK细胞扩增所需的营养物质，包括NaHCO₃、人白蛋白、人胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂类混合物、生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺、多胺混合物、注射用氢化可的松琥珀酸钠、必需氨基酸和非必需氨基酸等其中的多种或全部，其中白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂类混合物、必需氨基酸和非必需氨基酸等组分为必需成分，在培养脐带血来源NK细胞时需添加氢化可的松琥珀酸钠，生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺、多胺混合物的添加，可促进细胞的增殖，为保障获得足够的细胞数，可添加上述物质。

NaHCO₃的作用是维系溶液的酸碱度；人白蛋白的作用是转运营养物质至细胞内；人胰岛素作用是刺激糖代谢，有助于细胞生长和增殖，提高细胞的活力和蛋白质的产量；人转铁蛋白的作用是转运铁等离子；亚硒酸钠的作用是提供硒元素，并具有抗氧化作用；乙醇胺的作用是提供细胞增殖需要的脂类物质前体；脂类混合物(例如亚油酸、亚麻酸、油酸、胆固醇的混合)的作用是维系细胞的正常脂代谢；生物素(维生素H、辅酶R)的作用是协助细胞脂、糖及氨基酸代谢；丙酮酸钠的作用是为细胞提供碳源；Hepes的作用是调节溶液的酸碱度；L-谷氨酰胺的作用是提供细胞合成核酸及蛋白质必需的氨基酸；多胺混合物(例如腐胺、尸胺、亚精胺、精胺的混合)的作用是多胺能够通过与DNA、RNA、各种胞质内配体及膜蛋白相互作用，促进细胞增殖；注射用氢化可的松琥珀酸钠的作用是促使造血细胞向NK细胞分化，是脐血来源NK细胞培养中添加的物质；必需氨基酸(如赖氨酸、色氨酸等)是机体不能主动合成的氨基酸，其作用是提供细胞增殖所需的氨基酸；非必需氨基酸(如谷氨酸、丙氨酸等)的作用是提供细胞增殖所需的氨基酸。

另外，已含有1)和2)商业化的组合培养基，如EX VIVO系列产品、NKGM-1、AIM-V等，培养基中已经添加了胰岛素、转铁蛋白、硒等NK细胞扩增所需营养物质，也适合于NK细胞的扩增。

3)环氧化酶2(COX-2)抑制剂：其作用是抵消巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)刺激单核/巨噬细胞分泌的PGE-2对NK细胞的抑制作用。已有的资料已经证实，巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)可以提高环氧化酶2(COX-2)的活性，增加培养细胞上清中前列腺素E-2(PGE-2)的浓度(Mitsunari M,et al.Macrophage-activating lipopeptide-2 inducescyclooxygenase-2 and prostaglandin E(2)via toll-like receptor 2 in humanplacental trophoblast cells.J Reprod Immunol.2006；72:46-59)。PGE-2是一种具有很强的抑制NK细胞活性的小分子物质。因此，为保留单核/巨噬细胞分泌物中刺激NK细胞活化的活性，同时消除其中的抑制因素，在培养体系中加入COX-2抑制剂。多种COX-2抑制剂都具有相似的功能，如吲哚美辛(indomethacin)、NS-398和塞来昔布(celecoxib)等，优选为吲哚美辛，吲哚美辛的浓度为0.5μM-50μM，推荐浓度为1-20μM，优选浓度为5μM。

4)细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-2+IL-15、IL-12、IL-18等，作用是通过与细胞表面的受体结合，促进细胞增殖。这些细胞因子可组合或单独使用，均可以达到有效扩增NK细胞的目的。本发明优选使用IL-2和IL-15(IL-2+IL-15)细胞因子组合，IL-2的浓度为2×10⁵-3×10⁶U/L(200U/mL-3000U/mL)，优选为1×10⁶U/L(1000U/mL)，IL-15的浓度为10-100mg/L(10-100ng/mL)，优选为50mg/L(50ng/mL)。

以下结合实施例详细说明。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

本发明所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、用人外周血单个核细胞体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞

本实施例所用的NK细胞来源于人外周血的单个核细胞。

一、体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系

用于体外活化扩增人NK细胞的培养体系，包括NK细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，具体配方如下：

1、人外周血细胞激活剂的配方：每升(/L)激活剂含：

(1)抗人CD16单克隆抗体(购自北京同立海源生物技术有限公司)1mg(0.5-5mg均可，推荐浓度为1-2mg)；

(2)巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)(购自北京安必奇生物科技有限公司，为美国Creative Peptides产品)10mg(1-100mg均可，推荐浓度为5-25mg)；

(3)溶剂为0.01M Tris-CL-NaCL溶液。Tris-CL-NaCL溶液含有Tris碱1.21g/L，NaCl 9g/L，用HCl调节pH值至7.2(7.0-7.5均可，推荐pH值为7.1-7.3)。

上述三种试剂均购自中国国药集团化学试剂有限公司。所述细胞激活剂中的三种组分可分开存放(分别存放于不同的容器中)或混合存放。

2、通用的NK细胞扩增培养基的配方，使用RPMI1640培养基作为基础培养基(按照说明书的方法配制RPMI1640培养基)，如表1所示，每升(/L)NK细胞扩增培养基添加RPMI1640粉剂10.39g，NaHCO₃ 2g，另外添加人白蛋白0.5-5g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物1-10mL，乙醇胺1-10×10^-4M，脂类混合物1-10mL，生物素1-20mg，丙酮酸钠55-220mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸1-20mM，L-谷氨酰胺146-730mg，多胺混合物1-10mL，RPMI1640氨基酸溶液1-20mL，注射用氢化可的松琥珀酸钠1-10×10^-6M，吲哚美辛0.5-10μM，IL-2 2×10⁵-3×10⁶U,IL-15 10-100mg。

人外周血NK细胞扩增培养基的配方优选为：每升(/L)培养基含：RPMI1640粉剂10.39g，NaHCO₃ 2.04g，人白蛋白2g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物10mL，乙醇胺6×10^-4M，脂类混合物1mL，生物素10mg，丙酮酸钠110mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸2mM，L-谷氨酰胺292mg，多胺混合物1mL，RPMI1640氨基酸溶液20mL，吲哚美辛5μM，IL-2 1×10⁶U，IL-15 50mg。

以上组分用注射用水溶解后，经过0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃避光保存。

表1人外周血NK细胞扩增培养基的配方

二、用人外周血单个核细胞体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞

1、人外周血单个核细胞的分离及自体血浆的处理

向健康人外周血30mL中加入肝素(购自河南省鹤壁市制药厂)抗凝，500g离心10分钟，收集血浆15mL，将血浆于56℃静置20分钟后取出，1200g离心5分钟，去除血小板沉淀，得到自体血浆，备用。

按实验室常规方法，将上述血液Ficoll密度梯度离心收集单个核细胞。细胞计数，总数为4.2×10⁷个。留取2×10⁶个细胞用于流式细胞学分析，具体步骤如下所述。其余细胞(4.0×10⁷个)加入含10％(V/V)自体血浆(2mL)和含重组人IL-2 1000U/mL、重组人IL-1550ng/mL的NK细胞扩增培养基(18mL)，单个核细胞悬液的细胞密度为2.0×10⁶个/mL(0.5-10×10⁶/mL均可，推荐为1-5×10⁶/mL)，用于培养。

2、活化人自然杀伤(NK)细胞

1)培养瓶铺板

用三种组分分开的细胞激活剂进行铺板：

(1)用3mL异丙醇溶解10μg巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2),滴加7mL 0.01MpH7.2Tris-CL-NaCL溶液至巨噬细胞激活脂肽-2的浓度为1mg/L，加入底面积为75cm²的培养瓶中，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上即可使用(如不是现场使用，可于4℃储存、3周内使用)；吸除巨噬细胞激活脂肽-2溶液，用0.01M pH7.2Tris-CL-NaCL溶液洗涤培养瓶底1次，以去除未黏附于容器底部的巨噬细胞激活脂肽-2；(2)将抗人CD16单克隆抗体100μg和10mL 0.01M pH7.2Tris-CL-NaCL溶液混合至抗人CD16单克隆抗体的浓度为10mg/L，加入培养瓶中，将培养瓶置于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上即可使用(如不是现场使用，可于4℃储存、3周内使用)。

为简化操作程序，可以直接将5mL所述三种组分混合的细胞激活剂加入底面积为75cm²的培养瓶中，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上即可使用(如不是现场使用，可于4℃储存、3周内使用)。

2)接种细胞

取出已经铺板的培养瓶，用注射用生理盐水洗涤1次，加入20mL外周血单个核细胞悬液(细胞密度为2.0×10⁶个/mL)，置于37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度下培养。

3、扩增人自然杀伤(NK)细胞

72小时后，向培养瓶中加入10％自体血浆(2mL)和表1的外周血NK细胞扩增培养基(18mL)，继续培养48小时。细胞总体积为40mL。

之后，将细胞悬液转入细胞培养袋中，加入10％自体血浆(4mL)和外周血NK细胞扩增培养基(36mL)，继续培养48小时。此时，细胞总体积为80mL。

加入10％自体血浆(7mL)和外周血NK细胞扩增培养基(73mL)，继续培养48小时。此时，细胞总体积为160mL。

补充外周血NK细胞扩增培养基160mL，培养24小时。此时，细胞总体积为320mL。

补充外周血NK细胞扩增培养基320mL，培养24小时。此时，细胞总体积为640mL。

补充外周血NK细胞扩增培养基640mL，培养24小时。此时，细胞总体积为1280mL。

补充外周血NK细胞扩增培养基1320mL，培养48小时。此时，细胞总体积为2600mL。

补充外周血NK细胞扩增培养基1000mL，培养48小时。此时，细胞总体积为3600mL。

细胞培养总时间为14天。细胞总体积为3600mL。

4、收获细胞

500g离心10min，收获细胞。细胞总数为9.28×10⁹个(初始细胞总数为4×10⁷个)，细胞活力为97％，活细胞数为9×10⁹个，细胞总数扩增225倍。

三、细胞形态观察

人外周血单个核细胞培养48小时的细胞形态如图2(标示大小：100μm)所示，可见贴壁的细胞集落，在集落旁，有大量的梭形细胞(单核/巨噬细胞，箭头所指)，提示单核/巨噬细胞对NK细胞的刺激作用。

人外周血单个核细胞培养72小时形成的集落的形态如图3(标示大小：100μm)所示，可见细胞集落体积变大，表明细胞已经进入增殖状态。

四、流式细胞学分析

取培养前和活化扩增培养2周(14天)的人外周血单个核细胞，加入FITC标记的抗CD3单克隆抗体及PE标记的抗CD56抗体，以加入独特型对照抗体管为对照，室温避光反应20分钟。洗涤后FACSCalibur收集细胞，WinMdi2.9软件分析结果。根据培养前和培养后NK细胞(CD3-/CD56+)比例以及总细胞数，计算出NK细胞的扩增倍数。

人外周血单个核细胞培养前及培养2周(14天)NK细胞比例的流式细胞学分析结果如图4所示，NK细胞比例从活化扩增前的8.67％升高至84％，在细胞总数扩增225倍的基础上，NK细胞总数扩增2180倍。

五、K562细胞杀伤实验

检测人外周血单个核细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增(14天)的来自人外周血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率。96孔培养板中加入对数生长期的K562细胞(来源于ATCC)，每孔2×10⁴个，总体积为50μL。将细胞分为：(1)效靶比1:2，NK细胞每孔接种1×10⁴个，总体积为50μL；(2)效靶比1:1，NK细胞每孔接种2×10⁴个，总体积为50μL；(3)效靶比10:1，NK细胞每孔接种2×10⁵个，总体积为50μL，或人外周血单个核细胞接种2×10⁵个，总体积为50μL；(4)培养基50μL作为靶细胞对照；(5)每组只加相应数量的NK细胞或人外周血单个核细胞。每组8孔。4小时后每孔加入浓度为1mg/mL的噻唑蓝(MTT)10μL，37℃反应4小时。加入10％十二烷基苯磺酸钠100μL。测定每孔560nm光密度值(OD560)。培养前(ctr)及培养14天后，按照不同的效靶比测定人外周血单个核细胞对K562白血病细胞的杀伤率。杀伤率＝(实验组OD值-靶细胞对照组OD值-相应数量靶细胞对照OD值)/(靶细胞对照OD值)×100％。

人外周血单个核细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增的来自人外周血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率测定结果如图5(纵坐标：杀伤率(％)，横坐标：效靶比)所示，较人外周血单个核细胞，经活化扩增的来自人外周血单个核细胞的NK细胞对K562细胞的杀伤能力明显提高，效靶比为1:1时平均杀伤率超过90％。

实施例2、用人脐带静脉血(人脐血)单个核细胞体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞

本实施例所用的NK细胞来源于人脐血的单个核细胞。

一、体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系

用于体外活化扩增人NK细胞的培养体系，包括NK细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，具体配方如下：

1、人脐血细胞激活剂的配方：与实施例1相同。

2、人脐血NK细胞扩增培养基是在实施例1通用的NK细胞扩增培养基的配方基础上，增加了注射用氢化可的松琥珀酸钠1-10×10^-6M。

二、用人脐血单个核细胞体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞

1、人脐血单个核细胞的分离及自体血浆的处理

使用采血袋(购自四川南格尔生物医学股份有限公司医用器具厂)采集健康人脐血80mL，其中采血袋中原有抗凝剂枸橼酸钠28mL，实际脐血量为52mL。500g离心10分钟，收集含抗凝剂的血浆50mL。将血浆于56℃静置20分钟后取出，1200g离心5分钟，去除血小板沉淀，得到自体血浆，备用。

按实验室常规方法，将上述血液Ficoll密度梯度离心以收集单个核细胞。细胞计数，总数为1.1×10⁸个。留取1×10⁷个细胞用于流式细胞学分析，具体步骤如下所述。其余细胞(1.0×10⁸个)加入含10％自体血浆(2mL)和重组人IL-2 1000U/mL、IL-15 50ng/mL的NK细胞扩增培养基(18mL)，单个核细胞悬液的细胞密度为5.0×10⁶个/mL(0.5-10×10⁶/mL均可，推荐为1-5×10⁶/mL)，用于培养。

2、活化人自然杀伤(NK)细胞

1)培养瓶铺板

用三种组分分开的细胞激活剂进行铺板：

(1)用9mL异丙醇溶解30μg巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2),滴加21mL 0.01MpH7.2Tris-CL-NaCL溶液至巨噬细胞激活脂肽-2的浓度为1mg/L，加入底面积为250cm²的培养瓶中，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上使用(非现场使用于4℃储存、3周内使用)，吸除巨噬细胞激活脂肽-2溶液，用0.01M pH7.2Tris-CL-NaCL溶液洗涤培养瓶底1次，以去除未黏附于容器底部的巨噬细胞激活脂肽-2；

(2)将抗人CD16单克隆抗体300μg和30mL 0.01M pH7.2 Tris-CL-NaCL溶液混合至抗人CD16单克隆抗体的浓度为10mg/L，加入培养瓶中，将培养瓶置于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上(非现场使用于4℃储存、3周内使用)。

为简化操作程序，可以直接将20mL步骤一中三种组分混合的细胞激活剂加入底面积为250cm²的培养瓶中，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上使用(非现场使用于4℃储存、3周内使用)。

2)接种细胞

取出已经铺板的培养瓶，用注射用生理盐水洗涤1次，加入50mL脐血单个核细胞悬液(细胞密度为5.0×10⁶个/mL)，置于37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度下培养。

3、扩增人自然杀伤(NK)细胞

72小时后，加入10％自体血浆(5mL)和人脐血NK细胞扩增培养基(45mL)，继续培养48小时。细胞总体积为100mL。

之后，将细胞悬液转入细胞培养袋中，加入10％自体血浆(10mL)和人脐血NK细胞扩增培养基(90mL)，继续培养48小时。此时，细胞总体积为200mL。

加入10％自体血浆(20mL)和人脐血NK细胞扩增培养基(180mL)，继续培养48小时。此时，细胞总体积为400mL。

加入10％自体血浆(10mL)和人脐血NK细胞扩增培养基(390mL)，继续培养24小时。此时，细胞总体积为800mL。

补充人脐血NK细胞扩增培养基800mL，培养48小时。此时，细胞总体积为1600mL。

补充人脐血NK细胞扩增培养基1600mL，培养48小时。此时，细胞总体积为3.2L。

补充人脐血NK细胞扩增培养基1800mL，培养48小时。此时，细胞总体积为5L。

细胞培养总时间为14天。细胞总体积为5L。

4、收获细胞

500g离心10min，收获细胞。细胞总数为1.6×10¹⁰个(初始细胞总数为1.0×10⁸个)，细胞活力为95％，活细胞数为1.52×10¹⁰个，细胞总数扩增152倍。

三、细胞形态观察

人脐血单个核细胞培养48小时的细胞形态如图6(标示大小：100μm)所示，可见贴壁的细胞集落，在集落旁，有大量的梭形细胞(单核/巨噬细胞，星号所示)，提示单核/巨噬细胞对NK细胞的刺激作用。

人脐血单个核细胞培养72小时形成的集落的形态如图7(标示大小：100μm)所示，可见细胞集落体积变大，表明细胞处于增殖状态。

四、流式细胞学分析

分析方法与实施例1相同。

人脐血单个核细胞培养前及培养2周(14天)NK细胞比例的流式细胞学分析结果如图8所示，NK细胞比例从活化扩增前的7.22％升高至94.5％，在细胞总数扩增152倍的基础上，NK细胞总数扩增1989倍。

五、K562细胞杀伤实验

检测人脐血单个核细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增(14天)的来自人脐血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率。检测方法与实施例1相同。

人脐血单个核细胞(杀伤细胞对照)和体外活化扩增的来自人脐血单个核细胞的NK细胞(实验细胞)对K562细胞(白血病细胞)的杀伤率测定结果如图9(纵坐标：杀伤率(％)，横坐标：效靶比)所示，较人脐血单个核细胞，经活化扩增的来自人脐血单个核细胞的NK细胞对K562细胞的杀伤能力明显提高，效靶比为1:1时平均杀伤率超过90％。

实施例1和实施例2共同验证了本发明用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系和方法使用健康人外周血或脐带静脉血的单个核细胞作为起始细胞均能实现NK细胞的活化扩增，扩增数量提高近2000倍或以上，经过活化扩增后的NK细胞具有很强的K562细胞杀伤活性，效靶比为1:1时平均杀伤率超过90％。可以合理推断，本发明用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系和方法也能应用于从其它组织如骨髓中对NK细胞的培养，本发明也适用于动物NK细胞的培养。

Claims (10)

1.用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，包括细胞激活剂和NK细胞扩增培养基，所述细胞激活剂包括：(1)抗人CD16单克隆抗体、(2)巨噬细胞激活脂肽-2(macrophage activating lipopeptide-2，MALP-2)和(3)溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液；

所述NK细胞扩增培养基包括：1)基础培养基、2)无血清培养基添加剂、3)环氧化酶2(COX-2)抑制剂和4)细胞因子。

2.根据权利要求1所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：在细胞激活剂中，所述抗人CD16单克隆抗体的使用浓度为0.5-5mg/L(推荐浓度为1-2mg/L，优选浓度为1mg/L)；所述巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的使用浓度为1-100mg/L(推荐浓度为5-25mg/L，优选浓度为10mg/L)；所述溶解抗人CD16单克隆抗体和巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-CL-NaCL溶液或其它不含EDTA或其它螯合剂的缓冲液，缓冲液的pH值为7.0-7.5(推荐pH值为7.1-7.3，优选pH值为7.2)。

3.根据权利要求1或2所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：所述细胞激活剂中的三种组分可分开存放(分别存放于不同的容器中)或混合存放。

4.根据权利要求1-3任一所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：在NK细胞扩增培养基中：

所述基础培养基选自RPMI1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基中的一种或其中两种或三种基础培养基的组合(优选RPMI1640培养基)；

所述无血清培养基添加剂包括NaHCO₃、人白蛋白、人胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂类混合物(例如亚油酸、亚麻酸、油酸、胆固醇的混合)、生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺、多胺混合物(例如腐胺、尸胺、亚精胺、精胺的混合)、氢化可的松琥珀酸钠、必需氨基酸(如赖氨酸、色氨酸等)和非必需氨基酸(如谷氨酸、丙氨酸等)中的多种或全部；其中白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂类混合物、必需氨基酸和非必需氨基酸为必需成分，生物素、丙酮酸钠、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、L-谷氨酰胺和多胺混合物为促进细胞增殖的添加物，氢化可的松琥珀酸钠为培养脐带血来源NK细胞是的专用添加剂；

所述环氧化酶2(COX-2)抑制剂为吲哚美辛(indomethacin)、NS-398和塞来昔布(celecoxib)中的一种(优选为吲哚美辛，吲哚美辛的浓度为0.5μM-50μM，推荐浓度为1-20μM，优选浓度为5μM)；

所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12和IL-18中的至少两种，优选使用IL-2和IL-15细胞因子组合，IL-2的浓度为2×10⁵-3×10⁶U/L(200U/mL-3000U/mL)，优选为1×10⁶U/L(1000U/mL)，IL-15的浓度为10-100mg/L(10-100ng/mL)，优选为50mg/L(50ng/mL)。

5.根据权利要求4所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：通用的NK细胞扩增培养基以RPMI1640培养基作为基础培养基，每升(/L)NK细胞扩增培养基含有：RPMI1640粉剂10.39g，NaHCO₃ 2g，人白蛋白0.5-5g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物1-10mL，乙醇胺1-10×10^-4M，脂类混合物1-10mL，生物素1-20mg，丙酮酸钠55-220mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸1-20mM，L-谷氨酰胺146-730mg，多胺混合物1-10mL，RPMI1640氨基酸溶液1-20mL，吲哚美辛0.5-10μM，IL-2 2×10⁵-3×10⁶U,IL-15 10-100mg。

6.根据权利要求5所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：人外周血NK细胞扩增培养基的配方优选为：每升(/L)培养基含RPMI 164010.39g，NaHCO₃ 2.04g，人白蛋白2g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物10mL，乙醇胺6×10^-4M，脂类混合物1mL，生物素10mg，丙酮酸钠110mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸2mM，L-谷氨酰胺292mg，多胺混合物1mL，RPMI1640氨基酸溶液20mL，吲哚美辛5μM，IL-2 1×10⁶U,IL-15 50mg。

7.根据权利要求5所述的用于体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的培养体系，其特征在于：人脐血NK细胞扩增培养基的配方优选为：每升(/L)培养基含RPMI164010.39g，NaHCO₃2.04g，人白蛋白2g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物10mL，乙醇胺6×10^-4M，脂类混合物1mL，生物素10mg，丙酮酸钠110mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸2mM，L-谷氨酰胺292mg，多胺混合物1mL，RPMI1640氨基酸溶液20mL，注射用氢化可的松琥珀酸钠1×10^-6M，吲哚美辛5μM，IL-2 1×10⁶U,IL-15 50mg。

8.一种体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，使用权利要求1至7任一项所述的培养体系，是将分离得到的单个核细胞作为起始细胞，先将所述细胞激活剂加入培养容器中进行铺板，然后向培养容器接种用含自体血浆的所述NK细胞扩增培养基制成的单个核细胞悬液，培养细胞，得到经活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。

9.根据权利要求8所述的体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，其特征在于：

所述NK细胞来源于人骨髓、外周血或脐带静脉血(脐血)的单个核细胞；

所述细胞激活剂中的三种组分可分开使用或混合使用；将三种组分分开铺板方法为：用异丙醇溶解巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2),滴加缓冲液至巨噬细胞激活脂肽-2的浓度为1-100mg/L(推荐1-2mg/L，优选1mg/L)，再将巨噬细胞激活脂肽-2溶液加入培养容器中，使溶液平铺于培养容器底部，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上，然后吸除巨噬细胞激活脂肽-2溶液，用缓冲液洗涤培养容器底部以去除未吸附于培养容器底部的巨噬细胞激活肽脂-2，再加入抗人CD16单克隆抗体和缓冲液至抗人CD16单克隆抗体的浓度为0.5-5mg/L(推荐5-25mg/L，优选10mg/L)，最低添加量为保证溶液铺满培养容器底部，将培养容器置于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上；

将三种组分混合的细胞激活剂进行铺板的方法为：将NK细胞激活剂加入培养容器中，最低添加量为保证溶液铺满整个培养容器底部，于37℃静置1小时以上(优选1-2小时)或4℃静置2小时以上；

所述单个核细胞悬液的细胞密度为0.5-10×10⁶/mL，推荐为1-5×10⁶/mL，优选为2×10⁶/mL；自体血浆的添加比例为1-20％(V/V)，优选为10％(V/V)；

所述培养细胞的培养条件为37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度，培养时间为10天-21天，推荐10-18天，优选14天；优选逐步扩大培养规模和增加培养时间，扩大培养规模的方法是添加含1-20％(优选10％，V/V)自体血浆的NK细胞扩增培养基，培养时间根据细胞数量和生长状态进行增加；采用常规离心的方法收获活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。

10.根据权利要求8或9所述的体外活化扩增人自然杀伤(NK)细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从外周血或脐血中分离得到单个核细胞；

2)将细胞激活剂加入培养容器中进行铺板：

将三种组分分开的细胞激活剂进行铺板或

将三种组分混合的细胞激活剂进行铺板；

3)向培养容器接种用含1-20％(V/V)自体血浆的所述人外周血NK细胞扩增培养基或所述人脐血NK细胞扩增培养基制成的单个核细胞悬液，在37℃、5％CO₂、95％空气、100％湿度条件下培养10天-21天(推荐10-18天，优选14天)，得到高纯度(纯度可达60-94％)的经活化扩增的人自然杀伤(NK)细胞。