TW202409092A - Ｃｄ３９／ｃｄ７３雙特異性抗原結合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於一種分離的抗原結合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，該第一結合域能夠結合CD39蛋白，該第二結合域能夠結合CD73蛋白。本揭露還提供了編碼該分離的抗原結合蛋白的核酸分子，包含該核酸分子的載體、細胞，包含該分離的抗原結合蛋白的醫藥組成物，製備該分離的抗原結合蛋白的方法及該分離的抗原結合蛋白的用途。
Description
本揭露關於生物醫藥領域，具體的關於一種CD39/CD73雙特異性抗原結合蛋白及其用途。
CD39，也稱為外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPDase1)，是將ATP磷酸水解以生成ADP及AMP的完整膜蛋白質。CD39表達在許多實體瘤細胞中，CD39可藉由抑制腫瘤特異性T細胞的激活、選殖擴增以及歸巢，從而參與腫瘤免疫逃逸，損害由效應T淋巴細胞進行的腫瘤細胞殺滅。CD39可直接造成癌細胞生長、分化、入侵、遷移、轉移及血管生成的調節。CD39對於血管生成的起始以及血管新生的進展均是重要的。
CD73，也稱NT5E，是一種分子量約為70Kd的細胞外5-核酸酶(NT5E)，藉由糖磷脂醯肌醇(GPI)錨定於細胞表面，主要以二聚體形式存在。在正常生理狀態下，CD73可表達於多種組織或器官，如肝臟、大腸、腎臟、脾臟、肺、卵巢、淋巴結等組織。
在功能上，CD39能與胞外ATP(eATP)結合，並將其水解為AMP；CD73則會將AMP水解為ADO。在ATP-ADO通路中，CD39是eATP水解的限
速酶，而CD73是AMP水解的限速酶。藉由CD39和CD73來控制嘌呤核苷酸的生成，進而調控核苷酸的信號傳遞。CD39可將能有效激活免疫細胞活性的eATP水解進而造成腫瘤的免疫逃逸；而CD73水解產生的ADO可活化免疫細胞，降低T細胞的免疫作用，進而導致腫瘤免疫逃逸。
因此，亟需進行以CD39/CD73為靶點的藥物研發，為腫瘤免疫治療提供新方向。
本揭露提供了一種分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：(1)以1×10-9M或更低的KD值與CD39蛋白結合；(2)以1×10-9M或更低的KD值與CD73蛋白結合；(3)對CD39抗原酶活功能具有抑制作用；(4)對CD73抗原酶活功能具有抑制作用；(5)具有熱穩定性；(6)能夠和人CD39和/或食蟹猴CD73相結合；(7)能夠和人CD73和/或食蟹猴CD73相結合；(8)能夠抑制腫瘤細胞的生長。
一方面，本揭露提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，該第一結合域能夠結合CD39蛋白，該第二結合域能夠結合CD73蛋白。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的第一結合域包含抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域為VHH。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含抗體重鏈可變區VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含FR1，該FR1的C端與該CDR1的N端直接或間接相連，且該FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含FR2，該FR2位於該CDR1和該CDR2之間，且該FR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含FR3，該FR3位於該CDR2和該CDR3之間，且該FR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含FR4，該FR4的N端與該CDR3的C端直接或間接相連，且該FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含VHH，且該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列選自下組：
(1)該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；
(2)該HCDR1包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含H-FR4，該H-FR4的N端與該HCDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，該H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該H-FR1包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；
(2)該H-FR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含VH，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該LCDR1包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；
(2)該LCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含L-FR1，該L-FR1的C端與該L-CDR1的N端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1和該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含L-FR4，該L-FR4的N端與該LCDR3的C端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，該L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該L-FR1包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；
(2)該L-FR1包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含VL，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體輕鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區源自Igκ恆定區。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結構域包含VH和VL，該VH和VL包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；
(2)該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二結合域包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈和抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；
(2)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域直接或間接相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域的C端與該第二結合域的N端相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域的C端與該第二結合域的重鏈可變區的N端相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域藉由連接子相連。
在某些實施方式中，該連接子包含肽接頭。
在某些實施方式中，該連接子包含(GGGGS)n的胺基酸序列，其中n為0至10中的任意正整數。
在某些實施方式中，該連接子包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含兩個該第一結合域。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該兩個第一結合域分別與該第二結合域的N端直接或間接相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該兩個第一結合域分別與該第二結合域的兩條重鏈的N端直接或間接相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含該第一結合域和該第二結合域的重鏈。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端直接或間接相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端藉由連接子相連。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二多肽鏈包含該第二結合域的輕鏈。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。
另一方面，本揭露還提供了一種藥物組合，其包含能夠結合CD39的抗原結合蛋白，以及能夠結合CD73的抗原結合蛋白。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
(1)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.5μg/mL的EC50與人CD39結合；
(2)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.7μg/mL的EC50與食蟹獼猴(cyno)CD39結合；
(3)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.3×10-8M的KD與人CD39結合；
(4)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.1×10-7M的KD與食蟹獼猴(cyno)CD39結合；
(5)藉由ATP酶活性分析測定，以小於約0.8μg/mL的EC50抑制在表達CD39的細胞中的ATP酶活性；
(6)抑制腫瘤細胞的CD39功能。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含VH，該VH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白為VHH。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
(1)能夠特異性結合CD73或其功能活性片段；
(2)能夠抑制CD73的酶活性；
(3)能夠誘導細胞表面的CD73的內吞；
(4)能夠抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VH，該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VL，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈恆定區。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VH和VL，該VH和VL包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；
(2)該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈和抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；
(2)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
另一方面，本揭露提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本揭露提供了載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本揭露提供了細胞，其包含該核酸分子或該載體。
另一方面，本揭露提供了醫藥組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
另一方面，本揭露提供了製備該分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
另一方面，本揭露提供了該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療疾病和/或病症。
在某些實施方式中，該疾病和/或病症由CD39和/或CD73介導。
在某些實施方式中，該疾病和/或病症包括腫瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或血液瘤。
在某些實施方式中，該疾病和/或病症包括胰腺癌和/或結直腸癌。
另一方面，本揭露提供了檢測樣品中CD39和/或CD73的方法，該方法包括施用該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在某些實施方式中，該方法為體外方法和/或離體方法。
另一方面，本揭露提供了該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測樣品中CD39和/或CD73的存在。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本揭露的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本揭露的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本揭露的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所揭露的具體實施方式進行改動而不脫離本揭露所涉及發明的精神和範圍。相應地，本揭露的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本揭露所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本揭露所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是CD39/CD73雙特異性抗體700035和700038的結構示意圖。
圖2顯示的是700035的還原SDS-PAGE圖。
圖3顯示的是700038的還原SDS-PAGE圖。
圖4顯示的是700035的非還原SDS-PAGE圖。
圖5顯示的是700038的非還原SDS-PAGE圖。
圖6顯示的是雙特異性抗體700035和700038對CD39酶活的抑制曲線圖。
圖7顯示的是雙特異性抗體700035對細胞表面CD73酶活的抑制曲線。
圖8顯示的是雙特異性抗體700038對可溶性CD73抗原酶活的抑制曲線。
圖9顯示的是本揭露所述的抗原結合蛋白在胰腺癌小鼠模型中的抗腫瘤效果。
圖10顯示的是本揭露所述的抗原結合蛋白在結直腸癌小鼠模型中的抗腫瘤效果。
以下由特定的具體實施例說明本揭露發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容容易地瞭解本揭露發明的其他優點及效果。
術語定義
在本揭露中，術語“CD39”通常是指由ENTPD1基因在人體內編碼的胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1多肽。CD39的其它名稱包括ENTPD1、ATPD酶、NTPD酶-1和SPG64。CD39催化細胞外三磷酸核苷(NTP；例如三磷酸腺苷或ATP)和二磷酸核苷(NDP；例如，二磷酸腺苷或ADP)的γ-和β-磷酸殘基水解，將這些分
子轉化為一磷酸核苷(NMP；例如，一磷酸腺苷或AMP)衍生物。CD39的示例性胺基酸序列示於NCBI參考序列：NP_001767.3中。
在本揭露中，術語“CD73”也稱“NT5E”、“分化簇73”、“5’-核苷酸酶(5’-NT)”或“胞外5’-核苷酸酶”。該術語涵蓋“全長”、未加工的CD73以及由細胞加工所產生的任何形式的CD73。在本揭露中，術語“CD73”包括全長野生型CD73及其突變體、片段、變體、同種型和同源物。在某些實施方式中，該CD73可以包括人CD73。例如針對人CD73的序列可以見Uniprot登錄號P21589下。
在本揭露中，術語“分離的”通常指從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“分離”的物質或成分，那麼可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語“分離的”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。
在本揭露中，術語“分離的抗原結合蛋白”通常指從天然狀態下經人工手段獲得的具有抗原結合能力的蛋白。該“分離的抗原結合蛋白”可以包含結合抗原的部分和視需要地，允許抗原結合部分採用促進該抗原結合部分結合抗原的構象的框架或構架部分。抗原結合蛋白可以包含例如抗體來源的蛋白框架區(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的備選蛋白框架區或人工框架區。此類框架包括，但不限於包含被引入例如以穩定抗原結合蛋白的三維結構的突變的抗體來源的框架區以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架區。參見例如Korndorfer等，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,
53(1)：121-129(2003)；Roque等，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。抗原結合蛋白的實例包括但不限於：人抗體、人源化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；四功能抗體；Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、F(ab)2、scFv、di-scFv、dAb、IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體以及其片段。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含不止一個結合域。在本揭露中，該結合域可以靶向不同的抗原。在本揭露中，該結合域可以靶向相同抗原的不同表位。
在本揭露中，術語“可變結構域”與“可變區”可以互換使用，通常指抗體重鏈和/或輕鏈的一部分。重鏈和輕鏈的可變結構域可以分別稱為“VH”和“VL”(或者分別稱為“VH”和“VL”)。這些結構域通常是抗體的變化最大的部分(相對於相同類型的其它抗體)，且包含抗原結合位點。
在本揭露中，術語“可變”通常指在抗體之間可變結構域的某些區段在序列上可能存在較大差異。可變結構域介導抗原結合並決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性並非在整個可變結構域範圍內均勻分佈。它通常集中在輕鏈和重鏈可變結構域中稱為高變區(CDR或HVR)的三個區段中。可變結構域的更高度保守的部分稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，大多數採用β-折疊構型，藉由三個CDR連接，其形成環形連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近地保持在一起，並且來自另一條鏈的CDR一同促進抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本揭露中，術語“抗體”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。除非另外被術語“完整的”修飾，如在“完整的抗體”中，為了本發明的目的，術語“抗體”也包括抗體片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原結合功能(例如，特異性結合CLDN18.2)的其它抗體片段。通常，這樣的片段應當包括抗原結合結構域。基本的4鏈抗體單元是由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元與另外一個稱為J鏈的多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包括2至5個可以與J鏈相結合聚合形成多價組合的基本4鏈單元。就IgG而言，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。每個L鏈藉由一個共價二硫鍵與H鏈連接，而兩個H鏈藉由一個或多個取決於H鏈同種型的二硫鍵相互連接。每個H和L鏈還具有規則間隔的鏈內二硫化橋鍵。每個H鏈在N末端具有可變結構域(VH)，對於α和γ鏈各自繼之以三個恆定結構域(CH)、對於μ和ε同種型繼之以四個CH結構域。每個L鏈在N末端具有可變結構域(VL)，在其另一端具有恆定結構域。VL與VH對應，且CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)相對應。特定的胺基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別抗體的結構和性質，參見例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,AbbaI.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71頁和第6章。來自任何脊椎動物物種的L鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列被分為兩種明顯不同的類型中的一種，稱為κ和
λ。根據重鏈(CH)恆定結構域的胺基酸序列，可以將免疫球蛋白分為不同的類別或同種型。目前存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分別被命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。基於CH序列和功能方面的相對小的差異，將γ和α類進一步分成亞類，例如，人表達下述亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
在本揭露中，術語“CDR”也稱“互補決定區”，通常指抗體可變結構域中的區域，其序列是高度可變的和/或形成結構定義環。例如，抗體可包括六個CDR；在VH中三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些實施方案中，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在缺乏輕鏈的情況下，其功能也能夠正常且穩定。參見，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
在本揭露中，術語“FR”通常指抗體可變結構域的更高度保守的部分，其被稱為框架區。通常，天然重鏈和/或輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，即在VH中四個(H-FR1、H-FR2、H-FR3、和H-FR4)，和/或在VL中四個(L-FR1、L-FR2、L-FR3、和L-FR4)。
在本揭露中，術語“抗原結合片段”通常指具有特異結合抗原能力的一個或多個片段。在本揭露中，該抗原結合片段可以包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在本揭露中，術語“Fab”通常指抗體的抗原結合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗體。抗體經木瓜蛋白酶消化後產生兩個相同的抗原結合片段，即“Fab”片段，和殘餘的“Fc”片段(即Fc區，同上)。Fab片段可
以由一條完整的L鏈與一條重鏈的可變區和該H鏈(VH)的第一恆定區(CH1)組成。
在本揭露中，術語“Fab′片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段，該片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有輕鏈，所有重鏈可變區以及重鏈的所有或部分第一和第二恆定區。例如，Fab′片段還可包括重鏈的部分或所有的220至330個胺基酸殘基。
在本揭露中，術語“F(ab')2”通常指藉由胃蛋白酶消化完整抗體所產生的抗體片段。F(ab')2片段含有由二硫鍵維持在一起的兩個Fab片段和部分鉸鏈區。F(ab')2片段具有二價抗原結合活性並且能夠交聯抗原。
在本揭露中，術語“Fv片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段，包括所有或部分重鏈可變區和輕鏈可變區，並且缺乏重鏈恆定區和輕鏈恆定區。重鏈可變區和輕鏈可變區包括例如CDR。例如，Fv片段包括重鏈和輕鏈的約110個胺基酸的所有或部分胺基端可變區。
在本揭露中，術語“scFv”通常指包含至少一個包括輕鏈的可變區抗體片段和至少一個包括重鏈的可變區的抗體片段的融合蛋白，其中該輕鏈和重鏈可變區是鄰接的(例如經由合成接頭例如短的柔性多肽接頭)，並且能夠以單鏈多肽形式表達，且其中該scFv保留其所來源的完整抗體的特異性。除非特別說明，否則如本揭露中使用的那樣，scFv可以以任何順序(例如相對於多肽的N-末端和C末端)具有該VL和VH可變區，scFv可以包括VL-接頭-VH或可以包括VH-接頭-VL。
在本揭露中，術語“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原結合片段，參考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：
544-6)，參考Holt等人，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及參考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公佈的專利申請。
在本揭露中，術語“單株抗體”通常指單分子組成的抗體分子製備物。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本揭露使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。
在本揭露中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本揭露中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗
體)(諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。
術語“全人源抗體”通常指僅包含人類免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果其是在小鼠中、在小鼠細胞中或在衍生自小鼠細胞的融合瘤中生產，那麼全人源抗體可能含有鼠糖鏈。類似地，“小鼠抗體”或“大鼠抗體”分別指僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。可藉由噬菌體展示或其它分子生物學方法，在人體內、在具有人類免疫球蛋白種系序列的轉基因動物體內生成全人源抗體。可用於製造抗體的示例性技術在美國專利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技術，如使用文庫，是本領域已知的。
在本揭露中，術語“直接相連”與術語“間接相連”相對，術語“直接相連”通常是指直接連接。例如，該直接相連可以為物質間沒有間隔子而直接相連的情況。該間隔子可以是連接子。例如，該連接子可以為肽連接子。術語“間接相連”通常是指物質間不直接相連的情況。例如，該間接相連可以為藉由間隔子而連接的情況。例如，在本揭露所述的分離的抗原結合蛋白中，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端可以直接或間接相連。
在本揭露中，術語“藥物組合”通常是指至少包含兩種活性成分/治療劑的組合。在一些實施方式中，各個活性成分/治療劑可以各自製備成獨立的製劑(固體、液體、凝膠體等)，在一些實施方式中，各個活性成分/治療劑可以存在於不同的容器中，還可以在需要的時候同時或分別與合適的載體配製成期望
的製劑；在一些實施方式中，各個活性成分/治療劑可以是不同來源的；在一些實施方式中，各個活性成分/治療劑可以以混合的形式形成醫藥組成物。
在本揭露中，術語“分離的核酸分子”通常指任何長度的分離形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。
在本揭露中，術語“載體”通常指可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體可以包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類可以包括逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
在本揭露中，術語“細胞”通常指可以是或已經是受試者質粒或載體的接受者的單個細胞、細胞系或細胞培養物，其包括本發明所述的核酸分子或本發明所述的載體。細胞可以包括單個細胞的後代。由於天然、偶然或有意的突變，後代可以不一定與原始母細胞完全相同(在總DNA互補體的形態上或在基因組上)。細胞可包括用本揭露所述的載體在體外轉染的細胞。細胞可以是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵
巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、LNCAP細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞。在某些實施方案中，細胞為哺乳動物細胞。
在本揭露中，術語“醫藥組成物”通常指用於預防/治療疾病或病症的組成物。該醫藥組成物可以包含本揭露所述的分離的抗原結合蛋白、本揭露所述的核酸分子、本揭露所述的載體和/或本揭露所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。此外，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下較佳地對接受者無毒。本發明的醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
在本揭露中，術語“藥學上可接受的載劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。生理學可接受的載體可包括例如緩衝劑、抗氧化劑、低分子量(少於約10個殘基)多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、單糖、二糖和其它碳水化合物、螯合劑、糖醇、成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑。
在本揭露中，術語“特異性結合”或“特異性的”通常指可測量的和可再現的相互作用，例如靶標和抗體之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體可以是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體。在某些實施方案中，抗體特異性結合蛋白質上的表位，該表位在不同種屬的蛋白質中是保守的。在某些實施方案中，特異性結合可以包括但不要求排他性地結合。
在本揭露中，術語“受試者”通常指人類或非人類動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本揭露中，術語“腫瘤”通常指由異常細胞生長形成的贅生物或實體病變。在本揭露中，腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤。
在本揭露中，涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本揭露中，該變體可以為，例如在該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合CD73和/或CD39蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1至30個、1至20個或1至10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本揭露中，該同源物可以為與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合CD73和/或CD39蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本揭露中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、
I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST算法的描述可參見S.Altschul,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers和D.Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
在本揭露中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本揭露中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%至10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
[發明詳述]
一方面，本揭露提供一種分離的抗原結合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，該第一結合域能夠結合CD39蛋白，該第二結合域能夠結合CD73蛋白。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可具有下述性質中的一種或多種：(1)以1×10-9M或更低的KD值與CD39蛋白結合；(2)以1×10-9M或更低的KD值與CD73蛋白結合；(3)對CD39抗原酶活功能具有抑制作用；(4)對CD73抗原酶活功能具有抑制作用；(5)具有熱穩定性；(6)能夠和人CD39和/或食蟹猴CD73相結合；(7)能夠和人CD73和/或食蟹猴CD73相結合；(8)能夠抑制腫瘤細胞的生長。
例如，該腫瘤可包含CD39陽性腫瘤。例如，該腫瘤可包含CD73陽性腫瘤。例如，該腫瘤可包括實體瘤。例如，該腫瘤可包括非實體瘤。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以1×10-9M或更低的KD值與CD39蛋白結合。例如，該分離的抗原結合蛋白可以小於約1×10-9M、小於約8×10-10M、小於約6×10-10M、小於約4×10-10M、小於約2×10-10M、小於約1×10-10M或更低的KD值與CD39蛋白結合。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以藉由ATP酶活性分析測定，以小於約0.8μg/mL的EC50抑制在表達CD39的細胞中的ATP酶活性；和/或，
例如，可以該EC50可以小於約0.7μg/mL、小於約0.6μg/mL、小於約0.5μg/mL、小於約0.4μg/mL、小於約0.3μg/mL、小於約0.2μg/mL、小於約0.1μg/mL、小於約0.09μg/mL、小於約0.08μg/mL、小於約0.07μg/mL、小於約
0.06μg/mL、小於約0.05μg/mL、小於約0.04μg/mL、小於約0.03μg/mL、小於約0.02μg/mL、小於約0.01μg/mL或更低。
抗體的CDR又稱互補決定區，是可變區的一部分。該區域的胺基酸殘基可以與抗原或抗原表位接觸。抗體CDR可以藉由多種編碼系統來確定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、綜合考慮Kabat/Chothia等。這些編碼系統為本領域內已知，具體可參見http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本領域技術人員可以根據抗體的序列和結構，用不同的編碼系統確定出CDR區。使用不同的編碼系統，CDR區可能存在差別。在本揭露中，該CDR涵蓋根據任何CDR劃分方式劃分得到的CDR序列；也涵蓋其變體，該變體包括該CDR的胺基酸序列經過取代、缺失和/或添加一個或多個胺基酸。例如1至30個、1至20個或1至10個，又例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個胺基酸取代、缺失和/或插入；也涵蓋其同源物，該同源物可以為與該CDR的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的胺基酸序列。
在本揭露中，例如，該CDR可以根據IMGT方式進行劃分。
此外，需要說明的是，本揭露所述分離的抗原結合蛋白可以包含與其存在一個或多個保守序列修飾的重鏈和/或輕鏈序列。所謂“保守序列修飾”是指不會顯著影響或改變抗體結合特性的胺基酸修飾。這樣的保守修飾包括胺基酸替換、添加和刪除。可以藉由領域內已知的標準技術，例如點突變和PCR介導的突變，將修飾引入本揭露所述分離的抗原結合蛋白中。保守胺基酸替換是
胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基進行替換。具有相似側鏈的胺基酸殘基組在領域內已知。這些胺基酸殘基組包括具有鹼性側鏈(例如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、谷胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)和芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。在本揭露中，本揭露所述分離的抗原結合蛋白的CDR區中的一個或多個胺基酸殘基可以用同側鏈組的其他胺基酸殘基替換。本領域內的技術人員知道，一些保守序列修改不會使抗原結合性消失，具體可以參見，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10：341-6 and Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
可以藉由本領域已知的各種測定鑑別、篩選或表徵本揭露所述的CD39抗原結合蛋白。
例如，可藉由已知方法諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FACS)、免疫組織化學、免疫熒光等來測試本揭露抗原結合蛋白或融合蛋白的抗原結合活性。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域直接或間接相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域的C端可與該第二結合域的N端相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域的C端可與該第二結合域的重鏈可變區的N端相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域藉由連接子相連。在本揭露中，該連接子可包含肽接頭。在本揭露中，該連接子可包含(GGGGS)n的胺基酸序列，其中n為0至10中的任意正整數。例如，該連接子可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白包含兩個該第一結合域。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該兩個第一結合域可分別與該第二結合域的N端直接或間接相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該兩個第一結合域可分別與該第二結合域的兩條重鏈的N端直接或間接相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含該第一結合域和該第二結合域的重鏈。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端可直接或間接相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端藉由連接子相連。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一多肽鏈可包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第二多肽鏈可包含該第二結合域的輕鏈。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第二多肽鏈可包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可包含兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。
藥物組合
在本揭露中，還提供了一種藥物組合，該藥物組合包含能夠結合CD39的抗原結合蛋白，以及能夠結合CD73的抗原結合蛋白。
在本揭露中，該藥物組合中能夠結合CD39的抗原結合蛋白和能夠結合CD73的抗原結合蛋白可以共同施用，也可以分別施用；可以以相同方式施用，也可以以不同方式施用；可以同時施用也可以先後施用(可以不限定施用的先後順序)。
在本揭露中，該藥物組合中能夠結合CD39的抗原結合蛋白和能夠結合CD73的抗原結合蛋白可以存在於同一容器中，也可以存在於不同容器中；可以獨立地單獨包裝，也可以形成混合物存在。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
(1)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.5μg/mL的EC50與人CD39結合；例如，可以該EC50可以小於約0.4μg/mL、小於約0.3μg/mL、小於約0.2μg/mL、小於約0.1μg/mL、小於約0.09μg/mL、小於約0.08μg/mL、小於約
0.07μg/mL、小於約0.06μg/mL、小於約0.05μg/mL、小於約0.04μg/mL、小於約0.03μg/mL、小於約0.02μg/mL、小於約0.01μg/mL或更低。
(2)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.7μg/mL的EC50與食蟹獼猴(cyno)CD39結合；例如，可以該EC50可以小於約0.6μg/mL、小於約0.5μg/mL、小於約0.4μg/mL、小於約0.3μg/mL、小於約0.2μg/mL、小於約0.1μg/mL、小於約0.09μg/mL、小於約0.08μg/mL、小於約0.07μg/mL、小於約0.06μg/mL、小於約0.05μg/mL、小於約0.04μg/mL、小於約0.03μg/mL、小於約0.02μg/mL、小於約0.01μg/mL或更低。
(3)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.3×10-8M的KD與人CD39結合；例如，可以該KD可以小於約1×10-8M、小於約9×10-9M、小於約8×10-9M、小於約7×10-9M、小於約6×10-9M、小於約5×10-9M、小於約4×10-9M、小於約3×10-9M、小於約2×10-9M、小於約1×10-9M、小於約8×10-10M、小於約6×10-10M、小於約4×10-10M、小於約2×10-10M、小於約1×10-10M或更低。
(4)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.1×10-7M的KD與食蟹獼猴(cyno)CD39結合；例如，可以該KD可以小於約1×10-7M、小於約9×10-8M、小於約8×10-8M、小於約7×10-8M、小於約6×10-8M、小於約5×10-8M、小於約4×10-8M、小於約3×10-8M、小於約2×10-8M、小於約1×10-8M、小於約8×10-9M、小於約6×10-9M、小於約4×10-9M、小於約2×10-9M、小於約1×10-9M或更低。
(5)藉由ATP酶活性分析測定，以小於約0.8μg/mL的EC50抑制在表達CD39的細胞中的ATP酶活性；例如，可以該EC50可以小於約0.7μg/mL、小於約0.6μg/mL、小於約0.5μg/mL、小於約0.4μg/mL、小於約0.3μg/mL、小於約0.2μg/mL、小於約0.1μg/mL、小於約0.09μg/mL、小於約0.08μg/mL、小於約
0.07μg/mL、小於約0.06μg/mL、小於約0.05μg/mL、小於約0.04μg/mL、小於約0.03μg/mL、小於約0.02μg/mL、小於約0.01μg/mL或更低。
(6)抑制腫瘤細胞的CD39功能。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
(1)能夠特異性結合CD73或其功能活性片段；
(2)能夠抑制CD73的酶活性；
(3)能夠誘導細胞表面的CD73的內吞；
(4)能夠抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖。
第一結合域
在本揭露中，該第一結合域能夠結合CD39蛋白。例如，該第一結合域可包含能夠結合CD39的抗原結合蛋白。
在本揭露中，該第一結合域可包含抗體或其抗原結合片段。
在本揭露中，該抗體可選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。在本揭露中，該抗原結合片段可選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域可為VHH。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該第一結合域包含抗體重鏈可變區VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含CDR3，且該CDR3可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含CDR2，且該CDR2可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含CDR1，且該CDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該CDR2可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該CDR3可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含FR1，該FR1的C端與該CDR1的N端直接或間接相連，且該FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含FR2，該FR2位於該CDR1和該CDR2之間，且該FR2可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含FR3，該FR3位於該CDR2和該CDR3之間，且該FR3可包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含FR4，該FR4的N端與該CDR3的C端直接或間接相連，且該FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第一結合域可包含VHH，且該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
第二結合域
在本揭露中，該第二結合域能夠結合CD73蛋白。在本揭露中，該第二結合域能夠包含能夠結合CD73的抗原結合蛋白。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體或其抗原結合片段。
在本揭露中，該抗體可選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在本揭露中，該抗原結合片段可選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含HCDR3，該HCDR3可包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含HCDR2，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含HCDR1，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。例如，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。例如，該HCDR1可包含SEQ ID NO：29該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1可包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2可包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含H-FR4，該H-FR4的N端與該HCDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，該H-FR1包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含VH，且該VH可包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體重鏈恆定區。
在本揭露中，該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體重鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體重鏈可變區VL中的至少一個CDR，且該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含LCDR3，該LCDR3可包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含LCDR2，該LCDR2可包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含LCDR1，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。例如，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：
18(WAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。例如，該LCDR1可包含SEQ ID NO：36該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含L-FR1，該L-FR1的C端與該LCDR1的N端直接或間接相連，且該L-FR1可包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1和該LCDR2之間，且該L-FR2可包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含L-FR4，該L-FR4的N端與該L-FR3的C端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含L-FR1、L-ER2、L-FR3和L-FR4，該L-FR1包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。例如，該L-FR1可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含
SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。例如，該L-FR1可包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含VL，且該VL可包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體輕鏈恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區源自Igκ恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結合域可包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結構域可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含可SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結構域可包含抗體重鏈和抗體輕鏈。例如，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。例如，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
能夠結合CD39的抗原結合蛋白
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含抗體或其抗原結合片段。
在本揭露中，該抗體可選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。在本揭露中，該抗原結合片段可選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可為VHH。
在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含CDR3，且該CDR3可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含CDR2，且該CDR2可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含CDR1，且該CDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該CDR2可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該CDR3可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含FR1，該FR1的C端與該CDR1的N端直接或間接相連，且該FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含FR2，該FR2位於該CDR1和該CDR2之間，且該FR2可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含FR3，該FR3位於該CDR2和該CDR3之間，且該FR3可包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含FR4，該FR4的N端與該CDR3的C端直接或間接相連，且該FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD39的抗原結合蛋白可包含VHH，且該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
能夠結合CD73的抗原結合蛋白
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體或其抗原結合片段。
在本揭露中，該抗體可選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在本揭露中，該抗原結合片段可選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。例如，該HCDR1可包含SEQ ID NO：11該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。例如，該HCDR1可包含SEQ ID NO：29該胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1可包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2可包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含H-FR4，該H-FR4的N端與該HCDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，該H-FR1包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含VH，且該VH可包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈恆定區。
在本揭露中，該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。例如，該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈，該抗體重鏈可包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區VL中的至少一個CDR，且該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基
酸序列。例如，該LCDR1可包含SEQ ID NO：19該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：18(WAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。例如，該LCDR1可包含SEQ ID NO：36該胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含L-FR1，該L-FR1的C端與該LCDR1的N端直接或間接相連，且該L-FR1可包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1和該LCDR2之間，且該L-FR2可包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含L-FR4，該L-FR4的N端與該L-FR3的C端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，該L-FR1包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。例如，該L-FR1可包含
SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。例如，該L-FR1可包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2可包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR3可包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含VL，且該VL可包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區源自Igκ恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。例如，該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該能夠結合CD73的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈可包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結構域可包含VH和VL，該VH可包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含可SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。例如，該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該第二結構域可包含抗體重鏈和抗體輕鏈。例如，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID
NO：26所示的胺基酸序列。例如，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
核酸分子、載體、細胞和醫藥組成物
另一方面，本揭露提供了分離的核酸分子，其可以編碼本揭露所述的分離的抗原結合蛋白。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的；(ii)藉由選殖重組產生的；(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離；或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。
另一方面，本揭露提供了一種載體，其可以包含本揭露所述的核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA轉譯的其他控制元件等。該載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。此外，該載體還可以包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
另一方面，本揭露提供了一種細胞，其可以包含本揭露所述的核酸分子和/或本揭露所述的載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞包含一個或一種本揭露所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本揭露所述的核酸分子或載體。例如，可將本揭露所述的載體引入該宿主細胞中，例如真核細胞，如
來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。在某些實施方式中，該細胞是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、LNCAP細胞、HeLa細胞、293T細胞、COS-1細胞、SP2/0細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞。可藉由本領域已知的方法將本揭露所述的載體引入該宿主細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
另一方面，本揭露還提供了醫藥組成物，其可以包含本揭露所述的分離的抗原結合蛋白、本揭露所述的核酸分子、本揭露所述的載體和/或本揭露所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
在本揭露中，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)佐劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下較佳地對接受者無毒。本發明的醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
在本揭露中，該醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。此類藥物的類型和有效量可以取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型，以及受試者的臨床參數。
在本揭露中，該藥學上可接受的載劑可以包括與藥物給藥相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、等滲劑和吸收延遲劑，通常安全、無毒。
在本揭露中，該醫藥組成物可以包含腸胃外、經皮、腔內、動脈內、鞘內和/或鼻內施用或直接注射到組織中。例如，該醫藥組成物可以藉由輸注或注射施用於患者或者受試者。在某些實施方案中，該醫藥組成物的施用可以藉由不同的方式進行，例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。在某些實施方案中，該醫藥組成物可以不間斷施用。該不間斷(或連續)施用可以
藉由患者佩戴的小泵系統來實現，以測量流入患者體內的治療劑，如WO2015/036583所述。
製備方法
另一方面，本揭露提供了製備該抗原結合蛋白的方法。該方法可包括，在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養本揭露所述的宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。
方法和用途
另一方面，本揭露提供了該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療疾病和/或病症。
另一方面，本揭露還提供了預防和/或治療疾病和/或病症的方法，該方法可以包括向有需要的受試者施用本揭露所述該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在本揭露中，該使用可以藉由不同方式進行，例如靜脈內、瘤內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。
另一方面，本揭露所述該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物，其可以用於預防和/或治療疾病和/或病症。
在本揭露中，該疾病和/或病症可以是CD39和/或CD73介導的疾病和/或病症。
在本揭露中，該疾病和/或病症可以包括腫瘤。
在本揭露中，該腫瘤可以包括實體瘤和/或血液瘤。
在本揭露中，該疾病和/或病症可以包括胰腺癌和/或結直腸癌。
另一方面，本揭露還提供了檢測樣品中CD39和/或CD73的方法，該方法包括施用該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
在本揭露中，該檢測樣品中CD39和/或CD73的方法可以是體外方法。在本揭露中，該檢測樣品中CD39和/或CD73的方法可以為非治療目的。在本揭露中，該檢測樣品中CD39和/或CD73的方法不是診斷方法。
另一方面，本揭露還提供了檢測樣品中CD39和/或CD73的試劑或試劑盒，其包含該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
另一方面，本揭露還提供了該分離的抗原結合蛋白、該藥物組合、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測樣品中CD39和/或CD73的存在和/或含量。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本揭露的抗原結合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本揭露發明的範圍。
[實施例]
實施例1 CD39-CD73雙特異性抗體的重鏈和輕鏈的序列設計
本揭露中的CD39-CD73雙特異性抗體的結構屬於VHH-IgG，即在一個IgG抗體的兩條重鏈的N端均連接另一個奈米抗體的VHH片段，其構型如圖1所示，這種形式的雙特異性抗體結構形式簡稱為CD39-VHH-CD73-IgG，其重鏈和輕鏈的主要組成設計如下面的表1。
表1 CD39-VHH-CD73-IgG重鏈和輕鏈的主要組成設計
CD39-VHH-CD73-IgG形式的雙特異性抗體700035和700038的重鏈序列如下表2所示；
表2 CD39-VHH-CD73-IgG雙特異性抗體的重鏈序列
CD39-VHH-CD73-IgG形式的雙特異性抗體700035和700038的輕鏈序列分別來源於900725的輕鏈(SEQ ID NO：42)和900698的輕鏈(SEQ ID NO：26)。
實施例2 CD39-CD73雙特異性抗體的表達與純化
實施例1中所得表達載體經過大腸桿菌擴增，用去內毒素質粒抽提試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，#DP117)製備足量質粒，用於瞬時轉染表達雙特異性抗體。表達所用的宿主細胞為CHO-S細胞(賽默飛，#R80007)。藉由將製備所得的兩種重鏈載體分別和輕鏈載體一起，與聚醚醯亞胺(PEI，Polysciences，#
24765-1)混合形成脂質體複合物後，轉染CHO-S細胞，放入培養箱中培養5-7天。離心收集細胞培養液上清，藉由Protein A親和層析管柱純化得到雙特異性抗體，並藉由分子排阻色譜進一步判斷蛋白的聚集情況。
雙特異抗體的表達純化以及檢測情況如圖2至圖5以及表3所示，檢測結果表明對於CD39-VHH-CD73-IgG形式的雙特異性抗體而言，IgG來源於不同母本單抗的SEC純度都較好，SEC純度達到95%左右。還原SDS-PAGE圖顯示700035和700038的重鏈和輕鏈都沒有降解，表明700035和700038的穩定性優異。
表3 CD39-CD73雙特異性抗體的SEC純度數據
實施例3 CD39-CD73雙特異性抗體的動力學參數測定
本試驗使用SPR方法測定CD39-CD73雙特異性抗體700035以及700038，以及親本對照抗體700053(CD39奈米抗體)，900698(700038對應的CD73親本單抗)和900725(700035對應的CD73親本單抗)與抗原的結合動力學及親和力。
試驗方法如下：
按照Human Antibody Captrue Kit(GE，#BR-1008-39)以及胺基偶聯試劑盒(GE，BR-1000-50)偶聯法準備Anti-Human Capture-CM5芯片(GE，#BR-1005-30)。將芯片置室溫平衡20~30min，裝入Biacore 8K儀器；用平衡緩衝液將抗原和抗體釋至實驗工作濃度；抗原用平衡緩衝液稀釋至50nM，再3倍稀釋度7個濃度梯度，並設置2個零濃度(即平衡緩衝液)和一個重複濃度(一般為最低濃度重複)；按照抗體，抗原，再生的次序，循環往復對10個抗原濃度(2個零濃度，7個梯
度濃度及1個重複濃度)進行實驗分析，抗原進樣流速30μL/分鐘，結合時間120秒，解離時間600秒；分析完成後，選用對應的分析程序分析數據，確認無明顯reference binding，選用Kinetics，1：1 binding model，擬合數據，獲得雙特異性抗體和親本對照抗體的動力學相關參數Ka，Kd和KD值
檢測結果如下表4和表5所示，結果表明對於人源CD39抗原，700035和700038的親和力相當，且明顯優於親本奈米抗體700053對CD39抗原的親和力。對於人源CD73抗原，700035雙抗相比於親本700025單抗，以及700038雙抗相比於900698單抗對CD73抗原的親和力相當。
表4候選抗體對人CD39抗原的結合親和力檢測
表5候選抗體對CD73抗原的結合親和力檢測
實施例4 CD39-CD73雙特異性抗體的生物學活性測定
4.1 CD39-CD73雙特異性抗體對CD39功能的抑制效果
檢測CD39-CD73雙特異性抗體對CD39功能的抑制效果的實驗步驟如下：將抗體用TM buffer工作液(TM buffer原液與DI Water按比例1：1混合)稀釋到30μg/mL，再3倍比例稀釋10個梯度。對過表達CD39的細胞CHOK1-huCD39-10B6進行計數，用TM buffer工作液重新懸浮為1*10E5/mL，每孔50μL鋪到96孔U底板中。將稀釋好的抗體每孔50μL加入鋪好細胞的96孔U底板，孵育1h。用TM Buffer工作液將ATP稀釋至60μM，每孔50μL加入細胞-抗體孵育結束後的96孔U底板中，孵育1h。孵育結束後，培養板離心(400G 2min)，每孔取50μL上清轉移到96孔黑板對應孔。將CellTiter-Glo® Substrate加入CellTiter-Glo® buffer，混勻並平衡至室溫，然後每孔50μL加入上述96孔黑板中，室溫避光反應10min，最後MD i3x酶標儀讀值檢測信號強度。
檢測結果如圖6以及表6所示，結果表明雙特異抗體700035以及700038對CD39抗原酶活功能的抑制能力比親本CD39奈米抗體700053都有3倍左右的增強，兩個雙特異抗體酶活抑制能力相當。
表6雙特異性抗體700035和700038對CD39功能的抑制效果
4.2 CD39-CD73雙特異性抗體對CD73功能的抑制效果
4.2.1檢測CD39-CD73雙特異性抗體700035對膜表面CD73酶活功能的抑制效果的實驗步驟如下：
將抗體用PBS稀釋到30μg/mL，再5倍比例稀釋8個梯度。對過表達CD73的細胞CHOK1-huCD73-3F4進行計數，用培養基重新懸浮為4*10E5/mL，每孔100μL鋪到96孔U底板中，離心(1500rpm 5min)後棄去上清。用稀釋好的系列
抗體重新懸浮細胞，每孔100μL，37℃孵育20min。孵育結束後每孔加200μL TM Buffer工作液(TM buffer原液與DI Water按比例1：1混合)進行洗滌，離心(1500rpm 5min)後棄去上清，再次每孔加200μL TM Buffer工作液洗滌後離心棄上清。用TM Buffer工作液將AMP稀釋至180μM，每孔100μL重新懸浮上述培養板中細胞，37℃孵育1h。孵育結束後，培養板離心(1500rpm 5min)，每孔取50μL上清轉移到96孔黑板對應孔。用TM Buffer工作液將ATP稀釋至60μM，每孔50μL加入上述96孔黑板中，37℃孵育15min。將CellTiter-Glo® Substrate加入CellTiter-Glo® buffer，混勻並平衡至室溫，然後每孔100μL加入上述96孔黑板中，室溫避光反應10min，最後MD i3x酶標儀讀值檢測信號強度。
雙特異性抗體檢測結果如圖7和表7所示，結果表明雙特異性抗體700035雙特異性抗體與CD73親本單抗900725相比，對CD73功能的抑制效果只有2倍左右的減弱。
表7雙特異性抗體700035對膜表達CD73酶活功能的抑制效果
4.2.2檢測CD39-CD73雙特異性抗體700038對可溶重組蛋白CD73酶活功能的抑制效果的實驗步驟如下：
將抗體用TM buffer工作液(TM buffer原液與DI Water按比例1：1混合)稀釋到128μg/mL，再2倍比例稀釋10個梯度；將CD73可溶蛋白用TM buffer工作液稀釋到0.3μg/mL，然後將稀釋好的雙特異性抗體(每孔25μL)和CD73可溶蛋白(每孔25μL)依次加入96孔黑板中。用TM Buffer工作液將AMP和ATP分別稀釋至240μM和80μM，並進行1：1混合，然後每孔50μL混合液加入上述含
有抗體-可溶CD73蛋白的96孔黑板中，反應10min。將CellTiter-Glo® Substrate加入CellTiter-Glo® buffer，混勻並平衡至室溫，然後每孔100μL加入上述96孔黑板中，室溫避光反應10min，最後MD i3x酶標儀讀值檢測信號強度。
雙特異性抗體檢測結果如圖8和表8所示，結果表明雙特異性抗體700038雙特異性抗體與CD73親本單抗900698相比，對CD73功能的抑制效果相當。
表8雙特異性抗體700038對可溶蛋白CD73酶活功能的抑制效果
實施例5 CD39-CD73雙特異性抗體的熱穩定性的檢測
檢測CD39-CD73雙特異性抗體700035和700038的熱穩定性的實驗步驟如下：將抗體濃度濃縮到20mg/mL，buffer緩衝體系為20mM醋酸-醋酸鈉，8% w/v蔗糖，pH5.7。使用蛋白穩定性分析儀(UNcle,UNCHAINED LABS,US)檢測雙特異性抗體700035和700038的熔解溫度(Tm)、聚集溫度(Tagg)，Tm以及Tagg的升溫範圍是25℃到95℃，升溫速率是0.3℃。
雙特異性抗體的熱穩定性檢測結果如表9所示，結果表明這種形式的雙特異性抗體的熱穩定性數據Tm和Tagg值都處於69℃到80℃範圍內，熱穩定性表現非常優異，其中700035的熱穩定性較700038更優。
表9雙特異性抗體700035和700038的熱穩定性數據
實施例6 CD39-CD73雙特異性抗體的種屬交叉試驗
本試驗使用SPR方法測定CD39-CD73雙特異性抗體700035以及700038與不同種屬(Human/Cynomolgus/Mouse)來源的CD39&CD73抗原的結合動力學及親和力。實驗方法如下：
按照Human Antibody Captrue Kit(GE，#BR-1008-39)以及胺基偶聯試劑盒(GE，BR-1000-50)偶聯法準備Anti-Human Capture-CM5芯片(GE，#BR-1005-30)。將芯片置室溫條件下平衡20~30min左右，然後裝入Biacore 8K儀器；用平衡緩衝液將抗原和抗體釋至實驗工作濃度；抗原用平衡緩衝液稀釋至50nM，再3倍稀釋度7個濃度梯度，並設置2個零濃度(即平衡緩衝液)和一個重複濃度(一般為最低濃度重複)；按照抗體，抗原，再生的次序，循環往復對10個抗原濃度(2個零濃度，7個梯度濃度及1個重複濃度)進行實驗分析，抗原進樣流速30μL/分鐘，結合時間120秒，解離時間600秒；分析完成後，選用對應的分析程序分析數據，確認無明顯reference binding，選用Kinetics，1：1 binding model，擬合數據，獲得雙特異性抗體動力學相關參數Ka，Kd和KD值。
檢測結果如下表10所示，結果表明對於CD39抗原，兩個雙特異性抗體700035和700038對人CD39抗原親和力都具有極高的親和力，分別達到7.08E-11以及9.18E-11，與猴CD39抗原的親和力也達到2.61E-9以及2.69E-9。對於CD73抗原，兩個雙特異性抗體700035和700038對人和猴的親和力相當，達到E-10左右。同時兩個雙特異性抗體對鼠CD39和CD73都沒有結合。綜上所述，對於CD39和CD73這兩個靶點，人和食蟹猴為相關種屬，小鼠非相關種屬。
表10對不同種屬CD39、CD73抗原的親和力檢測
實施例7 受試物在人胰腺癌細胞BxPC-3 hPBMC模型中的藥效學研究
人胰腺癌細胞BxPC-3，以RPMI-1640培養基添加10% FBS培養於含5% CO2的37℃培養箱。細胞連續培養十代之前，將約含1×107 BxPC-3細胞的PBS 100μL和等體積Matrigel混勻後，藉由皮下注射接種於30隻NPG小鼠背部右邊靠近腋下，接種體積為200μL左右。接種前用2至5%異氟烷將小鼠麻醉。當腫瘤生長到平均約50至80mm3左右時，30隻荷瘤小鼠將根據腫瘤體積和體重被隨機分成5組，每組6隻，經尾靜脈注射1×107 PBMC(100uL)。分組當天進行給藥，動物的給藥體積按照10μL/g體重進行調整，分組情況和給藥方案如表10
所示。每天觀察每隻小鼠的外觀及行為，自分組開始連續觀察4週，測定動物體重(BW,Body weight)，腫瘤體積(TV,Tumor volume)，相對腫瘤體積(RTV)，相對腫瘤抑制率(TGI,Tumor growth inhibitory)。
表11分組和給藥方案
結果如圖9所示，從結果可以看出和陰性對照抗體900543(重鏈序列如SEQ ID NO：48所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：49所示)相比，CD39奈米抗體700053，CD73單抗900725都有很好的抗胰腺癌腫瘤生長效果。而700053與900725聯用相比於兩個單抗具有更優的抗腫瘤效果。同時CD39/CD73雙抗700035與700053和9000725聯用效果相當，證明該雙抗相對於兩個親本抗體具有協同抗腫瘤效果。
實施例8受試物在小鼠結直腸癌模型中的藥效學研究
將MC38-hCD73小鼠結直腸癌腫瘤細胞以5×105個/0.1mL濃度接種於雌性B-hCD73/hCD39(v3)人源化小鼠的右側皮下，待腫瘤生長至101mm3左右時，隨機分組給藥(分組當天記為D0)，分組情況和給藥方案如表11所示。每組6隻，共4組，分別為900543(hIgG1同型對照，10mg/kg)、700053(CD39奈米單抗，5.2mg/kg)、900698(CD73單抗，10mg/kg)和700038(CD39/CD73雙抗，11.6
mg/kg)。分組後，各組小鼠均為腹腔注射給藥，每週給藥2次，連續給藥4週，共8次。給藥和觀察期間每週測量2次小鼠體重和腫瘤體積，並記錄測量值。在分組後第25天(D25)結束實驗，動物安樂死，剝取腫瘤稱重、拍照，計算腫瘤體積生長抑制率TGITV(%)和瘤重抑制率TGITW(%)並進行統計學分析。治療期間，各組小鼠正常攝食飲水，體重穩定，無停藥無死亡，藥物未見明顯毒副作用，小鼠耐藥性良好。
表12分組和給藥方案
結果如圖10所示，在實驗結束時(D25)，700053(5.2mg/kg)組、900698(10mg/kg)組、700038(11.6mg/kg)組的平均腫瘤體積分別為1858±318mm3、1420±347mm3、1213±274mm3，對應的腫瘤體積生長抑制率TGITV為21.9%、41.4%、50.6%。與同型對照抗體900543組(2352±248mm3 & 2.477±0.358g)相比，700053組、900698組及700038組腫瘤體積和腫瘤重量明顯縮小和降低，以上數據表明700053、900698及700038均有抑制腫瘤生長的效果，而且CD39/CD73雙抗抗腫瘤效果相對於CD39奈米單抗以及CD73單抗具有協同效應。
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Claims (114)
- 一種分離的抗原結合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，該第一結合域能夠結合CD39蛋白，該第二結合域能夠結合CD73蛋白。
- 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：(1)以1×10-9M或更低的KD值與CD39蛋白結合；(2)以1×10-9M或更低的KD值與CD73蛋白結合；(3)對CD39抗原酶活功能具有抑制作用；(4)對CD73抗原酶活功能具有抑制作用；(5)具有熱穩定性；(6)能夠和人CD39和/或食蟹猴CD73相結合；(7)能夠和人CD73和/或食蟹猴CD73相結合；以及(8)能夠抑制腫瘤細胞的生長。
- 如請求項1或2所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項3所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
- 如請求項3或4所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
- 如請求項1至5中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域為VHH。
- 如請求項1至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含抗體重鏈可變區VHH中的至少一個CDR，該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至7中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至10中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含FR1，該FR1的C端與該CDR1的N端直接或間接相連，且該FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含FR2，該FR2位於該CDR1和該CDR2之間，且該FR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含FR3，該FR3位於該CDR2和該CDR3之間，且該FR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至13中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域包含FR4，該FR4的N端與該CDR3的C端直接或間接相連，且該FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至14中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中 該第一結合域包含VHH，且該VHH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至15中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項16所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、人源化抗體和全人源抗體。
- 如請求項16或17所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段選自下組：Fab、Fab’、F(ab)2、Fv、F(ab’)2、scFv、VHH、di-scFv和dAb片段。
- 如請求項1至18中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至19中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至20中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至21中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至22中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1、HCDR2和HCDR3 的胺基酸序列選自下組：(1)該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；(2)該HCDR1包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至24中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至25中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至26中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含H-FR4，該H-FR4的N端與該HCDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至27中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，該H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含選自下組的胺基酸序列：(1)該H-FR1包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；(2)該H-FR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含VH，且該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至29中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體重鏈恆定區。
- 如請求項30所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。
- 如請求項30或31所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。
- 如請求項30至32中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。
- 如請求項30至33中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至34中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至35中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至36中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至37中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至38中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至39中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1、LCDR2和LCDR3包含選自下組的胺基酸序列：(1)該LCDR1包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；(2)該LCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至40中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中 該第二結合域包含L-FR1，該L-FR1的C端與該L-CDR1的N端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至41中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1和該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至42中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至43中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含L-FR4，該L-FR4的N端與該LCDR3的C端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至44中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，該L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含選自下組的胺基酸序列：(1)該L-FR1包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；(2)該L-FR1包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至45中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含VL，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺 基酸序列。
- 如請求項1至46中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體輕鏈恆定區。
- 如請求項47所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區源自Igκ恆定區。
- 如請求項47或48所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。
- 如請求項47至49中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至50中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至51中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結構域包含VH和VL，該VH和VL包含選自下組的胺基酸序列：(1)該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；(2)該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至52中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二結合域包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈和抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：(1)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含 SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；(2)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至53中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域和該第二結合域直接或間接相連。
- 如請求項1至54中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域的C端與該第二結合域的N端相連。
- 如請求項1至55中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域的C端與該第二結合域的重鏈可變區的N端相連。
- 如請求項1至56中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域和該第二結合域藉由連接子相連。
- 如請求項57所述的分離的抗原結合蛋白，其中該連接子包含肽接頭。
- 如請求項57或58所述的分離的抗原結合蛋白，其中該連接子包含(GGGGS)n的胺基酸序列，其中n為0至10中的任意正整數。
- 如請求項57至59中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該連接子包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至60中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含兩個該第一結合域。
- 如請求項61所述的分離的抗原結合蛋白，其中該兩個第一結合域分別與該第二結合域的N端直接或間接相連。
- 如請求項61或62所述的分離的抗原結合蛋白，其中該兩個第 一結合域分別與該第二結合域的兩條重鏈的N端直接或間接相連。
- 如請求項1至63中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含該第一結合域和該第二結合域的重鏈。
- 如請求項64所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端直接或間接相連。
- 如請求項64或65所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一結合域和該第二結合域的重鏈的N端藉由連接子相連。
- 如請求項64至66中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
- 如請求項64至67中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二多肽鏈包含該第二結合域的輕鏈。
- 如請求項64至68中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
- 如請求項64至69中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含兩條該第一多肽鏈和兩條該第二多肽鏈。
- 一種藥物組合，其包含能夠結合CD39的抗原結合蛋白，以及能夠結合CD73的抗原結合蛋白。
- 如請求項71所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：(1)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.5μg/mL的EC50與人CD39結合；(2)藉由FACS檢測法測定，以小於約0.7μg/mL的EC50與食蟹獼猴 (cyno)CD39結合；(3)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.3×10-8M的KD與人CD39結合；(4)藉由Biacore檢測法測定，以小於約1.1×10-7M的KD與食蟹獼猴(cyno)CD39結合；(5)藉由ATP酶活性分析測定，以小於約0.8μg/mL的EC50抑制在表達CD39的細胞中的ATP酶活性；(6)抑制腫瘤細胞的CD39功能。
- 如請求項71或72所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至73中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至74中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至75中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至76中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD39的抗原結合蛋白包含VH，該VH包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至77中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合 CD39的抗原結合蛋白為VHH。
- 如請求項71至78中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：(1)能夠特異性結合CD73或其功能活性片段；(2)能夠抑制CD73的酶活性；(3)能夠誘導細胞表面的CD73的內吞；(4)能夠抑制腫瘤細胞的生長和/或增殖。
- 如請求項71至79中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至80中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至81中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至82中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至83中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VH，該VH包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至84中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈恆定區。
- 如請求項85所述的藥物組合，其中該抗體重鏈恆定區源自IgG重鏈恆定區。
- 如請求項85或86所述的藥物組合，其中該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。
- 如請求項85至87中任一項所述的藥物組合，其中該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區或人IgG4重鏈恆定區。
- 如請求項85至88中任一項所述的藥物組合，其中該抗體重鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至89中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至90中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至91中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至92中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：18(WAS)或SEQ ID NO：35(LAS)所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至93中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至94中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VL，該VL包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至95中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈恆定區。
- 如請求項96所述的藥物組合，其中該抗體輕鏈恆定區源自人Igκ恆定區。
- 如請求項96或97所述的藥物組合，其中該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至98中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至99中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含VH和VL，該VH和VL包含選自下組的胺基酸序列：(1)該VH包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；(2)該VH包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如請求項71至100中任一項所述的藥物組合，其中該能夠結合CD73的抗原結合蛋白包含抗體重鏈和抗體輕鏈，該抗體重鏈和抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：(1)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；(2)該抗體重鏈包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
- 一種載體，其包含如請求項102所述的核酸分子。
- 一種細胞，其包含如請求項102所述的核酸分子或如請求項103所述的載體。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項71至101中任一項所述的藥物組合、如請求項102所述的核酸分子、如請求項103所述的載體和/或如請求項104所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
- 一種製備如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項104所述的細胞。
- 一種如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項71至101中任一項所述的藥物組合、如請求項102所述的核酸分子、如請求項103所述的載體、如請求項104所述的細胞和/或如請求項105所述的 醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療疾病和/或病症。
- 如請求項107所述的用途，其中該疾病和/或病症由CD39和/或CD73介導。
- 如請求項107或108所述的用途，其中該疾病和/或病症包括腫瘤。
- 如請求項109所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或血液瘤。
- 如請求項107至110中任一項所述的用途，其中該疾病和/或病症包括胰腺癌和/或結直腸癌。
- 一種檢測樣品中CD39和/或CD73的方法，該方法包括施用如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項71至101中任一項所述的藥物組合、如請求項102所述的核酸分子、如請求項103所述的載體、如請求項104所述的細胞，和/或如請求項105所述的醫藥組成物。
- 如請求項112所述的方法，其為體外方法和/或離體方法。
- 一種如請求項1至70中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項71至101中任一項所述的藥物組合、如請求項102所述的核酸分子、如請求項103所述的載體、如請求項104所述的細胞和/或如請求項105所述的醫藥組成物在製備試劑盒中的用途，該試劑盒用於檢測樣品中CD39和/或CD73的存在。
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