TW200918553A

TW200918553A - Human GM-CSF antigen binding proteins

Info

Publication number: TW200918553A
Application number: TW097134377A
Authority: TW
Inventors: Dauphine Barone; Kenneth A Brasel; Jose Carlos Escobar; Jacqueline A Kirchner; Kara Olson
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2008-09-08
Publication date: 2009-05-01
Also published as: EA201000490A1; NZ583787A; CA2698667C; KR101274356B1; US8268311B2; US20130259799A1; WO2009038760A2; US8481704B2; CA2698667A1; CR11374A; US20110189082A1; MX2010002968A; BRPI0817007A2; CN101861336A; KR20100059985A; PE20091193A1; CL2008002750A1; US20130071923A1; WO2009038760A3; AU2008302747B2

Description

200918553 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明是關於結合至人類GM-CSF蛋白質之抗原結合蛋白質。【先前技術】顆粒細胞巨噬細胞群落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) ; CSF2)是被已充分硏究的蛋白質，經長期觀察得知其具有造血特性（亦 ν 即骨髓系統之前驅細胞（p r 〇 g e n i t 〇 r c e 11 s )的增殖及分化之刺激以及成熟細胞的增殖）（評論於Blood 77:1131，1991; Rev Infect Dis 12: 41，1990; Med_ Oncol. 13:141, 1996)。GM-CSF 是由肺上皮細胞及腸的潘氏細胞（Paneth cells)基本持續地產生（BBRC * 312:897，2003)，但有廣泛種類的細胞表現GM-CSF是隨來自T細胞、巨噬細胞/單核球（monocyte)、纖維母細胞及內皮細胞之顯著表現而活化 U Infect Dis 172:1573，1995; J Infect Dis 185:1490, 2002; J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003)。GM-CSF 受體、（GM-CSFR ; CSFR2)由兩種蛋白質的異質複合體所組成，即一種專一於GM-CSF之親和力高多胜肽以及一種由 G Μ - C S F、IL - 3及IL - 5共享之親和力低共有/3多胜肽（評論於 J Allergy Cin Immunol 112:653，2003 ; Cytokine and Growth Factor

Reviews 12:19, 2001)。GM-CSFR表現在骨髓系統的所有細胞。 GM - C S F提高天生的免疫系統的活性，其係經由仲介導致或影響骨髓系統細胞’包括巨噬細胞/單核球、樹突細胞 (D C s )、嗜中性白血球及嗜伊紅白血球的分化、存活、增殖 200918553 及活化之訊息（評論於：J Immun 143:1198, 1989; Rev Infect Dis 12:41， 1990; Blood 77:1131, 1991; Trends in Immun. 23:403, 2002; Growth Fetors 22:225, 2004)。GM-CSF是活體外（/« v/iro)製造單核球衍生之 DCs及第1型巨噬細胞之重要因子（PN AS 101:4560, 2004)，且已顯示在活體內（/π Wvo)誘發DCs的分化及活化（Blood 95:2337，2000)。GM-CSF存在所製造之人類單核球衍生之巨噬細胞（第1型巨噬細胞），產生高水平的發炎前驅細胞激素，例如IL-23但不是IL-12;反之M-CSF(CSFl)存在所製造之第2型巨噬細胞，產生抗發炎性細胞激素，例如IL- 1 0 但不是 IL-23(PNAS 101: 4560, 2004)。經GM-CSF刺激之人類單核球或巨噬細胞具有增加的功能，包括細胞毒性、其他發炎前驅細胞激素（IL-1 Θ、TNF α 及IL-6)的產生及吞噬作用。基於這些作用，近來致力硏發 GM-CSF作爲有效的佐劑用於感染性疾病或與疫苗投與（評論於 Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 13::S47, 1994; Curr Opin Hematol. 7:168, 2000)。的確，某些臨床環境背景下投與rhGM-CSF可戲劇性地改善真菌感染的結果及清除（Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13: S18, 1994; J Med Microbiol 47: 1998)。微神經膠細胞（microglia)是CNS的固有巨噬細胞，以及活體外硏究的數據指出GM-CSF是一關鍵細胞激素，其增強胎兒及成人微神經膠細胞的存活、活化、增殖、甚至分化 (Glia 12:309，1994; J Immunol Methods 300:32, 2005)。此外有數個小鼠 MS模式硏究報告提供APCs(微神經膠細胞或DCs)於CNS血管週隙對於疾病開始及持續扮演關鍵角色之證據（Nat. Med. 200918553 11:146，，2005; Nat· Med. 11:328, 2005; Nat. Med. 11:335, 2005)。微神經膠細胞的GM-CSF刺激向上調節MHCII並增強抗原呈現。只有近來已發表，GM-CSF在疾病中扮演發炎前驅細胞激素之角色，且非必要性作爲造血生長因子（評論於Trends in Immun. 23: 403, 2002; Growth Factors 22: 225, 2004)，以及其於導致或增強發炎性/自體免疫疾病之角色。在多發性硬化症（MS)、類風濕性關節炎（RA)、氣喘、牛皮癖、異位性皮膚炎及類肉瘤病（sarcoidosis)的發炎局部位置，已觀察到含量水平提高的GM-CSF。血清中通常不會觀察到GM-CSF提高，因此決定疾病關聯性需要分析標的組織。有兩個臨床硏究在MS中進行，其中經由ELISA測量具疾病進展中之復發-緩解型（RR)MS病患（組織收集2週內有新症狀或現有症狀惡化）的腦脊髓液（CSF)及血清之GM-CSF 蛋白質含量，以及與具穩定疾病之RRMS病患（前6個月無事件狀況）或其他神經性疾病（OND)對照組比較（Eur Neurol 33:152,1993; Immunopharmacol. Immunotoxicol. 20:373,1998)。重要地， OND對照組不包括阿兹海默症（Alzheimer’s disease)或血管性癡呆症（vascular dementia)病患，因爲已報告此等病患的 CSF及血清中高額地增加 GM-CSF含量（Acta Neurol Scand 103:166, 2001)。 GM-CSF含量在低的pg範圍，但相較於穩定疾病CSF， GM-CSF在疾病進展中RRMS顯著較高；以及相較於OND CSF，在疾病進展中MS CSF顯著較高。此外，進展中疾病相對於穩定疾病之CSF有較高含量TNF- α，以及穩定疾病 200918553 相對於進展中疾病之CSF有較高含量TGF-/S和IL-10。該硏究包括關於病患不間斷治療之非常仔細的內含物判斷標準以及進展中疾病相對於穩定疾病的臨床定義’以及樣本收集的同步性。有趣地是任何組別之間，血清的GM-CSF含量無顯著差異。此外’一硏究在MS損害的星狀細胞中觀察 GM-CSF之選擇性免疫組織化學偵測，但不於對照組CNS白質（n = 3 MS捐贈者，Glia 12:309，1994)。最後，隨發炎反應期間的活化，經活化之T細胞及單核球/巨噬細胞能產生大量GM-CSF。有足夠證據證明在MS損害中存在這雨種細胞類型（Ann Neurol. 47:707，2000)，以及 CSF 中有 T 細胞（評論於 Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 1: 257, 2001)。. 除GM-CSF表現與MS有關聯之外，對於其他發炎/自體免疫疾病有許多疾病關聯數據，以及甚至一些證據對於給予外源性GM-CSF使疾病惡化。相較於〇A(生物分析’ Clin. Exp. Immunol. 72:67，1988)以及相較於非RA對照組（生物分析， Rheumatol Int. 14:177，1995)，在 RA 方面已於具 RA 或牛皮癬性關節炎（P s 〇 r i a t i c A r t h r i t i s ; P s A )之病患滑液（S F )偵測到提高含量之GM-CSF。此外，CD68 +巨噬細胞存在於關節與 RA病患疾病嚴重度之間有強烈關聯性（Ann Rheum Dis 64:8 3 4，2005)。最後，已發表具費爾蒂氏症候群（Felty’s syndrome)(嗜中性白血球減少症）之RA病患的GM-CSF處理可使疾病惡化（Blood 74:2769, 1989)。在氣喘方面，經由免疫組織化學已發現氣喘病患之支氣管切片的GM-CSF含量提高，以及觀察到類固醇處理後 200918553 GM-CSF含量降低與增加於 FEV1之間有關聯性（Chest 105:687,1994; Am Rev Respir Dis 147:1557, 1993)。也已報告在時斷時續的輕微氣喘病患痰中GM-CSF含量提高（Ann Allergy Asthma Immunol 86:304, 2001)。支持GM-CSF之拮抗作用的數據，包括硏究經由抗-GM-CSF mAb減弱有症狀病患BALF之嗜伊紅白血球促進活性（活體外，Eur· Respir. J. 12:872,丨998)。在牛皮癬方面，在牛皮癬皮膚偵測到GM-CSF表現，但未於對照組皮膚樣本偵測到（Arch Dermatol Res. 287:158, 1995; Clin Exp Dermatol. 19:383，1994; Dermatologica. 181:16，1990)。也已發表牛皮癖之GM-CSF處理能惡化疾病（Br J Dermatol.1 28:46 8， 1 993 ” . 在異位性皮膚炎（A D )方面，經由原位雜交在慢性a D的損傷組織切片，比在急性AD或無損傷皮膚偵測到顯著高數量表現 GM-CSF mRNA 的細胞（p<0.05; J Clin Invest. 95:211， 1 99 5)。在第二項硏究中，經由損傷的AD皮膚（表皮及真皮部分二者）之免疫組織化學法偵測到更高含量的GM-CSF;以及相較於非異位性皮膚炎對照組的角化細胞，建立自A D病患未涉及之皮膚的角化細胞培養顯現自動增加及PMA-刺激製造 GM-CSF(J Clin Invest. 99:3009, 1997)。由多個團體製造缺乏 GM-CSF(Science 264:713，1994; PNAS 91:5592, 1994)及 GM-CSFRc(Immunity 2:211，1995; PNAS 92:9565, 1995) 之小鼠。在造血作用之穩定狀態水平中無明顯差異，但有肺泡蛋白質沉著症（alveolar proteinosis)的組織學證據之小鼠，更易受感染’且在IgG製造呈現適度的延遲，以及在 200918553 KLH免疫之後減小抗原專一性T細胞反應（PNAS 94:1 2 5 5 7， 1997)。GM-CSF-/·小鼠對 MOG35-55 誘發之 EAE (J Exp Med.l 94:8 73，200 1 )、膠原蛋白誘發之關節炎（CIA; JI 1 6 1:3 63 9，1 99 8)以及 mBSA/IL-1 誘發之關節炎（Arthritis Rheum 44:111，2 00 1 )有抗性。相較之下，已在數個實驗室製造出GM-CSF基因轉殖（Tg)小鼠，且其與發炎/自體免疫疾病的發展有關聯（Cell 51:675，1987; JI 166:2090，2001; J Clin Invest 97:1102, 1996; J Allergy Clin Immunol 111:1076, 2003; Lab Invest 77:615, 1997)。因此所屬技藝對於GM-CSF抑制劑有需求。【發明內容】提供結合GM-CSF(尤其是人類GM-CSF)之抗原結合蛋白質。人類GM-CSF抗原結合蛋白質能抑制、妨礙或調整至少一種有關 GM-CSF之生物反應，且因此可用於改善 GM-CSF有關疾病或失調的影響。因此某些抗原結合蛋白質結合至GM-CSF能抑制、妨礙或阻斷GM-CSF傳訊息，降低單核球遷移到腫瘤，以及降低腫瘤相關巨噬細胞（TAM s)的積聚。也提供表現系統，包括製造GM-CSF抗原結合蛋白質用之細胞株以及診斷及治療有關人類GM-CSF疾病之方法。提供之某些經單離之抗原結合蛋白質含有：（A)—個或 —個以上選自由下所組群組之重鏈互補決定區域（CDRH):⑴ 選自由 SEQ ID NO: 10、22、70、94及142所組群組之 CDRH1 ; (ii)選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、 200918553 71、95、106、119及143所組群組之CDRH2; (iii)選自由 SEQ ID NO: 12 ' 24、36、48' 60、72、83、96、108、120、 132 及 1 44 所組群組之 CDRH3 ;以及（iv) —（i)、（ii)及（iii) 之CDRH，含有不超過4個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；（B)—個或一個以上選自由下所組群組之輕鏈互補決定區域（CDRL): (i)選自由SEQ IDN0:4、16、 30、 40、 52、 64、 88、 100 ' 107、 112、 118、 124、 125 及: 136所組群組之CDRL1; (ii)選自由所SEQ ID NO:5、17、 29、34、41、65、77、101、113、130、131 及 137 組群組之 CDRL2 ; (iii)選自由 SEQ ID ΝΟ : 6、1 8、42、46、66、78、 84、89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3;以及（iv) —（i)、（Π)及（iii)之CDRL’含有不超過4個胺基酸之 —個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；或（C)一個或一個以上的（A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的（B)之輕鏈 CDRL。在一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質可含有至少一或兩個上述（A)之 CDRH以及至少一或兩個上述（B)之 CDRL。又在另一態樣，經單離之抗原結合蛋白質包括 CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 及 CDRL3。此外，上述（A)之CDRH進一步選自由下所組群組：⑴ 選自由 SEQ ID Ν0:1〇、22、70、94及 142所組群組之 CDRH1 ; (Π)選自由 SEQ ID N0:11、23、28、35、47、59、 71、95、106 ' 119及143所組群組之CDRH2 ; (iii)選自由 SEQIDNO:12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、 200918553 132 及 144 所組群組之 CDRH3 ;以及（iv) —（i)、（ii)及（iii) 之CDRH，含有不超過2個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；上述（B)之CDRH是選自由下所組群組： (0選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、100、 107、1 12、1 18、124、125 及 136 所組群組之 CDRL1 ; (ii) 選自由 SEQ ID NO: 5 ' 17、29、34、41、65、77、101、113、 130、131及137所組群組之CDRL2; (iii)選自由SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 及138所組群組之CDRL3 ;以及（W) —（i)、（ii)及（iii)之 CDRL，含有不超過2個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；或（C)一個或一個以上的（A)之重鏈CDRH 以及一個或一個以上的（B)之輕鏈CDRL。又在另一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質可含有： (A) 選自由下所組群組之CDRH : (i)選自由SEQ ID NO: 10、 22、70、94及142所組群組之CDRH 1，（ii)選自由SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 及 143 所組群組之 CDRH2，（iii)選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、 60、72、83、96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3 ; (B) 選自由下所組群組之CDRL: (i)選自由SEQ ID N0:4、 16、 30、 40、 52、 64、 88、 100、 107、 112、 118、 124、 125 及136所組群組之CDRL1，（ii)選自由SEQ ID NO:5、17、 29、34、41、65、77、101、113、130、131 及 137 所組群組之 CDRL2，（iii)選自由 SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、 84、89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3;或 200918553 (C)一個或一個以上的（A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的（B)之輕鏈CD RL。在一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質可包括：（A)選自由SEQ IDNO:10、22、70、94及142所組群組之 CDRH1，選自由 SEQIDNO:ll、23、28、35、47、 59、71、95、106、119及143所組群組之CDRH2，選自由 SEQIDNO:12、24、36、48、60、72、83、96、108、120' 132及144所組群組之CDRH3 ;以及（B)選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、 125及136所組群組之CDRL1，選自由SEQIDNO:5、17、 29、34、41、65、77、101、113' 130、131 及 137 所組群組之 CDRL2 及選自由 SEQ ID NO:6、1 8、4 2、4 6 ' 6 6、7 8、 84、89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3。在另一具體例中，可變重鏈（VH)具有至少90%序列相同於選自由 SEQ ID NO:9、21、33、45、57' 69、81、93、105、117、 129及141所組群組之胺基酸序列，及/或可變輕鏈（VL)具有至少9 0 %序列相同於選自由S E Q I D Ν Ο : 3、1 5、2 7、3 9、5 1、 63、75、87、99、1 1 1、123及135所組群組之胺基酸序列。在進一步之一具體例中，VH是選自由SEQ ID NO:9、21、 33、45、57、69、81、93、105、117、129 及 141 所組群組，及 /或 VL 是選自由 SEQ IDNO:3、15、27、39、51、63、75、 8 7、9 9、1 1 1、1 2 3 及 1 3 5 所組群組。在另一態樣，提供經單離之抗原結合蛋白質專一結合至含GM-CSF序列之抗原決定基（epit0pe)，其中結合至GM-CSF 之抗體在含GM-CSFR的細胞中拮抗GM-CSF仲介之傳訊息 200918553 的活化。又在另一態樣，提供結合GM-CSF之經單離之抗原結合蛋白質，其含有：（A) —個或一個以上選自由下所組群組之重鏈CDRs(CDRH) : (i)—種CDRH1具有至少80%相同於選自由3£(^10>10:10、22、70、94及142所組群組之€01^1， (ii) 一種 CDRH2具有至少 80%相同於選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 及 143 所組群組之CDRH2，（iii)—種CDRH3具有至少80%相同於選自由 SEQIDNO:12、24、36、48、60、72、83、96、108、 120、132及144所組群組之CDRH3 ; (B)—個或一個以上選自由下所組群組之輕鏈CDRs(CDRL) : (i)—種CDRL1，其爲 80%相同於選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 100、107、112、118、124、125 及 136 所組群組之 CDRL1， (ii)一種CDRL2，其爲80%相同於選自由SEQIDNO:5、17、 2 9、34、41、65、77、101、113、130、1 3 1 及 13 7 所組群組之CDRL2，（iii) 一種CDRL3,其爲80%相同於選自由SEQID NO:6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 及138所組群組之CDRL3 ;或（C) —個或一個以上的（A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的（B)之輕鏈CDRL。在一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質包括：（A)—個或一個以上選自由下所組群組之CDRH : (i)—種CDRH1具有至少90% 相同於選自由SEQ ID NO:10、22、70、94及142所組群組之001^1，（1〗）一種€011112具有至少90%相同於選自由3£(5 ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59' 71、95' 106、119 及 143 200918553 所組群組之CDRH2，（iii)一種CDRH3具有至少90%相同於選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、96、108、 120、132及144所組群組之CDRH3 ; (B)—個或一個以上選自由下所組群組之CDRL : (i)—種CDRL 1，其爲至少90%相同於選自由 SEQIDNO:4、16、30、40、52、64、88、100、 107、112、118、124、125 及 136 所組群組之 CDRL1，（ii) 一種CDRL2,其爲至少90%相同於選自由SEQ IDNO:5、17、 2 9、34、41、65、77、101、113、130、1 3 1 及 1 3 7 所組群組之CDRL2，（iii) 一種CDRL3，其爲至少90%相同於選自由 SEQ ID NO: 6 ' 18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、 126及138所組群組之CDRL3 ;或（C)一個或一個以上的（A) 之重鏈CDRH以及一個或一個以上的（B)之輕鏈CDRL。在另一態樣，提供一種結合GM-CSF之經單離之抗原結合蛋白質，該抗原結合蛋白質包括：A)選自由下所組群組之重鏈互補決定區域（CDRH): (i)—種選自由SEQ ID N0s:12、 24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3，（ii) 一種CDRH3，其胺基酸序列與（i)之 CDRH3的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，（iii)一種選自由 XdzXsXdXsXeXvXsFDXWSEQ ID ^^0:83)所組群組之€011113胺基酸序列，其中乂1是選自由£ 及無胺基酸所組群組，X2是選自由G及無胺基酸所組群組， X3是選自由P、D及G所組群組，X4是選自由Y、W、R及 K所組群組，X5是選自由S、W、F及T所組群組，X6是選自由Y及L所組群組，X7是選自由D及G所組群組，X8是 -15- 200918553 選自由Υ、無胺基酸及A所組群組，以及χ9是選自由M、τ 及V所組群組；及/或Β)選自由下所組群組之輕鏈互補決定區域（CDRL): (i) —種選自由 SEQ ID N〇s:6、18、42、46、 66、78、84、89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3, (ii)一種CDRL3,其胺基酸序列與（i)之CDRL3的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，以及iii)一種選自由下所組群組之CDRL3胺基酸序列：XiQXzXsXAXadj (SEQ IDNO:84)，其中乂1是選自由Q及L所組群組，χ2是 ^ 選自由丫及3所組群組，乂3是選自由0、0及？所組群組， Χ4是選自由R、τ及S所組群組，Χ5是選自由S及V所組群組，Χ6是選自由F及Ρ所組群組，以.及Χ7是選自由R及 W 所組群組；以及 XiXzXsXeSSNXsXsXASEQ ID ΝΟ:89)， ' 其中Χι是選自由S及Α所組群組，Χ2是選自由S及Α所組群組，x3是選自由w及F所組群組，X4是選自由D及T所組群組，X5是選自由G、W及無胺基酸所組群組，X6是選自由V、L及P所組群組，以及X6是選自由V及無胺基酸、所組群組。在另一具體例中，抗原結合蛋白質進一步含有：A)選自由下所組群組之CDRH:(i)—種選自由SEQlDNOs:10、22' 7〇、94及142所組群組之CDRH1，（ii) 一種CDRH1 ’其以不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代不同於（i)t CDRH1 ， (iii)— 種胺基酸序列選自由 X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9(SEQ ID NO:94)所組群組之 CDRH1，其中乂丨是選自由G及無胺基酸所組群組，χ2是選 200918553 自由G及無胺基酸所組群組，X3是選自由γ及F所組群組， X4是選自由T及S所組群組，X5是選自由T、S及G所組群組，X6是選自由G及S所組群組，X7是選自由Y及G所組群組，X8是選自由I及Μ所組群組’以及X9是選自由Η 及S所組群組，或（iv)—種選自由SEQIDNOs:5、17、29、

34 、 41 、 65 、 77 、 101 、 113 、 130 、 131 及 137 所組群組之 CDRH2，（v)—種CDRH2，其胺基酸序列（iv)之CDRH2的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，或（vi) —種由 XiX2X3X4X5X6GX7X8X9Xl〇XllXl2Xl3X|4XlsG(SEQ IDNO:106)組成之CDRH2胺基酸序列，其中X1是選自由W 及無胺基酸所組群組，X2是選自由I及Y所組群組，X3是選自由N、S及I所組群組，X4是選自由P、A及Y所組群組，X5是選自由N及Y所組群組，X6是選自由S及N所組群組，X7是選自由G及N所組群組，X8是選自由T及R所組群組，X9是選自由N及D所組群組，X! 〇是選自由Y及S 所組群組，X! i是選自由A及N所組群組，X12是選自由Q 及R所組群組，X13是選自由K及R所組群組，X14是選自由F及L所組群組，以及X15是選自由Q、K及R所組群組；或B)選自由下所組群組之CDRL : (i)—種選自由SEQ ID NOs:4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、 124、125及136所組群組之CDRL1，（ii) —種CDRL1，其胺基酸序列與（i)之CDRL 1的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，（iii)一種選自由下所組群組之CDRL1 胺基酸序列：KSSQSXiXLYSSXzNXsNXALX^SEQ ID 200918553 NO: 1 07)，其中X!是選自由V及I所組群組，X2是選自由S 及N所組群組，X3是選自由E及K所組群組，X4是選自由 Y及F所組群組，以及X5是選自由T及A所組群組； RASXiX2X3X4X5X6YX7X8(SEQ ID NO:118)，其中 X,是選自由Q及P所組群組，X2是選自由S及Y所組群組，X3是選自由V、L及I所組群組，Χ4是選自由s及C所組群組，X5 是選自由S及N所組群組，X6是選自由S、I、T及無胺基酸所組群組，X7是選自由F及L所組群組，以及X8是選自由 A 及 N 所組群組，或 XiXasXiXsXsYXasXgXuNXHVX^ (SEQ ID NO:125)，其中乂1是選自由I、S及T所組群組， X2是選自由R及G所組群組，X3是選自由T及S所組群組， X4是選自由R及S所組群組，X5是選自由G及S所組群組， X6是選自由S、Η及D所組群組，X7是選自由I及V所組群組，X8是選自由A及G所組群組，X9是選自由無胺基酸及G所組群組，X1Q是選自由S及Y所組群組，Xh是選自由Y及T所組群組，以及X! 2是選自由Q、N及S所組群組，或（iv)—種選自由 SEQ ID NOs:5、17、29、34、41、65、77、 101、113、130、131 及 137 所組群組之 CDRL2，（v)—種 CDRL2 ,其胺基酸序列與（iv)之CDRL2的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，或（vi)—種選自由下所組群組之 CDRL2胺基酸序列：XiXaXsXdsXgXASEQ ID NO:130)，其中乂1是選自由G、T及W所組群組，X2是選自由T及A所組群組，X3是選自由S及A所組群組，X4是選自由S及T所組群組，X5是選自由R及L所組群組，X6 -18- 200918553 是選自由A、E及Q所組群組，以及X7是選自由T及S所組群組；或 XiX2X3X4RPS(SEQ ID NO:131)，其中 X,是選自由E及S所組群組，χ2是選自由D、V及N所組群組，X3 是選自由D、S及N所組群組，以及X4是選自由Q、G及Η 所組群組。在一態樣，文中提供之經單離之抗原結合蛋白質可爲單株抗體，多株抗體，重組抗體，人類抗體，人類化抗體，嵌合型抗體，多專一性抗體或其抗體片段。在另一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質的抗體片段可爲Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，Fv片段，雙鏈抗體（diabody)或單鏈抗體分子。在進一步之一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質是人類抗體且能爲IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。又在另一態樣，經單離之抗原結合蛋白質可偶合至標記基並能與所提供經單離之抗原結合蛋白質之一抗原結合蛋白質競爭結合至人類GM-CSF的細胞外部分。又在另一態樣，經單離之抗原結合蛋白質與文中提供之抗原結合蛋白質競爭結合至人類GM-CSF受體互相作用部分。在一具體例中，抗原結合蛋白質是單株抗體，多株抗體，重組抗體，人類抗體，人類化抗體，嵌合型抗體，多專一性抗體或其抗體片段。在相關具體例中提供人類及單株抗體以及包括Fab片段、Fab1片段、F(aV)2片段、Fv片段之抗原片段，雙鏈抗體（diabody)或單鏈抗體分子。在其他具體例中，抗原結合蛋白質是IgG卜、IgG2-、IgG3-或IgG4-型。再者所提供爲偶合至標記基之經單離之抗原結合蛋白質。 -19- 200918553 又在另一態樣，本發明進一步預期抑制GM-CSF活性以限制導致或影響包括巨噬細胞/單核球、樹突細胞（DC)、嗜中性白血球及嗜伊紅白血球之骨髓系統細胞分化、存活、增殖及活化的訊息，及/或DC分化及/或活化訊息。此外，本發明預期抑制GM-CSF活性以限制單核球衍生之巨噬細胞 (第1型巨噬細胞）產生高程度的發炎前驅細胞激素，例 IL-23 。在另一態樣，所提供爲編碼結合至GM-CSF之抗原結合蛋白質之經單離多核苷酸，其中該經單離多核苷酸是可操作地連接（Ο p e r a b 1 y 1 i n k e d)到一調節序列。在另一態樣，所提供爲表現載體及經表現載體（其含有前述編碼能結合至GM-CSF之抗原結合蛋白質之經單離多核苷酸）轉形或轉染之宿主細胞。在另一態樣，所提供爲製備抗原結合蛋白質之方法，其包括從分泌抗原結合蛋白質之宿主細胞製備抗原結合蛋白質之步驟。又在另一態樣，提供一種醫藥組成物，含有至少一前述提供之抗原結合蛋白質以及醫藥可接受賦形劑。在一具體例中，醫藥組成物可含有選自由放射性同位素、放射性核種、毒素或治療性及化學治療性基團所組群組之額外活性劑。又在另一態樣，提供一種於病人治療或預防與GM-CSF 有關症狀之方法，包括對病人投與有效量之至少一種經單離之抗原結合蛋白質。在一具體例中，症狀是選自由風濕病疾病、自體免疫疾病、血液疾病、腫瘤疾病、發炎疾病、神經 -20 - 200918553 系統之退化症狀、胃腸道、胃尿道症狀、內分泌失調等等所組群組。在一具體例中，症狀是選自由多發性硬化症（MS)、類風濕性關節炎（RA)、氣喘、牛皮癬、異位性皮膚炎及類肉瘤病（sarcoidosis)之失調或疾病所組群組。在另一具體例中包括單獨以經單離之抗原結合蛋白質之治療或以組合治療。又在另一具體例中，症狀是選自乳癌、前列腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、星狀細胞癌（astrocytic cancer)、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臟癌以及卵巢癌。在另一態樣，本發明提供一種在病人抑制GM-CSF結合至GM-CSFR細胞外部分之方法，包括投與有效量之至少一種文中提供之抗原結合蛋白質。又在另一態樣，本發明提供一種在病人抑制人類 GM-CSFR磷酸化之方法，包括投與有效量之至少一種文中所述之抗原結合蛋白質。又在另一態樣，當經單離之抗原結合蛋白質投與至病人時，降低單核球趨化性。在一具體例中，抗原結合蛋白質抑制單核球遷移。又在另一具體例中，當經單離之抗原結合蛋白質投與至病人時，單核球遷移到腫瘤被抑制。又在另一態樣，進一步提供一種治療多發性硬化症之方法，包括投與文中所述經單離之抗原結合蛋白質。所預期之多發性硬化症爲復發-緩解型多發性硬化症、惡化-復發型多發性硬化症、原發性漸進型多發性硬化症或蓄發性漸進型多發性硬化症。 200918553 又在一態樣所提供爲一種治療類風濕性關節炎之方法’包括投與文中所述經單離之抗原結合蛋白質。又在一態樣是提供經單離之抗原結合蛋白質，其以人類 GM-CSF的1對數範圍內與食蟹獼猴GM-CSF交叉反應，且其在GM-CSF依存性分析測量以iC5G<lnM結合gm-CSF。這些及其他態樣將於文中更詳細說明。所提供之各態樣可包括文中提供之各種具體例。因此預期包括一個要素或要素組合之每一具體例能包括於所述之每一態樣。所揭示之其他特性 '目的及優點在之後的詳細說明中是顯而易見。【實施方式】詳細說明應Bt解本;發明不受限於文中所述之特定方法論、步驟程序以及試劑等等，且就其本身而論可變化。文中使用之專門用語之目的僅爲敘述特殊具體例，且不因此限制所揭示之範圍，範圍只由申請專利範圍定義。本發明之方法及技術通常根據所屬技術領域熟知的慣用方法’以及敘述於本說明書從頭到尾所引用及討論的各種一般的及更專一的參考資料來實施。例如參閱Sambrook ei «/.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed·，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。用語“多核苷酸”包括單股及雙股核苷酸，以及包括基因 -22 - 200918553 體DNA，RNA ’ mRNA，cDNA，或來自合成或其與正常天然所見序列無關聯之某些組合。含有具體指定序列之經單離多核苷酸，除具體指定序列之外可包括用於至多十個或甚至多達二十個其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括可操作地連接（operably linked)調節序列（該調節序列控制所述核酸序列之編碼區域的表現），及/或可包括載體序列。含有該多核苷酸之核苷酸可爲核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的修飾型。該修飾包括鹼基修飾，例如溴尿苷 (bromouridine)及肌苷（inosine)衍生物；核糖修飾，例如 2 ’，3 ’ -二去氧核糖；以及核苷酸間連接修飾，例如硫代磷酸化（phosphorothioate) ’ 一硫代憐酸化（phosphorodithioate)，硒代磷酸化（phosphoroselenoate)，二硒代磷酸化 (phosphorodiselenoate) ，安利硫代磷酸化 (phosphoroanilothioate)’ 安利磷酸化（phoshoraniladate)U& 醯胺碟酸化（phosphoroamidate)。用語“寡核苷酸”意指含有100或更少核苷酸之多核苷酸。在某些具體例中，寡核苷酸長度爲10至60個鹼基。在其他具體例中’寡核苷酸長度爲12、13、14、15、16、17、 18、19或20至4G個核苷酸。寡核苷酸可爲單股或雙股，例如用於構築突變基因。寡核苷酸可爲有意義或反意義寡核苷酸。寡核苷酸能包括用於偵測分析之可偵測標記，例如放射性標記’蛋光標記’半抗原（hapten)或抗原標記。寡核苷酸可使用作爲例如PCR引子，選殖用引子或雜交探針。用語“調節序列”是指一多核苷酸序列能影響連接 -23 - 200918553 (ligate)到它之編碼序列的表現及處理。此等調節序列的性質可隨宿主生物體而異。在特殊具體例中，用於原核生物之調節序列可包括啓動子，核糖體結合位置以及轉錄終止序列。舉例而言’用於真核生物之調節序列可包括含有轉錄因子用之一個或複數識別位置之啓動子，轉錄增強子 (enhancer)序列以及轉錄終止序列。“調節序列”能包括前導（leader)序列及/或接合搭檔序列（fusion partner sequences)。用語“載體”意指用於將編碼情報資料之蛋白質轉移進入宿主細胞之任何分子或實體（例如核酸，質體，噬菌體或病毒）。用語“表現載體”或“表現構築體”是指適用於宿主細胞轉形之載體，以及含有核酸序列指揮及/或調節（與宿主細胞有關連）其操作地連接之一個或一個以上異質編碼區域的表現。表現構築體可包括但不限爲影響或調節轉錄、轉譯之序列；若存在插入序列（intron)，則爲影響其可操作地連接之編碼區域的R N A接合（s p 1 i c i n g)。文中所用“可操作地連接（operably linked)”意指此用語所適用的成分有關聯於使他們實行他們的固有功能。舉例而言’在載體中“可操作地連接”至蛋白質編碼序列之調節序列，例如啓動子是經安排以至於調節序列的正常活性誘使蛋白質編碼序列轉錄導致所編碼蛋白質的重組表現。用語“轉染（transfect ion)”意指戲胞攝入外來或外源性 DNA，且當外源性DNA已導入細胞膜內時則細胞已經“被轉染”。許多轉染技術爲技藝所熟知並揭示本文中。例如參閱 Graham et al., 1973, Virology 52:456: Sambrook et al., 2001, Molecular 200918553

Cloning: A Laboratory Manual, supra] Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene U_:197。此等技術能用於導入一個或一個以上外源性DNA部分（moiety)於適合的宿主細胞。用語“多胜肽’’或“蛋白質”意指具有天然蛋白質之胺基酸序列的大分子，也就是由天然存在及非重組細胞所產生之蛋白質；或由基因工程或重組細胞所產生之蛋白質，以及含有具天然蛋白質之胺基酸序列之分子，或具有一個或一個以上胺基酸刪除自、添加到及/或取代於天然序列之分子。該用語也包括胺基酸聚合物，其中一個或一個以上胺基酸是對應之天然存在.的胺基酸及聚合物之化學類似物。用語“多胜肽”及“蛋白質”包含GM-CSF抗原結合蛋白質、抗體或具有一個或一個以上胺基酸刪除自、添加到及/或取代於抗原結合蛋白質的序列。用語“多胜肽片段”是指相較於全長天然蛋白質，具有胺基末端刪除、羧基末端刪除及/或內部刪除之多胜肽。相較於天然蛋白質，此等片段亦可含有經修飾胺基酸。在特定具體例中，片段約爲5至500個胺基酸長度。例如片段能爲至少 5、 6、 7、 8、 10、 14、 20、 50、 70、 100、 110、150、200' 250、300、350、400 或 450 個胺基酸長度。可用的多胜肽片段包括抗體的免疫功能性片段，包括結合功能部位（domain)。至於GM-CSF-結合蛋白質，可用片段包括但不限爲CDR區域、重鏈或輕鏈的可變功能部位、抗體鏈的一部分或僅其包括兩CDR之可變區域等等。用語“經單離之蛋白質”是指從蛋白質或多胜肽或將妨 -25 - 200918553 礙其治療、診斷、預防、硏究或其他用途之其他污染物中純化之蛋白質。多胜肽之“變異體”（例如抗原結合蛋白質或抗體）含有胺基酸序列中一個或一個以上胺基酸殘基是插入、刪除自及 /或取代進入相對於另一多胜肽序列的胺基酸序列。變異體包括接合蛋白質。多胜肽之“衍生物”是已經過化學修飾，例如經由接合到另一化學部分（moiety)之多胜肽（例如抗原結合蛋白質或抗體），在某種程度上不同於插入、刪除或取代之變異體。整個說明書所用與生物材料，例如多胜肽、核酸、宿主細胞等等有關之用語“天然存在”，是指在自然界發現的材料。文中所用“抗原結合蛋白質”意指專一結合特定目標抗原之蛋白質，所提供之抗原爲GM-CSF或人類GM-CSF。當解離常數（Kd)爲S10_8 Μ時，稱一抗原結合蛋白質“專一結合”其目標抗原。當Kd爲yx 1 (Γ9 Μ時，抗體以“高親和力”專一結合抗原，以及當Kd爲$5χ 10·1G Μ時，以“非常高親和力”專一結合抗原。在一具體例中，抗體具有SIO·9 Μ 的Kd，以及約lx l〇_4/sec的停止速率（0ff-rate)。在一具體例中，停止速率爲< 1 X 1 〇_5。在其他具體例中，抗體將以介於約ΙΟ·8 Μ及ΙΟ·10 Μ間之Kd結合至GM-CSF或人類，且又在另一具體例中以Kd βχΐ (Γ115結合。 “抗原結合區域”意指專一結合特定抗原之蛋白質或蛋白質的一部分。舉例而言’抗原結合蛋白質之一部分含有與 -26 - 200918553 抗原互相作用之胺基酸殘基並賦予該抗原結合蛋白質對於抗原的專一性及親和力’此稱爲“抗原結合區域，，。抗原結合區域典型包括一個或—個以上“互補結合區域，，（“CdRs”）。某些抗原結合區域也包括一個或—個以上“骨架（framework)，，區域。“ C D R ”是提供抗原結合專一性及親和力之胺基酸序列。”骨架（framework)”區域有助於維持CDrs的適當構形以促進抗原結合區域與抗原間的結合。在某些態樣’提供結合GM-CSF蛋白質或人類GM-CSF 之重組抗原結合蛋白質。在此文章中，“重組蛋白質”是使用重組技術製造之蛋白質’亦即透過文中所述重組核酸的表現。製造重組蛋白質的方法及技術爲技藝熟知。用語“抗體”是指一完整免疫球蛋白的任何同型物或其片段可與完整抗體競爭專一結合至目標抗原，包括例如嵌合型、人類化、完全人類以及雙專—性（bi specific)抗體。此等 “抗體”爲抗原結合蛋白質的一種類。完整的抗體通常應含有至少兩全長重鏈及兩全長輕鏈，但某些場合可包括較少鏈，例如天然存在於大羊駝（camelids)的抗體，其中可只含有重鏈。抗體可只衍生自單一來源；或可爲“嵌合型，，，亦即抗體的不同部分可衍生自兩不同抗體，進一步如下所述。抗原結合蛋白質、抗體或結合片段可於融合瘤、由重組DNA技術或酵素或化學切割完整抗體來製造。除非其他指示，用語“抗體”除含有兩全長重鏈及兩全長輕鏈之抗體以外，包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白質，其實例敘述於下。用語“輕鏈”包括全長輕鏈及其片段具有足夠序列賦予 -27 - 200918553 結合專一性。典型的哺乳動物抗體中’應可發現包括可變區域功能部位（variable region domain)vL以及恆定區域功能部位（constant region domain)CL之全長輕鏈，其中輕鏈的可變區域功能部位接近多胜肽的胺基末端。典型的人類抗體輕鏈包括κ鏈或λ鏈。用語“重鏈”包括全長重鏈及其片段具有足夠可變區域序列賦予結合專一性。哺乳動物全長重鏈抗體典型包括一可變區域功能部位vΗ以及三個恆定區域功能部位：CΗ 1、Cη2 及C Η 3。V η功能部位接近多胜肽的胺基末端，以及C η功能部位接近羧基末端，以CH3最接近多胜肽的羧基末端。人類重鏈典型可爲同型物，包括IgG(包括.IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4 亞型），IgA(包括 IgAl 及 IgA2 亞型），lgM 及 IgE。文中所用用語抗體之“功能片段”（或簡稱“片段’，）或免疫球蛋白鏈（重鏈或輕鏈）’是含有抗體之一部分（不論該部分如何取得或合成）的抗原結合蛋白質，其至少缺乏全長鏈中某些胺基酸但仍能專一結合至抗原。此等片段具生物活性他們專一結合至目標抗原，並能與其他抗原結合蛋白質（包括完整抗體）競爭專一結合至指定的抗原決定基。在一態樣，此等片段將保留至少一 CDR存在於全長輕鏈或重鏈，以及在某些具體例中將含有單一重鏈及/或輕鏈或其一部分。這些生物活性片段可經由重組DNA技術製造，或可經由或酵素或化學切割抗原結合蛋白質（包括完整抗體）來製造。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限於Fab，Fab，，FUb，；)2， F v，功能部位抗體以及單鏈抗體，以及可衍生自任何哺乳動 -28 - 200918553 物來源，包括但不限於人類、小鼠、大鼠、大羊駝或兔子。進一步預期，文中揭示之抗原結合蛋白質的功能部分，例如一個或一個以上CDRs能共價鍵結到蛋白質或小分子以創造一針對體內特殊標的治療劑，具有雙功能治療特性或具有延長的血清半衰期。 “Fab片段”是由一輕鏈及一重鏈的CH1與可變區域所組成。Fab的重鏈分子與另一重鏈分子無法形成二硫鍵。 “Fc”區域含有兩個重鏈片段，其含有抗體的CH1及CH2 功能部位。這兩重鏈片段是經由兩個或兩個以上二硫鍵以及 CH3功能部位的疏水性互相作用保持在一起。 “Fab’片段”含有一輕鏈及一重鏈的一部分（其含有VH 功能部位與CH 1功能部位，以含CH1及CH2功能部位間之區域），以至於在兩Fab’片段的兩重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(aV)2分子。 “F(ab')2片段”含有兩個輕鏈及兩個重鏈（在CH1及Ch2 功能部位間含有恆定區域的一部分），如此在兩重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab')2片段是由兩Fab'片段所組成，其經由兩重鏈間的二硫鍵保持在一起。 “ F v區域”含有來自重鏈及輕鏈的可變區域，但缺乏恆定區域。 “單鏈抗體”是Fv分子，其中重鏈及輕鏈可變區域已經由彈性連接體（flexible linker)連結形成單一多胜肽鏈，其形成一抗原結合區域。單鏈抗體的細節討論於PCT公開第WO 88/0 1649 及美國專利第 4,946,778 及 5,260,203 號。 -29 - 200918553 “功能部位抗體”是一免疫功能性免疫球蛋白片段，只含有重鏈的可變區域或輕鏈的可變區域。在某些場合，兩個或兩個以上vH區域與胜肽連接體共價結合產生二價功能部位抗體。二價功能部位抗體的兩個vH區域可對準相同或不同的抗原。 “二價抗原結合蛋白質”或“二價抗體”含有兩抗原結合位置。在某些場合，兩結合位置具有相同抗原專一性。二價抗原結合蛋白質及二價抗體可爲雙專一性，參閱以下。 “多專一性抗原結合蛋白質”或“多專一性抗體”是對準超過一個抗原或抗原決定基。 “雙專一性（bispecific)”、“雙重專一性（dual-specific)” 或“雙功能（bi functional)”抗原結合蛋白質或抗體分別爲混合的抗原結合蛋白質或抗體，具有兩不同的抗原結合位置。雙專一性抗原結合蛋白質及抗體是多專一性抗原結合蛋白質抗體的一種類，且可由各種方法產生，包括但不限於融合瘤的融合或Fab'片段的連接。例如參閱Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321: Kostelny et al., 1992, J. Immunol. iii:l547-1553。雙專一性抗原結合蛋白質或抗體的兩結合位置將結合至兩不同抗原決定基，其可存在於相同或不同蛋白質標的上。用語“中和性抗原結合蛋白質”或“中和性抗體”是分別指結合至配體（ligand)的抗原結合蛋白質或抗體，防止配體對其結合伙伴的結合並阻礙配體結合至其結合伙伴所將產生的生物反應。評估抗原結合蛋白質，例如抗體或其免疫功 -30- 200918553 能性片段之結合及專一性，抗體或片段將實質抑制配體對其結合伙伴的結合，當抗體過多，則降低結合伙伴結合到配體的量至少約 2 0 %、3 0 %、4 0 %、5 0 %、6 0 %、7 0 %、8 0 %、8 5 %、 90%、95%、97%、99%或更大（在活體外競爭結合分析中測量）。至於GM-CSF抗原結合蛋白質，此等中和性分子將減少GM-CSF結合GM-CSFR的能力。文中用於競爭相同抗原決定基之抗原結合蛋白質（例如中和性抗原結合蛋白質或中和性抗體）使用用語“競爭”時，意指抗原結合蛋白質之間的競爭是由分析測定，其中抗原結合蛋白質（例如抗體或其免疫功能性片段）在測試下防止或抑制參考抗原結合蛋白質（例如配體或參考抗體）專一結合至共同抗原（例如GM-CSF或其片段）。能使用多種競爭結合分析，例如固相直接或間接放射性免疫分析（RIA)，固相直接或間接酵素免疫分析（EIA)，三明治競爭分析（例如參閱 Stahli er α/.，1983, Mer/zo心 k 以叮mo/ogy £:242-253)，固相直接生物素 -抗生物素蛋白 EIA(例如參閱 Kirkland ei α/.，1986，/. /mm⑽〇/. ；ί V 111:3614-3619)，固相直接標記分析，固相直接標記三明治分析（例如參閱 Harlow and Lane, 1988，J Cold Spring Harbor Press)，使用1-125標記之固相直接標記RIA (例如參閱 Morel ei α/., 1988, Afo/ec. /mwmno/. 25.:7-15) ’固相直接生物素-抗生物素蛋白ElA(例如參閱Cheung，ei α/.，1990，F/ro/og少 176:546-552)，以及直接標記 RIA (Moldenhauer W «/.，1990，J. Immunol. 32:77-82)。通常此等分析包含使用結合在固體表面或具有這些任一的細胞之經純化抗原，未標記之測試抗原結合 -31- 200918553 蛋白質以及標記之參考抗原結合蛋白質。競爭性抑制作用是在測試抗原結合蛋白質存在下，經由測定結合到固體表面或細胞的標記量來測量。通常測試抗原結合蛋白質是過量的。經由競爭分析（競爭抗原結合蛋白質）確認抗原結合蛋白質包括抗原結合蛋白質如同參考抗原結合蛋白質結合至相同抗原決定基，以及抗原結合蛋白質結合至鄰近的抗原決定基而足以最接近被參考抗原結合蛋白質結合之抗原決定基以發生立體障礙。關於測定競爭結合用方法之額外詳述提供於文中實施例中。通常當競爭抗原結合蛋白質過量時，其將抑制參考抗原結合蛋白質對共同抗原的專 —結合至少 4 0 %、4 5 %、5 0 %、5 5 %、6 0 %、6 5 %、7 0 % 或 75%° 在某些場合，結合被抑制至少8 0 %、8 5 %、9 0 %、9 5 °/。或9 7 % 或更多。用語“抗原”是指能經選擇性結合劑，例如抗原結合蛋白質（包括例如抗體或其免疫功能片段）結合的分子或分子的一部分，且另外能用於動物以產生能結合至該抗原的抗體。抗原可具有一個或一個以上能與不同抗原結合蛋白質（例如抗體）互相作用之抗原決定基。用語“抗原決定基（epitope)”包括能專一結合至抗原結合蛋白質之任何決定基。抗原決定基是抗原的一區域，經專一對準該抗原之抗原結合蛋白質所結合，且當抗原爲蛋白質時’包括與抗原結合蛋白質接觸之專一胺基酸。最常見爲抗原決定基存在於蛋白質上，可理解包括非胺基酸的轉譯後修飾，但在某些場合可存在於其他種類分子上，例如核酸。抗 -32- 200918553 原決定基可包括分子的化學活性表面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有專一的三次元結構特徵及 /或專一的電荷特徵。通常專一於特定目標抗原之抗體在蛋白質及/或大分子之複合體混合物中將優先辨認目標抗原上的抗原決定基。用語“相同（identity)”是指兩個或兩個以上多胜肽分子或兩個或兩個以上多核苷酸之序列間的關係，是經由對齊 (aligning)及比較序列決定。“相同百分比”意指比對分子中胺基酸或核苷酸間相同殘基的百分比，並基於所比對最小分子的大小來計算。對於這些計算，對齊中的空隙（若有的話）必須經特殊的數學模式或電腦程式處理（亦即“演算法”）。能用於計算對齊之核酸或多胜肽相同性之方法包括那些敘述於 Computational Molecular Biology^ (Lesk, A. M.? ed.)5 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W.5 ed.)? 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.)5 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et αί, 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073。在計算相同百分比時，要比對的序列以使序列間得到最大相配的方式對齊。用於決定相同百分比之電腦程式是GCG 套裝軟體，其包括 GAP(Devereux eiW.，1984, iVwc/. 11:387;

Genetics Computer Group, University of Wisconsin，Madison, WI)。電腦演算法GAP是用於對齊兩個多胜肽或多核苷酸以決定序列相 -33 - 200918553 同百分比。序列是以達到他們各自胺基酸或核苷酸之最理想相配來對齊（“相配距離（matched span)”是以演算法決定）。使用間隔打開的扣分（gap opening penalty)(其係以3x平均對角線計算，其中“平均對角線（a v e r a g e d i a g ο n a 1) ”是所用比較矩陣的對角線平均；“對角線”是經由特殊比較矩陣分配到每一完美胺基酸配對的計分或數目）以及間隔延長的扣分（gap extension penalty)(其通常爲間隔打開扣分的1/10倍）以及比較矩陣（例如PAM 250或BLOSUM 62)連接演算法。在特定具體例中，經由演算法也使用標準比較矩陣（PAM 25 0比較矩陣參閱 Dayhoff ei α/.，1978, o/iVoiez_« Segwe/tce SirMCiwre 1:345-352; BLOSUM 62 比較矩陣參閱 Henikoffeia/·，1992,尸 roc. #a/7. Zcai/. Sc?·· i/.S1」· ^£:10915-10919)。使用GAP程式測定多胜肽或核苷酸序列相同百分比之可取用參數如下：演算法：Needleman ei α/., 1 9 7 0, J. Mol. Biol. 4 8 :443 -45 3 ；比較矩陣：；6[081；^[62來自1^11丨1^(^【“^/.,1992，同前；間隔扣分：1 2 (但末端間隔無扣分）間隔長度扣分：4 相似度閾値：0 爲對齊兩胺基酸序列用之特定對齊設計可能導致只有兩序列的短暫區域相配，且此小的對齊區域可具有非常高的序列相同性，即使兩全長序列之間無顯著關聯。因此，若希望造成跨越目標多胜肽至少5 0個連續胺基酸的對齊，所選之對齊方法（GAP程式）可經調整。 -34- 200918553 文中使用之“實質純”意指所述分子種類是佔絕大多數的種類；亦即以莫耳計，其比同一混合物中任何其他個別種類更大量。在特定具體例中，實質純分子是一組成物中目標種類含有存在之全部大分子種類的至少5〇%(以莫耳計）。在其他具體例中，實質純組成物將含有組成物中存在之全部大分子種類的至少8 0 %、8 5 %、9 0 %、9 5 %或9 9 %。在特定具體例中，已純化實質均一的物質至以慣用偵測方法不會在組成物中偵測到污染物的程度，且因此該組成物由單一可偵測到的大分子種類所組成。用語“治療有效量”是指所測定之GM-CSF抗原結合蛋白質在哺乳動物中產生任何治療反應的量。此等治療有效量. 可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易確定。 “胺基酸”包括其在技藝之標準含義。20種天然存在的胺基酸及其依照慣用之縮寫。參閱/mwwno/ogj-vl办加心价，2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, eds.)5 Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)。20種慣用胺基酸之立體異構物（例如D_胺基酸），非天然胺基酸例如[α]-、[α]-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸及其他非慣用胺基酸也適用於作爲多胜肽成分。非慣用胺基酸之實例包括：4-羥脯胺酸，[γ]-羧基麩胺酸，[ε] -Ν,Ν,Ν-三甲基離胺酸，[ε]-Ν-乙醯基離胺酸，0-磷酸絲胺酸’ Ν-乙醯基絲胺酸，Ν-甲醯基甲硫胺酸，3-甲基組胺酸， 5-羥離胺酸’ [σ]-Ν-甲基精胺酸，以及其他類似胺基酸及亞胺基酸（例如4-羥脯胺酸）。文中使用之多胜肽標記法，根據標準用法及習慣，左手方向爲胺基末端方向以及右手方向爲 -35 - 200918553 羧基末端方向。一般槪述文中提供結合 GM-CSF 蛋白質，尤其是人類 GM-CSF(hGM-CSF)蛋白質之抗原結合蛋白質。所提供之抗原結合蛋白質是多胜肽，有如文中所述一個或一個以上互補決定區域（CDRs)嵌入及/或加入其中。在某些抗原結合蛋白質中，CDRs是嵌入“骨架（framework)”區域，其將CDR(s)定位使達到CDR(s)之適合的抗原結合特性。一般而言，所提供之抗原結合蛋白質能妨礙、阻斷、降低或調整GM-CSFR與 GM-CSF間之互相作用。文中敘述之某些抗原結合蛋白質是抗體或衍生自抗體。在特定具體例中，抗原結合蛋白質之多胜肽結構是基於抗體，包括但不限於單株抗體，雙專一性抗體，最小抗體 (minibodies)，功能部位抗體，合成抗體（本文中有時稱爲“抗體擬物（antibody mimetics)”），嵌合型抗體，人類化抗體，人類抗體，抗體接合物（本文中有時稱爲“抗體共軛體”），及其各別片段。此不同結構進一步說明於本文中。文中提供之抗原結合蛋白質已證明能結合至某些 GM-CSF的抗原決定基，特別是人類GM-CSF。因此文中提供之抗原結合蛋白質能抑制GM-CSF活性。特別是抗原結合蛋白質結合至這些抗原決定基尤其可抑制GM-CSFR傳訊息的誘發、GM-CSF誘發之細胞生長或分化及其他隨GM-CSF 結合至GM-CSFR誘發之生理作用。文中揭示之抗原結合蛋白質具有各種用途。某些該抗原 -36 - 200918553 結合蛋白質’例如可用於專一結合分析、GM-CSF(特別是 hGM-CSF)或其配體的親和力純化，以及鑑定gm-CSF活性之其他拮抗劑的篩選分析。某些該抗原結合蛋白質可用於抑制GM-CSFR結合至GM-CSF，或抑制GM-CSF的自體磷酸化。抗原結合蛋白質可用於如文中說明之各種治療應用。舉例而言，某些 GM-CSF抗原結合蛋白質可用於治療與 GM-CSF有關之症狀，例如在病人降低單核球趨化性，抑制單核球遷移到腫瘤，或抑制腫瘤中與腫瘤有關之巨噬細胞的積聚，如文中進一步說明。抗原結合蛋白質之其他用途，包括例如與.GM-CSF有關之疾病或症狀的診斷以及決定 GM-CSF存在與否的篩選分析。文中所述之某些抗原結合蛋白質可用於治療與GM-CSF活性有關之結果、症狀及/或病變。這些包括但不限於各種發炎性疾病。 GM-CSF抗原結合蛋白質提供可用於調節GM-CSF活性之各種選擇性結合劑。這些試劑包括例如抗原結合蛋白質，其含有抗原結合功能部位 (例如單鏈抗體，功能部位抗體，免疫附著（immunoadhesion) 及具抗原結合區域之多胜肽）且專一結合至GM-CSF多胜狀，特別是人類 GM-CSF。這些試劑，例如可用於抑制 GM-CSFR結合至GM-CSF，並能藉此用於抑制一個或一個以上與GM - C S F傳訊息有關之活性。一般而言，所提供之抗原結合蛋白質典型含有如文中所述之一個或一個以上CDRs(例如1’2’3,4’5或6個CDRs)。 -37 - 200918553 在某些場合’抗原結合蛋白質含有（a) —多胜狀結構以及（b) —個或一個以上CDRs插入及/或加入多胜肽結構。多胜肽結構可採用各種不同形式。舉例而言’其能爲或含有天然存在抗體之骨架（framework)，或其片段或變異體，或本質上可完全合成。各種多胜肽結構之實例進一步說明於下。在特定具體例中，抗原結合蛋白質之多胜肽結構是抗體或衍生自抗體，包括但不限於單株抗體，雙專一性抗體，最小抗體（minibodies)，功能部位抗體，合成抗體（本文中有時稱爲“抗體擬物（antibody mimetics)”），嵌合型抗體，人類化抗體，人類抗體，抗體接合物（本文中有時稱爲“抗體共軛體”），及各別之一部分或片段。在某些場合，抗原結合蛋白質是抗體的免性片段（例如Fab，Fab’，F(ab’）2或scFv)。本文中進一步說明及定義各種結構。本文中提供之某些抗原結合蛋白質專一結合至人類 GM-CSF。使用之“專一結合”意指平衡解離常數爲<1〇_8至 < 1 0 -10 Μ，或 < 1 0.9 至 < 1 0.10 Μ。在具體例中，使用抗原結合蛋白質於治療應用，抗原結合蛋白質能抑制、妨礙或調整一種或一種以上之gm_csf的生物活性。在此情形，當過多抗體降低結合至GM-CSFR之人類GM-CSF的量時，抗原結合蛋白質專一結合及/或實質抑制人類GM-CSF結合至GM-CSFR至少約40%、60%、80%、 8 5 %或以上（例如在活體外競爭結合分析中測量結合），反之亦然。GM-CSF具有許多不同的生物作用，其能在許多不同分析中在不同的細胞種類中測量；本文中提供此等分析之實 -38 - 200918553 例。提供之某些抗原結合蛋白質具有與天然存在之抗體有關的典型結構。這些抗體的結構單位通常含有一個或一個以上的四聚體，每一四聚體由相同兩對多胜狀鏈所組成，雖然某些種類的哺乳動物也產生只具有單一重鏈之抗體。典型的抗體中，每對或每雙包括一全長“輕”鏈（在特定具體例中，約25 kDa)及一全長“重”鏈（在特定具體例中，約50-70 kDa)。各個免疫球蛋白鏈由數種“免疫球蛋白功能部位”所構成，各大約由90至1 1 0個胺基酸所組成並表現摺疊形態特徵。這些功能部位組成抗體多胜肽的基本單位。每一鏈的胺基末端部分包括一個主要負責抗原辨認之可變功能部位。羧. 基末端部分在演化上比該鏈的另一末端更保守，並稱爲“恆定區域”或“C區域”。人類輕鏈一般分類爲κ及λ輕鏈，且此等每一含有一可變功能部位及一恆定功能部位。重鏈通常分類爲μ、δ、γ、α、或ε鏈，且這些分別定義爲抗體之同型物 IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有數種亞型，包括但不限於 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG^IgM 亞型包括 IgMl 及 IgM2。 IgA亞型包括IgAl及IgA2。在人類，IgA及IgD同型物含有四重鏈及四輕鏈；IgG及IgE同型物含有兩重鏈及兩輕鏈；以及IgM同型物含有五重鏈及無輕鏈。重鏈C區域通常含有一個或一個以上功能部位，其可負責效應功能。重鏈恆定區域功能部位的數目將視同型物而異。I g G重鏈，例如各含有三個C區域功能部位，已知爲CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有這些同型物及亞型。在特定具體例中， -39 - 200918553 GM-CSF 抗體是 IgGl、IgG2 或 IgG4 亞型。在全長輕鏈及重鏈中，可變及恆定區域是經由約12個或以上之胺基酸的“J”區域連結，以及重鏈也包括約1 0個或以上之胺基酸之“D”區域。例如參閱Fundamental Immunology，2nd ed.，Ch_ 7 (Paul, W.，ed.) 1989, New York: Raven Press。每一輕鏈 / 重鏈對之可變區域通常形成抗原結合位置。 1.抗體之可變功能部位本文中提供之各種重鏈及輕鏈可變區域描述於表1。這些可變區域各可附加於上述重鏈及輕鏈恆定區域，以分別形成完整的抗體重鏈及輕鏈。再者，如此所產生之重鏈及輕鏈序列各可經組合形成完整的抗體結構。所提供爲抗原結合蛋白質，含有選自由Vh1、Vh2、Vh3、 Vh4、Vh5、Vh6、Vh7、Vh8、Vh9、VH10、VH11 及 Vh12 所組群組之抗體重鏈可變區域，及/或選自由Vl1、Vl2、Vl3、

Vl4、 Vl5、 Vl6、 Vl7、 Vl8、 Vl9、 VLl〇、 VL11 及 Vl12 所組群組之抗體輕鏈可變區域，如下表1所示。此類型之抗原結合蛋白質通常能以式“ vHx/vLy”命名，其中“ X ”對應於重鏈可變區域的數目以及“ y ”對應於輕鏈可變區域的數目，如表1所列： -40 - 200918553 表1 :示範性VH及Vl鏈

命名胺基酸序列 VhI QVQLVQSGAEVKKPGASVKYSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNSAQKFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCAREGGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS rSE〇. ID. NO:91 Vh2 QVQLYQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD DTAYYYCARDKWLDGFDYWGQGTLVTVSS S [SEQ. ID. NO:211 Vh3 QVQLVQSGAAVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTASMELSRLRSD DTAVYFCARDRWLDAFDIWGQGTMVTVSS TSEQ. ID.NO:331 Vh4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQRFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCARAPYDWTFDYWGQGTLVTVSS TSEQ. ID.NO:451 Vh5 QVQLYQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGRNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCARDRWLDAFEIWGQGTMVTVSS [SEQ. ID. NO:571 Vh6 QVQLVQSGAEVKQPGASVKVSCEASGYTFTSYGISWVRQAPGQGL EWMGWISAYNGNTDYAQKLQGRVTMTTDTSTSAAYMELRSLRSD DTAVYYCARQRYYYSMDVWGQGTTVTVSS TSEQ. ID. NO:691 Vh7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSWLRSD DTAVYYCARDRWLDAFDIWGQGTMVTVS TSEQ. ID. N0:811 Vh8 QVQLYQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSGYYMYWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYARKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD DTAVYYCARRPWELPFDYWGOGTLVTVSS [SEQ. ID. NO:931 Vh9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFKGRVTMTRDTSISTAHMELSRLRSD DTAVYYCVRNGDYVFTYFDYWGQGTLVTVSS TSEQ. ID. NO:1051 Vh1〇 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSD -41 - 200918553 命名胺基酸序列 DTAVYYCARFGYFGYYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ. ID. NO:1171 VhII QYQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQG LEWMGWINPNSGGTNYAQKFRGRVTMTRDTSISTAYVELSRLRSDD TAVYYCARDPYTSGFDYWGQGTLVTYSS rSEQ. ID. NO:1291 Vh12 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRSGGYYWSWIRQHPGKG LEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTA VYYCAREDTAMDYFDYWGQGTLYTVSS TSEQ. ID. NO:1411 VL1 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSILYSSSNENFLTWYQQKPGQ PPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYAVYYCQQ YFSVFRTFGQGTRVEIK [SE〇. ID. NO:31 Vl2 EIVLTQSPGTLSLSPGDRATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRL LIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDRS PRTFGQGTKVEIK [SEQ. ID. NO:151 Vl3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRL LIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTVSRLEPEDFAVYYCQQYDRS PRTFGQGTKVEIK [SEQ. ID. NO:271 Vl4 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQYISNTYLAWFQQKPGQAPRL LIYGAATRATGIPDRFSGSGSGTDFTFTISRLEPEDFAVYYCQQYGSS PWTFGQGTTVEIK [SEQ. ID. NO:391 Vl5 EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVCSSYLAWYQQKPDQAPR LLISGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYDRS PRTFGQGTKVEIK [SEQ. ID.NO:511 Vl6 NFMLAQPHSVSESPGKTVTISCIRTSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTT VIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSCD ISNVVFGGGTKLTVL TSEQ. ID. NO:631 Vl7 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQVPRL LIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTVSRLEPEDFAVYYCLQYDRS PRTFGQGTKVEIK TSEQ. ID. NO:751 -42- 200918553 命名胺基酸序列 Vl8 EIVLTQSPGTLSLSLGERAILSCRASQSLSSIYLAWYQQKPGQAPGLL IYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYATSP WTFGQGTKVEVK [SEQ. ID. NO:871 Vl9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKL LIYTASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSFP ITFGPGTKVDIK [SEQ. ID. NO:991 Vl1〇 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAP KLMIYEVSGRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSF TGSSTWLFGGGTKLTVL TSEQ. ID. NO.llll VL11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASPSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLL IYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGWSP RTFGQGTKVEIK TSE〇. ID. NO: 1231 Vl12 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSHIGSNTVNWYQHLPGTAPKL LIYSNNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWD DSLNGPVFGGGTKLTVL [SEQ. ID. NO:135] 表1所列各重鏈可變區域可與任一表1所示輕鏈可變區域組合形成抗原結合蛋白質。此等組合之實例包括VH 1與 VL1、VL2、VL3、VL4、Vl5、VL6、V L 7、V L 8、V L 9、V L 1 〇、 VL11 及 VL12 之任一組合，或 Vh2 與 Vl1、Vl2、Vl3、Vl4、 Vl5、Vl6、Vl7、Vl8、Vl9、VL10、VL11 及 VL12 之任一組合等等。在某些場合，抗原結合蛋白質包括至少一重鏈可變區域及/或一輕鏈可變區域來自表1所列者。在某些場合，抗原結合蛋白質包括至少兩不同重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域來自表1所列者。此等抗原結合蛋白質之一實例含有（a) 一 VhI 以及（b)VH2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6、Vh7、Vh8、Vh9、 VHl〇、VH1 1 或 VH12 之一。 -43 - 200918553 另一實例含有（a) — Vh2 以及（b)VHl、VH3、Vh4、VH5、 VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11 或 VH12 之一。又另一實例含有（a)— Vh3 以及（b)VH 卜 Vh2、Vh4、Vh5、Vh6、Vh7、 Vh8、Vh9、VH10、VH11 或 Vh12 之一等等。再者，如此抗原結合蛋白質之另一實例含有（a) — VL1 以及（b)VL2、Vl3、Vl4、Vl5、Vl6、Vl7' Vl8、Vl9、VlIO、 VL11或VL12之一。再者，如此抗原結合蛋白質之另一實例含有（a) —' Vl2 以及（1))Vl1、Vl3、Vl4、Vl5、Vl6、Vl7、 Vl8、Vl9、VL10、VL1 1或VL12之一·。再者，如此抗原結合蛋白質之另一實例含有（a) — VL3以及（b)VLl、VL2、VL4、 VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VLl〇、yLll 或 VL12 之一等等。重鏈可變區域的各種組合可與任何輕鏈可變區域各種組合來組合。在其他情形中，抗原結合蛋白質含有兩相同輕鏈可變區域及/或兩相同重鏈可變區域。如一實施例，抗原結合蛋白質可爲抗體或免疫功能性片段，其包括兩輕鏈可變區域及兩重鏈可變區域組合輕鏈可變區域對及重鏈可變區域對，如表 1所列。所提供之某些抗體含有重鏈可變功能部位，其含有胺基酸之序列只有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12' 13、14或15個胺基酸殘基不同於選自VH1、VH2、VH3、VH4、 Vh5、Vh6、Vh7、Vh8、Vh9、VHl〇、VH11 及 VH12 之重鏈可變功能部位之序列，其中各個此等序列差異獨立爲一個胺基酸刪除、插入或取代。某些抗體之重鏈可變區域含有胺基 -44- 200918553 酸之序列爲具有至少7 0 %、7 5 %、8 0 %、8 5 %、9 0 %、9 5 %、 9 7%或99%序列相同於乂!41、¥以、¥«3、〃^14、¥^15、¥116、 VH7、VH8、VH9、VH10、VH11及VH12之重鏈可變區域的胺基酸序列。某些抗體含有輕鏈可變功能部位，其含有胺基酸之序列只有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12' 13、 14 或 15個胺基酸殘基不同於選自VL1、Vl2、Vl3、Vl4、Vl5、 Vl6、Vl7、Vl8、Vl9、VL10、VL11 及 VL12 之輕鏈可變功能部位之序列，其中各個此等序列差異獨立爲一個胺基酸刪除 '插入或取代。某些抗體之輕鏈可變區域含有胺基酸之序歹丨j 具有至少 7 0 %、7 5 %、8 0 % ' 8 5 %、9 0 %、9 5 %、9 7 % 或 9 9 % 序列相同於 VL1、VL2、VL3、Vl4、VL5、Vl6、VL7、VL8、 VL9、VL10、VL11及VL12之輕鏈可變區域的胺基酸序列。還有其他抗原結合蛋白質，例如抗體或免疫功能性片段包括恰如所述變異體重鏈及變異體輕鏈之變異體形式。 2. CDRs 在傳統抗體中，CDRs是嵌入重鏈及輕鏈可變區域的骨架（framework)中，在此他們構成負責抗原結合及辨識之區域。相同物種之免疫球蛋白鏈的可變功能部位通常展現類似的整個結構，含有以高可變區域連結之相當保守的骨架區域 (FR)，通常稱爲“互補決定區域”或CDRs。可變區域含有至少三個重鏈或輕鏈CDRs。來自上述各重鏈/輕鏈對之兩鏈的 CDRs，通常經由骨架區域對齊以形成一結構專一結合目標蛋白質（例如GM-CSF)上的專一抗原決定基可。從N-末端至 -45 - 200918553 C-末端，天然存在的輕鏈及重鏈可變區域通常皆遵照這些要素的下歹[J 順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。對於指定號碼給佔據這些功能部位各位置之胺基酸，已設計一編號系統。所給抗體之互補決定區域（CDRs)及骨架區域（FR)可使用此系統識別。此編號系統定義於Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991, or Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917: Chothia et al., 1989, 施加以141:878-883。本文中提供之CDRs不僅可用於定義傳統抗體結構之抗原結合功能部位，並如文中所述可嵌入其他各種多胜肽結構中。本文中揭示之抗原結合蛋白質是多胜肽，於其中移植、插入及/或加入一個或一個以上CDRs。抗原結合蛋白質可具有1、2、3、4、5或6個CDRs。然而亦可預期抗原結合蛋白質可具有超過6個CDRs。如此抗原結合蛋白質可具有例如一重鏈 CDR1(“CDRH1”），及 / 或一重鏈 CDR2(“CDRH2”），及/或一重鏈 CDR3(“CDRH3”），及/或一輕鏈 CDR1 (“CDRL1”），及 /或一輕鏈 CDR2(“CDRL2”），及 /或一輕鏈 CDR3(“CDRL3”）。一些抗原結合蛋白質包括 C D RH 3及 CDRL 3二者。某些文中揭示之抗原結合蛋白質含有一個或一個以上胺基酸序列是相同的，或具有實質序列相同於表 2(CDRH)及表3(CDRL)所示一個或一個以上CDRs的胺基酸序列。 -46 - 200918553

表2 :示範性CDRH序列 SEQ ID NO: 胺基酸序列 10 GYYIH 11 WINPNSGGTNSAQKFRG 12 EGGYSYGYFDY 22 GYYMH 23 WINPNSGGTNYAQKFKG 24 DKWLDGFDY 35 WINPNSGGTNYAQKFQG 36 DRWLDAFDI 47 WINPNSGGTNYAQRFRG 48 APYDWTFDY 59 WINPNSGGRNYAQKFQG 60 DRWLDAFEI 70 SYGIS 71 WISAYNGNTDYAQKLQG 72 QRYYYSMDV 94 GYYMY 95 WINPNSGGTNYARKFQG 96 RPWELPFDY 108 NGDYVFTYFDY 119 WINPNSGGTNYAQKFRG 120 FGYFGYYFDY 132 DPYTSGFDY 142 SGGYYWS 143 YIYYSGSTYYNPSLKS 144 EDTAMDYFDY 200918553

表3 :示範性CDRL序列 SEQ ID NO: 胺基酸序列 4 KSSQSILYSSSNENFLT 5 WASTRES 6 QQYFSVFRT 16 RASQSVSSSYFA 17 GASSRAT 18 QQYDRSPRT 40 RASQYISNTYLA 41 GAATRAT 42 QQYGSSPWT 52 RASQSVCSSYLA 64 IRTSGSIASNYYQ 65 EDDQRPS 66 QSCDISNVV · 77 GTSSRAT 78 LQYDRSPRT 88 RASQSLSSIYLA 90 QQYATSPWT 100 RASQSISNYLN 101 TASSLQS 102 QQSFSFPIT 112 TGTSSDVGGYNYVS 113 EVSGRPS 114 SSFTGSSTWL 124 RASPSVSSSYFA 126 QQYGWSPRT 136 SGSRSHIGSNTVN 137 SNNHRPS 138 AAWDDSLNGPV 在一態樣，文中揭示之C D Rs包括衍生自相關單株抗體 -48 - 200918553 群之共有序列（consensus sequences)。如文中所述’“共有序列，，是指胺基酸序列具有保守胺基酸共有於一些序列及所給胺基酸序列中不同之可變胺基酸之間。所提供之CDR共有序歹IJ包括對應於各CDRH卜CDRH2、CDRH3、CDRL卜CDRL2 及 CDRL3 之 CDRs。共有序列是使用對應於抗-GM-CSF抗體之VH及Vl CDRs標準譜系分析（phylogenic analyses)決定。共有序列的決定是經由維持CDRs連續於對應VH或VL之相同序列。 CDRH1 共有序列包括由 (SEQ ID NO:94)組成之胺基酸序列，其中乂,是選自由G及無胺基酸所組群組，X2是選自由G及無胺基酸所組群組’ X3是選自由Y及F所組群組，X4是選自由T及S所組群組， X5是選自由T、S及G所組群組，X6是選自由G及S所組群組，X7是選自由Y及G所組群組，X8是選自由I及Μ所組群組，以及Χ9是選自由Η及S所組群組。在一態樣，CDRH 1 共有爲 SEQ ID NO :94，X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9，其中 Xi是選自由G及無胺基酸所組群組，X2是選自由G及無胺基酸所組群組，X3是選自由Y及F所組群組，X4是選自由 T及S所組群組，X5是選自由T、S及G所組群組，X6是選自由G及S所組群組，X7是選自由Y及G所組群組，X8是選自由I及Μ所組群組，以及X9是選自由Η及S所組群組。 CDRH2 共有序列包括由 (SEQ ID NO :106)組成之胺基酸序列，其中X!是選自由W及無胺基酸所組群組，X2是選自由I及Y所組群組，X3是選 -49 - 200918553 自由N、S及I所組群組，Χ4是選自由P、A及Y所組群組’ x5是選自由Ν及Υ所組群組，x6是選自由S及Ν所組群組， Χ7是選自由G及Ν所組群組，Χ8是選自由Τ及R所組群組， Χ9是選自由Ν及D所組群組，Χ1()是選自由Υ及S所組群組，X i 1是選自由Α及Ν所組群組，X, 2是選自由Q及R所組群組，X! 3是選自由K及R所組群組，X! 4是選自由F及 L所組群組，以及X15是選自由Q、K及R所組群組。在一態樣，CDRH2 共有序列是 WINPNSGGTNX1 AX2X3FX4G，其中XI是Υ或S，X2是Q或R，X3是Κ或R，以及Χ4是R、 K 或 Q(SEQ ID NO__28)。 CDRH3共有序歹IJ包括選自由XiX2X3X4X5X6X7X8FDX9 (SEQIDNO:83)所組群組之胺基酸序列，其中乂1是選自由E 及無胺基酸所組群組，X2是選自由G及無胺基酸所組群組， X3是選自由P、D及G所組群組，X4是選自由Y、W、R及 K所組群組，X5是選自由S、W、F及T所組群組，X6是選自由Y及L所組群組，X7是選自由D及G所組群組，X8是選自由Y、無胺基酸及A所組群組，以及X9是選自由Μ、T 及V所組群組。 CDRL 1共有序列包括選自由下所組群組之胺基酸序列：KSSQSXaYSSXzNXsNXiLX^SEQ ID NO: 107)，其中 Xi 是選自由V及I所組群組，x2是選自由s及N所組群組， Χ3是選自由Ε及Κ所組群組，Χ4是選自由Υ及F所組群組，以及是選自由Τ及Α所組群組；RASXiXzXJJsXeYXyXs (SEQ ID ΝΟ:1 18)，其中X,是選自由Q及P所組群組，Χ2 -50 - 200918553 是選自由s及Y所組群組，Χ3是選自由V、L及I所組群組’ X4是選自由S及C所組群組，X5是選自由S及N所組群組’ X6是選自由S、I、T及無胺基酸所組群組，X7是選自由F 及L所組群組，以及X8是選自由A及N所組群組；以及 '^^^々XsXsXTXsXgXioNXnVXdSEQ ID NO:125)，其中 X!是選自由I、S及T所組群組，X2是選自由R及G所組群組，X3是選自由T及S所組群組，X4是選自由R及S所組群組，x5是選自由G及S所組群組，x6是選自由S、Η及D 所組群組，Χ7是選自由I及V所組群組，Χ8是選自由Α及 G所組群組，X9是選自由無胺基酸及G所組群組，X! 〇是選自由S及Y所組群組，X! !是選自由Y及T所組群組，以及 x12是選自由Q、N及S所組群組。在一態樣，CDRL1共有序歹丨j是RASQX1X2X3X4X5YX6A，其中XI是s或y，X2是 ¥、1或！^，乂3是3或>^，\4是3或（：，乂4是3、丁、3或¥， X5 是 F 或 L(SEQ ID NO:30)。 CDRL2共有序列包括選自由下所組群組之胺基酸序列：XiXzXsXiXsXsXASEQ ID NO:130)，其中 X,是選自由 G、 T及W所組群組，X2是選自由T及A所組群組，X3是選自由S及A所組群組，χ4是選自由S及T所組群組，X5是選自由R及L所組群組，X6是選自由A、E及Q所組群組，以及X?是選自由T及S所組群組；以及XtXzXsXjPSiSEQ ID NO: 13 1)，其中Χι是選自由E及S所組群組，X2是選自由D、V及N所組群組，X3是選自由D、S及N所組群組，以及X4是選自由Q、G及Η所組群組。在一態樣，CDRL2共 200918553 有序列爲 GXl SSRAT，其中 XI 爲 A 或 T(SEQ ID NO:34)。 CDRL3共有序列包括選自由下所組群組之胺基酸序列：XAXzXsXAXsXsXvTXSEQIDNOJq，其中乂,是選自由 Q及L所組群組，X2是選自由Y及S所組群組，X3是選自由D、G及F所組群組，X4是選自由R、T及S所組群組， X5是選自由S及V所組群組，X6是選自由F及P所組群組，以及 X7是選自由 R 及 W 所組群組；以及 XiXzXsXiDSSNXsXeXWSEQ ID NO:89)，其中乂1是選自由 S 及A所組群組，X2是選自由S及A所組群組，X3是選自由 W及F所組群組，X4是選自由D及T所組群組，X5是選自由G、W及無胺基酸所組群組，X.6是選自由V、L及P所組群組，以及X6是選自由V及無胺基酸所組群組。在一態樣， CDRL3共有序列是QQXdzXsXeXsXeT，其中X,是Y或S， X2 是 F、G 或 A，X3 是 S、T 或 W，X4 是 V、S、F，X5 是 F 或 P，X6 是 R、W 或 I(SEQIDNO:46)。在另一態樣，所提供之CDRs是：（a)選自由下所組群組之 CDRH: (i)選自由 SEQ ID NO:10、22、70、94 及 142 所組群組之 CDRH1，（Π)選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、 47、59、71、95、106、119 及 143 所組群組之 CDRH2，（iii) 選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、96、108' 120、132 及 144 所組群組之 CDRH3，以及（iv)—（i)、（ii)及 (iii)之CDRH，其含有一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入，但不超過5、4、3、2或1個胺基酸；（B)選自由下所組群組之 CDRL: (i)選自由 SEQ ID N0:4、16、30、40、52、 200918553 6 4、8 8、1 0 0、1 0 7、1 1 2、1 1 8、1 2 4、1 2 5 及 1 3 6 所組群組之 CDRL1，（ii)選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、 77、101、113、130、13 1 及 137 所組群組之 CDRL2，（iii) 選自由 SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、84、89、90、 102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3，以及（iv) —（i)、 (ii)及（iii)之CD RL ’其含有一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入，但不超過5、4、3、2或1個胺基酸胺基酸。又在另一態樣，表2及3所列之C D Rs變異體形式具有至少80%、8 5%、9 0%或95%序列相同於表2及3所列之CDR 序列。

根據一態樣，所提供爲結合GM - C S F之經單離之抗原結合蛋白質，含有：（A)—個或一個以上選自由下所組群組之重鏈互補決定區域（CDRH): (i)選自由SEQIDNO:10、22、 70、94及142所組群組之€〇11111，（丨丨）選自由8£(^1〇^^〇:11、 23、28、35、47、59、71、95、106、119 及 143 所組群組之 CDRH2，（iii)選自由 SEQ IDNO:12、24、36、48、60、72、 83、96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3，以及（iv) 一（i)、（ii)及（iii)之CDRH，其含有一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入但不超過5、4、3、2或1個胺基酸；（B) 一個或一個以上選自由下所組群組之輕鏈互補決定區域 (CDRL):⑴選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 100、107、112、118、124、125 及 136 所組群組之 CDRL1， (ii)選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77、101、 113、130、131 及 137 所組群組之 CDRL2,（iii)選自由 SEQ ID 200918553 NO:6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 及138所組群組之CDRL3，以及（iv)— (i)、（ii)及（iii)之 CDRL ’其含有一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入，但不超過5、4、3、2或1個胺基酸；或（C) —個或一個以上之（A)重鏈CDRH以及一個或一個以上之（B)輕鏈CDRL。又在另一具體例中，經單離之抗原結合蛋白質可含有： (A) 選自由下所組群組之CDRH: (i)選自由SEQ ID NO:10、 22、70、94及142所組群組之CDRH1，（ii)選自由SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 及 143 所組群組之 CDRH2，以及（iii)選自由 SEQ ID NO:12、24、36、 48、60、72' 83、96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3; (B) 選自由下所組群組之CDRL: (i)選自由SEQ ID NO:4、 16、 30、 40、 52、 64、 88、 100、 107、 112' 118、 124、 125 及136所組群組之CDRL1，（ii)選自由SEQ ID NO:5、17、 29、34、41、65、77' 101、113、130、131 及 137 所組群組之 CDRL2，（iii)選自由 SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、 84、89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3;或 (C) —個或一個以上之（A)重鏈CDRH以及一個或一個以上之 (B)輕鏈 CDRL。在另一具體例中，可變重鏈（VH)具有至少80%、85%、 90 %或95 %序列相同於選自由SEQ ID NO:9、21、33、45、 57、69、81、93、105、117、129及141所組群組之胺基酸序列，及/或可變輕鏈（VL)具有至少80%、85%、90%或95% 序列相同於選自由 SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63' 75、 -54 - 200918553 87、99、111、123及135所組群組之胺基酸序列。在另一態樣，提供結合GM-CSF之經單離之抗原結合蛋白質，該抗原結合蛋白質包括：A)選自由下所組群組之重鏈互補決定區域（CDRH):⑴選自由SEQ ID NOs:12、24、36、 48、60、72、83、96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3, (ii) 一 CDRH3，其胺基酸序歹IJ與（i)之CDRH3的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，（iii)選自由 X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9(SEQ ID NO:83)所組群組之 CDRH3 胺基酸序列，其中X i是選自由E及無胺基酸所組群組，X2 是選自由G及無胺基酸所組群組，X3是選自由P、D及G 所組群組，是選自由Y、W、R及K所組群組，X5是選_自由S、W、F及T所組群組，X6是選自由Y及L所組群組， X7是選自由D及G所組群組，X8是選自由Y、無胺基酸及 A所組群組，以及X9是選自由Μ、T及V所組群組；及/或 Β)選自由下所組群組之輕鏈互補決定區域（CDRL) : (i)選自由 SEQ ID NOs:6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、 114、126及138所組群組之CDRL3，（ii)— CDRL3，其胺基酸序列與（i)之CD RL3的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，以及iii)選自由下所組群組之CDRL3胺基酸序列：XiQX2X3X4X5X6X7T(SEQ IDNO:84)，其中乂丨是選自由Q及L所組群組，χ2是選自由Y及S所組群組，X3 是選自由D、G及F所組群組，X4是選自由R、T及S所組群組，X5是選自由S及V所組群組，X6是選自由F及P所組群組，以及 X7是選自由 R及 W所組群組；以及 -55 - 200918553

XjXaXsXADSSNXsXeXnSEQIDNOJW，其中乂,是選自由 S 及A所組群組，X2是選自由S及A所組群組，X3是選自由 W及F所組群組，χ4是選自由D及T所組群組，X5是選自由G、W及無胺基酸所組群組，χ6是選自由v、L及P所組群組及Χ7是選自由V及無胺基酸所組群組。在另一具體例中，抗原結合蛋白質進一步含有：Α)選自由下所組群組之CDRH: (i)選自由SEQ ID NOs:10、22、70、 94及142所組群組之CDRH1，（ii)一 CDRH1，其胺基酸序列與（i)之CDRH1的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，（iii)選自由 XiXzGXsXdFXsXeYXvXsX^SEQ ID N0:94)所組群組之CDRH1胺基酸序列，其中X1是選自由G 及無胺基酸所組群組，X2是選自由G及無胺基酸所組群組， X3是選自由Y及F所組群組，X4是選自由T及S所組群組， X5是選自由T、S及G所組群組，X6是選自由G及S所組群組，X7是選自由Y及G所組群組，X8是選自由I及Μ所組群組，以及Χ9是選自由Η及S所組群組，或（iv)選自由 SEQIDNOs:ll、23、28、35、47、59、71、95、106、119 及 143所組群組之CDRH2，（v)— CDRH2，其胺基酸序列與（iv) 之CDRH2的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或

取代，或（vi)由 X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X1〇X11Xl2X13Xi4Xi5G

(SEQ ID NO:106)CDRH2組成之胺基酸序列，其中 X!是選自由W及無胺基酸所組群組，X2是選自由I及Y所組群組， X3是選自由N、S及I所組群組，X4是選自由P、A及Y所組群組，X5是選自由N及Y所組群組，X6是選自由S及N -56 - 200918553 所組群組，X7是選自由G及N所組群組，X8是選自由T及 R所組群組，x9是選自由Ν及D所組群組，X,。是選自由Υ 及S所組群組，X! i是選自由Α及Ν所組群組，Χ12是選自由Q及R所組群組，Χ13是選自由Κ及R所組群組，Χ14是選自由F及L所組群組，以及Χ15是選自由Q、Κ及R所組群組；或Β)選自由下所組群組之CDRL : (i)選自由SEQ ID NOs:4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、 124、125及136所組群組之CDRL1，（ii)一 CDRL1，其胺基酸序列與（i)之CDRL 1的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，（iii)選自由下所組群組之CDRL1胺基酸序歹 1J ^KSSQSXiXLYSSXzNXsNXAX^SEQ ID NO:107)，其中X i是選自由V及I所組群組，X2是選自由S及N所組群組，X3是選自由E及K所組群組，X4是選自由Y及F所組群組，以及 X5是選自由 T 及 A 所組群組； RASXiXzXsXgXsXeYXaySEQ ID NO:118)，其中 X,是選自由Q及P所組群組，X2是選自由S及Y所組群組，X3是選自由V、L及I所組群組，x4是選自由S及C所組群組，X5 是選自由S及N所組群組，X6是選自由S、I、T及無胺基酸所組群組，X7是選自由F及L所組群組，以及X8是選自由 A 及 N 所組群組；或 XiXaAAXsXeYXTXsXgXwNXHVXu (SEQ ID NO:125)，其中Χι是選自由I、S及T所組群組， X2是選自由R及G所組群組，X3是選自由T及S所組群組’ X4是選自由R及S所組群組，X5是選自由G及S所組群組， X6是選自由S、Η及D所組群組，X7是選自由I及V所組 -57 - 200918553 群組，Χ8是選自由A及G所組群組，Χ9是選自由無胺基酸及G所組群組，X1Q是選自由S及Υ所組群組’ Xu是選自由Y及T所組群組，以及X! 2是選自由Q、N及S所組群組，或（iv)選自由 SEQ ID N〇s:5、17、29、34、41、65、77、101、 1 13、130、13 1 及 137 所組群組之 CDRL2，（v) — CDRL2，其胺基酸序列與（iv)之CDRL2的差異爲不超過2個胺基酸之胺基酸添加、刪除或取代，或（vi)選自由下所組群組之CDRL2 胺基酸序列：X!X2X3X4X5X6X7(SEQ IDNO:130)，中 X,是選自由G、T及W所組群組，X2是選自由T及A所組群組， x3是選自由s及A所組群組，x4是選自由S及T所組群組， X5是選自由R及L所組群組，X6是選自由A、E及Q所組群組，以及X7是選自由T及S所組群組；或XiXzXsX^PS (SEQ ID NO:131)，其中Χι是選自由E及S所組群組，X2 是選自由D、V及N所組群組，X3是選自由D、S及N所組群組，以及X4是選自由Q、G及Η所組群組。在一態樣，本文中提供之經單離之抗原結合蛋白質可爲單株抗體’多株抗體，重組抗體，人類抗體，人類化抗體，嵌合型抗體，多專一性抗體或其抗體片段。在另一具體例中，本文中提供之經單離之抗原結合蛋白質的抗體片段，可爲Fab片段，Fab1片段，F(ab')2片段，Fv 片段，雙鏈抗體（diabody)或單鏈抗體分子。在進一步之一具體例中，本文中提供之經單離之抗原結合蛋白質是人類抗體，且可爲IgGl-、IgG2-、IgG3-或IgG4-類型。 -58- 200918553 又在另一態樣，本文中提供之經單離之抗原結合蛋白質可偶合至一標記基且能與本文所提供經單離之抗原結合蛋白質之一抗原結合蛋白質競爭結合至人類GM-CSF的細胞外部分。在一具體例中，當投與本文所提供經單離之抗原結合蛋白質至病人時，能降低單核球趨化性、抑制單核球遷移到腫瘤或抑制腫瘤中與腫瘤有關之巨噬細胞的積聚。熟習該項技藝者可知，對於具有一個以上來自所述序列 CDR之任何抗原結合蛋白質，獨立選自所述序列CDRs之任合組合是有用的。因此，可製自具有1、2、3、4、5或6個獨立選自CDRs之抗原結合蛋白質。然而，如熟習該項技藝者可知，特定的具體例通常利用非反覆CDRs之組合，例j如抗原結合蛋白質通常不以兩CDRH2區域來製造等等。一些所提供之抗原結合蛋白質更詳細討論於下。抗原結合蛋白質以及結合抗原決定基當聲稱一抗原結合蛋白質結合指定殘基內之抗原決定基時，例如GM-CSF或GM-CSF之細胞外功能部位，舉例而言其意指該抗原結合蛋白質專一結合至由指定殘基組成之多胜肽（例如GM-CSF的指定節段）。此等抗原結合蛋白質通常不接觸GM-CSF或GM-CSF之細胞外功能部位內的每一殘基。並非GM-CSF或GM-CSF之細胞外功能部位內每單~胺基酸取代或刪除是顯著影響結合親和力所需。抗原結合蛋白質之抗原決定基專一性可由各種方法決定。一方法例如包括測試大量之約1 5個胺基酸跨越抗原序列且不同地增加小數量胺基酸（例如3個胺基酸）之重疊胜肽。該胜狀固定於微滴 -59 - 200918553 定皿的井內。固定可經由該胜肽的一末端生物素化而有效。可選擇地，相同胜狀的不同樣本可在胺基及羧基末端生物素化並固定在欲比較用的分隔井內。此可用於鑑定末端專一之抗原結合蛋白質。可選擇地，可包括額外的胜肽在感興趣之特殊胺基酸的終端。此方法可用於鑑定對GM-CSF內部片段 (或GM-CSF之細胞外功能部位）之末端專一之抗原結合蛋白質。使用抗原結合蛋白質或免疫功能性片段篩選專一結合至各個不同的胜肽。抗原決定基被定義爲存在一全部胜肽共有之胺基酸節段，抗原結合蛋白質對它顯現專一性結合。關於定義抗原決定基之專一方法的細節於實施例1 3中提出。競爭抗原結合蛋白質在另一態樣，提供之抗原結合蛋白質與一例示之抗體或 * 功能片段競爭結合至上述抗原決定基，以專一結合至 GM-CSF。此等抗原結合蛋白質亦可如文中例示之一抗原結合蛋白質，結合至相同抗原決定基，或重疊之抗原決定基。與例示之抗原結合蛋白質競爭或結合至相同抗原決定基之 X 抗原結合蛋白質及片段，被預期將顯示類似的功能特性。例示之抗原結合蛋白質及片段包括以上所述者，包括含於表 1、2及3之具重鏈及輕鏈、可變區域功能部位及CDRS者。 1.單株抗體提供之抗原結合蛋白質包括結合至GM-CSF之單株抗體。單株抗體可使用技藝已知的任何技術製造，例如免疫行程安排完全後，使收取自基因轉殖動物的脾臟細胞永生不死。能使用技藝已知的任何技術使脾臟細胞永生不死，例如 -60 - 200918553 經由使他們與骨髓瘤細胞融合以製造融合瘤。用於製造融合瘤融合步驟之骨髓瘤細胞較佳爲非抗體製造性、具有高融合效率且缺乏使他們無法生長於某些選擇性培養基而只支持所欲的融合細胞（融合瘤）生長的酵素。用於小鼠融合的適當細胞株實例包括 Sp-20 ’ P3-X63/Ag8，P3-X63-Ag8.653 ’ NS 1/1 .Ag 4 1 ， Sp210-Agl4，FO，NSO/U，MPC-11 ， MPC11-X45-GTG 1.7 及 S194/5XX0Bul;用於大鼠融合的適當細胞株實例包括 R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR9 8 3 F及 4B210。可用於細胞融合的其他細胞株爲 U-266， GM 1 5 00-GRG2 > LIC R L Ο N Η M y 2 及 U C 7 2 9 · 6。在.某些場合，在一具體例中，融合瘤細胞株之製造是以 GM-CSF免疫原免疫動物（例如具有人類免疫球蛋白序列之基因轉殖動物）；從被免疫動物收取脾臟細胞；融合收取之 # 脾臟細胞至骨髓瘤細胞株，藉此產生融合瘤細胞；從融合瘤細胞確定融合瘤細胞株並鑑定產生結合GM-CSF多胜肽之抗體的融合瘤細胞株。此等融合瘤細胞株及由他們產生之抗 ^ -GM-CSF單株抗體包含於本發明中。融合瘤細胞株分泌之單株抗體能使用技藝已知的任何技術純化。可進一步篩選融合瘤或單株抗體以鑑定具特殊性質之單株抗體，例如阻斷Wilt誘發活性之能力。此等篩選的實例提供於以下實施例中。 2.嵌合型及人類化抗體也提供以前述序列爲基礎之嵌合型及人類化抗體。用於作爲治療劑之單株抗體在使用之前可經各種修飾。一實施例 -61- 200918553 爲嵌合型抗體，其係由來自不同抗體的蛋白質節段（其共價連接以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能性部分）所構成之抗體。通常，重鏈及/或輕鏈之一部分是一樣於或同源於（homologous)衍生自特殊物種之抗體或屬於特殊抗體類型或亞型中之對應序列，而剩餘鏈是一樣於或同源於衍生自另一物種之抗體或屬於另一抗體類型或亞型中之對應序列。有關嵌合型抗體之方法，例如參閱美國專利第 4,8 1 6,5 6 7 號以及 Morrison e，α/.，1985，Proc. TVa". Jcac/. Sc/. C/M ^1:6851-6855。CDR移植敘述於例如美國專利第6,1 8 0,370號、第 5,693,762 號、第 5,693,76 1 號、第 5,5 8 5,089 及第 5,5 3 0，101 號。通常製造嵌合型抗體的目的是爲創造嵌合體，其中來自預計病人物種之胺基酸數目被最大化。一實施例是“ C D R移植”之抗體，其中該抗體含有一個或一個以上來自特殊物種或屬於特殊抗體類型或亞型屬於同型物抗體之互補決定區域（CDRs)，，而剩餘抗體鏈是一樣於或同源於衍生自另一物種之抗體或屬於另一抗體類型或亞型中之對應序列。用於人類時，可變區域或選自齧齒目動物抗體之CDRs常被移植到人類抗體，置換人類抗體中天然存在的可變區域或CDRs。嵌合型抗體之一可用類型爲“人類化”抗體。通常，人類化抗體是製造自最初產生於非人類動物之單株抗體。在此單株抗體之某些胺基酸殘基，通常來自抗體之非抗原辨識，係經修飾以同源於人類抗體對應同型物中之對應殘基。人類化能使用各種方法進行，例如經由對人類抗體之對應區域取代 -62 - 200918553 以至少一部分齧齒目動物可變區域（例如參閱美國專利第 5,5 8 5,0 8 9 號及第 5,693,762 號；Jones e，乂，1986， 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536)。在一態樣，文中提供之抗體輕鏈及重鏈可變區域之 CD Rs(參閱表2)被移植至相同、不同或親源物種 (phylogenetic species)抗體的骨架區域（FRs)。例如重鏈及輕鏈可變區域 VhI、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6、Vh7、Vh8、 Vh9、VH10、VH11 及 VH12，及 /或 VL1、Vl2、Vl3、Vl4、 Vl5 ' Vl6、Vl7、Vl8、Vl9、VLl〇、VL11 及 VL12 之 CDRs 可被移植至共有的人類FRs。爲創造共有的人類FRs ’來自數種人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FRs可經對齊以鑑定共有胺基酸序列。在其他具體例中’本文中揭示之重鏈或輕鏈 * 的FRs被來自不同重鏈或輕鏈的FRs置換。在一態樣’抗 -GM-CSF抗體之重鏈及輕鏈的FRs中罕見胺基酸不會被置換，而其餘的FR胺基酸被置換。“罕見胺基酸（rare amino 、 acid)’，是在一位置中的專一的胺基酸，此特殊胺基酸通常未見於FR。另外，來自一重鏈或輕鏈之經移植可變區域可與不同於本文所揭示之特殊重鏈或輕鏈恆定區域之恆定區域使用。在其他具體例中，經移植可變區域是單鏈Fv抗體的一部分。在特定具體例中，來自人類以外其他物種之恆定區域可與人類可變區域一起使用以產生混合抗體（hybrid antibodies)。 3.完全人類抗體 -63- 200918553 也提供完全人類抗體。製造專一於所給抗原但未使人類接觸該抗原之完全人類抗體之方法是可得的（“完全人類抗體”）°提供用於實施製造完全人類抗體之一具體方法是小鼠體液性免疫系統的“人類化，，。導入人類免疫球蛋白（Ig)所在於小鼠（其中小鼠的內源性Ig基因已被去活性）是在小鼠、能以任何所欲抗原免疫之動物中製造完全人類單株抗體（mAbs) 之一方法。使用完全人類抗體能免疫免疫原性及過敏性反應’其有些是因投與小鼠或衍生自小鼠的mAbs至人類作爲治療劑所引起的。完全人類抗體可經由免疫基因轉殖動物（通常爲小鼠）來製造’該動物能在缺乏產生內源性免疫球蛋白中製造全部人類抗體。用於此目的之抗原典型具有六個或六個以上連續的胺基酸，且可共軛至一載劑，例如半抗原。例如參閱 Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258: and Bruggermann et al., 1993, Year in 2:33。此方法之一實例中，基因轉殖動物的製造是使編碼小鼠免疫球蛋白鏈中重鏈及輕鏈的內源性小鼠免疫球蛋白所在失能，並插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質所在的人類基因體DNA到小鼠基因體大片段中。具有少於整體人類免疫球蛋白所在之經部分修飾之動物，之後經雜交以得到具有全部所欲免疫系統修飾之動物。當投與免疫原後’這些基因轉殖動物產生免疫專一於該免疫原之抗體，但具有人類而非鼠類的胺基酸序列’包括可變區域。此等方法之進一步詳細說明請參閱例如W096/33735及W094/02602。有關 -64 - 200918553 基因轉殖小鼠製造人類抗體的額外方法敘述於美國專利第 5,54 5,8 07 號、第 6,713,610 號、第 6,673,9 8 6 號、第 6，1 62,963 號、第 5,54 5,8 07 號、第 6,3 00，129 號、第 6,2 5 5,4 5 8 號、第 5,877,397 號、第 5,874,299 及第 5,545,806 號；PCT 公開號 W091/10741、W090/0 4036 以及 EP 546073B1 及 EP 546073A1。上述之基因轉殖小鼠於本文中稱爲“HuMab”小鼠，含有一人類免疫球蛋白基因微小基因座，其編碼未重新排列之人類重鏈（[μ]及[γ])及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列，和去活化內源性[μ]及[κ]鏈所在之靶突變（Lonberg W d.，I"4, Mi:856-859)。因此，該小鼠展現降低表現小鼠IgM或[κ]且對免疫作.用反應，以及導入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行型交換（class switching)及體細胞突變以產生高親和力人類 IgG[K]單株抗體（Lonberg α/.，·ίΜ/?Α·α.; Lonberg and Huszar，1995, ^ Intern. Rev. Immunol. 1_3_: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad.

Sci· 764:536-546)〇 HuMab 小鼠之製備詳細敘述於 Taylor 以 a/., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et aL, 1993, International I Immunology 5_:647-656; Tuaillon et aL, 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et aL, 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al. s 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546: Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85。進一步參閱美國專利第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,63 3,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661，016 號、第 -65- 200918553 5,814,318號、第5,874,299及第5,770,429號以及美國專利第 5,545，807 號；PCT 公開號 W〇 93/1227、WO 92/22646 及 WO 92/03 9 1 8。用於在這些基因轉殖小鼠製人類抗體之技術也揭示於 PCT 公開號 WO 9 8/24893 以及 Mendez W «/., 1997, TVaiwre 11:146-156。舉例而言，會 t使用 HCo7 及 HCol2 基因轉殖小鼠品系製造抗-GM-CSF抗體。使用融合瘤技術可製造並從如上所述之基因轉殖小鼠選擇具所欲專一性之抗原專一性人類mAbs。使用適合的載體及宿主細胞，此等抗體可經選殖及表現，或可從培養的融合瘤細胞收取抗體。完全人類抗體亦可衍生自噬菌體展現（phage display) 資料庫（例如揭示於 Hoogenboom ei α/., 1991，·/. Μο/· 5ίο/. 227:381; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581V 噬菌體展現技術模仿免疫篩選，透過在絲狀細菌噬菌體的表面展現抗體庫，隨後並經由他們結合至所選抗原來篩選噬菌體。此等技術之一敘述於PCT公開號WO 99/ 1 0494，其敘述使用此等方法對MPL-及msk-受體具高親和力及功能性作用抗體之單離。 4.雙專一性或雙功能性抗原結合蛋白質提供之抗原結合蛋白質也包括雙專一性及雙功能性抗體，其包括如上所述一個或一個以上CD Rs或一個或一個以上可變區域。雙專一性或雙功能性抗體在某些情形是具有兩不同重鏈/輕鏈對及兩不同結合位置之人造混合抗體。雙專一性抗體可由各種方法製造，包括但不限於融合瘤之融合或 Fab'片段的連接。例如參閱 Songsivilai and Lachmann，1990, C7in. -66- 200918553

Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553。 5.各種其他形式所提供之一些抗原結合蛋白質是以上揭不之抗原結合蛋白質的變異體型（例如具有表1 - 4所列序列者）。例如一些抗原結合蛋白質具有一個或一個以上保守胺基酸取代於一個或一個以上表1-4所列之重鏈或輕鏈、可變區域或CDRs。天然存在之胺基酸依據常見側鏈性質可分類爲： 1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，lie ; 2) 中性親水性：C y s，S e r，T h r，A s n，G1 n ; 3 )酸性：A s p，G1 u ; 4) 驗性：His，Lys，Arg; 5) 影響鏈方位之殘基：Gly，Pro ;以及 6) 芳香族：Trp ， Tyr ， Phe 。保守胺基酸取代可包括這些分類之一類的成員與同類另一成員的交換。保守胺基酸取代可包含非天然存在的胺基酸殘基，其通常經由化學胜肽合成倂入而非經由生物系統合成倂入。這些包括擬肽（peptidomimetics)及胺基酸部分的其他反向或顛倒形式。非保守取代可包括將以上種類之一成員交換爲另一種類之一成員。此等經取代殘基可導入同源於人類抗體之抗體的區域，或導入該分子的非同源區域。製造此改變時，根據特定具體例可考慮胺基酸的親水指數（hydropathic index)。蛋白質的親水槪廓是經由指定每一胺基酸一數値（“親水指數”）來計算，然後延著胜肽鏈重複平 -67 - 200918553 均這些數値。每一胺基酸依據其疏水性及電荷特性已被指定親水指數。他們爲：異白胺酸（ + 4.5)，纈胺酸（+ 4.2)，白胺酸（ + 3.8)，苯丙胺酸（ + 2.8)，半胱胺酸/胱胺酸（ + 2.5)，甲硫胺酸（+1.9)，丙胺酸（+1.8)，甘胺酸（-0.4)，酥胺酸（-0.7)，絲胺酸（-〇_8)，色胺酸（-0.9)，酪胺酸（-1.3)，脯胺酸（-1.6)，組胺酸（-3.2)，麩胺酸（-3.5)，麩醯胺酸（-3.5)，天冬胺酸（-3.5)，天冬醯胺酸（-3.5)，離胺酸（-3.9)以及精胺酸（-4.5)。技藝已瞭解親水槪廓在賦予蛋白質交互作用之生物功能上的重要性（例如參閱 Kyte d α/.，1982, J. Mo/. 5/〇/. 111:105-131)。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或計分之其他胺基酸，且仍保留類似的生物活性。基於親水指數製造之改變，在特定具體例中包括親水指數在±2以內之胺基酸的取代。在某些態樣，包括在± 1以內者，以及在其他態樣，包括在± 0.5以內者。技藝也已瞭解，基於親水性可有效產生類似胺基酸的取代，特別是藉此創造之生物功能性蛋白質或胜肽，預計可用於免疫具體例中，如目前情形。在特定具體例中，蛋白質之最大局部平均親水性（由其鄰近胺基酸之親水性所控制）關聯於其免疫原性及抗原結合或免疫原性，亦即關聯於蛋白質的生物特性。這些胺基酸殘基已被指定下列親水性値：精胺酸 ( + 3.0)，離胺酸（ + 3.0)，天冬胺酸（+ 3.0±1)，麩胺酸（+ 3.0±1) ’ 絲胺酸（ + 0.3)，天冬醯胺酸（ + 0.2)，麩醯胺酸（ + 0.2)，甘胺酸 (〇)，酥胺酸（-〇·4)，脯胺酸（_〇·5±1)，丙胺酸（-0.5)，組胺酸 -68 - 200918553 (-〇 . 5 )，半胱胺酸（-1 · 〇)，甲硫胺酸（-1 . 3) ’纈胺酸（_丨5 )，白胺酸（-1.8)，異白胺酸（-1.8)，酪胺酸（-2.3)’苯丙胺酸（_25) 以及色胺酸（-3.4)。依據類似親水性値製造改變時，在特定具體例中包括親水性値在±2以內之胺基酸的取代，在其他具體例中包括在± 1以內者；以及又於其他具體例中包括在 ±0.5以內者。在某些場合，亦可從一級胺基酸序列、依據親水性鑑定抗原決定基。這些區域也稱爲“抗原決定基核心區域”。示範性保守胺基酸取代提出於表4。表4:保守胺基酸取代原本的殘基示範性取代 Ala S e r Arg Ly s A sn Gin, His Asp Glu C y s S e r Gin A s n Glu Asp Gly Pro His A s n，Gin lie Leu, Val Leu lie, Val Ly s Arg, Gin, Glu Met L e u，lie Phe Met, Leu, Tyr S e r Thr Thr S e r Trp Tyr Ty r Trp, Phe Val lie, Leu -69 - 200918553 熟悉該項技藝者能使用熟知技術決定本文中所述之適宜的多胜肽變異體。熟悉該項技藝者經由對準不認爲對活性具重要性之區域，可確認能改變但未破壞活性之分子的適宜範圍。熟悉該項技藝者也能確認類似多胜狀間是保守的分子殘基及一部分。在進一步之具體例中，連可能對生物活性或結構是重要之區域可進行保守胺基酸取代而未破壞生物活性或對多胜肽結構無不利影響。此外，熟悉該項技藝者能檢閱結構-功能硏究，確認類似多胜肽中對活性或結構是重要的殘基。鑑於如此比較，能預料蛋白質中胺基酸殘基的重要性，該胺基酸殘基對應於類似蛋白質中對活性或結構是重要的胺基酸殘基。熟悉該項技藝者可選擇化學性類似之胺基酸取代此等經預料之重要胺基酸殘基。熟悉該項技藝者也能在類似多胜肽中分析有關其結構之3 -次元結構及胺基酸序列。考慮此等資訊，熟悉該項技藝者可預料有關其3次元結構之抗體胺基酸殘基的對齊。熟悉該項技藝者可選擇對預料將位於蛋白質表面的胺基酸殘基不製造基本的改變，因爲此等殘基可能涉及與其他分子的重要相互作用。再者，熟悉該項技藝者可製造含有單一胺基酸取代在每一所欲胺基酸殘基之測試變異體。然後使用關於 GM-CSF中和活性之分析法篩選這些變異體，（參閱以下實施例）如此可得到有關哪一胺基酸可經改變以及哪一個肯定不能改變的資訊。換言之，依據此等例行實驗所收集之資訊，熟悉該項技藝者能輕易決定胺基酸位置，其應避免單獨的或 -70- 200918553 組合其他突變之進一步取代。已有一些科學刊物致力於二級結構的預測。參閱Moult， 1996, Curr. Op. in Biotech, 7_:422-427; Chou et al., 1974, Biochem, 13:222-245; Chou et al.9 1974, Biochemistry 113:211 -222; Chou et al., 1978, Adv. EnzymoL Relat. Areas MoL Biol. 47:45-148; Chou et aL, 1979, Ann. Rev. 41:251-276 ;以及 Chou W α厂，1979,扪叩/y^. 乂丛:367-384。再者，目前可使用電腦程式協助預測二級結構。預測二級結構之一是基於同質性模擬（homology modeling)。舉例而言，具 v 有序列相同性大於30%或相似度大於40%之兩多胜肽或蛋白質常具有淚似結構拓撲學。近日之蛋白質結構資料庫（PDB) 的成長已使二級結構的可預測性提高，包括多胜肽或蛋白質結構中摺疊的可能數量。參閱Holm ei a/., 1999, iVwc/. 心义 22:244-247。已提出（Brenner eia/_，1997, Cwrr. Ο;?. Sirwc，. β/ο/.2:369-376) ^ 所給多胜肽或蛋白質中存有有限的摺疊數量，且一旦結構的關鍵數量已被解決，則結構預測將戲劇性地變得更準確。預測二級結構之額外方法包括“線程（threading)” ^ (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 生:15-19)，“槪廓分析（profile analysis)”（Bowie ei a/·, 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159: Gribskov et a/·，1987，iVoc. iVflfi. JcaA Sci. M:4355-4358)以及“進化連接 (evolutionary linkage)” （參閱 Holm，1999，同上，以及 Brenner, 1 997，同上）。在某些具體例中’製造胺基酸取代係爲：（1)降低對蛋白水解的感受性，（2)降低對氧化的感受性，（3 )改變對形成 200918553 之蛋白質複合體的結合親和力，（4)改變配體或抗原結合親和力，及/或（4)在此等多胜肽上給予或修飾其他物理化學或功能性特性。舉例而言，單一或多胺基酸取代（在特定具體例中，保守胺基酸取代）可製作於天然存在之序列。取代可製造於位在形成分子間接觸之功能部位外側之部分抗體。於此具體例中，可使用之“保守性胺基酸取代”不會實質改變親代序列的結構特徵（例如，一個或一個以上的置換胺基酸不會瓦解親代或天然抗原結合蛋白質之二級結構特徵）。技藝辯認多胜狀二級及二級結構之實例敘述於Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing ;以及 Thornton ei a/.,1991，Waiwre 354:105。額外較佳之抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親代或天然胺基酸序列中一個或一個以上半胱胺酸殘基被刪除或被取代以另一胺基酸（例如絲胺酸）。半胱胺酸變異體可用於特別是抗體必須再摺疊爲生物活性構形時。半胱胺酸變異體可具有比天然抗體更少的半胱胺酸殘基，且通常具有偶數以使來自未配對半胱胺酸之相互作用最小化。揭示之重鏈及輕鏈、可變區域功能部位及C D R s可用於製備多胜狀，該多胜肽含有能專一結合至GM-CSF多胜肽之抗原結合區域。舉例而言，表3及4所列之一個或一個以上 CDRs能共價或非共價倂入分子（例如多胜肽）以產生免疫附著。免疫附著可倂入CDR(s)作爲較大多胜肽鏈之一部分， -72 - 200918553 可共價連接CDR(s)至另一多多胜肽鏈，或可非共價倂入 CDR(s)。CDR(s)使免疫附著能專一結合至感興的特殊抗原 (例如一 GM-CSF多胜肽或其抗原決定基）。也提供基於本文中所揭示可變區域功能部位及CDRs之擬物（mimetics)(例如“胜肽擬物（peptide mimetics)”或“擬肽 (peptidomimetics)”）。這些類似物可爲胜肽、非胜肽、或胜肽及非胜肽區域之組合。Fauchere，1986，」i/v. Drug 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; and Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 11:1229。結構類似於治療用胜肽之胜肽擬物可用於產生類似的治療或預防效果。此等化合物常藉助電腦化分子模擬來硏發。•一般而言，擬肽（peptidomimetics)是蛋白質，結構類似於展現所欲生物活性（例如專一結合GM-CSF的能力）的抗體’但具有一個或一個以上的胜狀連接，可以技藝熟知的方法經由選自下列所組群組組成之連接置換：-CH2NH-、 -CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式）、-COCH2-、 -CH(OH)CH2-以及-CH2SO-。以相同種類D-胺基酸之共有序列一個或一個以上胺基酸的系統性取代（例如D-離胺酸代替 L-離胺酸），亦可用於某些具體例中產生更穩定的蛋白質。此外，含有共有序列或實質相同的共有序列變異之受限胜肽，可由技藝已知方法製造（Rizo and Gierasch，1992,如hv. 幻_:387)，例如經由添加內部半胱胺酸殘基，其能形成環化胜肽之分子內二硫橋（disulfide bridges)。也提供本文中所述抗原結合蛋白質之衍生物。該衍生之抗原結合蛋白質可含有任何分子或物質給予抗體或片段所 -73 - 200918553 欲性質’例如於特定用途時增加半衰期。該衍生之抗原結合蛋白質能含有，例如可偵測（或標記）部分（例如放射性、比色性、抗原性或酵素性分子，可偵測珠（例如磁性或電密集（例如金）珠）’或結合至另一分子之分子（例如生物素或卵白素 (streptavidin))) ’治療或診斷部分（例如放射性、細胞毒性或醫藥活性部分）’或增加特定用途時抗原結合蛋白質適合性的分子（例如投與至患者，例如人類病患或其他活體內或活體外用途）。能用於衍生抗原結合蛋白質之分子的實例包括 . 白蛋白（例如人類血清白蛋白）以及聚乙二醇（PEG)。能使用技藝已熟知技術製備抗原結合蛋白質之白蛋白-連接及PEG 化衍生物。在一具體例中，抗原結合蛋白質共軛或另外連接至甲狀腺運送蛋白（TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體能以例如選自葡聚糖、聚（η-乙烯基-2-吡咯酮）、聚乙二醇、 * 聚丙二醇同質聚合物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇類以及聚乙烯醇類所組群組之化學劑經化學修飾。、其他衍生物包括GM-CSF抗原結合蛋白質與其他蛋白質或多胜肽之共價或聚集共軛物，例如經由表現含有異質多胜肽接合至GM-CSF抗原結合蛋白質Ν-末端或C-末端之重組的接合蛋白。舉例而言，共軛之胜肽可爲異質訊息（或前導（leader))多胜肽，例如酵母菌 α-因子前導（a-factor leader)，或胜肽例如抗原決定基標籤。含GM-CSF抗原結合蛋白質之接合蛋白質能含有添加以促進GM-CSF抗原結合蛋白質純化或鑑定之胜肽（例如聚-組胺酸）。GM-CSF抗原 200918553 結合蛋白質也能連接到如敘述於Hopp ei α/·，1S>88, ^o/Tec/mo/og;；豆:1204以及美國專利第5,011,912號之FLAG胜狀。FLAG胜肽具高度抗原性且提供經專一單株抗體（mAb)可逆地結合之抗原決定基，能快速分析及易於純化所表現之重組蛋白質。可用於製備接合蛋白質（其中FLAG胜肽接合到所給多胜肽）之試劑可獲自市售商品（Sigma，St. Louis，MO)。含一個或一個以上GM_CSF抗原結合蛋白質之寡聚物可運用於作爲GM-CSF拮抗劑。寡聚物可爲共價連接或非共價連接之二聚體、三聚體、或更高的寡聚物之形式。含有兩個或兩個以上GM-CSF抗原結合蛋白質之寡聚物的一實例被預期以同質二聚體使用。其他寡聚物包括異質二聚體.、同質三聚體、雜質三聚體、同質四聚體，雜質四聚體等等。一具體例是針對寡聚物，其含有透過接合到GM-CSF抗原結合蛋白質之胜肽部分間共價或非共價交互作用連結之多GM-CSF-結合多胜肽。此等胜肽可爲胜肽連接體（spacers) 或具有促進寡聚物化作用之胜肽。白胺酸拉鍊結構及衍生自抗體的某些多胜肽是在能促進附著於GM-CSF抗原結合蛋白質的寡聚物化作用之胜肽中，詳細如下所述。在特殊具體例中，寡聚物含有二到四個GM-CSF抗原結合蛋白質。該寡聚物之GM-CSF抗原結合蛋白質部分可爲上述之任何形式，例如變異體或片段。較佳爲寡聚物含有具有 GM-CSF結合活性之GM-CSF抗原結合蛋白質。在一具體例中，寡聚物是使用衍生自免疫球蛋白之多胜肽製備。含有某些異質多胜肽接合到抗體衍生之多胜肽各種 -75 - 200918553 部分（包括Fc功能部位）之接合蛋白的製備，已敘述於例如 Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; and Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4，pages 10.19.l-10.19.il o 一具體例是針對經由接合gm-csf抗原結合蛋白質至抗體Fc區域所產生之含有兩接合蛋白之二聚體。該二聚體之製造能經由例如插入一編碼該接合蛋白之基因接合體至適當的表現載體，在以重組表現載體轉形之宿主細胞中表現該基因接合體，並使所表現之接合蛋白質裝配更像抗體分子，於是Fc部分間形成鏈間.二硫鍵以產生二聚體。文中使用之用語“ Fc多胜肽”包括衍生自抗體Fc區域之多胜肽之天然及突變蛋白質形式。也包括含有促進二聚體化之樞紐區之此等多狀的截頭形式（truncated forms)。含有 Fc部分（以及從其形成之寡聚物）之接合蛋白質提供以親和力色層分析經蛋白質A或蛋白質G管柱易於純化之優點。敘述於 PCT公開號 WO 93/10151及美國專利第 5，426,048號與第5,262,522號之一適當的Fc多胜肽，是單鏈多胜肽從人類IgGl抗體Fc區域之N-末端樞紐區延伸至天然C-末端。另一可用Fc多胜肽是Fc突變蛋白質，敘述於美國專利第 5,457,035 號及 Baum ei cr/.，1994, £細Ο J. 11:3992-4001。此突變蛋白質之胺基酸序列相同於WO公開號 93/10 151所示之天然Fc序列，除胺基酸19已從Leu改爲 Ala，胺基酸20已從Leu改爲Glu，以及胺基酸22已從Gly 200918553 改爲Ala除外。突變蛋白質對Fc受器展現降低的親和力。在其他具體例中’ GM-CSF抗原結合蛋白質之重鏈及/ 或輕鏈的可變部分可替換抗體重鏈及/或輕鏈的可變部分。此外，寡聚物是含有多GM-CSF抗原結合蛋白質及含或不含胜肽連接體（spacer peptides)之接合蛋白質。適宜之胜肽連接體爲美國專利第4,751，180及4,935,233號所述者。寡聚物GM-CSF抗原結合蛋白質衍生物之另一製備方法包括使用白胺酸拉鍊結構。白胺酸拉鍊結構功能部位是促進該結構所存在之蛋白質寡聚物化之胜肽。白胺酸拉鍊結構原始於數種DNA-結合蛋白質中被識別（Landschulz H fl/·, 1 98 8, Science 240:1 759)，並自此於各種不同的蛋白質中被發現。已知的白胺酸拉鍊結構爲天然存在之二聚體化或三聚體化之胜肽及其衍生物。適合用於製造可溶寡聚物蛋白質之白胺酸拉鍊結構功能部位的實例敘述於PCT公開號 WO 94/10308,以及衍生自肺表面張力蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鍊敘述於Hoppe ei 1994, F凡此344:191。使用經修飾白胺酸拉鍊結構，使接合至它的異質蛋白質能穩定三聚體化者，敘述於 Fanslow ei a/.，1994, Sewin. /所色:267-278。在一方法中，含有GM-CSF抗原結合蛋白質片段或接合到白胺酸拉鍊結構胜肽之衍生物的重組接合蛋白質，表現於適當宿主細胞中，且從培養的上清液回收可溶性寡聚物GM-CSF抗原結合蛋白質片段或形成之衍生物。所提供之一些抗原結合蛋白質具有對GM-CSF之結合親和力（Ka)經測量至少爲1〇4或105/Mx秒，例如以下實施例 -77 - 200918553 所述。在其抗原結合蛋白質具有至少1〇6、1〇7、1〇8或1〇9/m X秒之Ka。所提供之某些抗原結合蛋白質具有低解離速率° 例如一些抗體具有lxlO·4 s·1、lx 1 0·5 s·1或更低之Kuf。在另一具體例中，Kcff相同於具有表2及3可變區域功能部位之以下組合之抗體。在另一態樣，本發明提供一種在活體外或活體內（例如投與至人類患者時）具有至少一天半衰期之抗原結合蛋白質。在一具體例中，抗原結合蛋白質具有至少三天半衰期。在另一具體例中，抗體或其一部分具有四天或更長的半衰期。在另一具體例中，抗體或其一部分具有八天或更長的半衰期。在另一具體例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾，使其相較於未經衍生或未經修飾的抗體具有更長的半衰期。在另一具體例中，抗原結合蛋白質含有點突變來增加血清半衰期，例如敘述於P c T公開號W Ο 0 0 / 0 9 5 6 0。 6.糖化作用抗原結合蛋白質可具有糖化作用樣式，其不同或改變自天然物種所存在者。如技藝所知，糖化作用樣式能隨蛋白質序列（例如存在或缺乏特殊糖化作用胺基酸殘基，討論於下），或宿主細胞或生物體中所產生之蛋白質而異。特殊表現系統討論於下。多胜肽的糖化作用典型爲N·連接或0-連接。N_連接是指碳水化合物部分附著到天冬醯胺酸殘基的側鏈。三胜狀序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-酥胺酸（其中χ爲脯胺酸除外之任何胺基酸），是碳水化合物部分的酵素附著 -78 - 200918553 於天冬醯胺酸側鏈用之辨識序列。如此，多胜肽中存在這些三胜肽序列創造可能的糖化作用位置。〇-連接之糖化作用是指糖類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著於羥基胺基酸，最常爲絲胺酸或酥胺酸，雖然5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可使用。添加糖化作用位置至抗原結合蛋白質可經由改變胺基酸序列適當地完成，以至其含有一個或一個以上的上述三胜肽序列（給予N-連接之糖化作用位置）。改變的製造亦可經由添加、取代以一個或一個以上絲胺酸或酥胺酸殘基至開始序列（給予〇-連接之糖化作用位置）。爲簡易，抗原結合蛋白質胺基酸序列較佳透過在DN A階段改變來變化，尤其.經由在預選鹼基突變編碼標的多胜肽之DNA，以至產生的密碼子將轉譯爲所欲胺基酸。增加抗原結合蛋白質上碳水化合物部分之數目的另一方法是將糖苷經化學或酵素偶合到該蛋白質。這些步驟的優點是它們不需在具有糖化作用能力於N-及0-連接糖化之宿主細胞中製造該蛋白質。隨使用之偶合模式，糖類可附著於 (a)精胺酸及組胺酸，（b)游離竣基，（c)游離硫氫基（sulfhydryl group)，例如半胱胺酸，（d)游離羥基，例如絲胺酸、酥胺酸或羥基脯胺酸，（e)芳香族殘基，例如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸’或（f)麩醯胺酸的醯胺基。這些方法敘述於p C T公開號 W0 87/05330’ 以及 Aplin and Wriston,1981，及ev, 5z_ocAem.，pp.259-306。開始抗原結合蛋白質上碳水化合物部分之移除可由化 -79 - 200918553 學或酵素達成。化學去糖化作用需要蛋白質暴露到化合物三氟甲磺酸或同等化合物。此處理導致除了連接糖（N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半乳糖胺）外之大部分或全部糖類的切割，而留下完整的多胜肽。化學去糖化作用敘述於Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131。多胜肽上碳水化合物部分之酵素切割能使用各種內-及外-糖苷酶達成，例如敘述於Thotakura ei α/., 1987, Me从.如qmo/. m:350。在可能糖化作用位置之糖化作用可經由、使用化合物衣黴素（^11114&111>^11)來防止，例如敘述於〇1^1011以 al, 1982, J. Biol. Chem. 257:3105。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷連接的形成。 . 因此態樣包括抗原結合蛋白質之糖化作用變異體，其中相較於親代多胜肽的胺基酸序列，糖化位置數及/或類型已 ' 經改變。在某些具體例中，抗體蛋白質變異體含有比天然抗體更多或更少的N-連接之糖化作用位置數。N-連接之糖化作用位置之特徵爲有序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中 k 以X標示之胺基酸殘基可爲任何胺基酸殘基，但脯胺酸除外。胺基酸殘基之取代以產生此序列，提供添加N-連接之碳水化合物鏈用的可能新位置。另外，消除或改變此序列的取代作用可防止添加天然多胜肽中存在之N-連接之碳水化合物鏈。舉例而言，經由刪除Asn或以不同胺基酸取代Asn 能降低糖化作用。在其他具體例中，創造出一個或一個以上新的N-連接位置。抗體通常在Fc區域具有N_連接糖化作用位置。 -80- 200918553 7.標記及效應基（Effector Groups) 在某些具體例中，抗原結合包括一個或一個以上標記。用語“標記基”或“標記”意指任何可偵測的標記。適宜之標記基的實例包括但不限爲下列：放射性同位素或放射性核種（例如 3H，14C，15N，35S，9<)Y，99Tc，11 Μη，1251，13 4)，螢光基團（例如 FITC，若丹明（rhodamine)，鑭系燐光體 (lanthanide phosphors))，酵素基團（例如山葵過氧化酶 (horseradish peroxidase)，β-半乳糖苷酶，蟲螢光素酶 (luciferase)，驗性磷酸酶），化學發光基團，生物素基團，或由二級報告子（例如白胺酸拉鍊配對序列，二級抗體之結合位置，金屬結合功能部位，抗原決定基標籤）辯認之預定多肽抗原決定基。在若干具體例中，標記基透過各種長度的連接體臂偶合至抗原結合蛋白質以降低可能的立體阻障。用於標記蛋白質之各種方法爲技藝已知且可用於進行本發明。用語“效應基”意指作用爲細胞毒殺劑偶合至抗原結合蛋白質之任何基。適宜效應基之實例是放射性同位素或放射性核種（例如 3：h ’ 14C , 15N，35S , 9QY，99Tc , iHln , 1251， 13 4)。其他適宜基包括毒素、治療基或化學治療基。適宜基之實例包括卡奇霉素（calicheamicin)、阿瑞司達丁 (auristatins)、膠達納黴素（g e 1 d an a m y c i η)及美登素 (maytansine)。在某些具體例中，效應基透過不同長度的連接體臂偶合至抗原結合蛋白質以降低可能的立體障礙。一般而言，標記隨分析中被偵測者而落於各種分類中： a)同位素標記，可爲放射性或重同位素；b)磁性標記（例如磁 200918553 性顆粒）；ο氧化還原活性部分；d)光染料：酵素基團（例如山癸過氧化酶（horseradish peroxidase)，yS-半乳糖苷酶，蟲螢光素酶（luciferase)，鹼性磷酸酶）；e)生物素化基團；以及 f)由二級報告子（例如白胺酸拉錬配對序列，二級抗體之結合位置，金屬結合功能部位，抗原決定基標籤等等）辯認之預定多胜狀抗原決定基。在某些具體例中，標記基透過各種長度的連接體臂偶合至抗原結合蛋白質以降低可能的立體阻障。專一標記包括光染料，包括但不限爲發光團 (chromophores)，磷光體（phosphors)及螢光體（fluorophores)，後者詳述於諸多例中。螢光體（fluorophores)能爲“小分子” 螢光物或蛋白質性螢光物。 “螢光標記”意指任何分子可透過其固有螢光性質被偵測。適宜之螢光標記包括但不限爲螢光素（fluorescein)，若丹明（rhodamine)，四甲基若丹明，曙紅（eosin)、藻紅 (erythrosine)，香豆素（coumarin)，甲基-香豆素，在（pyrene)，螢光物馬拉塞綠（Malacite green)，二苯代乙嫌（stilbene)，螢光物：Lucifer Yellow、Cascade BlueJ、Texas Red、IAEDANS、EDANS、 BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon green、 Alexa-Fluor 染料（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alex a Fluor 488、 Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow 以及 R-藻紅蛋白（phycoerythrin)(PE)(Molecular Probes, Eugene，OR)、FITC、若丹明（rhodamine)以及 Texas -82 - 200918553

Red(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。包括螢光體（fluorophores)之適宜光染料敘述於 Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland，Molecular Probes，1992。適宜的蛋白質螢光標記也包括但不限爲綠螢光蛋白質，包括水母冷光（Renilla)，浮游生物海筆（Ptilosarcus)或水母發光蛋白類 GFP(Chalfie ei α/.，1994，Science 263 : 8 02-8 0 5 )，E G F P (C1 ο n t e c h, Mountain View > Genbank 登錄號 U55762)，藍登光蛋白質（BFP，Quantum Biotechnologies, Inc_, Quebec, Canada; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. 5k/· 6:178-182)，強化黃螢光蛋白質（EYFP，Clontech)，蟲登光素酶（luciferase)(Ichiki ei β/.，1993, J. //nmwno/. 150:5408-5417)，冷-半乳糖苷酶（Nolan ei a/·，1988, iVoc. iVai/. Sci. t/U. 85 : ' 2603-2607)及水母冷光（Renma)(PCT 專利申請案號 W092/1 5 673 > WO9 5/0 7463 > WO98/ 1 460 5 > W098/26277 > WO99/49019，美國專利第 5292658，5418155，5683888，、 5741668， 5777079， 5804387， 5874304， 5876995， 5925558 號）。 C.編碼GM-CSF抗原結合蛋白質之核酸也提供編碼本文中所述抗原結合蛋白質或其部分之核酸，包括編碼抗體之一個或兩個鏈或其片段、衍生物、突變蛋白質或變異體之核酸，編碼重鏈可變區域或僅CDRs之多核苷酸’多核苷酸其足以使用作爲鑑定、分析、突變或增幅編碼多胜肽之多核苷酸用雜交探針、PCR引子或定序用引 -83 - 200918553 子，用於抑制多核苷酸表現之抗-有意義核酸，以及前述之互補序列。該核酸可爲任何長度。他們可爲，例如長度爲5、 10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150' 175、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 750、 1,000、 1，500、3,000、5,000個或以上核苷酸，包括介於其間的所有値，及/或可含有一個或一個以上額外序列（例如調節序列）及/或較大核酸的一部分（例如載體）。該核酸可爲單股或雙股以及可包括RNA及/或DNA核苷酸及其人造變異體（例如胜肽核酸）。編碼特定抗原結合蛋白質或其部分（例如全長抗體，重鏈或輕鏈，可變功能部位，.或CDRH1、CDRH2、CDRH3、 CDRL1、CDRL2或CDRL3)之核酸可單離自小鼠的B-細胞’ 該小鼠已經由GM-CSF或其免疫原性片段免疫。該核酸可經由慣用做法，例如聚合酶鏈鎖反應（PCR)單。噬菌體展現是已知技術之另一實施例，藉此可製備抗體衍生物及其他抗原結合蛋白質。在另一方法中，在任何適合的重組表現系統中表現感興趣抗原結合蛋白質成分之多胜肽，以及使所表現之多胜肽組裝形成抗原結合蛋白質分子。由於遺傳密碼的退化性，表1 -4所列或其他本文中描述之每一多胜肽亦可由所提供以外之極大數量的其他核酸序列所編碼。所屬技術領域中具有通常知識者應知本申請案對於編碼每一抗原結合蛋白質之毎一退化的核苷酸序列’提供足夠的書面說明及可實施性。一態樣進一步提供在特定雜交條件下雜交到其他核酸 -84 - 200918553 之核酸。雜交核酸的方法爲技藝熟知。例如參閱Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6。如文中定義，中度嚴格（moderately stringent)雜交條件是使用含5X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)' 0·5% SDS' 1 _0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗液，約50%甲醯胺、6X SSC之雜交緩衝液，以及55 t (或其他類似雜交液’例如含有約50%甲醯胺、具42°C的雜交溫度）的雜交溫度，以及60°C於〇.5X SSC、 0.1% SDS之清洗條件。嚴格雜交條件是於6X SSC在45°C { 雜交，隨後在68°C於0.1XSSC、0.2% SDS清洗一次或一次以上。再者，熟習該項技藝者能操作雜交及/或清洗條件以增加或減少雜交的嚴格度，以至於含有核苷酸序列彼此至少 65、70、75、80、85、90、95、98 或 99 % 相同的核酸（包括 ' 介於其間的所有値）通常仍雜交到彼此。 " 影響雜交條件選擇的基本參數及設計適宜條件的指南提出於，例如 Sambrook，Fritsch，and Maniatis (2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 1.. Harbor, N.Y. and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et β厂，eds·, John Wiley & Sons, Inc·, sections 2.10 and6.3-6.4)，且肯巨輕易由所屬領域具有通常知識者依據例如，核酸的長度及/或鹼基組成物來決定。經由突變作用能將變化導入核酸，藉此導致其編碼的多胜肽（例如抗體或抗體衍生物）的胺基酸序列改變。使用技藝已知技術能將突變導入。在一具體例中，一個或一個以上特定胺基酸殘基是使用，例如指定位置之突變法來改變。在另 -85 - 200918553 一具體例中，一個或一個以上隨機選擇之殘基是使用，例如隨機突變法來改變。然而其經製作，對於所欲性質之突變多胜肽能被表現及篩選。突變能導入核酸中而無需顯著改變其編碼之多胜肽的生物活性。例如，能製造核苷酸取代造成胺基酸取代在非必需胺基酸殘基。另外，一個或一個以上突變能導入核酸以選擇性改變其編碼之多胜肽的生物活性。例如，突變能定量或定性改變生物活性。定量改變的實例包括增加、降低或消除活性。定性改變的實例包括改變抗體的抗原專一性。在另一態樣，本發明提供多核酸分子，其適用於作爲偵測核酸序列用之引子或雜交探針。多核酸能僅含有編碼全長多胜肽之一部分的核酸序列，例如，能用於作爲探針或引子之片段或編碼多胜狀活性部分（例如，G Μ - C S F結合部分）之片段。根據核酸序列的探針能用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼本發明多胜肽之轉錄體。該探針能含有一標記基，例如放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔因子。此等探針能用於鑑定表現該多胜肽之細胞。另一態樣提供之載體，含有編碼如文中所述多胜肽或其一部分（例如包含一個或一個以上CDRs或一個或一個以上可變區域功能部位之片段）之核酸。載體之實例包括但不限爲質體，病毒載體，非附加型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。重組表現載體能含有核酸以適於宿主細胞中表現核酸之形式。重組表現載體包括一個或一個以上基於 -86 - 200918553 宿主細胞可用於表現而選擇之調節序列，其爲可操作地連接 (operably linked)到欲表現之核酸序列。調節序列包括在許多種類宿主細胞（例如，SV40早期基因增強子，勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus)啓動子以及巨細胞病毒啓動子）中主導核苷酸序列之組成型表現（constitutive expression)者，只於某些宿主細胞主導核苷酸序列表現者（例如，組織專一調節序列，參閱 tissue-specific regulatory sequences，see, Voss ei α/·，1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et a/.,1987, Science 236:1237，以及對特別處理或條件反應主導核苷酸序列之誘發表現者（例如，哺乳動物細胞之金屬硫蛋白（metallothionin)啓動子以及原核及真核系統中之四環黴素反應性及/或鏈黴素反應性啓動子）（參閱同前）。熟習該項技藝者應知表現載體的設計能依此等因子決定作爲欲轉形之宿主細胞、所欲蛋白質表現程度的選擇等等。表現載體能導入宿主細胞藉此製造蛋白質或胜狀，包括由文中所述由核酸編碼之接合蛋白質或胜肽。在另一態樣，提供已導入重組表現載體之宿主細胞。宿主細胞能爲任何原核細胞（例如大腸桿菌（厂//))或真核細胞（例如，酵母菌，昆蟲，或哺乳動物細胞（例如，CHO細胞））。載體DNA能經由慣用轉形或轉染技術導入原核或真核細胞。對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知隨所用的表現載體及轉染技術，只有小部分的細胞可整合外來DNA到其基因體中。爲鑑定及選擇這些整合體，通常與感興趣基因一起導入編碼可篩選記號之基因（例如，抗生素之抗性）至宿主細胞。較佳的可篩選記號包括那些對藥物具抗性者’例如 -87 - 200918553 G418 ’ 效高黴素（hygromycin)及甲氨蝶啥（methotrexate)。在其他方法中，以導入的核酸穩定轉染之細胞能經由藥物篩選來鑑定（例如，已倂入可篩選記號基因之細胞將存活，而其他細胞死亡）。 D.抗原結合蛋白質之製備完全人類抗體可如上所述經由免疫含有人類免疫球蛋白所在之基因轉殖動物或經由篩選表現全部人類抗體之噬菌體展現資料庫來製備。單株抗體（mAbs)能經由各種技術產生，包括慣用單株抗體方法論，例如 Kohler and Milstein，1975, 256:495 之標準體細胞雜交技術。另外，能運用製造單株抗體之其他技術，例如Β -淋巴細胞的病毒或致癌基因轉形。製備融合瘤用之一合適的動物系統是小鼠系統，其爲一已建立非常良好之方法。技藝已之單離融合用經免疫之脾臟細的免疫作法步驟及技術。對於此步驟程序，來自經免疫小鼠的Β細胞與適宜的永生不死夥伴（例如小鼠骨髓瘤細胞株）融合。此外，視需要可免疫大鼠或其他哺乳動物代替小鼠，以及來自此等動物的Β 細胞能與小鼠骨髓瘤細胞株融合形成融合瘤。此外，可使用小鼠以外來源的骨髓瘤細胞株。製造融合瘤的融合步驟程序亦已熟知。所提供之單鏈抗體可透過胺基酸橋（短胜狀連接體）經由連接重鏈及輕鏈可變功能部位（F ν區域）片段而形成，導致單一多胜肽鏈。此等單鏈Fvs(SCFvS)已於編碼兩可變功能部位多胜肽（VL及VH)之DNA間經由接合編碼胜肽連接體之 -88- 200918553 DNA來製備。所得多胜肽能自行摺疊回去以形成抗原結合單體，或他們能形成多聚物（例如’二聚體’三聚體，或四聚體），視兩可變功能部位間之彈性連接體的長度而異（Kortt ei α/·，1997,尸ro，.五叹.拉:423; Kortt ei α/., 2001，5z’ow〇Z.五叩· ^:95-108)。經由組合不同之含Vl及VH的多胜肽，有一者能形成結合不同抗原決定基之多聚物型 scFvs(Kriangkum α/.，2001，5/owo/. 11:31-40)。製造單鏈抗體已硏發之技術包括那些敘述於美國專利第 4,946,778 號；

Proc. Natl. Acad. Sci. ί/.S.J.85_:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387。衍生自文中所提供抗.體之單鏈抗體，包括但不限於scFvs，其含有表1所述重鏈及輕鏈可變區域之可變功能部位組合，或具有移植到表2 及3所述任何CDRs之輕鏈及重鏈可變功能部位組合。使用亞型交換（subclass switching)方法，文中提供之抗體是某一亞型者可經改變爲來自不同亞型的抗體。因此例如 IgG抗體可衍生自IgM抗體，反之亦然。此等技術使新抗體的製備具有所給抗體（親代抗體）之抗原結合特性，但也展現與抗體同型物或不同於親代抗體之亞型有關之生物特性。可運用重組DNA技術。編碼特殊抗體多胜肽之經選殖DNA可用於此等程序中，例如，編碼所欲同型物抗體恆定功能部位之 DNA。例如參閱 Lantto ei α/.，2002，Mei/zo心 ΜοΛ 扪〇/. 111:303-316。因此，所提供之抗體包括含有例如上述具有所欲同型物（例如 IgA、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE 及 IgD) 之可變功能部位組合及其Fab或F(ab’ ）2片段者。再者，若 200918553

IgG4爲所欲，其亦可視需要導入點突變（CPSCP->CPPCP)於樞紐區，如 Bloom ei α/.，1997, Proiez·” Sciewce i:407 所述，倂入本文參考）以減輕能導致IgG4抗體異源性之內部-H鏈二硫鍵形成的傾向。再者，用於衍生具有不同性質（亦即改變對他們要結合之抗原的親和力）之抗原結合蛋白的技術也已知悉。此等技術之一稱爲鏈改組（chain shuffling)，涉及展現免疫球蛋白可變功能部位基因庫於絲狀細菌噬菌體的表面，通常稱爲噬菌體展現（phage display)。鏈改組已被用於製備對半抗原2-苯基曙哩-5-酮（hapten 2-phenyloxazol-5-one)具高親和力之抗體，敘述如 Marks ei α/.，1992, 10:779。可製造保守修飾於表1所述之重鏈及輕鏈可變區域，或表2及3所述CDRs(以及對編碼核酸之對應修飾）以製造具 ' 有功能基及生化特性之GM-CSF抗原結合蛋白質。達到此等修飾之方法敘述於上。 GM-CSF抗原結合蛋白質可於各方面進一步經修飾。舉、例而言，假設他們是用於治療目的，可將他們與聚乙二醇（聚乙二醇化）共軛以延長血清半衰期或增加蛋白質運送。另外，患者抗體或其片段之V區域可與不同抗體分子的Fc區域接合。用於此目的之Fc區域可經修飾以使其不結合補體，因此當使用該接合蛋白質作爲治療劑時降低病人誘發溶胞作用的可能性。此外，可將患者抗體或其功能片段與人類血清白蛋白共軛以增強抗體或其片段的血清半衰期。另一可用於本發明抗體或其片段的接合夥伴是甲狀腺運送蛋白 -90 - 200918553 (TTR)。TTR具有形成四聚體的能力，因此抗體-TTR接合蛋白質能形成多價抗體，可增加其結合抗體親抗原性。另外’文中所述抗原結合蛋白質之功能及/或生化特性的實質修飾’可在重鏈及輕鏈的胺基酸序列中產生取代來達成’他們的功效顯著不同在維持（a)取代區域中分子骨幹的結構，例如摺板（sheet)或螺旋（helical)構形，（b)目標位置之分子的電荷或疏水性，或（c)龐大側鏈。“保守胺基酸代”可包括以非天然殘基取代天然胺基酸殘基，該非天然殘基在該胺基酸殘基位置對極性或電荷具有些微或無作用。參閱表5。再者’多胜肽中任何天然殘基亦可以丙胺酸取代，如前所述之丙胺酸掃描突變。 # 患者抗體的胺基酸取代（不論保守或非保守）可由熟悉該項技藝者應用例行技術實施。胺基酸取代能用於鑑定文中所提供抗體的重要殘基，或增加或減少這些抗體對人類 GM-CSF的親和力或對於文中所述其他抗原結合蛋白質之修飾的結合親和力。表現抗原結合蛋白質之方法形成含有至少一如上所述多核苷酸之質體、表現載體、轉錄或表現匣之表現系統及構築體，也提供於本文中，以及含有此等表現系統或構築體之宿主細胞。抗原結合蛋白質可由數種常見技術之任一種製備。例如使用技藝已知的任何技術，經由重組表現系統可製造 GM-CSF抗原結合蛋白質。例如參閱 Monoclonal Antibodies， Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al.(eds.) 200918553

Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.)5 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y. (1988) 〇抗原結合蛋白質能被表現於融合瘤細胞株（例如特別是抗體可被表現於融合瘤）或融合瘤以外的細胞株。編碼抗體的表現構築體能用於轉形哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。轉形可使用任何用於導入多核苷酸到宿主細胞之已知方法來進行，包括例如包裝多核苷酸於病毒或噬菌體中以及經由技藝已知轉染步驟將構築體轉導（transduce)宿主細胞，如例示於美國專利第 4,399,2 1 6號、第4,9 1 2,040號、第 4,740,46 1號、第4,95 9,45·5號。所用最佳轉形步驟將視欲轉形之宿主細胞種類而異。導入異質多核苷酸到哺乳動物細胞之方法爲技藝熟知，以及包括但不限於葡聚糖仲介轉染、磷酸鈣沉澱、凝聚胺（polybrene)仲介轉染、原生質體融合、電穿孔作用、多核苷酸裝入微脂粒法、核酸與正電荷脂質混合、以及直接顯微注射DNA至細胞核。重組表現構築體典型含有一編碼多胜肽之多核苷酸，該多胜肽含有下列一個或一個以上者：一個或一個以上本文提供之CDRs，輕鏈恆定區域，輕鏈可變區域，重鏈恆定區域（例如CH1、CH2及/或CH3)，及/或GM-CSF抗原結合蛋白質之另一支架（scaffold)部分。使用標準連接（ligati〇n)技術將這些核酸序列插入適當表現載體中。在一具體例中，重鏈或輕鏈恆定區域附加於抗-GM-CSF-專一重鏈或輕鏈可變區域的 C-末端並連接至表現載體中。載體典型經選擇在特定所用宿 -92 - 200918553 主細胞中具有功能者（亦即該載體相容於宿主細胞系統，能允許存在基因的增幅及/或表現）。在某些具體例中，使用載體，其係使用蛋白質報告子，例如二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase)運用蛋白質-片段互補分析法（例如參閱美國專利第6,2 7 0,964號）。適合的表現載體能購買，例如購自 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)或 Bd Biosciences(San Jose, CA)。選殖及表現抗體及片段用之其他可用載體，包括那些敘述於Bianchi and McGrew，2003,抝攸认价5/oe/ig. M:439-44。額外可用的表現載體討論於例如 Methods Enzymol., vol.185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Pfess 。通常用於任何宿主細胞之表現載體應含有維持質體及選殖與表現外源性核苷酸序列用之序列。於某些具體例中如此序列集合稱爲“側序列（flanking sequences)”者，通常應包括一個或一個以上的下列核苷酸序列：啓動子，一個或一個以上增強子（enhancer)序列，複製的起點（origin)，轉錄終止序列’含有供體及受體接合位置（splice site)之完整的插入序列’編碼多胜肽分泌用前導序列之序列，核糖體結合位置，聚腺苷酸化作用序列，編碼將表現多胜肽之核酸插入用聚連接子區域，以及可篩選記號要素。可選擇地，載體可含有“標籤”-編碼序列，亦即位於 GM-CSF抗原結合蛋白質編碼序列γ或3'末端之寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚組胺酸（例如六組胺酸），或另一 “標籤”例如FLAG®、HA (紅血球凝集素流感病毒）或， -93 - 200918553 其存在於市售可得抗體。此標籤通常接合到多胜肽，隨多胜肽表現，且能提供作爲親和力純化或從宿主細胞偵測 GM-CSF抗原結合蛋白質的工具。親和力純化能例如使用反此標籤之抗體爲親和力基質經由管柱色層分析來達成。可選擇地，此標籤能隨後從已純化GM-CSF抗原結合蛋白質經由各種方法移除，例如使用切割用特定胜肽酶。側序列可爲同源（亦即來自相同物種及/或品系作爲宿主細胞），異種的（亦即來自宿主細胞物種或品系以外之物種），混種（亦即來自一個以上來源之側序列組合），合成或天然的。如此，側序列的來源可爲任何原核或真核生物體，任何脊椎或無脊椎生物體，或任何植物，但側序列在宿主細胞系統內是有功能的且能由此活化。可用於載體之側序列可獲自技藝熟知數種方法之任一種。通常文中可用之側序列應已事先經由定圖譜及/或限制核酸內切酶分解確認，且能因此從適當組織來源使用適當限制核酸內切酶來單離。在某些情形中，側序列的整個核苷酸序列可爲已知。在此，側序列可使用文中所述之核酸合成或選殖用方法來合成。不論全部或只有部分的側序列是已知，其可使用聚合酶鏈鎖反應（PCR)及/或以適當探針，例如來自相同或另一物種之寡核苷酸及/或側序列片段經由篩選基因體資料庫來獲得。當側序列是未知時，含有側序列DNA之片段可單離自可含有例如編碼序列或甚至另一基因或基因們之DNA的較大段片。單離作用之達成可經由限制核酸內切酶分解以產生 -94 - 200918553 適當DNA片段，隨後使用瓊脂凝膠純化、Qiagen®管柱色層分析（Qiagen，Chatsworth，CA)或熟習該技藝者已知的其他方法單離。爲達成此目的之適宜酵素的選擇，對該技藝具有通常知識者應是顯而易見的。複製的起點通常爲購買之原核表現載體的一部分，且該起點有助於載體在宿主細胞中增幅。若選擇的載體未包含複製位置的起點，可根據已知序列化學合成並連接到載體內。例如，質體 pBR322 (New England Biolabs，Beverly, MA)的複製起點是適於大部分的革蘭氏陰性細菌，以及各種病毒起點（例如SV40，多瘤病毒（polyoma virus)，腺病毒，濾泡性口炎病毒（VSV)，或乳突瘤病毒（papillomaviruses).例如Η P V 或BPV)可用於哺乳動物細胞選殖載體。通常對於哺乳動物的表現載體不需要複製成分的起點（例如，SV40起點通常只用於因其也含有病毒早期啓動子）。轉錄終止序列典型位於多胜肽編碼區域的3’至末端並用於終止轉錄。通常轉錄終止序列在原核細胞是富含G-C片段隨後爲聚Τ序列。而此序列可輕易選殖自資料庫甚或購買的部分載體，其也能使用核酸合成方法，例如那些文中所述者輕易合成。可篩選記號基因編碼宿主細胞生長於選擇用培養基時存活及生長所必需之蛋白質。典型的篩選記號基因編碼之蛋白質爲：（a)具有抗性於抗生素或其他毒素，例如安比西林 (ampicillin)、四環黴素或康那黴素（kanamycin)於原核宿主細胞；（b)細胞之完全營養缺陷；或（c)無法獲自複合體或已 -95 - 200918553 界定培養基之補給性關鍵養分。專一可篩選記號是康那黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環黴素抗性基因。有利爲新黴素（neomycin)抗性基因亦可用在原核及真核宿主細胞中篩選。其他可篩選基因可用於增幅將被表現的基因。增幅是一過程，其中生長或細胞存活關鍵蛋白質之製造所需基因被前後反覆於重組細胞續代染色體中。哺乳動物細胞用適當可篩選記號之實例，包括二氫葉酸還原酶（DHFR)及無啓動子胸腺嘧啶激酶基因。哺乳動物細胞轉形體是置於篩選壓力下，其中只有轉形體因載體中存在可篩選基因而唯一能適應存活。篩選壓力的給予是經由在培養基中篩選劑濃度相繼增加的條件下培養已轉形細胞，藉此造成可篩選基因及編碼另一基因的DNA(例如結合GM-CSF多胜肽之抗原結合蛋白質）的增幅。結果，增加數量之多胜肽（例如抗原結合蛋白質）合成自增幅的DNA。核糖體結合位置通常爲rnRNA轉譯開始所需以及有 Shine-Dalgarno序列之特徵（原核生物）或Kozak序列（真核生物）。該要素通常位於啓動子3'以及欲表現多胜肽之編碼序列5'。在某些情形，例如糖化作用是真核宿主細胞表現系統所欲時，可運用各種預-或前序列來促進糖化作用或產量。例如，可改變特殊訊息胜肽的肽酶切割位置，或添加前序列 (prosequences)，其也可影響糖化作用。最終蛋白質產物在-1 位置（相對於成熟蛋白質的第一胺基酸）可具有一個或一個 -96 - 200918553 以上額外胺基酸使易表現，其可不完全已移除。例如最終蛋白質產物可具有一個或兩個胺基酸殘基於肽酶切割位置，附著於胺基末端。另外，使用一些酵素切割位置可造成所欲多胜狀之輕微截頭形式，若此酵素切在成熟多胜肽此區域。表現及選殖典型將含有由宿主生物體辨認的啓動子以及可操作地連接（operably linked)到編碼GM-CSF抗原結合蛋白質之分子。啓動子是位於結構基因開始密碼子上游（亦即5 ’）（通常約1 0 0至1 0 0 0 b p以內）之未轉錄序列，控制結構基因的轉錄。啓動子習慣被分爲兩類：可誘發啓動子及組成型啓動子（constitutive promoter)。可誘發啓動子對一些培養條件改變反應而在他們的控制下開始增加DNA轉錄程度，例如一養分之存在或缺乏或溫度變化。在另一方面，組成型啓動子均律地轉錄可操作地連接他們的基因，亦即對基因表現有少許或無控制。已知有極多啓動子被可能宿主細胞辨認。適宜的啓動子可操作地連接至編碼含有G Μ - C S F抗原結合蛋白質之重鏈或輕鏈的DN A，其係以限'制酵素分解從來源 DN A移除啓動子並插入所欲啓動子序列到載體內。用於酵母菌宿主之適宜的啓動子亦爲技藝熟知。酵母菌增強子有利用於酵母菌啓動子。用於哺乳動物宿主細胞之適宜的啓動子已熟知，且包括但不限爲那些可獲自病毒基因體者，例如多瘤病毒，禽痘病毒（fowlpox virus)，腺病毒（例如腺病毒 2)，牛乳突瘤病毒，鳥肉瘤病毒（avian sarcoma virus)，巨細胞病毒，反轉錄病毒，B型肝炎病毒以及最佳爲猴病毒40(SV40)。其他適宜的哺乳動物啓動子包括異種的 -97 - 200918553 哺乳動物啓動子，例如熱休克啓動子及肌動蛋白啓動子。，可能感興趣之額外啓動子包括但不限爲：SV40早期啓動子（Benoist and Chambon, 1981，Nature 290:304-3 10)； CMV 啓動子（Thornsen ei £?/.，1 9 84，Proc. iVa". 基丄:659-663);含於勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus) 3'長終端重覆之啓動子（Yamamoto et al. , 1980,Ce// H 7 8 7-797);疱疹胸腺嘧啶激酶啓動子（Wagner n a/.，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78_: 1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啓動子及調節序列（Prinster ei α/.，1982,

Uij 3 9-42);以及原核啓動子例如 β-內醯胺酶啓動子 (Villa-Kamaroff et al., 1 9 7 8, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2J_:3 727-3 73 1 );或啓動子（DeBoer ei a/.，1 9 83，Proc. Wad. dcac/· /7.5·.丄1〇_:21-25)。也感興趣爲下列動物轉錄控制區域，其展現組織專一性及已用於基因轉殖動物：胰腺細胞中活化之胰肽酶I基因控制區域（Swift Μ a/.，1 984，Ce// 38:639-646; Ornitz e t al. , 1986， Cold Spring Harbor Sy m p. Quant. Biol. 50:399-409: MacDonald, 1987， Hepatology 1:425 -5 1 5);在胰 β細胞活化之胰島素基因控制區域 (Hanahan, 1 98 5, Nature 3 15:115-122);在淋巴細胞活化之免疫球蛋白基因控制區域（Grosschedl ei α/.，1 984, Ce// 38:647-658; Adames e t al. , 1 9 8 5, Nature 318:533-538;

Alexander et al., 1 9 87, Mol. Cell. Biol. 1: 1 4 3 6 - 1 4 4 4);在睪九、乳房、淋巴及肥大細胞中活化之小鼠乳房腫瘤病毒控制區域（Leder d α/.，1 986，Ce// ϋ:485-4 95);在肝臟中活化之 -98- 200918553 白蛋白基因控制區域（Pinkert ei α/.，1987，Ge«e·? Deve/· J_ :26 8-276);在肝臟中活化之α-胎兒蛋白質基因控制.區域 (Krumlauf et al., 1 985, Mol. Cell. Biol. 5_: 1 6 3 9 - 1 6 4 8 ;

Hammer et al. , 1987, Science 2 5 3: 53-58);在肝臟中活化之 a 1-抗胰蛋白酶酵素基因控制區域（Kelsey ei a/.，1987，Genes jj 161-171);在脊髓細胞中活化之β-血球蛋白基因控制區域（Mogram ei σ/·, 1985，iVaiwre 3 1 5:3 3 8 - 3 40;

Kollias ei α/·, 1986，Ce// 11:89-94);在大腦寡樹突細胞中活化之脊髓磷脂基本蛋白質基因控制區域（Readhead Μ α/., 1 9 8 7, Ce// 41J 703-7 1 2);在骨格肌中活化之肌球蛋白輕鏈-2 基因控制區域（Sani，1 98 5，iVaiwe 3 1 4:2 83 -2 86)以及在下視丘中活化之性腺刺激素促泌素基因控制區域（Mason W 1986, Science 234:1372-1378)。增強子序列可插入載體中經由較高真核生物增加編碼含有人類GM-CSF抗原結合蛋白質之輕鏈或重鏈的DNA轉錄。增強子爲DN A之順作用要素，通常約10-300 bp長度，作用於啓動子增加轉錄。增強子爲相當方位及位置依存性，已發現於轉錄單位5'及3'位置。已知數種增強子序列可獲自哺乳動物基因（例如血球蛋白，胰肽酶，白蛋白，胎兒蛋白質及胰島素）。然而，通常使用來自病毒的增強子。技藝已知的SV40增強子、巨細胞病毒早期啓動子增強子、多瘤病毒增強子及腺病毒增強子示範性增強真核啓動子活化.的要素。而增強子可位於載體之編碼序列的5'或3'，通常位於啓動子的5 '位置。編碼適當天然或異種訊息序列（前導序列 -99- 200918553 或訊息胜狀）之序列能倂入表現載體，促進抗體的細胞外分泌。訊息胜肽或前導的選擇隨欲製造抗體的宿主細胞種類而異，且異種訊息序列能置換天然的訊息序列。在哺乳動物宿主細胞中具功能的訊息胜肽實例包括下列：敘述於美國專利第4,965，195號之介白素-7 (IL-7)之訊息序列；敘述於Cosman er α/·, 1984, 112 : 768之介白素-2受體訊息序列；敘述於歐洲專利第03 67 566號之介白素-4受體訊息胜肽；敘述於美國專利第4,968,607號之第I型介白素-1受體訊息胜肽；敘述於歐洲專利第〇 460 846號之第II型介白素-1受體訊息胜肽。所提供之表現載體可構築自開始載體，例如市售之載體。此等載體可或不可含有全部所欲側序列。當一個或一個以上文中所述側序列未存在於載體時，他們可能個別地得到並連接到載體。用於得到每一側序列的方法爲熟習該項技藝者熟知。載體經構築以及編碼輕鏈、重鏈、或含有GM-CSF抗原結合序列之輕鏈及重鏈之多核苷酸已插入載體適當位置後，完成之載體可插入增幅及/或多胜肽表現用適當的宿主細胞。將抗原結合蛋白質之表現載體轉形到選擇的宿主細胞，可經由熟知方法達成，包括轉染、感染、磷酸鈣共沉澱、電穿孔作用、顯微注射、脂轉染法（丨ipofecti〇n)、DEAE-葡聚糖仲介轉染、或其他已知技術。所選方法在某種程度上將爲所用宿主細胞種類的功能。這些方法及其他適當方法爲熟習該項技藝者熟知並提出於例如Sambrook ei α/.，2001,同上。 -100- 200918553 當宿主細胞培養於適當條件時，合成能隨後收集自培養基（若宿主細胞將其分泌到培養基中）或直接來自產生他之宿主細胞（若它不被分泌）之抗原結合蛋白質。適宜之宿主細胞的選擇將視各種因子而異，例如所欲之表現程度、所欲或必要活性之多胜肽修飾（例如糖化作用或磷酸化作用）及使易於摺疊到生物活性分子內。可獲作爲表現用宿主之哺乳動物細胞株爲技藝熟知，包括但不限爲可獲自美國菌種中心（ATCC)之不死細胞株，包括但不限爲中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，HeLa細胞，幼倉鼠腎 (BHK)細胞，猴腎細胞（COS)，人類肝細胞癌細胞（例如Hep G2)，以及諸多其他細胞株。在特定具體例中·，細胞株之選擇可透過決定哪一細胞株具有高表現程度及組成性產生具 GM-CSF結合特性之抗原結合蛋白質。在另一具體例中，能選擇來自B細胞系、不製造其自身抗體但具有能力製造及分泌異種抗體之細胞株。 F.使用人類GM-CSF抗原結合蛋白質於診斷及治療目的抗原結合蛋白質可用於偵測生物樣本的G Μ - C S F以及確認產生G Μ - C S F之細胞或組織。專一結合至G Μ - C S F之抗原結合蛋白質可用於治療有其需要之病人與GM-CSF有關之疾病。一例爲GM-CSF抗原結合蛋白質可用於診斷分析，例如結合分析以偵測及/或定量表現於組織或細胞中的 GM-CSF。此外’ GM-CSF抗原結合蛋白質能用於抑制GM-CSF 與其受體形成複合體，藉此調節細胞或組織中GM-CSF的生物活性。如此結合至GM-CSF之抗原結合蛋白質可調整及/ 200918553 或阻斷與其他結合化合物的相互作用，而可具有治療用途於改善與GM-CSF有關的疾病。 1.適應症本發明也有關於GM-CSF抑制劑（如揭示者），例如 GM-CSF抗體於製造用於預防或治療性處理文中揭示之各種醫學失調之藥劑的用途。GM-CSF抑制劑可用於治療各種狀況，而其中過多GM-CSF對潛在疾病或失調扮演角色，或施予負面症狀。本發明之具體例包括使用揭示之G Μ - C S F抑制劑，特別是GM - C S F抗體、組成物或組合療法來治療或預防各種風濕病疾病之方法。這些包括成人型及幼年型類風濕性關節炎，硬皮症，全身紅斑性狼瘡，痛風，骨關節炎，風濕性多發性肌痛症，血清陰性脊柱關節病（包括僵直性脊椎炎），以及賴特氏病（Reiter’s disease)。主題之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法也用於治療牛皮癣性關節炎及慢性萊姆病關節炎（Lyme Arthritis)。以這些化合物、組成物及組合療法亦可 ' 治療或預防史迪爾氏症候群（S t i 1Γ s d i s e a s e)以及與類風濕性關節炎有關之葡萄膜炎。此外，本發明之化合物、組成物及組合療法可用於治療隨意肌及其他肌肉失調造成的發炎，包括皮肌炎（dermatomyositis)，包涵體肌炎（inclusion body myositis) ’多發性肌炎（p〇lymy0sitis)以及肺淋巴管肌瘤病 (lymphangioleimyomatosis) 〇本發明提供GM-CSF抑制劑（例如GM-CSF抗體）、組成物及組合療法（例如GM-CSF抑制劑及TNF抑制劑如 -102- 200918553 ENBREL (依那西普（etanercept))或其他活性劑）用於治療骨骼及關節之非關節炎內科狀況。此包括導致骨質流失之蝕骨細胞失調’例如但不限於骨質疏鬆（包括停經後骨質疏鬆），骨關節炎’牙周病造成牙齒鬆脫或喪失，以及關節置換後義肢鬆脫（通常與磨損殘骸之發炎反應有關）。該後者情形也稱爲骨科植入物骨溶解效應（orthopedic implant osteolysis)” 。可以本發明化合物、組成物及組合療法治療之另一狀況是顧頸關節功能障礙（temporal mandibular joint dysfunction ； TMJ) ° 可以揭示之GM_CSF抑制劑組成物及組合療法治療之各種其他醫學失調包括：多發性硬化症，貝塞特氏症候群 (Behcet’s syndrome)，薛格連氏症候群（sjogren’s syndrome) ’自體免疫溶血性貧血，/3地中海型貧血，肌萎縮性脊髓側索硬化（Lou Gehrig’s Disease)，帕金森氏症 (Parkinson’s Disease) ’ 以及不知原因之腱鞘炎 (tenosynovitis)，以及各種自體免疫疾病或與遺傳性缺乏有關之疾病，包括X-染色體連結之心智遲緩。也提供使用G Μ - C S F抑制劑、組成物或組合療法治療各種內分泌系統失調之方法。舉例而言，G Μ - C S F抑制劑組成物或其他GM-CSF抑制劑組成物、含或不含TNF抑制劑（例如ENBREL)或其他上述活性劑適合用於治療幼年型糖尿病 (包括自體免疫糖尿病以及胰島素依存型糖尿病），也治療成年型糖尿病（包括非胰島素依存型及肥胖仲介之糖尿病）。此外，使用本發明化合物、組成物及組合療法治療與糖尿病有 -103- 200918553 關之繼發性狀況，例如糖尿病視網膜病變，糖尿病病人之腎移植排斥，肥胖仲介之胰島素抗性以及腎衰竭，其本身可能與蛋白質尿素及高血壓有關。其他內分泌失調也可治療這些化合物、組成物及組合療法，包括多囊性卵巢症，X染色體性聯隱性遺傳疾病，甲狀腺機能低下以及甲狀腺炎，包括橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis)(亦即自體免疫甲狀腺炎）。再者，GM-CSF抑制劑包括GM-CSF抑制劑，單獨或組合其他細胞激素，包括TNF抑制劑（例如EN BREL)，可用於治療或預防與甲狀腺細胞官能障礙有關之醫學狀況，包括正甲狀腺疾病症候群（euthyroid sick syndrome)。以GM-CSF抑制劑、組成物或組合療法可治療或可預防之胃腸道系統狀況，包括乳糜瀉（coeliac disease)。舉例J而言’ GM-CSF抑制劑組成物、含或不含TNF抑制劑（例如 ENBREL)或其他上述活性劑適合於治療或預防乳糜瀉。此外’本發明之化合物、組成物及組合療法適合用於治療或預防克隆氏疾病（Crohn’s disease)，潰瘍性大腸炎，原發性胃輕癱（idiopathic gastroparesis)，胰臟炎（包括慢性胰臟炎，急性胰臟炎），發炎性腸道疾病及潰瘍，包括胃及十二指腸潰瘍。也包括使用本發明GM-CSF抑制劑、組成物或組合療法於治療泌尿生殖系統失調之方法。舉例而言，G Μ - C S F抑制劑組成物單獨或組合IL-1(例如Kineret®(anakinra))或TNF 抑制劑（例如ENBREL)或其他上述活性劑適合用於治療或預防腎小球性腎炎（8丨〇11161>111〇1^?111>川5)，包括因暴露於毒素之 -104- 200918553 自體免疫腎小球性腎炎或因溶血性鏈球菌（haemolytic streptococci)或其他感染劑感染繼發之腎小球性腎炎。以本發明之化合物、組成物及組合療法亦可治療者爲尿毒症候群 (uremic syndrome)及其臨床倂發症（例如腎衰竭，貧血以及肥厚性心肌病變），包括與暴露於環境毒素、藥劑或其他原因有關之尿毒症候群。GM-CSF抑制劑（特別是GM-CSF抗體）單獨或組合TNF抑制劑（特別是ENBREL)可用於治療及預防造成吸收功能改變之膽囊壁發炎所造成之倂發症。此等倂發症包括膽石症（cholelithiasis)(膽結石）及膽管結石症 (choliedocholithiasis)(膽管結石）以及膽石症與膽管結石症的復發。又可以本發明化合物、組成物及組合療法治療者爲血液透析的倂發症，攝護腺症狀包括良性攝護腺肥大症、非細菌性攝護腺炎及慢性攝護腺炎，以及血液透析的倂發症。文中也提供者爲使用GM-CSF抑制劑、組成物或組合療法來治療各種血液及腫瘤性失調之方法。舉例而言，GM - C S F 抑制劑單獨或組合 GM-CSF抑制劑、TNF抑制劑（例如 ENBREL)或其他上述活性劑可用於治療與各種形式癌症有關的症狀，包括急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病， Epstein-Barr病毒-陽性鼻咽癌，神經膠質瘤，結腸、胃、前列腺、腎細胞、子宮頸及卵巢癌、肺癌（S C L C及N S C L C)，包括與癌症有關之惡病質、疲勞、無力、惡病質之腫瘤伴生徵候群及高血鈣症。可以本發明GM-CSF抑制劑、組成物或組合療法治療之額外疾病爲實體腫瘤（solid tumor)，包括肉瘤，骨肉瘤，以及癌（carcinoma)如腺癌（例如乳癌）以及鱗狀 -105- 200918553 細胞癌。此外’本發明之化合物、組成物或組合療法可用於治療食道癌，胃癌，膽囊癌’白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓白血病、慢性或急性淋巴胚細胞性白血病及多毛狀細胞白血病（hairy cell leukemia)。其他具侵略轉移可能性之惡性腫瘤（包括多骨髓瘤）能以本發明之化合物、組成物及組合療法來治療，尤其是包括G Μ - C S F 抑制劑及可溶性TNF受體（例如ENBREL)之組合療法。此外’所揭示之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法能用於治療貧血及血液失調，包括慢性原發性嗜中性白血球減少症，慢性疾病的貧血，再生不良性貧血（包括Fanconi氏再生不良性貧血），原發性血小板減少性紫斑症（ITP)，血栓性血小板低下性紫斑症，骨髓發育不良症候群（包括頑抗性貧血、具環鐵芽球（ringed sideroblasts)之頑抗性貧血、具過多芽之頑抗性貧血、具過多芽於轉形之頑抗性貧血），骨髓纖維化/骨髓組織變形，以及鐮刀型細胞血管閉塞危險期（sickle cell vasocclusive crisis) 〇各種淋巴組織增生性失調亦可以所揭示之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法治療。GM-CSF抑制劑單獨或組合 TNF抑制劑（例如ENBREL)或其他上述活性劑可用於治療或預防自體免疫淋巴組織增生性症候群（ALPS)，慢性淋巴胚細胞性白血病，多毛狀細胞白血病，慢性淋巴性白血病，週邊 T細胞淋巴瘤，小淋巴細胞淋巴瘤，被套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma)，爐泡淋巴瘤，伯奇氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma)，Epstein-Barr病毒-陽性T細胞淋巴瘤，組織細 -106- 200918553 胞淋巴瘤，何杰金氏病（Hodgkin's disease)，瀰漫侵略性淋巴瘤，急性淋巴性白血病，Τ γ淋巴組織增生性疾病，皮膚 Β細胞淋巴瘤，皮膚Τ細胞淋巴瘤（亦即蕈狀肉芽腫（m y c 〇 s i s fungoides))以及西紮利症（Sezary syndrome)。此外，使用本發明之GM-C SF抑制劑、組成物及組合療法用於治療遺傳性狀況。特別是GM-CSF抑制劑單獨或組合 TNF抑制劑如 ENBREL，可用於治療疾病如高雪氏症 (Gaucher's disease)，亨丁頓氏症（Huntington's disease)，線狀IgA疾病，以及肌肉萎縮症。其他可以所揭示GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法治療或預防之狀況，包括產生自頭或脊髓受傷，包括因頭部創傷之硬腦膜下血腫。舉例而言，GM-CSF抑制劑單獨或組合 TNF抑制劑如ENBREL可用於治療頭部受傷及脊髓骨受傷。與此療法之關聯，所述組成物及組合適用於預防顱內神經損傷以及預防與治療頸椎性頭痛（cervicogenic headache)。所述組成物及組合進一步適用於治療與腦部照射有關之神經病學副作用。所揭示之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法進一步用於治療肝臟狀況。例如GM-CSF抑制劑單獨或組合TNF抑制劑如ENBREL或其他活性劑，可用於治療肝炎，包括急性酒精性肝炎，急性藥物誘發或病毒性肝炎（肝炎A、B及C)，硬化膽管炎（sclerosing cholangitis)，以及不知原因誘發之肝臟發炎。與肝臟發炎之關聯，GM-CSF抑制劑進一步用於治療肝竇上皮細胞。 -107- 200918553 此外，所揭示之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法可用於治療包括喪失聽力且與異常IL-1表現有關之各種失調。例如GM-CSF抑制劑單獨或組合TNF抑制劑可用於治療或預防與耳蝸神經有關之聽力喪失，其被認爲自體免疫過程造成’亦即自體免疫性喪失聽力。此狀況目前處以類固醇、胺甲喋哈及/或環憐醯胺（cyclophosphamide)。所揭示之 GM - C S F抑制劑、組成物及組合療法也可治療或可預防者爲梅尼爾氏症（Meniere's syndrome)及膽脂瘤，一種中耳失調常有喪失聽力。與移植有關之症狀亦可以所揭示之GM-CSF抑制劑組成物或組合療法來治療或預防。此等失調包括移植物對抗宿主疾病以及實體器官移植，例如心臟、肝臟、皮膚、腎臟、肺臟（肺移植氣道閉塞）或其他移植物，包括骨髓移植物造成之倂發症。眼睛症狀亦可以所揭示之GM-CSF抑制劑，尤其是 GM-CSF抗體、組成物或組合療法治療或預防，包括裂孔性視網膜剝離（rhegmatogenous retinal detachment)以及發炎性眼睛疾病（包括與抽煙及斑點退化有關之發炎性眼睛疾病）。 GM-CSF抑制劑組成物及組合療法亦可用於治療影響雌性生殖系統之失調。實例包括但不限爲多植入物衰竭/不孕症，胎兒流失症候群或IV胚胎流失（自然流產），妊娠子癇前症（preeclamptic pregnancies)或子癇症，子宮內膜異位，慢性子宮頸炎，以及早產。此外，所揭示之GM-CSF抑制劑組成物及組合療法可用 -108- 200918553 於治療或預防坐骨神經痛’老化的症狀，嚴重的藥物反應（例如1 1-2毒性或博來黴素（bleomycin)誘發之肺病及纖維化）；或抑制在心臟或其他手術之同種異體紅血球細胞輸血之前、期間或之後的發炎反應，或治療肢臂或關節的創傷性損傷，例如創傷性膝蓋損傷。所揭示之GM-C SF抑制劑組成物及組合療法可用於治療中樞神經系統（CNS)損傷，包括影響中樞神經系統中發炎刺激期間的神經毒性神經傳遞物質放電，以及抑制或防止在 / I 中樞神經系統損傷處發展出膠質疤痕。與中樞神經系統醫學狀況之關聯，GM-CSF抑制劑可用於治療顳葉癲癇。與癲癇之關聯及治療發作，降低嚴重度與發作復發次數，以及降低發作之有害損傷的嚴重度。GM-CSF抑制劑單獨或組合文中所述藥劑可用於降低神經元損失，神經元退化，以及與發作有關之神經膠變性（gliosis)。再者，所揭示之GM-CSF抑制劑組成物及組合療法可用於治療重症疾病多發性神經病變及肌病變（critical illness 、 polyneuropathy and myopathy ； CIPNM)，急性多發性神經病變，神經性厭食症，貝爾氏麻痺（B e 1Γ s p a 1 s y)，慢性疲勞症候群，傳染性癡呆（包括庫賈氏病（Creutzfeld-Jacob disease))，髓鞘脫失神經性病變（demyelinating neuropathy)，基林色瑞症候群（Guillain-Barre syndrome)，椎間盤疾病，海灣戰爭症候群（Gulf war syndrome)，慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病變，重症肌無力，無症狀性腦缺血（silent cerebral ischemia)，睡眠失調（包括嗜睡症及睡眠窒息症）， -109- 200918553 慢性神經元退化，以及中風（包括腦缺血疾病）。經由單獨投與G Μ - C S F抑制劑或組合文中所述活性劑而可治療或預防之其他疾病及醫學狀況，包括厭食症及/或厭食性狀況，腹膜炎，內毒素血症及敗血性休克，肉芽腫形成，中暑，變應性肉芽腫血管炎（Chur g-Strauss syndrome)，急性感染後之慢性發炎，例如肺結核及痲瘋，全身性硬化症以及肥厚性症痕。G Μ - C S F抑制劑組合IL - 1抑制劑之外，TN F 抑制劑、IFN- α、- /3或-r及/或IL·4抑制劑適合用於治療肥厚性疤痕。本文揭示之GM-CSF抑制劑可用於降低與抗體治療、化療、放射線治療有關的毒性，以及其他細胞凋亡（apoptosis) 誘發劑，例如TRAIL及TRADE。本文中提供爲治療或預防牛皮癣性損害之方法，包括對人類病人投與治療有效量之G Μ - C S F抑制劑。該治療能有效對抗發生於具有一般牛皮癬或牛皮癖性關節炎病患的牛皮癬性損害。經由GM - C S F抑制劑有效治療的症狀在發炎反應扮演角色。肺失調包括氣喘’慢性阻塞性肺部疾病，肺泡蛋白質沉著症，博來黴素（b 1 e 〇 m y c i η)誘發之肺病及纖維化，放射線誘發之肺纖維化，囊狀纖維化，肺部膠原蛋白積聚，以及 ARDS。GM-CSF抑制劑可用於治療罹患各種皮膚失調的病患，包括但不限於疱疹皮膚炎（Duhring’s disease)，異位性皮膚炎’接觸性皮炎，蓴麻疹（包括慢性原發性蓴麻疹），以及自體免疫起水泡疾病’包括尋常型天飽瘡（pemphigus 200918553 vulgaris)以及大水皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid)。可以 G Μ - C S F抑制劑組合治療之其他疾病包括重症肌無力，類肉瘤病（sarcoidosis)，包括肺類肉瘤病，硬皮症，反應性關節炎，高IgE症候群，多發性硬化症及原發性高嗜伊紅白血球症候群。本發明之療法亦可用於治療對藥物治療的過敏性反應以及作爲對過敏免疫療法之佐劑。在一具體例中，GM-CSF抑制劑組成物可用於治療神經系統之退化症狀，例如多發性硬化症，復發-緩解型多發性硬化症，惡化-復發型多發性硬化症，原發性及繼發性進行性多發性硬化症。對準GM-CSF在多發性硬化症的臨床前模式是有效的，以及多發性硬化症中GM-CSF路徑的治療干涉，當免除適應性的免疫反應時透過直接作用在單核球、巨噬細胞及樹突細胞可降低CNS發炎。GM-CSF踢除小鼠對活動性實驗性自體免疫腦脊髓炎（EAE)誘發有抗性，McQualter, et al.，2001，J. Exp. Med. 194:873-881。表現 GM-CSF 經反轉錄病毒轉導之T細胞的授受性轉移可誘發EAE惡化，Marusic et al.， 2002, Neurosci. Lett. 332: 185-9。GM-CSF 踢除之 T 細胞的授受性轉移無法誘發 EAE，Ponomarev et al·，2007, J. Immunol” 178:39-48。申請人已證明，相較於以同型物對照組單株抗體治療’以抗 -老鼠 GM-CSF抗體在復發-緩解型多發性硬化症 SJL-PLP139_151EAE模式的預防性治療顯著延遲開始及降低疾病發生率與降低體重流失及平均臨床計分’參閱第1及2 圖。以抗-mGM-CSF單株抗體治療性處理SJL/PLP 125-151 EAE會顯著降低疾病嚴重性及CNS發炎，以及加速復元。 200918553 相較於以同型物對照組單株抗體治療，以抗-mGM-CSF單株抗體於SJL-PLP139_151 AT-EAE的預防性及治療性處理會降低平均臨床計分，參閱第2圖。GM-CSF抑制劑組成物能單獨使用或組合其他藥劑，例如干擾素p-la(AVONEX®;Bi〇gen-IdeC 及 REBIF® EDM Serono, Inc.，Pfizer，Inc.)，干擾素 p-lb(B SERON® ; Bayer Health Care.)，醋酸格拉默（glatiramer acetate) (COPAXONE® ; Teva Pharmaceuticals)及 / 或抗-VLA4 mAb (TYSABRI®，Biogen-Idec，Elan)。在本發明一具體例中，揭示於本文中可以GM-CSF抑制劑（例如GM-CSF抗體）治療之各種醫學失調，是與另一細胞激素或細胞激素抑制劑組合治療。例如GM-CSF抑制劑可以組成物投與，該組成物也含有抑制其他發炎性細胞激素與其受體相互作用之化合物。GM-CSF抑制劑及其他細胞激素抑制劑可以分開的組成物投與，且這些可經由相同或不同路徑投與。用於與GM-CSF抑制劑組合之細胞激素抑制劑實例，包括可那些可掊抗例如TGF-yS、IFN-r、IL-6或IL-8及 TNF，特別是TNF- α。GM-CSF抑制劑與IL-6的組合可用於治療及預防發作的復發，包括由GABA-A受體拮抗誘發的發作’與EEG持續狀態有關的發作以及癲癇狀態期間運動肢發作的發生。再者，GM-CSF抑制劑與IFN- r -lb的組合及/ 或 c-套組抑制劑可用於治療原發性肺纖維化及囊狀纖維化。治療疾病的其他組合包括使用 GM-CSF抑制劑與妨礙 RANK與RANK-配體（例如RANK-配體抑制劑）結合的化合物’或RANK的適宜形式（包括RANK: Fc)。例如GM-CSF抑 200918553 制劑與RANK: Fc的組合可用於預防各種情況的骨破壞，包括但不限於各種風濕病疾病，骨質疏鬆，多發性骨髓瘤或導致骨退化的其他惡性腫瘤，或防止轉移到骨頭爲目的之抗-腫瘤治療，或與義肢磨損殘骸或牙周病有關的骨破壞。本文中揭示之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法可用於治療細菌、病毒或原生動物感染產生之副作用及/或倂發症用藥。根據此具體例，當感染引起免疫系統過度刺激以至於 GM-CSF的產生及/或活性導致對病人負面影響，以 GM-CSF抑芾ij劑治療感染的病患可用於改善與該感染或用於治療該感染之治療劑有關的這些副作用及/或倂發症或。此等感染劑及感染的非限制例爲黴漿菌肺炎，AIDS及與AIDS 聯合及/或有關於AIDS之症狀，例如AIDS癡呆複合體，與 AIDS有關的消耗，由於抗反轉錄病毒治療引起之脂肪失養症，CMV(巨細胞病毒），卡波西氏肉瘤（Kap osi's sarcoma)，原生動物疾病（包括瘧疾及血吸蟲病），痲瘋結節性紅斑，細菌或病毒腦膜炎，肺結核（包括肺結核）以及細菌或病毒感染之繼發性肺炎，例如回歸熱疏螺旋體（Borrelia recurrentis) 引起之體蟲回歸熱（louse-borne relapsing fevers)，疱疹病毒之疱疼基質角膜炎（herpetic stromal keratitis)、角膜損害，以及病毒誘發之角膜失調，人類乳突病毒感染，流行性感冒感染及傳染性單核白血球增多症。心血管失調及損傷可以所揭示之G Μ - C S F抑制劑、醫藥組成物或組合療法治療及/或預防。特別是心血管失調可以 G Μ - C S F抑制劑組成物單獨或組合T N F抑制劑（例如ε N B R E L) 200918553 及/或其他上述試劑來治療。如此可治療之心血管失調包括主動脈瘤（包括腹主動脈瘤，急性冠心症候群，動脈炎），血流阻斷（包括腦動脈阻斷），冠狀繞道手術倂發症，缺血/再灌注損傷，心臟疾病（包括動脈硬化性心臟病，心肌炎：包括慢性自體免疫心肌炎及病毒心肌炎），心臟衰竭（包括慢性心臟衰竭，鬱血性心臟衰竭，惡病質之心臓衰竭），心肌梗塞，心臟手術後或頸動脈球血管成形術後之血管再狹窄及/或動脈硬化，無症狀的心肌缺血，左心室收縮異常，左心室輔助器之移植後倂發，雷諾氏現象（Raynaud’s phenomena)，血栓靜脈炎，血管炎（包括川崎氏血管炎（Kawasaki's vasculitis))，靜脈阻塞性疾病，巨細胞動脈炎，韋格納肉芽腫（Wegener、granulomatosis)，心肺繞道手術後之心智混亂，以及紫斑症（Schoenlein-Henoch purpura)。GM-CSF 抑制劑、TNF抑制劑及血管新生抑制劑（例如抗-VEGF)之組合可用於治療特定心血管疾病，例如主動脈瘤及腫瘤。此外，使用本發明之GM-CSF抑制劑、組成物及組合療法來治療慢性疼痛症狀，例如慢性骨盆疼痛包括慢性攝護腺炎/骨盆疼痛症候群。如進一步實施例，使用本發明之 G Μ - C S F抑制劑及組成物及組合療法來治療疱疼後神經痛。除人類病人之外，GM-CSF抑制劑可用於治療非人類動物，例如寵物（狗，貓，鳥，靈長類等等），馴養之農場動物 (馬，牛’綿羊，豬，鳥等等），或任何動物罹患IL -1仲介之發炎或關節炎症狀。於此情形，適當劑量可根據動物體重決定。舉例而言’可使用一劑0.2-1 mg/kg。另外，根據動物 -114- 200918553 表面積決定劑量’示範性劑量範圍爲0.1 - 2 0 m g / m2，或更佳爲5 -1 2 mg/m2。對於小動物，例如狗或貓之適宜劑量爲〇 . 4 mg/kg。GM-CSF抑制劑（較佳構築自衍生自接受者物種的基因）或另一可溶IL-1受體模擬物的投與，是經由注射或其他適合的路徑每週一次或一次以上直到該動物的症狀改善，或可無限期投與。 2.診斷方法所述抗原結合蛋白質可用於偵測、診斷或監測與 GM-CSF有關之疾病及/或症狀之診斷用途。所揭示者提供用於偵測樣本中GM-CSF的存在，其係使用熟悉該項技藝者已知的典型免疫組織染色法（例如Tijssen，1993, ⑽/_ce aW以縱;； of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-^096^° GM-CSF 的偵測可在活體內或活體外進行。本文中提供之診斷應用包括使用抗原結合蛋白質來偵測GM-CSF的表現以及配體對GM-CSF的結合。可用於偵測 GM-CSF存在的方法實例包括免疫分析法，例如酵素連接免疫吸附分析（ELISA)以及放射性免疫分析（RIA)。對於診斷應用’抗原結合蛋白質典型將以可偵測標記基團標記。適合的標記基團包括但不限爲下列：放射性同位素或放射性核種（例如 3H，14C，15N，35S，9DY，99Tc，ιηΙη， I’ 131I)’蛋光基團（例如FITC，若丹明（rhodamine)，鑭 200918553 系燐光體（lanthanide phosphors))，酵素基團（例如山葵過氧化酶（horseradish peroxidase)，β -半乳糖苷酶，蟲螢光素酶 (luciferase)，鹼性磷酸酶），化學發光基團，生物素基團或由二級報告子（例如白胺酸拉鍊配對序列，二級抗體、金屬結合功能部位、抗原決定基標籤之結合位置）辨認之預定多胜肽抗原決定基。在若干具體例中，標記基團是透過各種長度連接體臂偶合到抗原結合蛋白質以降低可能的立體阻障礙。各種標記蛋白質之方法爲技藝已知且可用於進行本發明。所揭示之一態樣提供用於鑑定表現GM-CSF之一個細胞或細胞們。在專一具體例中，以標記基團標記抗原結合蛋白質以及偵測經標記抗原結合蛋白質結合至GM-CSF。在另一專一具體例中，抗原結合蛋白質結合至GM-CSF是在活體內偵測。在另專一具體例中，使用技藝已知技術單離及測量 GM-CSF抗原結合蛋白質。參閱例如 //ar/ow «m/ lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed.，1993, Current Protocols In 幻/ New York: John Wiley & Sons o 本發明之另一態樣提供用於偵測與所提供抗原結合蛋白質競爭結合至GM-CSF之試驗分子的存在。此等分析之一實例將包括於存在或缺乏試驗分子下偵測一含有GM-CSF量之溶液中游離抗原結合蛋白質的含量。游離抗原結合蛋白質的含量增加（亦即抗原結合蛋白質未結合至GM-CSF)代表該試驗分子能與抗原結合蛋白質競爭GM-CSF結合。在一具體 200918553 例中，以標記基團標記抗原結合蛋白質。另外’試驗分子經標記以及於抗原結合蛋白質存在或缺乏下監測游離試驗分子的量。 3·治療方法：醫藥調配物，投與路徑也提供使用抗原結合蛋白質之方法。在若干方法中，提供抗原結合蛋白質給病人。抗原結合蛋白質抑制GM-CSFR 結合至人類GM-CSF。在若干方法中投與抗原結合蛋白質也能經由抑制 GM-CSFR結合至人類 GM-CSF而抑制人類 GM-CSF的自磷酸化。再者，在特定方法中，經由投與有效量之至少一種抗原結合蛋白質到病人來降低單核球趨化性。在若干方法中，經由投與有效量之抗原•結合蛋白質可抑制單核球遷移到腫瘤。此外，經由投與文中提供之抗原結合蛋白質可抑制腫瘤中與腫瘤有關之巨噬細胞的積聚。也提供醫藥組成物，含有治療有效量之一種或複數種本發明之抗原結合蛋白一起與醫藥可接受稀釋劑、載劑 (c a r r i e r)、助溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。此外，本發明提供投與此等醫藥組成物以治療病人之方法。用語“病人” 包括人類病人。可接受的調配物材料其所用劑量及濃度對接受者是無毒性。在一專一具體例中，提供含有治療有效量人類GM-CSF 抗原結合蛋白質之醫藥組成物。在特定具體例中，可接受的調配物材料較佳爲其所用劑量及濃度對接受者是無毒性。在特定具體例中，醫藥組成物可含有調配物材料用於修飾、維持或保存例如pH、滲透性、 200918553 黏性、清澈度、顏色、等滲壓性、氣味、無菌、安定性、溶解或釋放率、組成物之吸附或穿透性。於此具體例中，適合的調配物材料包括但不限爲胺基酸（例如甘胺酸，麩醯胺酸，天冬醯胺酸，精胺酸或離胺酸）；抗微生物劑；抗氧化劑（例如抗壞血酸，亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉）；緩衝液（例如硼酸鹽，碳酸氫鹽，Tris-HCl，檸檬酸鹽，磷酸鹽或其他有機酸）；增體劑（例如甘露醇或甘胺酸）；螯合劑（例如乙二胺四醋酸（EDTA));複合劑（例如咖啡因，聚乙烯呲咯酮，；3 -環糊精或羥基丙基- /3-環糊精）；塡充物；單醣；雙醣；及其他碳水化合物（例如葡萄糖，甘露糖或糊精）：蛋白質（例如血清白蛋白，明膠或免•疫球蛋白）；著色劑，調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物（例如聚乙烯呲咯酮）；低分子量多胜肽；形成鹽之反離子（例如鈉）；防腐劑（例如氯化銨，苯甲酸，水楊酸，硫柳汞（thimerosal)，苯乙醇，對羥基苯甲酸甲酯 (methylparaben)，對經基苯甲酸丙酯（propylparaben)，氯己定（chlorhexidine)，山梨酸或過氧化氫）；溶劑（例如甘油，丙二醇或聚乙二醇）；糖醇類（例如甘露醇或山梨糖醇）；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑（wetting agent)(例如普朗尼克類 (pluronics)，PEG，山梨醇酐酯，聚山梨醇酯類例如聚山梨醇酯20，醇酯（triton)，胺基丁三醇，卵磷脂，膽固醇，太羅朋（tyloxapal));安定性增強劑（例如蔗糖或山梨糖醇）；滲漲度增強劑（tonicity enhancing agent)(例如鹼金屬鹵化物’ 較佳爲氯化鈉或氯化鉀，甘露醇山梨糖醇）；運輸用運載體 (vehicle);稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參閱Remington’ j 200918553

Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1995, Mack Publishing Company ° 在特定具體例中，最佳醫藥組成物將由熟習該項技藝者依據例如所欲投與的路徑、運輸的格式以及所欲劑量決定。參閱例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，同上。在特定具體例中，此等組成物可影響所揭示之抗原結合蛋白質的物理狀態、安定性、活體內釋放率及活體內清除率。在特定具體例中，醫藥組成物中主要的運載體（vehicle)或載劑本質上可爲水溶液或非水溶液。例如適宜的運載體（v e h i c 1 e )或載劑可爲注射用水，生理食鹽水溶液或人造腦脊髓液，可補充非經腸投與用組成物常見之其他物質。中性緩衝之生理食鹽水或混與血清白蛋白之生理食鹽水是進一步之示範性運載體 (vehicle)。在專一具體例中，醫藥組成物含有約pH 7.0-8.5 之Tris緩衝液，或約pH 4.0-5.5之醋酸鹽緩衝液，以及可進一步包括山梨糖醇或爲此之適當取代。在特定具體例中，人類GM-CSF抗原結合蛋白質組成物可經由混合所選具有所欲純度之組成物與選擇之調配劑製備爲凍乾塊或水溶液形式用於保存（Remington' s Pharmaceutical Sciences，同上）° 又在特定具體例中，人類GM-CSF抗原結合蛋白質可使用適合的賦形劑例如蔗糖調配爲凍乾物。該醫藥組成物能選擇用於非經腸運輸。另外，組成物可選擇用於吸入劑或透過消化道運輸，例如口服。此等醫藥可接受組成物之製備是在技藝之技術中。調配物成分較佳以投與位置可接受的濃度存。在特定具 -119- 200918553 體例中，緩衝液用於維持組成物在生理的pH或在稍低PH，典型在pH約5至約8範圍內。當考慮非經腸投與時，該治療性組成物可以含有所欲人類GM-CSF抗原結合蛋白質於醫藥可接受運載體（vehicle)之無熱原、非經腸可接受水溶液之形式提供。特別適用於非經腸注射之運載體（vehicle)是無菌蒸餾水，其中人類GM-CSF 抗原結合蛋白質調配爲無菌、等滲透溶液、經適當保存。在特定具體例中，製備物能包含調配物具有所欲分子與試劑，例如可提供控制或持續釋放產物、能透過積存注射之注射微小球、生物可浸蝕顆粒、聚合性化合物（例如聚乳酸或聚乙醇酸）、珠或微脂粒。在特定具體例中，亦可使用玻尿酸，在循環期間具有促進持續的效果。在特定具體例中，可植入之藥物運輸裝置可用於導入所欲抗原結合蛋白質。

某些醫藥組成物調配爲吸入劑。在某些具體例中，人類 GM-CSF抗原結合蛋白質調配爲乾燥、可吸入粉末。在專一具體例中，人類GM-CSF抗原結合蛋白質吸入劑溶液亦可與推進物調配用於氣霧劑運輸。在特定具體例中，溶液可經噴霧狀化。肺部投與及其調配方法進一步敘述於PCT公開號 W094/20069 ’且敘述經化學修飾蛋白質之肺運輸。也考慮能口服投與之調配物。以此方式投與之人類GM-CSF抗原結合蛋白質能與或不與習慣用於化合固體劑型（例如錠劑及膠囊）之載劑調配。在特定具體例中，膠囊可設計以釋放調配物的活性部分在胃腸道之點當生物利用率是最大化且前全身性分解是最小化時。額外試劑能包括以促進人類G Μ - C S F -120- 200918553 抗原結合蛋白質的吸收。亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩散劑及結合劑。某些醫藥組成物含有有效量之一種或複數種人類 GM-CSF抗原結合蛋白質與適於製造錠劑之無毒賦形劑於混合物中。經由溶解錠劑於無菌水或另一適當的運載體 (vehicle)，可將溶液製備爲單位劑型。適合的賦形劑包括但不限爲惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鹽、乳糖、或磷酸鈣；或結合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。額外醫藥組成物對熟習該項技藝者是明顯的，包括調配物含有人類GM-CSF抗原結合蛋白質於持續型-或控制型-運輸調配物。調配各其他持續型-或控制型-運輸工具例如微脂粒載劑、生物可浸蝕微顆粒或多孔珠及積存注射之技術，亦知於熟習該項技藝者。參閱例如PCT公開號WO 93 / 1 5 722，且敘述運輸醫藥組成物用多孔聚合性微顆粒之控制釋放。持續釋放製備物可包括成形物品形式例如膜或微膠囊之半滲透型聚合物基質。持續釋放基質包括聚酯類，水膠類 (hydrogels)，聚乳酸酯（例如敘述於美國專利第3,7 73,9 1 9號及歐洲專利申請案第EP 05 84 8 1號），L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸之共聚合（Sidman ei £?/.，1983, 纱wers 2_:547-556)，聚（2- 經基乙基-甲丙嫌酸）（Langer ei 〇人，1981，</. 11:167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12.:98-105)'乙烯-醋酸乙烯 (Langer ei α/.，1981，同上）或聚- D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利申請案第EP 1 3 3,98 8號）。持續釋放組成物亦可包括微脂 200918553 粒，能以數種技藝已知方法之任一製備。參閱例如EPP stein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. S ci. U . S . A . 82_ ： 3688-3692 ；歐洲專利申請公開號EP 036,676;EP 088,046及EP 143,949。用於活體內投與之醫藥組成物典型以無菌製備物提供。無菌作用能透過無菌濾膜經由過濾達成。當組成物是凍乾時，使用此方法之無菌作用可在凍乾及復原之前或之後進行。投與用組成物能以凍乾形式或溶液貯存。非經腸組成物通常置於具有無菌出口的容器中，例如靜脈溶液袋或具有以皮下注射針可穿刺塞子之小瓶。一旦醫藥組成物經調配，可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、結晶或經脫水或凍乾粉末保存於無菌小瓶內。此等調配物可以立即使用之形式或投與前復原之形式（例如凍乾）保存。也提供製造單劑投與單位用之套組。特定套組含有具有乾燥蛋白質之第一容器以及具有水溶液調配物之第二容器。在特定具體例中，提供含有單一及多室預塡充注射器（例如液體注射器及凍乾注射器）之套組。欲使用含人類GM-CSF抗原結合蛋白質之醫藥組成物的治療有效量將隨，例如治療背景及目標而異。熟習該項技藝者應知治療用適當劑量水平，在某種程度上將依據運送的分子、所用人類GM-CSF抗原結合蛋白質之適應症、投與路徑及病患大小（體重，體表面或器官大小）及/或健康狀況（年齡及健康槪況）而異。在特定具體例中，臨床醫生可定量劑量及修改投與路徑以得到最佳治療效果。典型劑量可爲從約0.1 # g/kg至最高約30 mg/kg或以 -122- 200918553 上之範圍，視以上提及之因子而異。在專一具體例中，劑量可爲從〇.1//§/让8至最高約3〇1118/1^之範圍，可從1以8/1^ 至最高約30mg/kg’可從10 Ag/kg至最高約i〇mg/kg，可從約 0.1 mg/kg 至 5 mg/kg，或可從約〇.3 mg/kg 至 3 mg/kg。給藥頻率將視特殊人類GM-CSF抗原結合蛋白質於所用調配物之藥物動力學參數而異。通常臨床醫生投與組成物直到劑量達到所欲效果。因此組成物可以單劑或兩劑或以上 (其可以或不可以含有相同量之所欲分子）投與一段時間，或透過植入裝置或導管持續灌注。適當劑量之確定可利用適當劑量-反應數據。在特定具體例中，抗原結合蛋白質能投與病人經一延長期間。抗原結合蛋白質之慢性投與可將常與抗原結合蛋白質（其爲非完全人類，例如在非人類動物中產生抗人類抗原之抗體，例如在非人類物種製造之非完全人類抗體或非人類抗體）有關的不利免疫或過敏反應最小化。醫藥組成物之投與路徑是依據已知方法，例如口服，透過靜脈內、腹膜內、腦內（實質內）、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內路徑注射；經由持續釋放系統或經由植入裝置。在特定具體例中，組成物可經由快速注射 (bolus injection)或連續式輸注或經由植入裝置投與。組成物也可透過已吸附於其上或塡裝入所欲分子之植入膜、藥棉或另一適當材料來局部投與。在特定具體例中，使用植入裝置，該裝置可植入任何適合的組織或器官，以及所欲分子的運輸可透過擴散、定時釋放藥九或持續投與。亦可依所欲使用依據所揭示之人類GM-CSF抗原結合 -123- 200918553 蛋白質醫藥組成物於生體外（ex v/vo)。於此情形，從病患移出之細胞、組織或器官暴露於人類GM-CSF抗原結合蛋白質之醫藥組成物，之後該細胞、組織及/或器官隨後植回該病患。特別是人類GM-CSF抗原結合蛋白質能經由植入特定細胞（其通常已經過遺傳工程處理）來運送，使用方法例如那些文中所述者，以表現及分泌該多胜肽。在特定具體例中，此等細胞可爲動物或人類細胞，以及可爲自體移植的、異體移植的、異種移植的。在特定具體例中，細胞可爲不死的。在其他具體例中，爲減少免疫反應的機會，細胞可裝入膠囊內避免周圍組織的滲透。在進一步具體例中，裝入膠囊的物質典型是生物可相容性，半滲透性聚合封入物或膜，能使蛋白質產物釋放但防止因病患免疫系統或來自組織周遭其他有害因子之細胞破壞。所確認之全部專利及其他刊物是以說明及揭示之目的明確倂入本中參考；舉例而言，此等刊物所述方法學可能用於有關聯之所述者。提供這些刊物僅因他們的揭示早於本申請案申請日。於此方面沒有任何事項應被解讀爲承認由於此先前發明或任何其他理由，本案發明人未享有早於此等揭示之權力。關於日期的所有陳述或關於這些文件內容的表述是根據本案申請人可得的資訊，且不構成任何方面承認該等日期或關於這些文件內容的正確性。提供下列實施例，包括實施之實驗及所得結果僅爲用於舉例說明之目的’且不因此解讀爲限制所附申請專利範圍之 -124- 200918553 範圍。實施例實施例1 :_用於產生、篩潠及特件描沭杭-GM-CSF里株杭體之GM-CSF及其他分子的說明使用數種不同重組及天然GM-CSF分子產生、篩選及特性描述抗-GM-CSF融合瘤及單株抗體。

人類GM-CSF 人類GM-CSF有兩個天然存在的對偶變異體，其差異在位置117之單一胺基酸。從短暫轉染CHO或COS細胞製造在胺基酸位置1 17爲酥胺酸（rhGM-CSF-Thr，SEQ ID NO:146) 或異白胺酸（GM-CSF-Ile，SEQ ID NO:145)之重組人類 GM-CSF分子並經親和力純化。天然人類GM-CSF(nhGM-CSF) 經親和力純化自以 PMA(0.01 ug/ml)、離子黴素 (ionomycin)(0.5 ug/ml)及 EGF(0.02 ug/ml)刺激後之 A431 細胞上清液，自以 PMA(10ng/mL)及離子黴素（500ng/mL)在 37°C刺激48小時後之人類週邊血液單核細胞（PBMCs)上清液，或以TNFa (25 ng/ml)及IL-1(10 ng/ml)刺激後之人類小氣道上皮細胞（SAEC)上清液。大腸桿菌（£· c〇h_)衍生之 rh GM-CSF是購買自R&D系統（Minneapolis，MN)。在胺基酸位置 23 具有白胺酸取代精胺酸之酵母菌衍生之 rhGM-CSF(Leukine®)是購買自 Berlex, I n c . (Μ ο n t v i 11 e , NJ)。大腸桿菌（五.co/i)衍生之rhGM-CSF-R23L是在胺基酸位置23具有白胺酸取代精胺酸之大腸桿菌（五.co//)衍生之 rhGM-CSF。酵母菌衍生之 rhGM-CSF nhGM-CSF(Leukine®)、 -125- 200918553 大腸桿菌（五_ co/〇衍生之rhGM-CSF及大腸桿菌（£. co//)衍生之rhGM-CSF-R2 3L在TF-1 STAT5磷酸化分析中已證明相等G Μ - C S F活性。

長尾拥猴（Cynomolgus macaque)GM-CSF 從轉染大腸桿菌（& 製造重組長尾獼猴gm-csf (rcynoGM-CSF，SEQ ID NO:53)。天然長尾獼猴 GM-CSF (ncynoGM-CSF)經親和力純化自以 TNFa(25 ng/ml)及 IL-1 (10 ng/ml)刺激後之切碎肺組織上清液，或自以PMA(10ng/mL) 及離子黴素（500ng/mL)在37°C刺激48小時後之長尾獼猴 PBMC上清液。犬 GM-CSF ·

從轉形之大腸桿菌（£· 製造犬 GM-CSF(SEQ ID NO :5 4)並使用標準管柱色層分析從包涵體純化。

兔子GM-CSF

從293 6E細胞製造含有His標籤之重組兔子GM-CSF (S E Q ID Ν Ο : 8 2)，並以Ta 1 ο η鈷IM A C純化經以5 m Μ咪唑、 20mM NaP〇4、300mM NaCbpH 7.2 清洗並以咪唑梯度（l〇mM 至300mM)溶析。

/Jn H GM-CSF 從轉形之酵母菌細胞製造重組小鼠GM-CSF(SEQ ID NO:58)，並以三管柱色層分析步驟純化：SP-Sepharose(捕捉），C1 8(逆相純化）以及SP-Sepharose(調換緩衝液）°

大鼠GM-CSF 重組大鼠GM-CSF是購買自R&D系統。 -126- 200918553 親和力純化從經刺激細胞之上清液親和力純化GM-CSF的進行是經由上清液循環經抗-GMCSF mAb(M8)親和力樹脂，以pH 6·〇檸檬酸鈉清洗’並以pH 4.5檸檬酸鈉溶析。匯集有關分層並調換緩衝液爲PBS。以OD28G測定重組GM-CSF濃度，而以ELISA測定天然GM-CSF濃度。用於特性描述抗- GM-CSF mAb之非-GM-CSF試劑重組人類CSF-1是購買自R&D系統。從轉染CHO細胞製造重組hIL-15並使用兩管柱步驟之純化方法純化。陰離子交換純化是以載入l〇mg/ml樹脂pH 7.5之Fractogel TMAE 650M 來進行，然後以 20mM Hepes pH 7.5、然後 20mM MES pH 6.5、然後 lOOmM NaCM、20mM MES 清洗。以 200mM NaCl、20mM MES pH 6.5溶析重組hIL-15。保持蛋白質於 lOmM NaHP04 pH 2.0達1小時（病毒去活化步驟），然後以載入 20 mg/ml 樹脂於 10mM NaHP04 pH 2.0 之 Fractogel EMD SO3 -650(M)進行陽離子交換純化步驟，以10mM檸檬酸鈉、10mM醋酸鈉、10mM MES、pH 4.0清洗，並以10mM 檸檬酸鈉、l〇mM醋酸鈉、lOmM MES、pH 6.0之梯度溶析液溶析，並調換緩衝液爲PBS。實施例2:中和件人類抗-GM-CSF杭體之製浩及篩潠 2.1結合GM-CSF之融合瘤的免疫及篩潠針對對抗人類GM-CSF之完全人類單株抗體的硏發，是使用XenoMouse®技術獲得。兩分開世代之10 KL Xenomice 每3-4天以大腸桿菌（厂co/i)衍生之rhGM-CSF或另注射哺 -127- 200918553 乳動物細胞衍生之rhGM-CSF-Ile及rhGM-CSF-Thr免疫達7 週（共1 6次注射）。第7及第1 1次追加後經由酵素連接免疫吸附分析（ELISA)監測血清力價，並在第16次追加後4天將具最佳力價的小鼠脾臟細胞融合到夥伴細胞株以產生融合瘤。所得多株融合瘤上清液經由ELISA篩選結合至GM-CSF 者，以及經由α篩選人類重鏈及/c及/或λ輕鏈的存在。此免疫戰役產生499株表現人類重鏈及輕鏈之具GM-CSF-結合活性者。 2.2使用hGM-CSF-依存件細朐系牛物分析法確認县GM-CSF 中和活件之融合瘤使用兩種細胞系生物分析法：在T F - 1細胞之G Μ - C S F 誘發STAT5磷酸化（2.2·l)以及AML-5細胞之GM-CSF-誘發增殖（2.2.2)來特性描述499融合瘤上清液之GM-CSF中和活性。從這些結果篩選14個融合瘤用於選殖。 2.2.1 在TF-1細朐抑制GM-CSF-誘發STAT-5磷酸化在 37°C、1 0% C02 於補充 5% FBS、1 0 mM Hepes、2mM L-麩醯胺酸、50 U/mL青黴素、50 /z g/mL鏈黴素、55 uM 锍基乙醇及10 ng/mL大腸桿菌（五.co/〇衍生之rhGM-CSF的 IMDM中增殖TF-1細胞。分析前1天，以35〇Xg離心6分鐘收取TF-1細胞，並於PBS清洗3次。以lxl06/mL再懸浮細胞並在 37°C、10% C〇2 於 IMDM + 0.5°/。FBS 不含 GM-CSF 中培養隔夜。在2 mL 9 6-井圓底平板以100 // L總體積進行分析。以1:4最終稀釋將融合瘤上清液置入平板製備一式兩份並以rhGM-CSF-Ile(〇.4 ng/mL終濃度）在37。(：培育30分 -128- 200918553 鐘。收取血清-及GM - C S F -缺乏之TF -1細胞，於P B S清洗並以6 xl 06細胞/mL再懸浮於含0.5% FBS之IMDM。添加50 # L細胞懸浮液（3 xlO5細胞/井）並將平板置37°C培育15分鐘。爲固定細胞，添加 25 μ L 之 10%三聚甲醛 (paraformaldehyde)於PBS爲終濃度2%三聚甲醒，並將平板置37°C培育15分鐘。添力口 200 #LIMDM + 0.5%FBS至井以終止固定作用，然後以3 5 Oxg離心平板7分鐘。移除細胞上清液，並一邊用力混合細胞下緩慢添加400 // L的90%

MeOH。-2(TC培育隔夜後旋轉該平板，以400 " L PBS/2% FCS清洗並以 50 β L 1:5稀釋（含 2%FBS於PBS)之抗 -PhosphoSAT5-Alexa488(Becton Dickinson 612598，. Franklin Lakes, NJ)在室溫培育30分鐘。以含2%FBS於PBS清洗、再懸浮細胞並轉移到圓底微力價平板，使用MultiWell FACScalibur(Becton Dickinson)進行流式細胞技術分析。使用FlowJo FACS分析軟體測定STAT5 +細胞的百分比。使用下列方程式計算融合瘤上清液之STAT5磷酸化的抑制百分比：

100-({[ A 之 STAT5+ °/〇 - B 之 STAT5+%]/[C 之 STAT5+% - B 之 STAT5+ %]}*1〇〇) 其中 A =細胞+融合瘤上清液+rhGM-CSF，B =只有細胞，C = 細胞 +rhGM-CSF 對於每一分析測定以大於閾値抑制 GM-CSF-依存性 STAT5磷酸化之融合瘤上清液，使用IL-3-誘發之STAT5磷酸化進一步特性描述其專一性，並使用TF-1 Phosflow生物分析法及AML-5細胞株GM-CSF-誘發增殖之生物分析法特性描述對抗nhGM-CSF及rcynoGM-CSF的效力（2.2.2)。顯示 -129- 200918553 GM-CSF-依存性磷- STAT5反應及抗-hGM-CSF抗體（MAB215, R&D 系統）抑制由〇.4 ng/mL rhGM-CSF-Ile 誘發 STAT5 磷酸化能力之代表性實驗示於第3圖。第4圖顯示以大腸桿菌（五. 〜⑴衍生之rhGM-CSF所免疫世代的融合瘤上清液，對 rhGM-CSF-Ile-誘發STAT5磷酸化之抑制百分比的長方條統計圖。 2.2.2經由融合瘤卜清液之AML-5細胞GM-CSF-依存件增殖的抑制作用在 37°C、10% C02 於補充 5% FBS、1 0 mM Hepes、2mM L-麩醯胺酸、50 U/mL青黴素、50 yg/mL鏈黴素、55uM /3-锍基乙醇及10 ng/mL大腸桿菌（五· coH)衍生之rhGM-CSF的 IMDM中增殖AML-5細胞。實驗當天，以3 5 0xg離心AML-5 細胞5分鐘並於PBS清洗4次移除殘留GM-CSF。爲測試 AML-5細胞之GM-CSF-或CSF-1-誘發增殖的抑制作用，將多株融合瘤上清液以1:10及/或1:30及/或1:90最終稀釋置於96-井平底微力價平板製備2份，並添加事先已測定EC90 値之細胞激素：0.05 ng/mL之A43 1細胞衍生之nhGM-CSF 及 rcynoGM-CSF ; 0.15 ng/mL 之 rhGM-CSF-Ile 及 rhGM-CSF-Thr ；以及 10 ng/mL 之 rhCSF-1。以對 1 0 0 μ L 體積爲5χ104細胞/mL(2.5 χ 103細胞/井）添加50 #LAML-5 細胞之前，在37°C培育抗體/細胞激素混合物30分鐘。在 3 7°C、10% C02培育平板72小時。爲偵測AML-5細胞增殖，平板脈衝以 1微居里（μ〇的氚化胸腺核苷（tritiated thymidine)，6小時後收取並以液態閃爍計數器讀取。使用 -130- 200918553 下列方程式計算融合瘤上清液之AML-5增殖的抑制百分比： 100-({ A 之 CPM/Β 之 CPM }*1〇〇) 其中A =細胞+融合瘤上清液+細胞激素，以及B =細胞 + 細胞激素篩選以1:30稀釋有效抑制人類及長尾獼猴GM-CSF-誘發、但非人類CSF-1-誘發AML-5細胞增殖之融合瘤上清液，用於選殖來製造單株抗-GM-CSF融合瘤。第5圖顯示展現 GM-CSF-依存性增殖反應及抗-hGM-CSF抗體（MAB215, R&D 系統）抑制由 0.15 ng/mL rhGM-CSF-Ile 誘發 AML-5 細胞增殖之能力的代表性實驗。 2.3單株融合瘤細朐株之製造根據該生物分析篩選結果，篩選14個多株融合瘤株用於經由限制稀釋選殖單株性。計數多株融合瘤平板之細胞，以48細胞/mL再懸浮並稀釋至24細胞/mL、4.8細胞/mL及 2.4細胞/mL於20 mL培養基。以200μΐ/井將細胞置於平板，對每一選殖之細胞株製造4種不同密度的平板（1 0細胞/井、 5細胞/井、1細胞/井以及〇. 5細胞/井）。選殖後兩週內，在顯微鏡下目視檢查平板並從來自1細胞/井及〇. 5細胞/井的選殖用平板（其中只偵測到單一群落）之各井收取上清液。經由E L I S Α篩選上清液的抗原專一性，並經由E LI S Α分析抗原陽性之上清液的重鏈及輕鏈物種及同型物組成物。只保持並冷凍來自已證明井中僅單一群落生長之每一細胞株的1至 3個子代選殖株，抗原專一免疫反應性以及人類λ或/c及 IgG組合。經由每一子代選殖株之序列分析確認單株性。 200918553

2.4純化自單株融合瘤卜.清液之杭-GM-CSF杭體的GM-CSF 中和活件特件描沭 2.4.1從融合瘤上清液純化I g G 使用蛋白質A管柱色層分析從單株融合瘤上清液親和力純化IgG，以及使用NanoDrop ND- 1 000 UV-Vis分光光度計在 A280(Nanodrop Technologies, Wilmington，DE)定量。 2.4.2以單株杭體抑制AML-5細胞之GM-CSF-依存件增殖如實施例2.2.2所述增殖及製備AML-5細胞用於分析。爲評估純化自融合瘤上清液之單株抗體抑制GM-CSF·或 CSF-1-誘發AML-5細胞增殖的能力，在96-井平底平板滴定各抗體製備2份（開始以5 pg/mL做8倍連續稀釋）。添加事先已測定EC90値之細胞激素：0· 1 ng/mL之nhGM-CSF(A43 1 或衍生自人類 PBMC) ; 0.3 ng/mL 之 rhGM-CSF-Ile ; 0.8 ng/mL 之 rhGM-CSF-Thr ； 0.05 ng/mL 之 rCynoGM-CSF ;以及3 ng/mL之rhCSF-1。在每一實驗中，也以2倍連續稀釋滴定GM-CSF及CSF-1以計算在該實驗中的EC90値。在添加100μί總體積之2.5xl04細胞/mL的AML-5細胞之前，在 37°C培育細胞激素及抗體30分鐘。在37°C、10% C02培育平板。3天之後，平板脈衝以1微居里（μ〇的氚化胸腺核，6 小時後收取並以液態閃爍計數器讀取。使用下列方程式計算純化自融合瘤上清液之mAb抑制AML-5增殖的百分比： ([A 之 CPM - B 之 CPM]/[ A 之 CPM - C 之 CPM])*100 其中A =細胞+細胞激素，B =細胞+mAb +細胞激素，以及C = 只有細胞 -132- 200918553 使用Microsoft Excel(Redmond，WA)產生非線性回歸分析以及增殖之50%抑制（IC 50)値計算。實驗中用於刺激細胞之細胞激素量在其EC90値的兩倍內者，用於計算單株融合瘤抗體的平均IC50値（表5)。使用一個或一個以上同一 mAb 選殖株（已經由序列確認）之實驗包括於平均中。表5:純化自融合瘤上清液之mAb於AML-5增殖及TF-1

Stat5磷酸化分析中之IC50(nM)値的表分析細胞激素 IgGA IgGB IgGC IgGD IgGE IgGF AML-5 增殖分析 rhGM-CSF-Ile 0.302 0.627 0.347 0.176 0.376 0.193 rhGM-CSF-Thr 0.286 0.470 0.501 0.315 0.296 0.179 nhGM-CSF (A431) 0.414 0.299 0.442 0.299 0.323 0.179 nhGM-CSF(PBMC) 0.235 0.947 0.659· 1.373 0.575 0.214 rcynoGM-CSF 0.710 0.574 0.496 0.169 0.669 0.897 TF-1 Stat5 磷酸化分析 rhGM-CSF-Ile 0.046 0.060 0.049 0.114 0.042 0.055 rhGM-CSF-Thr 0.016 0.023 0.027 0.061 0.035 0.027 nhGM-CSF (A431) 0.143 0.075 0.074 0.116 0.067 0.081 rcynoGM-CSF 0.057 0.075 0.066 0.066 0.274 0.063 如第6圖及表5所示，來自融合瘤上清液之數個單株抗體以劑量依存性方式抑制GM-CSF-誘發、但非CSF-1-誘發之AML-5細胞增殖。經由相稱於增殖之最大抑制作用的一半，在此分析中單株抗體對抗測試之GM-CSF形式具有1C 50 値 < 1 η Μ。 2.4.3 TF-1細朐中經由純化自融合瘤匕清液之抗-GM-CSF單株杭體的GM-CSF-依存件STAT-5磷酸化抑制作用如實施例2.2.1所述增殖及製備TF-1細胞用於分析。爲評估TF-1細胞的GM-CSF-或rhIL-3-誘發STAT5磷酸化之 -133- 200918553 抑制作用，純化自融合瘤上清液之單株抗體，各在96-井圓底深井平板中滴定製備2份（開始以2pg/mL做5倍連續稀釋）。添加事先已測定EC90値之細胞激素：0.3 ng/mL之 nhGM-CSF(A43 1)及 rcynoGM-CSF ； 0.9 ng/mL 之 rhGM-CSF-Ile 及 rhGM-CSF-Thr;以及 30 ng/mL 之 rhIL-3。在每一分析中，也以2倍連續稀釋滴定GM-CSF及IL-3以計算每一分析中的EC90値。在添加100pL總體積之3xl05 細胞/mL血清及GM-CSF缺乏之TF-1細胞之前，在37°C培育細胞激素及抗體3 0分鐘。在3 7 ° C刺激細胞1 5分鐘然後固定，如實施例2.2.1所述可滲透及分析STAT5磷酸化。使用下列方程式計算純化自融合瘤上清液之mAb抑制Stat5磷酸化的百分比： ([A 之 Stat5 + % - B 之 Stat5+ %]/[A 之 Stat5+% - C 之 Stat5+%])*100 此處A =細胞+細胞激素，B=細胞+mAb+細胞激素，以及C=只有細胞使用GraphPad Prism 4.01計算非線性回歸分析以及增殖之最大抑制作用的一半（1C 5 0hm)値。用於刺激細胞之細胞激素量在其EC90値兩倍內之實驗被用於計算單株抗體的平均IC50値（表5)。如第7圖及表5所示，在TF-1細胞中數種單株抗體以劑量依存性方式抑制GM-CSF-誘發、但非rhIL-3-誘發之 STAT5磷酸化。在此分析中單株抗體具有<0.3 nM之IC50hni 値對抗測試之GM-CSF形式。甯施例3 :夾自轉染細胞株之重組單株杭體（mAb)的選殖及表現 -134- 200918553 用於抗體選殖株之重鏈及輕鏈可變區域被次選殖到人類 IgG2骨架（framework)並短暫或穩定轉染及表現於 COS(短暫轉染）或CHO(穩定轉染）細胞。經由短暫轉染表現於COS細胞之抗體是純化自上清液，使用結合於TBS、pH 7.4 之 2.2x10cm MabSeleetSurer 蛋白質 A，以 50mM 檸檬酸、 pH 3.4 + /-0.2溶析。使用庫存pH 8_0之1M Tris鹼調整溶析液至pH 6.0並使用透析調換緩衝液爲10mM乙酸、9%蔗糖、 pH 5.2。得到一選殖株繼續透析爲具有10mM KP、16 1mM L-Arg、pH 7.6之緩衝液，然後濃縮爲20mg/mL。表現自穩定CHO細胞株之抗體是純化自上清液，使用結合於 TBS、pH 7.4 之 l.lxlOcmMabSelectSurer 蛋白質 A，以100mM乙酸、pH 3.6溶析。使用GE去鹽管柱將溶析液經調換緩衝液5mg爲10mM乙酸、9%蔗糖、pH 5.2。然後使用 GE去鹽管柱將2 0-30mg的材料調換緩衝液爲CellgroPBS、 p Η 7.2。來自第二細胞轉染之材料經第二次純化並維持於 lOmM Μ乙酸、9%蔗糖、pH 5.2緩衝液。實施例4 :經由表面電漿共振之重組mAb對rhGM-CSF-Ile 的動力學結合分析使用表面電漿共振在25 °C、使用裝配CM4感應晶片之 Biacore 3000 儀（Biacore AB, Uppsala，Sweden)進行抗 -GM-CSF重組單株抗體之動力學結合分析。使用標準含 HBS-EP之胺偶合化學作爲進行緩衝液將山羊抗-人類IgG捕捉抗體共價固定於晶片。簡言之，以0.1 M NHS及0.4 M EDC 之1:1 (ν/ν)混合物以流速5 μί/分鐘活化每一流式細胞7分 -135- 200918553 鐘。山羊抗-人類IgG以30 pg/mL於10 mM乙酸鈉、pH 5.5 以密度〜3200 RU固定在兩流式細胞。於7-分鐘以5 μί/分鐘注射1 Μ乙醇胺將殘留反應表面去活性。以1 00 μί/分鐘將50 pL之10 mM甘胺酸HCM、pH 1.5注射3次於每一流式細胞以移除任何殘留之非共價結合的捕捉抗體並適應每一表面。將進行緩衝液轉換爲含0.1 m g / m L B S A及2 m g / m L CM-葡聚糖之HBS-EP用於所有剩餘步驟。以10 pL /分鐘注射0.5 pg/mL之重組抗- GM-CSF mAb 於山羊抗-人類IgG表面1.5分鐘以得到表面密度〜111 RU。剩餘之山羊抗-人類IgG表面留下未經修飾作爲參考。開始進行5個循環之緩衝液空白以適應晶片表面。製備濃度 300、100、33.3、11.1、3.70 及 1.23 nM — 式三份之重組 hGM-CSF-Ile樣本’並與6緩衝液空白以100 μί/分鐘隨機順序注射於補捉重組抗-GM-CSF IgG及參考表面。使每一複合體結合 2.5分鐘，並分離 2.5分鐘。此外，100 nM rhGM-CSF-Ile及緩衝液空白之一式三份樣本另以1〇〇 pL/分鐘注射於兩表面’並使結合2.5分鐘及分離90分鐘以收集更多分離相數據。表面再生於每一 rhGM-CSF-Ile或緩衝液以100 μ!^/分鐘注射1 0 mM甘胺酸HC1、pH 1 .5達30-秒及隨後注射緩衝液30-秒之後。數據是經由減去參考表面反應以移除大部分的折射指數變化之雙重參考’然後減去平均之緩衝液空白反應以移除來自流式細胞之系統性人造物。由於缺乏動力學資訊從分析刪除收集自300 nM曲線之數據，因該數據缺乏曲率及濃度 -136- 200918553 爲〜6000xKd。數據經以 Scrubber(2.0a 版，BioLogic Software，Campbell，Australia)處理及全面性適於 1:1 相互作用模式以得到動力學速率常數kd及ka ’以及平衡結合常數Kd。結果不於表6。表6 :經由表面電漿共振之重組mAb對rhGM-CSF-Ile的動力學結合分析 mAb KaiM-'s-1) Kd (s'1) KD (pM) IgG A 3.34 x 105 3.03 x 10'5 90 IgG B 6.54 x 10s 3.19 x 10'5 49 IeB c 8.67 x 105 7.05 x 10 '5 81 IgG E 9.12 x 10s 1.16 x IQ 5 128

實施例5:抗-GM-CSF抗體對其他物種之GM-CSF以ELISA 測量的交叉反應性

評估融合瘤mAb選殖株及來自以上之重組mAb結合 rhGM-CSF-Ile、rhGM-CSF-Thr、酵母菌衍生之 rhGM-CSF (Leukine®)、£· c ο Π 衍生之 r h G Μ - C S F、nh GM - C S F 及 / 或來自一個或一個以上下列物種：小鼠、大鼠、兔子、犬及長尾獼猴之重組GM-CSF的能力（第8A及8B圖）。以50 μί的1 Ug/mL GM-CSF溶液或對照組蛋白質塗覆96-井平板的個別井並在4°C培育隔夜。以PBS/Tween清白平板4次，然後以 2 ug/ml添加以上抗-GM-CSF mAb(或對照組抗體）與各 GM-CSF蛋白質至井，在室溫培育1小時，然後以PBS/Tween 清白4次。以1 :8000添加HRP-共軛之抗-人類IgG，在室溫培育1小時，然後以PBS/Tween清白平板4次。添加TMB 200918553 顯影劑，培育10分鐘並在平板讀取儀於65 Onm讀取平板。抗- GM-CSF mAb選殖株及重組mAb結合至rhGM-CSF-Ile、 rhGM-CSF-Thr 、五.co/;衍生之 rhGM-CSF 及重組 cynoGM-CSF’但未結合至小鼠、大鼠或犬GM-CSF。某些但非全部的選殖株也結合至酵母菌衍生之 rhGM-CSF(Leukine®)(第8 A圖）。在一分開分析中，一來自融合瘤上清液之抗-GM-CSF mAb選殖及第二穩定細胞株 (SCL)轉染結合至 PBMC 衍生之 nhGM-CSF、rhGM-CSF-Ile 及 rcynoGM-CSF，但未結合至小鼠、大鼠、兔子或犬 GM-CSF(第 8B 圖）。實施例6:對於重組抗-GM-CSF mAb於細朐系牛物分析法及人額全體血液使用多GM-CSF分子之IC50値測定如上所述，從短暫轉染細胞及穩定轉染細胞株表現完全人類重組抗-hGM-CSF抗體。從兩獨立的短暫轉染（第一 TT 及第二TT)以及兩分開收取之穩定細胞株（第一 SCL及第二 SCL)純化材料。下歹丨J實驗說明對於對抗不同形式之人類及長尾獼猴GM-CSF的六個重組抗體選殖株之IC50値測定（表 7-9)。 6.1經由重組杭- GM-CSF mAb之AML-5細朐GM-CSF-依存忤增殖的抑制作用如實施例2.4.2所述使用mAb開始以10 pg/mL的9-倍連續稀釋及事先測定EC90濃度之細胞激素進行AML-5增殖分析。對於使用第二TT及第二SCL材料之實驗（第9圖），以下列濃度添加細胞激素：〇·2 ng/mL之 PBMC衍生之 -138- 200918553 nhGM-CSF; 0.4 ng/mL 之 rhGM-CSF-Ile;以及 0.1 ng/mL 之 rCynoGM-CSF。對於其他分析，除以上細胞激素之外測試 rhGM-CSF-Thr(0_4 ng/mL)及肺組織衍生之 ncynoGM-CSF(3 ng/mL)。在每一實驗中，也使用2-倍連續稀釋滴定所用之細胞激素來計算該實驗之EC90値。添加2.5xl04 AML-5細胞 /m L於總體積1 〇〇 μ L之前，在3 7 ° C培育細胞激素及抗體3 0 分鐘。在3 7 ° C、1 0 % C Ο 2 7 2小時之後，每一井添力□ 1微居里氚化胸腺核苷。6小時後收取細胞培養，並以液態閃爍計數器測量倂入之氚化胸腺核苷。如實施例2.4.2計算經由重組mAb之AML-5增殖的抑制百分比。使用Microsoft Excel 產生非線性回歸分析以及增殖之50 %抑制（IC 50)値計算。實驗中用於刺激細胞之細胞激素量在其EC 90値的兩倍內者，用於計算各mAb的平均IC50値。 ' 全部短暫-及穩定細胞株產生之之重組抗體以劑量依存性方式抑制GM-CSF-誘發的AML-5細胞增殖。全部來自短暫轉染的六個上述抗體以IC50値<0.8 nM抑制人類GM-CSF 以及以IC50値<3.5 nM抑制長尾獼猴GM-CSF。全部六個穩定細胞株上述抗體以IC50値<1 .5 nM抑制人類GM-CSF以及以IC50値<3.5 nM抑制長尾獼猴GM-CSF。對於三種抗體的結果示於第9圖。對於AML-5增殖分析所測試之全部抗體 IC 5 0値及細胞激素之槪述示於表7。 -139- 200918553 表7: AML-5增殖分析中重組mAb的IC50(nM)値細胞激素抗體 n IgG A IgGB IgGC IgG E rhGM-CMS-Ile 第一 TT 2 0.545 0.286(n4) 0.258(n4) 0.403 第二TT 3 0.579 0.581 0.380 0.380(n2) 第一 SCL 3 0.844 1.192 0.766 0.971(n2) 第二 SCL 1 0.966 0.943 0.595 rhGM-CSF-Thr 第一 TT 2 0.475 0.540 0.469 0.371 第二TT 1 0.181 0.200 0.165 0.249 第一 SCL 2 0.706 0.509 0.557 0.549 nhGM-CSF (PBMC) 第一 TT 2 0.264 0.155 0.190 0.247 第二TT 2 0.195 0.232 0.312 0.574(nl) 第一 SCL 2 0.308 0.270 0.160 0.360(nl) 第二 SCL 1 0.251 0.213 0.081 rcynoGM-CSF 第一 TT 1 0.395 0.072 0.253 0.215 第二TT 1 1.607 1.319 0.864 0.693 第一 SCL 2 3.267 1.177 1.624 2.479(nl) 第二 SCL 1 2.488 0.842 1.755 ncynoGM-CSF (lung) 第二TT 1 1.530 3.242 1.222 1.331 第一 SCL 1 1.471 2.683 1.696 1.604 6.2在TF-1細朐中經由重細杭-GM-CSF mAb之GM-CSF-依存件STAT5磷酸化的抑制作用如實施例2.4.3所述使用mAb開始以2 pg/mL的6-倍連續稀釋及事先測定EC90濃度之細胞激素進行TF-1 STAT5 磷酸化分析。對於使用第二TT及第二SCL材料之實驗（第 1 0圖），以下列濃度添加細胞激素：0.6 ng/mL之PBMC衍生之 nhGM-CSF 及 rhGM-CSF-Ile ; 0.1 ng/mL 之 rcynoGM-CSF。對於使用第一 ττ材料之實驗（第11圖），使用來自經刺激人類小呼吸道上皮細胞（SAEC)培養上清液（最終nhGM-CSF濃度爲0.2 ng/mL)及來自經刺激長尾獼猴肺培養上清液（最終 ncynoGM-CSF濃度爲〇.l ng/mL)。第12圖中，添加來自經剌激長尾獼猴PBMC培養上清液（最終GM-CSF濃度爲1 ng/mL) -140- 200918553 至來自第二SCL之GM-CSF mAb。對於其他分析，除以上細胞激素之外測試0.75 ng/mL之rhGM-CSF-Thr。在每一實驗中，也使用2-倍連續稀釋滴定所用之細胞激素來計算該實驗之E C 9 0値。1 5分鐘之後，固定及滲透細胞，以及如上實施例2.2.1及2.4.3所述使用抗-磷-STAT5抗體偵測STAT5磷酸化的量。如實施例2.4.3計算經由重組mAb之Stat5磷酸化的抑制百分比。使用GraphPad Prism 4.01計算非線性回歸分析以及增殖之最大抑制作用的一半（1C 5 0hm)値。實驗中用於刺激細胞之細胞激素量在其EC90値的兩倍內者，用於計算該單株抗體的平均IC50値。 6.3經由雷絹杭-GM-CSF mAb之原始人類單梭球的GM-CSF- 依存件活化抑制作用爲評估mAb中和人類單核球中GM-CSF-誘發之代謝活性的能力，使用單核球單離套組11^山61^18丨〇1“11)從白血球分離包（Amgen華盛頓血液捐贈計畫）單離原始單核球。負篩選的細胞是9 0 % - 9 5 % C D 1 4 +細胞如流式細胞技術評估（數據未示）。在96-井平底平板中，PBMC衍生之nhGM-CSF或 rhGM-CSF-Ile(0.05 ng/mL)與開始以 20 pg/mL 之 6-倍連續稀釋的mAb培育30分鐘。添加CD14 +細胞（150,000/mL)於共 100 μί 培養基（補充以 10% FCS、10 mM Hepes、2mML-麩醯胺酸、50 U/mL青黴素、50 pg/mL鏈黴素及55 μΜβ -疏基乙醇之RPMI)至平板並在37°C、5% C02培育5天。經由添加 2 0 μί 之 Alamar Blue(BioSource，DAL1025，Invitrogen, Carlsbad, CA)與培養基之1 : 1混合物評估GM-CSF-誘發的代謝活性’並在4-8 小時後計算5 70-600nm的吸光率。使用下列方程式計算經由 -14 1- 200918553 重組mAb之人類CD 1 4 +單核球活性的抑制百分比： ([A 之 OD570-6Q。- B 之 OD570-6GG 〇f]/[A 之〇D57q._ - C 之 OD570-60Q])*1〇〇其中A =細胞+細胞激素，B =細胞+mAb +細胞激素，以及C = 只有細胞使用Microsoft Excel產生非線性回歸分析及增殖之 5 0%抑制作用（IC50)値計算。實驗中用於刺激細胞之細胞激素量在其EC90値的兩倍內者，用於計算該mAb的平均1C50 値（表8)。短暫-及穩定細胞株產生之之重組抗體以劑量依存性方式抑制GM-CSF-誘發的 AML-5細胞增殖。該抗體以 IC50h„Wil<0.13 nM 抑制人類 GM-CSF 以及以 iC50htn 値 <0.31 nM抑制長尾獼猴GM-CSF。表8 : TF-1 Stat5磷酸化分析中重組mAb的IC50(nM)値細胞激素抗體 η IgGA IeG B IgG C IgG E rhGM-CMS-IIe 第一 ττ 1 0.117 0.046 0.072 0.101 第二ττ 2 0.016 0.013 0.012 第一 SCL 1 0.011 0.008 0.002 第二 SCL 1 0.027 0.009 0.011 rhGM-CSF-Thr 第一 ΤΤ 1 0.114 0.052 0.050 0.068 nhGM-CSF (PBMC) 第二ττ 1 0.009 0.008 0.009 第二 SCL 1 0.010 0.008 0.009 nhGM-CSF (SAEC上清液）第一 ΤΤ 1 0.042 0.025 0.022 0.030 rcynoGM-CSF 第一 ΤΤ 2 0.050 0.021 0.031 0.052 第二ττ 1 0.230 0.183 0.305 第二 SCL 1 0.128 0.149 0.196 ncynoGM-CSF (肺上清液）第二ΤΤ 1 0.179 0.079 0.141 0.191 ncynoGM-CSF (PBMC上清液）第一 ττ 1 0.0022 第二 SCL 1 0.0004 -142- 200918553 短暫-及穩定細胞株產生之重組抗體以劑量依存性方式抑制GM-CSF-誘發的人類單核球活性。不顧表現方法，上述抗體皆以IC50値<0.55 nM抑制天然及重組hGM-CSF。對於第一 TT材料之結果示於第π圖。人類單核球分析中對於全部測試抗體之IC50値槪述示於表9。表9 :人類單核球分析中重組mAb的IC50(nM)値細胞激素抗體 η IgG A IgGB IgG C IgG E rhGM-CMS-Ile 第一 TT 1 0.076 0.078 0.034 0.089 第二TT 2 0.136 0.096 0.083 0.142 第一 SCL 1 0.028 0.051 0.046 第二 SCL 1 0.130 0.150 0.089 nhGM-CSF (PBMC) 第一 TT 1 0.549 0.253 0.301 0.490 第二TT 2 0.210 0.219 0.161 0.305 第一 SCL 2 0.149 0.151 0.085 0.210(nl) 第二 SCL 1 0.171 0.204 0.114 g . 4經由穩定C Η Ο 朐株製浩之雷絹杭-GM - C S F於人類整體血液產牛GM-CSF-誘發之ΕΝΑ-78或ΜΙΡ-1 β的抑制作用製備重組hGM-CSF-Ile(終濃度2 ng/mL)於補充10%正常人類血清、100 U/mL青黴素、100 ug/mL鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸及25 mM HepeS之RPMI，並在96-井平底平板添加至以100 Hg/mL開始6-倍連續稀釋之穩定CHO細胞株的重組mAb。將相配於人類IgG2之同型物單株抗體（抗-KLH) 添加至全部井中至最終總IgG濃度爲100 pg/mL，並在37°C 培育平板30分鐘。於4-倍連續稀釋+/- 1 00 pg/mL相配於人類IgG2之同型物滴定細胞激素來計算該實驗EC 90値。收集人類整體血液至Amgen整體血液捐贈計畫之Na-肝素採血管 -143- 200918553 (Becton Dickinson)，以及添加 228 pL(2 8 5 μί 總體積）血液至井並以緩慢吸量混合。在37°C、5% C02培育40小時後，以73 Oxg旋轉平板5分鐘，然後小心收集55 μί血漿並轉移到新的96井平板及冷凍。使用R&D系統之hENA78及 hMIP-lb DuoSets試劑及方法步驟經由ELISA分析ENA78 及 MIP-lb之前，解凍血漿並匯合一式兩份的井。使用 GraphPad Prism 4.01計算非線性回歸分析以及增殖之最大抑制作用的一半（IC50hm)値。在此人類整體血液分析中，重組人類GM-CSF mAb呈現抑制GM-CSF-誘發製造ENA78及MIP-lb。IC50hm値之測定，對於ENA78製造爲0.155 nM以及MIP-lb製造爲0.299 · nM(第 1 4 圖）。實施例7: GM-CSF-誘發AML-5增殖分析人類單核球生物分析及TF-1細朐分析中GM-CSF-誘發TF-1 STAT-5磷酸化之酵母茼衍牛.之 rhGM-CSF(Leukine®)、A431 衍生之 nhGM-CSF、大腸桿茼衍生之rhGM-CSF及大腸稈茼衍牛之 rhGM-CSF-R23L的中和作用如實施例 2.4.2所述使用純化自融合瘤上清液之 GM-CSF mAb開始以5 pg/mL的9-倍連續稀釋及事先測定 EC90濃度之細胞激素（大腸桿菌（£. coH)衍生之rhGM-CSF 爲0.1 ng/mL，酵母菌衍生之rhGM-CSF爲0.05 ng/mL)進行 AML-5增殖分析。也使用2-倍連續稀釋滴定所用之細胞激素來計算該實驗之EC90値。添加2.5xl04 AML-5細胞/mL於總體積1〇〇μί之前，在37°C培育細胞激素及抗體30分鐘。 -144- 200918553 在37 °C、10% C02 72小時之後，每一井添加1微居里氚化胸腺核苷。6小時後收取細胞培養’並以液態閃爍計數器測量倂入之氚化胸腺核苷。如第1 5 a圖所示，四個mAb能中和五.c ο / ί衍生之r h G Μ - C S F的活性，但不能中和酵母菌衍生之 rhGM-CSF(Leukine®)。如實施例6.3所述使用純化自融合瘤上清液之mAb開始以12 g/mL的3-倍連續稀釋及事先測定EC90濃度之細胞激素（A431細胞衍生之 nhGM-CSF以及酵母菌衍生之 rhGM-CSF爲0.04 ng/mL)進行人類單核球分析。也使用2-倍連續稀釋滴定所用之細胞激素來計算該實驗之EC90値。添加1.5xl05人類CD14 +細胞/mL於總·體積ΙΟΟμί之前，在 37°C —起培育細胞激素及抗體30分鐘。在37°C於5%C02 « > 培育平板5天，並經由測量Alamar Blue的還原來評估 GM-CSF-誘發的代謝活性。對於兩分析，使用 Microsoft Excel產生非線性回歸分析以及增殖之50%抑制（IC50)値計算。實驗中用於刺激細胞之細胞激素量在其EC90値的兩倍 * 內者包括在分析中。如第1 5b圖所示，四個mAb能中和A43 1 細胞衍生之rhGM-CSF的活性，但不能中和酵母菌衍生之 rhGM-CSF(Leukine®)。如實施例 2.2. 1所述使用重組抗-GM-CSF mAb進行 TF-1 STAT5磷酸化分析。在一式兩份之96井平板中，抗 -GM-CSF mAb開始以2 pg/mL的6-倍連續稀釋及事先測定 EC9Q濃度之細胞激素（大腸桿菌（£；. coH)衍生之rhGM-CSF及大腸桿菌衍生之rhGM-CSF-R2 3L爲0.5 ng/mL，酵母菌衍生 -145- 200918553 之 rhGM-CSF-R23L(Leukine®)爲 0.2 ng/mL)。30 分鐘培育後，添加3xl05 TF-1細胞/ml至總體積100 μί。在37°C培育平板15分鐘。爲固定細胞，添加25 μί的10%三聚甲醛於PBS至終濃度爲2%三聚甲醛，以及在37°C培育平板10 分鐘。將 200 μί IMDM + 0.5% FBS ' 10 mM Hepes ' 2mM L-麩醯胺酸、50 U/mL青黴素、50 pg/mL鏈黴素、55 ιιΜβ-锍基乙醇添加至井中以終止固定作用，然後以3 50xg離心平板 1 0分鐘。移除細胞上清液並強力混合細胞時緩慢添加400 μί 之90% MeOH。在-20°C隔夜培育後旋轉平板，以600 μί的 PBS/2% FCS清洗並與50 pL之1:5稀釋（於含2% FBS之PBS) 抗-磷 S TAT 5jAlexa488(Becton Dickinson 6 1 2598，Franklin • Lakes, NJ)在室溫培育30分鐘。清洗細胞，再懸浮於含2% f FBS 之 PBS，然後使用 MultiWell FACScalibur (Becton Dickinson)轉移至圓底微力價平板用於流式細胞技術分析。使用FlowJo FACS分析軟體測定STAT5 +細胞的百分比。使用下列方程式計算經由融合瘤上清液之STAT5磷酸化的抑、制百分比：

100-({[A 之 STAT5+% B 之 STAT5+%]/[C 之 STAT5+% - B 之 STAT5+%]}*100) 其中 A =細胞+融合瘤上清液+rhGM-CSF，B =只有細胞，C = 細胞 +rhGM-CSF 在GM-CSF-誘發TF-1細胞pSTAT5分析中，大腸桿菌 (E. co/〇衍生之 rhGM-CSF-R23L 展現 EC 90 (0.3 84 ng/mL)可媲美於酵母菌衍生之 rhGM-CSF-R23L(Leukine®)(0.130 ng/mL)及大腸桿菌衍生之rhGM-CSF(0.298 ng/mL)。如第16 -146- 200918553 圖所示，抗-GM-CSF mAb中和大腸桿菌衍生之rhGM-CSF，但不中和酵母菌衍生之（Leukine®)或未醣化大腸桿菌衍生之rhGM-CSF-R23L。此使人聯想到該差別的基礎是由於相較於天然 GM-CSF，酵母菌衍生之 rhGM-CSF-R23L(Leukine®) 及大腸桿菌rhGM-CSF-R23L之一級序列中同一單一胺基酸差異（在位置23的白胺酸爲精胺酸），而非因爲酵母菌表現之糖化作用差異。實施例8:經由結合競爭之上述六個杭-GM-CSF單株杭體的抗原決定某結合使用結合競爭分析進行抗原決定基結合，其中一經標記 mAb與過量其他未標記mAb競爭結合至rhGM-CSF-Ile。與另一競爭之抗體被分配於同一群中。上述六個抗-GM-CSF mAb有五個彼此競爭結合至rhGM-CSF，而有一個未如此。【圖式簡單說明】第la-d圖：A)在活動性EAE中預防性投與抗-老鼠 GM-CSF Mab會延遲疾病開始及降低發生率。爲誘發活動性 SJL/PLP139-i5iEAE，對 11 小鼠皮下給予 250 /z g PLP139-151 + C F A並進彳7 3週評估。在免疫當日對每組1 1隻小鼠給予5 0 0 V g抗-老鼠GM-CSF mAb、同型物對照組mAb或PBS。取每日重量及計分。臨床計分0:沒有疾病；1:無力的尾巴； 2 :扶直反射的輕微損害或步伐異常；3 :嚴重後肢虛弱，部分後肢麻痺；4 :全部的後肢麻痺，使用前肢移動。相較於對照組，抗-GM-CSF mAb顯示開始延遲，以及以45%的發生率相較於對照組的9 1 -1 〇 0 %。 -147- 200918553 B及C)預防性投與抗-GM-CSF mAb防止體重損失（B) 及降低平均臨床計分（C)。 D)500 gg的單劑抗-mGM-CSF mAb、同型物對照組 m A b或P B S在疾病開始日的結果，η = 1 4小鼠。在活動性E A E 治療性投與抗-GM-CSF mAb可降低平均臨床計分。P<0.05 對同型物對照組或PBS。第2a-c圖：A)在活動性EAE治療性投與抗-mGM-CSF mAb加速復元。復元=減少2 1全部計分2 2d連續地計分s 1。 B)相較於處以抗-mGM-CSF mAb、同型物對照組mAb 或PBS對照組之小鼠，在疾病開始日（免疫後第13天）的治療性抗-mGM-CSF mAb處理可降低CNS發炎。 C及D)在授受性轉移EAE，預防性或治療性投與抗 -mGM-CSF mAb可改善疾病。在授受性轉移EAE模式中，對15隻小鼠給予100 // g PLP139.151 + CFA，以及在活體外以 PLP胜肽刺激4天之免疫後第10天收取淋巴結，然後注射到小鼠接受者。對小鼠進行3週的體重評估及臨床計分。第 C圖顯示細胞轉移日之處理，第D圖顯示EAE開始之日的處理。第3圖：代表性TF-1 Stat5磷酸化分析顯示抗- GM-CSF mAb 抑制作用或〇·4 ng/ml rhGM-CSF-Ile。第4圖：長方條統計圖顯示大腸桿菌（R c〇/〇rhGM-CSF 免疫之小鼠的融合瘤上清液於TF - 1 S TAT 5磷酸化分析中 rhGM-CSF-Ile之抑制作用分佈。第5圖：代表性AML-5增殖分析顯示抗-GM-CSF mAb -148- 200918553 抑制 0.15 ng/ml rhGM-CSF-Ile。第6a-f圖：純化自融合瘤上清液之mAb於AML-5增殖分析中抑制GM-CSF及CSF-1。第7a-b圖：純化自融合瘤上清液之mAb於TF-1 Stat5 磷酸化分析中抑制GM-CSF及IL_3。第 8a-b圖：以ELISA測量融合瘤上清液抗-GM-CSF mAb或重組抗-GM-CSF mAb結合至各種物種之GM-CSF的結果。第9圖：於AML-5增殖分析中重組mAb (第二TT及第二SCL)抑制人類及長尾獼猴GM-CSF。第10圖：於TF-1 Stat-5磷酸化·分析中重組mAb(第二 TT及第二SCL)抑制人類及長尾獼猴GM-CSF。第11圖：於TF-1 Stat5磷酸化分析中重組mAb(第一 TT)抑制天然人類及長尾獼猴肺衍生之GM-CSF。第12圖：於TF-1 Stat5磷酸化分析中重組mAb(第二 SCL)IgGB抑制天然長尾獼猴PBMC衍生之GM-CSF。第13圖：在人類單核球分析中重組mAb (第二TT)抑制人類 GM-CSF。第14圖：重組mAb(第二SCL)IgG B抑制GM-CSF-誘發製造MIP-lb及ENA78於整體血液。第15a-b圖：在AML-5增殖分析（a)或單核球分析（b) 中，純化自融合瘤上清液之mAb不會抑制酵母菌衍生之 rhGM-CSF(Leukine®)。第16圖：mAb中和大腸桿菌衍生rhGM-CSF，但不中 -149- 200918553 和酵母菌衍生之rhGM-CSF(Leukine®)或未醣化大腸桿菌衍生之 rhGM-CSF-R23L。【主要元件符號說明】 Μ 。 -150-

Claims

200918553 十、申請專利範圍： 1 . 一種結合G Μ - C S F之經單離之抗原結合蛋白質’含有： Α) —個或一個以上選自由以下所組群組之重鏈互補決定區域（CDRH): (i) 選自由 SEQ ID NO:10、22、70、94 及 142 所組群組之CDRH1; (ii) 選自由 SEQIDNO:ll、23、28、35、47、59、71、 9 5、1 0 6、1 1 9 及 1 4 3 所組群組之 C D RH 2 ; (iii) 選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、 96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3;以及 (iv) —（i)、（ii)及（iii)之CDRH，含有不超過4個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入； B)—個或一個以上選自由以下所組群組之輕鏈互補決定區域（CDRL): (i) 選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 1 〇〇、1 0 7、1 1 2、1 1 8、1 2 4、1 2 5 及 1 3 6 所組群組之 CDRL1; (ii) 選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77、 101、113' 130、131 及 137 所組群組之 CDRL2; (iii) 選自由 SEQ ID NO:6 ' 18 ' 42、46、66、78、84、 89、90、1〇2、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3 : 以及 (iv) —（i)、（ii)及（iii)之CDRL，含有不超過4個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；或 200918553 c)一個或一個以上A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上B) 之輕鏈CDRL。 2.如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其含有至少一A)之CDRH以及至少一 B)之CDRL。 3 .如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其含有至少兩個A)之CDRH以及至少兩個B)之CDRL。 4 .如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其含有該 CDRH卜 CDRH2、CDRH3、CDRL卜 CDRL2及 CDRL3。 5.如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該A)之CDRH是選自由下所組群組： (i) 選自由 SEQ ID NO:10、22、70、94 及 142 所組群組之CDRH1; (ii) 選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、 95、106、119 及 143 所組群組之 CDRH2; (iii) 自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、 9 6、108、120、1 3 2 及 1 4 4 所組群組之 C D RH 3 ;以及 (iv) —（i)、（ii)及（iii)之CDRH，含有不超過2個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；該B)之CDRL是選自由下所組群組： (i) 選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 100、107' 112、118、124、125 及 136 所組群組之 CDRL1; (ii) 選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77、 1 0 1、1 1 3、1 30、1 3 1 及 1 37 所組群組之 CDRL2 ; 200918553 (iii) 選自由 SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、84、 89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3 ; 以及 (iv) —（i)、（Π)及（iii)之CDRL ’含有不超過2個胺基酸之一個或一個以上胺基酸取代、刪除或插入；或 C)一個或一個以上的A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的B)之輕鏈CDRL。 6.如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，含有 A) 選自由下所組群組之CDRH : (i) 選自由 SEQ ID NO:10、22、70、94 及 142 所組群組之 CDRH1: · (ii) 選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、 95、 106、119 及 143 所組群組之 CDRH2; (iii) 選自由 SEQ IDNO:12、24、36、48、60、72、83、 96、 108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3; B) 選自由下所組群組之CDRL : (i) 選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 1 0 0、1 0 7、1 1 2、1 1 8、1 24、1 2 5 及 1 3 6 所組群組之 CDRL1; (ii) 選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77、 101、1 13、130、131 及 137 所組群組之 CD RL2 ; (iii) 選自由 SEQ ID NO:6、18、42、46、66、78、84、 89、90、102、1 14、126 及 138 所組群組之 CDRL3 ; 200918553 C)—個或一個以上的A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的B)之輕鏈CDRL。 7.如申請專利範圍第6項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質含有： A) SEQ ID NO: 1 0 > 22 ' 70 及 142 之 CDRH1，SEQ ID ΝΟ:11、23、35、47、59、71、95 及 143 之 CDRH2, 以及 SEQ IDNO:12、24、36、48、60、72、96、108、 120 ' 132 及 144 之 CDRH3;以及 B) SEQ ID NO:4、16、40、52、64、88、100、112、124 及 136 之 CDRL1，SEQ ID NO:5、17、29、41、65、77' 89、101、113 及 137 之 CDRL2，以及 SEQ ID N0:6、 18、42、66、78、126 及 138 之 CDRL3。 8 .如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質含有重鏈可變區域（VH)具有至少80%序列相同於選自由 SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、 9 3、1 0 5、1 1 7、1 2 9及1 4 1所組群組之胺基酸序列，及/或可變輕鏈輕鏈可變區域（VL)具有至少80%序列相同於選自由 SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、 1 23及1 3 5所組群組之胺基酸序列。 9.如申請專利範圍第8項之經單離之抗原結合蛋白質，其中 VH具有至少90%序列相同於選自由SEQ ID N〇:9、21、 33、45、57、69、81、93、105、117、129 及 141 所組群組之胺基酸序列，及/或VL具有至少90%序列相同於選自由 SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、 200918553 1 2 3及1 3 5所組群組之胺基酸序列。 1 〇·如申請專利範圍第8項之經單離之抗原結合蛋白質，其中 VH 是選自由 SEQ IDNO:9、21、33、45、57、69、81' 93、 105、117、129及141所組群組，及/或VL是選自由SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123 及 135 所組群組。 1 1 .一種結合GM-CSF之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質含有： A) —個或一個以上選自由下所組群組之重鏈CDRs(CDRH): (i) 選自由 SEQ ID NO: 10 ' 22、70、94 及 142 所組群組之CDRH1; (ii) 選自由 SEQ IDNO:ll、23、28、35、47、59、71、 95、 1 06、1 1 9 及 143 所組群組之 CDRH2 ; (iii) 選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、 96、 108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3; B) —個或一個以上選自由下所組群組之輕鏈CDRs(CDRL): (i) 選自由 SEQ ID NO:4、16 ' 30、40、52、64、88、 100、 107、 112、 118、 124、 125 及 136 所組群組之 CDRL1; (ii) 選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77、 101、 113、130、131 及 137 所組群組之 CDRL2; (iii) 選自由 SEQ ID NO:6、1 8、42、46、66、78、84、 89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3 ; 200918553 c)—個或一個以上的A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的B)之輕鏈CDRL。 1 2 □申請專利範圍第1 1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質含有： A) —個或一個以上選自由下所組群組之CDRH : (i) 選自由 SEQ ID NO:1〇、22、70' 94 及 142 所組群組之CDRH1; (ii) 選自由 SEQ ID ΝΟ:11、23、28、35、47、59、71、 9 5、1 0 6、1 1 9 及 1 4 3 所組群組之 C D RH 2 ; (iii) 選自由 SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、83、 96、108、120、132 及 144 所組群組之 CDRH3; B) —個或一個以上選自由下所組群組之CDRL : (i) 選自由 SEQ ID NO:4、16、30、40、52、64、88、 100、107、112、118' 124、125 及 136 所組群組之 CDRL1; (ii) 選自由 SEQ ID NO:5、17、29、34、41、65、77 ' 1 0 1、1 1 3、1 3 Ο、1 3 1 及 1 3 7 所組群組之 C D RL 2 ; (iii) 選自由 SEQ ID N0:6、18、42、46、66、78、84、 89、90、102、114、126 及 138 所組群組之 CDRL3; 或 C) 一個或一個以上的A)之重鏈CDRH以及一個或一個以上的B)之輕鏈CDRL。 1 3 ·$[]申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是單株抗體，多株抗體，重組抗體，人 200918553 類抗體，人類化抗體，嵌合型抗體，多專一性抗體或其抗體片段。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗體片段是Fab片段，Fab’片段，F(ab')2片段，Fv片段，雙鏈抗體（diabody)或單鏈抗體分子。 1 5 .如申請專利範圍第1 3項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是人類抗體。 16_如申請專利範圍第13項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是單株抗體。 17.如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是IgGl-、IgG2·-、IgG3-或IgG4-型。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是IgGl-或IgG2-型。 1 9 .如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質是偶合至標記基。 20. 如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質抑制GM-CSF結合至人類GM-CSF的細胞外部分。 21. —種核酸分子，其係編碼如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白質。 22. 如申請專利範圍第21項之核酸分子，其中該核酸分子是可操作地連接（operably linked)到一調節序列。 23 .—種載體，含有如申請專利範圍第2 1項之核酸分子。 24·—種載體，含有如申請專利範圍第22項之核酸分子。 200918553 2 5.—種宿主細胞，含有如申請專利範圍第22項之核酸分子。 2 6·—種宿主細胞，含有如申請專利範圍第24項之載體。 27.—種製備如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白質之方法，其包括從分泌該抗原結合蛋白質之宿主細胞製備該抗原結合蛋白質之步驟。 2 8 · —種醫藥組成物，含有至少一如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白質以及醫藥可接受賦形劑。 29_如申請專利範圍第28項之醫藥組成物，進一步含有額外活性劑。 3 〇 .$卩申請專利範圍第2 9項之醫藥組成物，其中該額外活性劑是選自由放射性同位素、放射性核種、毒素或治療性及化學治療性基團所組群組。 3 1 · —種如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質之用途，其係用於製造在病人中治療或預防與GM-CSF有關症狀之藥劑。 32·如申請專利範圍第31項之用途，其中該症狀是選自由風濕病疾病、自體免疫疾病、血液疾病、腫瘤疾病、發炎疾病、神經系統之退化症狀、胃腸道、胃尿道症狀及內分泌失調所組群組。 33. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該症狀是選自由多發性硬化症、類風濕性關節炎、氣喘、牛皮癣、異位性皮膚炎及類肉瘤病（sarcoidosis)所組群組。 34. 如申請專利範圍第3 1項之用途，其中該經單離之抗原結合蛋白質是單獨投與或作爲組合治療。 200918553 3 5.—種如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質之用途，其係用於製造在病人中抑制 GM-CSF結合至 GM-CSFR之細胞外部分之藥劑。 3 6.—種如申請專利範圍第1項之經單離之抗原結合蛋白質之用途，其係用於製造在病人中抑制GM-CSF活性之藥劑。 37.如申請專利範圍第36項之用途，其中該GM-CSF活性是選自由骨髓系統細胞之分化、存活、增殖及活化所組群組。