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KR20230162310A - Light 단백질 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Light 단백질 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230162310A
KR20230162310A KR1020220062018A KR20220062018A KR20230162310A KR 20230162310 A KR20230162310 A KR 20230162310A KR 1020220062018 A KR1020220062018 A KR 1020220062018A KR 20220062018 A KR20220062018 A KR 20220062018A KR 20230162310 A KR20230162310 A KR 20230162310A
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KR
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gly
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KR1020220062018A
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이다혜
유수민
장지훈
이병철
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주식회사 카나프테라퓨틱스
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Abstract

LIGHT 단백질 및 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질은 항암 효과를 나타낼 수 있다. 특히, 상기 융합단백질은 FAP을 과발현하는 암세포를 효율적으로 타겟하고, LIGHT이 림포톡신베타 수용체 및 HVEM에 결합하여 삼차 림프 구조 형성을 촉진하고 혈관을 정상화시킬 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 면역세포를 종양 조직내로 효율적으로 침투시킴으로써 암을 효과적으로 치료할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질은 항-PD-1 항체와 병용 투여할 경우 각각을 투여할 경우에 비해 암을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.

Description

LIGHT 단백질 및 항-FAP 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING LIGHT PROTEIN AND ANTI-FAP ANTIBODY AND USE THEREOF}
본 발명은 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체; 및 항-FAP 항체를 포함하는 신규한 융합단백질 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
LIGHT 단백질은 TNFSF14로도 알려져 있으며, TNF 수퍼패밀리의 동종삼량체로 존재하는 당단백질이다. LIGHT 단백질은 활성화된 림프구, NK 세포, 미성숙 수지상 세포, 단핵구 및 과립구에 발현되며, 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체(Herpes virus entry mediator, HVEM/TNFRSF14)와 림포톡신 베타 수용체(Lymphotoxin beta receptor, LTβR)에 결합하고, 이를 활성화시킨다. 이러한 기작으로 Th1 면역 반응을 공동 자극하고, CD8+ T 세포 매개 종양 면역을 강화할 뿐만 아니라, T 세포를 활성화하고, 동종 이식 거부 반응을 조절한다. 특히, LIGHT 단백질은 림프 세포의 활성화, 혈관 정상화 및 헤르페스 바이러스 감염 억제에 관여하는 것으로 알려져 있다.
한편, 섬유아세포 활성 단백질(Fibroblast activation protein alpha, FAPα)은 활성화된 섬유아세포 상에서 발현된 젤라티나아제이다. FAP은 전립선암 및 췌장암을 포함한 다양한 인간 암종의 암 관련 섬유아세포에서 90% 이상 발현되는 것으로 알려져 있다. 이에, 최근 들어 FAP 발현 세포를 표적화하는 면역 요법을 개발하는데 관심이 급증하고 있다(Fang J. et.al., Mol. Ther. Oncolytics., 3:16007, 2016).
Fang J. et.al., Mol. Ther. Oncolytics., 3:16007, 2016
이에 본 발명자들은 항암 효과를 가지는 신규한 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, LIGHT 단백질 및 항-FAP 항체를 포함한 융합단백질이 전신 독성을 줄이면서 항암 활성이 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, FAP(Fibroblast activation protein alpha)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
LIGHT 단백질 및 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질은 항암 효과를 나타낼 수 있다. 특히, 상기 융합단백질은 FAP을 과발현하는 암세포를 효율적으로 타겟하고, LIGHT 단백질이 림포톡신 베타 수용체 및 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체에 결합하여 삼차 림프 구조 형성을 촉진하고 혈관을 정상화시킬 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 면역세포를 종양 조직내로 효율적으로 침투시킴으로써 암을 효과적으로 치료할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질은 항-PD-1 항체와 병용 투여할 경우 각각을 투여할 경우에 비해 암을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.
도 1은 일 실시예에 따른 T3.01, T3.02, T3.03, T3.04, T3.05 및 T3.06에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 T3.07, T3.08, T3.09, T3.10, T3.11 및 T3.13에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 T3.14, T3.15, T3.16, T3.17 및 T3.18에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 T3.01m, T3.02m, T3.05m, T3.06m, T3.07m 및 T3.08m에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 T3.10m, T3.11m, T3.12m, T3.13m, T3.14m 및 T3.19m에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 a) 항-FAP/scLIGHT3 이중 특이적 항체, b) LIGHT가 Fc의 C 말단에 결합된 항-FAP/scLIGHT3 이중 특이적 항체, c) LIGHT가 Fc의 C 말단에 결합된 항-FAP/scLIGHT2 이중 특이적 항체, d) 항-FAP/scLIGHT-LTβ2 이중 특이적 항체의 모식도이다.
도 7a 내지 도 7c는 일 실시예에 따른 재조합 FAP(recombinant human FAP, rhFAP)에 대한 T3.01, T3.07 및 T3.14의 결합력을 표면플라즈몬 공명 분석 방법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 8a 내지 도 8e는 일 실시예에 따른 LIGHT 수용체 LTβR에 대한 T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 결합력을 표면플라즈몬 공명 분석 방법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 9a 내지 도 9e는 일 실시예에 따른 LIGHT 수용체 HVEM에 대한 T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 결합력을 표면플라즈몬 공명 분석 방법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 10a 내지 도 10e는 일 실시예에 따른 LIGHT 수용체 DcR3에 대한 T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 결합력을 표면플라즈몬 공명 분석 방법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 11은 HEK293-hFAP 세포 및 HEK293 세포에 대한 T3.10, T3.01, T3.05, T3.06, T3.14 및 T3.18의 결합력을 유세포 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 12는 B16F10-mFAP 세포 및 B16F10 세포에 대한 T3.10m 및 T3.01m의 결합력을 유세포 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 13a는 A375 세포에 대한 T3.10, T3.01, T3.07, T3.04 및 T3.18의 결합력을 유세포 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 13b는 A375 세포에 대한 T3.10, T3.01, T3.07, T3.04 및 T3.18의 결합력을 농도별 평균형광강도(Mean fluorescence intensity, MFI)로 나타낸 그래프이다.
도 14a는 T3.10, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17 및 T3.18과 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체(Herpes virus entry mediator, HVEM)와의 결합력을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 14b는 T3.10, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17 및 T3.18과 림포톡신 베타 수용체(Lymphotoxin beta receptor, LTβR)와의 결합력을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 14c는 T3.10, T3.05, T3.06, T3.04 및 T3.14와 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체와의 결합력을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 14d는 T3.10, T3.05, T3.06, T3.04 및 T3.14와 림포톡신 베타 수용체와의 결합력을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 15a는 rhLIGHT, T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10에 의한 A375 세포주의 사이토카인 IL-8 분비능을 측정한 그래프이다.
도 15b는 rhLIGHT, T3.01, T3.07, T3.18 및 T3.10에 의한 A375 세포주의 사이토카인 IL-8 분비능을 측정한 그래프이다.
도 16a는 T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10에 의한 인간 T 세포의 사이토카인 IFN-γ 분비능을 측정한 그래프이다.
도 16b는 T3.01, T3.07, T3.04, T3.18 및 T3.10에 의한 인간 T 세포의 사이토카인 IFN-γ 분비능을 측정한 그래프이다.
도 17a는 TNF-α, T3.01m 및 T3.10m의 LIGHT 활성을 NIH-3T3 NFκB 리포터 세포에서의 발광도를 통해 확인한 그래프이다.
도 17b는 T3.10, T3.01, T3.04, T3.14 및 T3.15의 LIGHT 활성을 NIH-3T3 NFκB 리포터 세포에서의 발광도를 통해 확인한 그래프이다.
도 18a는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체에 의한 종양 성장 억제 정도를 확인하기 위해 개체별 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18b는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직으로부터 면역세포를 분리하고, 종양 내 면역세포의 분포도를 유세포분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 18c는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직으로부터 면역세포를 분리하고, 종양 내 면역세포의 CCR7 발현 정도를 유세포분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 18d는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직을 면역조직화학염색을 통해 고내피세정맥(High endothelial venule, HEV)의 마커 MECA-79의 발현을 나타낸 결과이다.
도 18e는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직을 면역조직화학염색을 통해 CD3, CD19 및 고내피세정맥의 마커 MECA-79의 발현을 수치화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 19a는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m의 용량 의존적인 종양 성장 억제 정도를 확인하기 위해 개체별 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19b는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m의 용량 의존적인 종양 성장 억제 정도를 확인하기 위해 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19c는 FAP 과발현 대장암 CT26-mFAP 세포주가 이식된 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.01m을 처리한 후, 부작용 확인을 위해 마우스의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20a는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리 후 개체별 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20b는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20c는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m을 처리한 후, 부작용 확인을 위해 마우스의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20d는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리 후 12일째에 마우스의 종양조직을 수확하고, 그 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20e는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리 후 12일째에 마우스의 수확된 종양조직을 면역조직화학염색을 통해 고내피세정맥 마커인 MECA-79의 발현과 면역세포의 분포를 나타낸다.
도 20f는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리 후 12일째에 마우스의 수확된 종양조직을 면역조직화학염색을 통해 고내피세정맥 마커인 MECA-79의 발현과 면역세포의 분포를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 20g는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직을 면역형광조직화학염색을 통해 고내피세정맥 마커인 MECA-79의 발현과 면역세포의 분포를 나타낸다.
도 20h는 FAP 과발현 흑색종 B16F10-mFAP 세포주가 이식된 마우스 모델에 대해 일 실시예에 따른 T3.01m, 항-PD-1 항체 및 T3.01m/항-PD-1 항체를 처리한 후 12일째에 수확된 종양조직을 면역형광조직화학염색을 통해 고내피세정맥 마커인 MECA-79의 발현과 면역세포의 분포를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 21은 FAP 과발현 섬유아세포 NIH-3T3-mFAP 및 폐암 세포주 LLC1을 공동주입한 마우스 종양 모델에서 일 실시예에 따른 T3.13m, T3.11m, T3.01m 또는 anti-PD1을 각각 또는 동시투여 처리 후, 종양의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 22는 LIGHT 및 림포톡신(Lymphotoxin, LT) 단백질을 포함하는 이종삼량체의 예를 나타낸 표이다.
FAP 항원결합부위 및 LIGHT 단백질을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, FAP(Fibroblast activation protein alpha)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다.
상기 융합단백질은 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제1 단량체; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 이때, LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체는 제1 단량체의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 이때, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 제2 단량체의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것일 수 있다.
LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체
본 명세서에서 사용된 용어, "LIGHT 단백질"은 TNFSF14로도 알려져 있으며, 동종삼량체로 존재하는 당단백질이다. 상기 LIGHT 단백질은 HVEM/TNFRSF14에 결합하여 이를 활성화하여 면역 반응을 증진시키는 것일 수 있다. 또한, LIGHT 단백질은 LTβ 수용체/TNFRSF3에 결합하여 사이토카인 생성, 림프절 조직 형성, 림프절 구조 및 기능 유지를 증진시키는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 LIGHT 단백질은 동종삼량체를 구성하는 하나의 단량체, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 지칭할 수 있다. 또한, 상기 LIGHT 단백질은 LIGHT 단량체, LIGHT 이량체 또는 LIGHT 삼량체를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질은 수용성일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헤르페스 바이러스 엔트리 매개체(herpesvirus entry mediator, HVEM)"은 단순포진바이러스(herpesvirus, HSV)의 감염 매개 수용체이다. HSV 당단백질은 HVEM 수용체에 결합한다. LIGHT 단백질은 HVEM/TNFRSF14에 결합하여 면역 반응을 증진시키고, T 세포의 활성화를 촉진시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서, LIGHT 단백질은 LIGHT 단백질의 일 단량체, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 LIGHT 단백질은 서열번호 77 또는 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 LIGHT 단백질의 단량체 또는 이의 단편일 수 있다.
또한, 상기 LIGHT 단백질은 서열번호 78 및 서열번호 93으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 92 또는 서열번호 93의 아미노산 서열에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 치환이 일어난 것일 수 있다. 더불어, 서열번호 78 또는 서열번호 93의 아미노산 서열과 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 118번째, 119번째, 195번째, 196번째, 198번째 및 226번째 내지 231번째로 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 (i) 226번째 내지 231번째; (ii) 118번째 내지 119번째; 또는 (iii) 195번째, 196번째 및 198번째 아미노산 서열이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 L118K, G119E, R195S, V196N, W198F, R226D, L227Y, R228T, D229K, G230E 및 T231D으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환이 일어난 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 78의 아미노산 서열에서 (i) R226D/L227Y/R228T/D229K/G230E/T231D; (ii) L118K/G119E; 또는 (iii) R195S/V196N/W198F의 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다. 이때, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 81, 서열번호 83 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 93의 아미노산 서열에서 194번째, 195번째, 197번째 및 225번째 내지 230번째의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 93의 아미노산 서열에서 (i) 194번째, 195번째 및 197번째 또는 (ii) 225번째 내지 230번째의 아미노산 서열이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 93의 아미노산 서열에서 R194N, V195N, W197F, R225D, P226Y, R227T, D228K, G229E 및 T230D로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환이 일어난 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 93의 아미노산 서열에서 (i) R194N/V195N/W197F 또는 (ii) R225D/P226Y/R227T/D228K/G229E/T230D의 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다. 이때, 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 96 또는 서열번호 98의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 LIGHT 단백질의 변이체는 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 동종다량체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "동종다량체"는 같은 종류의 단백질이 복수 개 결합되어 있는 복합체를 의미한다. 상기 단백질은 같은 종류의 단백질이 2개 연결되어 있는 동종이량체, 같은 종류의 단백질이 3개 연결되어 있는 동종삼량체일 수 있다. 본 명세서에서, 동일하지 않은 LIGHT 단백질의 단량체가 복수 개 결합되어 있는 경우도 동종다량체라고 정의한다. 예를 들어, LIGHT 단백질 및 이의 변이체가 결합되어 있는 경우에도 동종다량체이다.
일 구체예에 있어서, LIGHT 단백질의 동종다량체는 동종이량체 또는 동종삼량체일 수 있다.
상기 동종다량체는 서열번호 78, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 93, 서열번호 96 또는 서열번호 98의 아미노산 서열로 구성된 단량체를 포함하는 동종다량체일 수 있다. 구체적으로, 동종이량체 또는 동종삼량체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 동종다량체는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 97 및 서열번호 99로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 LIGHT 단백질은 LT(lymphotoxin) 단백질 또는 이의 변이체가 추가적으로 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 LIGHT 단백질은 상기 LIGHT 단백질에 LTα(lymphotoxin-α) 또는 LTβ(lymphotoxin-β) 단백질이 결합된 이종다량체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "LT(lymphotoxin) 단백질"은 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼 패밀리의 구성원이며, 림프구의 성장과 기능을 조절하고 신체의 다양한 세포에 의해 발현된다. LT 단백질은 LTα(lymphotoxin-α) 및/또는 LTβ(lymphotoxin-β)로 구성될 수 있다. 또한, LT 단백질은 삼량체로 존재할 수 있다. 상기 삼량체는 동종삼량체 또는 이종삼량체일 수 있으며, 구체적으로, LTα 단량체가 3개 결합된 동종삼량체인 LTα3 또는 LTβ 단량체가 3개 결합된 동종삼량체인 LTβ3 일 수 있다. 또한, LTα 단량체가 1개, LTβ 단량체가 2개 결합된 이종삼량체인 LTα1LTβ2 일 수 있다. 또한, LTα 단량체가 2개, LTβ 단량체가 1개 결합된 이종삼량체인 LTα2LTβ1일 수 있다.
본 명세서에서, LT 단백질은 LTα 또는 LTβ 단백질 단량체, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 총칭한다. 일 구체예에 있어서, LT 단백질은 LTβ 단량체 단백질일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질은 상기 LIGHT 단백질의 동종다량체에 LT 단백질 또는 이의 단편이 결합될 수 있다. 이때, 상기 LT 단백질은 LTα 또는 LTβ 단백질의 단량체일 수 있으며, LTα 및 LTβ 단백질을 포함하는 다량체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LTβ 단백질은 서열번호 87의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 LTβ 단백질은 서열번호 88의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 일 구체예에 있어서, 상기 LTβ 단백질은 서열번호 289의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 LTβ 단백질은 서열번호 290의 아미노산 서열일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LT 단백질 또는 이의 변이체의 동종이량체는 서열번호 288 또는 서열번호 291번의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 LIGHT 단백질은 상기 LIGHT 단백질의 단량체에 LT 단백질의 동종이량체가 결합된 것일 수 있다. 이때, 상기 LIGHT 단백질의 동종다량체는 서열번호 78, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 93, 서열번호 96 및 서열번호 98으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, LT 단백질의 동종이량체는 서열번호 288 또는 서열번호 291번의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 동종다량체는 펩타이드 링커로 연결된 것일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 서열번호 120 내지 서열번호 126로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 상기 이종이량체는 후술하는 바와 같다.
LIGHT 단백질 및 LT 단백질의 이종다량체
본 발명의 일 측면은, LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체 및 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 이종다량체를 제공한다. 이때, LIGHT 단백질 및 LT 단백질은 펩타이드 링커로 연결된 것일 수 있다.
LIGHT 단백질, LT 단백질, 이의 단편 또는 이의 변이체 및 다량체는 상술한 바와 같다.
상기 이종다량체는 LIGHT 단백질 및 LTβ 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 이종다량체는 서열번호 78, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 93, 서열번호 96 및 서열번호 98로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 LIGHT 단백질 단편 또는 이의 변이체; 및 서열번호 88 또는 서열번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 LTβ 단백질의 단편 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 이종다량체는 LIGHT 단백질 및 LT 단백질을 포함하는 이종이량체일 수 있다.
또한, 상기 이종다량체는 LIGHT 단백질 및 LT 단백질을 포함하는 이종삼량체일 수 있다. 구체적으로, 상기 이종삼량체는 2개의 LIGHT 단백질 및 1개의 LT 단백질; 또는 1개의 LIGHT 단백질 및 2개의 LT 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 이종다량체는 하기 구조식 (A)로 구성된 것일 수 있다.
N'-Y1-[링커(1)]n-Y2-[링커(2)]m-(Y3)a-C' (A)
이때, 상기 구조식 (A)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 Y1, Y2 및 Y3는 각각 LIGHT 단백질의 단편 또는 이들의 변이체; 또는 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체이며,
이때, Y1, Y2 및 Y3는 적어도 하나의 LIGHT 단백질의 단편 또는 이들의 변이체; 및 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체;를 포함하여야 하고,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이며,
상기 n, m, 및 a는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
일 구체예에 있어서, 상기 이종다량체는 a 및 m이 각각 0이고, n이 1인 구조식 (A)의 구조를 갖는 이종이량체일 수 있다. 이때, Y1은 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체이고, Y2는 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 이종다량체는, LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체이고, Y2는 LTβ 단백질의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 이때, 상기 이종이량체의 Y1은 서열번호 78, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 93, 서열번호 96 또는 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하고, Y2는 서열번호 88 또는 서열번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 이종다량체는 a, n 및 m이 각각 1인 구조식 (A)의 구조를 갖는 이종삼량체일 수 있다.
이때, 상기 이종삼량체의 Y1 내지 Y3은 하기 중 하나의 조합일 수 있다(도 22 참조):
(i) Y1 및 Y2가 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y3이 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체;
(ii) Y1이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y2 및 Y3이 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체;
(iii) Y1이 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y2 및 Y3이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체;
(iv) Y1 및 Y2가 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y3이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체;
(v) Y1 및 Y3이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y2가 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체; 또는
(vi) Y1 및 Y3이 LT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y2가 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체.
일 구체예에 있어서, 상기 이종삼량체는 Y1이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y2 및 Y3이 LTβ 단백질의 단편 또는 이의 변이체; 또는 Y1 및 Y2가 LTβ 단백질의 단편 또는 이의 변이체, Y3이 LIGHT 단백질의 단편 또는 이의 변이체인 것일 수 있다. 이때, 상기 이종삼량체는 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
FAP 및 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위
본 명세서에서 사용된 용어, "FAP(Fibroblast activation protein)"은 세포 표면에서 발현되고 다양한 종양 유형의 종양 세포 또는 다양한 종양 유형의 종양 세포 환경에서 제시되는 단백질인 섬유아세포 활성화 단백질을 지칭한다. FAP은 종양 미세환경의 종양-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 표면에 선택적으로 과발현하고 있는 것으로 알려져 있다.
또한, FAP은 효소 촉매 도메인이 위치하는 C-말단 세포외 도메인을 갖는 2개의 N-글리코실화된 서브유닛을 함유하는 동종이량체로, 글리코실화된 형태의 FAP은 포스트(post)-프롤릴 다이펩티딜 펩티다제 및 젤라티나제(gelatinase) 활성 모두를 갖는다.
한편, FAP은 프롤릴 엔도 펩티다아제(Prolyl endopeptidase)로서, 약 170 kDa의 막에 결합된 겔라티나제(gelatinase)이다. 상기 Prolyl endopeptidase FAP은 특정 아미노산 서열을 인지하여 절단할 수 있다. 이에 따라, FAP은 FAPα, 세파라제(separase), 또는 순환 항플라스민-절단 효소(circulating antiplasmin-cleaving enzyme)로도 명명된다.
상기 FAP의 아미노산 서열은 GenBank accession No. AAC51668에 기재된 것일 수 있으며, 인간 FAP은 단일클론 항체(mAb) F19(국제특허출원 공개 제WO 93/05804호 참조)의 사용을 통해 배양된 섬유아세포에서 처음으로 확인되었다. FAP은 많은 암들에서 발현되고 정상 조직에서의 제한된 발현으로 인해 다양한 암종의 영상화, 진단 및 치료를 위한 기대되는 항원성 표적으로 활용된다.
상기 FAP은 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 FAP 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 인간 FAP의 임의의 변이체, 동형 및 종 상동체를 포함한다. 본 발명의 항체는 암세포(종양 세포 또는 종양 간질의 세포)의 막 또는 세포 표면 상에 존재하는 FAP에 결합할 수 있고, ADCC 또는 다른 이펙터 매개된 암세포의 사멸을 유발할 수 있다. 또한, FAP의 효소 활성(예를 들면, 세린 펩티다제, 젤라티나제, 콜라게나제 활성), FAP 매개된 ECM 분해, 및 FAP 매개된 세포 침습 또는 이동을 차단하는 데에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 결합 활성을 갖지 않는 표적과 유사한 대조군 분자와 경쟁함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합 부위(Epitope)"는 항체의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정인자를 지칭한다. 상기 항원 결합 부위는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹이며, 보통 특이적 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 하전 특징을 가진다. 상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 FAP에 특이적으로 항원-항체 결합을 할 수 있는 분자를 총칭할 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 단편은 FAP과 특이적으로 결합할 수 있는 항원결합도메인을 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.
상기 항원 결합 부위는 결합에 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산, 또는 항원 결합 부위의 아미노산 잔기에 의해 효과가 차단되는 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 결합 부위는 FAP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 및 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 지칭한다. 면역글로불린 분자는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY 또는 이의 하위부류(subclass)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 합성 항체, 모노클로날 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabody), scFv(예를 들어, 단일특이적 및 이중특이적 등을 포함함), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-연결 Fv(sdFv), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 및 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체 단편"은 항체의 일부, 예컨대, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv일 수 있다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 온전한(intact) 항체에 의해 인지되는 동일한 항원과 결합한다.
일 구체예에 있어서, 상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 101의 HCDR1, 서열번호 102의 HCDR2 및 서열번호 103의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 104의 LCDR1, 서열번호 105의 LCDR2, 서열번호 106의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 이때, 일 구체예로, 상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 107의 중쇄가변영역 및 서열번호 108의 경쇄가변영역을 가질 수 있다.
또한, 일 구체예로 서열번호 109의 HCDR1, 서열번호 110의 HCDR2 및 서열번호 111의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 112의 LCDR1, 서열번호 113의 LCDR2, 서열번호 114의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 이때, 일 구체예로 상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 115의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 116의 경쇄가변영역을 가질 수 있다.
또한, 상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 공지된 항-FAP 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항-FAP 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 알려진 항체를 제한 없이 의미할 수 있다.
상기 항-FAP 항체 또는 이의 단편은 NG-641, AMG-506/MP-0310, RG-7827의 28H1, RG-7827의 4B9, OMTX-705, 3F2, 4G8, 3D9, 4B3, 19G1, 20G8, 5B8, 5F1, 14B3, 16F1, 16F8, O3C9, 29B11, O2D7 및 23C10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
다른 한가지 예로, 상기 항체는 한국공개특허 KR 20200037826 A, 미국공개특허 US 2020-0385488 A1, 미국등록특허 US 3,924,445 B2, 미국등록특허 US 9,011,847 B2 또는 미국공개특허 US 2017-007716 A1에 개시된 항-FAP 항체 또는 이의 단편을 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 NG-641의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 127의 HCDR1, 서열번호 128의 HCDR2, 서열번호 129의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 130의 LCDR1, 서열번호 131의 LCDR2, 서열번호 132의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 248의 중쇄가변영역 및 서열번호 249의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 28H1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 133의 HCDR1, 서열번호 134의 HCDR2, 서열번호 135의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 136의 LCDR1, 서열번호 137의 LCDR2, 서열번호 138의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 250의 중쇄가변영역 및 서열번호 251의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 4B9의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 139의 HCDR1, 서열번호 140의 HCDR2, 서열번호 141의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 142의 LCDR1, 서열번호 143의 LCDR2, 서열번호 144의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 252의 중쇄가변영역 및 서열번호 253의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 OMTX-705의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 145의 HCDR1, 서열번호 146의 HCDR2, 서열번호 147의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 148의 LCDR1, 서열번호 149의 LCDR2, 서열번호 150의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 254의 중쇄가변영역 및 서열번호 255의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 3F2의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 151의 HCDR1, 서열번호 152의 HCDR2, 서열번호 153의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 154의 LCDR1, 서열번호 155의 LCDR2, 서열번호 156의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 256의 중쇄가변영역 및 서열번호 257의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 4G8의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 157의 HCDR1, 서열번호 158의 HCDR2, 서열번호 159의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 160의 LCDR1, 서열번호 161의 LCDR2, 서열번호 162의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 258의 중쇄가변영역 및 서열번호 259의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 3D9의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 163의 HCDR1, 서열번호 164의 HCDR2, 서열번호 165의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 166의 LCDR1, 서열번호 167의 LCDR2, 서열번호 168의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 260의 중쇄가변영역 및 서열번호 261의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 4B3의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 169의 HCDR1, 서열번호 170의 HCDR2, 서열번호 171의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 172의 LCDR1, 서열번호 173의 LCDR2, 서열번호 174의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 262의 중쇄가변영역 및 서열번호 263의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 19G1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 175의 HCDR1, 서열번호 176의 HCDR2, 서열번호 177의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 178의 LCDR1, 서열번호 179의 LCDR2, 서열번호 180의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 264의 중쇄가변영역 및 서열번호 265의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 20G8의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 181의 HCDR1, 서열번호 182의 HCDR2, 서열번호 183의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 184의 LCDR1, 서열번호 185의 LCDR2, 서열번호 186의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 266의 중쇄가변영역 및 서열번호 267의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 5B8의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 187의 HCDR1, 서열번호 188의 HCDR2, 서열번호 189의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 190의 LCDR1, 서열번호 191의 LCDR2, 서열번호 192의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 268의 중쇄가변영역 및 서열번호 269의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 5F1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 193의 HCDR1, 서열번호 194의 HCDR2, 서열번호 195의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 196의 LCDR1, 서열번호 197의 LCDR2, 서열번호 198의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 270의 중쇄가변영역 및 서열번호 271의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 14B3의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 199의 HCDR1, 서열번호 200의 HCDR2, 서열번호 201의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 202의 LCDR1, 서열번호 203의 LCDR2, 서열번호 204의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 272의 중쇄가변영역 및 서열번호 273의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 16F1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 205의 HCDR1, 서열번호 206의 HCDR2, 서열번호 207의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 208의 LCDR1, 서열번호 209의 LCDR2, 서열번호 210의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 274의 중쇄가변영역 및 서열번호 275의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 16F8의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 211의 HCDR1, 서열번호 212의 HCDR2, 서열번호 213의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 214의 LCDR1, 서열번호 215의 LCDR2, 서열번호 216의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 276의 중쇄가변영역 및 서열번호 277의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 O3C9의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 217의 HCDR1, 서열번호 218의 HCDR2, 서열번호 219의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 220의 LCDR1, 서열번호 221의 LCDR2, 서열번호 222의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 278의 중쇄가변영역 및 서열번호 279의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 22A3의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 223의 HCDR1, 서열번호 224의 HCDR2, 서열번호 225의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 226의 LCDR1, 서열번호 227의 LCDR2, 서열번호 228의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 280의 중쇄가변영역 및 서열번호 281의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 29B11의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 229의 HCDR1, 서열번호 230의 HCDR2, 서열번호 231의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 232의 LCDR1, 서열번호 233의 LCDR2, 서열번호 234의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 282의 중쇄가변영역 및 서열번호 283의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 O2D7의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 235의 HCDR1, 서열번호 236의 HCDR2, 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 238의 LCDR1, 서열번호 239의 LCDR2, 서열번호 240의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 284의 중쇄가변영역 및 서열번호 285의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 23C10의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 241의 HCDR1, 서열번호 242의 HCDR2, 서열번호 243의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 244의 LCDR1, 서열번호 245의 LCDR2, 서열번호 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-FAP 항체는 서열번호 286의 중쇄가변영역 및 서열번호 287의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-FAP 항체는 AMG-506/MP-0310일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항-FAP 항체는 암세포상에 존재하는 FAP에 특이적으로 결합하여, 암세포의 사멸을 유발할 수 있는 한 어떠한 항체도 이용될 수 있다.
제1 단량체의 구조
상기 제1 단량체는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다. 이때, 상기 제1 단량체는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체; 및 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체는 제1 단량체의 C 말단 또는 N 말단에 결합된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 이때, FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 제1 단량체의 C 말단 또는 N 말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는, N 말단에 결합된 것일 수 있다.
상기 제1 단량체는 하기 구조식 (I) 또는 구조식 (II)의 구조를 포함하는 것일 수 있다.
N'-X-[링커(3)]q-Fc 도메인-[링커(4)]r-(Y)c-C'(I)
N'-(Y)d-[링커(3)]q-Fc 도메인-[링커(4)]r-X-C'(II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
상기 Y는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체이며,
상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
상기 c, d, q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, 상기 제1 단량체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 9 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 35로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열번호를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 제1 단량체는 항체의 일 단량체 구조를 포함하며, 구체적으로 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄; 또는 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 2 및 서열번호 4; 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 서열번호 13; 서열번호 2 및 서열번호 16; 서열번호 22 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 25; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31 또는 서열번호 23 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 구조식 (I)의 구조를 가지며, q는 1이며, r 및 c은 각각 0인 것일 수 있다. 이때, 제1 단량체는 도 6의 a의 왼쪽 단량체 구조를 가진다. 또한, 상기 제1 단량체는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 2 및 서열번호 4; 서열번호 22 및 서열번호 23; 또는 서열번호 23 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 구조식 (I)의 구조를 가지며, q는 1이고, r 및 c는 각각 1인 것일 수 있다. 이때, 제1 단량체는 도 6의 b 또는 도 6의 c의 왼쪽 단량체 구조를 가진다. 또한, 상기 제1 단량체는 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 13; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 또는 서열번호 23 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
제2 단량체의 구조
상기 제2 단량체는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함한다. 상기 제2 단량체는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 제2 단량체는 하기 구조식 (III) 또는 구조식 (IV)를 포함하는 것일 수 있다.
N'-(X)e-[링커(5)]s-Fc 도메인-[링커(6)]t-Y'-C'(III)
N'-Y'-[링커(5)]s-Fc도메인-[링커(6)]t-(X)f-C'(IV)
이때, 상기 구조식(III) 및 (IV)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
상기 Y'는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체; 또는 LIGHT 단백질 및 LTβ 단백질의 이종다량체이며,
상기 링커(5) 및 링커(6)은 펩타이드 링커이고,
상기 e, f, s 및 t는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, 상기 제2 단량체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열번호를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 제2 단량체는 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 서열번호 13; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 36; 또는 서열번호 37로 구성된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 구조식 (III)의 구조를 가지며, s는 1이고, e 및 t는 각각 1이며, 상기 Y'는 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 단량체일 수 있다. 이때, 도 6의 b 또는 도 6의 c의 오른쪽 단량체 구조를 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 제2 단량체는 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 서열번호 13; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30 또는 서열번호 23 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 구조식 (III)의 구조를 가지며 s는 1이고, e 및 t는 각각 1이며, 상기 Y'는 LIGHT 단백질 단편의 동종이량체일 수 있다. 이때, 도 6의 b의 왼쪽 단량체 구조를 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 제2 단량체는 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 23 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 구조식 (IV)의 구조를 가지며, s는 1이고, t 및 f는 각각 0이며, Y'는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체인 것일 수 있다. 이때, 도 6의 a의 오른쪽 단량체 구조를 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 제2 단량체는 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 18; 서열번호 24; 서열번호 26; 서열번호 27; 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 구조식 (IV)의 구조를 가지며, s는 1이고, t 및 f는 각각 0이며, Y'는 LIGHT 단백질 및 LTβ 단백질의 이종다량체인 것일 수 있다. 이때, 도 6의 d의 오른쪽 단량체 구조를 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 제2 단량체는 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 36; 또는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
펩타이드 링커
본 명세서에서 사용하는 용어, "펩타이드 링커"는 융합 단백질 내에서 도메인과 도메인 사이에 물리 화학적 거리를 두거나, 혹은 연결을 위하여 사용되는 펩타이드이다. 상기 링커는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1) 내지 (6)은 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 의미한다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커(1) 내지 펩타이드 링커(6)는 3 내지 80개의 연속된 아미노산, 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 3 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 15개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n, GGGS(G4S)n, GGS(G3S)n 또는 GGSG(G3S)n (이때, n은 0 내지 10의 정수)을 포함할 수 있다. 이때, n은 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1) 또는 링커(2)는 서열번호 120 내지 서열번호 126으로 구성된 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드 링커(1) 또는 상기 펩타이드 링커(2)는 서열번호 122, 서열번호 124 또는 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 링커(3) 또는 펩타이드 링커(5)는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(3) 또는 펩타이드 링커(5)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있고 (G4S)n, GGGS(G4S)n, GGS(G3S)n 또는 GGSG(G3S)n(이때, n은 0 내지 10의 정수)을 추가로 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커(3) 또는 펩타이드 링커(5)는 서열번호 117, 서열번호 118 또는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 링커(3)은 힌지 영역으로 구성되고, 펩타이드 링커(5)는 힌지 영역 및 (G4S)n, GGGS(G4S)n, GGS(G3S)n 또는 GGSG(G3S)n(이때, n은 0 내지 10의 정수)의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이때, (G4S)n, GGGS(G4S)n 또는 GGS(G3S)n는 서열번호 120 내지 서열번호 126으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드 링커(3)은 서열번호 117, 서열번호 118 또는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 펩타이드 링커 (5)는 서열번호 117, 서열번호 118 또는 서열번호 119; 및 서열번호 123 또는 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 펩타이드 링커(4) 또는 펩타이드 링커(6)는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 3 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 15개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n, GGGS(G4S)n, GGS(G3S)n 또는 GGSG(G3S)n(이때, n은 0 내지 10의 정수)을 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 또한, 상기 펩타이드 링커(4) 또는 상기 펩타이드 링커(6)은 서열번호 120 또는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
Fc 영역 또는 이의 단편
이때, 상술한 면역글로불린 단편은 면역글로불린의 Fc 영역일 수 있다. 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 이때, 상기 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역일 수 있으며, 구체적으로, IgG1 또는 IgG2a에서 유래한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG2a Fc 도메인일 수 있다. 이때, 상기 IgG1 Fc 도메인은 서열번호 292의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 IgG2a Fc 도메인은 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 라이신(K), 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 Fc 영역은 놉 구조 또는 홀 구조를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "놉-인투-홀(knob-into-hole)"은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 이종이량체 항체 등과 같이, 서로 다른 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 설계 전략이다. 일반적으로, 이러한 기술은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)에 놉(knob)을 그리고 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에 상응하는 홀(hole)을 도입하는 것을 포함하고, 그리하여 놉을 홀 내에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진시키고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있다.
'놉'은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)으로부터의 소형 아미노산 측쇄들을 보다 큰 측쇄들(예컨대, 알지닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 상기 놉에 동일하거나 유사한 크기의 상보적 '홀'은 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에서 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄들(예컨대, 알라닌, 세린, 발린, 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다. 상기 놉 및 홀은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예컨대, 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 놉 또는 홀을 포함하는 Fc 영역은 서열번호 34 및 서열번호 294 내지 서열번호 296으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 놉 구조 또는 홀 구조는 야생형의 IgG1에서 366번째, 368번째 및/또는 407번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 놉 구조는 서열번호 292 또는 서열번호 297의 아미노산 서열이 T366W로 치환된 형태일 수 있고, 홀 구조는 서열번호 292 또는 서열번호 297의 아미노산 서열이 T366S, L368A 및 Y407V로 치환된 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 놉 구조 또는 홀 구조는 야생형의 IgG2a에서 321번째, 323번째 및 362번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 놉 구조는 서열번호 293 또는 서열번호 298의 아미노산 서열이 T321W로 치환된 형태일 수 있고, 홀 구조는 서열번호 293 또는 서열번호 298의 아미노산 서열이 T321S, M323A 및 Y362V으로 치환된 형태일 수 있다.
상기 Fc 도메인 변이체는 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 이때, "DANG 변이"는 인간 IgG1 또는 마우스 IgG2a 내의 효과기 기능을 제거하기 위한 D265A/N297G 돌연변이를 지칭한다.
IgG 분자에서 상기 Fc 영역이 매개하는 효과기 기능은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개의 세포독성(ADCC), 식균작용, 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체, BCR)의 저하 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역을 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 결합시키는 것을 필요로 한다.
비변이 Fc 영역의 아미노산 서열의 치환으로 효과기 기능을 변화시킬 수 있으며, 효과기 기능이 변화된 Fc 영역은 예를 들어 C1q 결합 및/또는 FcR 결합을 변형시켜 이에 따라 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 설계할 수 있다. 즉, 상기 'DANG 변이'는 항체 제조시 원하지 않는 효과기 작용이 발생하지 않도록 IgG 분자에서 상기 Fc 영역이 매개하는 효과기 기능을 제거함을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 DANG 변이를 포함하는 IgG1의 Fc 영역은 서열번호 292의 아미노산 서열에서 D265A/N297G 돌연변이 DANG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IgG1의 Fc 영역은 서열번호 297번의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 DANG 변이를 포함하는 IgG2a의 Fc 영역은 서열번호 293의 아미노산 서열에서 D219A/N254G 돌연변이 DANG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, DANG 변이를 포함하는 IgG2a의 Fc 영역은 서열번호 298의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IgG1 유래 Fc 영역은 DANG 변이 및 놉-인투-홀 구조를 모두 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IgG1 유래 Fc 영역은 서열번호 15 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IgG2a 유래 Fc 영역은 DANG 변이 및 놉-인투-홀 구조를 모두 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IgG2a 유래 Fc 영역은 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
융합단백질의 구조
상기 융합단백질은 항체일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 동종이량체 구조의 항체일 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 놉-인투-홀 구조를 포함하는 헤테로다이머 항체일 수 있다.
상기 융합단백질은 구조식 (I) 및 구조식 (III); 또는 구조식 (I) 및 구조식 (IV)를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체 또는 제2 단량체는 하기 중 하나의 구조를 가질 수 있다.
제1 단량체의 예시:
(i) q, r 및 c가 1인 경우의 구조식 (I); 또는
(ii) q는 1이고, r 및 c가 0인 경우의 구조식 (I).
제2 단량체의 예시:
(iii) s, e 및 t가 1이며, Y'는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체인 구조식 (III);
(iv) s는 1이고, t 및 f는 0이며, Y'는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체인 구조식 (IV); 또는
(v) s는 1이고 t 및 f는 0이며, Y'는 LIGHT 단백질 및 LTβ 단백질의 이종다량체인 구조식 (IV).
상기 구조식 (I) 내지 (VI)에서, Y 또는 Y'는 하기의 구조를 가질 수 있다.
LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체의 예시:
(vi) LIGHT 단백질의 일 단량체 또는 이의 변이체;
(vii) 상기 (vi)의 동종이량체; 또는
(viii) 상기 (vi)의 동종삼량체.
LIGHT 단백질 및 LTβ 단백질의 이종다량체의 예시:
(ix) n, m 및 a는 1이고, Y1은 LIGHT 단백질의 일 단량체 또는 이의 변이체이고, Y2 및 Y3는 LTβ 단백질의 일 단량체인 구조식 (A).
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (i)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (iii)를 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 6의 b 및 c). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 23, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 13; 서열번호 23, 서열번호 29 및 서열번호 30; 또는 서열번호 23 및 서열번호 31을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (ii)를 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (iv)를 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 6의 a). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3; 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 5; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 5; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 6; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 7; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 8; 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 18; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 23, 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 27; 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 28을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (ii)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (v)를 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 6의 d). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 36 및 서열번호 37로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 17; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 19; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 20; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 21; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 36; 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 37을 포함하는 것일 수 있다.
본원 다중 특이적 융합 단백질은 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 및/또는 세포 리간드 또는 다른 단백질을 결합하여 화학적으로 변형될 수 있다. 이처럼 수많은 화학적 변형은 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 상기 구조식 (I) 또는 구조식 (II)로 이루어진 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 구조식 (III) 또는 구조식 (IV)로 이루어진 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체의 폴리펩티드는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 2 및 서열번호 4; 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 서열번호 13; 서열번호 2 및 서열번호 16; 서열번호 22 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 25; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 23 및 서열번호 35로 구성된 폴리펩티드와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 38 및 서열번호 39; 서열번호 39 및 서열번호 41; 서열번호 39 및 서열번호 46; 서열번호 39 및 서열번호 47; 서열번호 39 및 서열번호 48; 서열번호 39 및 서열번호 49; 서열번호 39 및 서열번호 50; 서열번호 39 및 서열번호 53; 서열번호 59 및 서열번호 60; 서열번호 60 및 서열번호 62; 서열번호 60 및 서열번호 63; 서열번호 60 및 서열번호 66; 서열번호 60 및 서열번호 67; 서열번호 60 및 서열번호 68; 서열번호 60 및 서열번호 72로 구성된 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체의 폴리펩티드는 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7; 서열번호 8; 서열번호 2 및 서열번호 9; 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 2 및 서열번호 13; 서열번호 2 및 서열번호 16; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 19; 서열번호 20; 서열번호 21; 서열번호 24; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 23 및 서열번호 35; 서열번호 36; 또는 서열번호 37로 구성된 폴리펩티드와 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 40; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 서열번호 39 및 서열번호 47; 서열번호 39 및 서열번호 48; 서열번호 39 및 서열번호 49; 서열번호 39 및 서열번호 50; 서열번호 39 및 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58; 서열번호 61; 서열번호 63; 서열번호 64; 서열번호 65; 서열번호 60 및 서열번호 66; 서열번호 60 및 서열번호 67; 서열번호 60 및 서열번호 68; 서열번호 60 및 서열번호 72; 서열번호 73; 또는 서열번호 74로 구성된 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(Signal sequence) 또는 리더 서열(Leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(Endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
상기 신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(Signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(Lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(Tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(Signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(Growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(Baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(Bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환 세포
본 발명의 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(Glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질의 생산방법
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(Fed batch 또는 Repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질의 용도
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 골암, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약학 조성물은 PD-1을 타겟하는 면역관문억제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "면역관문 억제제"는 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제하는 면역관문 단백질(Immune checkpoint protein)의 활성을 저해하는 하는 물질로, 암세포가 면역시스템을 회피하는 기능을 발휘하는 것을 막음으로써 암세포를 제거하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "PD-1(programmed cell death protein 1)"은 CD279로 지칭되며, 활성화된 T 세포의 표면에 발현되는 단백질이다. 암세포 표면에 있는 단백질인 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC)과 반응하여 TCR(T cell receptor) 및 CD28로 매개된 T-세포 활성, 성장 인자 및 사이토카인 생성을 억제하여 음성 신호전달을 유도한다. PD-1 억제제는 예를 들어, 펨브롤리주맙(키트루다®), 니볼루맙(옵디보®), 세미플리맙(립타요®), JTX-4014, 스파르탈리주맙, 캄렐리주맙, 신틸리맙, 티슬레리주맙, 토리팔리맙, 도스탈리맙, INCMGA00012, AMP-224, 및 AMP-514이다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 종양 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 종양 치료 활성을 나타내거나, 특히, 암에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 암의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 종양 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 개체는 암을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. anti-FAP/scLIGHT3 IgG1 DANG, 인간 융합 단백질의 개요
PROTEIN Format Description 해당서열
T3.01 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq3
T3.02 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 seq2, seq4, seq5
T3.03 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 knob DANG, K&H seq1, seq2, seq5
T3.04 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3(GGGGS4), hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq6
T3.05 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3(226-231), hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq7
T3.06 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT3(195-198), hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq8
T3.07 K&H anti-hu FAP-hu scLIGHT2/anti-hu FAP-hu LIGHT, hu IgG1 DANG (2+1) seq2, seq9, seq10
T3.08 Fc-fusion anti-hu FAP-hu LIGHT, hu IgG1 DANG (2+1) seq2, seq11
T3.09 K&H anti-hu FAP-hu scLIGHT2/anti-hu FAP-hu LIGHT, hu IgG1 (2+1) seq2, seq12, seq13
T3.10 K&H anti-hu FAP/null, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq14
T3.11 K&H null/hu scLIGHT3, hu IgG1 DANG seq3, seq15
T3.13 Mab anti-hu FAP, hu IgG1 DANG seq2, seq16
T3.14 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT-LTb2, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq17
T3.15 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT-LIGHT(L118K, G119E)2, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq18
T3.16 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT(226-231)-LTb2, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq19
T3.17 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT(195-198)-LTb2, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq20
T3.18 K&H anti-hu FAP/hu scLIGHT(GGSG)-LTb2, hu IgG1 DANG seq1, seq2, seq21
[seq1]은 인간 항-FAP 항체(anti-FAP antibody)의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, DANG 변이(D265A 및 N297G)를 통해 이펙터 기능을 제거하고, T366W 변이로 놉 구조를 형성한 인간 IgG1 Fc로 구성된다.
[seq2]는 인간 항-FAP 항체의 경쇄 서열로 구성된다.
[seq3]은 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역(91-240)과 링커 GGSG로 구성된 동종삼량체, 링커 GGGS와 T366S, L368A 및 Y407V 변이로 홀 구조를 형성한 인간 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
[seq4]는 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc knob으로 구성된다.
[seq5]는 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역과 링커 GGSG로 구성된 동종삼량체, 링커 GGGS와 인간 IgG1 Fc hole로 구성된다.
[seq6]은 인간 LIGTH 단백질 soluble form 영역(91-240)과 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS로 구성된 동종삼량체, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq7]은 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역에서 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 226-231번을 변이시킨 동종삼량체, 링커 GGGS와 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq8]은 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역에서 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 195-198번을 변이시킨 동종삼량체, 링커 GGGS와 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq9]는 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc knob DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역과 링커 GGSG로 구성된 동종이량체를 포함한다.
[seq10]은 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc hole DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열로 구성된다.
[seq11]은 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열로 구성된다.
[seq12]는 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc knob, 링커 GGGGSGGGGS, 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역과 링커 GGSG로 구성된 동종이량체를 포함한다.
[seq13]은 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc hole, 링커 GGGGSGGGGS, 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열로 구성된다.
[seq14]는 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq15]는 인간 IgG1 Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq16]은 인간 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 CH1 영역 서열, 인간 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
[seq17]은 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 87-243번 서열과 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq18]은 야생형 및 아미노산 118번 류신(L), 119번 글리신(G)을 라이신(K), 글루탐산(E)으로 변이한 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq19]는 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 226-231번을 변이시킨 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 87-243번 서열과 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq20]은 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 195-198번을 변이시킨 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 87-243번 서열, 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq21]은 인간 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 인간 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 87-243번 서열, 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
T3.01(seq1, seq2, seq3)은 인간 항-FAP 항체 서열과 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.02(seq2, seq4, seq5)는 인간 항-FAP 항체 서열과 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 특이적 항체이다.
T3.03(seq1, seq2, seq5)은 인간 항-FAP 항체 서열과 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 일부 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.04(seq1, seq2, seq6)는 인간 항-FAP 항체 서열과 링커 길이를 변경한 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.05(seq1, seq2, seq7)는 인간 항-FAP 항체 서열과 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.06(seq1, seq2, seq8)은 인간 항-FAP 항체 서열과 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 인간 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.07(seq2, seq9, seq10)은 중쇄의 C말단에 인간 LIGHT 동종이량체 서열이 연결된 인간 항-FAP 항체 서열과 중쇄의 C말단에 인간 LIGHT 서열이 연결된 인간 항-FAP 항체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.08(seq2, seq11)은 중쇄의 C말단에 인간 LIGHT 서열이 연결된 인간 항-FAP 항체 서열을 갖는 이펙터 기능이 제거된 Fc 융합 단백질이다.
T3.09(seq2, seq12, seq13)는 중쇄의 C말단에 인간 LIGHT 동종이량체 서열이 연결된 인간 항-FAP 항체 서열과 중쇄의 C말단에 인간 LIGHT 서열이 연결된 인간 항-FAP 항체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 특이적 항체이다.
T3.10(seq1, seq2, seq14)은 인간 항-FAP 항체 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T3.11(seq3, seq15)은 인간 LIGHT 동종삼량체 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T3.13(seq2, seq16)은 이펙터 기능이 제거된 인간 항-FAP 항체이다.
T3.14(seq1, seq2, seq17)는 인간 항-FAP 항체 서열과 인간 LIGHT 및 인간 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.15(seq1, seq2, seq18)는 인간 항-FAP 항체 서열과 인간 LIGHT 및 일부 아미노산을 변이시킨 인간 LIGHT로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.16(seq1, seq2, seq19)은 인간 항-FAP 항체 서열과 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 인간 LIGHT 및 인간 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.17(seq1, seq2, seq20)은 인간 항-FAP 항체 서열과 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 인간 LIGHT 및 인간 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.18(seq1, seq2, seq21)은 인간 항-FAP 항체 서열과 링커 길이를 변경한 인간 LIGHT 및 인간 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
[seq1] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob DANG
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq2] anti-hu FAP LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFSGSGFGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYFSYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[seq3] hu scLIGHT3-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq4] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq5] hu scLIGHT3-hu IgG1 Fc hole
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq6] hu scLIGHT3(GGGGS4)-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq7] hu scLIGHT(226-231)3-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVDYTKEDRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVDYTKEDRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVDYTKEDRSYFGAFMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq8] hu scLIGHT(195-198)3-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSSNWFDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSSNWFDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSSNWFDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq9] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob DANG-hu scLIGHT2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
[seq10] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc hole DANG-hu LIGHT
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
[seq11] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc DANG-hu LIGHT
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
[seq12] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob-hu scLIGHT2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
[seq13] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc hole-hu LIGHT
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
[seq14] hu IgG1 Fc hole DANG
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq15] hu IgG1 Fc knob DANG
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq16] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc DANG
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq17] hu scLIGHT-LTb2-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq18] hu scLIGHT-LIGHT(L118K, G119E)2-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQKELAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQKELAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq19] hu scLIGHT(226-231)-LTb2-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVDYTKEDRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq20] hu scLIGHT(195-198)-LTb2-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSSNWFDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq21] hu scLIGHT-LTb2(GGSG)-hu IgG1 Fc hole DANG
EVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMVGGSGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
준비예 2. anti-FAP/scLIGHT3 IgG2a DANG, 마우스 융합 단백질의 개요
PROTEIN Format Description 해당서열
T3.01m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT3, mu IgG2a DANG seq22, seq23, seq24
T3.02m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT3, mu IgG2a seq23, seq25, seq26
T3.05m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT3(225-230), mu IgG2a DANG seq22, seq23, seq27
T3.06m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT3(194-197), mu IgG2a DANG seq22, seq23, seq28
T3.07m K&H anti-mu FAP-mu scLIGHT2/anti-mu FAP-mu LIGHT, mu IgG2a DANG (2+1) seq23, seq29, seq30
T3.08m K&H anti-mu FAP-mu LIGHT, mu IgG2a DANG (2+1) seq23, seq31
T3.10m K&H anti-mu FAP/null, mu IgG2a DANG seq22, seq23, seq32
T3.11m K&H null/mu scLIGHT3, mu IgG2a DANG seq24, seq33
T3.12m K&H null/mu scLIGHT3, mu IgG2a seq26, seq34
T3.13m Mab anti-mu FAP, mu IgG2a DANG seq23, seq35
T3.14m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT-LTb2, mu IgG2a DANG seq22, seq23, seq36
T3.19m K&H anti-mu FAP/mu scLIGHT-LTb2, mu IgG2a knob DANG seq22, seq23, seq37
[seq22]는 마우스 항-FAP 항체(anti-FAP) 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, DANG 변이(D219A, N254G)를 통해 이펙터 기능을 제거하고, T321W 변이로 놉 구조를 형성한 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.
[seq23]은 마우스 항-FAP 항체의 경쇄 가변 서열로 구성된다.
[seq24]는 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역(91-239)과 링커 GGSG로 구성된 동종삼량체, 링커 GGGS와 T321S, M323A 및 Y362V 변이로 홀 구조를 형성한 마우스 IgG2a Fc DANG으로 구성된다.
[seq25]는 마우스 항FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, 마우스 IgG2a Fc knob으로 구성된다.
[seq26]은 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역과 링커 GGSG로 구성된 동종삼량체, 링커 GGGS와 마우스 IgG2a Fc hole로 구성된다.
[seq27]은 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역에서 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 225-230번을 변이시킨 동종삼량체, 링커 GGGS와 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq28]은 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역에서 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시키기 위해 아미노산 194-197번을 변이시킨 동종삼량체, 링커 GGGS와 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq29]는 마우스 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, 마우스 IgG2a Fc knob DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역과 링커 GGSG로 구성된 동종이량체를 포함한다.
[seq30]은 마우스 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, 마우스 IgG2a Fc hole DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열로 구성된다.
[seq31]은 마우스 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 GGGGSGGGGS, 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열로 구성된다.
[seq32]는 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq33]은 마우스 IgG2a Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq34]는 마우스 IgG2a Fc knob으로 구성된다.
[seq35]는 마우스 항-FAP 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a CH1 영역 서열, 마우스 IgG2a Fc DANG으로 구성된다.
[seq36]은 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 153-305번 서열과 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq37]은 마우스 LIGHT 단백질 soluble form 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 Lymphotoxin beta 단백질 세포외 도메인 영역 중 아미노산 153-305번 서열과 링커 GGSG로 구성된 이종삼량체, 링커 GGGS, 마우스 IgG2a Fc hole로 구성된다.
T3.01m(seq22, seq23, seq24)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 마우스 LIGHT 동종 삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.02m(seq23, seq25, seq26)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 마우스 LIGHT 동종 삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 특이적 항체이다.
T3.05m(seq22, seq23, seq27)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 HVEM 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 마우스 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.06m(seq22, seq23, seq28)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 DcR3 수용체에 대한 결합력을 약화시킨 마우스 LIGHT 동종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.07m(seq23, seq29, seq30)은 중쇄의 C말단에 마우스 LIGHT 동종이량체 서열이 연결된 마우스 항-FAP 항체 서열과 중쇄의 C말단에 마우스 LIGHT 서열이 연결된 마우스 항-FAP 항체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.08m(seq23, seq31)은 중쇄의 C말단에 마우스 LIGHT 서열이 연결된 마우스 항-FAP 항체 서열을 갖는 이펙터 기능이 제거된 Fc-융합 단백질이다.
T3.10m(seq22, seq23, seq32)은 마우스 항-FAP 항체 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T3.11m(seq24, seq33)은 마우스 LIGHT 동종 삼량체 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T3.12m(seq26, seq34)은 마우스 LIGHT 동종 삼량체 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 항체이다.
T3.13m(seq23, seq35)은 이펙터 기능이 제거된 마우스 항-FAP 항체이다.
T3.14m(seq22, seq23, seq36)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 마우스 LIGHT 및 마우스 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 특이적 항체이다.
T3.19m(seq22, seq23, seq37)은 마우스 항-FAP 항체 서열과 마우스 LIGHT 및 마우스 Lymphotoxin beta로 구성된 이종삼량체 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 일부 제거된 이중 특이적 항체이다.
[seq22] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob DANG
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq23] anti-mu FAP LC
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSGVNFMHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
[seq24] mu scLIGHT3-mu IgG2a Fc hole DANG
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq25] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq26] mu scLIGHT3-mu IgG2a Fc hole
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq27] mu scLIGHT(225-230)3-mu IgG2a Fc hole DANG
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVDYTKEDRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVDYTKEDRSYFGAFMV GGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVDYTKEDRSYFGAFMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq28] mu scLIGHT(194-197)3-mu IgG2a Fc hole DANG
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSNNWFDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSNNWFDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSNNWFDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq29] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob DANG-mu scLIGHT2
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGSGNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMV
[seq30] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc hole DANG-mu LIGHT
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMV
[seq31] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc DANG-mu LIGHT
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSNPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMV
[seq32] mu IgG2a Fc hole DANG
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq33] mu IgG2a Fc knob DANG
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq34] mu IgG2a Fc knob
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq35] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc DANG
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq36] mu scLIGHT-LTb2-mu IgG2a Fc hole DANG
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSLPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq37] mu scLIGHT-LTb2-mu IgG2a Fc hole
NPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVGGGGSGGGGSGGGGSLPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVGGSGLPAAHLIGAWMSGQGLSWEASQEEAFLRSGAQFSPTHGLALPQDGVYYLYCHVGYRGRTPPAGRSRARSLTLRSALYRAGGAYGRGSPELLLEGAETVTPVVDPIGYGSLWYTSVGFGGLAQLRSGERVYVNISHPDMVDYRRGKTFFGAVMVGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
제조예 1. 융합 단백질의 제조
제조예 1.1. 벡터 구성과 플라스미드 맥시프렙
하기 표 3 및 표 4에 시약 및 장비를 기재하였다.
시약 제조사 Catalog#
pTT5 Chempartner
In-Fusion HD cloning kit Clontech 639648
Accuprime pfx DNA polymerase Invitrogen 12344-04
Gel DNA fragment purification Kit TaKaRa D823A
FastDigest®BamHI Fermentas FD0055
FastDigest®EcoRI Fermentas FD0275
장비 및 도구 제조사 모델명
생물 안전 작업대 NUAIRE LabGard class ±
원심분리기 Eppendorf 5424
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
PCR을 통해 합성한 DNA 단편을 증폭시키고, 젤로 PCR 생성물을 정제하였다. 제한효소 EcoRI와 BamHI로 pTT5 벡터를 자르고 난 후 젤을 정제하였다. In-Fusion Kit를 이용해 각각의 PCR 생성물과 선형 벡터를 연결하였다. 생성한 벡터를 ECOS101 DH5α competent cell에 형질전환을 시키고, 100 μg/mL 엠피실린을 함유하는 2xYT 한천 판에 배양하였다. 모든 조작 과정은 표준 형질 전환 프로토콜을 따라 수행하였다. 콜로니 PCR로 양성 재조합체를 확인하고, 재조합 플라스미드를 sequence-verify sequencing을 수행하였다. 단일 콜로니를 선택하여 100 μg/mL 엠피실린을 함유하는 5 mL 2xYT 배지에 종균을 접종하였다. 37 ℃에서 8시간 동안 흔들면서 배양하였다.이후, 종균을 1:1,000의 비율로 200 mL의 선택적 2xYT 배지에 희석하였다. 37℃에서 16시간 동안 흔들면서 배양하였다. 4℃, 4,700 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 박테리아 세포를 수확하였다. 12 mL의 RES-EF 완충액에 박테리아 펠릿을 재부유 시켰다. 그 후, 12 mL의 LYS-EF 완충액을 첨가하고, 밀봉한 튜브를 힘차게 뒤집어 완전히 혼합한 뒤, 실온에서 5분간 배양하였다. 12 mL의 NEU-EF 완충액을 용해물에 첨가하고, 힘차게 뒤집어 빠르게 완전히 혼합하였다. NucleoBond® Xtra 컬럼 필터에 용해물을 주입하기 전, 필터의 막힘을 방지하기 위해 용해물 튜브를 3번 정도 뒤집어 침전물의 균질한 현탁을 제조하였다.
그 후, 10 mL의 필터 세척 완충액 FIL-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼 필터와 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. NucleoBond® Xtra 컬럼 필터를 빼내거나 컬럼을 거꾸로 뒤집어 제거하였다. 90 mL의 세척 완충액 ENDO로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다.
45 mL의 세척 완충액 WASH-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. 15 mL의 용출 완충액 ELU로 플라스미드 DNA를 용출시켰다. 용출액은 50 mL 원심분리 튜브에 수집하였다. 10.5 mL의 상온 이소프로판올을 첨가하여 용출된 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 볼텍스 후, 혼합물을 2분간 그대로 방치하였다.
그 후, 5 mL의 70% 에탄올을 펠릿에 첨가하였다. 파이펫 팁을 이용해 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 완전히 제거하였다. 펠릿을 상온(20℃-25℃)에서 건조시켰다. 그 후, DNA 펠릿을 1,000 μL의 H2O로 용해시켰다.
제조예 1.2. 세포 형질 주입과 단백질 발현
하기 표 5에 사용한 재료 및 시약을 기재하였다.
재료 및 시약 제조사 (Product #)
293F cells Invitrogen (R790-07)
OPM 293 OPM (81075-001)
Pluronic® F-68, 10% (100X) Gibco (24040-032)
1 mg/mL PEI Polyscience (23966)
OPTI MEM I Gibco (31985088)
Peptone (20x) FLUKA(P0521-1KG)
셰이커 플라스크
ISF1-X 배양기 셰이커 Kuhner shaker
완전 배지를 넣은 293F seed strain을 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 유지하였다. 세포를 0.3 내지 0.4Х106 cell/mL의 밀도로 배양하고, 매 2 내지 3일마다 배지를 교환하였다. 형질 주입 24시간 전, 새로 계대 배양한 293F 세포를 2.6Х106 cell/mL로 준비하였다. 준비한 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 배양하였다. 형질 주입 당일, 새로운 배지를 사용하여 5.0Х106 cells/mL의 밀도로 세포를 조정하였다. 3 L 셰이커 플라스크에서 1 L의 총 부피로 수행하였다. 0.4 mg HC 및 0.6 mg LC 플라스미드를 50 mL OPTI MEM°으로 희석하고, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 그 후, 2 mg PEI를 50 mL OPTI MEM°으로 희석하여 형질 주입 시약을 준비하였다.희석된 PEI를 DNA 혼합물에 첨가한 뒤, 즉시 혼합하였다. 이후 15분간 상온에서 배양하였다. 2.6x106 cell/mL로 준비한 293F 세포에 DNA-PEI 혼합물을 첨가하였다. 이후, 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 24시간 동안 계속 배양하였다. 형질 주입 24시간 후, 최종 농도가 0.5%가 되도록 배양액의 1/20에 10% peptone을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 계속 배양하였다. 형질 주입 후 2 내지 5일 기간에 매일 세포 밀도/생존 능력을 측정하고 기록하였다. 형질 주입 7일 후 또는 세포 생존 능력이 70% 미만에서 정제를 위해 세포를 수확하였다.
제조예 1.3. 단백질 정제
하기 표 6 내지 표 8에 단백질 정제를 위해 사용한 시약, 각 완충액의 구성 및 장비를 기술하였다.
시약 제조사 Catalog#
Mabselect SuRe GE Healthcare 11003493
Tris SIGMA 77-86-1
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
Sodium citrate Adamas-beta 76198B
Citric acid GENERAL-Reagent G83162B
Arginine VETEC V900343-500G
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512-500G
Triton X-100 ABCONE X10010-1L
Triton X-114 SIGMA-ALDRICH X114
Millex-GP Filter Unit 0.22 ㎛ Sterile MILLIPORE SLGP033RS
NaOH Merck B146369740
완충액 A 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0
완충액 B 25 mM Tris, 150 mM NaCl,0.1% Triton X-100, 0.1% Triton X-114 pH 8.0
완충액 C 100 mM Sodium Citrate, 150 mM NaCl, pH 3.0
완충액 D 1 M Arginine, 400 mM Succinic acid, pH 9.0
완충액 E 20 mM PB pH 6.5, 1 M (NH4)2SO4
완충액 F 20 mM PB pH 6.5, 25% isopropyl alcohol
최종완충액 20 mM HEPES, pH 7.5, 240 mM sucrose 혹은 20 mM his acetate pH 5.5, 240 mM sucrose
기기 제조사 모델명
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
원심분리기 Beckman J-26xp
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
Sartopore 2 filter Sartorius 5445307H9-OO-A
Mabselect sure 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 2,000 x g, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 그 후, Sartopore 2 필터로 상층액을 여과하였다. 완충액 A로 평형화된 5 mL MabSelect Sure 컬럼으로 정화된 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 완충액 A로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 완충액 B로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 완충액 A로 컬럼을 세척하였다. 6 CV 완충액 C로 결합된 단백질을 용출하고, 1/6 부피의 완충액 D를 넣어 용출한 물질을 중화하였다. SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 진행하였다.HIC 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 그 후, 밤새 4℃에서 완충액 E에 대해 단백질을 투석하였다. 완충액 E로 평형화된 HIC 컬럼에 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 완충액 E로 컬럼을 세척하였다. 기울기 용리(10 CV 완충액 F 0%- 40%)로 결합된 단백질을 용출하였다. 2 CV 100% 완충액 F로 결합된 단백질을 용출하였다. SDS-PAGE 분석을 진행하였다.
경우에 따라, SEC 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 최종 완충액으로 평형화된 SEC 컬럼에 상층액을 로딩한 뒤, 최종 완충액과 함께 단백질을 용출하였다.
정제한 단백질을 한 군데로 모아준 다음, 밤새 4℃에서 최종 완충액에 대해 단백질을 투석하였다. 그 후, SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1 내지 도 5에 나타난 것과 같이, 일 실시예의 인간 단백질 및 마우스 단백질이 정제되었음을 확인하였다.
제조예 2. 이중 특이적 항체 생산량 개선
제조예 2.1. 인간 LIGHT를 포함하는 융합 단백질 생산량 개선 변화 확인
하기 표 9에는 세포주 및 세포 형질 주입시 DNA 비율 변화에 따른 인간 항-FAP/LIGHT 이중 특이적 항체 생산량의 변화를 나타내었다. 괄호는 단백질의 생산 규모를 의미하며, 단위는 L이다. 괄호 앞의 숫자는 정제된 단백질의 양을 생산규모로 나누어 얻은 1L 당 생산량이다.
PROTEIN Description 세포주 DNA 비율 생산된 단백질의 양 (㎎)(생산규모, L)
T3.01 anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 DANG Expi293 1:1:2 1.2 (1)
T3.01 anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 DANG Expi293 1:1:20 6.76 (1)
T3.01 anti-hu FAP/hu scLIGHT3, hu IgG1 DANG CHO 1:1:5 41 (0.03)
상기 표 9에 나타낸 것과 같이, 단백질 발현시 세포내로 주입하는 인간 항-FAP 서열과 LIGHT 영역의 DNA 비율 및 세포주를 변화시킴에 따라 생산된 단백질의 양이 증가되었다. LIGHT 영역의 DNA 비율을 10배 증가시킴에 따라 생산된 T3.01의 양이 약 5배 개선되었음을 확인하였다. LIGHT 영역의 DNA 비율을 2.5배 증가함과 동시에 CHO 세포주를 이용함에 따라 T3.01의 생산수율이 약 34배 개선됨을 확인하였다.
제조예 2.2. 마우스 LIGHT를 포함하는 융합 단백질 생산량 개선 변화 확인
하기 표 10에는 세포주 및 세포 형질 주입시 DNA 비율 변화에 따른 마우스 항-FAP/LIGHT 이중 특이적 항체 생산량의 변화를 나타내었다.
PROTEIN Description 세포주 DNA 비율 생산된 단백질의 양 (㎎)(생산규모, L)
T3.01m anti-mu FAP/mu scLIGHT3, mu IgG2a DANG Expi293 1:1:1 1.2 (1)
T3.01m anti-mu FAP/mu scLIGHT3, mu IgG2a DANG Expi293 1:1:1 1.6 (10)
T3.01m anti-mu FAP/mu scLIGHT3, mu IgG2a DANG CHO 1:1:5 5.67 (1)
상기 표 10에 나타낸 것과 같이, 단백질 발현시 세포내로 주입하는 마우스 항-FAP 서열과 LIGHT 영역의 DNA 비율 및 세포주를 변화시킴에 따라 생산된 단백질의 양이 증가되었다. LIGHT 영역의 DNA 비율을 5배 증가함과 동시에 CHO 세포주를 이용함에 따라 T3.01m의 생산수율이 약 4배 개선됨을 확인하였다.
제조예 3. 세포주 및 세포주 배양
인간 배아 신장 섬유아세포주 HEK293, 인간 악성흑색종 세포주 A375, 마우스 대장암 세포주 CT26-WT, 마우스 폐암 세포주 LLC1, 마우스 흑색종 세포주 B16F10 및 마우스 섬유아세포주인 NIH-3T3 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 공급받아 사용하였다. HEK293 세포, B16F10 세포 및 NIH-3T3 세포는 10% FBS(GIBCO)를 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다. HEK293 세포에 인간 FAP(Fibroblast activation protein alpha)를 과발현시킨 세포주(HEK293-hFAP)는 인간 FAP 유전자를 전달할 수 있는 렌티바이러스(lentivirus)를 이용하여 제작하였다. HEK293-hFAP 세포는 10% FBS(GIBCO), 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycin)을 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다.
CT26-WT 세포, B16F10 및 NIH-3T3 세포에 마우스 FAP(Fibroblast activation protein alpha)을 과발현 시킨 세포주(CT26-mFAP, B16F10-mFAP 및 NIH-3T3-mFAP)는 마우스 FAP 유전자를 전달할 수 있는 렌티바이러스(lentivirus)를 이용하여 제작하였다. CT26-mFAP 세포는 10% FBS(GIBCO), 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycin)을 포함하는 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다. B16F10-mFAP 세포는 10% FBS(GIBCO), 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycin)을 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다. NIH-3T3-mFAP 세포는 10% FBS(GIBCO), 5 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Puromycin)을 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다.
마우스 섬유아세포주인 NIH-3T3 세포주에 NFκB 유도적인 Luciferase 리포터 유전자를 형질전환시킨 NIH-3T3-NFκB(luc) 세포주는 BPS Bioscience(San Diego, USA)로부터 공급받아 사용하였다. NIH-3T3-NFκB(luc) 세포주는 10% Calf serum(GIBCO), 600 ㎍/㎖ 제네티신(Geneticin)을 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다.
제조예 4. 인간 면역세포 분리 및 활성화
IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 대한적십자사(Korean Red Cross, Korea)로부터 혈액팩을 공급받아 말초 혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 동결하였다. 해동한 PBMC는 음성선택(Negative selection) 방법으로 Easy sep(Stem cell) 키트(Kit)로 인간 T 세포를 분리하였다. 인간 T 세포는 10% FBS(GIBCO)가 포함된 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다.
실시예 1. 융합 단백질의 결합 친화도 확인
실시예 1.1. 재조합 인간 FAP에 대한 융합 단백질의 결합 확인
T3.01, T3.07 및 T3.14의 재조합 인간 FAP에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)으로 확인하였다.
구체적으로, CM5 칩의 표면을 50 nM NHS(N-hydroxysuccinimide)와 200 nM EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)의 1:1 혼합물로 활성화시키고, 20 μg/mL의 항-인간 IgG(Fc) 항체를 10 μL/min의 속도로 400초간 고정화(Immobilization) 하였다. 남아있는 활성화 에스터 그룹(active ester groups)은 1 M 에탄올아민(ethanolamine)으로 블로킹 하였다. T3.01, T3.07 및 T3.14을 각각 2 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL로 희석하여 항-인간 IgG(Fc) 항체가 고정화된 CM5 칩에 반응시켰다. 재조합 인간 FAP을 1xHBS-EP+버퍼용액에 50 nM 혹은 100 nM로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 인간 FAP을 30 μL/min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신(Glycine) pH1.5 용액으로 30 μL/min의 속도로 30초간 재생(Regeneration) 단계를 수행하였다.
그 결과, 표 11, 도 7에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.07 및 T3.14가 재조합 인간 FAP에 결합하여, FAP을 특이적으로 표적할 수 있음을 확인하였다.
Kinetics model Capture 1 Solution Analyte 1 Solution Kinetics Chi² (RU²) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1:1 binding 2 μg/mL T3.01 human FAP 2.18E-01 1.07E+05 3.89E-06 3.64E-11
1:1 binding 1 μg/mL T3.07 human FAP 4.98E-01 3.91E+05 1.18E-04 3.03E-10
1:1 binding 2 μg/mL T3.14 human FAP 3.24E-01 1.24E+05 1.53E-06 1.23E-11
실시예 1.2. LIGHT 수용체 인간 LTβR에 대한 융합 단백질의 결합 확인
T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 인간 LTβR에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명으로 확인하였다.
구체적으로, CM5 칩의 표면을 50 nM NHS와 200 nM EDC의 1:1 혼합물로 활성화시키고, 5 μg/mL의 인간 LTβR을 10 μL/min의 속도로 60초간 고정화하였다. 남아있는 활성화 에스터 그룹은 1 M 에탄올아민으로 블로킹하였다. T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18을 각각 1xHBS-EP+버퍼용액에 12.5 nM, 25 nM, 100 nM 중 하나로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 융합 단백질들을 30 μL /min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신 pH1.5 용액으로 30 μL/min의 속도로 30초간 재생 단계를 수행하였다.
그 결과, 표 12, 도 8에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18이 인간 LTβR에 결합하는 것을 확인하였다.
Kinetics model Capture 1 Solution Analyte 1 Solution Kinetics Chi² (RU²) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1:1 binding 5 μg/mL human LTβR T3.01 4.66E-01 3.46E+05 3.21E-04 9.28E-10
1:1 binding 5 μg/mL human LTβR T3.07 8.89E-01 4.09E+05 3.82E-04 9.35E-10
1:1 binding 5 μg/mL human LTβR T3.09 5.40E-01 7.70E+05 4.83E-04 6.28E-10
1:1 binding 5 μg/mL human LTβR T3.14 6.14E-01 1.50E+06 4.34E-04 2.90E-10
1:1 binding 5 μg/mL human LTβR T3.18 3.76E-01 1.29E+06 3.15E-04 2.45E-10
실시예 1.3. LIGHT 수용체 인간 HVEM에 대한 융합 단백질의 결합 확인
T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 인간 HVEM에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명으로 확인하였다.
구체적으로, CM5 칩의 표면을 50 nM NHS와 200 nM EDC의 1:1 혼합물로 활성화시키고 5 내지 6 μg/mL의 인간 HVEM을 10 μL/min의 속도로 60초간 고정화하였다. 남아있는 활성화 에스터 그룹은 1 M 에탄올아민으로 블로킹하였다. T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18을 각각 1xHBS-EP+버퍼용액에 100 nM로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 융합 단백질들을 30 μL/min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신 pH1.5 용액으로 30 μL/min의 속도로 30초간 재생 단계를 수행하였다.
그 결과, 표 13, 도 9에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.07 및 T3.09가 인간 HVEM에 결합하는 것을 확인하였다.
Kinetics model Capture 1 Solution Analyte 1 Solution Kinetics Chi² (RU²) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1:1 binding 5 μg/mL human HVEM T3.01 6.65E-02 2.81E+05 1.19E-03 4.24E-09
1:1 binding 5 μg/mL human HVEM T3.07 2.16E-01 2.85E+05 1.14E-03 3.99E-09
1:1 binding 5 μg/mL human HVEM T3.09 2.40E-01 4.01E+05 1.67E-03 4.17E-09
1:1 binding 6 μg/mL human HVEM T3.14 N/A N/A N/A N/A
1:1 binding 6 μg/mL human HVEM T3.18 N/A N/A N/A N/A
실시예 1.4. LIGHT 수용체 인간 DcR3에 대한 융합 단백질의 결합 확인
T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18의 인간 DcR3에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명으로 확인하였다.
구체적으로, CM5 칩의 표면을 50 nM NHS와 200 nM EDC의 1:1 혼합물로 활성화시키고 5 내지 6 μg/mL의 인간 DcR3를 10 μL/min의 속도로 60초간 고정화하였다. 남아있는 활성화 에스터 그룹은 1 M 에탄올아민으로 블로킹하였다. T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18을 각각 1xHBS-EP+버퍼용액에 50 nM 혹은 200 nM로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 융합 단백질들을 30 μL/min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신 pH1.5 용액으로 30 μL/min의 속도로 30초간 재생 단계를 수행하였다.
그 결과, 표 14, 도 10에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.07, T3.09, T3.14 및 T3.18이 인간 DcR3에 결합하는 것을 확인하였다.
Kinetics model Capture 1 Solution Analyte 1 Solution Kinetics Chi² (RU²) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1:1 binding 5 μg/mL human DcR3 T3.01 1.51E-01 6.62E+05 2.36E-04 3.57E-10
1:1 binding 5 μg/mL human DcR3 T3.07 1.55E-01 3.27E+05 1.95E-04 5.98E-10
1:1 binding 5 μg/mL human DcR3 T3.09 1.84E-01 4.00E+05 2.85E-04 7.11E-10
1:1 binding 6 μg/mL human DcR3 T3.14 2.10E-02 2.04E+05 1.98E-03 9.72E-09
1:1 binding 6 μg/mL human DcR3 T3.18 6.95E-02 2.14E+05 1.70E-03 7.93E-09
실시예 1.5. FAP 발현 세포와의 결합 확인
T3.10, T3.01, T3.05, T3.06, T3.14 및 T3.18의 HEK293 및 HEK293-hFAP 세포에 대한 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, 세포주를 1x105 cells/100 ㎕로 FACS 완충용액에 부유하여 준비하고, T3.10, T3.01, T3.05, T3.06, T3.14 및 T3.18을 각각 1 ㎍씩 처리하였다. 세포들은 FACS 완충용액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-인간 IgG 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 음성대조군(Negative control) 시료는 항-인간 IgG 항체(Biolegend)로만 염색되었다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 것과 같이, T3.10, T3.01, T3.05, T3.06, T3.14 및 T3.18이 인간 FAP을 발현하는 세포주에 99% 이상 결합함을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 인간 FAP을 발현하는 세포주에 결합하여, FAP을 특이적으로 표적할 수 있음을 의미한다. 반면 음성대조군인 HEK293 세포주에는 융합 단백질이 결합하지 않았다.
또한, T3.10m 및 T3.01m의 B16F10 및 B16F10-mFAP 세포에 대한 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, 세포주를 1x105 cells/100 ㎕로 FACS 완충용액에 부유하여 준비하였다. T3.10m 및 T3.01m을 각각 1 ㎍ 처리하였다. 세포들은 FACS 완충용액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-마우스 IgG2a 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 음성대조군(Negative control) 시료는 항-마우스 IgG2a 항체(Biolegend)로만 염색되었다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 것과 같이, T3.10m 및 T3.01m이 FAP을 발현하는 세포주에 99% 이상 결합함을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 마우스 FAP을 발현하는 세포주에 결합하여, FAP을 특이적으로 표적할 수 있음을 의미한다. 반면 음성대조군인 B16F10 세포주에는 융합 단백질이 결합하지 않았다.
실시예 1.6. LTβR 발현 세포와의 결합 확인
T3.01, T3.07, T3.04 및 T3.18의 LTβR를 발현하는 A375 세포에 대한 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, A375 세포주를 1x105 cells/100 ㎕로 FACS 완충용액에 부유하여 준비하고, T3.01, T3.07, T3.04 및 T3.18을 각각 500 nM로 부유하여 연속희석법으로 희석한 후 100 ㎕ 처리하였다. 세포들은 FACS 완충용액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-인간 IgG 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.
그 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.07, T3.04 및 T3.18이 LTβR를 발현하는 세포주에 96% 이상 결합하고, 농도 의존적인 결합을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 LTβR를 발현하는 세포주에 결합하여, LTβR를 특이적으로 표적할 수 있음을 의미한다. T3.10은 음성대조군으로 사용하였다.
실시예 1.7. 재조합 인간 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체에 대한 융합 단백질의 결합 확인
융합 단백질의 LIGHT가 작용하기 위해 헤르페스 바이러스 엔트리 매개체 (HVEM)에 결합해야 함을 고려하여, T3.01이 재조합 인간 HVEM에 결합하는 것을 확인하였다:
(i) 재조합 인간 HVEM 단백질(R&D systems)을 1 ㎍/㎖로 부유하여 96-웰 면역 플레이트(96-well immune plate)에 분주하고 24시간 처리하였다.
(ii) 세척용액으로 웰(well)을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1 시간 블로킹 하였다.
(iii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18 및 T3.10 또는 T3.05, T3.06, T3.04, T3.14 및 T3.10을 1 nM로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18 및 T3.10 또는 T3.05, T3.06, T3.04, T3.14 및 T3.10을 2 시간 처리하였다.
(iv) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 인간 재조합 FAP-바이오틴(FAP-biotin)을 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 2 시간 처리하였다.
(v) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)로 20 분간 처리하였다.
(vi) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 기질 용액(Substrate solution)을 20 분간 처리하였다.
(vii) 정지 용액(Stop solution)을 처리하고 450 ㎚ 흡광도에서 측정되었다.
그 결과, 도 14a와 도 14c에 나타낸 것과 같이, T3.01 및 T3.04가 농도 의존적인 방법으로 재조합 인간 HVEM 단백질에 결합함을 확인하였다. T3.10은 음성대조군으로 사용하였다.
실시예 1.8. 재조합 인간 림포톡신 베타 수용체 (LTβR)에 대한 융합 단백질의 결합 확인
융합 단백질의 LIGHT가 작용하기 위해 림포톡신 베타 수용체(LTβR)에 결합해야 함을 고려하여, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18 및 T3.10 또는 T3.05, T3.06, T3.04, T3.14 및 T3.10이 재조합 인간 LTβR에 결합하는 것을 확인하였다:
(i) 재조합 인간 LTβR 단백질을 1 ㎍/㎖로 부유하여 96-웰 면역 플레이트(96-well immune plate)에 분주하고 24 시간 처리하였다.
(ii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1 시간 블로킹(Blocking) 하였다.
(iii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18 및 T3.10 또는 T3.05, T3.06, T3.04, T3.14 및 T3.10을 1 nM로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18 및 T3.10 또는 T3.05, T3.06, T3.04, T3.14 및 T3.10을 2 시간 처리하였다.
(iv) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 인간 재조합 FAP-바이오틴(FAP-biotin)을 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 2 시간 처리하였다.
(v) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP로 20 분간 처리하였다.
(vi) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 기질 용액을 20 분간 처리하였다.
(vii) 정지 용액을 처리하고 450 ㎚ 흡광도에서 측정되었다.
그 결과, 도 14b와 도 14d에 나타낸 것과 같이, T3.01, T3.14, T3.16, T3.17, T3.18, T3.05, T3.06, T3.04 및 T3.14가 농도 의존적인 방법(Concentration dependent manner)으로 재조합 인간 LTβR 단백질에 결합함을 확인하였다. T3.10은 음성대조군으로 사용하였다.
실시예 2. 융합 단백질의 사이토카인 분비능 확인
실시예 2.1. 사이토카인 측정을 위한 효소 결합 면역 침강 분석
사이토카인 측정을 위해, 하기와 같은 단계로 -80℃또는 -20℃에서 보관된 상층액에서 효소 결합 면역 침강 분석(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA, R&D systems)을 진행하였다:
(i) 포획 항체(Capture antibody)를 분석증명서(Certificate of Analysis, CoA)에 따라 희석하여 96-웰 플레이트에 24 시간 코팅하였다.
(ii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 1% BSA 용액으로 1 시간 블로킹 하였다.
(iii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 시료를 2 시간 처리하였다.
(iv) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 탐지 항체(Detection antibody)를 분석증명서에 따라 희석하여 웰에 분주한 후 2 시간 처리하였다.
(v) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP로 20 분간 처리하였다.
(vi) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 기질 용액으로 20 분간 처리하였다.
(vii) 정지 용액을 처리하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 2.2. A375 세포주에서의 사이토카인 분비능 확인
A375 세포주에 LIGHT를 처리하였을 때, LTβR 매개 반응에 의한 NFκB 신호전달을 통해 IL-8 분비가 일어남을 고려하여, A375 세포주에 재조합 인간 LIGHT, T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10 또는 재조합 인간 LIGHT, T3.01, T3.07, T3.18 및 T3.10을 처리하였을 경우의 IL-8 분비능을 평가하였다.
구체적으로, A375 세포주를 1x105 cells/㎖ 로 희석하여 96-웰 플레이트에 100 ㎕/well로 분배하였다. 24 시간 후 재조합 인간 LIGHT, T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10 또는 재조합 인간 LIGHT(R&D systems), T3.01, T3.07, T3.18 및 T3.10을 10 nM로 희석하여 100 ㎕/well로 분배하였다. 처리 6 시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 시료들은 -80℃에서 보관되었다.
그 결과, 도 15a에 나타낸 것과 같이, 재조합 인간 LIGHT를 처리한 시료의 반수유효농도(EC50)는 225.8 pM; T3.01을 처리한 시료는 EC50 36.78 pM; T3.04를 처리한 시료는 EC50 60.42 pM; T3.14를 처리한 시료는 EC50 55.82 pM; T3.15를 처리한 시료는 EC50 3792 pM임을 확인하였다. 이에 반해, 대조군인 T3.10을 처리한 시료에서는 IL-8이 확인되지 않았다. 도 15b에 나타낸 것과 같이, 재조합 인간 LIGHT를 처리한 시료의 EC50는 190 pM; T3.01을 처리한 시료는 EC50 46.85 pM; T3.07을 처리한 시료는 EC50 47.66 pM; T3.18을 처리한 시료는 EC50 77.84 pM임을 확인하였다. 이에 반해, 대조군인 T3.10을 처리한 시료에서는 IL-8이 확인되지 않았다.
이러한 결과는, T3.01, T3.04, T3.14, T3.15, T3.07 및 T3.18이 A375 세포에 작용하여 IL-8 분비를 유도함을 의미한다.
실시예 2.3. 인간 T 세포에서의 사이토카인 분비능 확인
인간 T 세포에 LIGHT를 처리하였을 때 주요 면역반응인 IFN-γ 분비가 일어남을 고려하여, 인간 T 세포에 T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10 또는 T3.01, T3.07, T3.04, T3.18 및 T3.10을 처리하였을 경우의 IFN-γ 분비능을 평가하였다.
구체적으로, 1 ㎍/㎖ 항-CD3 항체(OKT3, Invitrogen)로 코팅 된 96-웰(well) 플레이트에 인간 T 세포를 5x105 cells/㎖로 희석하여 200 ㎕/well로 분배하였다. T3.01, T3.04, T3.14, T3.15 및 T3.10은 20 nM 또는 10 nM로 희석하여 20 ㎕/well로 분배하였다. 처리 48 시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 시료들은 -80℃에서 보관되었다.
그 결과, 도 16a에 나타낸 것과 같이, T3.01을 20 nM 처리한 시료에서는 평균 1,977.5 pg/㎖ IFN-γ가 확인되었다. 이에 반해, T3.04, T3.14 및 T3.15을 처리한 시료에서의 IFN-γ는 대조군인 T3.10을 처리한 시료에서 확인된 IFN-γ의 양과 차이가 없음이 확인되었다.
구체적으로, 1 ㎍/㎖ 항-CD3 항체(OKT3, Invitrogen)로 코팅 된 96-웰(well) 플레이트에 인간 T 세포를 5x105 cells/㎖로 희석하여 200 ㎕/well로 분배하였다. T3.01, T3.07, T3.04, T3.18 및 T3.10은 40 nM, 20nM 또는 10 nM로 희석하여 20 ㎕/well로 분배하였다. 처리 48 시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 시료들은 -80℃에서 보관되었다.
그 결과, 도 16b에 나타낸 것과 같이, T3.01을 40 nM 처리한 시료에서는 평균 2,671 pg/㎖ IFN-γ가 확인되었다. 이에 반해, T3.07, T3.04 및 T3.18을 처리한 시료에서의 IFN-γ는 대조군인 T3.10을 처리한 시료에서 확인된 IFN-γ의 양과 차이가 없음이 확인되었다.
이러한 결과는, T3.01이 인간 T 세포에 작용하여 IFN-γ 분비를 유도함을 의미한다.
실시예 3. 융합 단백질의 신호전달 유도능 확인
실시예 3.1. LIGHT 감지 세포에서의 신호전달능 확인
LIGHT는 LTβR에 결합하였을 때 신호전달 매개 물질인 NFκB 신호전달을 유도한다고 알려져 있음을 고려하여, 일 구체예의 융합 단백질의 LTβR를 발현하는 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에서의 신호전달능력을 평가하였다.
구체적으로, NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포주를 5x105 cells/㎖ 로 희석하여 50 ㎕/well로 분배되었다. 재조합 마우스 TNF-α(R&D systems), T3.01m 및 T3.10m를 4 ㎍/㎖로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 마우스 TNF-α, T3.01m 및 T3.10m을 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에 처리하였다. 처리 6 시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 96-웰 플레이트에서 One-step™ Luciferase assay 시약(BPS bioscience)과 혼합되었다. 혼합 30분 후, Lumenometer(Thermo Fisher)에서 발광정도를 측정하였다.
그 결과, 도 17a에 나타낸 것과 같이, T3.01m 처리군의 경우 LIGHT가 결합하여 NFκB 신호 전달하였음을 발광도로 확인하였다. 이에 비해, 대조군인 T3.10m은 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에 처리하였을 때, LIGHT에 결합하지 못함을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 LTβR에 특이적으로 결합하여 신호전달을 유도함을 의미한다.
실시예 3.2. 인간 LIGHT의 종간 반응 확인
인간 LIGHT가 마우스와 종간 반응을 가지는지 확인하기 위해, 일 구체예의 융합 단백질의 LTβR를 발현하는 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에서의 신호전달능력을 평가하였다.
구체적으로, NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포주를 5x105 cells/㎖ 로 희석하여 50 ㎕/well로 분배되었다. T3.01, T3.04, T3.14 및 T3.15를 30 nM로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. T3.01, T3.04, T3.14 및 T3.15를 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에 처리하였다. 처리 6 시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 96-웰 플레이트에서 One-step™ Luciferase assay 시약(BPS bioscience)과 혼합되었다. 혼합 30 분 후, Lumenometer(Thermo Fisher)에서 발광정도를 측정하였다.
그 결과, 도 17b에 나타낸 것과 같이, T3.14, T3.01 및 T3.04 처리군의 경우 인간 LIGHT가 마우스 LTβR에 결합하여 NFκB 신호전달하였음을 발광도로 확인하였다. 이에 비해, T3.15 처리군의 경우 104 pM 고농도 이상에서만 약하게 발광도를 확인하였고, 대조군인 T3.10은 NIH-3T3-NFκB(Luc) 세포에 처리하였을 때, LIGHT에 결합하지 못함을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 종간 반응을 통해 마우스 LTβR에 특이적으로 결합하여 신호전달을 유도함을 의미한다.
실시예 4. 융합 단백질의 대장암 동물모델에서의 항암 효능 평가
실시예 4.1. FAP 발현 대장암 동물모델에서의 항암 효능 평가
대장암의 경우 종양세포 자체에서도 FAP 발현이 높음을 고려하여, 항암효과를 평가하기 마우스 대장암 세포주인 CT26 세포에 마우스 FAP을 과발현을 유도한 종양모델에서 종양성장억제능을 평가하였다.
FAP 발현 종양 동물모델 제작을 위하여 마우스 대장암 세포주인 CT26에 마우스 FAP을 과발현하여 사용하였다. 구체적으로, 배양중인 마우스 FAP 과발현 CT26-mFAP 세포주를 Hanks' Balanced salt solution(HBSS, Gibco)에 재부유한 후 1 ㏄ 주사기(25G)를 이용하여 6 주령 BALB/c 마우스의 좌측 등쪽 피하부위에 각 마우스당 1x106 개의 종양세포를 100 ㎕씩 이식하여 FAP 발현 대장암 동물모델을 수득하였다. 종양 크기는 디지털 버니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 단축과 장축을 측정하였으며, (단축, ㎜)2 x (장축, ㎜) x 0.5의 계산식으로 종양 크기를 주 2 회 측정하였다.
다음으로, 약효평가를 위하여 종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 각 실험군당 7 마리씩 구성하였으며, 대조군으로 PBS를 3일에 1 번 총 4회 복강 투여하였다. T3.01m 단독 투여군, 면역관문 억제제인 aPD-1(Clone RMP1-14, BioXCell) 단독 투여군, T3.01m 및 aPD-1 병용투여군을 실험군으로 하여 종양성장 억제능력을 평가하였다. T3.01m은 100 ㎍, aPD-1은 200 ㎍ 용량으로 3일에 1번 4회 복강 투여하여 종양성장 억제능을 관찰하였다. 측정한 종양 크기를 개체별 그래프로 표시하였으며(도 18a), 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 종양 성장이 억제됨을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험군에서 각 그룹별 4마리 또는 5마리는 첫 복강주사 후 11일째에 IACUC 규정에 따른 처치방법을 통해 종양조직을 수확하였다. 수확한 종양조직은 종양분리(Tumor dissociation, Miltenyi, Germany) 키트를 사용하여 면역세포를 분리하였다. 세포들은 항-마우스 CD45 항체(Biolegend), 항-마우스 CD3 항체(BD), 항-마우스 CD4 항체(Biolegend), 항-마우스 CD8 항체(eBioscience), 항-마우스 CCR7 항체(Biolegend), 항-마우스 CD19 항체(Biolegend), 항-마우스 CD11c 항체(Biolegend), 항-마우스 CD49b 항체(Biolegend), 항-마우스 CD11b 항체(Biolegend), 항-마우스 Gr-1 항체(Biolegend), Live/Dead(eBioscience) 및 Counting beads(eBioscience)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR을 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
그 결과, 도 18a에 나타낸 것과 같이, 투여 후 11일이 경과한 시점에서 대조군, T3.01m 투여군 및 aPD-1 투여군에 대비하여 T3.01m과 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 더 우수한 종양성장 억제능이 관찰되었다. 이러한 결과는, 항-FAP 과 LIGHT 융합 단백질인 T3.01m이 항-PD-1 항체와 병용 투여 시, 대장암 마우스 모델에서 시너지 효과가 현저함을 의미한다.
또한, 종양조직내 면역세포 분포 분석을 통해 상기와 같은 효과가 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용투여에 의한 면역세포의 종양내 침투에 따른 항암효과인지 확인하였다.
그 결과, 도 18b에 나타낸 것과 같이, 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용 투여군의 CD19+ 세포, CD11b+ 세포, CD3+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포, CD11c+ 세포, CD3-CD49b+ 세포 및 CD3+CD49b+ 세포의 절대적인 면역세포의 수가 증가하였음을 확인하였다. 이러한 결과는, 상기와 같은 결과가 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용투여에 의한 면역세포 침투 증가에 따른 항암효과임을 의미한다.
또한, 도 18c에 나타낸 것과 같이, 종양조직내 면역세포의 CCR7+ 세포 분포 분석을 통해 상기와 같은 효과가 융합 단백질에 의해 High endothelial venules(HEV)가 형성되어 Chemotaxis를 유도해 CCR7+ 세포의 침투 증가를 유도했음을 의미한다.
다음으로, 상기 실험군에서 각 그룹별 3 마리는 첫 복강주사 후 11일째에 IACUC 규정에 따른 처치방법을 통해 종양조직을 수확하였다. 수확된 종양조직은 10% Neutral buffered formalin에 24 시간 고정 후 Vacuum Tissue Processor(HistoCorePEARL, Leica)에서 탈수 후, Tissue embedding center(EG1150, Leica)에서 FFPE block을 제작하였다. 종양조직내 면역세포 침투와 HEV 형성을 확인하기 위해 면역조직화학검사(Immunohistochemistry, IHC)하였다. 조직은 항-마우스 CD3 항체(Abcam), 항-마우스 CD19 항체(Cell signaling) 및 항-마우스 MECA-79 항체(Thermo)로 각각 염색되었다.
그 결과, 도 18d에 나타낸 것과 같이, 융합 단백질에 의해 HEV의 형성이 유도되었음을 확인하였다. IHC 결과를 정량화 하여 그래프로 나타내었을 때(도 18e), 융합 단백질이 처리된 군에서 HEV 형성과 면역세포의 침투가 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는, 융합 단백질이 3 차 림프구 구조(Tertiary lymphoid structures, TLS) 형성을 유도함에 따른 면역세포 침투 증가에 의한 항암효과임을 나타낸다.
실시예 4.2. FAP 발현 대장암 동물모델에서의 투여량 의존적인 항암 효능 평가
FAP 발현 종양 동물모델 제작을 위하여 마우스 대장암 세포주인 CT26에 마우스 FAP을 과발현하여 사용하였다. 구체적으로, 배양중인 마우스 FAP 과발현 CT26-mFAP 세포주를 Hanks' Balanced salt solution(HBSS, Gibco)에 재부유한 후 1 ㏄ 주사기(25G)를 이용하여 6주령 BALB/c 마우스의 좌측 등쪽 피하부위에 각 마우스당 1x106 개의 종양세포를 100 ㎕씩 이식하여 FAP 발현 대장암 동물모델을 수득하였다. 종양 크기는 디지털 버니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 단축과 장축을 측정하였으며, (단축, ㎜)2 x (장축, ㎜) x 0.5의 계산식으로 종양 크기를 측정하였다.
다음으로, 약효평가를 위하여 종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 각 실험군당 7 마리씩 구성하였으며, 대조군으로 PBS를 3 일에 1 번 총 4 회 복강 투여하였다. T3.01m 100 ㎍ 단독 투여군, T3.01m 400 ㎍ 단독 투여군, 면역관문 억제제인 aPD-1(Clone RMP1-14) 200 ㎍ 단독 투여군, T3.01m 100 ㎍과 aPD-1 200 ㎍ 병용투여군 및 T3.01m 400 ㎍과 aPD-1 200 ㎍ 병용투여군을 실험군으로하여 종양성장 억제능력을 평가하였다. 모든 실험물질들은 3일에 1번 4회 복강 투여하여 종양성장 억제능을 관찰하였다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다. 측정한 종양 크기를 그래프로 표시하였으며(도 19a 및 도 19b), 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용 투여군이 융합 단백질의 투여량 증가에 따라 종양 성장이 억제됨을 확인하였다. 실험물질에 의한 부작용을 몸무게 변화로 나타내었다(도 19c). 실험물질 복강주사 후 부작용이 없음을 확인하였다.
실시예 4.3. 융합 단백질의 흑색종 동물모델에서의 항암 효능 평가
융합 단백질의 3차 림프구 구조(Tertiary lymphoid structures, TLS) 형성 유도를 통한 항암효과를 확인하기 위하여 면역 세포 침윤이 적은 것으로 알려져 있는 마우스 흑색종 세포주인 B16F10에 마우스 FAP을 과발현 시킨 후 C57BL/6J 마우스에 이식하여 종양성장억제능을 평가하였다.
구체적으로, 배양중인 B16F10-mFAP 세포를 Hanks' Balanced salt solution(HBSS,Gibco)에 재부유한 후 6주령 C57BL/6J 마우스의 좌측 등쪽 피하부위에 각 마우스당 2x105 개의 종양세포를 100 ㎕씩 이식하였다.
다음으로, 약효평가를 위하여 종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 각 실험군당 7 마리씩 구성하였으며, 대조군으로 PBS를 시험군은 3일에 1번 총 4회 복강 투여하였다. T3.01m 300 ㎍ 단독 투여군, 면역관문 억제제인 aPD-1(Clone RMP1-14) 200 ㎍ 단독 투여군 및 T3.01m 300 ㎍ 과 aPD-1 200 ㎍ 병용투여군을 실험군으로 하여 종양성장 억제능력을 평가하였다. 모든 실험물질들은 3일에 1번 4회 복강투여하여 종양성장 억제능을 관찰하였다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다. 측정한 종양 크기를 그래프로 표시하였으며(도 20a 및 도 20b), 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 종양 성장이 억제됨을 확인하였다. 실험물질에 의한 부작용을 몸무게 변화로 나타내었다(도 20c). 실험물질 복강주사 후 부작용이 없음을 확인하였다. 실험물질 복강주사 후 13일째에 인도적 종료시점에 따라 종료된 개체를 제외한 개체들의 종양조직을 분리하여 그룹별 상대적인 무게를 비교하였다(도 20d). 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용투여군에서 종양조직 무게가 줄어든 것을 확인할 수 있었고, 항암효과가 뛰어남을 보여주었다. 수확된 종양조직은 10% Neutral buffered formalin에 고정되었다.
다음으로, 종양조직내 면역세포 침투와 HEV 형성을 확인하기 위해 면역조직화학검사하였다. 조직은 항-마우스 CD3 항체(Abcam), 항-마우스 CD19 항체(Cell signaling) 및 항-마우스 MECA-79 항체(Thermo)로 동시 염색되었다.
그 결과, 도 20e에 나타낸 것과 같이, 융합 단백질에 의해 HEV의 형성이 유도되었음을 확인하였다. IHC 결과를 정량화 하여 그래프로 나타내었을 때(도 20f), 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용투여 처리된 군에서 HEV 형성과 면역세포의 침투가 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는, 면역 세포 침윤이 적은 모델에서 융합 단백질이 3차 림프구 구조 형성을 유도함에 따른 면역세포 침투 증가에 의한 항암효과임을 나타낸다.
다음으로, 종양조직내 면역세포 침투와 HEV 형성을 확인하기 위해 면역조직형광염색(Immunofluorescence, IF)하였다. 조직은 항-마우스 CD3 항체(Abcam) 및 항-마우스 MECA-79 항체(Thermo)로 동시에 형광 염색되었다. 그 결과, 도 20g에 나타낸 것과 같이, 융합 단백질에 의해 HEV 형성이 유도되었음을 확인하였다. IF 결과를 정량화 하여 그래프로 나타내었을 때(도 20h), 융합 단백질과 항-PD-1 항체 병용투여 처리된 군에서 HEV 형성과 T-세포의 침투가 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는, 면역 세포 침윤이 적은 모델에서 융합 단백질이 3차 림프구 구조 형성을 유도함에 따른 면역세포 침투 증가에 의한 항암효과임을 나타낸다.
실시예 4.4. 섬유아세포 공동주입 폐암 동물모델에서의 암표적 시너지 효능 평가
항-FAP 서열 구조와 LIGHT 서열 구조가 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체 형태 융합 단백질의 암표적에 따른 항암효능 비교를 위해, 마우스 FAP을 과발현 시킨 마우스 섬유아세포 세포주인 NIH-3T3-mFAP 세포와 마우스 폐암 세포주인 LLC1을 1:1 비율로 공동주입한 동물모델에서의 종양성장억제능을 확인하였다.
구체적으로, 배양중인 세포를 마우스 FAP 과발현 NIH-3T3-mFAP 세포주와 LLC1 세포주를 각각 5x105 cells/50 ㎕ 농도로 Hanks' Balanced salt solution에 재부유하여 세포를 1:1 비율로 섞은 후 6주령 C57BL/6J 마우스의 좌측 등쪽 피하부위에 각 마우스당 100 ㎕씩 이식하였다.
다음으로, 약효평가를 위하여 종양의 크기가 70 내지 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 각 실험군당 7마리씩 구성하였으며, 대조군으로 PBS를 시험군은 3일에 1번 총 5회 복강 투여하였다. T3.13m, T3.11m, aPD-1 병용투여군; T3.13m, aPD-1 병용투여군; T3.01m, aPD-1 병용투여군; aPD-1 투여군을 실험군으로 하여 종양성장 억제능력을 평가하였다. 모든 실험물질들은 3 일에 1번 5회 복강투여하여 종양성장 억제능을 관찰하였다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 것과 같이, 투여 후 15일이 경과한 시점에서 대조군에 대비하여 T3.01m 과 aPD-1 병용투여군에서 우수한 종양성장 억제능이 관찰되었으며, T3.13m, aPD-1 병용투여군 및 T3.13m, T3.11m, aPD-1 병용투여군과 비교하여 T3.01m 과 aPD-1 병용투여군에서 우수한 종양성장 억제능이 확인되었다. 이러한 결과는, FAP만 표적하는 경우 또는 암표적이 없는 LIGHT와 비교하였을 경우보다 일 구체예의 융합 단백질이 시너지 효과가 현저함을 의미한다.
<110> Kanaph Therapeutics <120> FUSION PROTEIN COMPRISING LIGHT PROTEIN AND ANTI-FAP ANTIBODY AND USE THEREOF <130> SPD22-033KNP <160> 298 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hu FAP HC-hu IgG1 Fc Knob DANG <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hu FAP LC <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 3 <211> 693 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu scLIGHT3-hu IgG1 Fc hole DANG <400> 3 Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe 20 25 30 Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala 35 40 45 Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys 50 55 60 Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr 65 70 75 80 Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro 85 90 95 Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe 100 105 110 Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg 115 120 125 Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr 130 135 140 Phe Gly Ala Phe Met Val Gly Gly Ser Gly Glu Val Asn Pro Ala Ala 145 150 155 160 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 165 170 175 Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr 180 185 190 His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 195 200 205 Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser 210 215 220 Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu 225 230 235 240 Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser 245 250 255 Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His 260 265 270 Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu 275 280 285 Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 290 295 300 Gly Gly Ser Gly Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn 305 310 315 320 Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu 325 330 335 Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val 340 345 350 Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly 355 360 365 Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu 370 375 380 Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser 385 390 395 400 Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp 405 410 415 Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys 420 425 430 Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly 435 440 445 Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 465 470 475 480 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 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tcgtcaccaa agccggatac tattacatct actctaaagt ccagctgggg 1200 ggcgtcggct gcccactggg actggcaagc actattaccc acggactgta taagaggacc 1260 cctcgctacc cagaagaact ggaactgctg gtgtctcagc agagcccttg tggcagggcc 1320 acatcctcta gtcgcgtgtg gtgggactcc tctttcctgg gcggcgtcgt gcacctggaa 1380 gccggcgaaa aagtcgtggt gcgggtgctg gatgagagac tggtgcggtt aagagatggc 1440 acccggagct atttcggcgc ctttatggtg ggaggaggag gaagcggcgg aggcggatcc 1500 ggaggaggcg gcagcggagg aggaggctcc gacaagaccc acacatgccc accttgtcca 1560 gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc caaggatacc 1620 ctgatgatca gcagaacccc agaggtgaca tgcgtggtcg tggccgtgtc ccacgaggac 1680 cctgaggtga agtttaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag 1740 ccccgggagg agcagtatgg ctctacctac agagtggtga gcgtgctgac agtgctgcac 1800 caggactggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaggtgt ctaataaggc cctgcctgcc 1860 ccaatcgaga agaccatcag caaggcaaag ggacagccaa gggagcctca ggtgtacacc 1920 ctgcctccaa gccgcgacga gctgacaaag aaccaggtga gcctgtcctg tgccgtgaag 1980 ggcttctatc ctagcgatat cgccgtggag tgggagtcca atggccagcc agagaacaat 2040 tacaagacca caccccctgt gctggactcc gatggctctt tctttctggt gtccaagctg 2100 accgtggata agtctcggtg gcagcagggc aacgtgtttt cttgtagcgt gatgcacgag 2160 gccctgcaca atcactacac acagaagtcc ctgtctctga gccccggcaa g 2211 <210> 44 <211> 2079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of hu scLIGHT(226-231)3-hu IgG1 Fc hole DANG <400> 44 gaggtcaacc ccgcagccca cctgacggga gccaacagta gcctgaccgg gagcggcggt 60 cccctgctgt gggagactca gcttggcctg gcatttctgc gaggtttgag ctaccatgac 120 ggcgctcttg ttgtgaccaa ggcgggttac tactacatct attcaaaggt tcagctgggg 180 ggtgtcggtt gcccactggg tctcgcctca accatcaccc acggcctgta taaaaggacc 240 ccgaggtacc cggaggaact tgaattgctt gtgagccagc agagcccctg tggtcgggcc 300 acctcaagct cacgggtttg gtgggattcc tctttcctgg gcggtgttgt gcatcttgaa 360 gccggtgaga aagtggtagt gagggtcctg gacgagcgac tcgtcgacta taccaaggag 420 gacaggtcat attttggcgc atttatggta ggaggatcag gagaggtgaa cccagccgcc 480 catctgactg gggccaactc aagtcttacc 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gaggtcaacc ccgcagccca cctgacggga gccaacagta gcctgaccgg gagcggcggt 60 cccctgctgt gggagactca gcttggcctg gcatttctgc gaggtttgag ctaccatgac 120 ggcgctcttg ttgtgaccaa ggcgggttac tactacatct attcaaaggt tcagctgggg 180 ggtgtcggtt gcccactggg tctcgcctca accatcaccc acggcctgta taaaaggacc 240 ccgaggtacc cggaggaact tgaattgctt gtgagccagc agagcccctg tggtcgggcc 300 acctcaagct caagtaactg gttcgattcc tctttcctgg gcggtgttgt gcatcttgaa 360 gccggtgaga aagtggtagt gagggtcctg gacgagcgac tcgtcagact gcgagatggc 420 acgaggtcat attttggcgc atttatggta ggaggatcag gagaggtgaa cccagccgcc 480 catctgactg gggccaactc aagtcttacc ggcagcggag gccccctgtt gtgggaaacg 540 caattggggc tggcgttcct gagggggctg agctatcacg acggtgccct ggtggttacc 600 aaagcgggct actattacat ttatagcaag gtgcaacttg gcggcgtcgg ctgccccttg 660 ggtctggcga gcacgattac ccatggcctc tacaagagga cgcccagata ccccgaagag 720 ctggagttgc tcgtgtccca gcagtcacct tgtggaaggg cgacctccag ttccagcaac 780 tggtttgaca gcagcttctt gggcggagtc gtccacctgg aggcaggcga aaaggtggtg 840 gtgagagtgc ttgatgagag gctggtgagg ctgagggacg gcaccagaag ctatttcggc 900 gctttcatgg tcggcggaag cggtgaggta aatcccgctg ctcatttgac cggcgccaat 960 tcctctctga ccggcagcgg aggccctctg ctgtgggaga cccagctggg actggctttt 1020 ctgaggggac tctcctacca tgatggagct ctggtcgtca ccaaggccgg atactactac 1080 atctactcca aagtgcaact cggaggagtc ggctgtcctc tcggactggc cagcacaatt 1140 acccatggac tgtacaaaag gacccctagg taccccgaag aactggagct gctcgtgtcc 1200 caacaatccc cttgcggaag agctacatcc agctccagca attggttcga cagctccttt 1260 ctgggaggag tggtccacct cgaagccggc gagaaagtcg tggtcagagt gctggacgag 1320 agactcgtcc gattgaggga tggaaccaga agctactttg gcgctttcat ggtgggcgga 1380 agcggcggag gcggaagcga taagacacac acatgccctc cttgccccgc ccccgagctg 1440 ctcggaggcc ctagcgtgtt tctgttcccc cccaagccca aagacacact gatgatctcc 1500 agaacccccg aggtgacatg cgtggtggtg gctgtgtccc atgaggaccc cgaagtcaag 1560 ttcaactggt acgtcgacgg cgtggaagtc cacaacgcca agacaaagcc tagagaggag 1620 caatacggca gcacatatag ggtcgtgagc gtgctgaccg tcctccacca agactggctc 1680 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aataaagctc tgcccgctcc catcgagaaa 1740 accatcagca aggccaaagg ccagcctagg gagccccaag tgtacacact gcctccctct 1800 agagacgagc tgaccaagaa tcaagtgtcc ctcagctgcg ctgtcaaggg cttctacccc 1860 agcgacattg ccgtggaatg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta taagaccacc 1920 ccccccgtgc tggattccga tggctccttc tttctggtga gcaaactgac agtggacaag 1980 tctagatggc agcaaggcaa cgtctttagc tgcagcgtca tgcacgaggc tctgcacaat 2040 cactacaccc agaagtctct gtctctgagc cccggcaaa 2079 <210> 46 <211> 2304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob DANG-hu scLIGHT2 <400> 46 caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaaga cctccagata caccttcaca gagtatacaa tccactgggt gcgccaggca 120 cctggacagc ggctggagtg gatcggaggc atcaacccca acaatggcat ccctaactac 180 aatcagaagt ttaagggcag agtgaccatc acagtggaca cctccgcctc tacagcctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc ccggagaagg 300 atcgcctacg gctatgacga gggccacgcc atggattact ggggccaggg caccctggtg 360 acagtgtcta gcgcctctac caagggacca agcgtgttcc cactggcacc atcctctaag 420 agcacctccg gaggaacagc cgccctgggc tgtctggtga aggactattt cccagagccc 480 gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggag tgcacacatt tcctgccgtg 540 ctgcagagct ccggcctgta cagcctgtct agcgtggtga ccgtgccatc ctctagcctg 600 ggcacccaga catatatctg caacgtgaat cacaagccta gcaatacaaa ggtggacaag 660 aaggtggagc caaagtcctg tgataagacc cacacatgcc ccccttgtcc tgcaccagag 720 ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 tctcgcaccc cagaggtgac atgcgtggtg gtggccgtga gccacgagga ccccgaggtg 840 aagtttaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcacaatg ccaagaccaa gccaagagag 900 gagcagtacg gctccaccta tagggtggtg tctgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 960 ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg tccaataagg ccctgcccgc ccctatcgag 1020 aagaccatct ctaaggcaaa gggacagcct agggagccac aggtgtacac cctgcctcca 1080 tcccgggacg agctgacaaa gaaccaggtg tctctgtggt gtctggtgaa gggcttctat 1140 ccctctgata tcgccgtgga gtgggagagc aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc 1200 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cccagagccc 480 gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggag tgcacacatt tcctgccgtg 540 ctgcagagct ccggcctgta cagcctgtct agcgtggtga ccgtgccatc ctctagcctg 600 ggcacccaga catatatctg caacgtgaat cacaagccta gcaatacaaa ggtggacaag 660 aaggtggagc caaagtcctg tgacaagacc cacacatgcc caccatgtcc agcacctgag 720 ctgctgggag gaccatccgt gttcctgttt cctccaaagc ccaaggatac actgatgatc 780 agccgcacac ctgaggtgac ctgcgtggtg gtggccgtgt cccacgagga ccccgaggtg 840 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaatg ccaagaccaa gcccagggag 900 gagcagtacg gctctacata tcgcgtggtg agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg tctaataagg ccctgccagc ccccatcgag 1020 aagaccatca gcaaggcaaa gggacagcca agggagcctc aggtgtatac actgccccct 1080 agccgcgatg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgtctt gtgccgtgaa gggcttctac 1140 ccatccgaca tcgccgtgga gtgggagtct aatggccagc ccgagaacaa ttataagacc 1200 acaccacccg tgctggactc cgatggctct ttctttctgg tgagcaagct gacagtggac 1260 aagtccagat ggcagcaggg caacgtgttt agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aatcactaca cccagaagtc tctgagcctg tcccctggca agggtggagg tggctcagga 1380 ggaggcggtt ctgaagtgaa ccctgccgct catctgactg gggctaactc aagtctgacc 1440 ggaagtgggg gacctctgct gtgggaaact cagctggggc tggccttcct gaggggcctg 1500 agctatcacg acggcgccct ggtggtgacc aaggcaggct actattacat ctacagcaag 1560 gtgcagctgg gaggagtggg atgcccactg ggcctggcat ccaccatcac acacggcctg 1620 tataagagga cccctcgcta cccagaggag ctggagctgc tggtgagcca gcagtcccct 1680 tgtggaaggg ccacaagctc ctctagagtg tggtgggata gctcctttct gggaggagtg 1740 gtgcacctgg aggcaggaga gaaggtggtg gtgcgggtgc tggacgagag actggtgcgg 1800 ctgagagatg gcaccagatc ctatttcggc gcctttatgg tg 1842 <210> 48 <211> 1839 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc DANG-hu LIGHT <400> 48 caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaaga cctccagata caccttcaca gagtatacaa tccactgggt gcgccaggca 120 cctggacagc ggctggagtg gatcggaggc atcaacccca acaatggcat ccctaactac 180 aatcagaagt ttaagggcag agtgaccatc 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sequence of anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob-hu scLIGHT2 <400> 49 caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaaga cctccagata caccttcaca gagtatacaa tccactgggt gcgccaggca 120 cctggacagc ggctggagtg gatcggaggc atcaacccca acaatggcat ccctaactac 180 aatcagaagt ttaagggcag agtgaccatc acagtggaca cctccgcctc tacagcctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc ccggagaagg 300 atcgcctacg gctatgacga gggccacgcc atggattact ggggccaggg caccctggtg 360 acagtgtcta gcgcctctac caagggacca agcgtgttcc cactggcacc atcctctaag 420 agcacctccg gaggaacagc cgccctgggc tgtctggtga aggactattt cccagagccc 480 gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggag tgcacacatt tcctgccgtg 540 ctgcagagct ccggcctgta cagcctgtct agcgtggtga ccgtgccatc ctctagcctg 600 ggcacccaga catatatctg caacgtgaat cacaagccta gcaatacaaa ggtggacaag 660 aaggtggagc caaagtcctg tgataagacc cacacatgcc ccccttgtcc tgcaccagag 720 ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 tctcgcaccc cagaggtgac 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agaggagctg gagctgctgg tgagccagca gtccccttgt 1680 ggaagggcca caagctcctc tagagtgtgg tgggatagct cctttctggg aggagtggtg 1740 cacctggagg caggagagaa ggtggtggtg cgggtgctgg acgagagact ggtgcggctg 1800 agagatggca ccagatccta tttcggcgcc tttatggtgg gtgggtctgg cgaggtgaac 1860 cccgccgccc atctgaccgg cgccaatagc agcctgacag gcagcggcgg ccctctgctg 1920 tgggagacac agctgggtct tgcttttctg cgcggcctgt cttatcacga cggcgctctg 1980 gtcgtgacca aggccggcta ctactacatc tacagcaagg tgcaactggg cggcgtggga 2040 tgtcctctgg gcctggcctc taccatcaca cacggcctgt acaaaagaac ccctcggtac 2100 cccgaggaac tggaactcct ggtcagccag caatctccat gcggcagagc caccagctct 2160 tctagagtgt ggtgggatag cagcttcctg ggcggcgtgg tgcacctgga ggccggcgag 2220 aaggtggtgg tcagagtgct ggacgagaga ctggtgcggc tgagagatgg gaccagaagc 2280 tacttcggcg cctttatggt g 2301 <210> 50 <211> 1839 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc hole-hu LIGHT <400> 50 caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaaga 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anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc DANG <400> 53 caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60 agctgcaaga cctccagata caccttcaca gagtatacaa tccactgggt gcgccaggca 120 cctggacagc ggctggagtg gatcggaggc atcaacccca acaatggcat ccctaactac 180 aatcagaagt ttaagggcag agtgaccatc acagtggaca cctccgcctc tacagcctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc ccggagaagg 300 atcgcctacg gctatgacga gggccacgcc atggattact ggggccaggg caccctggtg 360 acagtgtcta gcgcctctac caagggacca agcgtgttcc cactggcacc atcctctaag 420 agcacctccg gaggaacagc cgccctgggc tgtctggtga aggactattt cccagagccc 480 gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggag tgcacacatt tcctgccgtg 540 ctgcagagct ccggcctgta cagcctgtct agcgtggtga ccgtgccatc ctctagcctg 600 ggcacccaga catatatctg caacgtgaat cacaagccta gcaatacaaa ggtggacaag 660 aaggtggagc caaagtcctg tgataagacc cacacatgcc ccccttgtcc tgcaccagag 720 ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 tctcgcaccc cagaggtgac atgcgtggtg gtggccgtga 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gaggagagcg ggtgtacgtg aatatctctc atcctgatat ggtggacttc 1380 gcacggggaa aaaccttctt tggggctgtc atggtcggag gctctggagg aggcggcagc 1440 gacaagaccc acacatgccc accatgtcca gcacctgagc tgctgggagg accatccgtg 1500 ttcctgtttc ctccaaagcc caaggataca ctgatgatca gccgcacacc tgaggtgacc 1560 tgcgtggtgg tggccgtgtc ccacgaggac cccgaggtga agtttaactg gtacgtggac 1620 ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagggagg agcagtacgg ctctacatat 1680 cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1740 tgcaaggtgt ctaataaggc cctgccagcc cccatcgaga agaccatcag caaggcaaag 1800 ggacagccaa gggagcctca ggtgtataca ctgcccccta gccgcgatga gctgaccaag 1860 aaccaggtgt ccctgtcttg tgccgtgaag ggcttctacc catccgacat cgccgtggag 1920 tgggagtcta atggccagcc cgagaacaat tataagacca caccacccgt gctggactcc 1980 gatggctctt tctttctggt gagcaagctg acagtggaca agtccagatg gcagcagggc 2040 aacgtgttta gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagtct 2100 ctgagcctgt cccctggcaa g 2121 <210> 59 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob DANG <400> 59 caggtgcagc tgcagcagtc cggagcagag ctggcaaggc ctggagcctc tgtgaacctg 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcaca aacaatggca tcaattggct gaagcagagg 120 accggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccaa gatctaccaa cacactgtat 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagcagacc ggagctccaa caccgcctac 240 atggagctga gaagcctgac atccgaggat tctgccgtgt atttttgtgc acgcaccctg 300 acagcaccct tcgccttttg gggacagggc accctggtga cagtgagcgc cgccaagacc 360 acagcaccaa gcgtgtatcc actggcaccc gtgtgcggcg ataccacagg ctctagcgtg 420 accctgggct gtctggtgaa gggctacttc cctgagccag tgaccctgac atggaacagc 480 ggctctctgt cctctggcgt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtccga tctgtataca 540 ctgagctcct ctgtgaccgt gacaagctcc acctggccca gccagtccat cacatgcaac 600 gtggcccacc ctgcctctag caccaaggtg gacaagaaga tcgagccacg gggccccaca 660 atcaagccat gtccaccttg caagtgtcca gcacctaatc tgctgggagg acctagcgtg 720 ttcatctttc cacccaagat caaggacgtg ctgatgatct ctctgagccc tatcgtgacc 780 tgcgtggtgg tggccgtgtc tgaggacgat ccagatgtgc agatcagctg gttcgtgaac 840 aatgtggagg tgcacaccgc ccagacccag acacaccggg aggactacgg ctccacactg 900 agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga tgtccggcaa ggagtttaag 960 tgcaaggtga acaataagga tctgccagcc cccatcgaga ggaccatctc taagcctaag 1020 ggcagcgtgc gcgcaccaca ggtgtatgtg ctgcctccac ccgaggagga gatgaccaag 1080 aagcaggtga cactgtggtg tatggtgacc gacttcatgc cagaggatat ctacgtggag 1140 tggaccaaca atggcaagac agagctgaac tataagaata cagagcccgt gctggacagc 1200 gatggctcct actttatgta tagcaagctg agggtggaga agaagaactg ggtggagcgc 1260 aattcctact cttgtagcgt ggtgcacgag ggcctgcaca accaccacac cacaaagtcc 1320 ttttctagaa cccccggcaa g 1341 <210> 60 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP LC <400> 60 cagatcgtgc tgacacagtc ccctgccatc atgtctgcca gcccaggcga gaaggtgacc 60 atgacatgct ctgccagctc cggcgtgaac ttcatgcact ggtaccagca gaagtctggc 120 acaagcccca agcggtggat cttcgacacc tccaagctgg cctctggcgt gcctgccaga 180 ttttccggct ctggcagcgg cacatcctat tctctgacca tctctagcat ggaggccgag 240 gacgccgcca cctactattg ccagcagtgg agcttcaatc cccctacatt tggcggcggc 300 accaagctgg agatcaagag ggcagatgca gcaccaacag tgtccatctt tccaccctcc 360 tctgagcagc tgaccagcgg aggagcatcc gtggtgtgct tcctgaacaa cttctacccc 420 aaggacatca acgtgaagtg gaagatcgat ggctctgaga ggcagaacgg cgtgctgaat 480 agctggacag accaggattc caaggactct acctatagca tgagctccac cctgacactg 540 accaaggatg agtacgagag gcacaatagc tatacatgcg aggccaccca caagacaagc 600 acctccccta tcgtgaagtc cttcaaccgc aatgagtgt 639 <210> 61 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu scLIGHT3-mu IgG2a Fc hole DANG <400> 61 aaccctgcag cacacctgac cggagcaaat gcatccctga tcggaatcgg aggaccactg 60 ctgtgggaga caaggctggg actggccttc ctgaggggac tgacctacca cgatggcgcc 120 ctggtgacaa tggagccagg ctactattac gtgtatagca aggtgcagct gtccggagtg 180 ggatgcccac agggactggc caacggcctg cctatcaccc acggcctgta taagcggaca 240 agcagatacc ccaaggagct ggagctgctg gtgtcccgga gatctccttg tggaagggcc 300 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atcgagcgga caatctctaa gcctaagggc agcgtgagag ccccacaggt gtatgtgctg 1800 cctccacccg aggaggagat gaccaagaag caggtgacac tgtcttgtgc cgtgaccgac 1860 ttcatgcctg aggatatcta tgtggagtgg accaacaatg gcaagacaga gctgaactac 1920 aagaatacag agccagtgct ggactccgat ggctcttact tcatggtgag caagctgagg 1980 gtggagaaga agaactgggt ggagcgcaat tcttacagct gctccgtggt gcacgagggc 2040 ctgcacaacc accacaccac aaagtctttt agccggaccc ctggcaag 2088 <210> 64 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu scLIGHT(225-230)3-mu IgG2a Fc hole DANG <400> 64 aaccctgcag cacacctgac cggagcaaat gcatccctga tcggaatcgg aggaccactg 60 ctgtgggaga caaggctggg actggccttc ctgaggggac tgacctacca cgatggcgcc 120 ctggtgacaa tggagccagg ctactattac gtgtatagca aggtgcagct gtccggagtg 180 ggatgcccac agggactggc caacggcctg cctatcaccc acggcctgta taagcggaca 240 agcagatacc ccaaggagct ggagctgctg gtgtcccgga gatctccttg tggaagggcc 300 aacagctccc gcgtgtggtg ggattctagc ttcctgggag gagtggtgca cctggaggca 360 ggcgaggagg tggtggtgcg ggtgcctggc 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ctggcaag 2088 <210> 65 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu scLIGHT(194-197)3-mu IgG2a Fc hole DANG <400> 65 aaccctgcag cacacctgac cggagcaaat gcatccctga tcggaatcgg aggaccactg 60 ctgtgggaga caaggctggg actggccttc ctgaggggac tgacctacca cgatggcgcc 120 ctggtgacaa tggagccagg ctactattac gtgtatagca aggtgcagct gtccggagtg 180 ggatgcccac agggactggc caacggcctg cctatcaccc acggcctgta taagcggaca 240 agcagatacc ccaaggagct ggagctgctg gtgtcccgga gatctccttg tggaagggcc 300 aacagctcca acaattggtt cgattctagc ttcctgggag gagtggtgca cctggaggca 360 ggcgaggagg tggtggtgcg ggtgcctggc aatagactgg tgaggccaag ggacggaacc 420 cggtcttact tcggagcctt tatggtggga ggcagcggca acccagcagc acacctgacc 480 ggcgccaacg ccagcctgat tggaatcgga ggacctctgc tgtgggaaac caggctggga 540 ctggcctttc tgagaggact gacctaccac gacggcgccc tggtcaccat ggagccaggc 600 tattactacg tgtactctaa ggtgcagctg agtggcgtcg gctgtcctca gggactggcc 660 aatggcctgc ccattactca cggcctgtat aagaggacaa gccgctaccc aaaagaactg 720 gagctgctgg tgagcaggcg ctccccatgt ggaagggcca actcctctaa taattggttc 780 gatagctcct tcctgggcgg cgtcgtccac ctggaagccg gagaagaagt cgtggtgcgg 840 gtgccaggaa atagactggt gcggcctaga gacggcacca gatcctattt cggcgccttt 900 atggtgggcg gctccggaaa tcccgccgcc cacctgactg gcgccaacgc ctctctgatt 960 ggcattggcg gccctctgct gtgggaaact agactgggcc tggcctttct gcgcggcctg 1020 acttatcatg acggcgccct ggtcactatg gagcctggat attattacgt gtattccaag 1080 gtgcagctgt ctggagtggg atgccctcag ggcctggcta acggcctgcc aattacacat 1140 ggactgtaca aacggacaag cagataccct aaagaactgg aactgctggt gtctcggaga 1200 agcccatgtg gcagggccaa ctctagtaac aattggtttg actcctcttt cctgggcggc 1260 gtcgtgcacc tggaagccgg agaggaagtc gtggtgcggg tcccagggaa caggctggtg 1320 aggcctaggg acggaaccag gagctacttt ggagccttta tggtcggcgg cagcggggga 1380 ggaggctccg agccacgcgg ccccacaatc aagccatgcc ccccttgcaa gtgtcctgca 1440 ccaaatctgc tgggaggacc atccgtgttc atctttccac ccaagatcaa ggacgtgctg 1500 atgatcagcc tgtccccaat cgtgacctgc gtggtcgtgg ccgtgagcga ggacgatcct 1560 gatgtgcaga tctcctggtt cgtgaacaat gtggaggtgc acaccgccca gacccagaca 1620 caccgggagg actacggctc cacactgaga gtggtgtctg ccctgcccat ccagcaccag 1680 gactggatga gcggcaagga gtttaagtgc aaggtgaaca ataaggatct gcccgcccct 1740 atcgagcgga caatctctaa gcctaagggc agcgtgagag ccccacaggt gtatgtgctg 1800 cctccacccg aggaggagat gaccaagaag caggtgacac tgtcttgtgc cgtgaccgac 1860 ttcatgcctg aggatatcta tgtggagtgg accaacaatg gcaagacaga gctgaactac 1920 aagaatacag agccagtgct ggactccgat ggctcttact tcatggtgag caagctgagg 1980 gtggagaaga agaactgggt ggagcgcaat tcttacagct gctccgtggt gcacgagggc 2040 ctgcacaacc accacaccac aaagtctttt agccggaccc ctggcaag 2088 <210> 66 <211> 2277 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob DANG-mu scLIGHT2 <400> 66 caggtgcagc tgcagcagtc cggagcagag ctggcaaggc ctggagcctc tgtgaacctg 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcaca aacaatggca tcaattggct gaagcagagg 120 accggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccaa gatctaccaa cacactgtat 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagcagacc ggagctccaa caccgcctac 240 atggagctga gaagcctgac atccgaggat tctgccgtgt atttttgtgc acgcaccctg 300 acagcaccct tcgccttttg gggacagggc accctggtga cagtgagcgc cgccaagacc 360 acagcaccaa gcgtgtatcc actggcaccc gtgtgcggcg ataccacagg ctctagcgtg 420 accctgggct gtctggtgaa gggctacttc cctgagccag tgaccctgac atggaacagc 480 ggctctctgt cctctggcgt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtccga tctgtataca 540 ctgagctcct ctgtgaccgt gacaagctcc acctggccca gccagtccat cacatgcaac 600 gtggcccacc ctgcctctag caccaaggtg gacaagaaga tcgagccacg gggccccaca 660 atcaagccat gtccaccttg caagtgtcca gcacctaatc tgctgggagg acctagcgtg 720 ttcatctttc cacccaagat caaggacgtg ctgatgatct ctctgagccc tatcgtgacc 780 tgcgtggtgg tggccgtgtc tgaggacgat ccagatgtgc agatcagctg gttcgtgaac 840 aatgtggagg tgcacaccgc ccagacccag acacaccggg aggactacgg ctccacactg 900 agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga tgtccggcaa ggagtttaag 960 tgcaaggtga acaataagga tctgccagcc cccatcgaga ggaccatctc taagcctaag 1020 ggcagcgtgc gcgcaccaca ggtgtatgtg ctgcctccac ccgaggagga gatgaccaag 1080 aagcaggtga cactgtggtg tatggtgacc gacttcatgc cagaggatat ctacgtggag 1140 tggaccaaca atggcaagac agagctgaac tataagaata cagagcccgt gctggacagc 1200 gatggctcct actttatgta tagcaagctg agggtggaga agaagaactg ggtggagcgc 1260 aattcctact cttgtagcgt ggtgcacgag ggcctgcaca accaccacac cacaaagtcc 1320 ttttctagaa cccccggcaa gggtggaggt ggctcaggag gaggcggttc taaccctgca 1380 gcacacctga ccggagcaaa tgcatccctg atcggaatcg gaggaccact gctgtgggag 1440 acaaggctgg gactggcctt cctgagggga ctgacctacc acgatggcgc cctggtgaca 1500 atggagccag gctactatta cgtgtatagc aaggtgcagc tgtccggagt gggatgccca 1560 cagggactgg ccaacggcct gcctatcacc cacggcctgt ataagcggac aagcagatac 1620 cccaaggagc tggagctgct ggtgtcccgg agatctcctt gtggaagggc caacagctcc 1680 cgcgtgtggt gggattctag cttcctggga ggagtggtgc acctggaggc aggcgaggag 1740 gtggtggtgc gggtgcctgg caatagactg gtgaggccaa gggacggaac ccggtcttac 1800 ttcggcgcct ttatggtggg tgggtctggc aatccagccg cccacctgac aggcgccaac 1860 gccagcctga tcggcatcgg cggacctctg ctgtgggaga caagactggg actggccttc 1920 ctgagaggcc tgacatatca cgatggcgcc ctggtgacaa tggaacctgg ctactactac 1980 gtgtacagca aggtgcagct gagcggagtt ggctgcccac agggcctcgc caatggcctg 2040 cctatcaccc acggcctgta caaacgcacc agcagatacc ccaaggaact ggagctgctg 2100 gtgtccaggc ggtctccttg cggcagagcc aactccagcc gggtgtggtg ggatagctct 2160 ttcctgggcg gcgtggtgca tctggaagcc ggcgaggaag tggtcgtgcg ggtgccagga 2220 aatagactgg ttagacctag agatgggacc agaagctact tcggcgcttt tatggtg 2277 <210> 67 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc hole DANG-mu LIGHT <400> 67 caggtgcagc tgcagcagtc cggagcagag ctggcaaggc ctggagcctc tgtgaacctg 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcaca aacaatggca tcaattggct gaagcagagg 120 accggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccaa gatctaccaa cacactgtat 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagcagacc ggagctccaa caccgcctac 240 atggagctga gaagcctgac atccgaggat tctgccgtgt atttttgtgc acgcaccctg 300 acagcaccct tcgccttttg gggacagggc accctggtga cagtgagcgc cgccaagacc 360 acagcaccaa gcgtgtatcc actggcaccc gtgtgcggcg ataccacagg ctctagcgtg 420 accctgggct gtctggtgaa gggctacttc cctgagccag tgaccctgac atggaacagc 480 ggctctctgt cctctggcgt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtccga tctgtataca 540 ctgagctcct ctgtgaccgt gacaagctcc acctggccca gccagtccat cacatgcaac 600 gtggcccacc ctgcctctag caccaaggtg gacaagaaga tcgagccacg cggccccaca 660 atcaagccat gccccccttg caagtgtcct gcaccaaatc tgctgggagg accatccgtg 720 ttcatctttc cacccaagat caaggacgtg ctgatgatca gcctgtcccc aatcgtgacc 780 tgcgtggtcg tggccgtgag cgaggacgat cctgatgtgc agatctcctg gttcgtgaac 840 aatgtggagg tgcacaccgc ccagacccag acacaccggg aggactacgg ctccacactg 900 agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga tgagcggcaa ggagtttaag 960 tgcaaggtga acaataagga tctgcccgcc cctatcgagc ggacaatctc taagcctaag 1020 ggcagcgtga gagccccaca ggtgtatgtg ctgcctccac ccgaggagga gatgaccaag 1080 aagcaggtga cactgtcttg tgccgtgacc gacttcatgc ctgaggatat ctatgtggag 1140 tggaccaaca atggcaagac agagctgaac tacaagaata cagagccagt gctggactcc 1200 gatggctctt acttcatggt gagcaagctg agggtggaga agaagaactg ggtggagcgc 1260 aattcttaca gctgctccgt ggtgcacgag ggcctgcaca accaccacac cacaaagtct 1320 tttagccgga cccctggcaa gggtggaggt ggctcaggag gaggcggttc taaccctgca 1380 gcacacctga ccggagcaaa tgcatccctg atcggaatcg gaggaccact gctgtgggag 1440 acaaggctgg gactggcctt cctgagggga ctgacctacc acgatggcgc cctggtgaca 1500 atggagccag gctactatta cgtgtatagc aaggtgcagc tgtccggagt gggatgccca 1560 cagggactgg ccaacggcct gcctatcacc cacggcctgt ataagcggac aagcagatac 1620 cccaaggagc tggagctgct ggtgtcccgg agatctcctt gtggaagggc caacagctcc 1680 cgcgtgtggt gggattctag cttcctggga ggagtggtgc acctggaggc aggcgaggag 1740 gtggtggtgc gggtgcctgg caatagactg gtgaggccaa gggacggaac ccggtcttac 1800 ttcggcgcct ttatggtg 1818 <210> 68 <211> 1815 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc DANG-mu LIGHT <400> 68 caggtgcagc tgcagcagtc cggagcagag ctggcaaggc ctggagcctc tgtgaacctg 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcaca aacaatggca tcaattggct gaagcagagg 120 accggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccaa gatctaccaa cacactgtat 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagcagacc ggagctccaa caccgcctac 240 atggagctga gaagcctgac atccgaggat tctgccgtgt atttttgtgc acgcaccctg 300 acagcaccct tcgccttttg gggacagggc accctggtga cagtgagcgc cgccaagacc 360 acagcaccaa gcgtgtatcc actggcaccc gtgtgcggcg ataccacagg ctctagcgtg 420 accctgggct gtctggtgaa gggctacttc cctgagccag tgaccctgac atggaacagc 480 ggctctctgt cctctggcgt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtccga tctgtataca 540 ctgagctcct ctgtgaccgt gacaagctcc acctggccca gccagtccat cacatgcaac 600 gtggcccacc ctgcctctag caccaaggtg gacaagaaga tcgagccacg gggccccaca 660 atcaagccat gtccaccttg caagtgtcca gcacctaatc tgctgggagg acctagcgtg 720 ttcatctttc cacccaagat caaggacgtg ctgatgatct ctctgagccc tatcgtgacc 780 tgcgtggtgg tggccgtgtc tgaggacgat ccagatgtgc agatcagctg gttcgtgaac 840 aatgtggagg tgcacaccgc ccagacccag acacaccggg aggactacgg ctccacactg 900 agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga tgtccggcaa ggagtttaag 960 tgcaaggtga acaataagga tctgccagcc cccatcgaga ggaccatctc taagcctaag 1020 ggcagcgtgc gcgcaccaca ggtgtatgtg ctgcctccac ccgaggagga gatgaccaag 1080 aagcaggtga cactgacgtg tatggtgacc gacttcatgc cagaggatat ctacgtggag 1140 tggaccaaca atggcaagac agagctgaac tataagaata cagagcccgt gctggacagc 1200 gatggctcct actttatgta tagcaagctg agggtggaga agaagaactg ggtggagcgc 1260 aattcctact cttgtagcgt ggtgcacgag ggcctgcaca accaccacac cacaaagtcc 1320 ttttctagaa cccccggcgg tggaggtggc tcaggaggag gcggttctaa ccctgcagca 1380 cacctgaccg gagcaaatgc atccctgatc ggaatcggag gaccactgct gtgggagaca 1440 aggctgggac tggccttcct gaggggactg acctaccacg atggcgccct ggtgacaatg 1500 gagccaggct actattacgt gtatagcaag gtgcagctgt ccggagtggg atgcccacag 1560 ggactggcca acggcctgcc tatcacccac ggcctgtata agcggacaag cagatacccc 1620 aaggagctgg agctgctggt gtcccggaga tctccttgtg gaagggccaa cagctcccgc 1680 gtgtggtggg attctagctt cctgggagga gtggtgcacc tggaggcagg cgaggaggtg 1740 gtggtgcggg tgcctggcaa tagactggtg aggccaaggg acggaacccg gtcttacttc 1800 ggcgccttta tggtg 1815 <210> 69 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu IgG2a Fc hole DANG <400> 69 gagccaaggg gccccaccat caagccatgc cccccttgca agtgtcctgc accaaacctg 60 ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagatca aggacgtgct gatgatcagc 120 ctgtccccca tcgtgacatg cgtggtggtg gccgtgtccg aggacgatcc tgatgtgcag 180 atctcttggt tcgtgaacaa tgtggaggtg cacaccgccc agacccagac acaccgggag 240 gactatggct ctacactgag agtggtgagc gccctgccca tccagcacca ggactggatg 300 agcggcaagg agtttaagtg caaggtgaac aataaggatc tgcccgcccc tatcgagcgg 360 accatcagca agcctaaggg ctccgtgaga gccccacagg tgtacgtgct gcctccaccc 420 gaggaggaga tgaccaagaa gcaggtgaca ctgagctgtg ccgtgaccga cttcatgcct 480 gaggatatct acgtggagtg gaccaacaat ggcaagacag agctgaacta taagaataca 540 gagccagtgc tggactccga tggctcttac tttatggtgt ccaagctgag ggtggagaag 600 aagaactggg tggagcgcaa ttcttatagc tgctccgtgg tgcacgaggg cctgcacaat 660 caccacacca caaagtcttt cagcagaacc cctggcaag 699 <210> 70 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu IgG2a Fc knob DANG <400> 70 gagccaaggg gccccaccat caagccatgc cccccttgca agtgtcctgc accaaacctg 60 ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagatca aggacgtgct gatgatcagc 120 ctgtccccca tcgtgacatg cgtggtggtg gccgtgtccg aggacgatcc tgatgtgcag 180 atctcttggt tcgtgaacaa tgtggaggtg cacaccgccc agacccagac acaccgggag 240 gactacggct ctacactgag agtggtgagc gccctgccca tccagcacca ggactggatg 300 tccggcaagg agtttaagtg caaggtgaac aataaggatc tgcccgcccc tatcgagcgg 360 accatcagca agcctaaggg ctccgtgaga gccccacagg tgtatgtgct gcctccaccc 420 gaggaggaga tgaccaagaa gcaggtgaca ctgtggtgta tggtgaccga cttcatgcct 480 gaggatatct acgtggagtg gaccaacaat ggcaagacag agctgaacta taagaataca 540 gagccagtgc tggactccga tggctcttac tttatgtatt ctaagctgag ggtggagaag 600 aagaactggg tggagcgcaa ttcttacagc tgctccgtgg tgcacgaggg cctgcacaat 660 caccacacca caaagtcttt cagcagaacc cctggcaag 699 <210> 71 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu IgG2a Fc knob <400> 71 gagccacgcg gccccacaat caagccatgc cccccttgca agtgtcctgc accaaatctg 60 ctgggaggac catccgtgtt catctttcca cccaagatca aggacgtgct gatgatcagc 120 ctgtccccaa tcgtgacctg cgtggtcgtg gacgtgagcg aggacgatcc tgatgtgcag 180 atctcctggt tcgtgaacaa tgtggaggtg cacaccgccc agacccagac acaccgggag 240 gactacaact ccacactgag agtggtgtct gccctgccca tccagcacca ggactggatg 300 agcggcaagg agtttaagtg caaggtgaac aataaggatc tgcccgcccc tatcgagcgg 360 acaatctcta agcctaaggg cagcgtgaga gccccacagg tgtatgtgct gcctccaccc 420 gaggaggaga tgaccaagaa gcaggtgaca ctgtggtgta tggtgaccga cttcatgcct 480 gaggatatct atgtggagtg gaccaacaat ggcaagacag agctgaacta caagaataca 540 gagccagtgc tggactccga tggctcttac ttcatgtaca gcaagctgag ggtggagaag 600 aagaactggg tggagcgcaa ttcttacagc tgctccgtgg tgcacgaggg cctgcacaac 660 caccacacca caaagtcttt tagccggacc cctggcaag 699 <210> 72 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc DANG <400> 72 caggtgcagc tgcagcagtc cggagcagag ctggcaaggc ctggagcctc tgtgaacctg 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcaca aacaatggca tcaattggct gaagcagagg 120 accggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccaa gatctaccaa cacactgtat 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg acagcagacc ggagctccaa caccgcctac 240 atggagctga gaagcctgac atccgaggat tctgccgtgt atttttgtgc acgcaccctg 300 acagcaccct tcgccttttg gggacagggc accctggtga cagtgagcgc cgccaagacc 360 acagcaccaa gcgtgtatcc actggcaccc gtgtgcggcg ataccacagg ctctagcgtg 420 accctgggct gtctggtgaa gggctacttc cctgagccag tgaccctgac atggaacagc 480 ggctctctgt cctctggcgt gcacaccttt cctgccgtgc tgcagtccga tctgtataca 540 ctgagctcct ctgtgaccgt gacaagctcc acctggccca gccagtccat cacatgcaac 600 gtggcccacc ctgcctctag caccaaggtg gacaagaaga tcgagccacg gggccccaca 660 atcaagccat gtccaccttg caagtgtcca gcacctaatc tgctgggagg acctagcgtg 720 ttcatctttc cacccaagat caaggacgtg ctgatgatct ctctgagccc tatcgtgacc 780 tgcgtggtgg tggccgtgtc tgaggacgat ccagatgtgc agatcagctg gttcgtgaac 840 aatgtggagg tgcacaccgc ccagacccag acacaccggg aggactacgg ctccacactg 900 agagtggtgt ctgccctgcc catccagcac caggactgga tgtccggcaa ggagtttaag 960 tgcaaggtga acaataagga tctgccagcc cccatcgaga ggaccatctc taagcctaag 1020 ggcagcgtgc gcgcaccaca ggtgtatgtg ctgcctccac ccgaggagga gatgaccaag 1080 aagcaggtga cactgacgtg tatggtgacc gacttcatgc cagaggatat ctacgtggag 1140 tggaccaaca atggcaagac agagctgaac tataagaata cagagcccgt gctggacagc 1200 gatggctcct actttatgta tagcaagctg agggtggaga agaagaactg ggtggagcgc 1260 aattcctact cttgtagcgt ggtgcacgag ggcctgcaca accaccacac cacaaagtcc 1320 ttttctagaa cccccggcaa g 1341 <210> 73 <211> 2145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of mu scLIGHT-LTb2-mu IgG2a Fc hole DANG <400> 73 aaccctgcag cacacctgac cggagcaaat gcatccctga tcggaatcgg aggaccactg 60 ctgtgggaga caaggctggg actggccttc ctgaggggac tgacctacca cgatggcgcc 120 ctggtgacaa tggagccagg ctactattac gtgtatagca aggtgcagct gtccggagtg 180 ggatgcccac agggactggc caacggcctg cctatcaccc acggcctgta taagcggaca 240 agcagatacc ccaaggagct ggagctgctg gtgtcccgga gatctccttg tggaagggcc 300 aacagctccc gcgtgtggtg ggattctagc ttcctgggag gagtggtgca cctggaggca 360 ggcgaggagg tggtggtgcg ggtgcctggc aatagactgg tgaggccaag ggacggaacc 420 cggtcttact tcggagcctt tatggtggga ggcggtggga gtggtggcgg gggatccgga 480 ggaggggggt cactgcctgc cgctcacctg atcggcgcct ggatgagcgg ccagggcctg 540 agctgggagg cttctcagga ggaagccttc ctgcggtccg gcgcccagtt cagccctaca 600 cacggcctgg ccctgcccca ggatggcgtg tactacctgt actgccacgt gggctaccgg 660 ggccggaccc ctcctgctgg cagaagcaga gccagatccc tgaccctgcg gagcgccctg 720 tacagagccg gcggagctta tggaagaggc agccctgagc tgctgctgga aggcgctgaa 780 accgtgaccc ctgtcgtgga ccccatcgga tacggaagcc tgtggtatac aagcgtggga 840 ttcggcggac tggctcagct gagaagcggc gagcgggtgt acgtgaacat cagccacccc 900 gacatggttg attaccggag aggaaagaca ttcttcggcg ccgtgatggt cggaggctct 960 ggactgcccg ccgcccacct gatcggcgcc tggatgtctg gccaaggcct cagctgggaa 1020 gccagccagg aggaagcttt tctgagaagc ggcgcccaat tttcccctac ccatggcctg 1080 gccctgcctc aggacggcgt gtattacctg tactgtcacg tgggctacag aggcagaacc 1140 ccacctgccg gcagaagccg ggccagatct ctgacactgc gctctgccct gtacagagcc 1200 ggcggcgcct acggcagagg ctccccagag ctgctgctcg agggcgccga gacagtgacc 1260 cccgtggtgg accctatcgg ctacggcagc ctgtggtaca ccagcgtggg cttcggcggc 1320 ctggcccagc tgcgcagcgg agagagagtg tacgtgaaca tttctcaccc tgatatggtg 1380 gactacaggc ggggcaagac cttcttcgga gccgtgatgg tggggggaag cggaggagga 1440 ggctccgagc cacgcggccc cacaatcaag ccatgccccc cttgcaagtg tcctgcacca 1500 aatctgctgg gaggaccatc cgtgttcatc tttccaccca agatcaagga cgtgctgatg 1560 atcagcctgt ccccaatcgt gacctgcgtg gtcgtggccg tgagcgagga cgatcctgat 1620 gtgcagatct cctggttcgt gaacaatgtg gaggtgcaca ccgcccagac ccagacacac 1680 cgggaggact acggctccac actgagagtg gtgtctgccc tgcccatcca gcaccaggac 1740 tggatgagcg gcaaggagtt taagtgcaag gtgaacaata aggatctgcc cgcccctatc 1800 gagcggacaa tctctaagcc taagggcagc gtgagagccc cacaggtgta tgtgctgcct 1860 ccacccgagg aggagatgac caagaagcag gtgacactgt cttgtgccgt gaccgacttc 1920 atgcctgagg atatctatgt ggagtggacc aacaatggca agacagagct gaactacaag 1980 aatacagagc cagtgctgga 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Claims (37)

  1. FAP(Fibroblast activation protein alpha)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제1 단량체; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 것인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 단량체는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 추가적으로 포함하는 것인, 융합단백질.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제2 단량체는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 78 또는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 LIGHT 단백질의 변이체는
    서열번호 78의 아미노산 서열에서 118번째, 119번째, 195번째, 196번째, 198번째 및 226번째 내지 231번째로 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열; 또는
    서열번호 93의 아미노산 서열에서 194번째, 195번째, 197번째 및 225번째 내지 230번째의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 LIGHT 단백질 변이체는 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 96 및 서열번호 98로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 LIGHT 단백질의 변이체는 상기 LIGHT 단백질 또는 이의 단편의 동종다량체인 것인, 융합단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 동종다량체는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 86, 서열번호 97 및 서열번호 99로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체는 LT(lymphotoxin) 단백질 또는 이의 변이체가 추가적으로 결합된 것인, 융합단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 LT 단백질 또는 이의 변이체는 서열번호 88 및 서열번호 290으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 LT 단백질 또는 이의 변이체는 동종이량체인 것인, 융합단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 LT 단백질 또는 이의 변이체의 동종이량체는 서열번호 288 또는 서열번호 291번의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는
    서열번호 101의 HCDR1, 서열번호 102의 HCDR2 및 서열번호 103의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 104의 LCDR1, 서열번호 105의 LCDR2, 서열번호 106의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 109의 HCDR1, 서열번호 110의 HCDR2 및 서열번호 111의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 112의 LCDR1, 서열번호 113의 LCDR2, 서열번호 114의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 127의 HCDR1, 서열번호 128의 HCDR2, 서열번호 129의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 130의 LCDR1, 서열번호 131의 LCDR2, 서열번호 132의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 133의 HCDR1, 서열번호 134의 HCDR2, 서열번호 135의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 136의 LCDR1, 서열번호 137의 LCDR2, 서열번호 138의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 139의 HCDR1, 서열번호 140의 HCDR2, 서열번호 141의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 142의 LCDR1, 서열번호 143의 LCDR2, 서열번호 144의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 145의 HCDR1, 서열번호 146의 HCDR2, 서열번호 147의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 148의 LCDR1, 서열번호 149의 LCDR2, 서열번호 150의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 151의 HCDR1, 서열번호 152의 HCDR2, 서열번호 153의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 154의 LCDR1, 서열번호 155의 LCDR2, 서열번호 156의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 157의 HCDR1, 서열번호 158의 HCDR2, 서열번호 159의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 160의 LCDR1, 서열번호 161의 LCDR2, 서열번호 162의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 163의 HCDR1, 서열번호 164의 HCDR2, 서열번호 165의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 166의 LCDR1, 서열번호 167의 LCDR2, 서열번호 168의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 169의 HCDR1, 서열번호 170의 HCDR2, 서열번호 171의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 172의 LCDR1, 서열번호 173의 LCDR2, 서열번호 174의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 175의 HCDR1, 서열번호 176의 HCDR2, 서열번호 177의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 178의 LCDR1, 서열번호 179의 LCDR2, 서열번호 180의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 181의 HCDR1, 서열번호 182의 HCDR2, 서열번호 183의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 184의 LCDR1, 서열번호 185의 LCDR2, 서열번호 186의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 187의 HCDR1, 서열번호 188의 HCDR2, 서열번호 189의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 190의 LCDR1, 서열번호 191의 LCDR2, 서열번호 192의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 193의 HCDR1, 서열번호 194의 HCDR2, 서열번호 195의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 196의 LCDR1, 서열번호 197의 LCDR2, 서열번호 198의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 199의 HCDR1, 서열번호 200의 HCDR2, 서열번호 201의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 202의 LCDR1, 서열번호 203의 LCDR2, 서열번호 204의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 205의 HCDR1, 서열번호 206의 HCDR2, 서열번호 207의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 208의 LCDR1, 서열번호 209의 LCDR2, 서열번호 210의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 211의 HCDR1, 서열번호 212의 HCDR2, 서열번호 213의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 214의 LCDR1, 서열번호 215의 LCDR2, 서열번호 216의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 217의 HCDR1, 서열번호 218의 HCDR2, 서열번호 219의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 220의 LCDR1, 서열번호 221의 LCDR2, 서열번호 222의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 223의 HCDR1, 서열번호 224의 HCDR2, 서열번호 225의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 226의 LCDR1, 서열번호 227의 LCDR2, 서열번호 228의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 229의 HCDR1, 서열번호 230의 HCDR2, 서열번호 231의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 232의 LCDR1, 서열번호 233의 LCDR2, 서열번호 234의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 235의 HCDR1, 서열번호 236의 HCDR2, 서열번호 237의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 238의 LCDR1, 서열번호 239의 LCDR2, 서열번호 240의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    서열번호 241의 HCDR1, 서열번호 242의 HCDR2, 서열번호 243의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 244의 LCDR1, 서열번호 245의 LCDR2, 서열번호 246의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는
    서열번호 107의 중쇄가변영역 및 서열번호 108의 경쇄가변영역;
    서열번호 115의 중쇄가변영역 및 서열번호 116의 경쇄가변영역;
    서열번호 248의 중쇄가변영역 및 서열번호 249의 경쇄가변영역;
    서열번호 250의 중쇄가변영역 및 서열번호 251의 경쇄가변영역;
    서열번호 252의 중쇄가변영역 및 서열번호 253의 경쇄가변영역;
    서열번호 254의 중쇄가변영역 및 서열번호 255의 경쇄가변영역;
    서열번호 256의 중쇄가변영역 및 서열번호 257의 경쇄가변영역;
    서열번호 258의 중쇄가변영역 및 서열번호 259의 경쇄가변영역;
    서열번호 260의 중쇄가변영역 및 서열번호 261의 경쇄가변영역;
    서열번호 262의 중쇄가변영역 및 서열번호 263의 경쇄가변영역;
    서열번호 264의 중쇄가변영역 및 서열번호 265의 경쇄가변영역;
    서열번호 266의 중쇄가변영역 및 서열번호 267의 경쇄가변영역;
    서열번호 268의 중쇄가변영역 및 서열번호 269의 경쇄가변영역;
    서열번호 270의 중쇄가변영역 및 서열번호 271의 경쇄가변영역;
    서열번호 272의 중쇄가변영역 및 서열번호 273의 경쇄가변영역;
    서열번호 274의 중쇄가변영역 및 서열번호 275의 경쇄가변영역;
    서열번호 276의 중쇄가변영역 및 서열번호 277의 경쇄가변영역;
    서열번호 278의 중쇄가변영역 및 서열번호 279의 경쇄가변영역;
    서열번호 280의 중쇄가변영역 및 서열번호 281의 경쇄가변영역;
    서열번호 282의 중쇄가변영역 및 서열번호 283의 경쇄가변영역;
    서열번호 284의 중쇄가변영역 및 서열번호 285의 경쇄가변영역; 또는
    서열번호 286의 중쇄가변영역 및 서열번호 287의 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  16. 제2항에 있어서,
    상기 제1 단량체는 하기 구조식 (I) 또는 구조식 (II)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(3)]q-Fc 도메인-[링커(4)]r-(Y)c-C'(I)
    N'-(Y)d-[링커(3)]q-Fc 도메인-[링커(4)]r-X-C'(II)
    이때, 상기 구조식(I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
    상기 Y는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체이며,
    상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
    상기 c, d, q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  17. 제2항에 있어서,
    상기 제2 단량체는 하기 구조식 (III) 또는 구조식 (IV)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-(X)e-[링커(5)]s-Fc 도메인-[링커(6)]t-Y'-C'(III)
    N'-Y'-[링커(5)]s-Fc도메인-[링커(6)]t-(X)f-C'(IV)
    이때, 상기 구조식(III) 및 (IV)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
    상기 Y'는 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체; 또는 LIGHT 단백질 및 LT 단백질의 이종다량체이며,
    상기 링커(5) 및 링커(6)은 펩타이드 링커이고,
    상기 e, f, s 및 t는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 링커는 (G4S)n, GGGS(G4S)n, GGS(G3S)n 또는 GGSG(G3S)n 링커를 포함할 수 있으며, 상기 n은 0 내지 10의 정수 중 어느 하나인 것인, 융합단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 117 내지 서열번호 126으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 인간 IgG1 또는 마우스 IgG2a 유래인 것인, 융합단백질.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 32 내지 서열번호 34, 서열번호 292 내지 서열번호 298으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  22. 제2항에 있어서,
    상기 제1 단량체는 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄; 또는 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인, 융합단백질.
  23. 제2항에 있어서,
    구조식 (I)의 제1 단량체; 및 구조식 (III)의 제2 단량체로 구성된 것인, 융합단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    구조식 (I)의 q, r 및 c은 1이고, 구조식 (III)의 e, s 및 t는 1인 것인, 융합단백질.
  25. 제2항에 있어서,
    구조식 (I)의 제1 단량체; 및 구조식 (IV)의 제2 단량체로 구성된 것인, 융합단백질.
  26. 제25항에 있어서,
    구조식 (I)의 q은 1이고 r 및 c은 0이고, 구조식 (IV)의 s는 1이며, t 및 f는 0인 것인, 융합단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 골암, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 립프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  29. 제27항에 있어서,
    항-PD-1 항체를 추가적으로 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  30. 제16항의 구조식 (I)의 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제16항의 구조식 (II)의 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  32. 제17항의 구조식 (III)의 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  33. 제17항의 구조식 (IV)의 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  35. 제33항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  36. 제35항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  37. i) 제36항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) FAP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위; 및 LIGHT 단백질, 이의 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법.
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