KR101710766B1 - 세포 배양물의 사전-예정된 비-피이드백 조절된 연속 공급 - Google Patents

Abstract

세포 배양물 성장 및 유지의 용도로 생물반응기에서 기질의 양적 균형에 근거하여 사전-예정된 비-피이드백 연속 공급 방법이 제공된다. 공개된 방법은 기계, 프로브 또는 작업자의 피이드백에 의존하지 않는다. 이 방법은 집중적 공급의 효과적이고 효율적인 대안이다.

Description

세포 배양물의 사전-예정된 비-피이드백 조절된 연속 공급{PRE-PROGRAMMED NON-FEEDBACK CONTROLLED CONTINUOUS FEEDING OF CELL CULTURES}

본 출원은 2011년 9월 16일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/535,809를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

발명의 분야

본 명세서는 강화된 세포 성장 및 단백질 발현을 제공하지만, 이 세포 배양물의 요구 변화에 순응하도록 피이드백 조절에 의존하지 않은 연속적 세포 배양물을 공급하는 방법에 관계한다.

포유류 세포 배양물은 재조합 치료 단백질의 제조용으로 광범위하게 이용된다. 단백질 치료제에 대한 시장의 성장과 생산 효과를 개선시키고, 생산된 제품의 비용을 감소시키기 위한 지속적인 노력으로 인하여 세포 배양물 산출량을 개선시키는 요구가 지난 10년간 엄청나게 증가되어 왔다. 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포가 치료 단백질 이를 테면, 단클론 항체들, 항원들 및 기타 특화된 단백질 양태의 생산에 흔히 이용된다.

포유류 세포를 이용한 단백질 생산은 전형적으로 세포 성장, 대사 및 원하는 단백질 제품의 합성을 지원하는 영양분 보충물이 생산을 통하여 세포로 공급되는 프로세스인, 페드-배취(fed-batch) 프로세스가 관련된다. 세포 배양물 페드-배취 공급 프로세스에 있어서 현재 산업 표준은 집중적(bolus) 공급이다. 집중적 공급 프로세스에서, 세포 배양물 생산 전과정을 통하여 다양한 시점에서 영양분은 간헐적 별개 추가로 세포에게 제공된다. 집중적 공급 프로세스는 수작업 공급 조작의 실용성에 의해 한정되기 때문에 방식이 단순하며, 이것이 보편적으로 이용되는 하나의 이유가 된다.

집중적 공급은 그러나 몇 가지 단점이 있는데, 가장 큰 단점은 세포가 실질적으로 필요로 하는 정확한 양의 영양분을 제공하는 것이 불가능하다. 다른 방식으로 말하자면, 집중적 공급은 세포 배양물의 특이적 요구에 맞출 수 없고, 결과적으로, 일부 영양분은 세포 배양물이 요구하는 것보다 훨씬 많은 양으로 공급될 수 있으며, 반면 다른 영양분은 세포가 필요로 하는 것보다 적은 수준에서 제공될 수 있다. 따라서, 방법적으로 단순하지만, 집중적 공급 방식은 과다공급으로 이어질 수 있고, 결과적으로 과도한 물질대사로 이어지고, 세포 성장 또는 생합성을 지원하지 않고, 세포의 성장을 실질적으로 방해하는, 젖산염과 같은 폐부산물의 축적을 초래할 수 있다.

제조 시나리오에서 집중적 공급 프로세스의 또다른 단점은 세포 배양물 성능에 차이를 야기할 수 있는 다양한 고유한 근원을 보유한다는 것이다. 이러한 근원중 하나는 요구된 공급 일에 공급 조작을 실시하는 시기의 가변성이다. 집중적 공급과 연관된 또다른 가변성 근원은 생물반응기로 투여되는 영양분 흐름 속도다. 별도로 또는 함께, 공급이 실행되는 시기와 세포에게 공급되는 속도의 변화는 실행할 때마다 주어진 세포 배양물의 특징 및 생산에 영향을 끼칠 수 있다. 집중적 공급과 연관된 여전히 또다른 단점은 전형적으로 작업자에 의해 실행되어야 하는 수작업 조작이라는 점이다. 자동화의 부족은 인적 및 재정적 자원을 소모할 수 있고, 가변성의 또다른 근원, 즉 작업자들간의 일관성 부족으로 인하여, 또는 동일한 작업자라면, 조절불가능한 작업자에 의해 도입된 변화로 인하여, 제조 프로세스에 도입되는 미묘한 차이로 나타난다.

집중적 공급의 단점들은 연속 공급 프로세스의 사용을 통하여 극복될 수 있다. 연속 공급 프로세스는 한 번에 다량의 집중적 첨가보다는 시간을 두고 배양물에 더 적은 양의 영양분을 연속적으로 공급함으로써 세포의 요구에 더 잘 부합되도록 기획될 수 있다. 이렇게 함으로써, 세포 성장을 위하여 영양분 농도는 좀 더 최적의 수준으로 조절 및 유지될 수 있고, 이로 인하여 과잉공급을 방지하고, 불필요한 폐기물의 생성을 최소화시키고, 분리되지 않는 유사-정상 상태(pseudo-steady state) 수준을 유지할 수 있다. 연속 공급 조작의 이용은 또한 집중적 공급 조작과 연관된 공급 시기 및 공급 속도의 가변성을 제거할 수 있는데, 그 이유는 이들 변수는 연속 공급 프로세스에서 자동으로 조절된다. 연속 공급 프로토콜을 이용하여 또한 작업자 개입(intervention) 또한 제거된다.

이 방식의 상이한 형태들이 설명되고 있지만, 이러한 방식들은 여전이 작업자의 오류 가능성을 개입시킨다. 예를 들면, Hu 및 Europa(미국 특허 제6,156,570호)는 생산성을 개선시킨 연속 공급 전략을 설명하였다. 그러나, 포유류 세포 배양물에 대한 이러한 연속 공급 전략은 설비 피이드백 조절에 의존하며, 이것은 공급 프로세스로 가변성을 도입시킬 수 있다.

요약하자면, 이러한 모든 방법에서 공통적인 단점은 이 프로세스를 관리하기 위하여 이들 모두는 일종의 기계에 의해 이루어지는 피이드백에 의존한다는 점이다. 따라서, 자동화되고, 세포 배양물로 전달되는 영양분을 조절하기 위하여 기계에 의해 중개된 피이드백에 의존하지 않고, 주어진 세포 배양물의 특정 요구에 맞출 수 있는 세포 배양물을 공급하는 방법이 필요하다.

발명의 요약

피이드백 조절을 이용하지 않고 포유류 세포 배양물을 연속적으로 공급하는 방법이 제시된다. 한 구체예에서 이 방법은 (a) 포유류 세포와 배지를 포함하는 포유류 세포 배양물을 포함하는 용기를 제공하고; (b) 영양분의 소모율(K₁), 성장률(K₂₁): 그리고 세포 배양물의 성장률(K₂₂)에 대한 바람직한 값을 결정하고; (c) 이 세포 배양물로 연속 공급 흐름을 제공하는데 적합한 장치를 제공하고, 여기에서 장치는 유속 F에서 배양물을 연속적으로 공급하는데 적합한 컨트롤러 모듈을 포함하고, 여기에서 F는 K₁exp(K₂₁t² + K₂₂t)로 정의되며; t는 생물반응기로 공급물 흐름이 첨가되는 시점으로부터 공급 흐름이 중단되는 시점까지의 기간이며; 그리고 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 (b)에서 결정된 값이 되며; 그리고 (d) 컨트롤러 모듈을 활성화시켜서 세포 배양물의 연속 공급을 개시하는 것을 포함한다. 한 구체예에서 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 실증적으로 결정된다. 또다른 구체예에서 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 모델링된다(modeled). 추가 구체예에서, 컨트롤러 모듈은 컴퓨터를 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서 공급 흐름은 다중 영양분을 포함한다. 추가 구체예에서 세포 배양물의 삼투질농도는 이 방법 동안에 일정하게 유지된다. 또다른 구체예에서, 배양물로 공급되는 영양분 은 포도당이다. 기타 구체예들에서 포유류 세포 배양물은 CHO 세포 배양물이다. 추가 구체예에서, 컨트롤러 모듈은 세포 배양물 중의 사전선택된 젖산염 수준에 반응하여 활성화되며, 또다른 구체예에서 컨트롤러 모듈은 세포 배양물 중의 사전선택된 포도당 수준에 반응하여 활성화된다. 여전히 또다른 구체예에서, 컨트롤러 모듈은 사전선택된 아미노산 수준, 이를 테면 아스파라긴 또는 글루타민에 반응하여 활성화된다. 추가 구체예에서 공급 흐름은 2종 또는 그 이상의 영양분을 포함한다.

도 1은 세포 계통 1의 세포 배양물 영양분 요구와 비교하여 공급 함수(function)의 잘 맞추어짐을 보여주는 플롯이다.
도 2는 세포 계통 1에 대해 테스트된 포도당 연속 공급 속도 및 용량 축적 현상을 표현한 플롯이다: 열린 모양(open shapes)은 포도당 유속으로, 좌측 Y-축에 나타내며, 닫힌 모양(solid shapes)은 공급된 누적 포도당 용량으로 우측 X-축에 나타낸다; 개방 삼각형 (△) 및 닫힌 삼각형 (▲)은 각각 연속 포도당 유속 및 용량 축적을 나타내는데, K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0331이며, 한편, 개방 다이아몬드(◇) 및 닫힌 다이아몬드 (◆)는 각각 연속 포도당 유속 및 용량이다, K₁=0.04, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0348, 그리고 개방 사각 (□) 및 닫힌 사각 (■)은 각각 연속 포도당 유속 및 용량이다, K₁=0.062, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0288.
도 3은 세포 계통 1에 대해 테스트된 공급 유속 및 용량 축적 현상을 표현한 플롯이다; 열린 모양은 공급 유속으로, 좌측 Y-축에 나타내며, 닫힌 모양은 공급된 누적 공급 용량으로 우측 Y-축에 나타낸다; 개방 다이아몬드 (◇)과 닫힌 다이아몬드 (◆)는 각각 연속 공급 유속 및 용량을 나타내고, K₁=0.59499, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0348이며, 한편, 개방 삼각형 (△)과 닫힌 삼각형 (▲)은 각각 연속 공급 유속 및 용량을 나타낸다, K₁=0.96678, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0288이며, 개방 원 (○) 및 닫힌 원 (●)은 2.875mL/hr의 일정한 공급 유속 및 이의 누적 용량을 각각 나타내고, 닫힌 사각(■)은 조절 집중적 공급의 누적 용량 현상을 나타낸다.
도 4a-4d는 세포 계통 1이 관련된 실험에 관계된 일련의 플롯으로써, 좀더 구체적으로 도 4a는 잔여 포도당을 나타내는 플롯이고, 도 4b는 삼투질농도를 나타내는 플롯이며, 도 4c는 세포 생존력을 보여주는 플롯이고, 그리고 도 4d는 통합된 생육가능한 세포 밀도를 보여주는 플롯이며; 개방 원 (○)은 집중적 포도당 및 공급 조절을 나타내고, 개방 사각 (□)은 집중적 공급과 함께 연속 포도당을 나타내고 (K₁=0.04, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0348), 별(*)은 집중적 공급과 함께 연속 포도당 (K₁=0.062, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0288)을 나타내고, 닫힌 삼각형 (▲)은 연속 공급 (K₁=0.59499, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0348)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0331)을 나타내고, 닫힌 다이아몬드 (◆)는 일정한 공급 (2.875mL/hr)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0331)을 나타내고, 그리고 닫힌 원 (●)은 연속 공급 (K₁=0.96678, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0288)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, K₂₂=0.0331)을 나타낸다.
도 5a-5c는 세포 계통 2가 연관된 실험과 관련된 일련의 플롯이며, 좀더 구체적으로 도 5a는 잔여 포도당을 나타내는 플롯이며, 도 5b는 통합된 생육가능한 세포 밀도를 나타내는 플롯이며, 도 5c는 역가를 나타내는 플롯이며; 별 (*)은 집중적 포도당 및 공급과 함께 조절을 나타내고, 개방 다이아몬드 (◇)는 집중적 공급과 함께 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=- 0.000051, K₂₂=0.0155)를 나타내고, 개방 삼각형 (△)은 집중적 공급과 함께 연속 포도당 (K₁=0.069, K₂₁=-0.000048, K₂₂=0.018)을 나타내고, 닫힌 삼각형 (▲)은 연속 공급 (K₁=1.1320, K₂₁=-0.000051, K₂₂=0.0155)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, K₂₂=0.0155)을 나타내고, 닫힌 다이아몬드 (◆)는 연속 공급 (K₁=0.8965, K₂₁=-O.O00051, K₂₂=0.0155)과 함께, 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, K₂₂=0.0155)을 나타내고, 닫힌 원 (●)은 연속 공급 (K₁=1.9056, K₂₁=-0.00006, K₂₂=0.0092)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, K₂₂=0.0155)을 나타내고, 그리고 닫힌 사각 (■)은 연속 공급 (K₁=2.3821, K₂₁=-0.00006, K₂₂=0.0092)과 함께, 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, K₂₂=0.0155)을 나타낸다.
도 6a-6d는 세포 계통 2가 연관된 실험과 관련된 일련의 플롯이며, 좀더 구체적으로 도 6a는 역가를 나타내는 플롯이며, 도 6b는 용량 생산성을 보여주는 플롯이며, 도 6c는 생존력을 보여주는 플롯이며, 그리고 도 6d는 통합된 생육가능한 세포 밀도를 보여주는 플롯이고; 개방 다이아몬드 (◇)는 집중적 포도당 및 공급 (600mL 총 공급)과 함께 조절을 나타내고, 개방 삼각형 (△)은 집중적 공급 (600mL 총 공급)과 함께 연속 포도당 (K₁=0.215, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003)을 나타내고, 닫힌 삼각형 (▲)은 연속 공급 (K₁=1.8744, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003) (540mL 총 공급)과 함께, 연속 포도당 (K₁=0.215, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003)을 나타내고, 그리고 닫힌 다이아몬드 (◆)는 연속 공급 (K₁=2.0827, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003) (600mL 총 공급)과 함께, 연속 포도당 (K₁=0.215, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003)을 나타낸다.
도 7a-7d는 세포 계통 2가 연관된 실험과 관련된 일련의 플롯이며, 좀더 구체적으로 도 7a는 역가를 나타내는 플롯이며, 도 7b는 용량 생산성을 보여주는 플롯이며, 도 7c는 생존력을 보여주는 플롯이며, 그리고 도 7d는 통합된 생육가능한 세포 밀도를 보여주는 플롯이고; 개방 삼각형 (△)은 집중적 포도당 및 공급 (600mL 총 공급)과 함께 조절을 나타내고, 개방 원 (○)은 연속 공급 (K₁=2.6503, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003) (600mL 총 공급)과 함께 집중적 포도당을 나타내고, 그리고 개방 사각(□)은 연속 공급 (K₁=2.2910, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003) (660mL 총 공급)과 함께 집중적 포도당을 나타낸다.
도 8a-8b는 세포 계통 3과 연관된 실험과 관련된 일련의 플롯이며, 좀더 구체적으로 도 8a는 역가를 나타내는 플롯이며, 도 8b는 특이적 생산성을 나타내는 플롯이며; 개방 삼각형 (△)은 집중적 포도당 및 공급과 함께 조절을 나타내고, 그리고 개방 다이아몬드 (◇)는 조절 공급과 동일한 300mL 용량으로 4일차부터 8일차 까지 연속 공급 (K₁=2.7233, K₂₁=-0.000003, K₂₂=0.003)과 함께 집중적 포도당을 나타낸다.

본 명세서에서 다른 정의가 없는 한, 본 출원과 연관되어 이용된 과학적 그리고 기술적 용어들은 당업계에 숙련자들에 의해 보통 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 내용에서 다른 요구가 없는 한, 단수는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함한다.

일반적으로, 본 명세서에서 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 그리고 혼성화의 기술과 관련되어 이용된 명명법은 당업계에 공지되어 있는 것들이며, 공통적으로 사용되는 것들이다. 본 출원의 방법들과 기술들은 다른 언급이 없는 한, 당업계에 공지되어 있는 그리고 본 출원을 통하여 언급되고 논의된 다양한 일반적인 그리고 구체적 참고자료에서 논의된 것과 같이 통상적인 방법들에 의해 일반적으로 실시된다. 가령, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 후속 판, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 그리고 Harlow & Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 공통적으로 성취되고, 본 명세서에서 기술된 것과 같이 제조업자의 설명에 따라 실행된다. 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의학 및 약학과 관련되어 이용된 용어 및 실험실 절차들은 당업계에 공지되어 있고, 당업계에서 흔히 이용된다. 화학 합성, 약제 준비, 제형화 및 전달 그리고 환자 치료에서는 표준 기술이 이용될 수 있다.

본 개시내용은 본 명세서에서 기술된 특정 방법, 프로토콜, 그리고 시약에 한정되지 않으며, 이들은 변화될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 기술된 용어들은 오로지 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 본 명세서의 범위를 제한시키고자 하는 의도는 아니다.

작업 실시예 이외, 또는 다른 곳에서 언급된 것과 같이, 본 명세서에서 이용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 함께 이용되는 경우 "약"은±5%, 이를 테면, 1%, 2%, 3%, 또는 4%를 의미할 수 있다.

프로세스를 조절하기 위하여 기계 피이드백에 의존하지 않는 연속 공급 방법의 요구에 부합되도록, 이러한 공급 방법이 제시된다. 한 측면에서, 공개된 방법은 세포 성장 모델과 세포 배양물의 기질 소모에 기초된다. 공개된 방법은 특이적 기질 소모율과 특이적 성장률을 나타내는 3가지 매개변수와 함께 공급 속도 함수를 제공한다; 3가지 매개변수들은 모두 주어진 배양물에 대해 최적화될 수 있으며, 모든 CHO 세포 계통에 대해 최적화될 수 있다. 바람직한 프로파일에 맞추기 위하여 세포 배양물 공급을 조절하도록 연속 공급 알고리즘에서 최적화된 기능이 이용된다. 이러한 공급 전략은 사전-예정되며, 그리고 전체 단백질 생산 프로세스 동안에 피이드백으로 조절되지 않을 수 있다. 따라서, 공급을 조절 또는 조정하기 위하여 기계로부터 입력이나 또는 다른 형태의 측량이 요구되지 않는다. 모든 유형의 영양분 공급, 이를 테면 포도당 공급 및 혼합물 공급에 적용될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 공개된 연속 공급 방법은 세포 생존력, 세포 밀도, 및 주어진 세포 배양물의 생산성을 개선시킬 수 있다. 공급 속도 기능은 또한 제한된 탄소 공급을 얻기 위하여 조율될 수 있고, 이로 인하여 부산 폐기물, 이를 테면, 젖산염 및 암모늄을 감소시킬 수 있다. 공개된 연속 공급 방법은 강화된 세포 배양물 성능, 더 나은 운영 일관성, 공급 조작 가변성의 제거 및 수작업 공급 조작에 대한 필요성 제거를 포함하는 다수의 방식에서 집중적 공급보다 우수하다. 이러한 연속 공급 전략은 통상적인 집중적 공급에 대한 개선된 그리고 실행가능한 대안이며, 그리고 흔히 이용되는 통상적인 집중적 공급 방식과 연관된 가변성을 감소 또는 제거한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 바람직한 분자를 발현시키는 배양물과 같은 세포 배양물을 연속적으로 공급하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 공급 함수를 제공하는데, 이는 성장하는 세포 배양물에게 첨가되는 영양분의 속도 및 용량을 관리한다. 공급 함수는 본 명세서에서 나타낸 것과 같이 유도될 수 있는데: 공급 함수에서 나타나는 개별 변수는 주어진 배양물에 대해 모두 측정될 수 있다.

광범위하게, 주어진 배양물에 대한 공급 함수의 개발은 영양분 소모 및 성장 매개변수들을 설명하는 3가지 매개변수들(K₁, K₂₁, 및 K₂₂)이 통합되며, 이들은 주어진 세포 배양물의 성장 요구 및 기질 소모 특징에 정합되고 이를 만족시키도록 결정된다. 공급 함수에서 또다른 변수는 공급 기간, (t)이며, 이는 공급되는 총 용량을 나타내며, 이 또한 주어진 세포 배양물의 성장 요구 및 기질 소모 특징에 정합되고 이를 만족시키도록 결정될 수 있다. 이들 매개변수들을 결정하고, 공급 함수에 이들을 통합시키고, 그리고 공급 함수와 적합한 하드웨어를 연계함으로써, 집중적 공급보다 성능이 개선된, 완전하게 자동화가능한 연속 공급 방법을 성취한다.

공개된 방법들은 임의의 단백질-기반 분자, 이를 테면, 임의의 길이의 단백질(가령, 치료 단백질), 항체, 페티바디(peptibody), 헤미바디(hemibody), 하나 또는 그 이상의 자연적으로 생성되지 않는 또는 암호화된 아미노산 (이를 테면, 항체 또는 치료 단백질), 펩티드, Fc 융합 단백질, SCFv, 단일 쇄 항체를 포함하는 분자의 제조에 적용될 수 있다.

공개된 방법들은 벤치 규모(가령, ~1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 50 L 배양물)에서부터 소규모 제조(가령, ~100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 또는 2000 L 배양물)에 이르기까지 임의의 바람직한 규모에 또한 이용될 수 있다. 특히 바람직한 형태에서, 공개된 방법들은 산업 규모(가령, ~5000, 7500, 10000 또는 15,000L)에 적용될 수 있다. 비용 절감을 포함하는 공개된 방법들의 장점들은 산업 규모에서 가장 현저할 것이지만, 이 방법은 적용되는 생산 규모와 무관하게 자명하다.

세포 성장을 지원하는 임의의 배지가 공개된 발명의 세포 배양물 및 방법들에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 배지는 혈청을 포함할 수 있고, 한편 또다른 구체예에서 배지는 무-혈청일 수 있다. 다양한 구체예들에서, 배지에는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 보충될 수 있다. 한 구체예에서 배지는 화학적으로 특정된 배지다.

정의

관례에 따라, 본 명세서에서 이용된 부정관사 하나( "a" 및 "an")는 특별히 다른 언급이 없는 한 "하나 또는 그 이상의"을 의미한다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본 명세서에서 호환사용되며, 아미노산 잔기들을 포함하는 중합체를 지칭한다. 이 용어들은 또한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 대응하는 자연적으로 생성되는 아미노산의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체들, 뿐만 아니라 자연적으로 생성되는 아미노산 중합체들에 또한 적용된다. 이 용어들은 당단백질들, 또는 인산화된 형태를 만들기 위하여 탄수화물 잔기들의 추가에 의해 변형된 아미노산 중합체들도 또한 포괄한다. 폴리펩티드들 및 단백질들은 자연적으로-생성되는 비-재조합 세포에 의해 만들어질 수 있고, 또는 폴리펩티드들 및 단백질들은 유전적으로-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산될 수 있다. 폴리펩티드들 및 단백질들은 고유 단백질의 아미노산 서열을 보유한 분자들, 또는 고유 서열로부터 결손, 고유 서열에 추가, 및/또는 비-자연적으로 생성되는 아미노산으로의 치환을 포함하는, 고유 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 가지는 분자를 포함할 수 있다.

공급 함수의 유도

제공된 비-피이드백 조절된 연속 공급 방법의 구성요소는 관심 대상의 포유류 세포 배양물 (가령, CHO, NSO, BHK21, PER.C6 또는 HEK 293 세포 배양물), 예를 들면 관심 단백질의 발현을 목적으로 키운 배양물의 독특한 성장 요구 및 성질에 맞춘 공급 함수(feeding function)다. 공급 함수는 성장, 생합성을 촉진시키고, 부산물의 형성을 감소시키는 목적에서 배양물의 영양 요구 프로파일(들)을 통합한다. 한 측면에서, 공급 함수는 세포 배양물 성장 프로파일의 과정에 걸쳐 시간적으로 임의의 시점에서 배양물의 최적의 영양적 요구의 표현으로 간주될 수 있다. 시간에 대한 함수로써 배양물의 영양 요구의 표현을 보유함으로써(가령, 공급 함수), 이러한 기계가 제공할 데이터는 이미 알고 있는 것이며, 공급 함수에 통합되기 때문에 임의의 피이드백 조절에 대한 필요가 없다. 공급 함수는 세포 배양물 성장의 완전한 자동화된 조작을 또한 허용하고; 일단 세포 배양물을 함유하는 생물반응기 안으로 영양분 흐름(들)을 조절하기 위하여 공급 공식(formula)이 배치되면, 개시 신호가 제공되고, 전체적인 세포 성장 프로세스는 공급 함수에 의해 조절되며, 추가적인 개입이 요구되지 않는다.

공급 함수는 기질의 주입 유속(F), 생물반응기 안에 최초 영양분 농도 (S_i), 영양분 비축 농도 (S_o), 영양분 산출량에 대한 최대 세포 밀도(

), 특이적 성장률(μ), 세포 밀도 (X), 및 생물반응기의 용량(V)을 포함하여 다중 변수를 고려한다. 이들 모든 변수는 특정 배양물에 대해 각 매개변수를 측정하고, 산출함으로써 바로 결정될 수 있다. 기질의 주입 유속 (F)은 생물반응기로 투여되는 기질의 공급 속도다. 최초 생물반응기 영양분 농도 (S_i)는 연속 공급이 개시되려는 시점에서 기질의 농도다. 이것은 오프-라인 영양분 분석기를 이용하여 배지 시료로 측정될 수 있다. 영양분 비축 농도(S_o)는 연속 공급을 제공하는 액체 저장기 안에 기질의 농도다. 영양분 산출량에 대한 최대 세포 밀도(

)는 총 세포 밀도를 이 시점에서 소비된 총 기질양으로 나눈 정점이다. 세포 밀도 (X)는 세포 카운터로 측정된 배양물 안에 있는 생육가능한 세포 밀도다. 특이적 성장률 (μ)은 주어진 시점에서 세포 성장 속도를 이 시점에서의 생육가능한 세포 밀도로 나눈 것으로 표시된다. μ은 다음의 상관관계를 이용하여 산출될 수 있다:

이때, X₂ 및 X₁은 각각 최종 및 최초 생육가능한 세포 밀도이며, t₂ 및 t₁은 각각 최종 및 최초 시기다. 생물반응기의 용량(V)은 생물반응기 안에서 임의의 주어진 시기에 총 배양물 용량으로 구성된다. 한 구체예에서, 공급 함수는 F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)의 형태를 취하고, 하기에서 나타낸 것과 같이 유도된다.

생물반응기 안에서 주어진 영양분의 양적 균형은 식 (1)에서 설명되는데, 여기에서 F는 영양분의 주입 유속이며, S_i는 생물반응기 안에 최초 영양분 농도이며, S_o는 영양분 비축 농도이며,

는 영양분 산출량에 대한 최대 세포 밀도이고, μ은 특이적 성장률이고, X는 세포 밀도이며, V는 생물반응기의 용량이다.

연속 공급과 조합되어 정상 상태(steady state) 영양분 농도를 추정함으로써, 이 식은 식 (2)로 감축된다,

여기서 특이적 영양분 소모

및 세포 성장은 XV=

에 의해 나타내며; X_i 및 V_i는 공급 시작시 각각 최초 세포 밀도와 생물반응기 용량을 나타낸다. 식 (2)는 하기와 같이 식(3)으로 단순화시킨다,

여기서

식 (3)은 그러나, 세포가 정체 상태(stationary phase)로 진입될 것이고, 그 다음 신속하게 사멸 상태(death phase)로 진입되기 때문에, 기하급수 상을 지난 세포 배양물 성장에는 적용될 수 없다. 따라서, 세포가 일단 사멸 상태에 있게 되면 공급을 감소시키기 위한 함수가 요구된다. 공개된 방법의 개발 동안 실행된 실험들에서, 전체적인 생산 기간에 걸쳐 특이적 성장률 (μ)이 플롯되고, 특이적 성장률 μ은 CHO 세포의 경우 시간의 경과에 따라 감소된다. 이것은 연구된 각 다중 세포 계통에서도 일관적으로 발견되었다. 시간에 대하여 μ에 대한 선형 경향의 피팅(fitting)은 양호한 적합(fit)을 보여주었고, 따라서 μ은 선형 식에 의해 나타낼 수 있다

여기서 K₂₁은 항상 음수이며, K₂₂는 항상 양수이고, 그리고 ｜K₂₂>>K₂₁｜이다. 식 (6)을 식(3)으로 치환시키면 공급 함수가 생성된다

식 (7)은 연속 공급 기획 및 실험 모두에 대한 기본을 형성한다. 식 (7)은 공급 프로파일에 곡률(curvature)을 제공하고, 따라서 현상이 단순히 기하급수적으로 상승되지 않는다. K₂₁은 항상 음수이기 때문에, 시간이 증가됨에 따라, 전체적인 K₂₁t²+K₂₂t는 음수가 되기 시작할 수 있고, 그 다음 공급 현상은 감소될 것이다. K₁은 이 값이 더 커짐에 따라 전체적인 공급 현상의 크기를 증폭시킨다.

K₁에 있어서, 식 (4)에서 q_s는 전체적인 생산에 걸쳐 일정불변의 값으로 간주된다. q_s는 포도당과 같은 특정 기질 소모율이다. 이것은 특이적 성장률(μ)을 기질 산출량에 대한 최대 세포 밀도(

)로 나눔으로써 산출된다. 이들 용어들은 위에서 설명되었다. 상수 q_s는 다중 세포 계통에 있어서 포도당으로 연구되었고, 그리고 세포가 정점 세포 밀도에 도달된 후, 가령, 7일 이후 q_s가 일정하게 유지된다는 가정은 일반적으로 사실이라는 것이 관찰되었다. 따라서, q_s가 일정하게 유지된다는 가정은 공급 함수를 단순화시키고, 최적화를 위한 3개의 K 변수들이 이미 존재한다면, 이 가정은 공급 함수에 큰 영향을 주지 않는다.

q_s가 일정하게 유지된다는 가정이 맞고, 공급 함수의 유도를 단순화시킨다면, 이 가정은 또한 일부 경우에서 좀더 정확한 공급 함수를 실행할 수 있는 변수를 또한 제거한다. 따라서, q_s에 대하여 좀더 정확하게 맞춤이 만들어질 수 있다는 것도 생각할 수 있다. 좀 더 높은 자유도(freedom)를 가진 공급 함수를 유도하기 위하여 좀더 정확하게 맞춰진 q_s 값이 식(7)에서 K₁을 대신할 수 있을 것이다. 이러한 추가적인 자유도를 추가함으로써, 더 높은 해결(resolution) 공급 함수를 얻는 것은 가능할 것이다. 이러한 좀 더 정확하게-맞춰진(fitted) 공급 함수가 공개된 방법들의 한 측면을 이룬다.

용량 식의 유도

본 명세서에서 나타낸 것과 같이, 주어진 세포 배양물의 독특한 요구에 부합된 공급 함수가 제공된다. 이 공급 함수는 세포 배양물의 영양분 요구를 나타내지만, 주어진 배양물에 추가될 농축된 영양분 비축분의 총 용량을 설명하는 용어를 명시적으로 제공하지 못한다. 이 양은 다음과 같이 공급 함수 자체로부터 유도될 수 있다.

공급 함수로부터 공급되는 농축된 영양분 비축분의 총 용량을 산출하는 능력은 프로세스 개발 응용에 공개된 방법의 사용을 고려하는 것이다. 세포 배양물로 공급될 공급 함수에 의해 나타내는 영양분을 포함하는 용액의 액체 용량의 이해는 바람직한 공급 용량의 기획, 용량 데이터의 피팅으로부터 K값을 생성하는 능력, 그리고 컨트롤러 상에서 용량 사용을 추적하는 능력을 용이하게 한다. 그러므로, 공급 함수에 의해 공급되는 용량의 산출은 연속 공급의 적용에 있어서 유가(valuable) 매개변수다. 용량 식은 식(8)에 나타낸 것과 같이 공급 함수를 통합시킴으로써 유도된다,

여기서

정확성을 위하여 처음 5개의 통합된 조건을 이용하여 용량 식을 만들기 위한 적분에서 지수 조건의 근사화(approximate)에 Maclaurin 시리즈가 이용된다.

여기서

최종 용량 식은 식 (12)에 나타내고, 시리즈의 5개 조건 모두 이용된다.

자동화된 연속 공급 방법

많은 단백질 생산 프로세스에서, 작업자는 생물 반응기에 연계된 피이드백 기계를 감시해야 하고, 주어진 세포 배양물의 국소 환경, 건강, 세포 밀도 및 단백질 생산에 관한 데이터를 얻는다. 이 데이터는 다시 작업자에게 제공되며, 작업자는 생물반응기 안에 선호되는 조건들이 유지되도록 데이터에 따른 성장 조건들을 조정한다.

공개된 방법들의 한 가지 장점은 완전하게 자동화된 방식으로 이 방법을 운용할 수 있고, 따라서 세포 배양물에 대한 데이터를 얻기 위하여 헌신하는 작업자 및 전용 기계의 필요성이 없어진다. 이것은 강화된 효과, 인적 및 물질적 자원의 견지에서 비용 절감, 그리고 작업자 편견 또는 실수에 대한 가능성을 최소화하는 능력 및 피이드백 기계(가령, 아미노산, 비타민 및 탄소원의 경우 HPLC; 포도당 및 젖산염 분석기(Nova Profiler 및 YSI Instruments); 세포 카운터(Cedex, 및 Vi-Cell); 생물반응기 즉석(in situ) 프로브(가령, pH, 용존 산소, 탁도, 정전용량, 및 NIR 프로브), 삼투압계 및 기타 기계들의 오류와 연관된 생산 문제들이 완전하게 제거될 수 있을 것이다.

흔히 세포 배양물 성장은 피이드백 기계로부터 배양물의 상태에 대하여 얻은 데이터에 응답하여 성장하는 배양물에 제공되는 공급원료의 내용물 및 용량을 지속적으로 감시하고 피이드백 기계로부터 배양물의 상태에 대하여 얻은 데이터에 응답하여 이를 조정하는, 점차 진전되는 실증적 행위로 처리된다. 공개된 방법으로 실행될 경우 이런 것은 필요 없게 되는데, 이 방법은 특정 세포 배양물에 맞출 수 있으며, 주어진 세포 배양물의 독특한 많은 성질과 요구들이 고려되기 때문이다.

공개된 방법은 관심대상 단백질의 강화된 생산을 또한 제공할 수 있다. 이 방법은 특정 세포 배양물에 최적화된 공급 함수를 포함하기 때문에, 배양물은 세포 배양물의 건강 및 생산성을 최대화시키고, 결과적으로 세포 단백질 생산을 최대화하는 조건들하에서 지속적으로 성장한다. 따라서, 또다른 장점은 주어진 세포 배양물에 대하여 최대 단백질 생산을 제공함으로써 이 방법은 비용 및 재원 절감을 부여한다.

한 구체예에서 이 방법은 다음과 같이 실행된다: 우선 세포와 배지를 포함하는 세포 배양물이 든 용기가 제공된다. 지적된 바와 같이, 공개된 방법은 임의의 바람직한 규모에서 실행될 수 있기 때문에, 따라서 제공된 용기는 임의의 규모일 수 있고, 반드시 청결하고 살균되어야 한다. 예를 들면, 소규모로 작업할 때, 용기는 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 50 L 생물반응기를 포함할 수 있고; 더 큰 규모에서 작업할 때, 용기는 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 또는 2000 L 생물반응기를 포함할 수 있으며, 또는 산업 규모에서 작업할 때, 용기는 5000, 7500, 10.000 또는 15,000 L 생물반응기를 포함할 수 있다. 이 방법에 이용된 임의의 용기는 1회용 용기, 이를 테면, 생물반응기로 쓸 수 있도록 개조된 연성 플라스틱 구조(가령, 살균된 플라스틱 주머니), 또는 경질의 1회용 플라스틱 플라스크 또는 탱크를 포함할 수 있다.

제공된 용기는 살균되고, 적절한 배지로 채워지고, 세포를 포함하는 세포 배양물이 도입된다. 그러나, 세포는 관심대상 단백질을 발현시키도록 개조될 필요는 없다; 즉, 이 방법은 관심 대상의 특정 단백질을 발현시키도록 개조되지 않은 세포 배양물, 또는 단백질 생산 이외의 목적으로 테스트된 또는 연구된 배양물을 포함하는 임의의 세포 배양물에서 실행될 수 있다. 세포는 포유류 세포, 가령 CEO 세포를 포함할 수 있고, 비록 이 방법이 내생성 단백질의 생산을 최적화하기 위하여 실행될 수 있지만, 관심 대상의 단백질을 발현시킬 수 있도록 조작될 수 있다. 다양한 구체예들에서, 세포는 임의의 진핵세포, 이를 테면 임의의 포유류 세포일 수 있고; 특정 실시예에서 이 세포는 CHO, NSO, BHK21, PER.C6 또는 HEK 293 세포이다. 이 세포는 항체 또는 Fc 융합 단백질을 포함하는 Fc-함유 분자를 발현시킬 수 있다. 항체가 발현될 때, 마우스 및 인간을 포함하는 임의의 종으로부터 항체가 유도될 수 있고, 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.

도입된 세포 배양물은 임의의 수의 세포를 포함할 수 있다. 일부 응용에서 이 방법은 냉동 슬랜트(slant)로부터 직접 취한 세포의 성장을 강화시키는데 이용될 수 있으며, 한편 기타 응용에서, 용기 안으로 도입에 앞서 원하는 양으로 세포를 증식시킬 수 있다.

세포가 성장하는 배지는 임의의 조성물일 수 있지만, 세포 배양물이 제공될 때마다 이 배양물의 성장을 뒷받침할 수 있도록 선택되는 것이 바람직하다. 이 방법에 이용될 수 있는 예시적인 배지는 MEM, DMEM, 그리고 혈청 보충된 F12 또는 MCDB 302와 같은 화학적으로-특정된 배지를 포함한다. 가령, 이용될 수 있는 추가 예시적인 배지 공식(formula)에 대하여 Freshney, Culture of Animal Cells, 5^th 판, Wiley-Liss (2005). 이 방법은 또한 펩톤 및 이스트 추출물을 이용하는 복합 배지에도 적용될 수 있다.

이 방법에 계속적으로, 세포 배양물의 기질 소모율 (K₁), 성장률 (K₂₁) 및 성장률 (K₂₂)에 대한 바람직한 값들이 결정된다. 공급 함수 F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)를 이용하기 위하여, 매개변수 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 이론적 산출을 이용하여 우선 결정될 수 있다. 즉, 이들 값은 세포의 알고 있는 성질들, 이를 테면, 특이적 성장률, 기질 산출량에 대한 최대 세포 밀도 및 특이적 기질 소모율의 외삽에 근거하여 결정될 수 있다. 이들 성질은 관심 대상의 세포 계통에서 실행되는 세포 배양 실험에 앞서 결정될 수 있고, 또는 관련 문헌들을 참고하여 알 수 있다. 이들 값은 성능을 최적화시키기 위하여 이들 매개변수들의 추가 실험적 개발을 위한 출발점으로 삼을 수 있다.

일부 경우에서, 이론적으로 산출된 K 값들은 충분히 예측가능할 것이며, 그리고 공급 함수에 직접적으로 통합될 수 있다. 다른 경우에서, 계산된 값을 최적화시키기 위하여, 하나 또는 그 이상의 테스트 배양물과 이로부터 유도된 성장 시간, 배지 성분, 영양분 요구, 공급 개시 시점 등에 관한 실질적인 데이터를 이용하여 이론적으로 산출된 K 값들을 더 다듬는 것이 바람직할 것이다.

K₂₁ 및 K₂₂에 대한 최초 이론 값을 산출하기 위하여, 관심대상의 주어진 세포 배양물의 특이적 성장률(μ)은 테스트 배양물을 이용하여 결정되거나 또는 기존의 알려진 성장률로부터 추출될 수 있고, 생산 시간의 일정에 따라 플롯된다. 그 다음 이 플롯의 선 회귀 피트(linear regression fit)가 실시되어, 직선 식 μ=K₂₁t+K₂₂ 을 얻고, 이때 K₂₁은 기울기 값을 나타내며, K₂₂는 직선 피트의 y-인터셉터 값을 나타낸다. K₂₁ 및 K₂₂에 대한 결정된 값들은 공급 함수 F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)로 다시 치환되어, 제공되어야 할 변수는 K₁와 t만 남게 된다.

K₁은 식 (4)를 이용하여 이론적으로 산출될 수 있다;

K₁의 계산에서 나타나는 매개변수 q_s는 특이적 영양분 소모율이며, 식

에 근거하여 세포 배양물 데이터로부터 산출된다. q_s는 포도당의 경우에서와 같이 일정불변인 것으로 추정된다. X_i와 V_i는 각각 최초 세포 밀도와 최초 용기 용량다. S_o는 공급되는 기질, 가령, 포도당의 비축 농도다. S_i는 용기 안에 최초 영양분 농도다. 이용가능한 이들 모든 값으로, K₁은 바로 산출될 것이며, 공급 함수로 다시 대용될 수 있다.

K₁을 결정한 후, 공급 함수 F의 3가지 매개변수 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 모두 알고 있는 값이다. 공급 속도는 시간에 대한 함수로써 생산 과정에 따라 변화될 것이지만, 공급 함수는 이들의 일시적인 변화를 고려하고, 따라서 배양물이 영양분을 필요로 하는 정확한 시기에 배양물에 의해 영양분이 정확하게 제공된다. 그 다음 기능은 컨트롤러 모듈로 입력될 것이며, 이는 공급 프로세스의 시작, 조절 및 종료시키는데 이용될 수 있다.

이 방법으로 계속해서, 그 다음 세포 배양물로 연속 공급 흐름을 공급하는데 적합한 장치가 제공되는데, 여기에서 장치는 유속 F 에서 배양물을 연속적으로 공급하는데 적합한 컨트롤러 모듈을 포함하고, 여기에서 F 는 K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t) 로 정의되며; t는 배취(batch) 공급 흐름이 생물반응기에 첨가되는 공급 프로토콜의 시작 시점에서 공급이 종료되는 시점까지의 시간이며, 그리고 K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 상기에서 설명된 것과 같이 측정된 값들이다.

본 명세서에서 기술된 것과 같이 K₁, K₂₁ 및 K₂₂을 결정하고, 세포 배양물에 연속 공급 흐름을 부여하는데 적합한 장치가 제공되며, 여기에서 장치는 공급 함수에 따라 유속 F 에서 배양물에 연속적으로 공급하는데 적합한 컨트롤러 모듈을 포함한다. 이러한 장치는 저장기로부터 조절된 속도에 의해 생물반응기로 액체 공급 흐름을 이동시키는 수단, 그리고 공급 프로파일에 따라 저장기로부터 생물반응기로 공급 흐름의 흐름을 개시 및 유지시킬 수 있는 컨트롤러 모듈을 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예는 Delta V 컨트롤러 모듈 (Emerson, St Louis, MO), 컨트롤러-조절된 펌프 (가령, Applikon Biotechnology, Foster City, CA; Cole-Parmer, Vernon Mills, IL; Watson-Marlow, Wilmington, MA; 및 SeiLog, Middleton, WI와 같은 공급업자로부터 이용가능한 것들)를 포함할 수 있다. 이 펌프는 세포 배양물 양립가능한 튜브(가령, Cole-Farmer, Vernon Hills, IL에서 이용가능한 튜브)에 의해 연결되며; 한 쪽 끝은 공급 액체 용기이며, 다른 끝은 생물반응기다.

한 특정 구체예에서, 3가지 K 값과 공급 시기 t는 연속 공급 함수에 입력되고, 컨트롤러 모듈, Delta V 컨트롤러 모듈 (Emerson, St Louis, MO)에 프로그램된다. 컨트롤러 모듈은 공급 함수 F의 명령에 의해 생물반응기로 공급 양을 지속적으로 이동시키기 위하여 공급 용기에 연결된 의해 명령된 펌프 (가령, Applikon 생물반응기 통합된 펌프; Applikon Biotechnology, Foster City, CA)를 조절한다. 배양물의 특정 요구에 따라, 생물반응기로 이동되는 공급 흐름의 용량 및 양은 공급 함수 F에 따라 속도가 변화되기 때문에 변화될 것이다. 컨트롤러 모듈은 공급 공식(formula) F에서 설명된 것과 같이 임의의 주어진 시점에서 배양물로 제공되는 공급원료의 용량을 조절한다.

공급물 이동을 실행하는데 이용되는 임의의 설비(가령, 펌프(들) 및 튜브)는 공급 공식(formula)을 사용하기에 정확한 펌프 구경측정 값을 확립하기 위하여 펌프 출력과 측정된 유속을 이용하여 앞서 산출될 수 있다. 이 값은 컨트롤러에 의해 이용되어, 공급 함수 F에 의해 설명되는 유속을 펌프에 의해 전달되는 용량 측정으로 전환될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 실시예들에서 설명된 것과 같이, 이와 같은 운반 시스템은 2L 생물반응기에 이용되었다. 500L, 2000L 및 15,000L와 같은 더 큰 규모의 경우, 운반 시스템은 대량 흐름 컨트롤러 또는 무게 저울 입력을 이용하는 것이 바람직하지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 둘 모두 대규모에서 공급을 위하여 확립되었고, 설비는 증명되었다.

이 방법의 후속 단계에서, 컨트롤러 모듈은 세포 배양물의 연속 공급을 개시하기 위하여 활성화된다. 컨트롤러 모듈에서 프로그램이 시작될 때, 매개변수/공급함수에 의해 설명된 기간 동안 예정된 시점에서 공급 함수에 의해 명령된 것과 같이 사전결정된 공급 시간에 걸쳐 계속 변화되는 공급 속도(가령, 저장기로부터 용기 안으로 영양분의 흐름)와 함께 공급이 개시된다.

컨트롤러 모듈이 배양물의 연속 공급을 활성화시키는 촉발 시점 또는 조건은 단백질 생산 프로세스의 성격 및 목표에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에서, 배양물은 설정 양의 최초 영양분을 제공받고, 최초 공급원료로부터 잔여 영양분이 특정 최저 목표 수준에 도달하는 후속 시점에서 연속 공급이 개시된다. 다른 경우에서, 최초 영양분이 배양물에 제공되지 않고, 공급 함수에 의해 요구되는 경우에만 이 방법의 시작으로 영양분이 제공된다.

연속 공급이 개시될 수 있는 촉발 조건의 추가 예로는 배양물이 지정된 생육가능한 세포 밀도 (VCD)에 도달한 시점 또는 배양물이 지정된 잔류 부산물 수준에 도달한 시점을 포함한다. 이들 촉발 조건(이 방법을 시작하기 앞서 테스트 배양물을 이용하여 확인할 수 있는)중 하나 또는 그 이상이 성립될 때, 관찰된 촉발 조건들은 연속 공급의 개시를 위하여 시간 토대로 전환될 수 있다. 즉, 특정 촉발 조건에 도달하는 시점을 결정하기 위하여, 테스트 배양물에 최초 공급원료가 제공되고, 배양물이 성장함에 따라 연구될 수 있으며, 컨트롤러 모듈은 이 시점에서 공급 함수를 활성화시키도록 설정될 것이다.

감시될 수 있는 잔여 영양분의 한 가지 특정 예는 포도당이며; 최초 포도당 수준이 세포 성장에 더 이상 충분하지 않은 수준으로 떨어지는 시점은 촉발 조건 또는 컨트롤러 모듈이 연속 공급을 개시하는 시점으로 삼을 수 있다.

또다른 실시예에서, 생육가능한 세포 밀도가 촉발 조건으로 이용될 수 있다. 한 가지 특정 실시예에서, 생육가능한 세포 밀도 목표는 ~5x10⁶ 세포/mL이며, 세포가 기하급수적 상태(exponential phase)로 막 진입하려는 시점에 해당된다.

여진히 또다른 실시예에서, 부산물 축적 수준이 촉발 조건으로 이용될 수 있다. 한 가지 특이적 실시예에서, 부산물 젖산염의 ~0.5 g/L이상의 축적은 촉발 조건으로 삼을 수 있고, 이에 부합될 때 연속 공급을 개시함으로써 과잉공급을 방지함으로써 낮은 수준의 젖산염을 유지할 수 있다.

공급 함수의 최적화

본 명세서에서 언급된 것과 같이, K₁, K₂₁ 및 K₂₂의 이론값은 최초 값을 제공하기 위하여 산출될 수 있지만, 공개된 방법들의 또다른 측면에서 계산된 값들은 임의선택적으로 최적화될 수 있다. K₁, K₂₁ 및 K₂₂ 값을 최적화시키기 위하여, "실험 기획" (DOE) 방식이 적용되어 3가지 K₁, K₂₁ 및 K₂₂ 매개변수 각각에 대한 주어진 범위를 평가할 수 있을 것이다. 이 범위는 최초 배양물에서 관찰되는 성능에 근거하여 결정되는데, 이때 K₁, K₂₁ 및 K₂₂의 이론 값은 공급 함수에 이용되었다. 최적화 프로세스에서 테스트된 범위는 공급되어야 할 바람직한 기질 용량의 총 양 (식 12를 이용하여 상기에서 설명된 것과 같이 결정될 수 있다)으로 안내된다.

공급 함수에서 최적화되어야 하는 것으로 보이는 4번째 매개변수는 총 공급 시간 (t)이다. 공급 함수에서 t가 총 운용 시간에 도달하면, 공급은 중단되어야 한다. 총 운용 시간은 이 배양물로 공급되는 총 기질 용량과 배양물이 공급을 필요로 하는 기간과의 균형을 맞추는데 이용된다. 예를 들면, 공급 함수에서 총 공급양은 더 적으면서, 더 오랜 시간에 걸쳐 배양물을 공급하는 것이 바람직한 경우, t는 증가될 것이며, K₁은 감소될 것이다.

한 구체예에서, 실증적 방법을 이용하여 K₁, K₂₁ 및 K₂₂ 값을 계산할 수 있다. 이론적인 것보다 실증적으로 최초 K₁, K₂₁ 및 K₂₂ 값을 얻은 장점은 실증적 방식이 더 정확한 값을 만들고, 이는 이 방법이 이용될 때 강화된 성능 및 단백질 생산으로 이어진다.

또다른 측면에서, K₁, K₂₁ 및 K₂₂을 더 잘 측정하기 위하여, 배양물에 대한 용량 기질 소모율 (g/hr)은 실제 집중적 공급 생산 데이터에 근거한 데이터를 이용하여 우선 계산된다. 용량 기질 소모율은 이 방법에서 이용될 세포를 포함하는 테스트 배양물을 운용하고, 그리고 표준 세포 배양물 영양분 분석기 (가령, Nova Profiler 또는 YSI Instruments에서 제작한 모델 YSI 7100, YSI 1500, YSI 5300, YSI 2300 및 YSI 2700 분석기 유닛을 포함하는 분석기들)를 이용하여 기질 소모를 감시함으로써 결정된다. 그 다음 용기 용량 및 기질 비축 농도의 공지의 성질들에 근거하여 결정된 희석 인자(dilution factor)는 기질 소모율에 적용되어, 이 배양물이 요구하는 기질의 양을 전달하는데 필요한 기질 공급 속도로 전환된다. 그 다음 산출된 기질 공급 속도는 생산 시간의 일정에 대해 플롯된다. 공급 함수, F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)가 이용되어, 이 구성에 최적화시킨다. 이 프로세스는 K₁, K₂₁ 및 K₂₂에 대하여 최상의 맞춤 값을 만든다. 임의선택적으로, 이들 값은 DOE 방식 또는 단순한 단일 인자 방식을 이용하여 성능의 추가 최적화를 위한 출발점으로 이용될 수 있다.

추가적인 최적화 방식

연속 공급 함수는 세포 배양물 체계 안에서 특정 영양분의 양적 균형에 근거하여 유도될 수 있다. 이 방식에서, 세포 성장 모델은 공급 함수를 해결하기 위하여 이 유도화에 통합된다. 한 예에서, 특이적 선형 성장률 모델은 이러한 유도화에 이용될 수 있다. 이것은 공급 함수, F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)를 제공한다. 이 공급 함수를 이용하여 세포 배양물 안에 영양분, 예를 들면 포도당, 아미노산 등의 연속 공급을 실행한다. 이 식에서 F는 영양분 유속이며, t는 배양물의 경과된 시간이며, K₁은 기질 소모를 설명하는 매개변수이며, K₂₁ 및 K₂₂는 모두 배양물의 성장 프로파일을 설명한다.

그러나, 이것이 연속 공급 함수가 생성될 수 있는 유일한 방식은 아니다. 또다른 방식에서 설명된 특이적 선형 성장률 모델을 이용하는 대신, S자형 모델이 배양물의 특이적 성장률을 설명하는데 이용될 수 있다. S자형 특이적 성장률 모델은 특이적 선형 성장률 모델을 이용하여 생성된 것과는 상이한 공급 함수를 만들 것이다. 이러한 S자형으로 유도된 공급 함수는 이의 특정된 매개변수들이 모든 세포 계통에 대해 최적화된다면, 선형으로 유도된 공급함수와 마찬가지로 동등하게 작용할 것이다.

공급 함수를 유도하는 또다른 예에서, 특이적 성장률을 표준화하기 위하여 선형 또는 S자형 식을 이용하는 대신, 성장 프로파일에 부합되는 실증적 공급 함수를 만들기 위하여 세포 성장 곡선이 표준화될 수 있다. 이러한 공급 함수는 피트 양호도(goodness of fit)에 따라 2차 또는 그 이상의 고차원의 다항식일 것이다. 따라서, 공급 함수는 특이적 성장률에 대하여 표준화하기 위하여 선형 또는 S자형 기능을 이용하여 최적화되거나, 또는 전체적으로 새로운 공급 함수는 성장 또는 영양분 곡선에 다항적 맞춤에 근거하여 유도화될 수 있고, 개발 용도를 위한 식의 단순화, 공급 프로파일을 조작하기 위하여 강화된 자유도의 필요 또는 실질적 세포 성장 또는 영양분 소모 프로파일에 직접적 맞춤과 함께 개선된 정확성의 필요를 포함하는 임의의 숫자의 인자들을 고려하여 어떤 기능을 이용할 것인지를 선택한다.

다중 영양분을 함유하는 공급물을 위한 공급 함수

한 측면에서 상기에서 명세서는 단일 영양분을 포함하는 공급 함수에 관계되었거나, 또는 영양분 혼합물을 포함하나, 공급 함수에서는 오로지 하나만 고려되는 공급물 흐름들에 관한 것이었다. 공개된 방법들은 그러나, 단일 영양분에 한정되지 않고, 다중 영양분 흐름 또는 다중 영양분을 포함하는 공급 비축물에 적용될 수 있다. 공개된 방법들은 혼합된 기질 공급물을 이용하여 연속 공급이 실행될 때 상이한 방식이 취해지기는 하지만, 2종 또는 그 이상의 영양분을 수용하는 공급 함수에 바로 통합되도록 개작될 수 있다.

다중 영양분을 포함하는 공급물 흐름이 이용될 때, 전체 혼합물에 대해 특이적 K₁, K₂₁ 및 K₂₂ 값을 계산하는 것이 어렵다. 단일 공급물 흐름에서 다중 영양분을 설명하는 한 가지 방식은 혼합된 영양분 공급물 흐름에 대해 최초 K₁, K₂₁ 및 K₂₂를 만드는데 필요한 데이터를 생성하기 위하여 공급물 안에 하나의 기질을 선택하는 것이다. 예를 들면, 포도당 및 기타 영양분을 포함하는 공급물 흐름을 이용할 때, 복합 공급물 흐름의 포도당 성분만이 감시되도록 선택할 수 있다. 이 흐름에서 포도당 성분의 대사로부터 획득된 데이터(가령, 시간에 대한 함수로써 소모율)를 이용하여 K₁, K₂₁ 및 K₂₂를 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 세포 성장, 생존력 및 생산에 필수적인 또는 상당히 이용되는 기질을 추적하는 것이 바람직할 것이다.

그 다음 최초 K 값들은 전체적인 공급 혼합물에 대해 최적화된다. 이 공급물은 다양한 농도의 다중 기질을 함유하기 때문에, 최적의 성능을 얻기 위하여 실증적 테스트가 바람직하다. 다중 기질에 대한 공급 함수의 최적화에 추가하여, 연속 공급 속도에 가장 잘 맞도록 영양분 농도를 조절하기 위하여 성장 배지가 개발될 수 있다.

실시예

실행된 실험들과 얻은 결과들을 포함하는 다음의 실시예들은 오로지 설명을 위하여 제공되는 것이며, 이에 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

재료 및 방법

세포 계통

3가지 세포 계통. 각각 상이한 단클론 항체들을 인코드하는 세포 계통 1, 세포 계통 2 및 세포 계통 3이 연구되었다. 세포는 3-4일간의 일정으로 진탕 플라스크(Corning, NY)에서 계대되었고, 해동된 후, 100㎍/L IGF-1 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 및 500 nM MTX (Bedford Laboratories, Beford, OH)가 보충되었다. 계대 조건은 36℃, 5% CO₂, 그리고 Thermo Electron Corporation, Waltham, MA의 진탕 플랫폼을 이용하는데 125mL 및 500mL 플라스크의 경우 160rpm, 3L 플라스크의 경우 90rpm이었다.

세포 계통 3 세포를 이용하여 N-1 용기에 0.75e⁶ 세포/mL로 접종하였다. N 생산 용기에 세포 계통 1과 연속 공급을 테스트하는 처음 세포 계통 2 실험은 1.0e⁶ 세포/mL로 접종되었다. 그 다음 후속 세포 계통 2 및 세포 계통 3 실험은 1.4e⁶ 세포/mL로 접종되었다. 결과 및 논의 부분에서 설명된 것과 같이 생산 기간은 상이한세포 계통에 대해 다양하였다.

세포 계통 간에 집중적 공급 전략은 다양하였다. 아래 결과 및 논의 부분에서 공급 용량 및 공급 일수가 설명된다. 집중적 포도당 공급물은 둘째 날에 시작하여 매일 6 g/L로 공급되었다.

분석 기술

VCD 및 생존력은 CEDEX 기계 (Innovatis, Germany)에서 측정되었고, 대사산물은 NOVA BioProfile 100+ (NOVA Biomedical, MA)에서 측정되었다. pH 및 가스는 Bioprofile pHox (NOVA Biomedical, MA)에서 분석되었고, 삼투질농도는 삼투압계(Advanced Instruments, Norwood, MA)에서 분석되었다.

역상-HPLC 분석에 의해 역가가 측정되었다. 이 분석은 친화력 크로마토그래피를 이용하였는데, 여기에서 단백질 A는 컬럼 서프트에 고정되었다. 중성 pH에서, 단클론 항체들 (mAb) 분자들은 Fc 부위를 통하여 단백질 A에 결합되었고, 한편 숙주-세포 단백질들, 조건화된 배지 성분과 완충액은 컬럼을 통과하는 흐름으로부터 용리되었다. 포획된 mAb들은 산성 pH에서 용리되었고, 280 nm에서 UV 흡수에 의해 탐지되었다. 구경측정 곡선은 범용 mAb 표준과 선형 회귀 분석을 이용하여 대응하는 피크 면적으로부터 유도되었다. 테스트 시료 안에 mAb의 농도는 구경측정 곡선으로부터 산출되었으며, 소멸 공동계수의 비율은 범용 mAb 표준 및 테스트된 mAb 테스트로부터 산출되었다.

결과 및 토의

연속 공급 방법과 집중적 공급 방법의 비교

세포 계통 1을 제 1 모델 세포 계통으로 이용하여 연속 공급 함수 F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)을 테스트하고, 집중적 공급을 이용한 세포 배양물 성능과 비교하여 세포 배양물 성능이 어떤지를 연구하였다. 한 가지 목적은 세포 배양물 페드-배취로써 생육가능한 치환물로써 연속 공급 모델의 응용을 설명하는 것이었다. 포도당을 연속적으로 공급하고 특정된 범위 안에서 이 농도를 유지시키는 공급 함수를 이용하는 능력은 또다른 목적이며, 그리고 수작업 집중적 포도당 공급보다 개선이었다.

세포 계통 1에 대해 연구된 집중적 프로세스는 13일 생산 프로세스이었다. 집중적 포도당은 일일 최대 6 g/L 추가되었다. 집중적 공급물은 5, 7 및 9일차에 각각 138mL의 용량으로 최대 414mL 공급물이 추가되었다.

공급 함수를 적용하기 위하여, K 값을 결정해야만 한다. 이론적인 방식을 이용하여, K₁ 값은 특이적 포도당 소모율, 및 최초 포도당, 공급 시작시 생육가능한 세포 밀도 및 배양물 용량 수준을 이용하여 식(4)에 의해 근사값이 정해질 수 있다. K₂₁ 및 K₂₂ 값은 세포 계통의 특이적 성장속도 시간 일정에 대해 1차원 선을 피팅함으로써 근사값을 얻을 수 있고, 이때, K₂₁은 기울기이며, K₂₂는 y-인터셉터이다.

K₁, K₂₁ 및 K₂₂를 결정하는 이론적 방식은 이의 용이함 및 단순함으로 인하여 우선 호의적이었지만, 궁극적으로 실증적 방식을 추구하도록 결정되었고, 이는 좀더 정확한 K 값을 제공한다. 실증적 방식을 이용하여, 집중적 공급 운용으로부터 생성된 실질적인 포도당 소모 용량 데이터에 부합되도록 공급 함수 F를 피팅시킴으로써 K 값들이 결정되었다. 도 1은 공급 함수 용량 식이 포도당 용량 소모 데이터 곡선에 가깝게 맞추어지는 지를 도표로 보여주는 한 가지 예다. 이 데이터 세트의 경우, 피트 양호도는 K₁=0.04, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0348의 K값을 만들었다. 따라서, 이러한 K 값 세트를 테스트의 한 조건을 이용하였다. 유사하게, 다른 K 값 세트는 또다른 집중적 공급 운용의 포도당 데이터에 공급 함수 용량 식을 피팅함으로써 생성되었다.

포도당 소모 용량 곡선에 가장 잘 피트된 몇 가지 K 값 세트들이 평가를 위하여 선택되었다. 도 2는 세포 계통 1을 테스트한 3가지 연속 포도당 공급 함수를 보여준다. 각 공급 함수에 대한 K 값은 범례에서 설명된다. 각 공급 함수는 상이한 유속 프로파일 및 추가된 상이한 총 포도당 용량을 생성하였다. 이 생산과정을 통하여 포도당 농도를 한 범위 안에 일관되게 잘 유지되는 지를 보기위하여 실증적으로 테스트되었다.

3가지 상이한 연속 영양분 혼합물 공급 프로파일은 상기에서 설명된 연속 포도당 공급중 하나와 조합되어 또한 테스트되었다(K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0331). 하나는 세포 배양물 성능에서 선형 용량 운반 프로파일을 평가하는 2.875mL/hr의 불변 연속 공급 속도다. 다른 두 가지 연속 공급물은 원래 기하급수적인 공급 함수를 이용하였다(도 3). 이들 두 연속 공급 운용에 대한 K 상수는 도 1에서 설명된 다른 두 연속 포도당 공급 운용의 K₂₁ 및 K₂₂ 값을 이용하고, 그리고 5일차 내지 9일차에 걸쳐 공급된 총 용량 414mL의 총 용량과 부합되도록 K₁을 역산출함으로써 단순하게 유도되었다. 테스트된 이들 K 상수들은 공급 함수에서 K 값들을 평가하기 위한 출발 점으로만 이용된다. 이들 연속 공급 운용은 도 3에 나타낸 것과 같이 표준 집중적 공급 운용에 비교되었다. 집중적 공급은 3회에 걸처 각 138mL 씩 제공되었다. 생산 종료시 414mL의 동일한 총 용량을 운반하기 위하여 4가지 공급 전략이 기획되었다. 따라서, 세포 배양물 성능에서 임의의 차이는 제공된 용량이 아니라 오로지 상이한 공급 전략 경향에만 기인될 것이다. 요약하자면, 두 가지 연속 공급 흐름을 이용하여 운용되었는데, 하나는 포도당이며, 다른 하나는 영양분 혼합물이다. 한 가지 조건은 공급 함수를 이용하여 연속 포도당 공급과 짝지어진 영양분 혼합물의 불변 유속 연속 공급이었다. 나머지 2개는 상기에서 불변 흐름으로 동일한 연속 포도당 공급과 짝지어진 2개의 상이한 연속 영양분 혼합물 공급이다. 네 번째는 표준 집중적 포도당 및 집중적 영양분 혼합물 공급 운용이었다.

도 4는 세포 계통 2에 적용된 연속 공급 모델의 결과를 보여준다. 도 4a의 데이터는 연속 포도당 공급이 특정된 포도당 농도 범위 안에서 잔여 포도당 농도를 일관되게 성공적으로 유지시킬 수 있다는 것을 설명한다. 닫힌 원 (●)으로 나타낸 운용은 이중 연속 포도당 (K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0331) 및 공급 (K₁=0.96678, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0288)의 운용이다. 이 운용의 포도당 농도 범위는 2 - 4 g/L 사이다. 개방 원 (○)으로 나타낸 집중적 포도당은 매일 6g/L로 수작업에 의해 공급된 결과 예상된 그리고 일반적으로 관찰된 진동 패턴(oscillatory pattern)을 보여주었다. 다른 연속 포도당 운용은 시간의 경과에 따라 더 많은 포도당이 축적되었고, 더 낮은 포도당으로 종료되었다. 도 4a에 나타낸 결과에서 공급 함수는 생산을 통하여 바람직한 일관적인 포도당 수준을 얻도록 실증적으로 최적화될 수 있음을 설명한다. 요약하면, 연속 포도당 공급은 배양물 안의 포도당 농도를 자동화된 방식으로 설정 범위 안에서 유지시킨다는 것이 관찰된 반면, 집중적 포도당은 진동 양식을 만들었고, 바람직한 안정적인 일관성있는 프로파일이 아니다.

도 4b에서 연속 공급 운용은 집중적 공급 운용 보다 더 낮은 삼투질 농도를 유지하였다는 것을 설명한다. 이것은 연속 포도당 공급이 매일 고정된 양의 단순한 집중적 공급보다는 세포에서 요구되는 양으로 배양물에 공급되도록 기획된 사실 때문인 것 같다. 연속 공급은 영양분 수준이 세포의 취입에 더 잘 부합되도록 허용함으로써 삼투질농도를 또한 더 낮출 수 있을 것이고; 집중적 공급의 용이함에서 전형적으로 관찰된 것과 같이 세포는 좀 더 효과적으로 영양분을 대사하고, 환경에서 급격한 변화를 겪지 않는다.

도 4c에서 연속 공급 세포의 세포 생존력은 집중적 공급 방식을 이용하여 공급된 세포와 필적한다는 것을 보여준다. 비록 세포의 생존력은 이들 두 방식에서 필적하지만, 도 4d는 세포 밀도 (IVCD)는 연속 포도당으로 연속 공급이 적용될 때 상당히 개선됨을 설명한다. 이 효과는 동일한 연속 포도당(K₁=0.0504, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0331)과 함께 복합된 연속 공급 K 상수(K₁=0.96678, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0288) 및 (K₁=0.59499, K₂₁=-0.00015, 및 K₂₂=0.0348)를 이용한 두 가지 운용, 닫힌 삼각형 (▲)과 닫힌 원 (●)에 대해서 관찰되었다. 불변 공급 속도와 다른 두 가지 운용과 동일한 연속 포도당 공급을 이용한, 닫힌 다이아몬드 (◆)로 나타낸 연속 공급 운용은 단지 집중적 공급 운용 (개방 원 (○)과 동일한 IVCD 만을 생성하였다. 이러한 관찰은 공급 함수의 기하급수적 프로파일은 세포 성장의 개선을 위하여 불변 공급 및 집중적 공급보다는 영양분 운반에서 더 낫다는 것을 의미한다. 이들 운용, 닫힌 삼각형(▲) 및 닫힌 원형(●)에 대한 역가는 다른 운용가운데서 또한 최고였으며, 조절 집중적 공급 운용 (개방 원 (○) 보다 대략 7% 더 높다. 공급 함수의 K 상수의 추가 최적화와 함께, 연속 공급의 역가는 집중적 공급에 비해 개선될 수 있으며, 이들 운용의 젖산염 및 암모늄 프로파일은 모두 유사하였다는 것이 주지된다.

세포 계통 2에 적용된 연속 공급 방법

세포 계통 2 또한 연속 공급 함수에 대해 테스트되었다. 세포 계통 1의 연구에서 실행된 것과 같이, 연속 포도당 공급의 K 값은 집중적 공급 운용으로부터 생성된 실질적인 포도당 소모 데이터에 부합되도록 공급 함수를 피팅함으로써 결정된다. 연속 공급의 K 값은 연속 포도당으로부터 K₂₁ 및 K₂₂ 변수에 근거하여 유도되었고, K₁은 설정 시간 안에 운반되는 총 용량을 이용하여 역산출되었다. 조절 프로세스는 16일간이다. 집중적 포도당은 일일 최대 6 g/L로 추가되었다. 집중적 공급은 5, 7, 9, 11 및 13일 시점에서 각 108mL씩 총 540mL의 공급물을 추가하였다. 다른 방식으로 언급하자면, 이중 연속 공급 운용에서 연속 포도당 공급 K 값은 동일하게 유지되었고, 오직 연속 영양분 혼합물 공급 K 값들이 변화되었다.

도 5는 세포 계통 2에 적용된 연속 공급 방법의 결과들을 보여준다. 테스트된 연속 포도당의 두 변수들은 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, 및 K₂₂=0.0155) 및 (K₁=0.069, K₂₁=-0.000048, 및 K₂₂=0.018)이었다. 이중 연속 포도당 및 공급 운용 모두에 대해 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, 및 K₂₂=0.0155)가 이용되었다. 도 5a는 실증적 개발로, 포도당 농도를 3 - 6 g/L의 특정 범위 안에 일관되게 유지시키는 것이 가능하다는 것을 설명한다. 이 범위를 획득한 운용은 연속 공급 (K₁=2.3821, K₂₁=-0.00006, 및 K₂₂=0.0092)과 연속 포도당 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, 및 K₂₂=0.0155)을 이용한 닫힌 사각(■)이다.

도 5b에서 연속 포도당 및 집중적 공급 운용 (개방 다이아몬드 (◇), 그리고 이중 연속 포도당 및 연속 공급 운용 (닫힌 사각 (■)의 세포 밀도(IVCD)는 집중적 공급 조절 운용 (*)보다 상당히 개선되었음이 설명된다.

도 5c는 상이한 연속 공급 함수는 광범위한 역가 변화를 만들 수 있음을 보여주는데, 540mL의 동일한 공급 용량이 공급되더라도 일부 역가는 더 낮고, 다른 것은 더 높다. 집중적 공급보다 개선된 역가를 나타내는 운용은 집중적 공급(가방 다이어몬드(◇)과 함께 연속 포도당 공급 (K₁=0.105, K₂₁=-0.000051, 및 K₂₂=0.0155)이었고; 이 운용의 역가는 5.5 g/L의 집중적 공급과 비교하여 6g/L이었다. 세포 생존력 또한 변화되었는데, 일부 연속 공급 프로파일은 집중적 공급에 부합되지만, 일부는 더 낮다. 데이터는 상이한 연속 공급 K 값을 가진 반응 범위를 보여주며, K 값 범위로 최적화에 대한 가능성을 설명한다.

세포 계통 2를 이용한 연속 공급 방법에서 더 높은 용량의 테스트

또다른 실험에서, 집중적 공급 프로세스는 4일차와 5일차에 84mL 로 변화되었고, 7, 9, 11 및 13일차에 108mL로 변화되어, 총 600mL이 공급되었다. 이러한 변형은 일일의 공급일을 더 추가하였고, 기존 조건보다 60mL 공급물을 더 추가한다. 가 더 공급된다. K 값들은 도 5에 나타낸 데이터에 근거하여 연속 포도당 및 연속 공급 식에 대해 더 정확해졌다. 포도당에 대한 K 값들은 (K₁=0.215, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)으로 변화되었고, 이는 세포 계통 2에 대한 수정된 포도당 소모 데이터에 더 적합하다. 본 연구에서, 도 6에 나타낸 것과 같이 4가지 조건이 있었다. 제 1 조건(개방 다이아몬드 (◇))은 대조군 집중적 포도당 및 공급이었다. 제 2 조건(개방 삼각형 (△))은 집중적 공급과 결합된 연속 포도당 (K₁=0.215, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)을 이용하는 것이다. 제 3 조건(닫힌 삼각형(▲)은 연속 공급 (K₁=1.8744, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)과 결합된 동일한 포도당 K 값을 이용한다. 제 4 조건(닫힌 다이아몬드(◆))은 연속 공급 (K₁=2.0827, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)과 결합된 동일한 연속 포도당 K값을 이용한다. 집중적 공급 조건들과 제 4 조건 연속 공급 모두다 600mL의 동일한 총 공급물을 운반한다. 제 3 조건 연속 공급은 비교용으로 540mL의 기존 총량을 운반하도록 설정되었다. 제 3과 제 4 조건에서 용량 차이에도 불구하고, 연속 공급 경향 곡선들은 동일한 것으로 기대되었는데, 이둘 두 기능은 동일한 K₂₁ 및 K₂₂ 값을 공유하기 때문이다. 한편, K₂₁ 및 K₂₂ 값은 동일하게 남아있지만, K₁ 값은 더 높은데, 이는 더 높은 수준의 공급 속도를 명령한다. 이 경우에서, 전체적인 공급 곡선은 더 낮은 K₁ 공급 곡선보다 더 많이 전환되었다. 모든 운용은 4일차에서 13일차까지 동일한 기간 안에 운반된 공급물을 보유한다.

본 연구에서, 연속 포도당의 잔여 포도당 농도는 개방 삼각형 (△) 운용의 경우 3 - 5 g/L의 좁은 범위 안에서 조절되었다. 이중 연속 포도당 및 공급물의 잔연 포도당은 더 변화가 있지만, 여전히 수용가능한데, 그 이유는 이러한 변화가 집중적 포도당 공급 (1 - 6 g/L 범위를 보유)보다는 여전히 더 작았기 때문이다.

도 6a는 연속 공급과 결합된 연속 포도당을 이용하여 역가가 개선됨을 설명한다. 두 연속 공급 조건들이 모두 대략적으로 8.4 g/L 역가에 도달하였고, 이는 임의의 세포 계통 2 프로세스에 대하여 관찰된 최고 역가였다. 집중적 공급 운용의 역가 경향은 11일차와 같은 초기에 연속 공급 운용보다 뒤쳐져 있었다. 용량당 생산성 또한 연속 공급 운용에서 더 높았다.

도 6c는 집중적 공급 운용과 비교하여 연속 공급 운용에서 세포 생존력이 더 높다는 것을 보여준다. 본 연구에서, 세포 생존력에 있어서 600mL의 연속 공급 용량이 높을수록 540mL 공급 용량보다 더 나았다. 생산 종료시 집중적 공급보다 세포 생존력에서 또한 9% 더 높았다. 도 6d에서 나타낸 것과 같이, 600mL의 공급물을 운반하는 연속 공급을 이용하면 IVCD에서 동일한 종류의 개선이 관찰되었다. 생산 종료시에, 540mL 연속 공급의 경우 187x10⁶ 세포 일수/mL와 비교하여, 연속 공급은 214x10⁶ 세포에 도달하였고, 그리고 집중적 공급 대조군의 경우는 170x10⁶ 세포 일수/mL이다. 이는 최고의 연속 공급은 집중적 대조군보다 IVCD에서 대략적으로 26% 개선이다.

연속 공급 용량에 대한 지속적 실험들에서, 연속 공급의 2가지 추가 변화는 600mL의 대조군 집중적 공급과 나란히 테스트되었다. 제 1 조건(개방 원 (○))은 5일차에 시작하여 13일차 까지 지속되는 (K₁=2.6503, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)의 연속 공급을 이용하였다. 연속 공급은 기존의 4일차보다 하루 늦게 시작되었기 때문에, 비록 K₁이 2.0827의 기존 연속 공급보다 더 높기는 하지만 총 공급은 여전히 600mL이었다. K₂₁ 및 K₂₂ 값은 기존 연속 공급과 여전히 동일하였다. 이 조건은 동일한 총 용량을 유지하면서 나중에 시작되는 연속 공급을 테스트한다. 제 2 조건에서, (K₁=2.2910, K₂₁=-0.000003, 및 K₂₂=0.003)의 연속 공급이 테스트되었는데, 이는 4일차부터 13일차까지 적용된다. 이것은 대조군 집중적 공급과 동일한 시작과 종료 시간이다. K₁은 2.0827에서 2.2910으로 증가되었지만, 그러나, 660mL의 더 높은 용량을 테스트하기 위하여. 이들 두 연속 공급 조건의 경우, 모두 집중적 포도당과 결합되었다. 목적은 연속 포도당 없이 단독의 연속 공급 효과를 이해하는 것이었다.

도 7a 및 7b는 연속 공급 조건 모두에서 역가 및 용량성 생산성이 약간 개선되었다는 것을 설명한다. 도 7c는 연속 공급 조건들에서 상당히 개선되었음을 설명한다. 이것은 이미 도 6의 조건에서 관찰되었다. 도 7d는 도 5에서 볼 수 있었던 훨씬 더 큰 개선과 대조적으로 연속 공급 조건에서 IVCD가 단지 조금 개선되었음을 설명한다.

세포 계통 3에서 연속 공급 방법 테스트

세포 계통 3은 연속 공급 함수를 이용하여 테스트되었다. 대조군 집중적 공급 프로세스는 4일차에 84mL, 6일차에 108mL, 그리고 8일차에 108mL, 총 300mL을 공급한다. 전체적인 프로세스는 12 일이었다. 집중적 포도당과 결합된 한 가지 연속 공급 조건이 테스트되었다. 임의의 진전없이, 세포 계통 2를 이용한 기존 연구와 동일한 -0.000003의 K₂₁ 및 0.003의 K₂₂가 이용되었다. 4일차에서 시작하여 8일차 까지 총 300mL을 공급하기 위하여 K₁은 2.7233으로 산출되었다.

세포 계통 3에 대한 데이터에서 연속 공급은 집중적 공급과 비교하여 역가를 4.2 g/L로부터 4.5 g/L로 개선시켰다는 것을 보여주었다(도 8a). 특이적 생산성, q_p는 8일차로부터 12일차를 통하여 연속 공급에서 또한 더 높았다(도 8b). 세포 생존력, IVCD, 젖산염 및 암모늄 프로파일에서는 유의미적인 차이는 없었다. 세포 계통 3의 역가는 상당히 개선될 수 있음이 결과에서 설명된다.

결론

세포 계통 1, 2 및 3의 연구에서, 집중적 공급을 대신하여 성공적으로 적용될 수 있는 세포 배양을 위하여 새로운, 사전-예정된 비-피이드백 연속 공급 모델이 설명된다. 3가지 상이한 세포 계통이 테스트되었고, 집중적 공급과 비교하여 다양한 장점들이 관찰되었다. 세포 계통 1의 경우, 삼투질농도 프로파일은 더 낮았고, IVCD는 더 높았다. 세포 계통 2의 경우, 역가, 용량성 생산성, 세포 생존력 및 IVCD은 모두 연속 공급으로 개선될 수 있음이 설명되었다. 세포 계통 3에 있어서, 역가 및 특이적 생산성은 연속 공급으로 개선될 수 있음이 설명되었다.

세포 배양 성능 개선에 추가적으로, 연속 공급 방법을 또한 이용하여 생산 전체를 통하여 포도당을 바람직한 범위 안에서 일관되게 유지시킬 수 있음이 설명되었다. 수작업에 의한 집중적 공급의 필요성이 없어지고, 결과적으로 인적 개입의 필요성이 없어지고, 자원을 절약하기 때문에 바람직하고 유익하다. 연속 공급 방법은 운용에 앞서 사전-예정되고, 그리고 작업자 개입이 없어지게 되며, 프로세스는 잘-개발된 확실한 K 값들로 인하여 운용 경우마다 일관성있다. 성공적인 이중 연속 포도당 및 공급 운용의 예들은 세포 배양물 공급의 완전한 자동화가 효과적임을 보여준다.

이들 연구 결과들은 공개된 연속 공급 방법이 세포 배양 성장의 성능 및 단백질 생산을 강화시킨다는 것을 설명하며, 이 방법은 통상적인 집중적 공급 전략을 대체할 수 있다는 것을 설명한다.

본 명세서에서 언급된 각 참고자료는 이것이 교시하는 것에 대하여 그리고 모든 목적에 대하여 여기에 참고자료로 편입된다.

본 명세서는 본 명세서에서 설명된 특정 구체예로 이 범위가 제한되지 않으며, 실시예들은 명세서의 개별 측면 및 명세서의 측면으로부터 기능적으로 대등한 방법 및 성분을 설명하기 위함이다. 또한, 본 명세서에서 나타내고, 설명된 것에 추가하여, 본 명세서의 다양한 변형들은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구범위 안에 포함된다.

Claims (14)

1. (a) 포유류 세포 및 배지를 포함하는 포유류 세포 배양물을 포함하는 용기를 제공하는 단계;
   (b) 세포 배양물의 영양분 소모율(K₁), 성장률 (K₂₁) 및 성장 속도 (K₂₂)에 대한 값을 결정하는 단계;
   (c) 세포 배양물에 연속 공급 흐름을 부여하는데 적합한 장치를 제공하고, 상기 장치는 유속 F에서 배양물을 연속적으로 공급하는데 적합한 컨트롤러 모듈을 포함하고, 여기서
   F는 K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)로 정의되며;
   t는 공급 흐름이 생물반응기에 첨가되는 시간부터 공급 흐름이 중단되는 시간까지의 기간이며;
   K₁, K₂₁ 및 K₂₂는 (b)에서 결정된 값인 단계; 및
   (d) 컨트롤러 모듈을 활성화시켜서 세포 배양물의 연속 공급을 개시하는 단계
   를 포함하는, 피이드백 조절을 이용하지 않고 포유류 세포 배양물을 연속적으로 공급하는 방법.
2. 제1항에 있어서, K₁, K₂₁ 및 K₂₂가 실증적으로 결정되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, K₁, K₂₁ 및 K₂₂가 이론적으로 산출되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 컨트롤러 모듈이 컴퓨터를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 공급 흐름이 다중 영양분을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포 배양물의 삼투질농도가, 이 방법의 전과정 동안 일정하게 유지되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 영양분이 포도당인 방법.
8. 제1항에 있어서, 포유류 세포 배양물이 CHO (차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)) 세포 배양물인 방법.
9. 제1항에 있어서, 컨트롤러 모듈이 세포 배양물 중의 사전선택된 젖산염 수준에 반응하여 활성화되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 컨트롤러 모듈이 세포 배양물 중의 사전선택된 포도당 수준에 반응하여 활성화되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 컨트롤러 모듈이 아미노산의 사전선택된 수준에 반응하여 활성화되는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 아미노산이 아스파라긴인 방법.
13. 제11항에 있어서, 아미노산이 글루타민인 방법.
14. 제1항에 있어서, 공급 흐름이 2종 이상의 영양분을 포함하는 것인 방법.
    

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