TWI793714B - 結合人cd38的抗體、其製備方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本發明屬腫瘤治療領域，涉及一種結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，能夠有效結合人CD38，應用於製備治療CD38強表現的疾病(例如多發性骨髓瘤)的藥物，具有良好的臨床應用前景。
Description
本發明屬腫瘤治療領域，涉及一種結合人CD38的抗體、其製備方法和用途。
多發性骨髓瘤(MM)是一種漿細胞惡性腫瘤，約占所有癌症的1%，易累及骨骼和腎臟，易致病理性骨折、骨痛、脊髓壓迫和腎功能衰竭。對於多發性骨髓瘤的治療，傳統的化療、放療等治療方法，難以取得令人滿意的療效。在過去的十年裏，針對骨髓瘤生物學的深入研究揭示了許多新的潛在的治療標的。
CD38是一種46 kDa的II型跨膜醣蛋白，CD38已被發現具有多種功能，包括胞外酶活性以及受體媒介的細胞粘附和訊息傳遞的調節。CD3的酵素活性涉及菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)轉化爲環腺苷二磷酸核糖(CADPR)、ADPR和菸鹼酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)，這是調節細胞內鈣信號所必需的受質。在對CD38受體功能的初步研究中，人們發現CD38媒介細胞與內皮細胞的結合，在淋巴細胞遷移中發揮作用，並與T、B和自然殺手(NK)細胞的表面分子有功能聯繫。CD38僅在祖細胞骨髓、生髮中心的B淋巴細胞、終末分化的漿細胞和活化的扁桃腺中高位準表現，而成熟和記憶B淋巴細胞表現低位準的CD38。在多發性骨髓瘤細胞上CD38強表現，使其成爲治療多發性骨髓瘤的理想標的。目前，已上市的Daratumumab、Isatuximab在多發性骨髓瘤治療上表現出色。目前國內還沒有相關產品，針對抗體療法的需求仍未得到滿足。
爲了解决上述技術問題，本發明的發明人進行了大量試驗，從抗原免疫、融合瘤製備和篩選、抗體表現純化到生物活性鑑定，篩選獲得了特異性結合人CD38的鼠源抗體，並在此基礎上，進一步建構獲得其嵌合抗體以及人源化抗體。
因此，本發明的目的在於提供一種結合人CD38的抗體或其抗原結合片段；提供編碼所述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的核苷酸分子；提供包含所述核苷酸分子的表現載體；提供所述表現載體的宿主細胞；提供所述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段製備方法；提供包含所述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段藥物組成物；提供所述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的應用。
爲了實現上述目的，本發明採用了如下技術方案：
本發明一方面提供了一種結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，包括：
(a)重鏈互補决定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，和
(b)輕鏈互補决定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本發明“抗體(Ab)”是約150000道爾頓的異四聚醣蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。本發明的抗體包括單株抗體、多株抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)等。
本發明“單株抗體”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位址。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同决定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個决定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們是透過融合瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本發明“抗原結合片段”是指能夠與人CD38特異性結合的抗體的片段。本發明的抗原結合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2
片段、Fv片段等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗體產生的片段。F(ab’)2
片段是用胃蛋白酶消化抗體產生的片段。Fv片段是由抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區緊密非共價結合的二聚物組成。
作爲優選的方案，所述的抗體爲鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
本發明“鼠源抗體”是指來源於大鼠或小鼠的抗體，優選小鼠。本發明的鼠源抗體爲使用人CD38爲抗原免疫小鼠並進行融合瘤細胞篩選獲得。
本發明“嵌合抗體”是指包含來源於一個物種的重和輕鏈可變區序列以及來源於另一個物種的恆定區序列的抗體，例如具有與人恆定區連接的鼠重和輕鏈可變區的抗體。優選的，本發明的嵌合抗體是由鼠源抗體50G12重鏈可變區和輕鏈可變區序列與人的恆定區拼接獲得。更優選的，本發明的嵌合抗體選自50G12-Chimeric。
本發明“人源化抗體”是指其CDR來源於非人物種(優選小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。優選的，本發明的人源化抗體由鼠源抗體50G12的CDR區和來源自人抗體的非CDR區重組，增加第四個框架區並對部分有重要影響的殘基進行突變獲得。更優選的，本發明的人源化抗體選自50G12-Humanized。
作爲優選的方案，所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2
片段、Fv片段。
作爲優選的方案，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
作爲優選的方案，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
作爲優選的方案，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本發明另一方面提供了一種核苷酸分子，所述核苷酸分子編碼上述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
本發明所述核苷酸分子的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地包括以下製備方法：透過基因選殖技術例如PCR方法等，獲得編碼上述單株抗體的核苷酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述單株抗體的核苷酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該結合人CD38的抗體或其抗原結合片段基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
本發明另一方面提供了一種表現載體，所述表現載體含有上述的核苷酸分子。
其中所述表現載體爲本領域常規的表現載體，是指包含適當的調控序列，例如啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表現載體。所述表現載體可以是病毒或質體，如適當的噬菌體或者噬菌粒，更多技術細節請參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編著。本發明所述表現載體較佳地爲pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pcDNA4，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0。
本發明另外提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述的表現載體。
本發明所述的宿主細胞爲本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核苷酸可被有效表現即可。其中所述宿主細胞包括原核表現細胞和真核表現細胞，所述宿主細胞較佳地包括：COS、CHO (中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地爲E. coli TG1、BL21(DE3)細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。將前述表現載體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形體。其中所述轉形方法爲本領域常規轉形方法，較佳地爲化學轉形法，熱休克法或電穿孔法。
本發明另一方面提供了上述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括以下步驟：
a)在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段；
b)分離並純化a)所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。
本發明所述的宿主細胞的培養方法、所述抗體的分離和純化方法爲本領域常規方法，具體操作方法請參考對應的細胞培養技術手册以及抗體分離純化技術手册。本發明中揭示的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的製備方法包括：在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段；分離和純化所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。利用上述方法，可以將重組蛋白純化爲基本均一的物質，例如在SDS-PAGE電泳上爲單一條帶。
可以利用親和層析的方法對本發明揭示的所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段進行分離純化，根據所利用的親和管柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗提結合在親和管柱上的所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。本發明的發明人對所得所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段進行了檢測實驗，實驗結果表明該所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段能很好地與抗原結合，具有較高的親和力。
本發明另一方面提供了一種組成物，所述組成物含有上述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
本發明提供的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的構形完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。通常情况下，對於液體製劑，通常可以在2°C-8°C條件下保存至少穩定一年，對於凍乾製劑，在30°C至少六個月保持穩定。所述雙特異性抗體製劑可爲製藥領域常用的懸浮液、注射液、凍乾等製劑。
對於本發明揭示的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段注射液或凍乾製劑，藥學上可以接受的載體較佳地包括但不限於：界面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑和緩衝液之一或其組合。其中界面活性劑較佳地包括但不限於：非離子型界面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)；poloxamer (如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌胺酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量應使結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的顆粒化趨勢最小。溶液穩定劑較佳地包括但不限於以下列舉之一或其組合：醣類，例如，還原性醣和非還原性醣；胺基酸類，例如，麩胺酸單鈉或組胺酸；醇類，例如：三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液穩定劑的加入量應該使最後形成的製劑在本領域的技術人員認爲達到穩定的時間內保持穩定狀態。等滲調節劑較佳地包括但不限於氯化鈉、甘露醇之一或其組合。緩衝液較佳地包括但不限於：Tris、組胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液之一或其組合。
本發明另一方面提供了上述的結合人CD38的抗體或藥物組成物在製備治療多發性骨髓瘤、白血病、B淋巴細胞瘤、自體免疫性疾病藥物中的應用。
作爲優選的方案，所述自體免疫性疾病選自系統性紅斑狼瘡、自體免疫性溶血性貧血、免疫性血小板减少性紫癜和重症肌無力。
本發明結合人CD38的抗體或其抗原結合片段及其組成物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情况，總給藥量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800 mg/天。
本發明另一方面提供了一種CAR建構物，所述CAR建構物的單株抗體抗原結合區的scFv段爲特異性結合於CD38的結合區，並且，所述scFv的重鏈可變區包括：
重鏈互補决定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，和
所述scFv的輕鏈可變區包括：
輕鏈互補决定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本發明另一方面提供了一種重組的免疫細胞，所述的免疫細胞表現外源的如上所述的CAR建構物。
本發明另一方面提供了一種抗體藥物偶聯物，所述的抗體藥物偶聯物含有：
(a)抗體部分，所述抗體部分包含如上所述的抗體或其抗原結合片段；和
(b)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酶、或其組合。
本發明另一方面提供了一種非診斷性體外檢測樣品中CD38蛋白的方法，所述方法包括步驟：
(1)在體外，將所述樣品與如上所述的抗體或其抗原結合片段或抗體藥物偶聯物接觸；
(2)檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD38蛋白。
本發明另一方面提供了一種預防和/或治療CD38相關疾病的方法，所述方法包括：給需要的對象施用如上所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段、組成物、抗體-藥物偶聯物、重組的免疫細胞、或其組合。
在另一優選例中，所述CD38相關疾病選自多發性骨髓瘤、白血病、B淋巴細胞瘤、自體免疫性疾病、或其組合。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
目前臨床上亟待開發新穎、特異、高效的CD38強表現疾病的治療藥，從而能夠改善患有此類疾病人群的生活品質，爲患者提供更多、更有效的治療方案。本發明的50G12-Humanized對人CD38具有很高的親和力，能夠有效地中和人CD38，與細胞膜表面對應抗原結合後能夠誘導細胞凋亡，延長受試動物的生存時間，具有良好的臨床應用前景。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，透過大量篩選，獲得了一種CD38抗體，具有高親和力和良好的生物活性，尤其具有優異的ADCC、CDC活性。本發明的人源化CD38抗體與市售的CD38抗體活性相當甚至更優。特別地，在小鼠淋巴瘤模型中，本發明的人源化CD38抗體能夠顯著延長受試動物的生存時間。因此本發明的CD38抗體可以被開發爲一種療效優越的抗腫瘤藥物。在此基礎上，本發明人完成了本發明。術語
本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚醣蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ (Kappa)或λ (Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解爲兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本發明中，術語“scFv”爲單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通常透過15～25個胺基酸的連接短鏈胜肽(linker)連接而成。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱爲互補决定區(complementarity-determining region，CDR)或高度變異區中的三個片段中。可變區中較守恆的部分稱爲框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-摺疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β摺疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對守恆的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱爲FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。對應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示爲(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“連接子”是指插入免疫球蛋白結構域中爲輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以摺疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的連接子是指連接子Linker1和Linker2，其中Linker1連接單鏈抗體(scFv)的VH和VL，而Linker2用於將scFv與另一抗體的重鏈進行連接。
合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。
在本發明中，本發明抗體還包括其守恆性變異體，指與本發明雙特異性抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些守恆性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A
| 最初的殘基 | 代表性的取代 | 優選的取代 |
| Ala (A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg (R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn (N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp (D) | Glu | Glu |
| Cys (C) | Ser | Ser |
| Gln (Q) | Asn | Asn |
| Glu (E) | Asp | Asp |
| Gly (G) | Pro；Ala | Ala |
| His (H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile (I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu (L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys (K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met (M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe (F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro (P) | Ala | Ala |
| Ser (S) | Thr | Thr |
| Thr (T) | Ser | Ser |
| Trp (W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val (V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本發明中，術語“抗”、“結合”、“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10-7
M，例如小於大約10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽决定簇。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。
本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。藥物組成物和應用
本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構形完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99 wt%，較佳地0.01-90 wt%，更佳地0.1-80 wt%)的本發明上述的雙特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的雙特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的雙特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情况下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀况等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。抗體 - 藥物偶聯物 (ADC)
本發明還提供了基於本發明抗體的抗體偶聯藥物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗體偶聯藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選爲化學偶聯。其中，所述效應分子優選爲具有治療活性的藥物。此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。
本發明抗體與所述效應分子之間可以是透過偶聯劑進行偶聯。所述偶聯劑的例子可以是非選擇性偶聯劑、利用羧基的偶聯劑、肽鏈、利用二硫鍵的偶聯劑中的任意一種或幾種。所述非選擇性偶聯劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐類偶聯劑(如順烏頭酸酐)、醯基腙類偶聯劑(偶聯位址爲醯基腙)中的任意一種或幾種。
抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。抗體可以被偶聯到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。功能劑可以直接地、或者是透過連接子間接地連接於抗體。
抗體可以偶聯藥物從而形成抗體藥物偶聯物(ADCs)。典型地，ADC包含位於藥物和抗體之間的連接子。連接子可以是可降解的或者是不可降解的連接子。可降解的連接子典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位址處連接子發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的連接子包括，例如酶降解的連接子，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者胞內體蛋白酶)降解的含有肽基的連接子，或者糖連接子例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。肽基連接子可以包括，例如二肽，例如纈胺酸-瓜胺酸，苯丙胺酸-離胺酸或者纈胺酸-丙胺酸。其它合適的可降解的連接子包括，例如，pH敏感連接子(例如pH小於5.5時水解的連接子，例如腙連接子)和在還原條件下會降解的連接子(例如二硫鍵連接子)。不可降解的連接子典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。
連接到抗體之前，連接子具有能夠和某些胺基酸殘基反應的活性反應基團，連接透過活性反應基團實現。巰基特異性的活性反應基團是優選的，並包括：例如馬來醯亞胺類化合物，鹵代醯胺(例如碘、溴或氯代的)；鹵代酯(例如碘、溴或氯代的)；鹵代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基鹵代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基碸，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。連接子可以包括，例如，透過硫代丁二醯亞胺連接到抗體上的馬來醯亞胺。
藥物可以是任何細胞毒性，抑制細胞生長或者免疫抑制的藥物。在實施方式中，連接子連接抗體和藥物，而藥物具有可以和連接子成鍵的功能性基團。例如，藥物可以具有可以和連接物成鍵的胺基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到連接子的情况下，藥物在連接到抗體之前，具有反應的活性基團。
有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、DNA小溝結合試劑、DNA複製抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼等。在本發明中，藥物-連接子可以用於在一個簡單步驟中形成ADC。在其它實施方式中，雙功能連接物化合物可以用於在兩步或多步方法中形成ADC。例如，半胱胺酸殘基在第一步驟中與連接子的反應活性部分反應，並且在隨後的步驟中，連接子上的功能性基團與藥物反應，從而形成ADC。
通常，選擇連接子上功能性基團，以利於特異性地與藥物部分上的合適的反應活性基團進行反應。作爲非限制性的例子，基於疊氮化合物的部分可以用於特異性地與藥物部分上的反應性炔基基團反應。藥物透過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環加成，從而共價結合於連接子。其它的有用的功能性基團包括，例如酮類和醛類(適合與醯肼類和烷氧基胺反應)，膦(適合與疊氮反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應)；和活化的酯類，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(適合與胺類和醇類反應)。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯技術》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本領域技術人員所熟知的。本領域技術人員能夠理解，對於藥物部分和連接子的選擇性反應，當選擇了一個互補對的反應活性功能基團時，該互補對的每一個成員既可以用於連接子，也可以用於藥物。
本發明還提供了製備ADC的方法，可進一步地包括：將抗體與藥物-連接子化合物，在足以形成抗體偶聯物(ADC)的條件下進行結合。
在某些實施方式中，本發明方法包括：在足以形成抗體-連接子偶聯物的條件下，將抗體與雙功能連接子化合物進行結合。在這些實施方式中，本發明方法還進一步地包括：在足以將藥物部分透過連接子共價連接到抗體的條件下，將抗體連接子偶聯物與藥物部分進行結合。
在一些實施方式中，抗體藥物偶聯物ADC如下分子式所示：
其中：
Ab是抗體，
LU是連接子；
D是藥物；
而且下標p是選自1到8的值。
以下實施例是對本發明進行進一步的說明，不應理解爲是對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法．這樣的方法對本領域中具有普通技術的人員是衆所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch,E.F. and Maniais,T. (1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd
edition, Cold spring Harbor Laboratory Press。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
以下實施例中使用的實驗材料和來源以及實驗試劑的配製方法具體說明如下。
實驗材料：
CHO-S細胞：購自Thermo Fisher Scientific。
重組細胞株CHOS-CD38：將人全長CD38穩定轉染到CHO-S細胞中，透過選殖篩選獲得穩定表現CD38的單株細胞株。
Raji細胞：購自ATCC，CCL-86。
小鼠骨髓瘤細胞SP2/0：購自ATCC，貨號CRL-1581。
Balb/c小鼠：購自上海靈暢生物科技有限公司。
CB-17 SCID小鼠：購自上海靈暢生物科技有限公司。
Ramos細胞：購自ATCC，貨號CRL-1596。
Daudi細胞：購自ATCC，貨號CCL-213。
DND-41細胞：購自豐輝生物。
人周邊血液單核細胞PBMC：購自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司。
反轉錄套組：購自Takara。
羊抗鼠二抗：購自Millipore, 貨號AP181P。
驢抗鼠PE螢光二抗：購自Jackson，貨號715-116-150。
羊抗人PE螢光二抗：購自Jackson，貨號 109-115-098
F16 Black Maxisorp Plate：購自Nunc，貨號475515。
實驗試劑：
PBS緩衝液：上海生工生物工程股份有限公司，貨號B548117-0500。
SFM培養基：購自Thermo Fisher Scientific公司，貨號12045-076。
TMB：購自BD公司，貨號555214。
NGD：購自sigma，貨號N5131-25MG。
牛血清白蛋白(BSA)：購自Fetal Bovine Serum。
β-巰基乙醇、胎牛血清、麩醯胺酸、丙酮酸鈉、MEM-NEAA、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin)均購自Gibco公司。
無酚紅RPMI-1640：購自Gibco，貨號11835055。
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay反應液：購自Promega，貨號：G1780。
HAT：購自Sigma-Aldrich，貨號H0262-10VL。
CCK-8：購自同仁化學，貨號CK04。
Trizol：購自Thermo Fisher Scientific，貨號15596018。
實驗儀器：
電融合儀：購自BTX。
流式細胞儀(CytoFLEX Cytometer System)：購自Beckman Coulter)。
本發明的抗體序列如下所示：
實施例 1 陽性對照抗體的製備
| 名稱 | 序列 | SEQ ID NO. |
| CD38抗體H-CDR1 | TYWMQ | 1 |
| CD38抗體H-CDR2 | AIYPGDGDITYNQKFKG | 2 |
| CD38抗體H-CDR3 | EGYYYGGALDY | 3 |
| CD38抗體L-CDR1 | TASSSVSSSYLH | 4 |
| CD38抗體L-CDR2 | GTSNLAS | 5 |
| CD38抗體L-CDR3 | HRYHRSPWT | 6 |
| CD38抗體重鏈可變區50G12-VH | QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFNTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDITYNQKFKGKATLTADKSSNTAYMHLSSLASEDSAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTSVTVSS | 7 |
| CD38抗體輕鏈可變區50G12-VL | QIFLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSPPKLWMYGTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHRYHRSPWTFGGGTKLEIK | 8 |
| CD38人源化抗體重鏈可變區50G12-Hu-VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSS | 9 |
| CD38人源化抗體輕鏈可變區50G12-Hu-VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVSSSYLHWYQQKPGKAPKLWMYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHRYHRSPWTFGQGTKVEIK | 10 |
| CD38人源化抗體重鏈50G12-Hu-HC | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNTYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDITYNQKFKGRVTLTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYYGGALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 11 |
| CD38人源化抗體輕鏈50G12-Hu-LC | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVSSSYLHWYQQKPGKAPKLWMYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHRYHRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 12 |
| 50G12-VH重鏈可變區核苷酸序列 | caggttcagctccagcagtctggggctgagctggcaagacctggggcctcagtgaagttg60tcctgcaaggcttctggctacacctttaatacctattggatgcagtgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggggctatttatcctggagatggtgatattacatataatcagaagtttaagggcaaggccacattgactgcagataaatcttccaacacagcctacatgcacctcagcagcttggcatctgaggactcagcggtctattactgtgcaagagagggatattattacggcggggctttggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca | 13 |
| 50G12-VL輕鏈可變區核苷酸序列 | caaatttttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaacgggtcaccatgacctgcactgccagctcaagtgtgagttcaagctacttgcactggtaccagcagaagccaggatccccccccaaactctggatgtatggcacatccaacctggcttctggagtcccacctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaccggtatcatcgttccccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa | 14 |
| 50G12-Hu-VH重鏈可變區核苷酸序列 | caggtgcagctcgtgcagtccggcgctgaggtgaagaagcccggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaacacctattggatgcaatgggtgaggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatctaccccggcgatggcgacatcacctacaaccagaagtttaagggcagggtgaccctgacagctgataaatctacatctactgtgtacatggagttatcttctctgagatctgaggatacagctgtgtactattgtgctagagagggatactattatggcggagccctggattattggggacagggaacactggtgacagtgtcttct | 15 |
| 50G12-Hu-LC輕鏈可變區核苷酸序列 | gatatccagatgacccagtctccttcttccctgtccgcttctgtgggagatagagtgacaattacatgtaccgcttcttcttctgtgtcttcttcttacctgcattggtatcagcagaagcctggcaaggctcctaaactgtggatgtatggaacatctaatctggcttctggcgtgccttctagattttctggctctggatctggcaccgattacacactgaccatctctagcctgcagcctgaggattttgccacatactactgtcacagatatcacagatctccttggacctttggccagggcaccaaggtggagatcaag | 16 |
| 50G12-Hu-HC重鏈的核苷酸序列 | caggtgcagctcgtgcagtccggcgctgaggtgaagaagcccggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaacacctattggatgcaatgggtgaggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatctaccccggcgatggcgacatcacctacaaccagaagtttaagggcagggtgaccctgacagctgataaatctacatctactgtgtacatggagttatcttctctgagatctgaggatacagctgtgtactattgtgctagagagggatactattatggcggagccctggattattggggacagggaacactggtgacagtgtcttctgcgagcaccaagggaccttccgtgtttcccctcgcccccagctccaaaagcaccagcggcggaacagctgctctcggctgtctcgtcaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggagccctgacaagcggcgtccacaccttccctgctgtcctacagtcctccggactgtacagcctgagcagcgtggtgacagtccctagcagctccctgggcacccagacatatatttgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgataagaaggtggagcctaagtcctgcgacaagacccacacatgtcccccctgtcccgctcctgaactgctgggaggcccttccgtgttcctgttcccccctaagcccaaggacaccctgatgatttccaggacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtcagccacgaggaccccgaggtgaaattcaactggtacgtcgatggcgtggaggtgcacaacgctaagaccaagcccagggaggagcagtacaattccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtcctccatcaggactggctgaacggcaaagagtataagtgcaaggtgagcaacaaggccctccctgctcccatcgagaagaccatcagcaaagccaagggccagcccagggaacctcaagtctataccctgcctcccagcagggaggagatgaccaagaaccaagtgagcctcacatgcctcgtcaagggcttctatccttccgatattgccgtcgagtgggagtccaacggacagcccgagaacaactacaagacaacaccccccgtgctcgattccgatggcagcttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtccagatggcaacaaggcaacgtcttcagttgcagcgtcatgcatgaggccctccacaaccactacacccagaagagcctctccctgagccctggaaag | 17 |
| 50G12-Hu-LC輕鏈的核苷酸序列 | gatatccagatgacccagtctccttcttccctgtccgcttctgtgggagatagagtgacaattacatgtaccgcttcttcttctgtgtcttcttcttacctgcattggtatcagcagaagcctggcaaggctcctaaactgtggatgtatggaacatctaatctggcttctggcgtgccttctagattttctggctctggatctggcaccgattacacactgaccatctctagcctgcagcctgaggattttgccacatactactgtcacagatatcacagatctccttggacctttggccagggcaccaaggtggagatcaagagaaccgtcgccgctcccagcgtcttcatcttcccccccagcgatgagcagctgaagagcggaaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctaccccagggaggccaaggtgcaatggaaggtggacaacgccctacagagcggcaactcccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggatagcacctacagcctgagcagcaccctcaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccatcagggcctgagcagccctgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc | 18 |
| Daratumumab的重鏈可變區胺基酸 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS | 19 |
| Daratumumab的輕鏈可變區胺基酸 | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK | 20 |
| Isatuximab的重鏈可變區胺基酸 | QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS | 21 |
| Isatuximab的輕鏈可變區胺基酸 | DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK | 22 |
本發明實施例中所述的Daratumumab的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列來自《WHO Drug Information, Vol. 24, No. 1, 2010》，即本發明的SEQ ID NO 19和20。
本發明實施例中所述的Isatuximab的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列來自《WHO Drug Information, Vol. 29, No. 3, 2015》，即本發明的SEQ ID NO 21和22。
由上海生工生物工程有限公司合成上述重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA。將合成的Daratumumab重鏈可變區基因與人IgG1重鏈恆定區基因相連，獲得全長的重鏈基因，命名爲Daratumumab-HC-IgG1；將Daratumumab輕鏈可變區基因與人Kappa鏈恆定區基因相連，獲得全長的輕鏈基因，命名爲Daratumumab-LC。將Daratumumab-HC-IgG1和Daratumumab- LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，利用PEI轉染法將所得重鏈和輕鏈表現載體一起轉入HEK293F細胞中以表現抗體，HEK293F細胞用Free Style 293表現培養基(Free Style 293 Expression Medium)培養。轉染後的HEK293F細胞置於CO2
震盪培養箱中培養5天，離心收集細胞上清液，利用Protein A親和層析法純化上清液中的抗體，所得抗體命名爲Daratumumab。此外，用相似的實驗方法獲得抗體Isatuximab。
人CD38胞外段序列資訊來源於https://www.uniprot.org/uniprot/P28907。由上海生工生物工程有限公司合成CD38胞外段的DNA，將重組基因建構到pcDNA3.4表現載體中。His標籤融合表現的重組蛋白利用金屬螯合親和層析管柱對培養上清液中的重組蛋白進行一步純化；Fc標籤融合表現的重組蛋白用ProteinA/G親和層析管柱進行一步純化。最終所得蛋白命名爲CD38-His/CD38-Fc。實施例 2 抗原免疫動物以及融合瘤的製備和篩選
步驟1：抗原免疫小鼠
用重組過度表現細胞株CHOS-CD38或腫瘤細胞株Raji細胞常規腹腔免疫Balb/c小鼠。第一天，用弗氏完全佐劑100 μl對Balb/c小鼠進行腹腔注射；第二天，用重組細胞株CHOS-CD38或Raji細胞腹腔免疫Balb/c小鼠，5*106
細胞/隻小鼠；第十四天，用重組細胞株CHOS-CD38或Raji細胞腹腔加強免疫Balb/c小鼠，5*106
細胞/隻小鼠，在第三十六天，用重組細胞株CHOS-CD38或Raji細胞同上次一樣加強免疫小鼠，三周以後腹腔內注射CD38-His抗原蛋白激發，3-4天後，取小鼠脾臟進行細胞融合實驗。
步驟2：融合瘤的製備和篩選
在小鼠末次免疫後3-4天，使用常規的融合瘤技術方案，將小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0透過電融合儀進行電融合。融合後的細胞在完全培養基中懸浮均勻，完全培養基爲將RPMI1640和DMEM F12培養基1：1混勻後加入1%的Glutmine (麩醯胺酸)，1% Sodium pyruvate (丙酮酸鈉)，1% MEM-NEAA (最小基本培養基-非必需胺基酸溶液)，1% Penicillin-streptomycin (青黴素-鏈黴素)，50 μM的β-巰基乙醇及20% FBS(胎牛血清)組成的培養基。融合後的細胞按105
個細胞/100 μl/孔，分入共36塊96孔培養盤中培養過夜，次日，每孔加入100 μl孔含有2×HAT的完全培養基，使96孔盤內培養液爲200μl/孔(含1×HAT)。在7-12天後，收穫上清液，透過Cell based ELISA方法篩選人CD38結合活性陽性的融合瘤孔。
其中，以細胞為基礎的ELISA (Cell based ELISA)方法篩選人CD38結合活性陽性的融合瘤孔的方法如下：將重組細胞株CHOS-CD38以PBS緩衝液稀釋至2*106
細胞/ml，100 μl/孔加入細胞培養盤中，37°C培養過夜。次日甩掉上清液，加入100 μl/孔細胞固定液室溫固定一小時，然後甩掉上清液加入5%脫脂奶粉37°C封阻2小時，PBST洗滌培養盤1次待用。將收取的融合瘤上清液依次加入封阻後的盤中，100μl/孔，37°C放置1h。PBST洗滌培養盤3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，37°C放置30 min；PBST洗滌培養盤5次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5°C)避光放置5min；每孔加入50 μl 2M H2
SO4
終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與標的抗原CD38結合能力。透過篩選共計拿到30株融合瘤細胞株。在含血清完全培養基中擴增篩選獲得的30株融合瘤細胞株，離心換液至無血清培養液SFM培養基，使細胞密度爲1~2×107
/ml，在8% CO2
、37°C條件下培養1周，離心獲取培養上清液，透過Protein G親和層析進行純化，得到3株抗人CD38單株抗體蛋白，分別命名爲50G12、279D11、153F11，其中50G12爲最優活性抗體。實施例 3 鼠源抗體 50G12 對人 CD38-Fc 蛋白的結合能力
間接酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)測定鼠源抗體對人CD38-Fc蛋白的結合能力。具體方法如下：
CD38-Fc蛋白以塗佈液(50mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至1 μg/ml塗佈孔盤4°C，過夜；再用5%的脫脂奶粉封阻，37°C培育2小時；PBST洗滌培養盤3次後，將實驗室製備的抗人CD38抗體50G12蛋白以1% BSA緩衝液梯度稀釋，100 μl/孔加入預塗佈的CD38-Fc的盤中，37°C培育一小時；PBST洗滌培養盤3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，37°C放置30 min；PBST洗滌培養盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5°C)避光放置5 min，每孔加入50 μl 2M H2
SO4
終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與標的抗原人CD38-Fc的結合能力，結果如圖1所示。
由圖1可知，鼠源抗體50G12、279D11、153F11與標的抗原CD38-Fc都有很好的結合活性，50G12結合活性最優，EC50
爲0.1727 nM。實施例 4 鼠源抗體 抑制 CD38 酵素活性的能力
CD38是一種酶，可以催化菸鹼醯胺鳥嘌呤二核苷酸(NGD)轉化爲環狀GDP核糖(cyclic GDP-ribose)，後者能夠激發出螢光。在此用螢光法測定了鼠源抗體50G12、279D11、153F11與對照抗體Daratumumab、Isatuximab、IgG對照(IgG control)對CD38酵素活性的抑制作用。具體方法如下：
待測鼠源抗體50G12、279D11、153F11與對照抗體Daratumumab、Isatuximab、IgG對照用Tris-Hcl稀釋至600 μg/ml，並按照3倍進行梯度稀釋，共10孔；CD38-His抗原用Tris-Hcl稀釋至5 μg/ml，將抗原與樣品抗體等體積加入反應盤中，各50 μl，震動搖晃10 min，37°C培育30 min。設置背景孔：(1)稀釋液孔：200 μl稀釋液；(2) NGD孔：100 μl稀釋液；(3)抗原孔：50μl抗原，150μl稀釋液。培育完成後，NGD用Tris-Hcl稀釋至250 μg/ml，除稀釋液孔與抗原孔外，每孔100 μl，震動搖晃5min，37°C培育90 min。用多功能酵素標示讀取儀在Ex：300，EM:410讀取培養盤，收集並處理數據，結果如圖2所示。
由圖2可知，只有鼠源抗體50G12和Isatuximab能有效阻斷CD38環化酶活性。實施例 5 鼠源抗體 對重組高度表現細胞株 CHOS-CD38 細胞和腫瘤細胞株 DND-41 細胞的結合能力
採用流式細胞術檢測鼠源抗體對重組高度表現細胞株CHOS-CD38細胞和腫瘤細胞株DND-41細胞的結合活性，具體方法如下：
分別收集細胞CHOS-CD38和DND-41細胞，離心去除細胞培養液，用PBS緩衝液洗2遍；計數並用1% BSA FACS緩衝液稀釋至2*106
細胞/ml，平盤培養細胞至96孔圓底盤中待用；待測抗體以1% BSA緩衝液稀釋8個梯度加入到上述細胞圓底盤中，4°C培育1小時；離心後，甩掉上清液，用1% BSA FACS緩衝液洗滌3遍，按1:300比例(詳見螢光二抗說明書)每孔加入100 μl的驢抗鼠PE螢光二抗或羊抗人PE螢光二抗，4°C，培育1小時；1% BSA FACS 緩衝液洗滌3遍，再用1% BSA FACS 緩衝液重新懸浮，200 μl/孔，使用FACScalibur BD 來測定分析樣品，所示抗體結合細胞結果見圖3A、圖3B。
由圖3A、圖3B可知，鼠源抗體50G12、279D11、153F11在CHOS-CD38和DND-41細胞上都有很好的結合活性。在CHOS-CD38細胞上，EC50
分別爲686.9 ng/ml，84.9 ng/ml，488.9 ng/ml；在DND-41細胞上，分別爲133.8 ng/ml，84.4 4ng/ml，96.89 ng/ml。實施例 6 鼠源抗體 CDC 活性測定
特異性抗體與細胞膜表面對應抗原結合後能夠活化補體經典途徑，從而形成的攻膜複合物裂解標的細胞，這叫做CDC作用。我們分別在CHOS-CD38、Raji、DND-41、Ramos、Daudi細胞上測定了CDC活性，具體方法如下：
以細胞培養基作爲緩衝液將抗人CD38單抗稀釋至起始濃度20 μg/ml，然後以3倍濃度梯度進行稀釋，共獲得8個濃度的稀釋液。將表現CD38的標的細胞(Daudi細胞等)計數後重新懸浮至3*105
個細胞/ml。將100 μl抗人CD38單抗的各種濃度稀釋液和80 μl高度表現CD38的標的細胞預先培育15 min，然後加入20 μl 50%的新鮮人血清(志願者捐贈)混勻。陽性對照孔爲單獨標的細胞加血清、陰性對照孔爲無細胞的培養基。培養箱中培育12-18h，加入20 μl CCK-8，4h後使用酵素標示讀取儀在450 nm處測定吸光值，根據450nm處的讀數計算毒殺率。毒殺率計算公式爲：
毒殺率(killing%)＝(陽性對照吸光值-實驗組吸光值)/(陽性對照吸光值-陰性對照吸光值)*100。
結果如圖4A、圖4B、圖4C、圖4D、圖4E所示，在不同細胞模型上，鼠源抗體50G12和279D11都有很強的CDC活性，153F11相對較弱。實施例 7 鼠源抗人 CD38 單株抗體的人源化
步驟1：鼠源抗人CD38單株抗體可變區序列的確定
使用Trizol從50G12融合瘤單株細胞株中萃取總RNA，用反轉錄套組將mRNA反轉錄成cDNA，透過文獻報導的組合引子(《抗體工程》(Antibody Engineering)第1卷，Roland Kontermann與Stefan Dübel編，組合引子的序列來自第323頁)用PCR擴增50G12的輕鏈可變區和重鏈可變區基因，然後將PCR產物選殖入pMD18-T載體，定序並分析可變區基因序列。鼠源抗體50G12可變區序列資訊如下：重鏈可變區基因序列全長357bp，編碼119個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；輕鏈可變區基因序列全長321bp，編碼107個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
步驟2：鼠源抗人CD38單株抗體的人源化
通對鼠源抗體50G12抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列進行分析，依據Kabat規則分別確定鼠源抗體50G12單抗重鏈和輕鏈的抗原互補决定區(CDR)和框架區(FR)。鼠源抗體50G12抗體重鏈CDR的胺基酸序列爲H-CDR1：SEQ ID NO：1、H-CDR2：SEQ ID NO：2和H-CDR3：SEQ ID NO：3，輕鏈CDR的胺基酸序列爲L-CDR1：SEQ ID NO：4、L-CDR2：SEQ ID NO：5和L-CDR3：SEQ ID NO：6。
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，將鼠源50G12單抗的重鏈可變區與人IgG生殖系序列進行同源性比較，選擇IGHV1-46*01爲重鏈CDR移植模板，將鼠源抗體50G12的重鏈CDR移植入IGHV1-46*01框架區，並在H-CDR3之後加入WGQGTLVTVSS作爲第四個框架區，獲得CDR移植重鏈可變區序列。同樣地，將鼠源抗體50G12的輕鏈可變區與人IgG生殖系序列同源性比較，選擇IGKV1-39*01爲輕鏈CDR移植模板，將鼠源抗體50G12的輕鏈CDR移植入IGKV1-39*01的框架區，並在L-CDR3之後加入FGQGTKVEIK作爲第四個框架區，獲得CDR移植輕鏈可變區序列。在CDR移植可變區的基礎上，對一些框架區的胺基酸位址進行回復突變。回復突變就是將CDR移植可變區的框架區內的某些胺基酸(對維持抗體結構和親和力比較重要的胺基酸)突變成鼠源框架區對應位置上的胺基酸。
在進行突變時，將胺基酸序列進行Kabat編碼，位址的位置由Kabat碼指示。優選的，對於CDR移植重鏈可變區，根據Kabat編碼，將第30位的T突變爲N，將第69位的M突變爲L，將第71位的R突變爲A，將第73位的T突變爲K。對於CDR移植輕鏈可變區，將第47位的L突變爲W，將第48位的I突變爲M，將第71位的F突變爲Y。上述帶有突變位址的重鏈可變區和輕鏈可變區分別定義爲人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別命名爲50G12-Hu-VH和50G12-Hu-VL，50G12-Hu-VH的胺基酸序列爲SEQ ID NO：9，50G12-Hu-VL的胺基酸序列爲SEQ ID NO：10。
由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述人源化的重鏈和輕鏈可變區的DNA。將合成的人源化重鏈可變區DNA與人IgG1重鏈恆定區DNA相連，獲得全長的人源化重鏈DNA，命名爲50G12-Hu-HC，人源化重鏈可變區DNA序列如SEQ ID NO：15所示，全長的人源化重鏈DNA序列如SEQ ID NO：17所示；將人源化輕鏈可變區DNA與人Kappa鏈恆定區DNA相連，獲得全長的人源化輕鏈DNA，命名爲50G12-Hu-LC，人源化輕鏈可變區DNA序列如SEQ ID NO：16所示，全長的人源化輕鏈DNA序列如SEQ ID NO：18所示。將50G12-Hu-HC和50G12-Hu-LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，利用上述實施例中描述的方法表現並純化抗體，其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示，所得抗體命名爲50G12-Humanized。
另外，將鼠源抗體50G12重鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區相連，獲得嵌合重鏈基因，命名爲50G12-Chi-HC；將鼠源50G12輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區相連，獲得嵌合輕鏈基因，命名爲50G12-Chi-LC。將50G12-Chi-HC和50G12-Chi-LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，利用上述實施例中描述的方法表現並純化抗體，所得抗體命名爲50G12-Chimeric。實施例 8 50G12-Humanized 對 CD38 的結合能力
用流式細胞法檢測50G12-Chimeric和50G12-Humanized對Daudi細胞表面CD38的結合能力。具體方法如下：
計數Daudi細胞後，用含有1% BSA的PBS溶液接種至96孔圓底培養盤中，每孔2×105
個細胞；在上述96孔盤中加入50μl用PBS溶液梯度稀釋的抗CD38抗體；置於室溫培育1小時，然後離心棄上清液，再用PBS洗滌細胞兩遍；加入用FITC標記的羊抗人(Fc-Speicific)抗體(用含1% BSA的PBS以1:1000稀釋)，室溫培育半小時；離心並洗滌細胞後在流式細胞儀上檢測FITC通道的平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity，MFI)；用流式細胞儀內建軟體處理實驗數據並計算平均螢光強度；用GraphPad Prism6進行數據分析和作圖，計算EC50
。
結果如圖5所示，50G12-Chimeric、50G12-Humanized、Daratumumab和Isatuximab均能有效結合Daudi細胞，它們的EC50
分別是0.5285nM、0.6047nM、0.4596nM和0.3234nM。上述結果顯示50G12-Humanized結合Daudi細胞的能力基本相當。其中同種型對照(Isotype Control)爲不結合Daudi細胞的人IgG1抗體。實施例 9 50G12-Humanized 抑制 CD38 環化酶活性
用螢光法測定了50G12-Humanized對CD38環化酶活性的抑制作用。具體方法如下：
配製PH6.5的50mM MES緩衝液，用MES緩衝液配製200 µM的菸鹼醯胺鳥嘌呤二核苷酸(NGD)溶液；用MES緩衝液將CD38-His稀釋到2 μg/ml，然後再加入終濃度爲10μg/ml的抗CD38抗體；在F16黑色Maxisorp培養盤(F16 Black Maxisorp Plate)中加入50µL NGD溶液，然後再加入50µL含有CD38-His和抗CD38抗體的溶液；用多功能酵素標示讀取儀SpectraMax M5在動態模式(kinetic mode)下讀取螢光值(Relative Fluorescence Unit，RFU)，激發和發射波長分別設定在300 nm和410 nm；用GraphPad Prism6進行數據分析和作圖。
結果如圖6所示，50G12-Humanized、Daratumumab和Isatuximab均能有效抑制CD38-His的酵素活性，它們的斜率分別爲155931、331046和93316，斜率越小說明抑制作用越強，所以三者抑制CD38環化酶活性由強到弱的順序爲Isatuximab、50G12-Humanized和Daratumumab。實施例 10 50G12-Humanized ADCC 活性測定
抗體的Fab段結合細胞表面的抗原表位，其Fc段與效應細胞(NK細胞、巨噬細胞等)表面的Fc受體結合，能夠媒介效應細胞直接毒殺標的細胞，這就是ADCC作用。在此測定了抗CD38抗體的ADCC活性。具體方法如下：
在無酚紅RPMI-1640中加入2%的胎牛血清；用該培養基將標的細胞Daudi細胞和人周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)按照1:25的比例混勻，接種到圓底96孔盤中，每孔150 µL，最終使每孔含有2×104
個Daudi細胞和5×105
個PBMC；加入50 µL梯度稀釋的抗CD38抗體；置於37°C、5% CO2
細胞培養箱中培育過夜；取50 µL細胞培養上清液，加入50µL CytoTox 96非-放射性細胞毒性試驗(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)反應液，30min後加入終止液終止反應，酵素標示讀取儀讀OD490；用GraphPad Prism6進行數據分析和作圖，計算EC50
。
結果如圖7所示，50G12-Humanized、Daratumumab和Isatuximab均能有效毒殺標的細胞，它們的EC50
分別爲0.1058 nM、0.08876 nM和0.0694 nM，三者的ADCC活性基本相當。實施例 11 50G12-Humanized CDC 活性測定
在Daudi、DND-41細胞模型測定人源化抗體50G12-Humanized CDC活性。詳細實驗方法如下：以細胞培養基作爲緩衝液將抗人CD38單抗稀釋至起始濃度20 μg/ml，然後以3倍濃度梯度進行稀釋，共獲得8個濃度的稀釋液。將表現CD38的標的細胞(Daudi細胞等)計數後重新懸浮至3*105
個細胞/ml。將100 μl抗人CD38單抗的各種濃度稀釋液和80 μl高度表現CD38的標的細胞預先培育15 min，然後加入20 μl 50%的新鮮人血清(志願者捐贈)混勻。陽性對照孔爲單獨標的細胞加血清、陰性對照孔爲無細胞的培養基。培養箱中培育12-18h，加入20 μl CCK-8，4h後使用酵素標示讀取儀在450 nm處測定吸光值，根據450 nm處的讀數計算毒殺率。毒殺率計算公式爲：
毒殺率(killing%)＝(陽性對照吸光值-實驗組吸光值)/(陽性對照吸光值- 陰性對照吸光值)*100。
實驗結果如圖8A、8B所示，在Daudi細胞模型上，人源化抗體50G12-Humanized CDC活性與Daratumumab和Isatuximab相當；在DND-41細胞模型上，人源化抗體50G12-Humanized CDC活性優於Daratumumab和Isatuximab。實施例 12 50G12-Humanized 誘導細胞凋亡的能力
抗CD38抗體與細胞膜表面對應抗原結合後能夠誘導細胞凋亡(Deckert J, Wetzel M, Bartle L M, et al. SAR650984, A Novel Humanized CD38-Targeting Antibody, Demonstrates Potent Antitumor Activity in Models of Multiple Myeloma and Other CD38+ Hematologic Malignancies[J]. Clinical Cancer Research, 2014, 20(17): 4574-4583.)。在凋亡細胞中，膜磷脂磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine，PS)從細胞膜內側轉移到外側，從而使PS暴露於外部細胞環境。Annexin V是一種35-36 kDa鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，對PS具有高親和力，能與暴露的PS結合。在此用FITC標記的Annexin V凋亡檢測套組測定了抗CD38抗體誘導細胞凋亡的活性。具體方法如下：
在RPMI-1640中加入2%的胎牛血清；用該培養基將Daudi細胞接種到96孔盤中，每孔1×105
個細胞/150 µL；加入50 µL梯度稀釋的抗CD38抗體；置於37°C、5% CO2
細胞培養箱中培育24h；用FITC標記的Annexin V凋亡檢測套組對凋亡細胞進行染色；離心並洗滌細胞後在流式細胞儀上檢測FITC通道的平均螢光強度；用流式細胞儀內建軟體處理實驗數據並計算染色細胞占總細胞的比例；用GraphPad Prism6進行數據分析和作圖，計算EC50
。
結果如圖9所示，50G12-Humanized、Daratumumab和Isatuximab均能有效誘導細胞凋亡，它們的EC50
分別爲0.5675 nM、0.3059 nM和0.302 nM。儘管三者的EC50
基本相當，但是50G12-Humanized、Daratumumab和Isatuximab最高能夠誘導發生凋亡的細胞比例分別爲28.4%、13.4%和49.0%。因此，所以三者誘導細胞凋亡的能力由強到弱的順序爲Isatuximab、50G12-Humanized和Daratumumab。實施例 13 50G12-Humanized 體內藥效評價
在人Ramos淋巴瘤細胞株CB-17 SCID小鼠移植瘤模型上驗證抗CD38人源化抗體50G12-Humanized的體內抗腫瘤活性。具體方法如下：
體外培養Ramos細胞，收穫後調整細胞濃度至5×107
個/ml，透過尾靜脈注射的方法，接種200 µl/隻細胞懸浮液到雌性CB-17 SCID小鼠體內，建立移植瘤模型。接種後第7天，將小鼠隨機分爲對照組，Daratumumab治療組，Isatuximab治療組和50G12-Humanized治療組，每組10隻小鼠。按照抗體40 mg/kg的劑量開始給藥治療，每周給藥兩次，連續給藥三周。觀察荷瘤小鼠的生存時間。以荷瘤小鼠的單側後肢或雙側後肢癱瘓，或體重下降超過20%，或嚴重身體狀况差導致不能自由採食和飲水爲動物人道主義終點，安樂死受試動物，記錄生存時間。
結果如圖10顯示，對照組的中位生存時間爲25天，與對照組相比，50G12-Humanized和陽性對照抗體Daratumumab，Isatuximab均能夠顯著延長受試動物的生存時間，中位生存時間分別爲38天，35.5天和38.5天。
圖1：鼠源抗體對標的抗原人CD38-Fc的結合活性
圖2：鼠源抗體阻斷CD38環化酶活性
圖3A：鼠源抗體對重組高度表現細胞株CHOS-CD38細胞的結合活性
圖3B：鼠源抗體對腫瘤細胞株DND-41細胞的結合活性
圖4A：鼠源抗體在CHOS-CD38細胞上的CDC活性
圖4B：鼠源抗體在Raji細胞上的CDC活性
圖4C：鼠源抗體在DND-41細胞上的CDC活性
圖4D：鼠源抗體在Ramos細胞上的CDC活性
圖4E：鼠源抗體在Daudi細胞上的CDC活性
圖5：人源化抗體50G12-Humanized對Daudi細胞的結合活性
圖6：人源化抗體50G12-Humanized抑制人CD38環化酶活性
圖7：人源化抗體50G12-Humanized的ADCC活性
圖8A：人源化抗體50G12-Humanized在Daudi細胞上的CDC活性
圖8B：人源化抗體50G12-Humanized在DND-41細胞上的CDC活性
圖9：人源化抗體50G12-Humanized誘導細胞凋亡的能力
圖10：人源化抗體50G12-Humanized在Ramos淋巴瘤動物模型上的抗腫瘤活性
Claims (22)
- 一種結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，包括：(a)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3，所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，和(b)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
- 如請求項1所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
- 如請求項1所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段。
- 如請求項1所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
- 如請求項1所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
- 如請求項1所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
- 一種核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼如請求項1-6中任一項所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項7所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
- 如請求項7所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
- 如請求項7所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
- 一種表現載體，其特徵在於，所述表現載體含有如請求項7-10中任一項所述的核苷酸分子。
- 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞含有如請求項11所述的表現載體。
- 一種製備如請求項1-6中任一項所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟：a)在表現條件下，培養如請求項12所述的宿主細胞，從而表現所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段；b)分離並純化a)所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段。
- 一種組成物，其特徵在於，所述組成物含有如請求項1-6中任一項所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載劑。
- 一種如請求項1-6中任一項所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段或如請求項14所述的組成物在製備治療多發性骨髓瘤、白血病、B淋巴細胞瘤、自體免疫性疾病藥物中的應用。
- 如請求項15所述的應用，所述自體免疫性疾病選自系統性紅斑狼瘡、自體免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫癜和重症肌無力。
- 一種CAR建構物，其特徵在於，所述CAR建構物的單株抗體抗原結合區的scFv段為特異性結合於CD38的結合區，並且，所述scFv的重鏈可變區包括：重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3，所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，和所述scFv的輕鏈可變區包括：輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
- 一種重組的免疫細胞，其特徵在於，所述的免疫細胞表現外源的如請求項17所述的CAR建構物。
- 一種抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述的抗體藥物偶聯物含有：(a)抗體部分，所述抗體部分包含如請求項1-6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段；和(b)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酶、或其組合。
- 一種體外檢測樣品中CD38蛋白的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟： (1)在體外，將所述樣品與如請求項1-6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如請求項19所述的抗體藥物偶聯物接觸；(2)檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD38蛋白。
- 一種如請求項1-6中任一項所述的結合人CD38的抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的組成物、如請求項19所述的抗體-藥物偶聯物、或如請求項18所述重組的免疫細胞、或其組合在製備預防和/或治療CD38相關疾病藥物中的應用。
- 如請求項21所述的應用，其特徵在於，所述CD38相關疾病選自多發性骨髓瘤、白血病、B淋巴細胞瘤、自體免疫性疾病、或其組合。
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