TW201326387A

TW201326387A - 細胞培養之預程式化無回饋控制之連續進料

Info

Publication number: TW201326387A
Application number: TW101133866A
Authority: TW
Inventors: Henry Lin; Jeremy Bezaire
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2013-07-01
Also published as: TWI583788B; EP2756069B1; JP2022058710A; BR112014008303A2; ES2862576T3; JP2020022492A; IL231032A0; CA2846905A1; CN103946366A; KR101710766B1; US9803166B2; KR20140044396A; ZA201401655B; JP2014526265A; MX2014003134A; JP2017029162A; CN103946366B; US20140295545A1; SG11201400656SA; MX356956B

Abstract

本發明提供一種預程式化無回饋連續進料方法，其係基於用於細胞培養生長及維持之生物反應器中之基質之質量平衡。所揭示方法不依賴儀器、探針或操作人員回饋。本發明對團式進料提供有效率且有效的替代方案。

Description

細胞培養之預程式化無回饋控制之連續進料

本發明係關於進料細胞培養之方法，該方法連續及提供增強之細胞生長及蛋白質表現但不依賴於回饋控制來適應不斷變化之細胞培養要求。

本申請案主張2011年9月16日申請之美國臨時申請案第61/535,809號之權利，該案係以引用其全文之方式併入本文。

哺乳動物細胞培養已廣泛用於醫藥及生物技術工業中以製造重組治療性蛋白質。改良細胞培養產率之需求在最近十年因蛋白質治療市場之不斷增長及對改良生產效率及降低製造商品之費用的不斷努力而驚人地增大。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞常用於製造治療性蛋白質，如單株抗體、抗原及其他特異化蛋白質模態。

利用哺乳動物細胞製造蛋白質一般涉及進料分批方法，其係在製造全程將營養補充物進料至細胞以支持細胞生長、代謝及合成所需蛋白質產物之方法。關於細胞進料分批進料方法之現有工業標準係團式進料。於團式進料方法中，將營養物以間歇離散添加之方式在細胞培養製造全程中之各個時間點提供至細胞。團式進料方法在其實現上過於簡單，係因其受手工進料操作之可行性約束，此係其通常被採用之一原因。

團式進料具有數個優點，然而，最大缺點係無法提供細胞實際需要之準確營養物量。換言之，團式進料不針對細胞培養之具體需求而定製且因此某些營養物係以比細胞培養所需還高的量提供，而其他營養物則以比細胞所需之量還低的水平提供。因此，雖然方法上極為簡單，但團式進料方法可導致過量進料，因此導致溢流代謝，進而導致對細胞生長或生物合成無支持作用且實際上可抑制細胞生長的副產物廢料(如乳酸)積累。

團式進料方法在製造方案中之另一缺點係團式進料方法具有固有可變性源，其等可導致細胞培養性能差異。此類源中之一者係在所需進料日中實施進料操作之時間可變性。與團式進料相關之另一可變性源係將營養物流投與至生物反應器中之速率。分開或一起地，實施進料之時間及細胞進料之速率之變化可影響每批指定細胞培養之特性及生產。與團式進料相關之另一缺點係其一般係手工操作，此需要由操作人員實施。缺少自動化可消耗人力及財力資源且意味著另一可變性源，即由於不同操作人員缺乏一致性而引入至製造過程中之微小差異，或操作人員係同一人，但操作人員引入之變化不可控制。

團式進料之缺點可透過使用連續進料方法克服。連續進料方法可經設計以藉由將較少量營養物隨時間連續進料至培養而更為滿足細胞需求，而不是大量單次團式添加。如此一來，可控制營養物濃度並維持在對細胞生長來說最優之水平，藉此防止過量進料、將不必要產物廢料之產生減至最小及維持不中斷之擬穩定狀態水平。採取連續進料操作亦可消除與團式進料操作相關之進料時間及速率之可變性，係因此等變量係於連續進料方法中受到自動控制。亦可透過使用連續進料方案排除操作人員干預。

雖然其他人已展示此方法之不同形式，然而此類方法仍會引入操作人員失誤之可能性。例如，Hu及Europa(美國專利案第6,156,570號)展示改良生產率之連續進料策略。然而，此用於哺乳動物細胞培養之連續進料方案依賴於設備回饋控制，此可將可變性引入至進料方法中。

總言之，所有此等方法之共通缺點係其等均依賴於一些類別的儀器獲得之回饋來管理製程。因此，需要一種進料細胞培養之方法，其可針對指定細胞培養之特殊要求定製，可自動進行且不依賴於儀器介導之回饋來控制遞送至細胞培養之營養物。

本發明提供一種不採用回饋控制之連續進料哺乳動物細胞培養之方法。於一實施例中，該方法包含(a)提供包含哺乳動物細胞培養之容器，細胞培養包含哺乳動物細胞及培養基；(b)確定營養物消耗速率(K₁)、細胞培養之生長速率(K₂₁)及生長速率(K₂₂)之較佳值；(c)提供適用於將連續進料流提供至細胞培養之裝置，其中該裝置包含適用於在流動速率F下連續進料培養之控制器模組，其中F係定義為K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；t係將進料流添加至生物反應器的時間至終止進料流的時間之持續時間；及K₁、K₂₁及K₂₂係於(a)中所確定之值；及(d)啟動控制器模組以開始細胞培養之連續進料。於一實施例中，K₁、K₂₁及K₂₂係依據經驗確定。於另一實施例中，K₁、K₂₁及K₂₂係經模型化。於另一實施例中，控制器模組包含電腦。於另一實施例中，進料流包含多種營養物。於另一實施例中，細胞培養之滲透壓在整個方法中維持恒定。於另一實施例中，進料至培養之營養物係葡萄糖。於其他實施例中，哺乳動物細胞培養係CHO細胞培養。於另一實施例中，控制器模組係對細胞培養中之預選擇乳酸濃度起反應而啟動，而於另一實施例中，控制器模組係對細胞培養中之預選擇葡萄糖濃度起反應而啟動。於另一實施例中，控制器模組係對胺基酸(如天冬醯胺或榖胺醯胺)之預選擇濃度起反應而啟動。於另一實施例中，進料流包含兩種或更多種營養物。

除非在本文中另外定義，否則與本申請案有關之科學及技術術語應具有為一般技術者所共知的含義。進一步，除非文中另外要求，否則單數形術語應包括複數及複數術語應包括單數。

一般而言，與本文中所描述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因及蛋白質及核酸化學及雜交有關之命名及其等技術係本技藝熟知及常用之彼等內容。除非另外說明，否則本申請案之方法及技術基本上係依照本技藝熟知及如本說明書全文所引述及討論之各基本及更具體參考文獻所描述之習知方法進行。參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)及後續版本；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)及Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)，其等係以引用之方式併入本文。酶反應及純化技術係依照生產商說明書進行，如本技藝通常實施般或如本文中所描述般。與本文所描述之分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學有關之術語及實驗室製程及技術係為本技藝熟知及常用者。可將標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送及治療病患。

應理解，本發明不限制於本文中所描述之特定方法、方案及試劑等且因此可變化。本文中所使用之術語係僅針對描述特定實施例之目的，且不意欲限制本發明之範圍。

在操作實例，或另外說明處以外，表示本文中所使用之表示成分量或反應條件之所有數字在所有情況中應視為藉由術語「約」修飾。當與百分比連用時，術語「約」可意指±5%，例如1%、2%，3%或4%。

為了滿足不依賴於儀器回饋以控制製程之連續進料方法的要求，提供此進料方法。於一態樣中，所揭示之方法係基於細胞生長及細胞培養之基質消耗模型。所揭示之方法提供具有三個表示比基質消耗速率及比生長速率之參數之進料速率函數；所有三個參數可針對指定培養最優化，且可針對所有CHO細胞株最優化。將最優化函數用於控制細胞培養進料之連續進料算法中以擬合所需特性。此進料策略可預程式化及在整個蛋白質生產製程期間呈非回饋控制。因此，無需來自儀器或其他測量形式之輸入以控制或調節進料。其可應用於所有營養物進料類型，如葡萄糖進料及混合物進料。如本文中所證實，所揭示之連續進料方法可改良細胞存活率、細胞密度及指定細胞培養之生產率。進料速率函數亦可經微調以達成有限碳進料及進而降低副產物廢料，如乳酸及氨。所揭示之連續進料方法在許多方面優於團式進料，包括增強細胞培養性能、較佳運行一致性、消除進料操作可變性及消除對手工進料操作之需求。此連續進料策略係對習知團式進料之改良及有價值替代方案，且降低或消除與常用習知團式進料方法有關的可變性。

於一態樣中，本發明提供連續進料細胞培養(如表現所需分子之培養)之方法。於一實施例中，該方法提供進料函數，其支配提供至正在生長之細胞培養之營養物之速率及體積。進料函數可如本文中所顯示般獲得；於該進料函數中出現之個別變量可均係針對指定培養測得。

廣義而言，關於指定培養之進料函數之建立將描述生長參數之三個參數(K₁、K₂₁及K₂₂)合併，確定此等參數以匹配及滿足指定細胞培養之生長需求及基質消耗特性。於進料函數中之另一變量係進料持續時間(t)，其決定待進料之體積之總量及亦可經確定以匹配及滿足細胞培養之生長需求及基質消耗特性。藉由確定此等參數，將其等合併至進料函數中及將進料函數與合適硬體關聯，將達成完全可自動化連續進料方法，該方法相較於團式進料增進性能。

所揭示之方法可應用於製造任一種蛋白質型分子(如任何長度之蛋白質(例如，治療性蛋白質)、抗體、肽體、半抗體、包含一或多個非自然存在或編碼胺基酸之分子(如抗體或治療性蛋白)、肽、Fc融合蛋白、SCFv、單鏈抗體等)。

所揭示之方法亦可在所需之任何規模下採用，自實驗室規模(例如，~1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或50升培養)至小規模製造(例如，~100、200、300、400、500、1000、1500或2000升培養)。於特別合適形式中，所揭示之方法可以工業規模應用(例如，~5000、7500、10000或15,000升)。所揭示之方法之優點，包括節省費用，在工業規模下最為顯著，但不論應用該等方法之生產規模如何均明顯。

可將支持細胞生長之任何培養基用於細胞培養及本發明之方法中。於一實施例中，該培養基可包含血清，而於另一實施例中，該培養基可係無血清。於各實施例中，培養基可補充有一或多種胺基酸。於一實施例中，培養基係化學限定式培養基。

定義

依照慣例，除非另外具體說明，否則如本文中所使用之「一」意指「一或多」。

術語「多肽」或「蛋白質」於本文中可交換使用以指謂包含胺基酸殘基之聚合物。該等術語亦適用於其中一或多個胺基酸殘基係對應天然存在胺基酸之類似物或擬似物之胺基酸聚合物，及天然存在胺基酸聚合物。該等術語亦可涵蓋已經改質(例如，透過添加碳水化合物殘基以形成糖蛋白)或經磷酸化之胺基酸聚合物。多肽及蛋白質可藉由天然存在或非重組細胞產生，或多肽及蛋白質可藉由基因工程化或重組細胞產生。多肽及蛋白質可包含具有原始蛋白質之胺基酸序列之分子，或在具有原始序列之一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代(包括以非天然存在胺基酸取代)之分子。

進料函數之推導

所提供之非回饋控制連續進料方法之組成係進料函數，其針對所關注的哺乳動物細胞培養(例如，CHO、NS0、BHK21、PER.C6或HEK 293細胞培養)之獨有生長要求及性質進行定製，例如，為(例如)表現所關注的蛋白質之目的而生長之培養。進料函數合併培養之營養需求特性，目的係促進生長、生物合成及減少副產物形成。於一態樣中，進料函數可視為在細胞培養生長特性過程中的任何時間點之時，培養之最優營養需求之表現。藉由將培養之營養需求表現作為時間之函數(即，進料函數)，消除對任何回饋控制之需求，係因此等儀器將提供之數據已知曉且合併至進料函數中。進料函數亦容許細胞培養生長之完全自動化操作；將控制營養物流之進料方程式輸入含有細胞培養之生物反應器及提供啟動信號後，整個細胞生長過程將藉由該進料函數控制及不需要額外干預。

該進料函數考量多個變量，包括基質之入口流動速率(F)、生物反應器中之起始營養物濃度(S_i)、營養物原料濃度(S_O)、最大細胞密度對營養物產率()、比生長速率(μ)、細胞密度(X)，及生物反應器之體積(V)。所有此等變量可藉由測量及計算特定培養之各參數而輕易確定。基質之入口流動速率(F)係將基質投與至生物反應器之進料速率。起始生物反應器營養物濃度(S_i)係在連續進料即將啟動時基質之濃度。此參數可利用離線營養物分析儀使用培養基樣品測得。營養物原料濃度(S_O)係在遞送出連續進料之液體儲集器中之基質之濃度。最大細胞密度對營養物產率()係總細胞密度峰值點除以在彼點時所消耗之總基質。細胞密度(X)係藉由細胞計數器測得之在培養中之存活細胞密度。將比生長速率(μ)描述為指定時間點之細胞生長速率除以在彼時間點之存活細胞密度。μ可利用關係式：計算，其中X₂及X₁各別係最終及初始存活細胞密度，及t₂及t₁各別係最終及初始時間。生物反應器之體積(V)係由在任何指定時間於生物反應器中之總培養體積組成。於一實施例中，進料函數之形式呈F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)且係如下顯示般推導。

於生物反應器中指定營養物之質量平衡係藉由方程式 (1)描述，其中F係該營養物之入口流動速率，Si係於生物反應器中之初始營養物濃度，S_O係營養物原料濃度，係最大細胞密度對營養物產率，μ係比生長速率，X係細胞密度，V係生物反應器之體積。

假定穩態營養物濃度與連續進料組合，該方程式簡化為方程式(2)，

其中比營養物消耗及細胞生長描述為XV=X_iV_ie^ut。X_i及V_i各別係進料開始時之初始細胞密度及生物反應器體積。方程式(2)簡化為以下方程式(3)，其中

K ₂=μ (5)

然而，由於細胞將進入穩定期及隨後快速進入死亡期，方程式(3)無法應用於指數期以外之細胞培養生長。因此，需要在細胞處於死亡期之後關於不斷下降進料之函數。於建立所揭示之方法時所進行之實驗中，觀察到當在整個生產時期描繪比生長速率(μ)時，該比生長速率μ就CHO細胞而言隨時間下降。發現此對於所研究之多種細胞株各者而言係一致的。關於時間對μ之線性傾向擬合展示良好擬合，及因此μ可藉由以下線性方程式表示K ₂=K ₂₁ t+K ₂₂ (6)其中K₂₁總是負，K₂₂總是正，及| K₂₂ |>>| K₂₁ |。將方程式(6)代入方程式(3)，獲得進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t) (7)

方程式(7)形成所有連續進料設計及實驗之基礎。方程式(7)提供對進料特性之曲率，因此該傾向並非僅指數上升。由於項K₂₁總是負，隨著時間增加，整個項K₂₁t²+K₂₂t可變為負且進料傾向隨後將下降。隨著值變大，K₁放大整個進料傾向之程度。

於方程式(4)中，就K₁而言，假定q_s在整個生產中係恒定值。q_s係(如)葡萄糖之比基質消耗速率。其係藉由將比生長速率(μ)除以最大細胞密度對基質產率()計得。此等項係於上文描述。針對多種細胞株研究關於葡萄糖之常數q_s及觀察到在細胞達到峰細胞密度之後，例如在第7天後，q_s維持恒定之假定證明為基本上正確。因此，假定q_s維持恒定簡化了進料函數，及若已獲得用於最優化之三個K變量，則此假定不會明顯影響進料函數。

雖然q_s維持恒定之假定合理且確實簡化進料函數之推導，然而此假定亦消除在某些情況中可促進更準確進料函數之變量。因此，可設想可產生關於q_s之更準確擬合。隨後可將q_s之更準確擬合值替代方程式(7)中之K₁以推導出具有甚至更高自由度之進料函數。藉由加入此等額外自由度，可達成甚至更高解析的進料函數。此等更準確擬合之進料函數形成所揭示方法之一態樣。

體積方程式之推導

如本文中所顯示，提供適用於指定細胞培養之獨特需求之進料函數。該進料函數描述細胞培養之營養物需求，但其未明確提供描述將添加至指定培養之濃縮營養物原料之總體積之項。此量可如下文所述般自進料函數本身推導。

由進料函數計算濃縮營養物原料之進料總體積之能力係於製程開發應用中使用所揭示方法之考量因素。了解包含特定營養物(例如，將進料至細胞培養之由進料函數所描述之營養物)之溶液之液體體積有利於所需進料體積之設計、自擬合體積數據產生K值之能力及追蹤控制器之體積使用之能力。因此，藉由進料函數計算進料體積對於連續進料應用係有價值的參數。體積方程式係如方程式(8)中所顯示般藉由積分進料函數推導。

其中

為達準確，將邁克勞林級數用於近似獲得積分中之指數項以產生使用該級數之前五個積分項之體積方程式。

其中x=K ₂₁ t ²+K ₂₂ t (11)

最終體積方程式顯示於方程式(12)中，及使用級數之所有該五個項。

自動化連續進料方法

於許多蛋白質生產製程中，需操作人員監視與生物反應器關聯之回饋儀器，該等儀器獲得關於指定細胞培養之局部環境、健康、細胞密度及蛋白質產生之數據。此數據回饋至操作人員，其隨後根據數據調節生長條件以維持生物反應器中之較佳條件設定。

所揭示之方法之一優點係以完全自動化方式運行該方法之能力，進而消除對專門操作人員及對獲得關於細胞培養之數據之專門儀器之需求。此轉變為增強之效率、人力及物力資源之費用節省及使操作人員偏差或誤差機率減至最小之能力且完全消除與回饋儀器(例如，用於胺基酸、維生素及碳源之HPLC；葡萄糖及乳酸分析儀(Nova Profiler and YSI Instruments)；細胞計數器(Cedex and Vi-Cell)；生物反應器原位探針(例如，pH、溶氧、渾濁度、電容及NIR探針)、滲透壓計及其他儀器)之失效有關的生產問題。

通常，將細胞培養生長作為漸進式經驗作業處理，由操作人員連續監視及對應自回饋儀器獲得之關於培養狀態之數據調節提供至生長中之培養之進料原料含量及體積。當實施所揭示之方法時，便無需如此，係因該方法係針對特定細胞培養定製及關於指定細胞培養之許多獨有特性及需求均在所揭示之方法中加以考量。

所揭示之方法亦可提供所關注之蛋白質之增強生產。由於該方法包含已針對特定細胞培養最優化之進料函數，該培養係於使細胞培養之健康及生產率，及進而細胞蛋白質生產最大化之條件下連續生長。因此，另一優點係該方法藉由提供針對指定細胞培養之最大化蛋白質生產而賦予費用及資源節省。

於一實施例中，該方法係依如下進行：起始時，提供含有細胞培養之容器，該細胞培養包含細胞及培養基。如上所述，所揭示之方法可以任何所需規模進行，故所提供之容器因此亦可呈任何規模且應潔淨及無菌。例如，當以小規模作業時，容器可包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或50升生物反應器；當以較大規模作業時，容器可包括100、200、300、400、500、1000、1500或2000升生物反應器，或當以工業規模作業時，該容器可包括5000、7500、10,000或15,000升生物反應器。用於該方法中之任何容器亦可包括可棄式容器，如適用作生物反應器之可撓性塑膠結構(例如，無菌塑膠袋)或剛性可棄式塑膠燒瓶或罐。

所提供之容器係經滅菌，裝以合適培養基及導入包含細胞之細胞培養。然而，細胞可不必適用於表現所關注之蛋白質；換言之，該方法可於任何細胞培養上進行，包括不適用於表現所關注之特定蛋白質之細胞培養，或針對與蛋白質生產無關之目的測試或研究之培養。細胞可包括哺乳動物細胞，如CHO細胞，且可經工程化以表現所關注之蛋白質，然而該方法亦可經實施以使內源性蛋白質之生產最優化。於各實施例中，細胞可為任何真核細胞，如任何哺乳動物細胞；於特定實例中，細胞係CHO、NS0、BHK21、PER.C6或HEK 293細胞。該等細胞可表現異種蛋白質，如含Fc分子，包括抗體或Fc融合蛋白。當表現抗體時，該抗體可自任何物種產生，包括小鼠及人類，且可為人類抗體或人化抗體。

所導入之細胞培養可包含任何數量細胞。於某些應用中，該方法可用於增強直接自冷凍培養基取得之細胞之生長，而於其他應用中，細胞可經擴增至所需量，然後導入至容器中。

細胞生長之培養基可具有任何組成且較佳適用於支持所提供之任何細胞培養之生長。可用於該方法中之培養基之實例包括MEM、DMEM及補充有血清之F12或完全化學限定式培養基(如MCDB 302)。關於可採用之其他示例性培養基配方，參見，例如，Freshney，Culture of Animal Cells,5^th Edition,Wiley-Liss(2005)。該方法亦可應用於使用蛋白腖及酵母提取物之複合培養基。

該方法接著確定細胞培養之基質消耗速率(K₁)、生長速率(K₂₁)及生長速率(K₂₂)之較佳值。為了使用進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)，參數K₁、K₂₁及K₂₂可在起始時藉由使用理論計算來確定。換言之，此等值可基於已知細胞性質(如比生長速率、最大細胞密度對基質產率，及比基質消耗速率)之外推確定。可首先確定此等性質，然後對所關注或自相關文獻之回顧而知曉之細胞株進行細胞培養實驗。此等值可用作此等參數之進一步經驗發展之起始點以使性能最優化。

於某些情況中，理論計得之K值可合理地預測且可直接合併至進料函數中。於其他情況中，宜利用一或多個測試培養及自其衍生之關於生長時間、培養基組分、營養物需求、進料啟動時間等之經驗數據改進理論計得之K值以使計算值最優化。

為了計算K₂₁及K₂₂之初始理論值，利用測試培養或選用自事先知曉之生長速率來確定所關注之指定細胞培養之比生長速率(μ)及在生產時間過程內繪圖。隨後進行該圖之線性回歸擬合以產生線性方程式μ=K₂₁t+K₂₂，其中K₂₁係藉由斜率值表示及K₂₂係藉由線性擬合之y-截距值表示。針對K₂₁及K₂₂所確定之值隨後反代入至進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)中，僅留下變量K₁及t需提供。

K₁可利用方程式(4)進行在理論上計得：

出現在K₁計算中之參數q_s係比營養物消耗速率且係基於方程式自細胞培養數據計得。假定q_s恒定，如葡萄糖之情況般。X_i及V_i各別係起始細胞密度及起始容器體積。S₀係待進料之基質(例如，葡萄糖)之原料濃度。S_i係容器中之初始營養物濃度。由於所有此等值均可取得，故K₁可輕易計得並代入至進料函數中。

確定K₁後，進料函數F之所有三個參數K₁、K₂₁及K₂₂具有已知值。進料速率在作為時間函數之生產過程中將會變化，但進料函數將考量此等波動及因此在培養需要營養物之準確時間時準確提供培養所需之營養物。隨後可將該函數輸入至控制器模組，該控制器模組可用於啟動、控制及終止進料過程。

該方法接著提供一種裝置，其適用於將連續進料流提供至細胞培養，其中該裝置包含適用於以流動速率F連續進料培養之控制器模組，其中F係定義為K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；t係自啟動進料方案，將分批進料流添加至生物反應器至進料結束之時間，及K₁、K₂₁及K₂₂係如上所述般確定之值。

確定如本文中所描述之K₁、K₂₁及K₂₂後，提供適用於將連續進料流提供至細胞培養之裝置，其中該裝置包含控制器模組，其適用於以流動速率F依照進料函數連續進料培養。此裝置可包含將液體進料流以受控制速率自儲集器轉移至生物反應器之構件，及可依據進料特性啟動並維持進料流自儲集器流動至生物反應器之控制器模組。此類裝置之實例可包含Delta V控制器模組(Emerson,St Louis,MO)、控制器控制泵(例如，如自諸如Applikon Biotechnology,Foster City,CA；Cole-Parmer,Vernon Hills,IL；Watson-Marlow,Wilmington,MA；及SciLog,Middleton,WI之供應商購置之彼等)。泵係藉由與細胞培養相容之管道(例如，如自Cole-Parmer,Vernon Hills,IL獲得之管道)連接；一端為進料液體容器及另一端為生物反應器。

於一特定實施例中，將三個K值及進料時間t輸入連續進料函數中，該函數已程式化至控制器模組中，如Delta V控制器模組(Emerson,St Louis,MO)。控制器模組控制連接至進料容器之泵(例如，Applikon生物反應器整合泵；Applikon Biotechnology,Foster City,CA)以依照進料函數F指揮將一定量進料連續遞送至生物反應器。根據培養之特定需求，遞送至生物反應器之進料流之體積及量將由於速率依進料函數F變化而變化。控制器模組控制在任何指定時間點提供至培養之進料原料之體積，如進料方程式F所描述般。

可先校準任何用於促進進料遞送之設備(例如，泵及管道)，然後使用進料方程式，利用泵輸出及測得流動速率以建立準確泵校準值。此值可供控制器使用以將進料函數F所描述流動速率轉化為泵轉移之體積之測量。如本文中所提供之實例中所描述，此遞送系統係用於2L生物反應器。就較大規模而言，如500L、2000L及15,000L，該遞送系統較佳，但不必，採用質量流動控制器或權重輸入。兩者係已建立及證實之在較大規模下進料之設備。

於該方法之下一步驟中，啟動控制器模組以引發細胞培養之連續進料。當於控制器模組上啟動程式時，進料在預定時間點開始，進料(即，營養物自儲集器流動至容器)速率在預定進料時間內依進料函數指揮而連續變化，持續藉由進料函數中之參數t所描述之時間。

控制器模組啟動培養連續進料之觸發時間點或條件係視蛋白質生產製程之屬性及目標而定。於某些情況中，以設定量之初始營養物提供至培養及在來自初始進料原料之殘餘營養物達到特定最小標的量之下一時間點時啟動連續進料。於其他情況中，不提供初始營養物至培養及在該方法啟動時才依照進料函數所要求般提供營養物。

可啟動連續進料之觸發條件之其他實例包括培養達到指定存活細胞密度(VCD)之點或培養達到指定殘餘副產物濃度之點。一旦建立此等觸發條件中之一或多者(可在啟動該方法前利用測試培養鑑定)，可將所觀察到之觸發條件轉化為啟動連續進料之時間基礎。換言之，可將初始進料原料提供至測試培養及隨著培養生長進行研究以確定在什麽時間點達到特定觸發條件及可設定控制器模組以於彼時間點啟動進料函數。

可監視之殘餘營養物之一具體實例係葡萄糖；可將初始葡萄糖濃度下降至不足以用於細胞生長之濃度時之時間點用作控制器模組啟動連續進料之觸發條件或時間點。

於另一實例中，可將存活細胞密度用作觸發條件。於一特定實例中，存活細胞密度標的為~5×10⁶細胞/ml，其對應細胞剛剛進入指數期之點。

於另一實例中，可將副產物累積濃度用作觸發條件。於一具體實例中，大於~0.5 g/L之副產物乳酸累積濃度可用作觸發條件，當符合時，其啟動連續進料以透過防止過量進料而維持低乳酸。

使進料函數最優化

如本文中所描述，可計算K₁、K₂₁及K₂₂之理論值以提供初始值，但於所揭示之方法之另一態樣中，計算值可視需要經最優化。為了使K₁、K₂₁及K₂₂值最優化，可應用「實驗設計(design of experiments)」(DOE)方法以評估三個K₁、K₂₁及K₂₂參數各者之指定範圍。該等範圍係基於在初始培養中所觀察到之性能確定，於初始培養中，將K₁、K₂₁及K₂₂之理論值用於進料函數中。於最優化方法中測試之範圍亦係由需進料之基質體積總量支配(該基質體積總量係如上所述般利用方程式12確定)。

出現在可經最優化之進料函數中之第四個參數係總進料時間(t)。當進料函數中之t達到總運行時間時，應停止進料。總運行時間係用於使待進料至培養之總基質體積與培養所需之進料持續時間平衡。例如，若需在較長時間內進料培養但使用較少總進料，則於進料函數t中可增大及K₁可降低。

於一實施例中，可將經驗方法用於計算K₁、K₂₁及K₂₂值。自經驗而非理論上獲得初始K₁、K₂₁及K₂₂之優點係經驗方法可產生更準確值，此導致當採用該方法時具有增強之性能及蛋白質生產。

於另一態樣中，為了更確定K₁、K₂₁及K₂₂，首先利用基於實際團式進料生產數據計算培養之體積基質消耗速率(g/小時)。體積基質消耗速率係藉由進行包含將用於該方法中之細胞之測試培養並利用標準細胞培養營養物分析儀(例如，Nova Profiler或諸如由YSI Instruments製造之彼等分析儀，包括型號YSI 7100、YSI 1500、YSI 5300、YSI 2300及YSI 2700分析儀單元)監視基質消耗來確定。隨後將稀釋因子應用於基質消耗速率，該稀釋因子係基於容器體積及基質原料濃度之已知性質確定，以將基質消耗速率轉化為遞送培養所需之基質之量所需之基質進料速率。隨後將計得之基質進料速率在生產時間過程內繪圖。然後將進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)用於使此圖之最佳擬合。此方法產生關於K₁、K₂₁及K₂₂之最佳擬合值。視需要，隨後可將此等值用作使用DOE方法或簡單單因子方法使性能進一步最優化之起始點。

其他最優化方法

連續進料函數可基於在細胞培養系統內之特定營養物之質量平衡推導。於此方法中，將細胞生長模型整合至此推導中以解得進料函數。於一實例中，可將線性比生長速率模型用於此推導中。此推導提供進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)。此進料函數係用於進行細胞培養中營養物(例如，葡萄糖、胺基酸等)之連續進料。於此方程式中，F係營養物流動速率，t係培養經過時間，K₁係描述基質消耗之參數，及K₂₁及K₂₂均描述培養之生長特性。

然而，此並非可產生連續進料函數之唯一途徑。於另一方法中，不使用如上所述之線性比生長速率模型，S狀模型可作為替代以描述培養之比生長速率。S狀比生長速率模型將產生與使用線性比生長速率模型所產生者不同之進料函數。此S狀推導進料函數將如線性推導進料函數般一樣運算，條件係其界定之函數已針對各細胞株最優化。

於推導進料函數之另一實例中，細胞生長曲線模型化可作為替代以產生匹配生長特性之經驗進料函數，而不是使用線性或S狀方程式形式來對特定生長速率進行模型化。此進料函數可乘以二次或更高次多項式，視擬合度而定。因此，進料函數可利用線性或S狀函數最優化以針對比生長速率模型化，或可基於對生長或營養物曲線之多項式擬合推導全新進料函數，及可基於對任何數量之因素之考量選擇使用哪一函數，包括用於開發利用之方程式之簡易性、增強操作進料特性之自由度或改良對實際細胞生長或營養物消耗特性之直接擬合之準確性的需求。

關於含有多種營養物之進料之進料函數

於一態樣中，本發明上文係關於包含單種營養物之進料函數，或包含營養物混合物但在進料函數中考量該等營養物中之僅一者之進料流。然而，所揭示之方法不限制於單種營養物，且可應用於多營養物流或包含多種營養物之進料原料。所揭示之方法可輕易適用於合併含有兩種或更多種營養物之進料函數，但當利用混合基質進料進行連續進料時，將採取不同方法。

當採用包含多種營養物之進料流時，難以計算整個混合物之具體K₁、K₂₁及K₂₂值。描述單個進料流中之多種營養物之一種方法係選擇進料中之單種基質來追蹤以產生獲得關於混合營養物進料流之初始K₁、K₂₁及K₂₂值所需之數據。例如，當使用包含葡萄糖及其他營養物之進料流時，可選擇複合進料流中之僅葡萄糖組分來監視。自流中之葡萄糖組分之代謝獲得之數據(例如，作為時間之函數之消耗速率)可用於產生K₁、K₂₁及K₂₂。一般而言，宜追蹤好利用或細胞生長、存活及生產必需之基質。

隨後針對整個進料混合物使初始K值最優化。由於進料含有各種濃度之多種基質，故較佳進行經驗測試以達成最優性能。除使多種基質之進料函數最優化外，可開發生長培養基以調節讓連續進料速率最佳擬合之營養物濃度。

實例

提供以下實例，包括所進行之實驗及所獲得之結果，僅供說明之用且不應視為限制。

材料及方法 細胞株

研究三種細胞株，細胞株1、細胞株2及細胞株3，各自編碼不同單株抗體。解凍及補充100 μg/L IGF-1(SAFC Biosciences,Lenexa,KS)及500 nM MTX(Bedford Laboratories,Beford,OH)後，讓細胞在搖瓶(Corning,NY)中以3至4天日程進行繼代。繼代條件為36℃，5% CO₂及160 rpm用於125 ml及500 ml燒瓶，及90 rpm用於3 L燒瓶，使用來自Thermo Electron Corporation,Waltham,MA之振盪台。

細胞株3細胞係以0.75e⁶細胞/ml用於接種N-1容器。N生產容器係以1.0e⁶細胞/ml接種，用於細胞株1及用於第一細胞株2實驗，測試連續進料。隨後以1.4e⁶細胞/ml接種後續細胞株2及細胞株3實驗。生產持續時間因不同細胞株而變化，如結果及討論章節中所描述。

團式進料策略因細胞株而變化。進料體積及進料天數詳細描述於以下結果及討論章節中。於第二天開始，將團式葡萄糖進料每日進料至6 g/L。

分析技術

VCD及存活率係於CEDEX儀器(Innovatis,Germany)上測量及代謝物係於NOVA BioProfile 100+(NOVA Biomedical,MA)上測量。pH及氣體係於Bioprofile pHox(NOVA Biomedical,MA)上分析及滲透壓係於滲透壓計(Advanced Instruments,Norwood,MA)上分析。

效價係藉由反相HPLC分析測量。該分析利用親和性層析，其中將A蛋白固定在管柱支撐物上。於中性pH下，單株抗體(mAb)分子係藉由Fc區結合至A蛋白，同時宿主細胞蛋白質、條件培養基組分及緩衝液自管柱以流過方式溶離。所捕獲之mAb係於酸性pH下溶離及在280 nm下藉由UV吸光度偵測。自通用mAb標準品及對應峰面積，利用線性回歸分析獲得校準曲線。隨後自該校準曲線計算測試樣品中之mAb之濃度及自通用mAb標準品及所測試之mAb計算消光係數比。

結果及討論 連續進料方法與團式進料方法之比較

將細胞株1用作第一模型細胞株以測試連續進料函數F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)及研究細胞培養性能，並與使用團式進料之細胞培養性能相比較。一個目的係要證實連續進料模型可用作分批進料細胞培養之可行替代方案。另一個目的係將進料函數用於連續進料葡萄糖及將濃度維持在所需範圍內之能力且改良手工團式葡萄糖進料。

針對細胞株1而研究之團式方法係13日生產方法。每日添加團式葡萄糖至高達6 g/L。於第5、7及9天時各以138 ml體積添加團式進料，共計414 ml進料。

為了應用進料函數，需確定K值。利用理論方法，可藉由方程式(4)，利用比葡萄糖消耗速率及開始時之初始葡萄糖、存活細胞密度及培養體積量近似取得K₁值。K₂₁及K₂₂ 值可藉由擬合比生長速率在細胞株時間過程中之線性直線近似取得，其中K₂₁係斜率及K₂₂係y-截距。

雖然確定K₁、K₂₁及K₂₂之理論方法在開始時由於其輕易及簡易性而有利，然而最終決定採取經驗方法，此方法提供更準確的K值。使用經驗方法，K值係藉由擬合進料函數F以匹配自團式進料作業所產生之實際葡萄糖消耗體積數據而確定。圖1以圖式說明進料函數體積方程式如何密切擬合經驗葡萄糖體積消耗數據曲線之一實例。就此數據組而言，擬合優度產生如下K值，K₁=0.04，K₂₁=-0.00015及K₂₂=0.0348。因此，將此組K值用作測試之一條件。類似地，亦藉由將進料函數體積方程式與其他團式作業之葡萄糖數據擬合產生不同的K值組。

選擇最優擬合葡萄糖消耗體積曲線之數個K值組用於評估。圖2顯示針對細胞株1測試之三個連續葡萄糖進料函數。各進料函數之K值描述於圖例中。進料函數中之各者產生不同流動速率特性及不同總葡萄糖添加體積。此等數據係依經驗測試以找出哪一者最適宜在整個生產期間將葡萄糖濃度一致地維持在某一範圍內。

亦組合上述連續葡萄糖進料(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)中之一者測試三種不同連續營養物混合物進料特性。一者係2.875 ml/小時之恒定連續進料速率，評估對細胞培養性能之線性體積遞送特性。另外兩連續進料利用呈指數特性之進料函數(圖3)。此兩連續進料作業之K常數係簡單地透過使用與圖1中所描述之另外兩連續葡萄糖進料作業相同之K₂₁及K₂₂值，及反計算K₁以匹配在第5天至第9天期間待進料之414 ml總體積來推導。所測試之此等K常數僅用作評估進料函數中之K值之起始點。將此等連續進料作業與如圖3中所顯示之標準團式進料作業比較。將團式進料投與三次，每次138 ml。所有四種進料策略係經設計以在生產結束時遞送414 ml之相同總體積。因此，細胞培養性能中之任何差異將僅歸咎於不同進料策略傾向而非進料體積。總言之，存在使用兩個連續進料流之作業，一者係葡萄糖及另一者係營養物混合物。一情況係營養物混合物之恒定流動速率連續進料與使用進料函數之連續葡萄糖進料配對。另外兩情況係兩種不同連續營養物混合物進料與和以上恒定流動相同的連續葡萄糖進料配對。第四種情況係標準團式葡萄糖與團式營養物混合物進料作業。

圖4顯示應用於細胞株1之連續進料模型之結果。圖4a中之數據證實連續葡萄糖進料可有效地將殘餘葡萄糖濃度一致地維持在限定之葡萄糖濃度範圍內。藉由實心圓形(●)表示之作業係雙連續葡萄糖(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)及進料(K₁=0.96678，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0288)作業。此作業之葡萄糖濃度範圍係維持在2至4 g/L之間。藉由空心圓形(○)表示之團式葡萄糖顯示預期及常見波動圖案，其係每日手工進料至6 g/L之結果。其他連續葡萄糖作業隨時間累積較高葡萄糖或結束時具有較低葡萄糖。顯示於圖4a中之結果證實進料函數可在經驗上經最優化以達成所需之一致葡萄糖濃度全程生產。總言之，觀察到連續葡萄糖進料以自動化方式將培養中之葡萄糖濃度維持在某一設定範圍內，而團式葡萄糖則產生波動行為，及不具有所需之穩定一致特性。

圖4b證實連續進料作業維持比團式進料作業還低之滲透壓。此可能歸因於如下事實：連續葡萄糖進料係經設計以對培養進料細胞所需之量，而非簡單地每日團式進料至固定量。連續進料亦可透過讓營養物濃度更為匹配細胞攝取而降低滲透壓；細胞更有效率地代謝營養物及不經歷在團式進料情況中所常見之劇烈環境變化。

圖4c顯示連續進料細胞之細胞存活率與利用團式進料方法進料之細胞相當。雖然兩種方法之間之細胞存活率相當，然而圖4d證實當應用連續進料與連續葡萄糖時，細胞密度(IVCD)顯著增進。此作用在兩種作業中觀察到：實心三角形(▲)及實心圓形(●)，使用兩組不同之連續進料K常數(K₁=0.96678，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0288)及(K₁=0.59499，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0348)，組合相同連續葡萄糖(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)。藉由實心菱形(◆)表示且使用恒定進料速率及與另外兩種作業相同之連續葡萄糖之連續進料作業僅產生與團式進料作業(空心圓形(○))相同之IVCD。此現象意指進料函數之指數特性在營養物遞送上較佳，使細胞生長較恒定進料及團式進料增進。此等作業之效價(實心三角形(▲)及實心圓形(●))亦係所有作業中最高且較對照團式進料作業(空心圓形(○))大概高7%。藉由使進料函數之K常數進一步最優化，連續進料之效價可增進超過團式進料。注意，此等作業之乳酸及氨特性極為類似。

應用於細胞株2時之連續進料方法

亦利用連續進料函數測試細胞株2。依照細胞株1之研究中之做法，連續葡萄糖進料之K值係藉由擬合進料函數以匹配自團式進料作業所產生之實際葡萄糖消耗數據來確定。連續進料之K值亦係基於來自連續葡萄糖之K₂₁及K₂₂之變化推導及利用在設定時間內遞送之總體積反計算K₁。控制過程為期16天。每日添加團式葡萄糖至多達6 g/L。於第5、7、9、11及13天時添加108 ml團式進料，共計540 ml進料。換言之，於雙連續進料作業中，連續葡萄糖進料K值保持相同及僅改變連續營養物混合物進料K值。

圖5顯示適用於細胞株2之連續進料方法之結果。所測試之兩不同連續葡萄糖係(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)及(K₁=0.069，K₂₁=-0.000048，K₂₂=0.018)。(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)係用於所有雙連續葡萄糖及進料作業。圖5a證實依經驗發展，可將葡萄糖濃度一致維持在3至6 g/L之具體範圍內。達成此範圍之作業係實心方形(■)，其使用連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與連續進料(K₁=2.3821，K₂₁=-0.00006，K₂₂=0.0092)。

圖5b證實連續葡萄糖與團式進料作業(空心菱形(◇))及雙連續葡萄糖與連續進料作業(實心方形(■))之細胞密度(IVCD)較團式進料對照作業(*)顯著增進。

圖5c顯示不同連續進料函數可產生大範圍變化的效價，其中某些效價較低而其他較高，即使進料540 ml相同量之進料體積。展示較團式進料增進之效價之作業係連續葡萄糖進料(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與團式進料(空心菱形(◇))；此作業之效價係6 g/L，而對照團式進料係5.5 g/L。細胞存活率亦有差異，某些連續進料特性匹配團式進料及某些則較低。此數據顯示不同連續進料K值之反應範圍及表明K值範圍最優化之潛力。

利用細胞株2在連續進料方法中測試較高體積

於另一實驗中，將團式進料方法在第4及5天改變成84 ml，及在第7、9、11及13天改變成108 ml，共計進料600 ml。此修改將增加額外一個進料日及較先前情況多進料60 ml。基於圖5中所顯示之數據進一步改進關於連續葡萄糖及連續進料方程式之K值。葡萄糖之K值更改為(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，此較佳擬合細胞株2之經修改葡萄糖消耗數據。於此研究中，存在四種情況，如圖6中所顯示。第一情況(空心菱形(◇))係對照團式葡萄糖及進料。第二情況(空心三角形(△))使用連續葡萄糖(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)結合團式進料。第三情況(實心三角形(▲))使用相同連續葡萄糖K值結合連續進料(K₁=1.8744，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)。第四情況(實心菱形(◆))使用相同連續葡萄糖K值結合連續進料(K₁=2.0827，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)。團式進料情況及第四情況連續進料均遞送600 ml相同量之總進料。第三情況連續進料係經設定遞送先前共540 ml以供比較。雖然第三與第四情況存在體積差異，然而預期連續進料傾向曲線相同，係因兩函數共享相同K₂₁及K₂₂值。雖然K₂₁及K₂₂值保持相同，然而K₁值較高，此要求較高進料速率量級。於此情況中，整個進料曲線移動高於較低K₁進料曲線。所有作業係於第4天至第13天之相同時間框架內遞送進料。

於此研究中，就空心三角形(△)作業而言，連續葡萄糖之殘餘葡萄糖濃度控制在3至5 g/L之狹窄範圍內。雙連續葡萄糖及進料之殘餘葡萄糖具有較大變化，但仍可接受，係因其變化仍小於團式葡萄糖進料(具有1至6 g/L之範圍)。

圖6a證實效價係利用連續葡萄糖結合連續進料而增進。兩種連續進料情況達成約8.4 g/L效價，此係任何細胞株2方法中觀察到之最高效價。至少在第11天前，團式進料作業之效價傾向落後於連續進料作業。連續進料作業之體積生產率亦較高。

圖6c顯示連續進料作業之細胞存活率較團式進料作業高。於此研究中，就細胞存活率而言，較高連續進料體積600 ml優於540 ml進料體積。於生產結束時，細胞存活率亦比團式進料高9%。使用連續進料遞送600 ml進料對於IVCD亦觀察到相同類型之增進，如圖6d中所顯示。於生產結束時，此連續進料獲得214×10⁶細胞天/ml，而540 ml連續進料則獲得187×10⁶細胞天/ml，及團式進料對照獲得170×10⁶細胞天/ml。最佳連續進料較團式進料獲得約26% 之IVCD增進。

在關於連續進料體積之連續實驗中，將連續進料與對照團式進料600 ml平行測試兩額外變化。第一情況(空心圓形(○))使用連續進料(K₁=2.6503，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，自第5天開始及持續至第13天。由於連續進料在第4天後開始，而總進料仍係600 ml，故K₁較先前連續進料之2.0827高。K₂₁及K₂₂值仍與先前連續進料相同。此情況測試較遲開始連續進料但維持相同總體積。於第二情況中，測試連續進料(K₁=2.2910，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，此在第4天至第13天內應用。此情況與對照團式進料具有相同開始及結束時間。然而，K₁自2.0827增大至2.2910以測試較高總體積660 ml。就此兩連續進料情況而言，兩者均結合團式葡萄糖。目的係理解連續進料在非連續葡萄糖下之單獨作用。

圖7a及7b證實連續進料情況兩者之效價及體積生產率稍有增進。圖7c證實連續進料情況之存活率顯著增進。此現象在先前圖6情況中已觀察到。圖7d證實連續進料情況之IVCD僅略微增進，相對地，於圖5中觀察到較大增進。

於細胞株3中測試連續進料方法

利用連續進料函數測試細胞株3。對照團式進料方法於第4天進料84 ml，第6天108 ml及第8天108 ml，共300 ml。整個過程為12天。測試一種連續進料結合團式葡萄糖情況。在使用來自利用細胞株2之先前研究之相同K₂₁(-0.000003)及K₂₂(0.003)下，無任何進展。K₁計得為 2.7233，進料共300 ml，自第4天開始至第8天。

關於細胞株3之數據顯示連續進料較團式進料增進效價，自4.2 g/L至4.5 g/L(圖8a)。自第8天至第12天，連續進料之比生產率q_p亦較高(圖8b)。細胞存活率、IVCD、乳酸及氨特性無明顯差異。結果證實細胞株3之效價可得以顯著增進。

結論

對細胞株1、2及3之研究證實一種用於細胞培養之新穎及有效預程式化無回饋連續進料模型可成功應用以代替團式進料。測試三種不同細胞株及觀察相較於團式進料之各優點。就細胞株1而言，證實滲透壓特性較低及IVCD較高。就細胞株2而言，證實藉由連續進料可增進效價、體積生產率、細胞存活率及IVCD。就細胞株3而言，證實可藉由連續進料增進效價及比生產率。

除細胞培養性能增進外，證實連續進料方法亦可用於在整個生產期間將葡萄糖一致地維持在適宜範圍內。此合理且有利，係因其消除對手工團式進料之需求，及因此消除對人為干預及節省資源之需求。由於連續進料方法係在作業前經預程式化及無需操作人員干預，故該方法在每次作業間保持一致，具有充分改良之可靠K值。成功雙連續葡萄糖與進料作業之實例顯示細胞培養進料之完全自動化有效。

此等研究之結果證實所揭示之連續進料方法增強細胞培養生長及蛋白質生產之性能及該方法可代替習知團式進料策略。

本文中所引述之各參考文獻係針對其所有教示內容及所有目的以引用其全文之方式併入本文。

本發明不限制於本文中所描述之具體實施例所界定之範圍，此等實施例意欲說明本發明之個別態樣且功能等效方法及組分形成本發明之態樣。實際上，除本文中顯示及描述之彼等內容外，熟習本項技術者將自以上敘述及附圖知曉本發明之各修改方案。此等修改方案係屬於隨附申請專利範圍之範圍內。

圖1係顯示進料函數相較於細胞株1之細胞培養營養物需求之擬合密切性之圖。

圖2係顯示葡萄糖連續進料速率及針對細胞株1所測試之體積積累傾向之圖；空心形狀係葡萄糖流動速率及顯示於左Y軸上及實心形狀係進料之累積葡萄糖體積及顯示於右Y軸上；空心三角形(△)及實心三角形(▲)各別係連續葡萄糖流動速率及體積累積，K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331，而空心菱形(◇)及實心菱形(◆)各別係連續葡萄糖流動速率及體積，K₁=0.04，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0348，及空心方形(□)及實心方形(■)各別係連續葡萄糖流動速率及體積，K₁=0.062，K₂₁--0.00015，K₂₂=0.0288。

圖3係顯示針對細胞株1所測試之進料流動速率及體積積累傾向之圖；空心形狀係進料流動速率及顯示於左Y軸上及實心形狀係進料的累計進料體積及顯示於右Y軸上；空心菱形(◇)及實心菱形(◆)各別表示連續進料流動速率及體積，K₁=0.59499，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0348，而空心三角形(△)及實心三角形(▲)各別表示連續進料流動速率及體積，K₁=0.96678，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0288，空心圓形(○)及實心圓形(●)各別表示恒定進料流動速率為2.875 ml/小時及其累計體積，及實心方形(■)表示控制團式進料之累計體積傾向。

圖4a至4d係一系列關於涉及細胞株1之實驗之圖，及更特定言之，圖4a係顯示殘餘葡萄糖之圖，圖4b係顯示滲透壓之圖，圖4c係顯示細胞存活率之圖，及圖4d係顯示積合存活細胞密度之圖；空心圓形(○)表示團式葡萄糖及進料對照，空心方形(□)表示團式進料之連續葡萄糖(K₁=0.04，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0348)與團式進料，星形(*)表示連續葡萄糖(K₁=0.062，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0288)與團式進料，實心三角形(▲)表示連續葡萄糖(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)與連續進料(K₁=0.59499，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0348)，實心菱形(◆)表示連續葡萄糖(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)與恒定進料(2.875 ml/小時)，及實心圓形(●)表示連續葡萄糖(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)與連續進料(K₁=0.96678，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0288)。

圖5a至5c係一系列關於涉及細胞株2之實驗之圖，及更特定言之，圖5a係顯示殘餘葡萄糖之圖，圖5b係顯示積合存活細胞密度之圖，圖5c係顯示效價之圖；星形(*)表示團式葡萄糖及進料對照，空心菱形(◇)表示連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與團式進料，空心三角形(△)表示連續葡萄糖(K₁=0.069，K₂₁=-0.000048，K₂₂=0.018)與團式進料，實心三角形(▲)表示連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與連續進料(K₁=1.1320，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)，實心菱形(◆)表示連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與連續進料(K₁=0.8965，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)，實心圓形(●)表示連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與連續進料(K₁=1.9056，K₂₁=-0.00006，K₂₂=0.0092)，及實心方形(■)係連續葡萄糖(K₁=0.105，K₂₁=-0.000051，K₂₂=0.0155)與連續進料(K₁=2.3821，K₂₁=-0.00006，K₂₂=0.0092)。

圖6a至6d係一系列關於涉及細胞株2之實驗之圖，及更特定言之，圖6a係顯示效價之圖，圖6b係顯示體積生產率之圖，圖6c係顯示存活率之圖，及圖6d係顯示積合存活細胞密度之圖；空心菱形(◇)表示團式葡萄糖及進料對照(600 ml總進料)，空心三角形(△)表示連續葡萄糖(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)與團式進料(600 ml總進料)，實心三角形(▲)表示連續葡萄糖(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)與連續進料(K₁=1.8744，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)(540 ml總進料)，及實心菱形(◆)表示連續葡萄糖(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)與連續進料(K₁=2.0827，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)(600 ml總進料)。

圖7a至7d係一系列關於涉及細胞株2之實驗之圖，及更特定言之，圖7a係顯示效價之圖，圖7b係顯示體積生產率之圖，圖7c係顯示存活率之圖，及圖7d係顯示積合存活細胞密度之圖；空心三角形(△)表示團式葡萄糖及進料對照(600 ml總進料)，空心圓形(○)表示團式葡萄糖與連續進料(K₁=2.6503，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)(600 ml總進料)及空心方形(□)表示團式葡萄糖與連續進料(K₁=2.2910，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)(660 ml總進料)。

圖8a至8b係一系列關於涉及細胞株3之實驗之圖，及更特定言之，圖8a係顯示效價之圖，及圖8b係顯示比生產率之圖；空心三角形(△)表示團式葡萄糖及進料對照，及空心菱形(◇)表示團式葡萄糖與連續進料(K₁=2.7233，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，自第4天至第8天共300 ml，與對照進料體積相同。

Claims

一種不採取回饋控制之連續進料哺乳動物細胞培養之方法，其包含：(a)提供包含哺乳動物細胞培養之容器，該哺乳動物細胞培養包含哺乳動物細胞及培養基；(b)確定該細胞培養之營養物消耗速率(K₁)、生長速率(K₂₁)及生長速率(K₂₂)之較佳值；(c)提供適用於將連續進料流提供至該細胞培養之裝置，其中該裝置包含適用於以一流動速率F連續進料該培養之控制器模組，其中F係定義為K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；t係自將該進料流添加至生物反應器起之時間至終止該進料流之時間止之持續時間；及K₁、K₂₁及K₂₂係於(b)中所確定之值；及(d)啟動該控制器模組以啟始該細胞培養之連續進料。
如請求項1之方法，其中K₁、K₂₁及K₂₂係以經驗確定。
如請求項1之方法，其中K₁、K₂₁及K₂₂係經模型化。
如請求項1之方法，其中該控制器模組包含電腦。
如請求項1之方法，其中該進料流包含多種營養物。
如請求項1之方法，其中該細胞培養之滲透壓在整個該方法期間維持恒定。
如請求項1之方法，其中該營養物係葡萄糖。
如請求項1之方法，其中該哺乳動物細胞培養係CHO細胞培養。
如請求項1之方法，其中該控制器模組係對在該細胞培養中之預選擇乳酸濃度起反應而啟動。
如請求項1之方法，其中該控制器模組係對在該細胞培養中之預選擇葡萄糖濃度起反應而啟動。
如請求項1之方法，其中該控制器模組係對預選擇胺基酸濃度起反應而啟動。
如請求項11之方法，其中該胺基酸係天冬醯胺。
如請求項11之方法，其中該胺基酸係榖胺醯胺。
如請求項1之方法，其中該進料流包含兩種或更多種營養物。