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TWI556827B - 抗－ｆａｐ抗體及其使用方法 - Google Patents

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Description

抗-FAP抗體及其使用方法
本發明係關於對纖維母細胞活化蛋白(FAP)具有特異性之抗體。另外，本發明係關於編碼此等抗體之多核苷酸、及包含此等多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於產生該等抗體之方法及其在治療疾病中之使用方法。
纖維母細胞活化蛋白(FAP)及抗-FAP抗體
人類纖維母細胞活化蛋白(FAP；GenBank登記號AAC51668)(亦稱作Seprase)係170 kDa整合膜絲胺酸肽酶(EC 3.4.21.B28)。FAP與密切相關之細胞表面酶二肽基肽酶IV(亦稱作CD26；GenBank登記號P27487)及其他肽酶一起屬於二肽基肽酶IV家族(Yu等人，FEBS J 277,1126-1144(2010))。其係含有兩個N-糖基化亞單位之同源二聚體，該等N-糖基化亞單位具有定位有酶之催化結構域的大C末端細胞外結構域(Scanlan等人，Proc Natl Acad Sci USA 91,5657-5661(1994))。呈糖基化形式之FAP具有後脯胺醯基二肽基肽酶與明膠酶活性二者(Sun等人，Protein Expr Purif 24,274-281(2002))。
人類FAP最初係使用單株抗體(mAb) F19(闡述於WO 93/05804中，ATCC編號HB 8269)在經培養纖維母細胞中鑑別。在包括小鼠在內之若干物種中發現該蛋白之同源物(Niedermeyer等人，Int J Cancer 71,383-389(1997)；Niedermeyer等人，Eur J Biochem 254,650-654(1998)；GenBank登記號AAH19190)。FAP具有獨特的組織分佈：發現其表現在所有原發性及轉移性上皮腫瘤(包括肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巢癌及乳腺癌)中之90%以上的反應性間質纖維母細胞上高度上調，而其通常不存在於正常成人組織中(Rettig等人，Proc Natl Acad Sci USA 85,3110-3114(1988)；Garin-Chesa等人，Proc Natl Acad Sci USA 87,7235-7239(1990))。隨後報導顯示，FAP不僅在間質纖維母細胞中表現，且亦在上皮來源之一些類型之惡性細胞中表現，且FAP表現與惡性表型直接相關(Jin等人，Anticancer Res 23,3195-3198(2003))。
由於FAP在許多常見癌症中表現及其在正常組織中之限制性表現，故認為其係使多種癌瘤成像、診斷及治療該等癌瘤的有前途之抗原靶標。因此，人們已培養出多種抗FAP之單株抗體用於研究、診斷及治療目的。
已研發出特異性結合人類FAP之F19抗體之人類化形式西羅珠單抗(Sibrotuzumab)/BIBH1(闡述於WO 99/57151中)及抗具有F19表位特異性之FAP抗原之其他人類化或完全人類抗體(闡述於Mersmann等人，Int J Cancer 92,240-248(2001)；Schmidt等人，Eur J Biochem 268,1730-1738(2001)；WO 01/68708)中)。OS4抗體係F19抗體之另一人類化(CDR移植)形式(West等人，J Biotech 92,159-168(2001)，而scFv 33及scFv 36具有與F19不同之結合特異性且與人類及小鼠FAP蛋白交叉反應(Brocks等人，Mol Med 7,461-469(2001))。最近，已研發出其他鼠類抗-FAP抗體以及其嵌合及人類化形式(WO 2007/077173，Ostermann等人，Clin Cancer Res 14,4584-4592(2008))。
腫瘤基質中之蛋白酶經由細胞外基質(ECM)組份之蛋白水解性降解來促進諸如血管發生及/或腫瘤細胞遷移等過程。此外，腫瘤基質在腫瘤之營養素及氧供給中以及在腫瘤侵潤及轉移中起到重要作用。該等基本功能使其不僅為診斷靶標且亦為潛在治療靶標。
在利用131碘標記之F19抗體之I期臨床研究中獲得關於使用抗-FAP抗體在活體內靶向腫瘤基質之概念之可行性的證據，此表明該抗體在腫瘤中之特定富集及轉移之檢測(Welt等人，J Clin Oncol 12,1193-1203(1994))。同樣，利用西羅珠單抗之I期研究表明131I標記抗體之特定腫瘤累積(Scott等人，Clin Cancer Res 9,1639-1647(2003))。然而，未偶聯西羅珠單抗在患有轉移性結腸直腸癌患者中之早期II期試驗因該抗體缺乏抑制腫瘤進展之功效而中斷(Hofheinz等人，Onkologie 26,44-48(2003))。此外，最近研發出之抗-FAP抗體在未偶聯形式下未顯示活體內抗腫瘤效應(WO 2007/077173)。
因此，業內仍需要靶向FAP之增強之治療方法(包括具有經改良功效之抗體)用於癌症治療。
抗體糖基化
寡糖組份可顯著影響與治療性糖蛋白之功效有關之性質，包括物理穩定性、對蛋白酶攻擊之抗性、與免疫系統之相互作用、藥物代謝動力學及特定生物活性。該等特性不僅可取決於存在或不存在寡糖，且亦取決於寡糖之特定結構。在寡糖結構與糖蛋白功能之間可得到一些概論。舉例而言，某些寡糖結構經由與特定碳水化合物結合蛋白相互作用來調介快速清除血流中之糖蛋白，而另一些則可與抗體結合並觸發不期望之免疫反應(Jenkins等人，Nature Biotechnol 14,975-81(1996))。
IgG1型抗體係癌症免疫療法中最常用之抗體，其係在每一CH2結構域中之Asn 297處具有保守N-連接糖基化位點之糖蛋白。兩種附接至Asn 297之複雜雙觸角寡糖隱藏在CH2結構域之間，與多肽骨架形成廣泛接觸，且其存在對抗體介導諸如抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)等效應子功能而言至關重要(Lifely等人，Glycobiology 5,813-822(1995)；Jefferis等人，Immunol Rev 163,59-76(1998)；Wright及Morrison，Trends Biotechnol 15,26-32(1997))。蛋白質改造研究已顯示，FcγR與IgG CH2結構域之較低鉸鏈區相互作用。Lund等人，J. Immunol. 157:4963-69(1996)。然而，FcγR結合亦需要在CH2區中存在寡糖。Lund等人，J. Immunol. 157:4963-69(1996)；Wright及Morrison，Trends Biotech. 15:26-31(1997)，從而表明，寡糖與多肽二者皆直接決定相互作用位點，或需要寡糖來維持活性CH2多肽構象。因此，對寡糖結構之修飾可作為增強IgG1與FcγR之間之相互作用之親和力及增強IgG1之ADCC活性之手段來探究。
一種顯著提高單株抗體效能之方式係藉由改造其寡糖組份來增強其細胞介導之天然效應子功能，如Umaa等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)及美國專利第6,602,684號(WO 99/54342)中所述，該等文獻之內容以全文引用方式併入本文。Umaa等人顯示，β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化形成二等分型寡糖之糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過表現顯著增強彼等細胞中所產生抗體之活體外ADCC活性。GnTIII在產生細胞系中之過表現產生富含二等分型寡糖之抗體，該等寡糖通常亦係非岩藻糖基化且為雜合型。若除GnTIII外，在產生細胞系中亦過表現甘露糖苷酶II(ManII)，則獲得富含複雜類型之二等分型非岩藻糖基化寡糖之抗體(Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。與具有未經修飾聚糖之抗體相比，兩種類型之抗體皆顯示大大增強之ADCC，但僅多數N-聚糖屬於複雜類型之抗體能夠誘導顯著的補體依賴性細胞毒性(Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。對Asn 297碳水化合物之組成之改變或其消除亦影響抗體Fc-結構域與FcγR及補體C1q蛋白之結合，此分別對於ADCC及CDC而言至關重要(Umaa等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Davies等人，Biotechnol Bioeng 74,288-294(2001)；Mimura等人，J Biol Chem 276,45539-45547(2001)；Radaev等人，J Biol Chem 276,16478-16483(2001)；Shields等人，J Biol Chem 276,6591-6604(2001)；Shields等人，J Biol Chem 277,26733-26740(2002)；Simmons等人，J Immunol Methods 263,133-147(2002))。
本發明提供特異性結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗體，該等抗體具有高親和力及/或增強之效應子功能。
在一個態樣中，本發明係關於特異性結合FAP之抗體，其包含至少一個(即1個、2個、3個、4個、5個或6個)以下中所述互補決定區(CDR)：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177。在一個實施例中，該抗體包含選自以下之3個重鏈CDR(即HCDR1、HCDR2及HCDR3)及/或3個輕鏈CDR(即LCDR1、LCDR2及LCDR3)：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177。在一更具體實施例中，該抗體包含選自以下中所述重鏈及輕鏈可變區序列之抗體重鏈可變區及/或抗體輕鏈可變區、尤其同時具有重鏈及輕鏈之可變區：SEQ ID NO 193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309及311。在一個實施例中，該抗體包含Fc區、尤其IgG Fc區。在又一實施例中，抗體係全長抗體、尤其IgG類抗體。在另一實施例中，抗體包含人類抗體恆定區。在一個實施例中，抗體係人類。在一個實施例中，抗體經糖改造以在Fc區中具有經修飾寡糖。在一個實施例中，與非糖改造抗體相比，該抗體在Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化及/或二等分型寡糖。在又一實施例中，該抗體具有增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合親和力。在一特定實施例中，增強之效應子功能係增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在另一實施例中，抗體以低於約1 μM、較佳低於約100 nM、最佳低於約1 nM或甚至低於約0.1 nM之KD值結合FAP。在一個實施例中，抗體係親和力成熟的。在一個實施例中，抗體結合人類組織中之FAP。在一個實施例中，抗體不會誘導FAP之內在化。
在其他態樣中，本發明亦係關於與抗體有關之多肽、多核苷酸、宿主細胞及表現載體。在又一態樣中，本發明係關於製備該抗體之方法。在又一態樣中，本發明係關於使用該抗體尤其用於治療特徵在於表現FAP之疾病(例如癌症)之方法。
 I.　定義
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)間之非共價相互作用之總強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和力」係指反映結合對成員(例如，抗體及抗原)間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別為k解離及k締合)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由業內已知之常用方法來量測親和力，包括彼等本文所述者。用於量測結合親和力之具體闡釋性及實例性實施例闡述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比在一或多個超變區域(HVR)(例如CDR)中具有一或多個改變(例如胺基酸突變)的抗體，此等改變使得可改良抗體對於抗原之親和力。通常，親和力成熟抗體結合與親代抗體相同之表位。
術語「抗-FAP抗體」及「結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗體」係指能夠以足夠親和力結合FAP從而使該抗體可用作靶向FAP中之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一個實施例中，抗-FAP抗體與不相關非FAP蛋白之結合程度小於該抗體與FAP之結合的約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)或流式細胞術(FACS)所量測。在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體與DPPIV(與FAP密切相關之蛋白，亦稱作CD26；GenBank登記號P27487)之結合程度小於該抗體與FAP之結合的約15%、約10%或約5%，如藉由FACS所量測。在某些實施例中，結合FAP之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(KD)。在某些實施例中，抗-FAP抗體結合在來自不同物種之FAP中保守之FAP表位。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。本發明亦包括具有Fc區之抗體片段及包含等效於免疫球蛋白之Fc區之區域的融合蛋白。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、單鏈抗體分子(例如scFv)、雙特異性抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合相同表位之抗體」(作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。
術語「抗原結合結構域」係指抗原結合分子中包含特異性結合抗原之一部分或全部且與其互補之區域的一部分。倘若抗原較大，則抗原結合分子可僅結合抗原之特定部分，該部分稱為表位。抗原結合結構域可由(例如)一或多個抗體可變結構域(亦稱為抗體可變區)提供。較佳地，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之剩餘部分源自不同來源或物種的抗體。對於嵌合抗體而言，舉例而言，非抗原結合組分可源自多種物種，包括靈長類動物，例如黑猩猩及人類。人類化抗體係嵌合抗體之尤佳形式。
抗體之「類別」係指其重鏈所擁有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干可進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼類(vinca alkaloids)(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應子功能」係指彼等歸因於抗體之Fc區之生物活性，其可隨抗體同種型而有所變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞因子分泌；免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc區」在本文中用於界定免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc區之C末端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據亦稱為EU指數之EU編號系統，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「與免疫球蛋白Fc區等效之區域」意欲包括免疫球蛋白Fc區之天然等位基因變體，以及具有可產生取代、添加或缺失但不會顯著降低免疫球蛋白介導效應子功能(例如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)之能力之改變之變體。舉例而言，免疫球蛋白Fc區之N末端或C末端可缺失一或多個胺基酸且不顯著損失生物功能。此等變體可根據業內已知通用規則來選擇以對活性造成最小效應(例如，參見Bowie,J. U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
「框架」或「FR」係指除超變區域(HVR)(或CDR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有實質上與天然抗體結構相似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化細胞」，其包括原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代與親代細胞之核酸含量可能並不完全相同，但可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。在一個實施例中，宿主細胞經改造使得可產生具有經修飾寡糖之抗體。在某些實施例中，宿主細胞已經進一步操作以表現提高含量之一或多種具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)活性之多肽。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，例如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞，僅舉幾個例子，且亦包括轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織中所含細胞。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組κ I(參見上文)。在一個實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人(參見上文)所述之III亞組。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。「人類化形式」之抗體(例如，非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
如本文所用術語「超變區域」或「HVR」係指抗體可變結構域區域中序列具有超變性及/或形成結構上經界定之環(「超變環」)中的每一者。通常，天然四鏈抗體包括6個HVR；3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包括來自超變環及/或來自「互補決定區域」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。超變區(HVR)亦稱作互補決定區(CDR)，且該等術語在本文中可參照可變區中形成抗原結合區之部分互換使用。此特定區域已闡述於以下文獻中：Kabat等人，美國衛生及人類服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services)，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)及Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)，其中該等定義在彼此進行比較時包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，本文所定義及使用之術語之範圍意欲涵蓋使用任一定義意指抗體或其變體之CDR。涵蓋上文所引用參考文獻中之每一者定義之CDR之合適胺基酸殘基展示於下表1中進行比較。涵蓋特定CDR之確切殘基數量可隨CDR之序列及尺寸而變。給定抗體之可變區胺基酸序列，彼等熟習此項技術者可以常規方式確定包含特定CDR之殘基。
1　表1中之所有CDR定義皆係根據Kabat等人所述之編號規定來編號(參見下文)。
2　表1中所用具有小寫字母「b」之「AbM」係指由Oxford Molecular之「AbM」抗體建模軟體定義之CDR。
Kabat等人亦定義用於可變區序列且適用於任一抗體之編號系統。熟習此項技術者不依賴除序列本身以外之任何實驗數據即可明確地將此「Kabat編號」系統指定給任一可變區序列。本文所用「Kabat編號」係指Kabat等人，國衛生及人類服務部，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)闡述之編號系統。除非另有說明，否則提及在抗體可變區中對具體胺基酸殘基位置進行編號時係根據Kabat編號系統。
CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。一般而言，給定CDR中僅1/5至1/3殘基參與抗原結合。可藉由(例如)根據Padlan等人，FASEB J. 9(1):133-139(1995)中所述方法自三維建模計算原子間接觸並確定給定殘基位置處之序列可變性來鑑別特定CDR中之特異性決定殘基。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於胺基酸殘基L1之31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處(參見Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633(2008))。
「抗體偶聯物」係偶聯至細胞毒性劑之抗體。
「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體係人類。
「經分離」抗體係自其天然環境組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至具有大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)方法所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，例如，參見Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87(2007)。
「經分離」多核苷酸係指自天然環境組份分離之多核苷酸分子。經分離多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子之細胞中所含的多核苷酸分子，但該多核苷酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗-FAP抗體之經分離多核苷酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個多核苷酸分子，包括單一載體或單獨載體中之此(等)多核苷酸分子、及存在於宿主細胞中一或多個位置處之此(等)多核苷酸分子。
本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群獲得之抗體，亦即，包含該群之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，此等變體通常以較小量存在。與通常編號針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單個決定簇。因此，修飾語「單株」表示自實質上同源抗體群獲得之抗體性質，且不應解釋為需要藉由任一特定方法產生抗體。舉例而言，用於本發明中之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物的方法，製備單株抗體之此等方法及其他實例性方法闡述於本文中。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N端至C末端，每一重鏈依次具有可變區(VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)及三個恆定結構域(CH1、CH2、及CH3)(亦稱為重鏈恆定區)。同樣，自N端至C末端，每一輕鏈依次具有可變區域(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及恆定輕鏈(CL)結構域(亦稱為輕鏈恆定區)。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分為兩種類型中之一者，稱為稱為κ型及λ型。
「無實質交叉反應性」意指分子(例如，抗體)尤其在與靶抗原比較時不識別或特異性結合與自身不同之實際靶抗原之抗原(例如與該靶抗原密切相關之抗原)。舉例而言，抗體可結合小於約10%至小於約5%與實際靶抗原不同之抗原，或可以選自由以下組成之群之量結合該與實際靶抗原不同之抗原：小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%，較佳小於約2%、1%或0.5%，且最佳小於約0.2%或0.1%與實際靶抗原抗原不同之抗原。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品商業包裝內之說明書，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症及/或涉及該等治療產品使用之警告的資訊。
術語「親代」抗體係指用作變體製備之起始點或基礎之抗體。
「就參考肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列對比電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼與使用者文件已一起編入美國版權局，Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且並不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：
100×分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係根據前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
同樣，具有與本發明參考核苷酸序列至少(例如)95%「一致」之核苷酸序列的核酸或多核苷酸意欲指多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是按參考核苷酸序列的每100個核苷酸計，該多核苷酸序列可包括最多5個點突變。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中最多5%核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可將佔參考序列中總核苷酸最多5%之大量核苷酸插入參考序列中。該等參考序列之改變可發生在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列殘基中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。實際上，可使用已知電腦程式(例如上文所列示者)按慣例確定任一特定多核苷酸或多肽與本發明核苷酸序列或多肽序列是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其呈現形式允許其中所含活性成份之生物活性有效，且不含對投與調配物之個體具有不可接受毒性的其他組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另外說明，否則本文所用術語「纖維母細胞活化蛋白(FAP)」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然FAP，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類，參見GenBank登記號AAC51668)及齧齒類動物(例如，小鼠，參見GenBank登記號AAH19190)。該術語涵蓋「全長」細胞中之未處理FAP以及自處理產生之任一形式的FAP。該術語亦涵蓋FAP之天然變體，例如，剪接變體或等位基因變體。較佳地，本發明之抗-FAP抗體結合FAP之細胞外結構域。實例性人類、小鼠及食蟹猴FAP胞外結構域(具有C末端聚離胺酸及6x His-標籤)之胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 317、SEQ ID NO: 319及SEQ ID NO: 321中。
本文所用「治療」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指嘗試改變所治療個體之自然疾病過程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)防止疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與使抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中每一結構域皆包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域文庫來進行分離。例如，參見，Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
本文所用術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱作「表現載體」。
本文所用術語「具有GnTIII活性之多肽」係指能催化將N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基以β-1-4鍵添加至N-連接寡糖中三甘露糖基核心之β-連接甘露糖苷上之多肽。此多肽包括表現類似於但不一定等同於β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(根據Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB)亦稱作β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙醯葡糖胺基轉移酶(EC 2.4.1.144))之酶活性之融合多肽，該活性係如特定生物學分析中所量測且具有或不具有劑量依賴性。倘若確實存在劑量依賴性，則其無需等同於GnTIII之活性，而係與GnTIII相比實質上類似於給定活性之劑量依賴性(即，候選多肽相對於GnTIII可展現較高活性，或其活性不小於GnTIII的約二十五分之一、且較佳活性不小於約十分之一，且最佳活性不小於約三分之一)。
本文所用術語「高爾基體定位結構域」係指高爾基體駐留多肽之胺基酸序列，其負責將多肽錨定至高爾基複合體內之位置。一般而言，定位結構域包含酶之胺基末端「尾」。
認為尤其具有前綴「糖-」之本文所用術語「改造(engineer,engineered,engineering」以及術語「糖基化改造」包括對天然或重組多肽或其片段之糖基化模式之任一操作。糖基化改造包括細胞糖基化機制之代謝改造(例如寡糖合成途徑之遺傳操作)，以達成細胞中表現之糖蛋白糖基化的改變。此外，糖基化改造包括突變及細胞環境對糖基化之效應。在一個實施例中，糖基化改造係糖基轉移酶活性之改變。在一特定實施例中，改造導致葡糖胺基轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性改變。
本文所用術語「Fc介導細胞毒性」包括抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及含有人類Fc區之可溶Fc融合蛋白介導之細胞毒性。其係引起「人類免疫效應細胞」溶解「靶向細胞」之免疫機制。
本文所用術語「人類免疫效應細胞」係指在表面上展示Fc受體之白細胞群，其經由該等Fc受體結合抗體或Fc融合蛋白之Fc區並實施效應子功能。此白細胞群可包括(但不限於)外周血單核細胞(PBMC)及/或自然殺傷(NK)細胞。
本文所用術語「靶向細胞」係指結合包含Fc區之抗原結合分子(例如，包含Fc區之抗體或其片段)或Fc融合蛋白特異性之細胞。抗原結合分子或Fc融合蛋白經由蛋白質部分中Fc區之N末端結合靶細胞。
本文所用術語「增強之Fc介導細胞毒性」定義為在給定時間內、在給定抗體或Fc融合蛋白濃度下、在靶細胞周圍培養基中藉由上文所定義之Fc介導細胞毒性機制溶解之「靶向細胞」數量的增加，及/或靶細胞周圍培養基中在給定時間內藉由Fc介導細胞毒性機制使給定數量之「靶向細胞」溶解所需之抗體或Fc融合蛋白濃度之降低。Fc介導細胞毒性之增強係相對於由相同抗原結合分子或Fc融合蛋白介導之細胞毒性而言，該相同抗體或Fc融合蛋白系由相同類型之宿主細胞使用相同標準製備、純化、調配及儲存方法(其為彼等熟習此項技術者已知)來產生，但尚未藉由經本文所述方法進行改造而具有經改變糖基化模式(例如表現糖基轉移酶GnTIII或其他糖基轉移酶)之宿主細胞來產生。
「具有增強的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之抗體」意指藉由彼等熟習此項技術者已知之任一適宜方法測得具有增強的ADCC之抗體(該術語如本文中所定義)。一種普遍接受之活體外ADCC分析係如下：
1)該分析使用已知可表現抗體之抗原結合區識別之靶抗原之靶細胞；
2)該分析使用自隨機選擇之健康供體血液中分離之人類外周血單核細胞(PBMC)作為效應細胞；
3)該分析根據以下方案來實施；
i)使用標準密度離心程序來分離PBMC且以5 x 106個細胞/ml將其懸浮於RPMI細胞培養基中；
ii)藉由標準組織培養方法來培養靶細胞，在生存力高於90%之指數生長期收穫細胞，在RPMI細胞培養基中洗滌，用100微居裏(micro-Curie)51Cr標記，用細胞培養基洗滌兩次，並以105個細胞/ml之密度使其再次懸浮於細胞培養基中；
iii)將100微升上述最終靶標細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定板的各孔中；
iv)在細胞培養基中將抗體自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml並將50微升所得抗體溶液添加至96孔微量滴定板中之靶細胞中，以一式三份測試覆蓋上述整個濃度範圍之各種抗體濃度；
v)對於最大釋放(MR)對照，在板中3個含有經標記靶細胞之其他孔中添加50微升2%(v/v)非離子型去污劑水溶液(Nonidet,Sigma,St. Louis)來代替抗體溶液(上述第iv點)；
vi)對於自發釋放(SR)對照，在板中3個含有經標記靶細胞之其他孔中添加50微升RPMI細胞培養基來代替抗體溶液(上述第iv點)；
vii)然後將96孔微量滴定板在50 x g下離心1分鐘並在4℃下培育1小時；
viii)將50微升PBMC懸浮液(上述第i點)添加至各孔中以產生25:1之效應細胞：靶標細胞比並將各滴定板在培育箱中於5% CO2氣氛下在37℃下放置4小時；
ix)自各孔收穫無細胞上清液並使用γ計數器對實驗釋放之放射性(ER)進行定量。
x)根據式(ER-MR)/(MR-SR)x 100計算每一抗體濃度下之特異性溶解百分比，其中ER係在該抗體濃度下(見上述第ix點)定量之平均放射性，MR係對MR對照(見上述第v點)定量之平均放射性(見上述第ix點)，且SR係對SR對照(見上述第vi點)定量之平均放射性(見上述第ix點)；
4)「增強之ADCC」定義為在上文所測試抗體濃度範圍內所觀察到特異性溶解之最大百分比增加，及/或達成在上文所測試抗體濃度範圍內所觀察到特異性溶解之最大百分比的一半所需抗體濃度之降低。ADCC之增強係相對於使用上述分析來量測且由相同抗體介導之ADCC而言，該相同抗體係由相同類型宿主細胞使用彼等熟習此項技術者已知之相同標準製備、純化、調配及儲存方法來產生，但尚未藉由經改造可過表現GnTIII之宿主細胞產生。
II.　組合物及方法
纖維母細胞活化蛋白(FAP)在大多數腫瘤中表現，但基本上不存在於健康成人組織中，因此靶向此抗原之抗體具有極大治療潛力。本發明提供結合FAP之抗體、尤其具有高親和力及強效應子功能之抗體。本發明抗體可用於(例如)診斷或治療特徵在於表現FAP之疾病，例如癌症。
A.　實例性抗-FAP抗體
本發明提供特異性結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗體。特定而言，本發明提供特異性結合FAP之抗體，其中該等抗體經糖改造以具有增強之效應子功能。
在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體包含至少一個(例如1個、2個、3個、4個、5個或6個)選自以下之群之重鏈或輕鏈互補決定區(CDR)：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177，或其至少含有該CDR之特異性決定殘基(SDR)之變體或截短形式。
在一個實施例中，該至少一個CDR係重鏈CDR、尤其選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141。在另一實施例中，抗體包含至少一個重鏈CDR及至少一個輕鏈CDR、尤其選自SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141之群之重鏈CDR3及選自SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177之群之輕鏈CDR3。
在一個實施例中，本發明抗體包含至少1個、至少2個或全部3個選自以下之重鏈CDR(HCDR)序列：(a) HCDR1，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；(b) HCDR2，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 133；及(c)HCDR3，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141。在又一實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(a)選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；(b)選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 133；及(c)選自以下之群之重鏈CDR3:SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；或其至少含有該等CDR之SDR之變體或截短形式。
在一個實施例中，本發明抗體包含至少1個、至少2個或全部3個選自以下之輕鏈CDR(LCDR)序列:(a)LCDR1，其包含選自以下之群之胺基酸序列:SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；(b)LCDR2，其包含選自以下之群之胺基酸序列:SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及(c)LCDR3，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177。在又一實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含(a)選自以下之群之輕鏈CDR1：SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；(b)選自以下之群之輕鏈CDR2：SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及(c)選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177；或其至少含有該等CDR之SDR之變體或截短形式。
在一更具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；選自以下之群之重鏈CDR2:SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ IDNO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 133；及選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之輕鏈CDR1：SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；選自以下之群之輕鏈CDR2：SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177；或其至少含有該等CDR之SDR之變體或截短形式。
在另一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 133；及選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之輕鏈CDR1：SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；選自以下之群之輕鏈CDR2：SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177，其中該等CDR中之至少一者選自以下之群：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 177。
在另一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 131及SEQ ID NO: 133；及選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之輕鏈CDR1：SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；選自以下之群之輕鏈CDR2：SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 175及SEQ ID NO: 177，其中該等CDR中之至少一者不為選自以下之群之CDR：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173及SEQ ID NO: 175。
在另一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 27；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105及SEQ ID NO: 107；及選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之輕鏈CDR1：SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 149；選自以下之群之輕鏈CDR2：SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 161；及選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173及SEQ ID NO: 175；或其至少含有該等CDR之SDR之變體或截短形式。
在一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 101；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在另一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 103；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 137；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 145、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 153及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 165。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 101；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 137；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 147、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 155及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 167。在另一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO:105；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 145、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 153及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 169。在另一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 101；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 137；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 149、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 157及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 167。在另一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 29；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 129及SEQ ID NO: 131；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO:133；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 137；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 147、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 155及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 167。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 101；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 177。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 77及SEQ ID NO: 109；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 79及SEQ ID NO: 111；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 131；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 23；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 81及SEQ ID NO: 113；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 135；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 143、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 151及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 163。在又一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 31；選自以下之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 95及SEQ ID NO: 127；及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 137；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 147、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 155及輕鏈CDR3 SEQ ID NO: 167。
在一個實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與選自以下之群之序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311。在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，其包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311。
在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-FAP抗體保持結合FAP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 197、201、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247、251、255、259、263、267、271、275、279、283、287、291、295、299、303、307或311中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失在HVR或CDR外部區域中(即，在FR中)發生。視情況，本發明之抗-FAP抗體包含SEQ ID NO 197、201、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247、251、255、259、263、267、271、275、279、283、287、291、295、299、303、307或311中之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含1個、2個或3個選自以下中所述序列之重鏈CDR用於HCDR1、HCDR2及HCDR3：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139及141。
在另一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與選自以下之群之序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309。在再一實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列:SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309。
在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-FAP抗體保持結合FAP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 193、195、199、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305或309中，總共有1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失在HVR或CDR外部區域中(即，在FR中)發生。視情況，本發明之抗-FAP抗體包含SEQ ID NO 193、195、199、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305或309中之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，該VL包含1個、2個或3個選自以下中所述序列之輕鏈CDR用於LCDR1、LCDR2及LCDR3：SEQ ID NO 143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177。
在另一態樣中，提供抗-FAP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任一實施例中之VH、及如上文所提供任一實施例中之VL。在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及輕鏈可變區，其包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309。在一個實施例中，抗體包含分別在以下中之VH及VL序列：SEQ ID NO 197、201、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247、251、255、259、263、267、271、275、279、283、287、291、295、299、303、307或311及SEQ ID NO 193、195、199、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305或309，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309，其中該等可變區中之至少一者不包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 253及SEQ ID NO: 255。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之胺基酸：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309，其中該等可變區中之至少一者包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 255；及輕鏈可變區，其包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249及SEQ ID NO: 253。
在一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 197之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 193或SEQ ID NO: 195之輕鏈可變區。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 201或SEQ ID NO: 203之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 199之輕鏈可變區。在再一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 207之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 205之輕鏈可變區。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 211之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 209之輕鏈可變區。在又一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 219之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 217之輕鏈可變區。在另一實施例中，本發明抗體包含含有選自以下之群之胺基酸序列之重鏈可變區:SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；或含有胺基酸序列SEQ ID NO: 293之輕鏈可變區。在一具體實施例中，本發明抗體包含a)重鏈可變區，其包含選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 303及SEQ ID NO: 307；及輕鏈可變區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 195；或b)重鏈可變區，其包含胺基酸序列或SEQ ID NO: 299或SEQ ID NO: 311；及輕鏈可變區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 205；或c)重鏈可變區，其包含胺基酸序列或SEQ ID NO: 197；及輕鏈可變區，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 293。在一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 259之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 195之輕鏈可變區。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 263之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 195之輕鏈可變區。在一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 307之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 305之輕鏈可變區。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 267之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 265之輕鏈可變區。在又一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 299之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 205之輕鏈可變區。在一特定實施例中，上述實施例中任一者之抗體另外包含免疫球蛋白之Fc區或等效於該Fc區之區域。
在一個實施例中，本發明抗體包含Fc區、尤其IgG Fc區、最特定而言IgG1 Fc區。
在一特定實施例中，本發明抗體係全長抗體、尤其IgG類抗體、最特定而言IgG1同種型抗體。在另一實施例中，本發明抗體係選自以下之群之抗體片段：scFv片段、Fv片段、Fab片段及F(ab')2片段。在又一實施例中，本發明抗體係具有Fc區之抗體片段或包含等效於免疫球蛋白之Fc區之區域之融合蛋白。在一個實施例中，本發明抗體係單株抗體。
在一個實施例中，本發明抗體係嵌合抗體、更具體而言人類化抗體。在一特定實施例中，本發明抗體係人類抗體。在另一實施例中，本發明抗體包含人類恆定區。在一個實施例中，本發明抗體包含人類Fc區、尤其人類IgG Fc區、最特定而言人類IgG1 Fc區。
在一個實施例中，本發明抗體包含重鏈恆定區，其中該重鏈恆定區係人類IgG恆定區、尤其人類IgG1恆定區，包含Fc區。在一具體實施例中，抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 313之重鏈恆定區。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 315之輕鏈恆定區。在再一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 313之重鏈恆定區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 315之輕鏈恆定區。
在一特定實施例中，本發明提供特異性結合FAP之抗體，其中該抗體包含a)重鏈可變區，其包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；或輕鏈可變區，其包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309；或其組合；及b)免疫球蛋白之Fc區或等效於該Fc區之區域。
在一個實施例中，本發明抗體包含Fc區，其中該Fc區係經糖改造Fc區。在又一實施例中，本發明抗體經糖改造以在Fc區中具有經修飾寡糖。在一具體實施例中，該抗體與非糖改造抗體相比在Fc區中具有提高比例之二等分型寡糖。在一更具體實施例中，抗體之Fc區中N-連接寡糖之至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%、較佳至少約50%、更佳至少約70%係二等分型寡糖。二等分型寡糖可為雜合型或複雜型。
在另一具體實施例中，本發明抗體與非糖改造抗體相比在Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖。在一更具體實施例中，抗體之Fc區中N-連接寡糖之至少約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%、較佳至少約50%、更佳至少約70%未經岩藻糖基化。非岩藻糖基化寡糖可為雜合型或複雜型。
在一特定實施例中，本發明抗體與非糖改造抗體相比在Fc區中具有提高比例之二等分型非岩藻糖基化寡糖。具體而言，抗體包含Fc區，其中N連接寡糖之至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%、較佳至少約15%、更佳至少約25%、至少約35%或至少約50%係二等分型非岩藻糖基化寡糖。二等分型非岩藻糖基化寡糖可為雜合型或複雜型。
在一個實施例中，本發明抗體具有增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合親和力。增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合可源自(例如)對抗體之糖改造及/或親和力成熟。在一個實施例中，增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合源自對抗體之Fc區之糖改造。在另一實施例中，增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合源自增強之親和力與糖改造之組合。增強之效應子功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：增強之Fc介導細胞毒性(包括增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞因子分泌，增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合、增強之與單核細胞之結合、增強之與多形核細胞之結合、增強之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、增強之靶結合抗體之交聯、增強之樹突細胞成熟或增強之T細胞啟動。在一特定實施例中，增強之效應子功能係增強之ADCC。增強之Fc受體結合較佳係與活化Fc受體、最佳FcγRIIIa之增強之結合。
在一個實施例中，本發明抗體在以治療有效量投與個體時不會引起臨床顯著程度之毒性。
在一個實施例中，本發明抗體係親和力成熟的。在又一實施例中，本發明抗體以低於約1 μM至約0.001 nM之解離常數(KD)值、尤其低於約100 nM、低於約10 nM、低於約1 nM或低於約0.1 nM之KD值結合纖維母細胞活化蛋白。在一個實施例中，本發明抗體結合人類、小鼠及食蟹猴FAP。在一個實施例中，本發明抗體結合人類及食蟹猴FAP。在一更具體實施例中，本發明抗體以低於約200 nM、低於約100 nM、更特定而言低於約10 nM或低於約1 nM、最特定而言低於0.1 nM之KD值結合人類、小鼠及食蟹猴FAP。KD值係藉由表面電漿共振使用呈Fab或IgG形式、尤其呈IgG形式之抗體來測定。
在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體結合人類組織中之FAP。在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體對人類及鼠類FAP具有交叉反應性。在另一實施例中，本發明抗體與二肽基肽酶IV家族之其他成員、尤其與DPPIV/CD26無實質交叉反應性。在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體在與細胞表面上表現之FAP結合後不會誘導FAP之內化。
在一特定實施例中，本發明提供特異性結合FAP之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；輕鏈可變區，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309；及人類IgGFc區，且其中視情況該抗體經糖改造以具有增強之效應子功能及/或Fc受體結合親和力。在另一特定實施例中，本發明提供特異性結合FAP之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；輕鏈可變區，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309；及人類IgG Fc區，且其中該抗體在該Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖及/或提高比例之二等分型寡糖。
在一個態樣中，本發明提供特異性結合FAP之抗體，其中該抗體源自親代抗體，該親代抗體包含重鏈CDR1 SEQ ID NO: 3、重鏈CDR2 SEQ ID NO: 35、選自以下之群之重鏈CDR3：SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 139及SEQ ID NO: 141；輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 145、輕鏈CDR2 SEQ ID NO: 153及選自以下之群之輕鏈CDR3：SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 173及SEQ ID NO: 175，且其中該抗體包含至少一個在親代抗體之至少一個重鏈或輕鏈CDR中之胺基酸取代或缺失。舉例而言，抗體可包含在親代抗體之一或多個超變區或CDR(即，1個、2個、3個、4個、5個或6個超變區或CDR)內之至少一個(例如約1至約10個，即，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)且尤其約2至約5個取代。在某些實施例中，上文所提供親代抗體之任一或多個胺基酸在以下CDR位置處經取代或缺失：
-　重鏈CDR1(SEQ ID NO: 3)：位置2及3
-　重鏈CDR2(SEQ ID NO: 35):位置1、3、4、5、6、7、8及9
-　輕鏈CDR1(SEQ ID NO: 145)：位置7、8及9
-　輕鏈CDR2(SEQ ID NO: 153)：位置1、2、3、4及5
-輕鏈CDR3(SEQ ID NO 165、167、169、171、173或175)：位置4、5、6及7
在某些實施例中，本文所提供之取代係保守取代。在某些實施例中，以下取代或缺失中之任一或多者可以任一組合作出：
-　重鏈CDR1(SEQ ID NO: 3)：Y2F、H或S、A3T
-　重鏈CDR2(SEQ ID NO: 35)：A1G、S3G、I、W或L、G4V、S、A或T、S5G或N、G6T或A、G7R、S、A、E或N、S8Y、L、R、I、N、Q、I或缺失、T9缺失
-　輕鏈CDR1(SEQ ID NO: 145)：S7T、S8R或S9 N
-　輕鏈CDR2(SEQ ID NO: 153)：Y1N、I或Q、G2V、A3G、S4T或Y、S5R、T或I
-　輕鏈CDR3(SEQ ID NO 165、167、169、171、173或175)：G4A、Q、N、L或H5I、L、V、Q、N或I6M、I7L
另外，該抗體與親代抗體相比亦可包含在重鏈或輕鏈之一或多個框架區內之一或多個添加、缺失及/或取代。在一個實施例中，該在至少一個CDR中之至少一個胺基酸取代導致該抗體與其親代抗體相比增強之結合親和力。在另一實施例中，該抗體對FAP之親和力為親代抗體之至少約2倍至約10倍(在比較本發明抗體與呈相同形式(例如Fab形式)之親代抗體時)。此外，源自親代抗體之抗體可單獨或組合納入與本發明抗體有關之先前段落中所述特徵中之任一者。
本發明亦提供編碼特異性結合FAP之抗體的多核苷酸。在一個態樣中，本發明係關於經分離多核苷酸，其編碼形成上文所述本發明之抗-FAP抗體之一部分的多肽。在一個實施例中，經分離多核苷酸編碼形成上文所述本發明之抗-FAP抗體之一部分的抗體重鏈及/或抗體輕鏈。
在一個實施例中，本發明係關於經分離多核苷酸，其包含編碼一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個或6個)以下中所述重鏈或輕鏈互補決定區(CDR)之序列：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177，或其至少含有該CDR之特異性決定殘基(SDR)之變體或截短形式。在另一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之3個重鏈CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)或3個輕鏈CDR(例如LCDR1、LCDR2及LCDR3)的序列：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177，或其至少含有該3個互補決定區中每一者之SDR之變體或截短形式。在再一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之3個重鏈CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)及3個輕鏈CDR(例如LCDR1、LCDR2及LCDR3)的序列：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175及177。在一特定實施例中，編碼一或多個CDR之多核苷酸包含與以下中所示CDR核苷酸序列中之一或多者至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列：SEQ ID NO 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191及192。
在又一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之群之重鏈可變區之序列：ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及/或編碼選自以下之群之輕鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及ID NO: 309。在一特定實施例中，編碼重鏈及/或輕鏈可變區之多核苷酸包含選自以下中呈現之可變區核苷酸序列之群之序列：SEQ ID NO 194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310及312、或其組合。
在一具體實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之群之重鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及編碼重鏈恆定區、尤其人類重鏈恆定區之序列。在一特定實施例中，該重鏈恆定區係人類IgG重鏈恆定區、特定而言人類IgG1重鏈恆定區，包含Fc區。在一具體實施例中，該重鏈恆定區包含序列SEQ ID NO: 313。在另一具體實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之群之輕鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309；及編碼輕鏈恆定區、尤其人類輕鏈恆定區之序列。在一具體實施例中，該輕鏈恆定區包含序列SEQ ID NO: 315。
在一個實施例中，本發明係關於組合物，其包含第一經分離多核苷酸，該第一經分離多核苷酸編碼包含與選自由以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 307及SEQ ID NO: 311；及第二經分離多核苷酸，其編碼包含與選自由以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 305及SEQ ID NO: 309。
在一個實施例中，本發明係關於組合物，其包含第一經分離多核苷酸，該第一經分離多核苷酸包含與選自由以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列：SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 244、SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO: 256、SEQ ID NO: 260、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 272、SEQ ID NO: 276、SEQ ID NO: 280、SEQ ID NO: 284、SEQ ID NO: 288、SEQ ID NO: 292、SEQ ID NO: 296、SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 304、SEQ ID NO: 308、and SEQ ID NO: 312；及第二經分離多核苷酸，其包含與選自由以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列：SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 246、SEQ ID NO: 250、SEQ ID NO: 254、SEQ ID NO: 258、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 274、SEQ ID NO: 278、SEQ ID NO: 282、SEQ ID NO: 286、SEQ ID NO: 290、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 298、SEQ ID NO: 302、SEQ ID NO: 306及SEQ ID NO: 310。
在又一態樣中，本發明亦係關於由上文所述本發明多核苷酸中任一者編碼之經分離多肽。
在又一態樣中，上文實施例中任一者之抗-FAP抗體可單獨或組合納入如下文在部分1-6中所述特徵中之任一者：
1.　抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(KD)。較佳地，本文所提供抗體以如藉由表面電漿共振(SPR)所測定低於1 nM之KD值結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)、尤其人類FAP。
根據一個實施例，使用表面電漿共振來量測KD。可在25℃下使用(例如)-T100機器(GE Healthcare)來實施此一分析，其中CM5晶片用於抗原固定。簡言之，根據供應商說明書使用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare.)。用10 mM乙酸鈉(pH 5)將抗-His抗體(五His，Qiagen)稀釋至40 μg/ml，然後以10 μl/分鐘之流速注射以達成約9000個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗-His抗體後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。隨後，以10 μl/min且以10 nM經20 sec(對於用Fab片段進行之量測而言)或以20 nM經25 s(對於用IgG抗體進行之量測而言)注射加His-標籤之抗原並經由其His標籤由經固定抗-His抗體捕獲。適宜FAP抗原構建體之蛋白質及DNA序列展示於SEQ ID NO 317-322中。對於動力學量測而言，在25℃下以90 μl/min之流速將抗體系列稀釋液(對於Fab片段，2倍稀釋液，介於6.25 nM至200 nM範圍內；或對於IgG，5倍稀釋液，介於3.2 pM至10 nM範圍)注射於10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(pH 7.4)中。應用以下參數：締合時間180 s，解離300 s(對於Fab而言)或900 s(對於IgG而言)，在每一循環之間用10 mM甘胺酸(pH 2)再生60 s。使用簡單一對一Langmuir結合模型( T100評估軟體)藉由同時擬合締合感測圖與解離感測圖來計算締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。以比率k解離/k締合之形式來計算平衡解離常數(KD)。例如，參見Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)。
2.　抗體片段
在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段、及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134(2003)；或Carter,Nat. Rev. Immunol. 6:343-357(2006)。
單鏈Fv或scFv片段包含VH結構域及VL結構域作為單一多肽鏈。通常，VH及VL結構域由連接體序列接合。關於scFv片段之綜述，例如，參見Plckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185、及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙特異性抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134(2003)中。
微抗體係二價同源二聚體scFv衍生物，其含有免疫球蛋白、較佳IgG、更佳IgG1之恆定區、通常CH3區作為二聚體化區。通常，恆定區經由鉸鏈區及/或連接體區連結至scFv。微抗體蛋白之實例可參見Hu等人，Cancer Res. 56: 3055-61(1996)。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製備抗體片段，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)來產生，如本文所述。
3.　嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號、及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855(1984))中。在一實例中，嵌合抗體包括非人類可變區域(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區域)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以減小對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人類抗體，且FR(或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。人類化可藉由各種方法來達成，包括(但不限於)(a)將整個非人類可變結構域移植至人類恆定區上以產生嵌合抗體，(b)僅將非人類(例如，供體抗體)CDR移植至人類(例如，接受者抗體)框架區及恆定區上，且保留或不保留關鍵框架殘基(例如彼等對保留良好抗原結合親和力或抗體功能至關重要之殘基)；(c)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；抗體-抗原相互作用之關鍵殘基)移植至人類框架區及恆定區上；或(d)移植整個非人類可變結構域，但藉由替代表面殘基來用類人部分將其「覆蓋」。人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv. Immunol. 44:65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec. Immun. 31(3):169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498(1991)(闡述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人、Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer 83:252-260(2000)(闡述FR改組之「導向選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見，Sims等人，J. Immunol. 151:2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見，Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285(1992)；及Presta等人，J. Immunol.,151:2623(1993))；人類成熟(經體突變)框架區或人類種係框架區(例如，參見，Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633(2008))；及自篩選FR文庫獲得之框架區(例如，參見，Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996))。
4.　人類抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74(2001)及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459(2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生具有響應抗原性激發之人類可變區域的完整人類抗體或完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座可替代內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125(2005)。例如，亦可參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區進行組合來修飾來自由該等動物產生之完整抗體的人類可變區域。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J. Immunol.,133: 3001(1984)；Brodeur等人，單株抗體Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J. Immunol.,147: 86(1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於以下文獻中：Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology 20(3):927-937(2005)；及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91(2005)。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。然後，此等可變結構域序列可與期望人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5.　源自文庫之抗體
可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自此等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。此等方法可例如，參見Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人，編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628(1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)來單獨選殖VH及VL譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，然後可篩選結合抗原之噬菌體，如Winter等人，Ann. Rev. Immunol.,12: 433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示抗體片段，該抗體片段呈單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段。來自免疫化來源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需構建雜交瘤。另一選擇為，可選殖天然譜(例如，自人類)以向各種無任何免疫之非自體抗原以及自體抗原提供單一來源之抗體，如由Griffiths等人，EMBO J,12: 725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高度可變CDR3區域並在活體外進行重排，如由Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol.,227: 381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號、及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段可視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。
6 . 　 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係關於FAP且另一者係關於任一其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合FAP之兩種不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑局域化至表現FAP之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537(1983))、WO 93/08829、及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655(1991))、及「隆凸與孔洞(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004 A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號、及Brennan等人，Science 229: 81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見，Kostelny等人，J. Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如，參見，Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J. Immunol. 152:5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J. Immunol. 147:60(1991)中所述。
本文亦包括經構建以具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體(包含「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576 A1)。
本文之抗體或片段亦包括含有結合FAP以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之FAb」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。
7.　抗體變體
在某些實施例中，本發明涵蓋本文提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體係藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失、及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構建體，前提為最終構建體應具有期望特性，例如抗原結合性。
a)　取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。
胺基酸取代可產生用具有相似結構及/或化學性質之另一胺基酸替代一種胺基酸，例如保守胺基酸替代。「保守」胺基酸取代可基於所涉及殘基在以下方面中之相似性來進行：極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性特性。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。保守取代展示於表2中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表2中之「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步所述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保持/改良抗原結合、降低免疫原性或改良ADCC或CDC。
可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組：
(1)疏水性殘基：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性殘基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性殘基：Asp、Glu；
(4)鹼性殘基：His、Lys、Arg；
(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
(6)芳族殘基：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將該等類別之一的成員調換成另一類別。舉例而言，胺基酸取代亦可產生用具有不同結構及/或化學性質之另一胺基酸代替一種胺基酸，例如用來自不同基團(例如，鹼性基團)之另一胺基酸代替來自一種基團(例如，極性基團)之胺基酸。可藉由使用重組DNA技術在多肽分子中系統性進行胺基酸插入、缺失或取代並分析所得重組變體之活性以實驗方式來確定允許之變化。
一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區域殘基。通常，所得選擇用於進一步研究之變體相對於親代抗體在某些生物性質(例如，增強之親和力、經減小免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保持親代抗體之某些生物性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地使用(例如)基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所述者)產生。簡言之，一或多個HVR殘基發生突變且變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物活性(例如結合親和力)。
可對HVR作出改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。此等改變可在HVR「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間發生高頻突變之密碼子編碼的殘基)(例如，參見，Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196(2008))、及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構建及重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Mo1ecukar Biokogy 178:1-37(O'　Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。然後建立二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特定鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要此等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)可發生於HVR中。此等改變可在HVR「熱點」或SDR外側。在上文所提供變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基組(例如，帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，並由中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。另一選擇為或另外，分析抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間之接觸點可能有益。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選殘基或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包含胺基-及/或羧基末端融合(長度介於一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽之間)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包含酶(例如用於ADEPT者)或可延長抗體血清半衰期之多肽與抗體N-末端或C末端之融合體。
b)　糖基化變體
在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一個態樣中，本發明提供具有增強之效應子功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之抗-FAP抗體之糖型。抗體之糖基化改造先前已有闡述。例如，參見美國專利第6,602,684號，其以全文引用方式併入本文中。自具有參與糖基化之基因之經改變活性之宿主細胞產生抗-FAP抗體的方法亦詳細闡述於本文中(例如，參見下文標題為「重組方法及組合物」之部分)。
IgG分子在其Fc區中載有兩個N-連接寡糖，其中每一重鏈上有一個。就任一糖基化而言，抗體以共用相同多肽骨架但具有附接至糖基化位點之不同寡糖之一群糖型形式產生。通常見於血清IgG之Fc區中之寡糖屬於複雜雙觸角類型(Wormald等人，Biochemistry 36:130-38(1997))，其具有低含量之末端唾液酸及二等分型N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)以及可變程度之末端半乳糖基化及核心岩藻糖基化(附接至「主幹」雙觸角寡糖結構中之GlcNAc殘基之岩藻糖)。一些研究表明，FcγR結合所需之最少碳水化合物結構位於寡糖核心內。Lund等人，J. Immunol. 157:4963-69(1996)。
產生抗體之工業及學術研究中使用之小鼠或倉鼠源細胞系通常將所需寡糖決定子附接至Fc位點上。然而，該等細胞系中表現之IgG缺乏少量見於血清IgG中之二等分型GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318:813-22(1995)。在N-連接糖基化途徑中，藉由GnTIII添加二等分型GlcNAc。Schachter,Biochem. Cell Biol. 64:163-81(1986)。
Umaa等人使用單個產生抗體之CHO細胞系，其先前經改造而以外部調節方式表現不同程度之選殖GnTIII酶基因(Umaa,P.等人，Nature Biotechnol. 17:176-180(1999))。此方法首次確認了糖基轉移酶(例如，GnTIII)之表現與經修飾抗體之ADCC活性之間的嚴格相關性。因此，本發明涵蓋抗-FAP抗體，其包含具有經改變糖基化之Fc區或等效於該Fc區的區域，經改變糖基化源自改變糖基轉移酶基因在產生抗體之宿主細胞中之表現程度。在一具體實施例中，基因表現程度變化係GnTIII活性提高。增強之GnTIII活性使抗體之Fc區中二等分型寡糖之百分比提高以及岩藻糖基化寡糖之百分比降低。此抗體或其片段具有增強之Fc受體結合親和力及增強之效應子功能。
提供具有二等分型寡糖之抗體，例如，其中附接至抗體Fc區之雙觸角寡糖由GlcNAc二等分。此等抗體變體可具有經減小岩藻糖基化及/或經改良ADCC功能。此等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umaa等人)及US 2005/0123546(Umaa等人)中。
在一個實施例中，本發明之抗-FAP抗體因藉由本發明方法對其寡糖之修飾而在Fc區中具有提高比例之二等分型寡糖。在一個實施例中，二等分型N-連接寡糖在本發明之抗-FAP抗體之Fc區中之百分比係總寡糖的至少約10%至約100%、具體而言至少約50%、更具體而言至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90-95%。二等分型寡糖可為雜合型或複雜型。
在另一實施例中，本發明之抗-FAP抗體因藉由本發明方法對其寡糖之修飾而在Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖。在一個實施例中，非岩藻糖基化寡糖之百分比係至少約20%至約100%、具體而言至少約50%、至少約60%至約70%且更具體而言至少約75%。非岩藻糖基化寡糖可屬於雜合型或複雜型。
岩藻糖之量係藉由計算岩藻糖在Asn 297處糖鏈內相對於所有附接至Asn 297之糖基結構(例如複雜結構、雜合結構及高甘露糖結構)之總和之平均量來確定，如藉由MALDI-TOF質譜所量測，如例如WO 2008/077546中所述。Asn 297係指大致位於Fc區中之297位(Fc區殘基之EU編號)之天冬醯胺殘基；然而，Asn 297亦可因抗體中之微小序列變化大致位於297位上游或下游±3個胺基酸處，即介於294位與300位之間。岩藻糖之相對量係含岩藻糖結構相對於所有藉由MALDI-TOF MS在N-糖苷酶F處理試樣中鑑別之糖基結構(例如複雜結構、雜合結構及高甘露糖結構)之百分比。此等岩藻糖基化變體可具有經改良ADCC功能。
可用於本發明之抗-FAP抗體之糖改造方法已更詳細地闡述於以下專利中：美國專利第6,602,684號、美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號、美國專利申請公開案第2003/0175884 A1號、美國臨時專利申請案第60/441,307號及WO 2004/065540，該等專利中每一者之全部內容皆係全文以引用方式併入本文中。或者，本發明之抗-FAP抗體可根據以下文獻中所揭示之技術進行糖改造以在Fc區具有減少之岩藻糖殘基：美國專利申請公開案第2003/0157108號(Genentech)或EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號；Niwa等人，J Immunol Methods 306,151/160(2006)；美國專利第6,946,292號(Kyowa)。本發明之經糖改造抗-FAP抗體亦可在產生經修飾糖蛋白之表現系統中產生，例如彼等以下專利中所教示者：美國專利申請公開案第60/344,169號及WO 03/056914(GlycoFi公司)或WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)。
與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺陷」抗體變體有關之出版物的其他實施例包括：WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2002/0164328；US 2004/0109865；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336: 1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包含缺少蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其在實例11中)、及基因剔除細胞系(例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞)(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol. Bioeng.,94(4): 680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
在一特定實施例中，本發明之抗-FAP抗體在Fc區中具有提高比例之二等分型非岩藻糖基化寡糖。二等分型非岩藻糖基化寡糖可為雜合型或複雜型。具體而言，本發明方法可用於產生抗-FAP抗體，其中抗原結合分子之Fc區中寡糖之至少約10%至約100%、具體而言至少約15%、更具體而言至少約20%至約25%且更具體而言至少約30%至約35%係二等分型非岩藻糖基化寡糖。本發明之抗-FAP抗體亦可包含Fc區，其中抗體之Fc區中寡糖之至少約10%至約100%、具體而言至少約15%、更具體而言至少約20%至約25%且更具體而言至少約30%至約35%係二等分雜合體非岩藻糖基化寡糖。
在某些實施例中，改變本文所提供抗體以增加或降低抗體發生糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個糖基化位點來便利地達成抗體糖基化位點的添加或缺失。
亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此等抗體變體可具有經改良CDC功能。此等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
亦可藉由(例如)以下方式增強抗原結合分子對FAP之親和力來提高本發明抗-FAP抗體之ADCC或其他效應子功能：親和力成熟或改良親和力之其他方法(參見Tang等人，J. Immunol. 2007,179:2815-2823)或如下文所述在Fc區中進行胺基酸修飾。本發明亦涵蓋該等方法之組合。
c)　Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些(但非全部)效應子功能之抗體變體，此情況使其成為許多應用之合意的候選物，在該等應用中抗體之活體內半衰期較為重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)體係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來證實CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)之第464頁表3中對FcR於造血細胞中之表現進行了總結。用於評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987))中。另一選擇為，可使用非放射性方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)、及CytoTox 非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於此等分析之有用效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內(例如，在諸如Clynes等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中所揭示之動物模型中)對所關注分子之ADCC活性進行評價。亦可實施C1q結合分析來證實抗體不能與C1q結合且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769(2006))。
具有降低效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩個或更多個處經取代之Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述與FcR具有改良或減小之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312、及Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)。
在一些實施例中，Fc區有所改變，從而改變(亦即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642、及Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)中所述。
具有經延長半衰期及與新生Fc受體(FcRn)(其負責將母體IgG轉移至胎中)(Guyer等人，J. Immunol. 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994))之改良結合的抗體闡述於US 2005/0014934 A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變體包括彼等在下列Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變體之其他實例亦可參見美國專利申請案第60/439,498號、第60/456,041號、第60/514,549號或WO 2004/063351(結合親和力因胺基酸修飾而增強之變體Fc區)；或美國專利申請案第10/672,280號或WO 2004/099249(與FcγR之結合因胺基酸修飾而改變之Fc變體)；Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988)；美國專利第5,648,260號、美國專利第5,624,821號及WO 94/29351。
d)　半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可能期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基出現於抗體之可及位點處。藉由使用半胱胺酸取代該等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生抗體偶聯物，如本文進一步所述。在某些實施例中，下列殘基中之任一個或多個可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)　抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生化所用聚合物之數量及/或類型可根據包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：擬改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體及非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其不危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺滅的溫度。
B.　重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一個實施例中，提供本文所述之編碼抗-FAP抗體之經分離多核苷酸。此多核苷酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包含此多核苷酸之載體(例如，選殖載體或表現載體)。在又一實施例中，提供包含此多核苷酸或此載體之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包含如下多核苷酸之載體：其編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，多順反子載體)，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之多核苷酸的第一載體、及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之多核苷酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞、尤其哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗-FAP抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包含編碼如上文所提供抗體之多核苷酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於抗-FAP抗體之重組產生而言，將一或多個編碼抗體之多核苷酸(例如，如上文所述)分離並插入一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。為彼等熟習此項技術者熟知之方法可用於構建含有抗-FAP抗體之編碼序列以及合適轉錄/轉譯控制信號之表現載體。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。例如，參見闡述於以下文獻中之技術：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中。
在一個實施例中，一個或若干編碼抗-FAP抗體之多核苷酸可在組成型啟動子或另一選擇為調節表現系統控制下表現。適宜調節表現系統包括(但不限於)四環素調節表現系統、蛻皮激素誘導型表現系統、乳糖切換表現系統(lac-switch expression system)、糖皮質激素誘導型表現系統、溫度誘導型啟動子系統及金屬硫蛋白金屬誘導型表現系統。若在宿主細胞系統內包含若干不同的編碼本發明抗體之多核苷酸，則其中一些可在組成型啟動子控制下表現，而其他在調節啟動子控制下表現。
用於選殖或表現編碼抗體之載體的適宜宿主細胞包括本文所述的原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，例如，參見美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C. Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，抗體可自細菌細胞漿液以可溶部分形式分離且可經進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦適於用於編碼抗體之載體之選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」從而產生部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat. Biotech. 22:1409-1414(2004)、及Li等人，Nat. Biotech. 24:210-215(2006)。此等表現系統亦教示於美國專利申請案第60/344,169號及WO 03/056914(用於在非人類真核宿主細胞中產生人類樣糖蛋白之方法)中。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用之許多杆狀病毒菌株，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述產生轉基因植物中之抗體之PLANIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(293或293T細胞，如(例如)Graham等人，J. Gen Virol. 36:59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(HepG2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如，參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C. Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
穩定表現一般優於瞬時表現，此乃因其通常可達成重現性更高之結果且亦更適於大規模生產；然而，確定瞬時表現是否更適於特定情形係在熟習此項技術者之技術範圍內。
本發明進一步係關於修飾由宿主細胞產生之本發明抗-FAP抗體之糖基化特徵的方法，其包含在該宿主細胞中表現一或多個編碼抗-FAP抗體之多核苷酸及一或多個編碼具有糖基轉移酶活性之多肽的多核苷酸、或包含此等多核苷酸之載體。通常，任一類型之培養細胞系(包括上述細胞系)皆可用於生成用以產生具有經改變糖基化模式之抗-FAP抗體細胞系。較佳細胞系包括CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞及其他哺乳動物細胞。具有糖基轉移酶活性之多肽包括β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、β(1,4)-半乳糖基轉移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶I(GnTI)及β(1,2)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶II(GnTII)。在一個實施例中，在宿主細胞中表現編碼具有糖基轉移酶活性之多核苷酸之多核苷酸之組合(例如，GnTIII及Man II)。同樣，該方法亦涵蓋在已斷裂或以其他方式不活化糖基轉移酶基因之宿主細胞(例如，已剔除編碼α1,6核心岩藻糖基轉移酶之基因之活性的宿主細胞)中表現一或多個編碼抗-FAP抗體之多核苷酸。在一特定實施例中，本發明之抗-FAP抗體可在進一步表現編碼具有GnTIII活性之多肽的多核苷酸的宿主細胞中產生以修飾該等抗體之糖基化模式。在一具體實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域的融合多肽。在另一特定實施例中，本發明抗-FAP抗體在表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸的宿主細胞中之表現產生具有增強之Fc受體結合親和力及/或增強之效應子功能之抗-FAP抗體。因此，在一個實施例中，本發明係關於宿主細胞，其包含(a)一或多個包含編碼具有GnTIII活性之多肽之序列的經分離多核苷酸；及(b)一或多個編碼本發明抗-FAP抗體之經分離多核苷酸。在一特定實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域及異源性高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域的融合多肽。特定而言，該高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II之高爾基體定位結構域。用於產生此等融合多肽及使用其產生效應子功能增強之抗體的方法揭示於WO 2004/065540、美國臨時專利公開案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號中，該等案件之全部內容皆明確地以引用方式併入本文中。在另一實施例中，宿主細胞另外包含經分離多核苷酸，該經分離多核苷酸包含編碼具有甘露糖苷酶II(ManII)活性之多肽之序列。編碼多肽之多核苷酸(如編碼抗-FAP抗體之多核苷酸)可在組成型啟動子或者調節型表現系統之控制下表現。此等系統為業內所熟知，且包括上文所述系統。
宿主細胞含有抗-FAP抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶活性之多肽之編碼序列，且表現生物活性基因產物，該等宿主細胞可藉由(例如)以下方式來鑑別：DNA-DNA或DNA-RNA雜交；存在或不存在「標記物」基因功能；評價轉錄程度，如藉由相應mRNA轉錄物在宿主細胞中之表現所量測；或檢測基因產物，如藉由免疫分析或藉由其為業內所熟知之生物活性方法所量測。GnTIII或Man II活性可藉由(例如)採用分別結合GnTIII或Man II之生物合成產物的凝集素來檢測。此一凝集素之實例係優先結合含有二等分型GlcNAc之寡糖的E4-PHA凝集素。具有GnTIII或Man II活性之多肽之生物合成產物(即特定寡糖結構)亦可藉由對自表現該等多肽之細胞所產生糖蛋白釋放的寡糖實施質譜分析來檢測。另一選擇為，可使用量測由細胞所產生抗體介導之增強之Fc受體結合或增強之效應子功能的功能分析，該等細胞經改造具有編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸。
本發明亦係關於產生具有經修飾寡糖之抗-FAP抗體之方法，其包含(a)在允許產生本發明抗-FAP抗體之條件下培養宿主細胞，該等宿主細胞經改造以表現至少一個編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之多核苷酸，其中該具有糖基轉移酶活性之多肽以足以修飾由該宿主細胞產生之該抗-FAP抗體之Fc區中之寡糖的量表現；及(b)分離該抗-FAP抗體。在一個實施例中，具有糖基轉移酶活性之多肽係GnTIII。在另一實施例中，存在兩種具有糖基轉移酶活性之多肽。在一特定實施例中，該兩種具有糖基轉移酶活性之肽係GnTIII及Man II。在另一實施例中，具有糖基轉移酶活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域之融合多肽。在一更具體實施例中，融合多肽進一步包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域。特定而言，高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位結構域、最特定而言甘露糖苷酶II之定位結構域。另一選擇為，高爾基體定位結構域選自由以下組成之群：甘露糖苷酶I之定位結構域、GnTII之定位結構域及α1,6核心岩藻糖基轉移酶之定位結構域。
在一特定實施例中，由上述宿主細胞或方法產生之經修飾抗-FAP抗體具有IgG恆定區或其包含Fc區之片段。在另一特定實施例中，抗-FAP抗體係人類化或人類抗體或其包含Fc區之片段。
由上述宿主細胞或方法所產生具有經改變糖基化之抗-FAP抗體因對宿主細胞之修飾(例如，藉由表現糖基轉移酶基因)而通常展示增強之Fc受體結合親和力及/或增強之效應子功能。較佳地，增強之Fc受體結合親和力係增強之與活化Fcγ受體、最佳FcγRIIIa受體之結合。增強之效應子功能較佳係以下中一或多者之增強：增強之抗體依賴性細胞毒性、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞因子分泌、增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、增強之Fc介導之細胞毒性、增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合，增強之與多形核細胞(PMNC)之結合、增強之與單核細胞之結合、增強之靶結合抗體之交聯、增強之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、增強之樹突細胞成熟及增強之T細胞啟動。
C.　分析
可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗-FAP抗體、篩選、或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
1.　結合分析及其他分析
在一個態樣中，舉例而言，藉由已知方法(例如ELISA、西方墨點(Western blot)等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與另一具體抗-FAP抗體競爭與FAP結合之抗體。在某些實施例中，此一競爭性抗體與由該另一具體抗-FAP抗體結合之相同表位(例如，線性或構形表位)結合。對抗體所結合表位作圖之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在實例性競爭分析中，在包含結合FAP之第一標記抗體(例如實例中所述3F2抗體)及第二未標記抗體之溶液中培育固定FAP，其中測試該第二未標記抗體與該第一抗體競爭結合FAP之能力。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定FAP。在允許第一抗體與FAP結合之條件下培育後，去除過量未結合抗體，並量測與固定FAP締合之標記的量。若與固定FAP締合之標記之量在測試試樣中相對於對照試樣實質上有所減小，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合FAP。參見Harlow及Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.　活性分析
在一個態樣中，提供分析以鑑別其具有生物活性之抗-FAP抗體。生物活性可包括(例如)靶向細胞之溶解、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或細胞凋亡之誘導。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。測試ADCC之實例性分析闡述於上文(參見「定義」：「具有增強之ADCC之抗體」)及實例11中。用於檢測細胞溶解(例如藉由量測LDH釋放)或細胞凋亡(例如使用TUNEL分析)之分析為業內所熟知。量測ADCC或CDC之分析亦闡述於WO 2004/065540(參見其中之實例1)中，其全部內容以引用方式併入本文中。
D.　抗體偶聯物
本發明亦提供包含偶聯至一或多種細胞毒性劑之本發明抗-FAP抗體的偶聯物，該等細胞毒性劑係(例如)化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌之酶促活性毒素、真菌、植物、或動物來源或其片段)或放射性同位素。
在個一實施例中，在抗體-藥物偶聯物(ADC)中，抗體偶聯至一或多種藥物，包括(但不限於)類美坦素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0425235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號、及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res. 53:3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res. 58:2925-2928(1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med. Chem. 13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj. Chem. 16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J. Med. Chem. 45:4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤；長春地辛；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)、紫杉醇、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，抗體偶聯物包含與酶促活性毒素或其片段偶聯之本文所述抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，抗體偶聯物包含偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物的本文所述抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當偶聯物用於檢測時，其可包含用於閃爍法研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238: 1098(1987)中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體的實例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接體可為促進細胞毒性藥物在細胞內釋放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含二硫化物連接體(Chari等人，Cancer Res. 52:127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之抗體偶聯物明確地涵蓋(但不限於)使用包括(但不限於)以下交聯體試劑製備之此等偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB、以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如，可購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
E.　診斷及檢測用方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供抗-FAP抗體中之任一者皆可用於檢測生物試樣中FAP之存在。本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物試樣包含細胞或組織，例如來自以下器官之細胞或組織：腦、乳腺、結腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮膚、小腸、胃或子宮，亦包括該等器官之細胞或組織腫瘤。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-FAP抗體。在又一態樣中，提供檢測生物試樣中FAP之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物試樣視情況與對照試樣、與本文所述抗-FAP抗體在允許抗-FAP抗體與FAP結合之條件下接觸，及檢測在抗-FAP抗體與FAP之間是否形成複合體。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗-FAP抗體來選擇適用於使用抗-FAP抗體之療法的個體，舉例而言，其中FAP係用於選擇患者之生物標記物。
可使用本發明抗體診斷之實例性病症包括與FAP表現相關之病症，例如癌症及某些發炎性病況。
在一個態樣中，提供診斷個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之診斷劑，其中該診斷劑包含本文所述抗-FAP抗體及標記(通常為成像劑)，該標記允許檢測該診斷劑與FAP之複合體。
在某些實施例中，提供經標記之抗-FAP抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶、或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基、及諸如此類。
F.　醫藥調配物
本文所述抗-FAP抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之此抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(,Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種其他醣胺多醣酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中者，後一些調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳為彼等具有相互間不會產生不利影響之補充活性者。舉例而言，若擬治療疾病係癌症，則可能期望進一步提供一或多種抗癌劑，例如化學治療劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞凋亡活化劑。此等活性成份適宜以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。
活性成份亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或介面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之固態疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件形式，例如，膜或微膠囊。
擬用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)使用無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。
本文所述分子可呈多種劑型，其包括(但不限於)液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合物微膠囊或微泡、脂質體及可注射或可輸注溶液。較佳形式取決於投與模式及治療應用，但通常可為可注射或可輸注溶液。
G.　治療方法及組合物
在治療方法中可使用本文所提供抗-FAP抗體或包含本文所提供抗-FAP抗體之醫藥調配物中之任一者。
本文所提供抗-FAP抗體可用於治療與相同細胞類型之正常組織相比特徵在於以下之疾病：FAP表現、尤其異常FAP表現(例如細胞中之過表現或以不同模式之表現)。與相同細胞類型之非腫瘤組織相比，FAP在許多人類腫瘤異常表現(例如過表現)。因此，本文所提供抗-FAP抗體尤其可用於預防腫瘤形成、根除腫瘤及抑制腫瘤生長或轉移。本文所提供抗-FAP抗體可用於治療任一表現FAP之腫瘤。可藉由本文所提供抗-FAP抗體治療之特定惡性腫瘤包括(例如)肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨骼肌癌。
本文所揭示抗-FAP抗體可用於抑制腫瘤生長或殺滅腫瘤細胞。舉例而言，抗-FAP抗體可結合癌性細胞(腫瘤細胞或腫瘤基質細胞)之膜或細胞表面上之FAP並誘發(例如)對癌性細胞之ADCC或其他效應子介導之殺滅。
另一選擇為，可使用抗-FAP抗體以尤其藉由物理干擾FAP與另一化合物之結合來阻斷其功能。舉例而言，抗原結合分子可用於阻斷FAP之酶活性(例如絲胺酸肽酶、明膠酶、膠原酶活性)、FAP介導之ECM降解及/或FAP介導之細胞侵潤或遷移。
在一個態樣中，提供用作藥劑之抗-FAP抗體。在其他態樣中，提供用於治療特徵在於表現FAP之疾病之抗-FAP抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中之抗-FAP抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有特徵在於表現FAP之疾病之個體之方法中的抗-FAP抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗-FAP抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如，如下文所述。在其他實施例中，本發明提供用於誘導細胞溶解之抗-FAP抗體。在某些實施例中，本發明提供用於在個體中誘導細胞溶解之方法中的抗-FAP抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗FAP抗體以誘導細胞溶解。任一上述實施例之「個體」較佳為人類。任一上述實施例之「特徵在於表現FAP之疾病」較佳為癌症，最佳為選自以下之群之癌症：肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨骼肌癌。任一上述實施例之「細胞」較佳為存在於腫瘤中之細胞，例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞，最佳為腫瘤細胞。與相同細胞類型之正常組織相比，任一上述實施例之「FAP表現」較佳係異常表現，例如細胞中之過表現或不同模式之表現。
在另一態樣中，本發明提供抗-FAP抗體在製造或製備藥劑之用途。在一個實施例中，該藥劑用於治療特徵在於表現FAP之疾病。在又一實施例中，該藥劑用於治療特徵在於表現FAP之疾病之方法中，該方法包含向患有特徵在於表現FAP之疾病之個體投與有效量該藥劑。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如下文所述。在又一實施例中，該藥劑用於誘導細胞溶解。在又一實施例中，該藥劑用於個體中誘導細胞溶解之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該藥劑以誘導細胞溶解。任一上述實施例之「個體」較佳為人類。任一上述實施例之「特徵在於表現FAP之疾病」較佳為癌症，最佳為選自以下之群之癌症：肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨骼肌癌。任一上述實施例之「細胞」較佳為存在於腫瘤中之細胞，例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞，最佳為腫瘤細胞。與相同細胞類型之正常組織相比，任一上述實施例之「FAP表現」較佳係異常表現，例如細胞中之過表現或不同模式之表現。
在又一態樣中，本發明提供治療特徵在於表現FAP之疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有特徵在於表現FAP之疾病之個體投與有效量之抗-FAP抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。在又一實施例中，本發明提供在個體中誘導細胞溶解之方法。在一個實施例中，該方法包含向該個體投與有效量之抗-FAP抗體以誘導細胞溶解。任一上述實施例之「個體」可為人類。任一上述實施例之「特徵在於表現FAP之疾病」較佳為癌症，最佳為選自以下之群之癌症：肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨骼肌癌。任一上述實施例之「細胞」較佳為存在於腫瘤中之細胞，例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞，最佳為腫瘤細胞。與相同細胞類型之正常組織相比，任一上述實施例之「FAP表現」較佳係異常表現，例如細胞中之過表現或不同模式之表現。
在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供之抗-FAP抗體中之任一者，例如用於上述治療方法中之任一者。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之抗-FAP抗體中之任一者及一或多種醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之抗-FAP抗體中之任一者及至少一種其他治療劑，例如下文所述。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，可共投與本發明抗體與至少一種其他治療劑。在某些實施例中，其他治療劑係抗癌劑，例如化學治療劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞凋亡活化劑。
上文所述之該組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或各別調配物中)及各別投與(在此情形下，投與本發明抗體可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後)。本發明抗體亦可與輻射療法組合使用。
本發明抗體(及任一其他治療劑)可藉由任何適宜手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，以及(若期望用於局部治療)病竈內投與。非經腸投與包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。靜脈內投與通常較佳。然而，預期腹膜內途徑尤其可用於例如治療結腸直腸腫瘤。可藉由任一適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，部分視投與時間長短而定。本文涵蓋各種投藥方案，包括(但不限於)在各時間點單次或多次投與、濃注(bolus)投與及脈衝輸注。
本發明抗體之調配、給藥及投與應以符合良好醫療實踐之方式實施。在此情況下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從業者已知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑、或本文所述約1%至99%之劑量、或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。
對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之合適劑量(當單獨使用或與一或多種其他其他治療劑組合使用時)應端視擬治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。該抗體適於一次性地或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)抗體可為投與患者之初始候選劑量，不論(例如)藉由一或多次單獨投與、抑或藉由連續輸注。端視上述因素而定，一種典型日劑量可介於約1 μg/kg至100 mg/kg之間或更高。對經若干天或更長時間重複投與而言，端視病況而定，治療通常將持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一個實例性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg之一或多個劑量(其任一組合)。此等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約兩個至約20個、或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習用技術及分析來容易地監測。
應理解，可使用本發明之抗體偶聯物代替抗-FAP抗體或與抗-FAP抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。
H.　製品
在本發明另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療選定病況。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含又一細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。另一選擇為或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包含自商業及用戶角度考慮所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解，上述製品中之任一者皆可包括本發明抗體偶聯物來代替抗-FAP抗體或與抗-FAP抗體一起使用。
III.實例
以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，可根據上文所提供一般說明來實踐各種其他實施例。
實例1
重組DNA技術
如以下文獻中所述使用標準方法來操作DNA：Sambrook,J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。根據廠商說明書使用分子生物學試劑。藉由雙鏈測序測定DNA序列。在一些情形下，期望基因片段係由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物藉由自動基因合成來製備。將兩側有單一限制內切酶裂解位點之基因片段選殖至pGA18(ampR)質粒中。自轉化細菌純化質粒DNA並藉由UV譜確定濃度。藉由DNA測序證實來亞選殖基因片段之DNA序列。基因片段經設計具有適宜限制位點以允許亞選殖至相應表現載體中。
有關人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊參見：Kabat,E.A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物第91-3242號。對於表現而言，所有構建體皆含有編碼前導肽之5'-端DNA序列，該前導肽引導蛋白質在真核細胞中分泌。SEQ ID NO 323-331給出實例性前導肽及編碼其之多核苷酸序列。
(糖改造)抗體之製備
已藉由亞選殖與預先插入相應接受者哺乳動物表現載體中之恆定重鏈或恆定輕鏈在框架內之可變區來獲得全抗體重鏈及輕鏈DNA序列。抗體表現由MPSV啟動子驅使且載體在CDS之3'端處載有合成聚A信號序列。另外，每一載體含有EBV OriP序列。
藉由使用磷酸鈣轉染共轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳動物抗體表現載體來產生抗體。藉由磷酸鈣方法轉染指數生長之HEK293-EBNA細胞。另一選擇為，藉由聚乙烯亞胺轉染懸浮生長之HEK293細胞。對於未經修飾非糖改造抗體之產生而言，僅用比率為1:1之抗體重鏈及輕鏈表現載體轉染細胞。
對於糖改造抗體之產生而言，用兩個其他質粒共轉染細胞，分別為：一個用於融合GnTIII多肽表現(GnT-III表現載體)且另一個用於甘露糖苷酶II表現(高爾基體甘露糖苷酶II表現載體)，比率為4:4:1:1。使用補充有10% FCS之DMEM培養基在T燒瓶以帖壁單層培養物形式生長細胞，且當該等細胞在介於50%與80%鋪滿之間時實施轉染。對於T150燒瓶之轉染而言，在轉染前24小時將1千5百萬個細胞接種於補充有FCS(最終濃度為10% V/V)之25 ml DMEM培養基中，並將細胞置於具有5% CO2氣氛之37℃培育箱中過夜。對於每一待轉染之T150燒瓶而言，藉由將94 μg總質粒載體DNA(在輕鏈與重鏈表現載體之間均分)、水(最終體積為469 μl)及469 μl 1 M CaCl2溶液混合來製備DNA、CaCl2及水之溶液。向此溶液加添加938 μl 50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)，立即混合10 sec並在室溫下靜置20 sec。用10 m補充有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液，並添加至T150中代替現有培養基。隨後再添加13 ml轉染培養基。在37℃、5% CO2下將細胞培育約17至20小時，隨後用25 ml DMEM(10% FCS)替代培養基。在培養基交換後約7天藉由以210 x g離心15 min來收穫條件培養基，無菌過濾(0.22 μm過濾器)溶液並添加最終濃度為0.01% w/v之疊氮化鈉，且保持在4℃下。
藉由親和層析使用蛋白質A(HiTrap ProtA,GE Healthcare)親和層析自細胞培養物上清液純化分泌野生型或糖改造非岩藻糖基化(afucosylated)抗體。簡言之，用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)平衡管柱，加載細胞上清液，隨後用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉(pH 7.5)進行第一次洗滌，且用13.3 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、500 mM氯化鈉(pH 5.45)進行第二次洗滌。用20 mM檸檬酸鈉、100 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸(pH 3)溶析抗體。在隨後尺寸排除層析步驟中在HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上將緩衝劑交換為25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液(pH 6.7)或另一選擇為140 mM氯化鈉、20 mM組胺酸(pH 6.0)並收集純單體IgG1抗體。若需要，在兩種標準純化步驟之間包括其他陽離子交換層析步驟。
藉由在280 nm下量測光學密度(OD)使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數來確定純化蛋白質試樣之蛋白質濃度。在還原劑(5 mM 1,4-二硫蘇糖醇)存在與不存在時藉由SDS-PAGE分析抗體之純度及分子量並用考馬斯(Coomassie)(購自Invitrogen之SimpleBlueTM SafeStain)染色。根據廠商說明書使用NuPAGE預澆注凝膠系統(Invitrogen,USA)(4-20% Tris-甘胺酸凝膠或3-12% Bis-Tris)。在25℃下使用Superdex 200 10/300GL分析型尺寸排除管柱(GE Healthcare,Sweden)在2 mM MOPS、150 mM NaCl、0.02% NaN3(pH 7.3)運行緩衝劑中分析抗體試樣之聚集體含量。在藉由用肽-N糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理去除N-聚糖後，藉由NanoElectrospray Q-TOF質譜驗證經還原抗體輕鏈及重鏈之胺基酸骨架之完整性。
野生型及糖改造28H1、29B11、3F2及4G8人類IgG抗體之純化及分析結果展示於圖15至22中。下表中給出產率：
藉由下文所述MALDI TOF-MS來分析附接至抗體Fc區之寡糖。藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放寡糖。所得含有經釋放寡糖之消化溶液經直接製備用於MALDI TOF-MS分析或用內H糖苷酶進一步消化，隨後製備試樣用於MALDI TOF-MS分析。
對(糖改造)抗體之糖結構之分析
為測定含有岩藻糖之寡糖結構與含有非岩藻糖(去岩藻糖)之寡糖結構之相對比率，藉由MALDI-Tof-質譜儀分析經純化抗體材料之經釋放聚糖。在37℃下將抗體試樣(約50 μg)與存於2 mM Tris(pH 7.0)中之5 mU N-糖苷酶F(QAbio；PNGaseF: E-PNG01)一起培育過夜，以自蛋白質骨架釋放寡糖。為將聚糖去胺基，添加乙酸以達成150 mM之最終濃度並在37℃下培育1h。為藉由MALDI TOF質譜進行分析，將2 μL試樣於MALDI靶上與2 μL DHB基質溶液(2,5-二羥基苯甲酸[Bruker Daltonics編號201346]，以4 mg/ml溶解於50%乙醇/5 mM NaCl中)混合並用MALDI TOF質譜儀Autoflex II儀器[Bruker Daltonics]分析。按常規，記錄50-300次擊射(shot)並將其合計至單次實驗中。藉由flex分析軟體(Bruker Daltonics)評估所獲光譜並測定每一所檢測峰之質量。隨後，藉由比較相應結構(例如分別為複雜結構、雜合結構及寡-或高甘露糖結構，且含有且不含有岩藻糖)之計算質量與理論預計質量將各峰指派給含有岩藻糖或去岩藻糖(非岩藻糖)之碳水化合物結構。
為測定雜合結構之比率，同時用N-糖苷酶F及內糖苷酶H[QAbio；EndoH: E-EH02]消化抗體試樣。N-糖苷酶F自蛋白質骨架釋放全部N-連接聚糖結構(複雜結構、雜合結構及寡-及高甘露糖結構)且內糖苷酶H另外在聚糖之還原端處兩個N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基之間裂解全部雜合型聚糖。隨後處理此消化物且藉由MALDI TOF質譜以與上文針對N-糖苷酶F消化試樣所述相同之方式分析。藉由比較N-糖苷酶F消化物與組合型N-糖苷酶F/Endo H消化物之模式，使用特定碳水化合物結構之信號之減弱程度來估計雜合結構之相對含量。自個體結構之峰高度比率計算每一碳水化合物結構之相對量並檢測全部寡糖之峰高度總和。岩藻糖之量係含岩藻糖結構相對於所有在N-糖苷酶F處理試樣中鑑別之碳水化合物結構(例如分別為複雜結構、雜合結構及寡-及高甘露糖結構)之百分比。非岩藻糖基化之量係無岩藻糖結構相對於所有在N-糖苷酶F處理試樣中鑑別之碳水化合物(例如分別為複雜結構、雜合結構及寡-及高甘露糖結構)之百分比。
下表中給出不同野生型及糖改造抗-FAP抗體之非岩藻糖基化程度：
實例2
一般Fab-文庫之構建
基於人類種系基因使用以下V-結構域配對構建呈Fab形式之一般抗體文庫：Vk3_20 κ輕鏈與VH3_23重鏈(對於DP47-3文庫)及Vk1_17κ輕鏈與VH1_69重鏈(對於DP88-3文庫)。參見SEQ ID NO 1及2。
在輕鏈之CDR3(L3)及重鏈之CDR3(H3)方面將兩個文庫隨機化並藉由剪接藉由重疊延伸(SOE) PCR自3個片段組裝每一文庫。片段1包含抗體基因中包括隨機化L3之5'端，片段2係自L3跨越至H3之中心恆定片段，而片段3包含隨機化H3及抗體基因之3'部分。
使用以下引物組合來產生DP47-3文庫之文庫片段：片段1(LMB3-LibL1b_新)、片段2(MS63-MS64)、片段3(Lib2H-fdseqlong)。參見表3.使用以下引物組合來產生DP88-3文庫之文庫片段：片段1(LMB3-RJH_LIB3)、片段2(RJH31-RJH32)及片段3(LIB88_2-fdseqlong)。參見表4.
產生文庫片段之PCR方案包括：在94℃下初始變性5分鐘；在94℃下1分鐘、在58℃下1分鐘及在72℃下1分鐘持續25個循環；及在72℃下末端延長10分鐘。對於組裝PCR而言，使用等莫耳比率之3個片段作為模板。組裝PCR方案包括：在94℃下初始變性3分鐘；及在94℃下30秒、在58℃下1分鐘及在72℃下2分鐘持續5個循環。在此階段，添加與片段1-3外側序列互補之引物並再實施20個循環，隨後在72℃下末端延長10 min。
在組裝足量全長隨機化Fab構建體後，用NcoI/NotI(對於DP47-3文庫而言)及NcoI/NheI(對於DP88-3文庫而言)消化Fab構建體，該等文庫與經相似處理之受體噬菌粒載體相連。對於DP47-3文庫而言，將22.8 μg Fab文庫與16.2 μg噬菌粒載體連接在一起。對於DP88-3文庫而言，將3.0.6 μg Fab文庫與30.6 μg噬菌粒載體連接在一起。
使用純化連接物分別進行68次轉化(對於DP47-3文庫而言)及64次轉化(對於DP88-3文庫而言)，以獲得4.2×1010(對於DP47-3而言)及3.3×109(對於DP88-3而言)之最終文庫尺寸。復蘇展示Fab文庫之噬菌粒顆粒並藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。
實例3
抗-FAP純系之選擇(初步選擇)
針對人類或鼠類纖維母細胞活化蛋白(FAP)之胞外結構域實施選擇，該等胞外結構域係在聚-離胺酸及6×his-標籤上游選殖。參見SEQ ID NO: 317及319。在選擇前，以10μg/ml或5 μg/ml之濃度將抗原塗覆至免疫管中，此端視選擇輪次而定。根據以下方案實施選擇：(i)將文庫DP47-3之約1012個噬菌粒顆粒與經固定人類或鼠類FAP結合2小時；(ii)使用5×5 mL PBS/Tween 20及5×5 ml PBS洗滌免疫管；(iii)藉由添加1 mL 100 mM TEA(三乙胺)將噬菌體顆粒溶析10分鐘並藉由添加500 μL 1 M Tris/HCl pH 7.4來中和；及(iv)再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用輔助噬菌體VCSM13感染且隨後PEG/NaCl沉澱噬菌粒顆粒以用於隨後選擇輪次中。
已實施3輪或4輪選擇，且在最終選擇輪次中使用抗原濃度降低之人類FAP且在一些情形下使用5 μg/ml之鼠類FAP。特定黏合劑定義為信號為背景之5倍高且藉由ELISA鑑別。用10 μg/ml人類或鼠類FAP塗覆NUNC maxisorp板，隨後添加含有Fab之細菌上清液並經由Flag-標籤藉由使用抗-Flag/HRP二級抗體來檢測特異性結合Fab。
以96孔模式中之1 mL培養物用細菌表現ELISA-陽性純系，並使用BIACORE T100對上清液實施動力學篩選實驗。在25℃下藉由表面電漿共振使用BIACORE T100機器(GE Healthcare)來量測KD，其中在CM5晶片上藉由胺偶合來固定抗人類F(ab')2片段特異性捕獲抗體(Jackson ImmunoResearch編號109-005-006)，且隨後捕獲細菌上清液或純化Fab製劑中之Fab。簡言之，根據供應商說明書使用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare)。用50 μg/ml 10 mM乙酸鈉(pH 5.0)稀釋抗人類F(ab')2片段特異性捕獲抗體，隨後以10 μl/分鐘之流速注射以達成約高達10.000個反應單位(RU)之偶合捕獲抗體。注射捕獲抗體後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，以10 μl/min之流速將來自細菌上清液之Fab或純化Fab注射300 s且解離300 s以達成捕獲基線穩定。捕獲程度在100-500 RU範圍內。在隨後步驟中，在25℃下以50 μl/min之流速注射人類或鼠類FAP分析物，其以單一濃度或以濃度系列(端視介於100 nM與250 pM之間之範圍內之純系親和力而定)稀釋於HBS-EP+(GE Healthcare,10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(pH 7.4))中。締合時間係120或180s，解離時間係300至600s。藉由依次以90 μl/min將甘胺酸(pH 1.5)注射30 s及以相同流速將NaOH注射20 s使感測器晶片表面再生。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE T100評估軟體或Scrubber軟體(BioLogic))藉由同時擬合締合感測圖與解離感測圖來計算締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。以k解離/k締合比率之形式來計算平衡解離常數(KD)。
實例4
抗-FAP親和力成熟文庫之構建
基於來自初步抗-FAP選擇之預選擇抗體構建三個親和力成熟文庫。更精確而言，其基於(i)抗人類FAP純系2D9(文庫a.m.FAP2D9)(參見SEQ ID NO: 229及231)，(ii)抗鼠類FAP純系4B8(文庫a.m.FAP4B8)(參見SEQ ID NO: 233及235)及(iii)交叉反應性純系7A1、13B2、13C2、13E8、14C10及17A11(文庫a.m.FAP庫)(參見對應於可變區序列7A1之SEQ ID NO: 237及239；對應於可變區序列13C2之SEQ ID NO: 241及243；對應於可變區序列13E8之SEQ ID NO: 245及247；對應於可變區序列14C10之SEQ ID NO: 249及251；及對應於可變區序列17A11之SEQ ID NO: 253及255)。
該等文庫中之每一者由兩個分別在輕鏈之CDR1及CDR2(L1/L2)或重鏈之CDR1及CDR2(H1/H2)方面隨機化之亞文庫組成。在轉化後彙集該等亞文庫。藉由4個擴增及組裝之隨後步驟來構建該等亞文庫中之每一者。
對於L1/L2文庫而言，擴增及組裝方案包括：(i)擴增片段1(LMB3-DPK22_CDR1_rand_ba_opt)及片段2(DPK22_CDR1_fo-DPK22_Ck_BsiWI_ba)；(ii)使用外部引物LMB3及DPK22_Ck_BsiWI_ba組裝片段1及2以產生片段3之模板；(iii)擴增片段3(LMB3-DPK22_CDR2_rand_ba)及片段4(DPK22_CDR2_fo-DPK22_Ck_BsiWI_ba)；及(iv)最終使用與上文相同之外部引物來組裝片段3及4。引物序列參見表5。
黑體：60%係原始鹼基且40%隨機化為M
下劃線：60%係原始鹼基且40%隨機化為N
對於H1/H2文庫而言，擴增及組裝方案包括：(i)擴增片段1(RJH53-DP47_CDR1_rand_ba_opt)及片段2(DP47_CDR1_fo-MS52)；(ii)使用外部引物RJH53及MS52組裝片段1及2以產生片段3之模板；(iii)擴增片段3(RJH53-DP47_CDR2_rand_ba)及片段4(DP47_CDR2_fo-MS52)；及(iv)最終使用與上文相同之外部引物來組裝片段3及4。引物序列參見表6。
黑體：60%係原始鹼基且40%隨機化為M
下劃線：60%係原始鹼基且40%隨機化為N
已分別用NcoI/BsiWI(對於a.m.FAP2D9及a.m.FAP4B8之L1/L2亞文庫而言)、MunI及NheI(對於a.m.FAP2D9及a.m.FAP4B8之H1/H2亞文庫而言)以及NcoI/BamHI(對於a.m.FAP庫之L1/L2文庫而言)及BspEI/PstI(對於a.m.FAP庫之H1/H2文庫而言)消化最終組裝產物，該等文庫與經相似處理之受體載體相連，該等受體載體分別係基於純系2D9、4B8之質粒製劑或純系7A1、13B2、13C2、13E8、14C10及17A11之等莫耳混合物。針對相應文庫(μg V-結構域/μg載體)連接以下量之消化隨機化(部分)V-結構域與消化受體載體：a.m.FAP2D9 L1/L2亞文庫(5.7/21.5)、a.m.FAP2D9 H1/H2亞文庫(4.1/15.5)、a.m.FAP4B8 L1/L2亞文庫(6.5/24.5)、a.m.FAP4B8 H1/H2亞文庫(5.7/21.5)、a.m.FAP庫L1/L2亞文庫(4.4/20)、a.m.FAP庫H1/H2亞文庫(3.4/15.5)。
彙集L1/L2與H1/H2亞文庫之純化連接物並將其用於3個親和力成熟文庫中之每一者之60次轉化，以獲得6.2×109(對於a.m.FAP2D9而言)、9.9×109(對於a.m.FAP4B8而言)及2.2×109(對於a.m.FAP庫而言)之最終文庫尺寸。
復蘇展示該等Fab文庫之噬菌粒顆粒並藉由PEG/NaCl純化來純化以用於二次選擇。
其他抗-FAP親和力成熟文庫之構建(基於純系3F2、3D9、4G8、4B3及2C6)
基於來自抗-FAP抗體之第一親和力成熟活動(campaign)之預選擇交叉反應性抗體構建4個其他親和力成熟文庫，該等預選擇交叉反應性抗體即純系3F2、3D9、4G8、4B3及2C6(參見對應於可變區序列3F2之SEQ ID NO: 195及197；對應於可變區序列3D9之SEQ ID NO: 199及201；對應於可變區序列4G8之SEQ ID NO: 205及207；對應於可變區序列4B3之SEQ ID NO: 209及211；對應於可變區序列2C6之SEQ ID NO: 217及219)。更精確而言，該4個文庫基於1)抗-FAP純系3F2、4G8及4B3(在可變重鏈之CDR 1及2方面隨機化之VH文庫，即H1/H2文庫)，2)抗-FAP純系3D9及2C6(在可變輕鏈之CDR 1及2方面隨機化之VL文庫，即L1/L2文庫)，3)抗-FAP純系3F2(在輕鏈CDR3方面軟隨機化之L3文庫，即L3文庫)及4)抗-FAP純系3F2(在重鏈之CDR3方面軟隨機化之H3文庫，即H3文庫)。對於L1/L2文庫及H1/H2文庫而言，分別以與針對抗-FAP抗體之第一親和力成熟活動所述完全相同之方式構建前兩個文庫。相反，對於基於純系3F2之L3及H3親和力成熟文庫而言，使用兩種新穎引物在親代純系之L3(AM_3F2_DPK22_L3_ba：CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC，其中帶下劃線鹼基為60%給定鹼基及40%混合物N(4種核苷酸A、C、G與T之混合物))及H3(AM_3F2_DP47_H3_fo: GGCCGTATATTACTGTGCG A A A GGG TGG TT T GGT GGT TTT A ACTACTGGGGCCAAGGAAC，其中帶下劃線鹼基為60%給定鹼基及40%混合物N，斜體鹼基為60%給定鹼基及40% G，且帶下劃線斜體鹼基為60%給定鹼基及40%混合物K(兩種核苷酸G與T之混合物))中引入軟隨機化。文庫尺寸如下：H1/H2文庫(1.13×1010)、L1/L2文庫(5.6×109)、L3文庫(2.3×1010)及H3文庫(2.64×1010)。
實例5
親和力成熟抗-FAP純系之選擇
針對人類或鼠類纖維母細胞活化蛋白(FAP)之胞外結構域實施選擇，該等胞外結構域係在聚_離胺酸及6×his-標籤之5'選殖。參見SEQ ID NO: 317及319。在選擇前，以10 μg/mL、5 μg/mL或0.2 μg/mL之濃度將抗原塗覆至免疫管中，此端視文庫及選擇輪次而定。根據以下方案實施選擇：(i)將文庫a.m.FAP2D9、a.m.FAP4B8或a.m.FAP庫之約1012個噬菌粒顆粒與經固定人類或鼠類FAP結合2小時；(ii)使用10-20×5 mL PBS/Tween20及10-20×5 mL PBS洗滌免疫管(端視文庫及選擇輪次而定)；(iii)藉由添加1 mL 100 mM TEA(三乙胺)將噬菌體顆粒溶析10分鐘並藉由添加500 μL 1 M Tris/HCl pH 7.4來中和；及(iv)再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用輔助噬菌體VCSM13感染且隨後PEG/NaCl沉澱噬菌粒顆粒以用於隨後選擇輪次中。
經2輪實施選擇並對3個文庫中之每一者之條件進行個別地調節。詳細而言，選擇參數為：a.m.FAP2D9(第1輪，5 μg/mL人類FAP及總共20次洗滌；第2輪，1 μg/mL人類FAP及總共30次洗滌)、a.m.FAP4B8(第1輪，1 μg/mL鼠類FAP及總共30次洗滌；第2輪，0.2 μg/mL人類FAP及總共40次洗滌)及a.m.FAP庫(第1輪，5 μg/mL人類FAP及總共30次洗滌；第2輪，5 μg/mL鼠類FAP及總共30次洗滌)。特定黏合劑定義為信號為背景之5倍高且藉由ELISA鑑別。用1 μg/ml或0.2 μg/ml人類或鼠類FAP塗覆NUNC maxisorp板，隨後添加含有Fab之細菌上清液並經由Flag-標籤藉由使用抗-Flag/HRP二級抗體來檢測特異性結合Fab。
以96孔模式中之1 ml培養物用細菌表現ELISA-陽性純系，並使用BIACORE T100對上清液實施動力學篩選實驗，如上文所述(參見實例3)。
親和力成熟抗-FAP純系之其他選擇
針對人類及鼠類纖維母細胞活化蛋白(FAP)之胞外結構域(參見SEQ ID NO: 317及319)實施選擇，該等胞外結構域係在6x-離胺酸及6x-his標籤上游選殖。在選擇前，以1 μg/ml、0.2 μg/ml或0.02 μg/ml之濃度將抗原塗覆至免疫管中，此端視文庫及選擇輪次而定。如針對抗-FAP抗體之第一親和力成熟活動所述實施選擇及基於ELISA之篩選。使用ProteOn XPR36生物感測器(Biorad)實施二次篩選，並在相同儀器上分析親和力純化Fab製劑以確定動力學速率常數及親和力。在25℃下藉由表面電漿共振使用ProteOn XPR36機器(Biorad)來量測KD，其中在GLM晶片上固定抗人類F(ab')2片段特異性捕獲抗體(Jackson ImmunoResearch編號109-005-006)且隨後捕獲細菌上清液或純化Fab製劑中之Fab。簡言之，用新鮮製備之N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-二甲基胺基丙基鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之混合物將GLM生物感測器晶片(Biorad)活化5 min。用10 mM乙酸鈉(pH 5.0)將抗人類F(ab')2片段特異性捕獲抗體稀釋至24 μg/ml，然後注射5 min以達成約高達10.000個反應單位(RU)之偶合捕獲抗體。注射捕獲抗體後，將1 M乙醇胺注射5 min以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，以30 μl/min之流速將來自細菌上清液之Fab注射100 s。捕獲程度在250 RU範圍內。在隨後步驟中，在25℃下以50 μl/min之流速注射人類、鼠類或食蟹猴FAP分析物之系列稀釋液(2倍稀釋液，最高濃度為25 nM)，該分析物係稀釋於PBS/0.005% Tween-20中。締合時間係240 s，解離時間係600至1800 s。藉由依次以100 μl/min將0.85% H3PO4注射30 s及以相同流速下將50 mMNaOH注射30 s使感測器晶片再生。使用簡單一對一Langmuir結合模型(ProteOn管理軟體2.1版)藉由同時擬合締合感測圖與解離感測圖來計算締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。以比率k解離/k締合之形式來計算平衡解離常數(KD)。
鑑別以下親和力成熟純系：19G1(參見SEQ ID NO: 257及259)、20G8(參見SEQ ID NO: 281及263)、4B9(參見SEQ ID NO: 265及267)、5B8(參見SEQ ID NO: 269及271)、5F1(參見SEQ ID NO: 273及275)、14B3(參見SEQ ID NO: 277及279)、16F1(參見SEQ ID NO: 281及283)、16F8(參見SEQ ID NO: 285及287)、O3C9(參見SEQ ID NO: 289及291)、22A3(參見SEQ ID NO: 301及303)及29B11(參見SEQ ID NO: 305及307)(所有該等純系皆選自H1/H2文庫且源自親代純系3F2)、O2D7(參見SEQ ID NO: 293及295)(選自基於親代純系3F2之L3文庫)及28H1(參見SEQ ID NO: 297及299)及23C10(參見SEQ ID NO: 309及311)(該兩個純系選自H1/H2文庫且源自親代純系4G8)。
圖1至5展示所選結合固定FAP之親和力成熟Fab之表面電漿共振感測圖且表7給出所得相應親和力。所選Fab跨越pM至nM範圍內之高親和力範圍且對人類(hu)及鼠類(mu) FAP以及食蟹猴(cyno) FAP具有交叉反應性，如針對所選純系所確定。將親和力成熟抗-FAP Fab轉化為Fab-IL2-Fab模式及IgG抗體以供特異性分析。結合特異性顯示為不與HEK293或CHO細胞上表現之DPPIV(為FAP之緊密同源物)結合(參見實例9)。
實例6
結合FAP之Fab之IgG轉化
已將親代3F2、4G8及3D9 Fab及親和力成熟3F2及4G8 Fab衍生物轉化為人類IgG1模式、小鼠IgG2a模式及人類IgG1模式。
藉由亞選殖與預先插入不同接受者哺乳動物表現載體中之相應恆定重鏈及恆定輕鏈區在框內之可變區來獲得全抗體重鏈及輕鏈DNA序列或藉由融合與接受者載體插入位點同源之短序列伸長來重組該等序列。根據來自Invitrogen之「In-Fusion選殖系統」實施重組。
在所有載體中，抗體表現由MPSV啟動子驅使且所有載體在CDS之3'端處載有合成聚A信號序列。另外，每一載體含有EBV OriP序列。
實例7
對抗-FAP IgG抗體之Biacore分析
隨後在25℃下藉由表面電漿共振(SPR)分析使用BIACORE T100機器(GE Healthcare)來測定並證實抗-FAP Fab片段3F2、4G8及3D9以及人類IgG1轉化抗-FAP抗體對人類、鼠類及食蟹猴FAP之親和力。出於此目的，藉由經固定抗-His抗體(Penta His Qiagen 34660)捕獲人類、小鼠或食蟹猴FAP細胞外結構域(SEQ ID NO 317-322)並使用該等抗體作為分析物。對於固定化而言，根據供應商說明書使用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,GE Healthcare)。使用10 mM乙酸鈉(pH 5)將五His抗體稀釋至40 μg/ml，然後以10 μl/分鐘之流速注射以達成約9000個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射配體後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。
對於動力學量測而言，以10 μl/min且以10 nM經20 s(對於Fab片段而言)或以20 nM經25 s(對於IgG而言)注射人類、小鼠或食蟹猴FAP細胞外結構域並經由其His標籤由經固定五His抗體捕獲。在25℃下以90 μl/min之流速將抗體系列稀釋液(對於Fab片段，2倍稀釋液，介於6.25 nM至200 nM範圍內：或對於IgG，5倍稀釋液，介於3.2 pM至10 nM範圍內)注射於HBS-EP+(GE Healthcare，10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(pH 7.4))中。應用以下參數：締合時間180 s，解離300 s(對於Fab而言)或900 s(對於IgG而言)，在每個循環之間用10 mM甘胺酸(pH 2)再生60 s。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE T100評估軟體1.1.1版)藉由同時擬合締合感測圖與解離感測圖(模型參數係局部Rmax且RI=0)來計算締合速率(k締合)及解離速率(k解離)。以k解離/k締合比率之形式來計算平衡解離常數(KD)。
表8中給出結合之KD值。圖6A-C展示對Fab片段之基於SPR之對應動力學分析，圖7A-C展示對IgG抗體之基於SPR之對應動力學分析。
實例8
抗-FAP抗體3F2、4G8及3D9在人類腫瘤組織切片上之結合
使用呈小鼠IgG2a形式之抗-FAP抗體純系3F2、4G8及3D9來實施實驗以檢測並比較FAP在新鮮冷凍人類腫瘤組織(乳癌、結腸腺癌及NSCLC組織)中之表現。
使用一個含有30種不同腫瘤(各具有兩個斑點)之新鮮冷凍組織微陣列(TMA)(AST 274)，其來自Roche TRS Pathology & Tissue Biomarkers腫瘤庫。含有10種乳腺侵潤性導管癌、10種結腸直腸腺癌及10種非小細胞肺癌之TMA購自Asterand有限公司(Royston,UK)。
對於免疫組織化學(IHC)染色而言，使用以下抗體：單株小鼠抗人類FAP純系3F2(15.8 ng/ml，稀釋於Ventana抗體稀釋劑中)、株小鼠抗人類FAP純系4G8(1000 ng/ml，稀釋於Ventana抗體稀釋劑中)及單株小鼠抗人類FAP純系.3D9(1000 ng/ml，稀釋於Ventana抗體稀釋劑中)。使用濃度為100 μg/mL之多株小鼠IgG2a(提供商：DAKO，X0943，批號00058066)作為同種型對照。
根據標準方案在Ventana Benchmark XT儀器上使用具有檢測用HRP-系統(含有通用型HRP多聚體及用於染色之DAB)之Ventana Ultra-View檢測套組實施染色。用蘇木精II(Hematoxylin II)(Ventana，Mayer蘇木精)及上藍試劑(Ventana)實施8 min對比染色。
半定量分析TMA並評估腫瘤組織中之總FAP表現(染色強度)以及FAP表現之定位。
對於所有3種抗-FAP抗體而言，所有可評估之腫瘤組織試樣(乳癌、結腸直腸癌症及肺癌)皆顯示腫瘤之間質組份中中度至強烈之染色FAP信號強度。對於每一腫瘤及抗體，可評估10個試樣中之至少7個。不能對剩餘試樣進行評估，此乃因組織核心具有摺疊偽影，僅含有正常組織或消失。
如所預計，FAP信號一定位於腫瘤之間質組份中。純系3F2與純系3D9與4G8之間之信號強度存在微小差異。純系3D9及4G8觀察到略強信號，但差異較小。
圖8A-D展示使用抗-FAP小鼠IgG2a 3F2、3D9或4G8或同種型對照抗體對FAP進行人類腫瘤組織試樣免疫組織化學染色之代表性顯微照片。
實例9
抗-FAP抗體與細胞上之FAP之結合
藉由FACS量測人類IgG1抗體3F2、4B3及4G8與穩定轉染HEK293細胞上表現之人類及鼠類FAP之結合。簡言之，將150.000個細胞/孔與指示濃度之抗-FAP抗體3F2、4B3及4G8在圓底96孔板中一起培育，在4℃下培育30 min，並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。在4℃下培育30 min後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)利用偶聯FITC之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類F(ab')2特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab編號109-096-097，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA中)檢測結合抗體。結果展示於圖9中。確定結合人類及鼠類FAP之半數最大結合的EC50值並在表9中給出。
FAP抗體之特異性
為評價噬菌體展示衍生抗體之結合特異性，量測抗-FAP人類IgG1抗體3F2、4B3及4G8與穩定表現DPPIV(FAP之在健康組織上表現之緊密同源物)或HER2之HEK293細胞之結合。簡言之，將200,000個細胞/孔(HEK293-DPPIV或HEK293-HER2作為對照)與30 μg/ml抗-FAP抗體3F2、4B3或4G8在圓底96孔板中一起培育，在4℃下培育30 min，並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。使用曲妥珠單抗(Trastuzumab)(抗-HER2抗體)或藻紅蛋白(PE)-偶聯小鼠抗人類抗-CD26/DPPIV抗體(CD26=DPPIV，小鼠IgG1,k，BD Biosciences，編號555437，純系M-A261)作為陽性對照。在4℃下培育30 min後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)利用偶聯PE之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcγ特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab編號109-116-170，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA 中)檢測結合抗體。此實驗之結果展示於圖10中。抗-FAP抗體皆未顯示與DPPIV或HER2之實質性結合，而是顯示在陰性對照(單獨二級抗體、同種型對照抗體或根本無抗體)範圍內之信號。
抗-FAP抗體與人類纖維母細胞上之FAP之結合
藉由FACS來量測人類IgG1抗體與人類纖維母細胞細胞系GM05389(源自人類胎肺，National Institute of General Medical Sciences,Camden,NJ)上表面之人類FAP之結合。簡言之，將200.000個細胞/孔與30 μg/ml抗-FAP抗體3F2或4G8在圓底96孔板中一起培育，在4℃下培育30 min並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。在4℃下培育30 min後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)利用偶聯FITC之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcγ特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab編號109-096-098，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA中)檢測結合抗體。此實驗之結果展示於圖11中。二種抗-FAP抗體皆強烈地結合人類纖維母細胞上表現之FAP。
抗-FAP抗體與腫瘤細胞上之FAP之結合
藉由FACS比較人類IgG1抗體與人類纖維母細胞細胞系GM05389及經穩定轉染HEK293細胞上表現之人類FAP之結合及與人類癌症細胞系ACHN、Colo205、MDA-MB231、MDA-MB435及KPL4上表現之FAP之結合。
簡言之，將200.000個細胞/孔與10 μg/ml抗-FAP抗體3F2或4G8在圓底96孔板中一起培育，在4℃下培育30 min且用PBS/0.1% BSA洗滌一次。在4℃下培育30 min後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)利用偶聯FITC之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類F(ab')2特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab編號109-096-097，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA中)檢測結合抗體。此實驗之結果展示於圖12中。數據顯示抗體3F2及4G8特異性結合FAP，該FAP在纖維母細胞及經穩定轉染HEK293細胞上強烈地過表現；而在ACHN、Colo205、MDA-MB231、MDA-MB435及KPL4人類腫瘤細胞系上僅可檢測到弱結合。
實例10
藉由FACS分析FAP在結合抗-FAP抗體後之內化
對於業內已知之若干FAP抗體而言，人們已闡述其在結合FAP後可誘導FAP內化(闡述於(例如)以下文獻中：Baum等人，J Drug Target 15,399-406(2007)；Bauer等人，Journal of Clinical Oncology,2010 ASCO年會論文集(會議後版本)，第28卷(5月20日增刊)，摘要編號13062(2010)；Ostermann等人，Clin Cancer Res 14,4584-4592(2008))。
因此，分析抗體之內化性質。簡言之，將在EMEM培養基+15% FCS中培養之GM05389細胞(人類肺纖維母細胞)分離，洗滌，計數，檢查生存力並以0.2百萬細胞/孔之密度接種於12孔板中。第二天，將FAP抗體4G8及3F2(圖13A)或僅4G8(圖13B)於冷培養基中稀釋至10 μg/ml，將細胞在冰上冷卻並如所指示單獨添加稀釋抗體(0.5 ml/孔)或培養基。隨後，在輕輕攪拌的同時將細胞在冷室內培育30min，隨後添加0.5 ml溫和培養基並在37℃下將細胞進一步培育所指示時間。當達到不同時間點時，將細胞轉移至冰上，用冷PBS洗滌一次並在4℃下與0.4 ml二級抗體(Alexa Fluor 633-偶聯山羊抗人類IgG，分子探針編號A-21091，2 mg/ml，使用1:500)一起培育30 min。然後用PBS/0.1% BSA將細胞洗滌兩次，轉移至96孔板上，在4℃及400 x g下離心4 min，且藉由渦旋使細胞微粒再懸浮。使用100 μl 2% PFA固定細胞。對於FACS量測而言，使細胞再懸浮於200 μl/試樣PBS/0.1% BSA中並用FACS CantoII(軟體FACS Diva)中之板方案量測。該等實驗之結果呈現於圖13A及B中，且顯示4G8及3F2抗-FAP抗體不誘導纖維母細胞上之FAP之內化。
藉由免疫螢光分析FAP在結合抗-FAP抗體後之內化
使GM05389細胞(人類肺纖維母細胞)生長於EMEM培養基+15% FCS中之玻璃蓋玻片上。在處理前，用PBS將細胞洗滌3次並在EMEM培養基+0.1% BSA中受餓2 h。將抗-FAP抗體(4G8 IgG)或抗-CD20抗體(GA101，用作同種型對照)稀釋於冷EMEM培養基中至最終濃度為10 μg/ml。在受餓後，將細胞於冰上冷卻，用冷PBS沖洗兩次並在4℃下在恆定攪拌下與稀釋抗體(0.5 ml/孔)一起培育45 min以允許表面結合。然後用冷PBS將細胞洗滌兩次並用冷PFA(T0，4%多聚甲醛，存於PFS(pH 7.4)中)固定或在37℃下在EMEM+10% FCS中進一步培育20 min、1 h、3 h及6 h。在每一時間點，用冷PBS將細胞洗滌兩次並在冰上用PFA固定20 min。固定後，用冷PBS將細胞洗滌4次，用Triton 0.03%透化並在室溫下與抗-EEA1(早期核內體標記物)抗體在封阻緩衝液(PBS+10% FCS)中一起培育45 min。然後用PBS將細胞洗滌3次並在室溫下與螢光標記二級抗體(驢抗-小鼠Alexa Fluor 594-偶聯抗體及山羊抗人類Alexa Fluor 488-偶聯抗體)一起再培育45 min。對細胞實施最後洗滌並使用Immuno Mount封固劑將其封固於玻璃支撐載玻片上。
圖14A-D呈現代表性免疫螢光影像，其顯示在與抗-FAP 4G8 IgG結合45 min(在4℃下)(A)、20 min(在37℃下)(B)、1小時(在37℃下)(C)或6小時(在37℃下)(D)後獲得的GM05389肺纖維母細胞上之FAP質膜染色。用作同種型對照之抗-CD20抗體GA101顯示背景染色。EEA1標記早期核內體。註意，FAP表面質膜染色在抗-FAP 4G8抗體結合後持續長達6小時。
實例11
對親和力成熟抗-FAP IgG抗體之Biacore分析
將源自3F2及4G8之親和力成熟抗-FAP Fab片段轉化為兔IgG抗體。隨後藉由在25℃下之SPR分析(Biacore)確定並證實人類、鼠類及食蟹猴FAP之基於親和力成熟3F2及4G8之兔IgG1轉化抗-FAP抗體與FAP之親和力。出於此目的，藉由經固定抗-His抗體(五His Qiagen 34660)捕獲人類、小鼠或食蟹猴FAP細胞外結構域(SEQ ID NO 317-322)並使用該等抗體作為分析物。以1:5將IgG自10 nM稀釋至3.2 pM。應用以下參數：締合時間180 s，解離900 s，流速90 μl/min。用10 mM甘胺酸pH 2再生60 s。用1:1模型對曲線實施擬合以得到KD值(Rmax局部，RI=0)。
實例12
親和力成熟抗-FAP抗體與細胞上之FAP之結合
藉由FACS量測源自4G8親代抗體之經Alexa-647(1.89 mg/ml，1.83莫耳染料/莫耳蛋白質)標記之親和力成熟人類IgG1抗體28H1與穩定轉染HEK293細胞上表現之人類FAP之結合。簡言之，將200.000個細胞/孔培育與指示濃度之2 μg/ml及10 μg/ml之親代4G8及親和力成熟28H1抗-FAP抗體在圓底96孔板中一起培養，在4℃下培育30 min並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)檢測在4℃下培育30 min後之結合抗體。數據顯示兩種抗體皆強烈地結合經人類FAP轉染之HEK293細胞(圖23)。
實例13
親和力成熟抗-FAP抗體與人類纖維母細胞上之FAP之結合
藉由FACS來量測源自3F2之親和力成熟人類IgG1抗體與人類纖維母細胞細胞系GM05389(源自人類胎肺，National Institute of General Medical Sciences,Camden,NJ)上表現之人類FAP之結合。簡言之，將200.000個細胞/孔與30 μg/ml親和力成熟3F2抗-FAP抗體在圓底96孔板中一起培育，在4℃下培育30 min並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。在4℃下培育30 min後使用FACS CantoII(軟體FACS Diva)利用偶聯FITC之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcγ特異性抗體(Jackson Immuno Research Lab編號109-096-098，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA中)檢測結合抗體。確定結合人類及鼠類FAP之半數最大結合的EC50值。
實例14
由糖改造抗-FAP IgG1抗體介導之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性
源自4G8或3F2之抗FAP人類IgG1抗體係藉由經編碼GnTIII及ManII之質粒共轉染來糖改造，如實例1中所述。隨後，在ADCC分析中比較糖改造親代4G8及3F2及親和力成熟28H1人類IgG1抗體介導優於其非糖改造野生型形式之抗體介導細胞毒性的潛力。
簡言之，收集經人類FAP穩定轉染之HEK293細胞作為靶細胞，將其洗滌並再懸浮於培養基中，在37℃下用新鮮製備之鈣黃綠素AM(Molecular Probes)染色30 min，洗滌3次，計數並稀釋至300.000個細胞/ml。將此懸浮液轉移至圓底96孔板(=30.000個細胞/孔)中，添加相應抗體稀釋液並培育10 min以促進測試抗體與細胞之結合，之後與效應細胞接觸。PBMC之效應子：靶標比率係25：1。實施4小時共培育。測定在受攻擊細胞崩解後乳酸脫氫酶(LDH)至上清液中之釋放作為讀出值。自共培養物上清液收集LDH並用LDH檢測套組(Roche Applied Science)分析。用ELISA吸收讀取器(SoftMaxPro軟件，參考波長：490 nm對650 nm)量測LDH酶之受質轉化。如圖24中所示，所測試所有抗-FAP抗體皆能夠誘導HEK293-hFAP細胞上之ADCC。糖改造(ge)形式之表現總是優於對應的野生型(wt)非糖改造形式。
儘管出於清晰理解之目的藉助闡釋及實例在某些細節上闡述了上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發明範圍。本文所引用所有專利及科學文獻之揭示內容皆全文以引用方式明確併入本文中。
<110>　瑞士商羅齊克雷雅公司
<120>　抗-FAP抗體及其使用方法
<130>　26953
<140>　100128607
<141>　2011-08-10
<150>　10172842.6
<151>　2010-08-13
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<170>　PatentIn version 3.5
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<400>　352
圖1展示對親和力成熟抗-FAP Fab片段之基於表面電漿共振(SPR)之動力學分析。圖中呈現純系19G1與人類(hu)FAP(A)及鼠類(mu)FAP(B)之結合、純系20G8與hu FAP(C)、mu FAP(D)之結合及純系4B9與hu FAP(E)及mu FAP(F)之結合的經處理動力學數據集。平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖2展示對親和力成熟抗-FAP Fab片段之基於SPR之動力學分析。圖中呈現純系5B8與hu FAP(A)及mu FAP(B)之結合、純系5F1與hu FAP(C)、mu FAP(D)之結合及純系14B3與hu FAP(E)及mu FAP(F)之結合之經處理動力學數據集。平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖3展示對親和力成熟抗-FAP Fab片段之基於SPR之動力學分析。圖中呈現純系16F1與hu FAP(A)及mu FAP(B)之結合、純系16F8與hu FAP(C)、mu FAP(D)之結合及純系O3C9與hu FAP(E)及mu FAP(F)之結合之經處理動力學數據集。平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖4展示對親和力成熟抗-FAP Fab片段之基於SPR之動力學分析。圖中呈現純系O2D7與hu FAP(A)及mu FAP(B)之結合、純系28H1與hu FAP(C)、mu FAP(D)、cyno FAP(E)之結合及純系22A3與hu FAP(F)、mu FAP(G)及食蟹猴(cyno) FAP(H)之結合之經處理動力學數據集。平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖5展示對親和力成熟抗-FAP Fab片段之基於SPR之動力學分析。圖中呈現純系29B11與hu FAP(A)、mu FAP(B)、cyno FAP(C)之結合及純系23C10與hu FAP(D)、mu FAP(E)及cyno FAP(F)之結合之經處理動力學數據集。平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖6展示對3F2(A)、4G8(B)及3D9(C)抗-FAP抗體以Fab片段形式與人類、小鼠及食蟹猴FAP結合之基於SPR的動力學分析。圖中呈現經處理動力學數據集，平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖7展示對3F2(A)、4G8(B)及3D9(C)抗-FAP抗體以人類IgG形式與人類、小鼠及食蟹猴FAP結合之基於SPR之動力學分析。圖中呈現經處理動力學數據集，平滑線代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中。
圖8展示以下之人類試樣之代表性照片：(A)使用2F3小鼠IgG2a抗體對FAP進行免疫組織化學染色的非小細胞肺癌(NSCLC)、(B)使用2F3小鼠IgG2a抗體對FAP進行免疫組織化學染色的結腸腺癌、(C)使用3D9小鼠IgG2a抗體對FAP進行免疫組織化學染色的結腸腺癌及(D)使用4G8小鼠IgG2a抗體對FAP進行免疫組織化學染色的結腸腺癌。在藉由所有抗體染色之所有試樣中之腫瘤基質中皆檢測到FAP(左圖)，而對於同種型對照抗體未觀察到染色(右圖)。
圖9展示人類IgG1抗-FAP抗體與經人類(A)或鼠類(B)FAP穩定轉染之HEK293細胞上表現之FAP的結合，如藉由FACS所測定。
圖10展示人類IgG1抗-FAP抗體與經穩定轉染HEK293細胞上表現之DPPIV(CD26)或HER2的結合，如藉由FACS所測定。使用抗-HER2抗體曲妥珠單抗及抗-CD26抗體作為陽性對照。使用二級抗體、對照IgG或根本無抗體(僅細胞)作為陰性對照。
圖11展示人類IgG1抗-FAP抗體與人類纖維母細胞(細胞系GM05389)上之FAP之結合，如藉由FACS所測定。使用二級抗體或根本無抗體作為陰性對照。
圖12展示人類IgG1抗-FAP抗體與人類纖維母細胞(細胞系GM05389)、不同人類腫瘤細胞系或經人類FAP穩定轉染之HEK293細胞之結合，如藉由FACS所測定。
圖13(A)及(B)展示GM05389肺纖維母細胞在與抗-FAP人類IgG1抗體3F2或4G8一起培育後之不同時間點，其表面上之FAP之表現程度，如藉由FACS所測定。未觀察到指示FAP內化之FAP表現程度之顯著降低。顯示單獨二級抗體作為陰性對照。
圖14呈現代表性免疫螢光影像，其顯示在與抗-FAP 4G8 IgG結合45 min(在4℃下)(A)、20 min(在37℃下)(B)、1小時(在37℃下)(C)或6小時(在37℃下)(D)後獲得的GM05389肺纖維母細胞上之質膜染色。用作同種型對照之抗-CD20抗體GA101顯示背景染色。EEA1標記早期核內體。註意，FAP表面質膜染色在抗-FAP4G8抗體結合後持續長達6小時。
圖15展示對野生型28H1人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖16展示對糖改造28H1人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖17展示對野生型29B11人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖18展示對糖改造29B11人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖19展示對野生型3F2人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖20展示對糖改造3F2人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖21展示對野生型4G8人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖22展示對糖改造4G8人類IgG之純化及分析。A)蛋白質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C)分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡述於實例1中。
圖23展示與親代4G8抗-FAP抗體之結合相比，親和力成熟抗-FAP抗體28H1與HEK293細胞上之人類FAP之結合。
圖24展示LDH釋放分析之結果，該分析利用HEK293-hFAP作為靶細胞且利用PBMNC作為效應細胞(F/F FcγRIIIa基因型)來測試由呈野生型(wt)及糖改造(ge)形式之抗-FAP IgG抗體28H1(親和力成熟)及4G8、3F8(親代)介導之ADCC。
(無元件符號說明)

Claims (40)

  1. 一種特異性結合纖維母細胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein(FAP))之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：267之胺基酸序列，及包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：265之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含免疫球蛋白之Fc區或等效於該Fc區之區域。
  3. 如請求項2之抗體，其中該Fc區係IgG Fc區。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體係全長IgG類抗體。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含人類恆定區。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體係人類抗體。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含糖改造之Fc區。
  8. 如請求項7之抗體，其中該抗體與非糖改造之抗體相比在該Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖。
  9. 如請求項7之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約100%之N-連接寡糖係非岩藻糖基化寡糖。
  10. 如請求項7之抗體，其中該抗體與非糖改造之抗體相比在該Fc區中具有提高比例之二等分型(bisected)寡糖。
  11. 如請求項7之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約100%之N-連接寡糖係二等分型寡糖。
  12. 如請求項7之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約50%之N-連接寡糖係二等分型非岩藻糖基化寡糖。
  13. 如請求項1之抗體，其中該抗體具有增強之效應子功能 及/或增強之Fc受體結合親和力。
  14. 如請求項13之抗體，其中該增強之效應子功能係增強之ADCC。
  15. 一種經分離之多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：267之序列之多肽及編碼包含SEQ ID NO：265之序列之多肽。
  16. 一種組合物，其包含第一經分離之多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：267之序列之多肽；及第二經分離之多核苷酸，編碼包含SEQ ID NO：265之序列之多肽。
  17. 一種載體，其包含如請求項15之多核苷酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項15之多核苷酸、如請求項16之組合物或如請求項17之載體。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其中該宿主細胞係經操作以表現升高之含量的一或多種具有GnTIII活性之多肽。
  20. 如請求項19之宿主細胞，其中該具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域及ManII之高爾基體定位結構域的融合多肽。
  21. 如請求項19或20之宿主細胞，其中該宿主細胞係經進一步操作以表現升高之含量的一或多種具有ManII活性之多肽。
  22. 一種產生特異性結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗體之方法，該方法包含a)如請求項18之宿主細胞在培養基中在允許表現該抗體之條件下培養，及b)回收該抗體。
  23. 一種產生特異性結合纖維母細胞活化蛋白(FAP)之抗體之方法，該方法包含a)在允許表現該抗體及允許該抗體之Fc區上存在之寡糖由該具有GnTIII活性之多肽修飾的條件下，在培養基中培養如請求項19至21中任一項之宿主細胞，及b)回收該抗體。
  24. 一種特異性結合FAP之抗體，其中該抗體係由如請求項22或23之方法產生。
  25. 一種抗體偶聯物(conjugate)，其包含如請求項1至14中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  26. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  27. 如請求項26之醫藥調配物，其進一步包含額外治療劑。
  28. 如請求項1或2之抗體，其用作藥劑。
  29. 如請求項1或2之抗體，其用於治療特徵在於表現FAP之疾病。
  30. 如請求項29之抗體，其中該疾病係癌症。
  31. 如請求項1或2之抗體，其用於誘導腫瘤細胞或腫瘤基質細胞之細胞溶解。
  32. 一種如請求項1至14中任一項之抗體之用途，其用於製造藥劑。
  33. 一種如請求項1至14中任一項之抗體或如請求項26或27之醫藥調配物之用途，其用於製造用以治療特徵在於表現FAP之疾病之藥劑。
  34. 如請求項33之用途，其中該藥劑包含其他治療劑或與該其他治療劑一起投與。
  35. 如請求項33或34之用途，其中該疾病係癌症。
  36. 一種如請求項1至14中任一項之抗體或如請求項26或27之醫藥調配物之用途，其用於製造用以誘導腫瘤細胞或腫瘤基質細胞溶解的藥劑。
  37. 如請求項36之用途，其中該細胞溶解係由該抗體之抗體依賴性細胞毒性誘導。
  38. 一種如請求項1至14中任一項之抗體之用途，其用於製造用以診斷特徵在於表現FAP之疾病之診斷劑，其中該診斷劑進一步包含允許檢測該抗體與FAP之複合體之標記。
  39. 一種診斷劑，其包含如請求項1至14中任一項之抗體及允許檢測該抗體與FAP之複合體之標記。
  40. 如請求項1或2之抗體，其係用於診斷或偵測之方法。
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Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2773515C (en) 2009-09-29 2015-04-28 Roche Glycart Ag Bispecific death receptor agonistic antibodies
CN105884898B (zh) 2010-08-13 2022-10-11 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
DK3075745T3 (en) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutated interleukin-2 polypeptides
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
KR101721301B1 (ko) 2011-08-23 2017-03-29 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항원 결합 분자
HUE038225T2 (hu) 2011-08-23 2018-10-29 Roche Glycart Ag Bispecifikus, T-sejtaktiváló antigénkötõ, molekulák
CA2844540C (en) 2011-08-23 2018-10-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
PL2882777T3 (pl) * 2012-08-07 2019-04-30 Roche Glycart Ag Kompozycja zawierająca dwa poddane obróbce przeciwciała ze zmniejszoną i zwiększoną funkcją efektorową
CA2876285A1 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US10087250B2 (en) 2012-10-08 2018-10-02 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
US20140242080A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105143270B (zh) 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
GB201402006D0 (en) 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
JP6306201B2 (ja) 2014-02-06 2018-04-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用
BR112016016658A2 (pt) * 2014-02-06 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag proteína de fusão de um anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, métodos para produzir uma proteína de fusão e de tratamento de uma doença em um indivíduo e uso da proteína de fusão
JP6983511B2 (ja) 2014-04-25 2021-12-17 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 脳中の転移乳癌および他の癌を処置するための方法および組成物
US10138295B2 (en) 2014-05-13 2018-11-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising AAV expressing dual antibody constructs and uses thereof
WO2016055432A2 (en) * 2014-10-08 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of bispecific antibodies specific for fap and dr5 and chemotherapeutic agents
HUE049982T2 (hu) 2014-11-14 2020-11-30 Hoffmann La Roche TNF-családba tartozó ligandum-trimert tartalmazó antigénkötõ molekulák
FI4141032T3 (fi) 2014-11-20 2024-07-31 Hoffmann La Roche T-solua aktivoivien bispesifisten antigeeniä sitovien molekyylien ja pd-1-akselia sitovien antagonistien yhdistelmähoito
AU2016205988A1 (en) * 2015-01-09 2017-07-13 Mabimmune Diagnostics Ag Novel anti-Fibroblast Activation Protein (FAP) antibodies and uses derived thereof
GB201500875D0 (en) * 2015-01-19 2015-03-04 Philogen Spa Antibodies for treatment and diagnosis
CN107207579B (zh) 2015-03-31 2022-02-25 豪夫迈·罗氏有限公司 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
MY192202A (en) 2015-10-02 2022-08-06 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
PE20180950A1 (es) * 2015-10-02 2018-06-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador
CN106928368B (zh) * 2015-12-30 2020-10-13 广西医科大学 一种FAP纳米抗体Nb57
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN106018780B (zh) * 2016-05-17 2017-12-26 扬州大学 一种基于f1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒
JP7012668B2 (ja) 2016-06-12 2022-02-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ジヒドロピリミジニルベンズアゼピンジカルボキサミド化合物
BR112019000015A2 (pt) 2016-06-30 2019-04-24 Oncorus, Inc. distribuição por vírus oncolítico pseudotipado de polipeptídeos terapêuticos
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
CN117752798A (zh) 2016-12-19 2024-03-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CA3039446A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
WO2018127473A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
MA47215A (fr) 2017-01-09 2019-11-13 Bioxcel Therapeutics Inc Procédés prédictifs et diagnostiques pour le cancer de la prostate
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
WO2018178076A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
JP7196094B2 (ja) 2017-03-29 2022-12-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体のための二重特異性抗原結合分子
CN117003887A (zh) 2017-04-03 2023-11-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗pd-1抗体与突变体il-2或与il-15的免疫缀合物
MX2019011907A (es) * 2017-04-04 2020-01-09 Hoffmann La Roche Nuevas moleculas de union a antigeno biespecificas capaces de unirse especificamente a cd40 y a fap.
CN110506059B (zh) 2017-04-05 2023-01-17 豪夫迈·罗氏有限公司 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
MX2019012187A (es) 2017-04-13 2019-11-25 Hoffmann La Roche Un inmunoconjugado de interleuquina-2, un agonista de cd40 y opcionalmente un antagonista de union al eje pd-1 para uso en metodos para tratar cancer.
JP2020535145A (ja) 2017-09-25 2020-12-03 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド 癌治療のための方法及び組成物
EP3687546A4 (en) 2017-09-26 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEART DISEASE WITH REDIRECTED T-LYMPHOCYTE IMMUNOTHERAPIES
EP3703746A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
KR20200079492A (ko) 2017-11-01 2020-07-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 2+1 컨터체
TW201930353A (zh) 2017-11-01 2019-08-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用經靶向之ox40促效劑的組合療法
CN109796532B (zh) * 2017-11-17 2024-09-10 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
JP2021508477A (ja) 2017-12-29 2021-03-11 オンコラス， インコーポレイテッド 治療用ポリペプチドの腫瘍溶解性ウイルス送達
CN118754990A (zh) * 2018-02-05 2024-10-11 奥里尼斯生物科学公司股份有限公司 成纤维细胞结合剂及其用途
BR112020015568A2 (pt) 2018-03-13 2020-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e método para tratar ou retardar a progressão do câncer
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
SG11202007961QA (en) 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
BR112020023299A2 (pt) * 2018-05-16 2021-02-02 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteína de ligação nkg2d, cd16 e uma proteína de ativação de fibroblastos
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
JP2022511396A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子
PE20211863A1 (es) 2018-10-01 2021-09-21 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap
US20200223925A1 (en) 2018-12-21 2020-07-16 Hoffmann-La Roche Inc. Tumor-targeted superagonistic cd28 antigen binding molecules
EP3898682A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
WO2020208049A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins
CN114127123A (zh) 2019-06-26 2022-03-01 豪夫迈·罗氏有限公司 结合cea的抗体与4-1bbl的融合
EP3990492A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
EP3763726A1 (en) 2019-07-08 2021-01-13 3B Pharmaceuticals GmbH Compounds comprising a fibroblast activation protein ligand and use thereof
CN114341158B (zh) 2019-07-08 2024-08-06 3B制药有限公司 包含成纤维细胞活化蛋白配体的化合物及其用途
DK3997103T3 (da) 2019-07-08 2024-12-02 3B Pharmaceuticals Gmbh Forbindelser med fibroplast-aktiverende proteinligand og anvendelse deraf
BR112022005404A2 (pt) 2019-09-23 2022-06-21 Univ Pennsylvania Anticorpo monoclonal contra a proteína de ativação de fibroblastos canina que reage de forma cruzada com a proteína de ativação de fibroblastos de camundongo e humana (fap)
JP7621344B2 (ja) 2019-09-23 2025-01-24 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）を標的とすることによる腫瘍組織の破壊の方法
WO2021142086A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Synthis Therapeutics, Inc. Alk5 inhibitor conjugates and uses thereof
CA3162009A1 (en) 2020-01-09 2021-07-15 F. Hoffmann-La Roche Ag New 4-1bbl trimer-containing antigen binding molecules
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
AU2021272340A1 (en) 2020-05-11 2022-12-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with modified pbmcs and an immunoconjugate
US20230250193A1 (en) * 2020-06-17 2023-08-10 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Antibodies to fibroblast activation protein and b7h3
CN115702168A (zh) 2020-06-23 2023-02-14 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向Her2的激动性CD28抗原结合分子
CN115916830A (zh) 2020-06-25 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd3/抗cd28双特异性抗原结合分子
CN112540176B (zh) * 2020-07-08 2021-09-28 深圳霁因生物医药转化研究院 用于诊断fap表达异常相关疾病的试剂盒、方法及计算机可读存储介质
MX2023000883A (es) 2020-07-24 2023-02-22 Genentech Inc Metodos para la expresion de una fusion anticuerpo-multimero.
US20230295258A1 (en) 2020-08-11 2023-09-21 Kanaph Therapeutics Inc. Fusion protein comprising il-12 and anti-fap antibody, and use thereof
JP2023549316A (ja) 2020-11-16 2023-11-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｆａｐを標的としたｃｄ４０アゴニストとの併用療法
EP4050018A1 (en) 2021-01-07 2022-08-31 3B Pharmaceuticals GmbH Compounds comprising a fibroblast activation protein ligand and use thereof
KR20230129261A (ko) 2021-01-07 2023-09-07 쓰리비 파마슈티컬스 게엠베하 섬유모세포 활성화 단백질 리간드를 포함하는 화합물및 그의 용도
US20240376171A1 (en) 2021-03-30 2024-11-14 Hoffmann-La Roche Inc. Protease-activated polypeptides
EP4323531A1 (en) 2021-04-12 2024-02-21 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
WO2023113806A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Affinia Therapeutics, Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
EP4326779A1 (en) * 2021-04-23 2024-02-28 Philogen S.p.A. Anti-fibroblast activation protein antibodies
IL308404A (en) 2021-04-27 2024-01-01 Generation Bio Co Non-viral DNA vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
EP4148067A1 (en) 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
EP4426735A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
EP4448560A1 (en) 2021-12-14 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a hla-a2/mage-a4 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
CR20240246A (es) 2021-12-20 2024-07-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos agonistas anti-ltbr y anticuerpos biespecificos que los comprenden
IL314831A (en) 2022-02-11 2024-10-01 Kanaph Therapeutics Inc Pharmaceutical composition for cancer treatment comprising fusion protein including il-12 and anti-fap antibody and anticancer agent
AU2023235112A1 (en) 2022-03-14 2024-10-17 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
WO2023186756A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon gamma variants and antigen binding molecules comprising these
CN114685673A (zh) * 2022-03-29 2022-07-01 深圳医爱健康管理有限公司 成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
KR20230162310A (ko) 2022-05-20 2023-11-28 주식회사 카나프테라퓨틱스 Light 단백질 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2024027771A1 (zh) * 2022-08-03 2024-02-08 南京维立志博生物科技有限公司 靶向FAP和TGFβ的抗体融合蛋白及其用途
WO2024074727A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genethon Immunotherapy of skeletal myopathies using anti-fap car-t cells
WO2024120199A1 (en) * 2022-12-08 2024-06-13 Analytical Biosciences Shanghai Limited Bispecific/multi-specific antibodies and uses thereof
WO2024184287A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an anti-egfrviii/anti-cd3 antibody and an tumor-targeted 4-1bb agonist
WO2024188966A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-hla-g/anti-cd3 bispecific antibody and a 4‑1bb (cd137) agonist
WO2024208776A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic split antibodies
WO2024208777A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag All-in-one agonistic antibodies
WO2024246083A1 (en) 2023-06-01 2024-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies targeting bcma and cd28
WO2024246086A1 (en) 2023-06-01 2024-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunostimulatory antigen binding molecules that specifically bind to bcma
WO2024261013A1 (en) 2023-06-21 2024-12-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with fap-targeted lymphotoxin beta receptor agonists
CN118496382B (zh) * 2024-05-22 2025-01-07 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种靶向fap的嵌合抗原受体、car-t细胞及其在肝纤维化中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030143229A1 (en) * 1998-04-30 2003-07-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPalpha -specific antibody with improved producibility
WO2007077173A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
AU2782292A (en) 1991-09-18 1993-04-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Activated stromal fibroblast-specific antibody, f19 and methods of using the same
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
EP0953639A1 (en) * 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
MX353234B (es) 1999-01-15 2018-01-08 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con función efectora alterada.
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
BR0014480A (pt) 1999-10-04 2002-06-11 Medicago Inc Método para regular a transcrição de genes estranhos
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
PT1242438E (pt) 1999-12-29 2007-02-28 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo dixorrubicinas e daunorrubicinas modificadas e seu uso terapêutico
CA2401252A1 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Human and humanized fap-alpha-specific antibodies
IL151853A0 (en) 2000-04-11 2003-04-10 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
JP4936299B2 (ja) 2000-08-21 2012-05-23 メレクシス・テクノロジーズ・ナムローゼフェンノートシャップ 磁場方向検出センサ
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
JP4290423B2 (ja) 2000-10-06 2009-07-08 協和発酵キリン株式会社 抗体組成物を生産する細胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2002358296C1 (en) 2001-12-27 2009-01-22 Glycofi, Inc. Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
MXPA04009924A (es) 2002-04-09 2005-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas de genoma modificado.
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
ATE472604T1 (de) 2002-09-12 2010-07-15 Greenovation Biotech Gmbh Verfahren zur herstellung von proteinen
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
WO2004057002A2 (en) 2002-12-20 2004-07-08 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1587921B1 (en) 2003-01-22 2010-07-28 GlycArt Biotechnology AG Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
PT2380910E (pt) 2003-11-05 2015-11-26 Roche Glycart Ag Moléculas de ligação ao antigénio com uma maior afinidade de ligação ao recetor de fc e uma melhor função efetora
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7521541B2 (en) 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
CA2773515C (en) 2009-09-29 2015-04-28 Roche Glycart Ag Bispecific death receptor agonistic antibodies
JP2013506664A (ja) * 2009-10-02 2013-02-28 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ リミテッド 抗線維芽細胞活性化タンパク質抗体並びにその方法及び使用
CN105884898B (zh) * 2010-08-13 2022-10-11 罗切格利卡特公司 抗成纤维细胞激活蛋白抗体及使用方法
DK3075745T3 (en) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutated interleukin-2 polypeptides
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
PL2882777T3 (pl) 2012-08-07 2019-04-30 Roche Glycart Ag Kompozycja zawierająca dwa poddane obróbce przeciwciała ze zmniejszoną i zwiększoną funkcją efektorową
CA2876285A1 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
MX2015014538A (es) 2013-05-07 2016-02-05 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigenos trimericas.
WO2016055432A2 (en) 2014-10-08 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of bispecific antibodies specific for fap and dr5 and chemotherapeutic agents

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030143229A1 (en) * 1998-04-30 2003-07-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPalpha -specific antibody with improved producibility
WO2007077173A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Melvyn Little,Recombinant antibodies for immunotherapy,2009. Michael MERSMANN et al, Int. J. Cancer: 92, 240–248 (2001) *

Also Published As

Publication number Publication date
PE20171512A1 (es) 2017-10-20
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EA201300239A1 (ru) 2013-08-30
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