Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20100059985A - 인간 ｇｍ－ｃｓｆ 항원 결합 단백질 - Google Patents

인간 ｇｍ－ｃｓｆ 항원 결합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20100059985A
KR20100059985A KR1020107008307A KR20107008307A KR20100059985A KR 20100059985 A KR20100059985 A KR 20100059985A KR 1020107008307 A KR1020107008307 A KR 1020107008307A KR 20107008307 A KR20107008307 A KR 20107008307A KR 20100059985 A KR20100059985 A KR 20100059985A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
csf
antigen binding
seq
binding protein
Prior art date
Application number
KR1020107008307A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101274356B1 (ko
Inventor
재클린 에이 키르히너
케네쓰 에이 브라셀
카라 올손
조세 카를로스 에스코바
다우핀 바론
Original Assignee
암젠 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 암젠 인크 filed Critical 암젠 인크
Publication of KR20100059985A publication Critical patent/KR20100059985A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101274356B1 publication Critical patent/KR101274356B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

인간 GM-CSF 단백질에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 벡터, 및 이를 함유하는 세포를 또한 제공한다. 항원 결합 단백질은 GM-CSFR에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하고, 골수 계열 세포주의 GM-CSF-유도된 증식 및 신호전달을 억제하고, 인간 단핵구의 GM-CSF-유도된 활성화를 억제할 수 있다.

Description

인간 ＧＭ－ＣＳＦ 항원 결합 단백질{HUMAN GM-CSF ANTIGEN BINDING PROTEINS}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본원은 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨, 2008년 8월 8일 출원된 미국 특허 가출원 61/087,551과 2007년 9월 18일 출원된 미국 특허 가출원 60/994,343을 기초로 한 우선권을 주장한다.
과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF; CSF2)는 그의 조혈 특성 (즉, 골수 계열의 전구 세포의 증식과 분화 및 성숙 세포 증식의 자극)에 대해 오래전에 알려진 잘 연구되어 있는 단백질이다 (문헌 ([Blood 77:1131, 1991]; [Rev Infect Dis 12:41, 1990]; [Med. Oncol. 13:141, 1996])에서 검토됨). GM-CSF는 폐 상피 세포 및 창자의 파네트 (Paneth) 세포에 의해 구성적으로 생산되지만 (BBRC 312:897, 2003), T 세포, 대식세포/단핵구, 섬유모세포 및 내피 세포로부터의 우세한 발현으로 활성화시에 매우 다양한 세포가 GM-CSF를 발현한다 ([J Infect Dis 172:1573, 1995]; [J Infect Dis 185:1490, 2002]; [J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003]). GM-CSF 수용체 (GM-CSFR; CSFR2)는 2개의 단백질; 즉, GM-CSF에 대해 특이적인 고 친화도 알파 폴리펩티드, 및 GM-CSF, IL-3 및 IL-5가 공유하는 저 친화도 공통 베타 폴리펩티드의 이종성 복합체로 이루어진다 (문헌 ([J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003]; [Cytokine and Growth Factor Reviews 12:19, 2001]에서 검토됨). GM-CSFR은 골수 계열의 모든 세포 상에서 발현된다.
GM-CSF는 대식세포/단핵구, 가지 세포 (DC), 호중구 및 호산구를 포함한 골수 계열 세포의 분화, 생존, 증식 및 활성화를 야기하거나 달성하는 신호를 매개함으로써 선천 면역계의 활성을 증대시킨다 (문헌 ([J Immun 143:1198, 1989]; [Rev Infect Dis 12:41, 1990]; [Blood 77:1131, 1991]; [Trends in Immun. 23:403, 2002]; [Growth Factors 22:225, 2004])에서 검토됨). GM-CSF는 단핵구-유래 DC 및 타입 (type) 1 대식세포의 시험관내 생성을 위한 중요한 인자이고 (PNAS 101:4560, 2004), 생체 내에서 DC의 분화 및 활성화를 유도하는 것으로 나타났다 (Blood 95:2337, 2000). GM-CSF의 존재 하에 생성된 인간 단핵구-유래 대식세포 (타입 1 대식세포)는 높은 수준의 전염증성 시토킨, 예를 들어 IL-23을 생산하지만, IL-12를 생산하지 않는 반면, M-CSF (CSF1)의 존재 하에 생성된 타입 2 대식세포는 항-염증성 시토킨, 예를 들어 IL-10을 생산하지만, IL-23을 생산하지 않는다 (PNAS 101: 4560, 2004).
GM-CSF로 자극시킨 인간 단핵구 또는 대식세포는 세포독성, 다른 전염증성 시토킨 (IL-1β, TNFα 및 IL-6)의 생산 및 식세포작용을 포함한 기능이 증가하였다. 이들 효과에 기반하여, GM-CSF를 감염성 질병에서 또는 백신의 투여와 함께 사용하기 위한 강력한 어주번트 (adjuvant)로서 개발하기 위해 최근에 많은 노력이 경주되었다 (문헌 ([Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 13::S47, 1994]; [Curr Opin Hematol. 7:168, 2000])에서 검토됨). 실제로, 일부 임상 상황에서 rhGM-CSF의 투여는 진균 감염의 결과 및 소거를 극적으로 개선한다 ([Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13: S18, 1994]; [J Med Microbiol 47: 1998]).
미세아교세포는 CNS의 거주성 대식세포이고 시험관내 연구로부터의 데이타는 GM-CSF가 소 및 성인 미세아교세포 모두의 생존, 활성화, 증식 및 심지어 분화를 향상시키는 핵심 시토킨임을 나타낸다 ([Glia 12:309, 1994]; [J Immunol Methods 300:32, 2005]). 또한, 마우스 MS 모델 연구로부터의 몇몇 보고에서는 질병 개시 및 존속을 위해 CNS의 혈관주위 공간에서 APC (미세아교세포 또는 DC)의 중요한 역할에 대한 증거를 제공한다 ([Nat. Med. 11:146, 2005]; [Nat. Med. 11:328, 2005]; [Nat. Med. 11:335, 2005]). 미세아교세포의 GM-CSF 자극은 MHCII를 상향조절하고 항원 제시를 향상시킨다.
최근에야 질병에서 전염증성 시토킨으로서 GM-CSF의 역할 및 조혈 성장 인자로서의 무용성 (문헌 ([Trends in Immun. 23:403, 2002]; [Growth Factors 22:225, 2004])에서 검토됨), 및 염증성/자가면역 질병을 야기하거나 증진시키는데 있어서 그의 역할이 확립되었다.
다발 경화증 (MS), 류마티스 관절염 (RA), 천식, 건선, 아토피 피부염 및 사르코이드증 (sarcoidosis)에서 염증의 국소 부위에서 상승된 수준의 GM-CSF가 관찰되었다. GM-CSF의 상승은 혈청에서 일반적으로 관찰되지 않고, 따라서 질병 연관성을 결정하는데 표적 조직의 분석이 필요하다. MS에서, 2개의 임상 연구를 수행하였고, 여기서 GM-CSF 단백질의 수준을 활동형 질병 (조직 수집의 2주 내에 새로운 증상, 또는 기존 증상의 악화)의 재발 완화형 (Relapsing-Remitting; RR) MS 환자로부터의 뇌척수액 (CSF) 및 혈청에서 ELISA에 의해 측정하고, 안정형 질병 (이전의 6개월 동안 에피소드가 없음)의 RRMS 환자 또는 기타 신경계 질병 (OND) 대조군과 비교하였다 ([Eur Neurol 33:152, 1993]; [Immunopharmacol. Immunotoxicol. 20:373, 1998]). 중요하게는, OND 대조군은 알츠하이머 (Alzheimer) 병 또는 혈관성 치매 환자를 포함하지 않았고, 이는 고도로 증가한 수준의 GM-CSF가 그러한 환자의 CSF 및 혈청에서 보고되었기 때문이다 (Acta Neurol Scand 103:166, 2001).
GM-CSF 수준은 낮은 pg 범위이지만, 안정형 질병 CSF에 비해 RRMS 활동형 질병 CSF에서, 및 OND CSF에 비해 MS 활동형 질병 CSF에서 유의하게 더 높았다. 또한, 활동형 대 안정형 질병의 CSF 내에 보다 높은 수준의 TNF-알파, 및 안정형 대 활동형 질병의 CSF 내에 보다 높은 수준의 TGF-베타 및 IL-10가 모두 존재하였다. 연구에서는 환자의 진행 중의 치료 및 활동형 대 안정형 질병의 임상 정의뿐만 아니라 샘플 수집의 동시성에 관하여 매우 조심스러운 포함 기준을 포함하였다. 흥미롭게도, 임의의 군들 사이에서 혈청 내의 GM-CSF 수준의 유의한 차이가 없었다. 또한, 한 연구에서는 MS 병변의 별아교세포에서 GM-CSF의 선택적 면역조직화학적 검출을 관찰하였고, 대조군 CNS 백색질에서는 관찰되지 않았다 (n=3 MS 공여자, [Glia 12:309, 1994]). 마지막으로, 활성화된 T 세포 및 단핵구/대식세포는 염증 반응 동안 활성화시에 다량의 GM-CSF를 생산할 수 있다. MS 병변 내에 이들 두 종류 세포 모두의 존재 (Ann Neurol. 47:707, 2000), 및 CSF 내에 T 세포 (Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 1: 257, 2001에서 검토됨)의 존재에 대한 충분한 증거가 존재한다.
GM-CSF 발현과 MS의 연관성에 추가로, 다른 염증성/자가면역 질병에 대한 풍부한 질병 연관 데이타가 존재하고, 심지어 외인성 GM-CSF의 투여시에 질병 악화에 대한 일부 증거가 존재한다. RA에서, OA (생물분석, [Clin. Exp. Immunol. 72:67, 1988])에 비해 및 비-RA 대조군 (생물분석, [Rheumatol Int. 14:177, 1995])에 비해 RA 또는 건선성 관절염 (PsA)의 환자의 활막액 (SF)에서 상승된 수준의 GM-CSF가 검출되었다. 또한, 관절 내의 CD68+ 대식세포의 존재와 RA 환자의 질병 심도 사이에 강한 상관관계가 존재한다 (Ann Rheum Dis 64:834, 2005). 마지막으로, 펠티 (Felty) 증후군 (호중구감소증)이 있는 RA 환자의 GM-CSF 처치는 질병을 악화시킬 수 있다고 보고되었다 (Blood 74:2769, 1989).
천식에서, GM-CSF는 면역조직화학에 의해 천식 환자의 기관지 생검에서 상승하는 것으로 밝혀졌고, 스테로이드 치료 후 GM-CSF 수준의 감소와 FEV1의 증가 사이의 상관관계가 관찰되었다 ([Chest 105:687, 1994]; [Am Rev Respir Dis 147:1557, 1993]). 또한, GM-CSF는 간헐성 경증 천식 환자의 가래에서 상승되는 것으로 보고되었다 (Ann Allergy Asthma Immunol 86:304, 2001). GM-CSF의 길항작용을 지지하는 데이타는 증상이 있는 환자의 BALF로부터 호산구 촉진 활성이 항-GM-CSF mAb에 의해 약화된 연구를 포함한다 (시험관내, [Eur. Respir. J. 12:872, 1998]).
건선에서, GM-CSF 발현이 건선성 피부에서 검출되었지만 대조 피부 샘플에서는 검출되지 않았다 ([Arch Dermatol Res. 287:158, 1995]; [Clin Exp Dermatol. 19:383, 1994]; [Dermatologica. 181:16, 1990]). 건선의 GM-CSF 처치가 질병을 악화시킬 수 있음이 또한 보고되었다 (Br J Dermatol.128:468, 1993).
아토피 피부염 (AD)에서, 급성 AD 또는 비병변 피부에서보다 만성 AD의 병변의 생검에서 계내 (in situ) 혼성화에 의해 유의하게 보다 다수의 GM-CSF mRNA 발현 세포가 검출되었다 (p<0.05; [J Clin Invest. 95:211, 1995]). 두 번째 연구에서, 병변성 AD 피부 (표피 및 진피 구획 모두)에서 면역조직화학에 의해 보다 높은 수준의 GM-CSF가 검출되었고, AD 환자의 비관련 피부로부터 확립된 각질세포 배양액은 비-아토피 대조군으로부터의 각질세포에 비해 GM-CSF의 증가한 자발적 및 PMA-자극된 생산을 보였다 (J Clin Invest. 99:3009, 1997).
GM-CSF ([Science 264:713, 1994]; [PNAS 91:5592, 1994]) 및 GM-CSFRc ([Immunity 2:211, 1995]; [PNAS 92:9565, 1995])가 결핍되는 마우스를 다수의 군에 의해 생성하였다. 마우스는 정상상태 수준의 조혈에서 명백한 차이가 없지만, 폐포 단백증의 조직학적 증거를 갖지 않고, 감염에 보다 취약하고, IgG 생산에서 적당한 지연을 나타내고, KLH 면역화 후에 항원-특이적 T 세포 반응이 감소하였다 (PNAS 94:12557, 1997). GM-CSF-/- 마우스는 MOG35-55-유도된 EAE (J Exp Med. 194:873, 2001), 콜라겐-유도된 관절염 (CIA; [JI 161:3639, 1998]) 및 mBSA/IL-1-유도된 관절염 (Arthritis Rheum 44:111, 2001)에 내성이다. 이와 대조적으로, GM-CSF 트랜스제닉 (Tg) 마우스가 많은 실험실에서 생산되었고, 염증성/자가면역 질병의 발병과 연관되었다 ([Cell 51:675, 1987]; [JI 166:2090, 2001]; [J Clin Invest 97:1102, 1996]; [J Allergy Clin Immunol 111:1076, 2003]; [Lab Invest 77:615, 1997]).
따라서, 당업계에는 GM-CSF 억제제가 필요하다.
GM-CSF, 특히 인간 GM-CSF에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 인간 GM-CSF 결합 단백질은 적어도 하나의 GM-CSF에 관련된 생물학적 반응을 억제하거나 저해하거나 조정할 수 있고, 따라서, GM-CSF-관련 질병 또는 질환의 효과를 개선하기 위해 유용하다. 그러므로, GM-CSF에 대한 특정 항원 결합 단백질의 결합은 GM-CSF 신호전달을 억제하거나 저해하거나 차단하고, 종양 내로의 단핵구 이동을 감소시키고, 종양-연관 대식세포 (TAM)의 축적을 감소시킬 수 있다.
GM-CSF 항원 결합 단백질의 생산을 위한, 세포주를 포함하는 발현 시스템, 및 인간 GM-CSF에 관련된 질병을 진단 및 치료하는 방법을 또한 제공한다.
제공되는 일부의 단리된 항원 결합 단백질은 (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및 (iv) 4개 이하의 아미노산 중의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및 (iv) 4개 이하의 아미노산 중의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL); 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다.
한 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 적어도 1 또는 2개의 상기 언급된 (A)의 CDRH 및 적어도 1 또는 2개의 상기 언급된 (B)의 CDRL을 포함할 수 있다. 또다른 측면에서, 단리된 항원 결합 단백질은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다.
또한, 상기 언급된 (A)의 CDRH는 (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산 중의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중에서 추가로 선택되고; 상기 언급된 (B)의 CDRH는 (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산 중의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL로 이루어지는 군 중에서 선택되거나; 또는 항원 결합 단백질은 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH; (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL; 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 (A) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; 및 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및 (B) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; 및 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 가변 중쇄 (VH)는 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖고/갖거나, 가변 경쇄 (VL)은 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시태양에서, VH는 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되고/되거나 VL은 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 측면에서, GM-CSF 서열을 함유하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하고, 여기서 GM-CSF에 결합하는 항체는 GM-CSFR을 함유하는 세포에서 GM-CSF 매개된 신호전달의 활성화를 길항한다.
또다른 측면에서, (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1과 적어도 80％ 동일성을 갖는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2와 적어도 80％ 동일성을 갖는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3과 적어도 80％ 동일성을 갖는 CDRH3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR (CDRH); (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1과 80％ 동일한 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2와 80％ 동일한 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3과 80％ 동일한 CDRL3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR (CDRL); 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 한 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1과 적어도 90％ 동일성을 갖는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2와 적어도 90％ 동일성을 갖는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3과 적어도 90％ 동일성을 갖는 CDRH3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 CDRH; (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1과 적어도 90％ 동일한 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2와 적어도 90％ 동일한 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3과 적어도 90％ 동일한 CDRL3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 CDRL; 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다.
추가 측면에서, A) (i) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH3과 상이한 CDRH3; (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9 (서열 83) (여기서, X1은 E 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 P, D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y, W, R 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, W, F 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 Y 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 Y, 아미노산 부재 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 M, T 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); 및/또는 B) (i) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL3과 상이한 CDRL3; 및 iii) X1QX2X3X4X5X6X7T (서열 84) (여기서, X1은 Q 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, G 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R, T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 F 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 R 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 및 X1X2X3X4DSSNX5X6X7 (서열 89) (여기서, X1은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 W 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 D 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G, W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 V, L 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 V 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH1과 상이한 CDRH1; (iii) X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9 (서열 94) (여기서, X1은 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, S 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 I 및 M으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 H 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1 아미노산 서열, 또는 (iv) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (v) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (iv)의 CDRH2와 상이한 CDRH2; 또는 (vi) X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14X15G (서열 106) (여기서, X1은 W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 I 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 N, S 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 P, A 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 N 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 G 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 T 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 N 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X15는 Q, K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 CDRH2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH; 또는 B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL1과 상이한 CDRL1; (iii) KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5 (서열 107) (여기서, X1은 V 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 E 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨); RASX1X2X3X4X5X6YX7X8 (서열 118) (여기서, X1은 Q 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 V, L 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, I, T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 또는 X1X2X3X4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12 (서열 125) (여기서, X1은 I, S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 R 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, H 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 I 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 아미노산 부재 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q, N 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1 아미노산 서열; 또는 (iv) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (v) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (iv)의 CDRL2와 상이한 CDRL2; 또는 (vi) X1X2X3X4X5X6X7 (서열 130) (여기서, X1은 G, T 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 R 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 A, E 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 또는 X1X2X3X4RPS (서열 131) (여기서, X1은 E 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 D, V 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Q, G 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL을 더 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 (chimera) 항체, 다중특이적 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다. 다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디 (diabody), 또는 단일쇄 항체 분자일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 인간 항체이고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
또다른 측면에서, 단리된 항원 결합 단백질은 표지기에 커플링될 수 있고, 인간 GM-CSF의 세포외 부분에 결합하기 위해 제공되는 단리된 항원 결합 단백질 중 하나의 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다.
또다른 측면에서, 단리된 항원 결합 단백질은 인간 GM-CSF의 수용체 상호작용 부분에 결합하기 위해 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질과 경쟁한다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이들의 항체 단편이다. 관련 실시태양에서, 인간 및 모노클로날 항체 및 항원 단편, 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일쇄 항체 분자를 제공한다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 IgG1형, IgG2형, IgG3형 또는 IgG4형의 것이다. 표지기에 커플링된 단리된 항원 결합 단백질을 추가로 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명에서는 대식세포/단핵구, 가지 세포 (DC), 호중구 및 호산구를 포함한 골수 계열 세포의 분화, 생존, 증식 및 활성화, 및/또는 DC의 분화 및/또는 활성화를 야기하거나 달성하는 신호를 제한하기 위해 GM-CSF 활성을 억제하는 것을 추가로 고려한다. 또한, 본 발명에서는 단핵구-유래 대식세포 (타입 1 대식세포)가 높은 수준의 전염증성 시토킨, 예를 들어 IL-23을 생산하는 것을 제한하기 위해 GM-CSF 활성을 억제하는 것을 고려한다.
추가 측면에서, GM-CSF에 결합하는 항원 결합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 또한 제공하고, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
다른 측면에서, GM-CSF에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질을 코딩하는 상기 언급된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 그러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 또한 제공한다.
다른 측면에서, 항원 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 항원 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 또한 제공한다.
또다른 측면에서, 적어도 하나의 제공되는 상기 언급된 항원 결합 단백질, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 제약 조성물은 방사선 동위원소, 방사선 핵종, 독소, 또는 치료기 및 화학치료기로 이루어지는 군 중에서 선택되는 추가의 활성 물질을 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 환자에게 유효량의 적어도 하나의 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 GM-CSF와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 병태는 류마티스 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 질환, 종양학적 질환, 염증성 질환, 신경계의 퇴행성 병태, 위장관, 위비뇨기 질환, 내분비 질환 등으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 병태는 다발 경화증 (MS), 류마티스 관절염 (RA), 천식, 건선, 아토피 피부염 및 사르코이드증으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질환 또는 질병이다. 다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질을 단독으로 또는 조합 요법으로서 사용하는 치료를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 병태는 유방암, 전립선암, 결직장암, 자궁내막 선암종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 위암, 별세포암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 난소암 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 제공되는 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 GM-CSFR의 세포외 부분에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 설명되는 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 인간 GM-CSFR의 인산화를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 단리된 항원 결합 단백질은 환자에게 투여될 때 단핵구 화학주성을 감소시킨다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 단핵구 이동을 억제한다. 또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질이 환자에게 투여될 때 종양 내로 단핵구 이동이 억제된다.
또 다른 측면에서는 본원에서 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 다발 경화증의 치료 방법을 또한 제공한다.
다발 경화증인 병태가 재발-완화성 다발 경화증, 진행-재발 다발 경화증, 원발성 진행 다발 경화증 또는 속발성 진행 다발 경화증인 것을 또한 고려한다.
한 측면에서, 본원에서 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 류마티스 관절염의 치료 방법을 또한 제공한다.
추가의 측면에서, 인간 GM-CSF의 1 로그 내에서 사이노몰거스 GM-CSF와 교차-반응성이고 GM-CSF 의존 분석으로 측정할 때 <1 nM의 IC50으로 GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
이들 및 다른 측면을 본원에서 보다 상세히 설명할 것이다. 제공되는 각각의 측면은 본원에서 제공되는 다양한 실시태양을 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 비롯한 각각의 실시태양이 설명되는 각각의 측면에 포함될 수 있음이 예상된다. 개시물의 다른 특색, 목적, 및 잇점은 다음의 상세한 설명에서 자명하다.
도 1 a-d: A) 활동형 EAE에서 항-뮤린 GM-CSF MAb의 예방적 투여는 질병의 발병을 지연시키고 발생률을 감소시켰다. 활동형 SJL/PLP139 -151 EAE를 유도하기 위해, 11마리의 마우스에게 250 ㎍ PLP139 -151 + CFA를 피하 제공하고 3주 평가하였다. 군 당 11마리의 마우스에게 500 ㎍ 항-뮤린 GM-CSF mAb, 이소형 대조 mAb 또는 PBS를 면역화시킨 날에 제공하였다. 매일 체중 및 점수를 매겼다. 임상 점수 0: 질병 없음; 1: 기운없는 꼬리; 2: 정향 (righting) 반사의 근소한 손상 또는 비정상적 보행; 3: 심한 뒷다리 쇠약, 부분적인 뒷다리 마비; 4: 완전 뒷다리 마비, 앞다리로 이동가능. 항-GM-CSF mAb는 대조군에 비해 발병의 지연을 보이고, 여기서 발생률은 대조군에서의 91-100％에 비해 45％이다.
B) 및 C) 항-GM-CSF mAb의 예방적 투여는 체중 손실을 방지하고 (B), 평균 임상 스코어를 감소시켰다 (C).
D) 질병 발병일에 단일 용량의 500 ㎍ 항-mGM-CSF mAb, 이소형 대조 mAb 또는 PBS로부터의 결과 (n=14 마우스). 활동형 EAE에서 항-GM-CSF mAb의 치료적 투여는 평균 임상 스코어를 감소시켰다. P<0.05 대 이소형 대조군 또는 PBS.
도 2a-c: A) 활동형 EAE에서 항-mGM-CSF mAb의 치료적 투여는 회복을 가속시켰다. 회복 = ≥ 1 전체 스코어가 ≥2d 동안 연속적으로 ≤1의 스코어로 감소.
B) 질병 발병일 (면역화 13일 후)에 치료적 항-mGM-CSF mAb 치료는 항-mGM-CSF mAb, 이소형 대조 mAb, 또는 PBS 대조군으로 처리한 마우스에 비해 CNS 염증을 감소시켰다.
C) 및 D) 입양 전이 (adoptive transfer) EAE 개선 질병에서 항-mGM-CSF mAb의 예방적 또는 치료적 투여. 입양 전이 EAE 모델에서, 15마리의 마우스에게 100 ㎍ PLP139 -151 + CFA를 제공하고, 면역화 10일 후에 림프절을 수확하고, 시험관 내에서 4일 PLP 펩티드로 자극하고 수여자 마우스 내로 주사하였다. 마우스를 체중 및 임상 스코어에 대해 3주 평가하였다. 도 C는 세포 전이일의 처치를 보여주고, 도 D는 EAE 발병일의 처치를 보여준다.
도 3: 0.4 ng/ml rhGM-CSF-Ile의 항-GM-CSF mAb 억제를 보여주는 대표적인 TF-1 Stat5 인산화 분석.
도 4: 이. 콜라이 (E. coli) rhGM-CSF 면역화시킨 마우스로부터의 하이브리도마 상등액의 TF-1 STAT5 인산화 분석에서 rhGM-CSF-Ile의 억제의 분포를 보여주는 막대그래프.
도 5: 0.15 ng/ml rhGM-CSF-Ile의 항-GM-CSF mAb 억제를 보여주는 대표적인 AML-5 증식 분석.
도 6a-f: AML-5 증식 분석에서 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb에 의한 GM-CSF 및 CSF-1의 억제.
도 7a-b: TF-1 Stat5 인산화 분석에서 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb에 의한 GM-CSF 및 IL-3의 억제.
도 8a-b: 다양한 종으로부터의 GM-CSF에 대한 하이브리도마 상등액 항-GM-CSF mAb 또는 재조합 항-GM-CSF mAb의 결합을 측정하는 ELISA의 결과.
도 9: AML-5 증식 분석에서 재조합 mAb (제2 TT 및 제2 SCL)에 의한 인간 및 cyno GM-CSF의 억제.
도 10: TF-1 Stat-5 인산화 분석에서 재조합 mAb (제2 TT 및 제2 SCL)에 의한 인간 및 cyno GM-CSF의 억제.
도 11: TF-1 Stat-5 인산화 분석에서 재조합 mAb (제1 TT)에 의한 천연 인간 및 cyno 폐-유래 GM-CSF의 억제.
도 12: TF-1 Stat-5 인산화 분석에서 재조합 mAb (제2 SCL) IgG B에 의한 천연 cyno PBMC-유래 GM-CSF의 억제.
도 13: 인간 단핵구 분석에서 재조합 mAb (제2 TT)에 의한 인간 GM-CSF의 억제.
도 14: 재조합 mAb (제2 SCL) IgG B에 의한 전혈에서 MIP-1b 및 ENA78의 GM-CSF-유도된 생산의 억제.
도 15a-b: 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb는 AML-5 증식 분석 (a) 또는 단핵구 분석 (b)에서 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®)를 억제하지 않는다.
도 16: mAb는 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF를 중화시키지만, 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®) 또는 비글리코실화된 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L을 중화시키지 않았다.
본 발명은 본원에서 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않고, 따라서 변할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하는 목적을 위한 것이고, 전적으로 청구항에 의해서만 규정되는 개시내용의 범위를 제한하려고 의도되지 않는다.
본원의 방법 및 기술은 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라, 및 달리 지시하지 않으면 본 명세서 전체에서 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참조문에 설명된 바와 같이 일반적으로 수행한다 (예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 [Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조).
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산을 모두 포함하고, 정상적으로 자연에서 발견되는 서열과 회합되지 않은 게놈 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이들의 몇몇 조합을 포함한다. 명시된 서열을 구성하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 명시된 서열에 추가로, 10 이하 또는 심지어 20 이하의 다른 단백질 또는 그의 일부에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 인용된 핵산 서열의 코딩 구역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나 벡터 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 두 종류의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예를 들어 브로모유리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예를 들어 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오티드간 연결 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 100개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개 염기이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 제작에서 사용하기 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석을 위한 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원성 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.
용어 "제어 서열"은 그가 라이게이팅되는 코딩 서열의 발현 및 처리에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 그러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 좌우될 수 있다. 특정 실시태양에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 (enhancer) 서열, 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 다수의 인식 부위를 포함한 프로모터를 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 (leader) 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 또는 엔티티 (entity) (예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다. 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성체"는 숙주 세포의 형질전환에 적합한 벡터를 나타내고, 그에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 코딩 구역의 발현을 (숙주 세포와 연관하여) 지시하고/하거나 제어하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 구성체는 그에 작동가능하게 연결된 코딩 구역의 전사, 번역에 영향을 미치거나 제어하고, 인트론이 존재하는 경우에 상기 코딩 구역의 RNA 스플라이싱 (splicing)에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때 "작동가능하게 연결된"은 용어가 적용되는 성분들이 그들의 고유한 기능을 수행하도록 하는 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터 내의 제어 서열, 예를 들어, 프로모터는 제어 서열의 정상 활성이 단백질 코딩 서열의 전사를 일으켜 코딩된 단백질의 재조합 발현을 일으키도록 배열된다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될 때 "형질감염된다". 많은 형질감염 기술이 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에 개시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., 1973, Virology 52:456]; [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌]; [Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier]; [Chu et al., 1981, Gene 13:197] 참조). 그러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티 (moiety)를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질, 즉, 천연 발생 세포 및 비-재조합 세포에 의해 생산되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미하거나; 유전공학 처리된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 그에 대한 부가, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 천연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 항원 결합 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 그에 대한 부가, 및/또는 치환을 갖는 GM-CSF 항원 결합 단백질, 항체, 또는 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 천연 단백질에 비해 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 그러한 단편은 또한 천연 단백질에 비해 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단편은 길이가 약 5 내지 500개 아미노산이다. 예를 들어, 단편은 길이가 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개 아미노산일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 항체의 면역학상 기능적 단편, 예를 들어 결합 도메인을 포함한다. GM-CSF-결합 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 구역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 일부 또는 단지 2개의 CDR을 포함하는 그의 가변 구역 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "단리된 단백질"은 그의 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 저해할 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물질로부터 정제되는 단백질을 나타낸다.
폴리펩티드 (예를 들어, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 비해 아미노산 서열 내로 삽입되고/되거나 그로부터 결실되고/되거나 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드의 "유도체"는 삽입, 결실, 또는 치환 변이체와 구분되는 일부 방식으로, 예를 들어, 다른 화학적 모이어티에의 컨쥬게이션을 통해 화학적으로 변형된 폴리펩티드 (예를 들어, 항원 결합 단백질, 또는 항체)이다.
생물학적 물질, 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 연관하여 본 명세서 전체에서 사용될 때 용어 "천연 발생"은 자연에서 발견되는 물질을 나타낸다.
본원에서 사용될 때 "항원 결합 단백질"은 명시된 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미하고; 제공된 항원은 GM-CSF, 또는 인간 GM-CSF이다.
항원 결합 단백질은 해리 상수 (Kd)가 ≤10-8 M인 경우에 그의 표적 항원에 "특이적으로 결합하는" 것으로 말해진다. 항체는 Kd가 ≤5 x 10-9 M인 경우에 "고 친화도"로, 및 Kd가 ≤5 x 10-10 M인 경우에 "매우 고 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시태양에서, 항체는 Kd가 ≤10-9 M이고, 오프율 (off-rate)은 약 1 x 10-4/sec이다. 한 실시태양에서, 오프율은 <1 x 10-5이다. 다른 실시태양에서, 항체는 약 10-8 M 내지 10-10 M의 Kd로 GM-CSF, 또는 인간 GM-CSF에 결합할 것이고, 또다른 실시태양에서 항체는 Kd ≤ 2 x 10-10으로 결합할 것이다.
"항원 결합 구역"은 명시된 항원에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호작용하고 항원 결합 단백질에 항원에 대한 그의 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원 결합 단백질의 상기 일부는 "항원 결합 구역"으로서 언급된다. 항원 결합 구역은 대개 하나 이상의 "상보성 결합 구역" ("CDR")을 포함한다. 특정 항원 결합 구역은 또한 하나 이상의 "프레임워크" 구역을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화도에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 구역은 항원 결합 구역과 항원 사이의 결합을 촉진하도록 CDR의 적합한 입체형태를 유지하는 것을 도울 수 있다.
특정 측면에서, GM-CSF 단백질, 또는 인간 GM-CSF에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 문맥에서, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 즉, 본원에서 설명되는 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법 및 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 무손상 면역글로불린, 또는 그의 단편을 나타내고, 예를 들어 키메라, 인간화, 전체 인간, 및 이중특이적 항체를 포함한다. "항체" 자체는 항원 결합 단백질의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 카멜리드 내에서 자연 발생하는 항체와 같이 보다 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 전적으로 단일 공급원으로부터 유래할 수 있거나, "키메라"일 수 있고, 즉, 항체의 상이한 부분들은 아래에 더욱 설명한 바와 같이 2개의 상이한 항체로부터 유래할 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마 내에서 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수 있다. 달리 지시하지 않으면, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 추가로, 그의 유도체, 변이체, 단편, 및 돌연변이체를 포함하고, 그 예를 아래에 설명한다.
용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 결합 특이성을 부여하기 위해 충분한 서열을 갖는 그의 단편을 포함한다. 전형적인 포유동물 항체에서, 가변 구역 도메인, VL, 및 불변 구역 도메인, CL을 포함하는 전장 경쇄를 발견할 것이고, 여기서 경쇄의 가변 구역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단을 향한다. 전형적인 인간 항체 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.
용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 결합 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 구역 서열을 갖는 그의 단편을 포함한다. 포유동물 전장 중쇄 항체는 일반적으로 가변 구역 도메인, VH, 및 3개의 불변 구역 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단을 향하고, CH 도메인은 카르복실-말단을 향하고, 여기서 CH3이 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝다. 인간 중쇄는 일반적으로 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 아형 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 아형 포함), IgM 및 IgE를 포함한 이소형의 것일 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 항체 또는 면역글로불린 사슬 (중쇄 또는 경쇄)의 "기능적 단편" (또는 간단히 "단편")은 전장 사슬 내에 존재하는 적어도 일부의 아미노산이 결여되지만 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분 (상기 부분이 얻어지거나 합성되는 방식에 무관하게)을 포함하는 항원 결합 단백질이다. 그러한 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합하고, 주어진 에피토프에 대한 특이적 결합에 대해 무손상 항체를 포함한 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있는 점에서 생물학적 활성이다. 한 측면에서, 그러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 보유할 것이고, 일부 실시태양에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있거나, 무손상 항체를 포함한 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수 있다. 면역학상 기능적 면역글로불린 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단일쇄 항체를 포함하고 이로 제한되지 않고, 인간, 마우스, 래트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래할 수 있다. 본원에 개시되는 항원 결합 단백질의 기능적 부분, 예를 들어, 하나 이상의 CDR이 제2 단백질에 또는 소분자에 공유 결합되어, 이중기능적 치료 특성을 갖거나 연장된 혈청 반감기를 갖는, 신체 내의 특정 표적에 대해 지시된 치료제를 생성할 수 있음이 추가로 고려된다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 구역로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 또다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 구역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄의 일부, 및 또한 CH1 및 CH2 도메인 사이의 구역을 포함하여, 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 디술피드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 구역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 구역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 구역을 포함하지만, 불변 구역이 결여된다.
"단일쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 구역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하는 Fv 분자이고, 이것은 항원 결합 구역을 형성한다. 단일쇄 항체는 PCT 공개 WO 88/01649와 미국 특허 4,946,778 및 5,260,203에 상세하게 논의되어 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 구역 또는 경쇄의 가변 구역만을 함유하는 면역학상 기능적 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 구역은 펩티드 링커와 공유 연결되어 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 구역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
"2가 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 2가 항원 결합 단백질 및 2가 항체는 이중특이적일 수 있다 (아래 참조).
"다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
"이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 각각 하이브리드 (hybrid) 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 단백질 및 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 종이고, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
용어 "중화 항원 결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 각각 리간드에 결합하여, 그의 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 방지하고, 그의 결합 파트너에 대한 리간드 결합으로부터 생성될 생물학적 반응을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체를 나타낸다. 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편의 결합 및 특이성을 평가하는데 있어서, 항체 또는 단편은 과잉의 항체가 리간드에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％ 이상으로 감소시킬 때 (시험관 내 경쟁적 결합 분석으로 측정할 때), 그의 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 실질적으로 억제할 것이다. GM-CSF 항원 결합 단백질의 경우에, 그러한 중화 분자는 GM-CSFR에 결합하는 GM-CSF의 능력을 감소시킬 것이다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)의 상황에서 사용될 때 용어 "경쟁하는"은 시험되는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편)이 공통 항원 (예를 들어, GM-CSF 또는 그의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질 (예를 들어, 리간드 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는 분석에 의해 결정되는 항원 결합 단백질들 사이의 경쟁을 의미한다. 하나의 항원 결합 단백질이 다른 것과 경쟁하는지 결정하기 위해 많은 종류의 경쟁적 결합 분석, 예를 들어 고상의 직접 또는 간접 방사성 면역분석 (RIA), 고상의 직접 또는 간접 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (예를 들어, [Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, [Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조), 고상의 직접 표지된 분석, 고상의 직접 표지된 샌드위치 분석 (예를 들어, [Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상의 직접 표지 RIA (예를 들어, [Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, [Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)을 사용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 분석은 이들 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다.
경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정한다. 대체로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질 (경쟁 항원 결합 단백질)은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 입체 장애가 일어나도록 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가의 상세한 내용을 본원의 실시예에 제공한다. 대체로, 경쟁 항원 결합 단백질은 과량으로 존재할 때 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 또는 75％ 억제할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 97％ 이상 억제된다.
용어 "항원"은 선택적인 결합제, 예를 들어 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편 포함)이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부이고, 추가로 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 동물 내에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정자를 포함한다. 에피토프는 그 항원을 특이적으로 표적으로 하는 항원 결합 단백질이 결합하는 항원의 구역이고, 항원이 단백질인 경우에, 항원 결합 단백질에 접촉하는 특이적 아미노산을 포함한다. 가장 종종, 에피토프는 비-아미노산 번역후 변형을 포함하는 것으로 생각되는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에 다른 종류의 분자, 예를 들어 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있고, 특이적인 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "동일성"은 서열들을 정렬하고 비교함으로써 결정할 때 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 서열들 사이의 관계를 나타낸다. "동일성 비율"은 비교된 분자 내의 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 비율을 의미하고, 비교되는 분자 중 최소의 것의 크기에 기초하여 계산한다. 이들 계산을 위해, 정렬 내의 갭 (gap) (존재할 경우)은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 어드레싱 (addressing)되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위해 사용할 수 있는 방법은 문헌 ([Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press]; [Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press]; [von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press]; [Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press]; 및 [Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073])에 기재된 것을 포함한다.
동일성 비율의 계산시에, 비교되는 서열들은 서열들 사이의 최대 매치 (match)를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 비율을 결정하기 위해 사용되는 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지이고, 이는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 위스콘신 대학교 (University of Wisconsin, 미국 위스콘신주 매디슨))를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP은 서열 동일성 비율을 결정해야할 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬시키기 위해 사용된다. 서열들은 그들의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 매칭에 대해 정렬된다 (알고리즘에 의해 결정될 때 "매칭된 스팬 (span)"). 갭 개방 패널티 (3x 평균 대각 (average diagonal)으로서 계산됨, 여기서 "평균 대각"은 사용되는 비교 행렬의 대각의 평균이고; "대각"은 특정 비교 행렬에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치에 지정된 스코어 또는 수이다) 및 갭 연장 패널티 (대체로 갭 개방 패널티의 1/10배임), 및 비교 행렬, 예를 들어 PAM 250 또는 BLOSUM 62를 알고리즘과 연관하여 사용한다. 특정 실시태양에서, 표준 비교 행렬 (PAM 250 비교 행렬에 대해 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)을 또한 알고리즘에 의해 사용한다.
GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 비율을 결정하기 위한 권장 파라미터는 다음과 같다:
알고리즘: [Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];
비교 행렬: 문헌 [Henikoff et al., 1992, 상기 문헌]으로부터 BLOSUM 62;
갭 패널티: 12 (그러나, 단부 갭에 대해서는 패널티가 없음);
갭 길이 패널티: 4;
유사성의 역치: 0.
2개의 아미노산 서열들을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 2개의 서열의 단지 짧은 구역의 매칭을 생성시킬 수 있고, 상기 작은 정렬된 구역은 2개의 전장 서열들 사이에 유의한 관계가 없는 경우에라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개의 연속 아미노산에 이르는 정렬을 생성하도록 경우에 따라 조정될 수 있다.
본원에서 사용될 때 "실질적으로 순수한"은 설명된 종의 분자가 존재하는 우세한 종임을, 즉, 몰 기초로 동일한 혼합물 내에 임의의 다른 개별 종보다 더욱 풍부함을 의미한다. 특정 실시태양에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 50％ (몰 기초)를 차지하는 조성물이다. 다른 실시태양에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 99％를 차지할 것이다.
특정 실시태양에서, 본질적으로 균질한 물질은 오염 종이 통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 검출될 수 없고, 따라서, 조성물이 단일 검출가능한 거대분자 종으로 이루어지는 정도로 정제되었다
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 임의의 치료 반응을 생성하는 것으로 결정된 GM-CSF 항원 결합 단백질의 양을 나타낸다. 그러한 치료 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인된다.
"아미노산"은 당업계에서 그의 일반적인 의미를 포함한다. 20개의 천연 발생 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 관례에 따른다 (문헌 [Immunology-A Synthesis, 2nd Edition (E.S. Golub and D.R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)] 참조). 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기에서, 표준 관례 및 관습에 따라 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시-말단 방향이다.
A. 일반적인 개요
GM-CSF 단백질, 특히 인간 GM-CSF (hGM-CSF) 단백질에 결합하는 항원 결합 단백질을 본원에서 제공한다. 제공되는 항원 결합 단백질은 본원에서 설명되는 하나 이상의 상보성 결정 구역 (CDR)이 그 내부로 파묻히고/파묻히거나 연결되는 폴리펩티드이다. 일부 항원 결합 단백질에서, CDR은 "프레임워크" 구역 내로 파묻히고, 이는 CDR(들)의 적합한 항원 결합 특성이 달성되도록 CDR(들)을 배향시킨다. 일반적으로, 제공되는 항원 결합 단백질은 GM-CSFR과 GM-CSF 사이의 상호작용을 저해하거나, 차단하거나, 감소시키거나, 조정할 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질은 항체이거나 항체로부터 유래한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디 (minibody), 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 칭함), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 컨쥬게이트"로서 칭함), 및 그의 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체에 기초한 것이다. 다양한 구조는 본원에서 추가로 설명된다.
본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 GM-CSF, 특히 인간 GM-CSF의 특정 에피토프에 결합하는 것으로 입증되었다. 그 결과, 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 GM-CSF 활성을 억제할 수 있다. 특히, 이들 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질은 GM-CSFR에 결합시에 특히 GM-CSFR 신호전달의 유도, GM-CSF 유도된 세포 성장 또는 분화, 및 GM-CSF에 의해 유도되는 다른 생리학적 효과를 억제한다.
본원에서 개시되는 항원 결합 단백질은 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어 일부의 항원 결합 단백질은 특이적 결합 분석, GM-CSF, 특히 hGM-CSF 또는 그의 리간드의 친화도 정제에서, 및 GM-CSF 활성의 다른 길항제를 확인하기 위한 스크리닝 분석에서 유용하다. 일부의 항원 결합 단백질은 GM-CSF에 대한 GM-CSFR의 결합을 억제하기 위해, 또는 GM-CSF의 자동인산화를 억제하기 위해 유용하다.
항원 결합 단백질은 본원에 설명되는 바와 같이 다양한 치료 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 GM-CSF 항원 결합 단백질은 GM-CSF와 연관된 병태를 치료하기 위해, 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 환자에서 단핵구 화학주성을 감소시키거나, 종양 내로 단핵구 이동을 억제하거나, 종양 내에서 종양 연관 대식세포의 축적을 억제하기 위해 유용하다. 항원 결합 단백질에 대한 다른 용도는 예를 들어, GM-CSF-연관 질병 또는 병태의 진단, 및 GM-CSF의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 스크리닝 분석을 포함한다. 본원에서 설명되는 일부의 항원 결합 단백질은 GM-CSF 활성과 연관된 예후, 증상 및/또는 건강 이상의 치료에 유용하다. 이들은 다양한 종류의 염증성 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
B. GM - CSF 항원 결합 단백질
GM-CSF의 활성을 조절하기 위해 유용한 다양한 선택적 결합제를 제공한다. 이들 물질은 예를 들어 항원 결합 도메인을 함유하는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 면역어드헤션 (immunoadhesion), 및 항원 결합 구역을 갖는 폴리펩티드)를 포함하고, GM-CSF 폴리펩티드, 특히 인간 GM-CSF에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 물질의 일부는 GM-CSF에 대한 GM-CSFR의 결합을 억제하는데 유용하고, 따라서 GM-CSF 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 제공되는 항원 결합 단백질은 대개 본원에서 설명되는 하나 이상의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조, 및 폴리펩티드 구조 내로 삽입되고/되거나 연결되는 (b) 하나 이상의 CDR을 포함한다. 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 상기 구조는 천연 발생 항체, 또는 그의 단편 또는 변이체의 프레임워크이거나 그를 포함할 수 있거나, 자연에서 완전히 합성될 수 있다. 다양한 폴리펩티드 구조의 예를 아래에서 추가로 설명한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 칭함), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 컨쥬게이트"로서 칭함), 및 그의 일부 또는 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체이거나 항체로부터 유래한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 항체의 면역학적 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv)이다. 다양한 구조는 본원에서 추가로 설명하고 규정한다.
본원에서 제공되는 특정 항원 결합 단백질은 인간 GM-CSF에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용될 때 "특이적으로 결합하는"은 평형 해리 상수가 <10-8 내지 <10-10 M, 별법으로 <10-9 내지 <10-10 M임을 의미한다.
항원 결합 단백질이 치료 용도로 사용되는 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 GM-CSF의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나, 저해하거나, 조정할 수 있다. 상기 경우에, 항원 결합 단백질은 인간 GM-CSF에 특이적으로 결합하고/하거나, 과잉의 항체가 GM-CSFR에 결합된 인간 GM-CSF의 양 또는 그 반대를 적어도 약 40％, 60％, 80％, 85％ 이상으로 (예를 들어 시험관내 경쟁적 결합 분석으로 결합을 측정함으로써) 감소시킬 때 GM-CSFR에 대한 인간 GM-CSF의 결합을 실질적으로 억제한다. GM-CSF는 많은 특유한 생물학적 효과를 갖고, 이는 상이한 세포 종류에서 많은 상이한 분석으로 측정할 수 있고; 그러한 분석의 예를 본원에서 제공한다.
제공되는 항원 결합 단백질의 일부는 일반적으로 천연 발생 항체와 연관되는 구조를 갖는다. 이들 항체의 구조적 단위는 일반적으로 각각 2개의 동일한 짝 (couplet)의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는 하나 이상의 사량체를 포함하지만, 일부 종의 포유동물은 또한 단일 중쇄만을 갖는 항체를 생산한다. 전형적인 항체에서, 각각의 쌍 또는 짝은 하나의 전장 "경쇄" (특정 실시태양에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중쇄" (특정 실시태양에서, 약 50-70 kDa)를 포함한다. 각각의 개별 면역글로불린 사슬은 각각 대략 90 내지 110개 아미노산으로 이루어지고 특징적인 폴딩 패턴을 나타내는 몇몇 "면역글로불린 도메인"으로 구성된다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드를 구성하는 기초 단위이다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 일반적으로 항원 인식을 담당하는 가변 도메인을 포함한다. 카르복시-말단 부분은 사슬의 다른 단부보다 진화상 더 보존되고, "불변 구역" 또는 "C 구역"으로 언급된다. 인간 경쇄는 일반적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류되고, 이들은 각각 하나의 가변 도메인 및 하나의 불변 도메인을 함유한다. 중쇄는 일반적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, 이들은 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 규정한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하고 이로 제한되지 않는 몇몇 아형을 갖는다. IgM 아형은 IgM1 및 IgM2를 포함한다. IgA 아형은 IgA1 및 IgA2를 포함한다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소형은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 함유하고; IgG 및 IgE 이소형은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하고; IgM 이소형은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 함유한다. 중쇄 C 구역은 일반적으로 효과기 기능을 담당할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 구역 도메인의 수는 이소형에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, IgG 중쇄는 각각 CH1, CH2 및 CH3으로 공지된 3개의 C 구역 도메인을 함유한다. 제공되는 항체는 임의의 이들 이소형 및 아형을 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, GM-CSF 항체는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 아형의 것이다.
전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 구역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 구역에 의해 연결되고, 여기서 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 구역을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press] 참조). 각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 구역은 일반적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
1. 항체의 가변 도메인
본원에서 제공되는 다양한 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 표 1에 제시한다. 각각의 이들 가변 구역은 상기 중쇄 및 경쇄 불변 구역에 부착되어 각각 완전한 항체 중쇄 및 경쇄를 형성할 수 있다. 추가로, 각각의 이렇게 생성된 중쇄 및 경쇄 서열은 조합되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다.
하기 표 1에 제시된 바와 같이 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 및 VH12로 이루어지는 군 중에서 선택되는 항체 중쇄 가변 구역, 및/또는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12로 이루어지는 군 중에서 선택되는 항체 경쇄 가변 구역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.
상기 종류의 항원 결합 단백질은 일반적으로 표 1에 나열된 바와 같이 식 " VHx/VLy" (식에서, "x"는 중쇄 가변 구역의 수에 대응하고, "y"는 경쇄 가변 구역의 수에 대응한다)로 나타내어질 수 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 1에 나열된 각각의 중쇄 가변 구역은 표 1에 제시된 임의의 경쇄 가변 구역과 조합되어 항원 결합 단백질을 형성할 수 있다. 상기 조합의 예는 임의의 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12와 조합된 VH1, 또는 임의의 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12와 조합된 VH2 등을 포함한다.
일부 경우에, 항원 결합 단백질은 표 1에 나열된 것으로부터의 적어도 하나의 중쇄 가변 구역 및/또는 하나의 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 표 1에 나열된 것으로부터의 적어도 2개의 상이한 중쇄 가변 구역 및/또는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 그러한 항원 결합 단백질의 예는 (a) 하나의 VH1, 및 (b) VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 또는 VH12 중의 하나를 포함한다.
또다른 예는 (a) 하나의 VH2, 및 (b) VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 또는 VH12 중의 하나를 포함한다. 다시, 또다른 예는 (a) 하나의 VH3, 및 (b) VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 또는 VH12 중의 하나 등을 포함한다.
다시, 그러한 항원 결합 단백질의 또다른 예는 (a) 하나의 VL1, 및 (b) VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 또는 VL12 중의 하나를 포함한다. 다시, 그러한 항원 결합 단백질의 또다른 예는 (a) 하나의 VL2, 및 (b) VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 또는 VL12 중의 하나를 포함한다. 다시, 그러한 항원 결합 단백질의 또다른 예는 (a) 하나의 VL3, 및 (b) VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 또는 VL12 중의 하나 등을 포함한다.
중쇄 가변 구역의 다양한 조합이 경쇄 가변 구역의 임의의 다양한 조합과 조합될 수 있다.
다른 경우에, 항원 결합 단백질은 2개의 동일한 경쇄 가변 구역 및/또는 2개의 동일한 중쇄 가변 구역을 함유한다. 일례로서, 항원 결합 단백질은 2개의 경쇄 가변 구역 및 2개의 중쇄 가변 구역을 표 1에 나열되는 바와 같은 경쇄 가변 구역의 쌍과 중쇄 가변 구역의 쌍의 조합으로 포함하는 항체 또는 면역학상 기능적 단편일 수 있다.
제공되는 일부의 항체는 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 및 VH12로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인의 서열과 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서 상이한 아미노산의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 그러한 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이다. 일부 항체에서 중쇄 가변 구역은 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 및 VH12의 중쇄 가변 구역의 아미노산 서열에 적어도 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
특정 항체는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인의 서열과 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서 상이한 아미노산의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 그러한 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이다. 일부 항체에서 경쇄 가변 구역은 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12의 경쇄 가변 구역의 아미노산 서열에 적어도 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％의 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
또다른 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 면역학상 기능적 단편은 바로 앞에 설명된 바와 같은 변이체 중쇄 및 변이체 경쇄의 변이체 형태를 포함한다.
2. CDR
전통적인 항체에서, CDR은 중쇄 및 경쇄 가변 구역에서 프레임워크 내에 파묻히고, 여기서 이들은 항원 결합 및 인식을 담당하는 구역을 구성한다. 동일한 종의 면역글로불린 사슬의 가변 도메인은 일반적으로 보다 종종 "상보성 결정 구역" 또는 CDR로 불리는 초가변 구역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 구역 (FR)을 포함하는 유사한 전체 구조를 보인다. 가변 구역은 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 상기 언급된 각각의 중쇄/경쇄쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 일반적으로 프레임워크 구역에 의해 정렬되어 표적 단백질 (예를 들어, GM-CSF) 상의 특이적 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 천연 발생 경쇄 및 중쇄 가변 구역은 모두 일반적으로 다음 순서의 이들 요소와 일치한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각각의 이들 도메인 내의 위치를 차지하는 아미노산에 숫자를 배정하기 위한 넘버링 시스템이 고안되었다. 주어진 항체의 상보성 결정 구역 (CDR) 및 프레임워크 구역 (FR)은 상기 시스템을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 넘버링 시스템은 문헌 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991], 또는 [Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883])에 정의되어 있다. 본원에서 제공되는 CDR은 전통적인 항체 구조의 항원 결합 도메인을 규정하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본원에서 설명되는 다양한 다른 폴리펩티드 구조 내에 파묻힐 수도 있다.
본원에서 개시되는 항원 결합 단백질은 하나 이상의 CDR이 그 내부로 그라프팅되고/되거나, 삽입되고/되거나, 연결된 폴리펩티드이다. 항원 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 가질 수 있다. 그러나, 항원 결합 단백질이 6개 초과의 CDR을 가질 수 있는 것으로 또한 고려된다. 따라서, 항원 결합 단백질은 예를 들어 하나의 중쇄 CDR1 ("CDRH1"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR2 ("CDRH2"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR3 ("CDRH3"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR1 ("CDRL1"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR2 ("CDRL2"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR3 ("CDRL3")을 가질 수 있다. 일부 항원 결합 단백질은 CDRH3 및 CDRL3을 모두 포함한다. 본원에서 개시되는 특정 항원 결합 단백질은 표 2 (CDRH) 및 표 3 (CDRL)에 제시되는 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 동일하거나 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
한 측면에서, 본원에서 개시되는 CDR은 관련 모노클로날 항체의 군으로부터 유래되는 컨센서스 서열을 포함한다. 본원에서 설명될 때, "컨센서스 서열"은 많은 서열 사이에 공통적인 보존된 아미노산, 및 주어진 아미노산 서열 내에서 변하는 가변 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 나타낸다. 제공되는 CDR 컨센서스 서열은 각각의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3에 대응하는 CDR을 포함한다.
컨센서스 서열은 항-GM-CSF 항체의 VH 및 VL에 대응하는 CDR의 표준 계통 분석을 이용하여 결정하였다. 컨센서스 서열은 CDR을 VH 및 VL에 대응하는 동일한 서열 내에서 인접하게 유지함으로써 결정하였다.
CDRH1 컨센서스 서열은 X1X2GX3X4FX5X6YX7X8X9 (서열 94) (여기서, X1은 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, S 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 I 및 M으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 H 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CDRH1 컨센서스 서열은 서열 94, 즉 X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9 (여기서, X1은 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, S 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 I 및 M으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 H 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)이다.
CDRH2 컨센서스 서열은 X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14X15G (서열 106) (여기서, X1은 W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 I 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 N, S 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 P, A 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 N 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 G 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 T 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 N 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X15는 Q, K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CDRH2 컨센서스 서열은 WINPNSGGTNX1AX2X3FX4G (여기서, X1은 Y 또는 S이고, X2는 Q 또는 R이고, X3은 K 또는 R이고, X4는 R, K 또는 Q임) (서열 28)이다.
CDRH3 컨센서스 서열은 X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9 (서열 83) (여기서, X1은 E 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 P, D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y, W, R 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, W, F 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 Y 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 Y, 아미노산 부재 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 M, T 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
CDRL1 컨센서스 서열은 KSSQSX1LYSSX2NX3NX4LX5 (서열 107) (여기서, X1은 V 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 E 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨); RASX1X2X3X4X5X6YX7X8 (서열 118) (여기서, X1은 Q 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 V, L 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, I, T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 및 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10NX11VX12 (서열 125) (여기서, X1은 I, S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 R 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, H 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 I 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 아미노산 부재 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q, N 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CDRL1 컨센서스 서열은 RASQX1X2X3X4X5YX6A (여기서, X1은 S 또는 Y이고, X2는 V, I 또는 L이고, X3은 S 또는 N이고, X4는 S 또는 C이고, X5는 S, T, S 또는 Y이고, X6은 F 또는 L임) (서열 30)이다.
CDRL2 컨센서스 서열은 X1X2X3X4X5X6X7 (서열 130) (여기서, X1은 G, T 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 R 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 A, E 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 및 X1X2X3X4RPS (서열 131) (여기서, X1은 E 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 D, V 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Q, G 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CDRL2 컨센서스 서열은 GX1SSRAT (여기서, X1은 A 또는 T임) (서열 34)이다.
CDRL3 컨센서스 서열은 X1QX2X3X4X5X6X7T (서열 84) (여기서, X1은 Q 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, G 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R, T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 F 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 R 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 및 X1X2X3X4DSSNX5X6X7 (서열 89) (여기서, X1은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 W 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 D 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G, W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 V, L 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 V 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CDRL3 컨센서스 서열은 QQX1X2X3X4X5X6T (여기서, X1은 Y 또는 S이고, X2는 F, G 또는 A이고, X3은 S, T 또는 W이고, X4는 V, S, F이고, X5는 F 또는 P이고, X6은 R, W 또는 I임) (서열 46)이다.
다른 측면에서, 제공되는 CDR은 (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및 (iv) 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH; (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및 (iv) 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL이다.
또다른 측면에서, 표 2 및 3에 나열된 CDR의 변이체 형태는 표 2 및 3에 나열된 CDR 서열에 적어도 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 서열 동일성을 갖는다.
한 측면에 따라, (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및 (iv) 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및 (iv) 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL); 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 (A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; 및 (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH; (B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL; 또는 (C) (A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 (B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 가변 중쇄 (VH)는 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 서열 동일성을 갖고/갖거나, 가변 경쇄 (VL)은 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 서열 동일성을 갖는다.
추가 측면에서, A) (i) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH3과 상이한 CDRH3; (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9 (서열 83) (여기서, X1은 E 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 P, D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y, W, R 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, W, F 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 Y 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 D 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 Y, 아미노산 부재 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 M, T 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택됨)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); 및/또는 B) (i) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL3과 상이한 CDRL3; 및 iii) X1QX2X3X4X5X6X7T (서열 84) (여기서, X1은 Q 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, G 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R, T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 F 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 R 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 및 X1X2X3X4DSSNX5X6X7 (서열 89) (여기서, X1은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 W 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 D 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G, W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 V, L 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 V 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH1과 상이한 CDRH1; (iii) X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9 (서열 94) (여기서, X1은 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, S 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 I 및 M으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 H 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1 아미노산 서열, 또는 (iv) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2; (v) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (iv)의 CDRH2와 상이한 CDRH2; 또는 (vi) X1X2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14X15G (서열 106) (여기서, X1은 W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 I 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 N, S 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 P, A 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 N 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 G 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 T 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 N 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 Y 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X15는 Q, K 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 CDRH2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH; 또는 B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1; (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL1과 상이한 CDRL1; (iii) KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5 (서열 107) (여기서, X1은 V 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 E 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨); RASX1X2X3X4X5X6YX7X8 (서열 118) (여기서, X1은 Q 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 V, L 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, I, T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 F 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 또는 X1X2X3X4X5X6YX7X8X9X10NX11VX12 (서열 125) (여기서, X1은 I, S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 R 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 R 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, H 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 I 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 A 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 아미노산 부재 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Q, N 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1 아미노산 서열; 또는 (iv) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2; (v) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (iv)의 CDRL2와 상이한 CDRL2; 또는 (vi) X1X2X3X4X5X6X7 (서열 130) (여기서, X1은 G, T 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 T 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 R 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 A, E 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨); 또는 X1X2X3X4RPS (서열 131) (여기서, X1은 E 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 D, V 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 Q, G 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL을 더 포함한다.
한 측면에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이들의 항체 단편일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질의 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일쇄 항체 분자일 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질은 인간 항체이고, IgG1형, IgG2형, IgG3형 또는 IgG4형의 것일 수 있다.
또다른 측면에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질은 표지기에 커플링될 수 있고, 인간 GM-CSF의 세포외 부분에 결합하기 위해 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질 중 하나의 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다. 한 실시태양에서, 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질은 환자에게 투여될 때 단핵구 화학주성을 감소시키거나, 종양 내로 단핵구 이동을 억제하거나, 종양 내의 종양 연관 대식세포의 축적을 억제할 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 제시된 서열로부터의 하나 초과의 CDR을 갖는 임의의 항원 결합 단백질에 대해, 제시된 서열로부터 독립적으로 선택되는 CDR의 임의의 조합이 유용하다. 따라서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 독립적으로 선택된 CDR을 갖는 항원 결합 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 당업자가 알 바와 같이, 구체적인 실시태양에서는 일반적으로 비-반복성인 CDR들의 조합을 이용하고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 일반적으로 2개의 CDRH2 구역으로 만들어지지 않는다.
제공되는 항원 결합 단백질의 일부를 아래에서 보다 상세히 논의한다.
항원 결합 단백질 및 결합 에피토프
항원 결합 단백질이 특정화된 잔기, 예를 들어 GM-CSF, 또는 GM-CSF의 세포외 도메인 내에서 에피토프에 결합하는 것으로 말해지는 경우 항원 결합 단백질이 특정화된 잔기 (예를 들어, GM-CSF의 특정화된 절편)로 이루어지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 그러한 항원 결합 단백질은 일반적으로 GM-CSF, 또는 GM-CSF의 세포외 도메인 내의 모든 잔기에 접촉하지는 않는다. GM-CSF, 또는 GM-CSF의 세포외 도메인 내의 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실은 반드시 결합 친화도에 유의하게 영향을 미치는 것도 아니다. 항원 결합 단백질의 에피토프 특이성은 다양한 방식으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원의 서열에 걸쳐 있고 소수의 아미노산 (예를 들어, 3개의 아미노산)의 증가분이 상이한 약 15개 아미노산의 겹치는 펩티드의 수집물을 시험하는 것을 포함한다. 펩티드를 미량역가 접시의 웰 내에 고정한다. 고정화는 펩티드의 하나의 말단을 비오티닐화함으로써 달성할 수 있다. 임의로, 비교의 목적으로 동일한 펩티드의 상이한 샘플을 아미노- 및 카르복시-말단에서 비오티닐화하고 별개의 웰 내에 고정할 수 있다. 이것은 단부-특이적 항원 결합 단백질을 확인하기 위해 유용하다. 임의로, 관심있는 특정 아미노산에서 종결하는 추가의 펩티드가 포함될 수 있다. 상기 방법은 GM-CSF (또는 GM-CSF의 세포외 도메인)의 내부 단편에 단부-특이적 항원 결합 단백질을 확인하기 위해 유용하다. 항원 결합 단백질 또는 면역학상 기능적 단편은 각각의 다양한 펩티드에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝된다. 에피토프는 항원 결합 단백질이 그에 대한 특이적 결합을 보이는 모든 펩티드에 공통적인 아미노산의 절편과 함께 발생하는 것으로 규정된다. 에피토프를 규정하는 특이적 방안에 관한 상세한 내용을 실시예 13에 설명한다.
경쟁성 항원 결합 단백질
다른 측면에서, GM-CSF에 대한 특이적 결합에 대해 상기 설명되는 에피토프에 결합하는 하나의 예시된 항체 또는 기능적 단편과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 그러한 항원 결합 단백질은 또한 본원에 예시된 항원 결합 단백질 중 하나와 동일한 에피토프, 또는 겹치는 에피토프에 결합할 수 있다. 예시된 항원 결합 단백질과 경쟁하고 그와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 단편은 유사한 기능적 특성을 보이는 것으로 예상된다. 예시된 항원 결합 단백질 및 단편은 표 1, 2 및 3에 포함된 중쇄 및 경쇄, 가변 구역 도메인 및 CDR을 갖는 것을 포함하여 상기 설명되는 것을 포함한다.
1. 모노클로날 항체
제공되는 항원 결합 단백질은 GM-CSF에 결합하는 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여, 예를 들어, 면역화 스케줄의 완료 후에 트랜스제닉 동물로부터 수확한 비장 세포를 불멸화함으로써 생산할 수 있다. 비장 세포는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여, 예를 들어, 이를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써 불멸화될 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 절차에 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생산성이고, 높은 융합 효율을 갖고, 목적하는 융합된 세포 (하이브리도마)만의 성장을 지지하는 특정 선택 배지 내에서 성장할 수 없도록 효소 결핍성이다. 마우스 융합에서 사용하기 위한 적합한 세포주의 예는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul을 포함하고; 래트 융합에서 사용되는 세포주의 예는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 포함한다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
일부 경우에, 하이브리도마 세포주는 동물 (예를 들어, 인간 면역글로불린 서열을 갖는 트랜스제닉 동물)을 GM-CSF 면역원으로 면역화하고; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 수확하고; 수확된 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성하고; 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하고, GM-CSF 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인함으로써 생산한다. 그러한 하이브리도마 세포주, 및 이들이 생산하는 항-GM-CSF 모노클로날 항체는 본원의 측면들이다.
하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 하이브리도마 또는 mAb는 Wnt 유도된 활성을 차단하는 능력과 같은 특정 특성을 갖는 mAb를 확인하기 위해 추가로 스크리닝할 수 있다. 그러한 스크린의 예를 아래 실시예에서 제공한다.
2. 키메라 및 인간화 항체
상기한 서열에 기반한 키메라 및 인간화 항체를 또한 제공한다. 치료제로서 유용한 모노클로날 항체는 사용에 앞서 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 한 예는 키메라 항체이고, 이는 공유 연결되어 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 또는 그의 면역학상 기능적 부분을 생산하는 상이한 항체로부터의 단백질 절편들로 구성된 항체이다. 일반적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 키메라 항체에 관련한 방법에 대해서는 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]를 참조한다. CDR 그라프팅은 예를 들어 미국 특허 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, 및 5,530,101에 기재되어 있다.
일반적으로, 키메라 항체를 제조하는 목적은 의도된 환자 종으로부터의 아미노산의 수가 최대화되는 키메라를 생성하기 위한 것이다. 한 예는 "CDR-그라프팅된" 항체이고, 여기서 항체는 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 하나 이상의 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함하는 한편, 항체 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 인간에서 사용하기 위해, 설치류 항체로부터의 가변 구역 또는 선택된 CDR이 종종 인간 항체 내로 그라프팅되어, 인간 항체의 천연 발생 가변 구역 또는 CDR을 교체한다.
하나의 유용한 종류의 키메라 항체는 "인간화" 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 처음에 비-인간 동물에서 생성되는 모노클로날 항체로부터 생산된다. 일반적으로 항체의 비-항원 인식 부분으로부터의 상기 모노클로날 항체 내의 특정 아미노산 잔기는 대응하는 이소형의 인간 항체 내의 대응하는 잔기에 상동성이도록 변형된다. 인간화는 예를 들어, 인간 항체의 대응하는 구역에 대해 설치류 가변 구역의 적어도 일부를 치환함으로써 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,585,089 및 5,693,762; 문헌 [Jones et al., 1986, Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27]; [Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536] 참조),
한 측면에서, 본원에서 제공되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 구역의 CDR (표 2 참조)은 동일하거나 상이한 계통발생 종의 항체로부터의 프레임워크 구역 (FR)에 그라프팅된다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 가변 구역 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11 및 VH12, 및/또는 VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11 및 VL12의 CDR은 컨센서스 인간 FR에 그라프팅될 수 있다. 컨센서스 인간 FR을 생성하기 위해, 몇몇 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR을 컨센서스 아미노산 서열을 확인하기 위해 정렬시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 본원에서 개시되는 중쇄 또는 경쇄의 FR을 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터의 FR로 교체한다. 한 측면에서, 항-GM-CSF 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR 내의 희귀한 아미노산은 교체되지 않지만, 나머지 FR 아미노산은 교체된다. "희귀한 아미노산"은 상기 특정 아미노산이 FR에서 보통 발견되지 않는 위치에 존재하는 특이적 아미노산이다. 별법으로, 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터의 그라프팅된 가변 구역은 본원에 개시되는 특정 중쇄 또는 경쇄의 불변 구역과 상이한 불변 구역과 함께 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 그라프팅된 가변 구역은 단일쇄 Fv 항체의 일부이다.
특정 실시태양에서, 하이브리드 항체를 생산하기 위해 인간 가변 구역(들)과 함께 인간 이외의 다른 종으로부터의 불변 구역을 사용할 수 있다.
3. 완전 인간 항체
완전 인간 항체를 또한 제공한다. 인간을 항원에 노출시키지 않으면서 주어진 항원에 특이적인 완전 인간 항체 ("완전 인간 항체")를 제조하기 위한 방법이 이용가능하다. 완전 인간 항체의 생산을 실행하기 위해 제공되는 하나의 특별한 수단은 마우스 체액성 면역계의 "인간화"이다. 내인성 Ig 유전자를 불활성화시킨 마우스 내로 인간 면역글로불린 (Ig) 로커스를 도입하는 것이 임의의 바람직한 항원으로 면역화시킬 수 있는 동물인 마우스에서 완전 인간 모노클로날 항체 (mAb)를 생산하는 하나의 수단이다. 완전 인간 항체를 사용하면 때때로 치료제로서 마우스 또는 마우스-유도체화된 mAb를 인간에게 투여함으로써 유발될 수 있는 면역원성 및 알레르기 반응을 최소화할 수 있다.
완전 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 레퍼토리 (repertoire)를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (대체로 마우스)을 면역화함으로써 생산할 수 있다. 상기 목적을 위한 항원은 대개 6개 이상의 연속 아미노산을 갖고, 임의로 합텐과 같은 담체에 컨쥬게이팅된다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555]; [Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258]; 및 [Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33])을 참조한다. 그러한 방법의 한 예에서, 트랜스제닉 동물은 내부의 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 코딩하는 내인성 마우스 면역글로불린 로커스를 불능화시키고, 마우스 게놈 내로 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 코딩하는 로커스를 함유하는 인간 게놈 DNA의 큰 단편을 삽입함으로써 생산한다. 이어서, 인간 면역글로불린 로커스의 완전 미만의 보완물을 갖는 부분 변형된 동물을 교잡시켜 모든 목적하는 면역계 변형을 갖는 동물을 얻는다. 면역원을 투여하면, 이들 트랜스제닉 동물은 면역원에 면역특이적이지만 가변 구역을 포함하는, 뮤린 아미노산 서열이 아닌 인간 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 그러한 방법의 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 WO96/33735 및 WO94/02602를 참조한다. 인간 항체를 제조하기 위한 트랜스제닉 마우스에 관련한 추가의 방법은 미국 특허 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 및 5,545,806; PCT 공개 WO91/10741, WO90/04036, 및 EP 546073B1 및 EP 546073A1에 기재되어 있다.
상기 설명되는 트랜스제닉 마우스 (본원에서 "HuMab" 마우스로 칭함)는 내인성 μ 및 κ 사슬 로커스를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니로커스 (minilocus)를 함유한다 (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현이 감소되고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입 유전자 (transgene)는 클래스 스위칭 (class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고 친화도 인간 IgG κ 모노클로날 항체를 생성한다 ([Lonberg et al., 상기 문헌]; [Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93]; [Harding and Lonberg, 1995, Ann. N. Y Acad. Sci. 764:536-546]). HuMab 마우스의 제조는 문헌 ([Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656]; [Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920]; [Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859]: [Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101]; [Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591]; [Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93]; [Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546]: [Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85])에 상세히 설명되어 있다. 추가로 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; 및 미국 특허 5,545,807; PCT 공개 WO 93/1227; WO 92/22646; 및 WO 92/03918을 참조한다. 이들 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체를 생산하기 위해 사용되는 기술은 또한 PCT 공개 WO 98/24893 및 문헌 [Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156]에 개시되어 있다. 예를 들어, HCo7 및 HCo12 트랜스제닉 마우스주가 항-GM-CSF 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
하이브리도마 기술을 사용하여, 상기 설명한 것과 같은 트랜스제닉 마우스로부터 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 mAb를 생산하고 선택할 수 있다. 그러한 항체는 적합한 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 클로닝하고 발현시킬 수 있거나, 항체는 배양된 하이브리도마 세포로부터 수확할 수 있다.
완전 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래할 수 있다 (문헌 [Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581]에 개시된 바와 같이). 파지 디스플레이 기술은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 항체 레퍼토리의 디스플레이를 통한 면역 선택, 및 선택되는 항원에 대한 결합에 의한 파지의 후속적인 선택을 모방한다. 그러한 기술의 하나가 PCT 공개 WO 99/10494에 기재되어 있고, 이는 그러한 방법을 사용하여 MPL- 및 msk-수용체에 대한 고 친화도 및 기능적 작용 항체의 단리를 설명한다.
4. 이중특이적 또는 이중기능적 항원 결합 단백질
제공되는 항원 결합 단백질은 또한 상기 설명한 바와 같이 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 구역을 포함하는 이중특이적 및 이중기능적 항체를 포함한다. 일부 경우에, 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 연결을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]) 참조).
5. 다양한 다른 형태
제공되는 항원 결합 단백질의 일부는 상기 개시되는 항원 결합 단백질의 변이체 형태 (예를 들어, 표 1-4에 나열된 서열을 갖는 것)이다. 예를 들어, 항원 결합 단백질의 일부는 표 1-4에 나열되는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄, 가변 구역 또는 CDR에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
천연 발생 아미노산은 일반적 측쇄 특성에 기초하여 클래스별로 나누어질 수 있다:
1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존적 아미노산 치환은 이들 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버와 교환하는 것을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 생물학적 시스템 내의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 포함되는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 펩티드모방체 (peptidomimetic) 및 다른 역전 또는 역위 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다.
비-보존적 치환은 다른 클래스의 멤버에 대한 상기 클래스 중 하나의 멤버의 교환을 포함할 수 있다. 그러한 치환된 잔기는 인간 항체와 상동성인 항체의 구역 내로, 또는 분자의 비-상동성 구역 내로 도입될 수 있다.
그러한 변화를 하는데 있어서, 특정 실시태양에 따르면, 아미노산의 수치 지수 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질의 수치 프로필은 각각의 아미노산에 수치값 ("친수도 지수")을 지정한 후, 펩티드 사슬을 따라 이들 값을 반복적으로 평균함으로써 계산된다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치 지수가 지정되었다. 이들은 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다.
단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치 프로필의 중요성은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol., 157:105-131] 참조). 특정 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있음이 알려져 있다. 수치 지수에 기초한 변화를 하는데 있어서, 특정 실시태양에서, 수치 지수가 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 일부 측면에서, 수치 지수가 ±1 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 다른 측면에서, ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다.
유사한 아미노산의 치환은 특히 그에 의해 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드를 본 경우에서와 같이 면역학적 실시태양에서 사용하도록 의도하는 경우에 친수도에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있음이 또한 당업계에서 이해된다. 특정 실시태양에서, 그의 인접 아미노산의 친수도에 의해 지배되는 단백질의 최대 국소 평균 친수도는 그의 면역원성 및 항원 결합 또는 항원성, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상호관련된다.
이들 아미노산 잔기에 다음의 친수도 값이 지정되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수도 값에 기초하여 변화를 이루는데 있어서, 특정 실시태양에서, 그의 친수도 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 다른 실시태양에서, ±1 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 또다른 실시태양에서, ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 일부 경우에, 또한 친수도에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 구역은 또한 "에피토프 코어 구역"으로서 언급된다.
예시적인 보존적 아미노산 치환을 표 4에 기재한다.
Figure pct00006
당업자는 잘 공지된 기술을 이용하여 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 당업자는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 구역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 당업자는 또한 유사한 폴리펩티드들 사이에 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있을 것이다. 추가의 실시태양에서, 심지어 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역이 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 또는 폴리펩티드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환에 적용될 수 있다.
추가로, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 내의 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 그러한 비교를 고려하여, 유사한 단백질에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 단백질 내의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 그러한 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당업자는 또한 유사한 폴리펩티드 내의 해당 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 그러한 정보를 고려하여, 당업자는 그의 3차원 구조에 관하여 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 당업자는 단백질의 표면 상에 있는 것으로 예측된 아미노산 잔기로의 라디칼 변화를 일으키지 않도록 선택할 수 있고, 그 이유는 그러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 또한, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성시킬 수 있다. 이어서, 이들 변이체는 GM-CSF 중화 활성에 대한 분석 (아래 실시예 참조)을 이용하여 스크리닝될 수 있어서, 어떠한 아미노산이 변화될 수 있는지 및 변화되어서는 안 되는지에 관한 정보를 얻는다. 즉, 그러한 일상적인 실험으로부터 모은 정보에 기초하여, 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합으로 추가의 치환을 피해야 하는 아미노산 위치를 쉽게 결정할 수 있다.
많은 학술 문헌들이 2차 구조의 예측에 대해 집중적으로 보고하였다 ([Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech., 7:422-427]; [Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245]; [Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222]; [Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148]; [Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276]; 및 [Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384] 참조). 또한, 2차 구조 예측을 돕기 위한 컴퓨터 프로그램이 현재 이용가능하다. 2차 구조 예측을 위한 한 방법은 상동성 모델링에 기초한다. 예를 들어, 서열 동일성이 30％를 초과하거나, 유사성이 40％를 초과하는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 토폴로지 (topology)를 갖는다. 단백질 구조 데이타베이스 (PDB)의 최근의 성장은 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내의 폴드 (fold)의 잠재적인 수를 포함하여 2차 구조의 향상된 예측가능성을 제공하였다. 예를 들어, 문헌 [Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res., 27:244-247]을 참조한다. 제시된 폴리펩티드 또는 단백질 내에 제한된 수의 폴드가 존재하고, 중요한 수의 구조가 밝혀진 후에 구조 예측이 보다 더 정확해질 것으로 제안되었다 (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:369-376).
2차 구조를 예측하는 추가의 방법은 "쓰레딩 (threading)" ([Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387]; [Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19]), "프로필 분석" ([Bowie et al., 1991, Science 253:164-170]; [Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159]; [Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358]), 및 "진화적 연결" ([Holm, 1999, 상기 문헌] 및 [Brenner, 1997, 상기 문헌] 참조)을 포함한다.
특정 실시태양에 따라, (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고/시키거나, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고/시키거나, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경시키고/시키거나, (4) 리간드 또는 항원 결합 친화도를 변경시키고/시키거나, (5) 그러한 폴리펩티드에 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 아미노산 치환이 이루어진다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (특정 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환)이 천연 발생 서열에서 이루어질 수 있다. 치환은 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부에 놓인 항체의 부분에서 이루어질 수 있다. 상기 실시태양에서, 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 모 또는 천연 항원 결합 단백질의 특징을 이루는 2차 구조를 파괴하지 않는 하나 이상의 교체 아미노산)이 사용될 수 있다. 당업계에서 인정되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 ([Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W.H. New York: Freeman and Company]; [Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing]; 및 [Thornton et al., 1991, Nature 354:105])에 기재되어 있다.
추가의 바람직한 항체 변이체는 모 또는 천연 아미노산 서열 내의 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 또다른 아미노산 (예를 들어, 세린)으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 특히 항체가 생물학적 활성 입체형태로 재폴딩되어야 할 때 유용하다. 시스테인 변이체는 천연 항체보다 더 적은 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 대개 비페어링된 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하기 위해 짝수의 시스테인을 갖는다.
개시되는 중쇄 및 경쇄, 가변 구역 도메인 및 CDR은 GM-CSF 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 구역을 함유하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 3 및 4에 나열된 하나 이상의 CDR은 분자 (예를 들어, 폴리펩티드) 내로 공유 또는 비공유 방식으로 포함되어 면역어드헤션을 제조할 수 있다. 면역어드헤션은 CDR(들)을 보다 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 포함할 수 있거나, CDR(들)을 또다른 폴리펩티드 사슬에 공유 연결할 수 있거나, CDR(들)을 비공유 방식으로 포함할 수 있다. CDR(들)로 인해 면역어드헤션은 관심있는 특정 항원 (예를 들어, GM-CSF 폴리펩티드 또는 그의 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 설명되어 있는 가변 구역 도메인 및 CDR에 기초한 모방체 (예를 들어, "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체")를 또한 제공한다. 이들 유사체는 펩티드, 비-펩티드, 또는 펩티드와 비-펩티드 구역의 조합물일 수 있다 ([Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29]; [Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392]; 및 [Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229]). 치료상 유용한 펩티드에 구조상 유사한 펩티드 모방체가 유사한 치료 또는 예방 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 화합물은 종종 컴퓨터 분자 모델링을 사용하여 개발된다. 일반적으로, 펩티드모방체는 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어 여기서 GM-CSF에 특이적으로 결합하는 능력을 보이는 항체에 구조상 유사한 단백질이지만, 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO- 중에서 선택되는 연결로 임의로 교체되는 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 특정 실시태양에서, 동일한 종류의 D-아미노산으로의 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적인 치환 (예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)은 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 구속형 (constrained) 펩티드는 당업계에 공지된 방법 (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem., 61:387)에 의해, 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는 분자내 디술피드 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.
본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 유도체를 또한 제공한다. 유도체화된 항원 결합 단백질은 항체 또는 단편에 목적하는 특성, 예를 들어 특정 용도에서 증가된 반감기를 부여하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항원 결합 단백질은 예를 들어, 검출가능한 (또는 표지) 모이어티 (예를 들어, 방사성, 비색, 항원성 또는 효소적 분자, 검출가능한 비드 (예를 들어 자성 또는 전자치밀 (electrodense) (예를 들어, 금) 비드), 또는 또다른 분자에 결합하는 분자 (예를 들어, 비오틴 또는 스트렙타비딘)), 치료 또는 진단 모이어티 (예를 들어, 방사성, 세포독성, 또는 제약 활성 모이어티), 또는 특정 용도 (예를 들어, 인간 대상과 같은 대상에의 투여, 또는 다른 생체내 또는 시험관내 용도)를 위한 항원 결합 단백질의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질을 유도체화하기 위해 사용될 수 있는 분자의 예는 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다. 항원 결합 단백질의 알부민-연결된 및 PEG화 유도체는 당업계에 잘 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 트랜스싸이레틴 (TTR) 또는 TTR 변이체에 컨쥬게이팅되거나 다른 방식으로 연결된다. TTR 또는 TTR 변이체는 예를 들어 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화학물질로 화학적으로 변형될 수 있다.
다른 유도체는 GM-CSF 항원 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종성 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한 것과 같은, 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 GM-CSF 항원 결합 단백질의 공유 또는 집합성 컨쥬게이트를 포함한다. 예를 들어, 컨쥬게이팅된 펩티드는 이종성 신호 (또는 리더) 폴리펩티드, 예를 들어, 효모 알파-인자 리더, 또는 펩티드, 예를 들어 에피토프 태그일 수 있다. GM-CSF 항원 결합 단백질-함유 융합 단백질은 GM-CSF 항원 결합 단백질의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드 (예를 들어, 폴리-His)를 포함할 수 있다. GM-CSF 항원 결합 단백질은 또한 문헌 [Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204]; 및 미국 특허 5,011,912에 기재되어 있는 바와 같이 FLAG 펩티드에 연결될 수 있다. FLAG 펩티드는 고도로 항원성이고, 특이적 모노클로날 항체 (mAb)가 가역적으로 결합하는 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 한다. FLAG 펩티드가 주어진 폴리펩티드에 융합되는 융합 단백질을 제조하기 위해 유용한 시약은 상업상 이용가능하다 (시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스)).
하나 이상의 GM-CSF 항원 결합 단백질을 함유하는 올리고머가 GM-CSF 길항제로서 사용될 수 있다. 올리고머는 공유-연결된 또는 비-공유-연결된 단량체, 삼량체, 또는 보다 고차 올리고머의 형태로 존재할 수 있다. 2개 이상의 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함하는 올리고머가 사용을 위해 고려되고, 그의 한 예는 동종이량체이다. 다른 올리고머는 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체, 이종사량체 등을 포함한다.
한 실시태양은 GM-CSF 항원 결합 단백질에 융합된 펩티드 모이어티들 사이의 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 연결된 다수 GM-CSF-결합 폴리펩티드를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 그러한 펩티드는 펩티드 링커 (스페이서), 또는 올리고머화를 촉진시키는 특성을 갖는 펩티드일 수 있다. 아래에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 그에 부착된 GM-CSF 항원 결합 단백질의 올리고머화를 촉진시킬 수 있는 펩티드들 중에는 류신 지퍼, 및 항체로부터 유래되는 특정 폴리펩티드가 있다.
특정 실시태양에서, 올리고머는 2 내지 4개의 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함한다. 올리고머의 GM-CSF 항원 결합 단백질 모이어티는 상기 설명되는 임의의 형태, 예를 들어, 변이체 또는 단편으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 올리고머는 GM-CSF 결합 활성을 갖는 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함한다.
한 실시태양에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래되는 폴리펩티드를 사용하여 제조한다. 항체-유래 폴리펩티드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 특정 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들어, 문헌 ([Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535]; [Byrn et al., 1990, Nature 344:677]; 및 [Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11])에 설명되어 있다.
한 실시태양은 GM-CSF 항원 결합 단백질을 항체의 Fc 구역에 융합시킴으로써 생성되는 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 이량체는 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포 내에서 유전자 융합체를 발현시키고, 발현된 융합 단백질을 항체 분자처럼 조립되도록 하여, 그 위에서 Fc 모이어티들 사이에 사슬간 디술피드 결합이 형성하여 이량체를 얻음으로써 제조할 수 있다.
용어 "Fc 폴리펩티드"는 본원에서 사용될 때 항체의 Fc 구역으로부터 유래하는 천연 및 돌연변이체 형태의 폴리펩티드를 포함한다. 이량체화를 촉진시키는 힌지 구역을 함유하는 말단절단된 (truncated) 형태의 상기 폴리펩티드가 또한 포함된다. Fc 모이어티를 포함하는 융합 단백질 (및 그로부터 형성된 올리고머)는 Protein A 또는 Protein G 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의한 용이한 정제의 잇점을 제공한다.
PCT 공개 WO 93/10151 및 미국 특허 5,426,048 및 5,262,522에 기재되어 있는 하나의 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체의 Fc 구역의 N-말단 힌지 구역으로부터 천연 C-말단까지 연장하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 또다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 5,457,035 및 문헌 [Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001]에 기재되어 있는 Fc 돌연변이체이다. 상기 돌연변이체의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu으로부터 Ala으로 변화되고, 아미노산 20이 Leu으로부터 Glu로 변화되고, 아미노산 22가 Gly으로부터 Ala로 변화된 것을 제외하고는, PCT 공개 WO 93/10151에 제시된 천연 Fc 서열과 동일하다. 돌연변이체는 Fc 수용체에 대한 감소된 친화도를 보인다.
다른 실시태양에서, 본원에 개시된 바와 같은 GM-CSF 항원 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분은 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분을 치환할 수 있다.
별법으로, 올리고머는 펩티드 링커 (스페이서 펩티드)를 갖거나 갖지 않으면서 다수 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 적합한 펩티드 링커에는 미국 특허 4,751,180 및 4,935,233에 기재된 것이 있다.
올리고머성 GM-CSF 항원 결합 단백질 유도체를 제조하는 또다른 방법은 류신 지퍼의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 그들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 촉진시키는 펩티드이다. 류신 지퍼는 원래 몇몇 DNA-항원 결합 단백질에서 확인되었고 (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), 그 이후에 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지의 류신 지퍼 중에는 이량체화 또는 삼량체화하는 천연 발생 펩티드 및 그의 유도체가 있다. 가용형 올리고머성 단백질을 생산하기 위해 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 공개 WO 94/10308에 기재되어 있고, 폐 계면활성제 단백질 D (SPD)로부터 유래되는 류신 지퍼는 문헌 [Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191]에 기재되어 있다. 그에 융합된 이종성 단백질의 안정한 삼량체화를 허용하는 변형된 류신 지퍼의 사용은 문헌 [Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278]에 설명되어 있다. 한 방법에서, 류신 지퍼 펩티드에 융합된 GM-CSF 항원 결합 단백질 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질을 적합한 숙주 세포 내에서 발현시키고, 형성되는 가용형 올리고머성 GM-CSF 항원 결합 단백질 단편 또는 유도체를 배양 상등액으로부터 수확한다.
제공되는 일부 항원 결합 단백질은 GM-CSF에 대한 결합 친화도 (Ka)가 예를 들어 아래 실시예에 설명된 바와 같이 측정될 때 적어도 104 또는 105/M x 초이다. 다른 항원 결합 단백질은 Ka가 적어도 106, 107, 108 또는 109/M x 초이다. 제공되는 특정 항원 결합 단백질은 낮은 해리율을 갖는다. 일부 항체는 예를 들어 Koff가 1 x 104 s-1, 1 x 105 s-1 또는 그 이하이다. 다른 실시태양에서, Koff는 표 2 및 3의 가변 구역 도메인의 다음 조합을 갖는 항체와 동일하다.
또다른 측면은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 (예를 들어, 인간 대상에게 투여될 때) 반감기가 적어도 1일인 항원 결합 단백질을 제공한다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 반감기가 적어도 3일이다. 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 일부는 반감기가 4일 이상이다. 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 일부는 반감기가 8일 이상이다. 다른 실시태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 비유도체화되거나 비변형된 항체에 비해 반감기가 보다 길도록 유도체화되거나 변형된다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCT 공개 WO 00/09560에 기재된 바와 같은 혈청 반감기를 증가시키는 점 돌연변이를 함유한다.
6. 글리코실화
항원 결합 단백질은 천연 종에서 발견되는 것과 상이하거나 변경된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 단백질의 서열 (예를 들어, 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재, 아래에서 논의됨), 또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 유기체에 따라 결정될 수 있다. 특정 발현 시스템을 아래에서 논의한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 나타낸다. 트리-펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트리-펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에의 부착을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질에 대한 글리코실화 부위의 부가는 편리하게는 하나 이상의 상기한 트리-펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 달성한다. 변경은 또한 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해). 용이함을 위해, 항원 결합 단백질 아미노산 서열은 DNA 수준에서 변화를 통해, 특히 목적하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 표적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 예정된 염기에서 돌연변이시킴으로써 변경될 수 있다.
항원 결합 단백질에 대한 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또다른 수단은 단백질에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 이들 절차는 N- 및 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포 내에서 단백질의 생산을 요구하지 않는 점에서 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 PCT 공개 WO 87/05330, 및 문헌 [Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306]에 설명되어 있다.
출발 항원 결합 단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성할 수 있다. 화학적 탈글리코실화에는 단백질을 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 노출하는 것을 필요로 한다. 상기 처리는 폴리펩티드를 무손상으로 남기면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 일으킨다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 ([Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52] 및 [Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131]에 설명되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350]에 설명된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성할 수 있다. 잠재적인 글리코실화 부위에서 글리코실화는 문헌 [Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105]에 설명된 바와 같이 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지할 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 연결의 형성을 차단한다.
따라서, 한 측면은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 글리코실화 부위의 수 및/또는 종류(들)이 변경된 항원 결합 단백질의 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항체 단백질 변이체는 천연 항체보다 더 많거나 더 적은 수의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결된 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하고, 여기서, X로 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 별법으로, 상기 서열을 제거하거나 변경시키는 치환은 천연 폴리펩티드 내에 존재하는 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 방지할 것이다. 예를 들어, 글리코실화는 Asn의 결실에 의해 또는 Asn을 상이한 아미노산으로 치환함으로써 감소시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 새로운 N-연결된 부위가 생성된다. 항체는 일반적으로 Fc 구역 내에 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다.
7. 표지 및 효과기 기
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 표지를 포함한다. 용어 "표지기" 또는 "표지"는 임의의 검출가능한 표지를 의미한다. 적합한 표지기의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광기 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소기 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광기, 비오티닐기, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시태양에서, 표지기는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암 (arm)을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 적합한 것으로 보일 때 사용될 수 있다.
용어 "효과기 기"는 세포독성제로서 작용하는 항원 결합 단백질에 커플링된 임의의 기를 의미한다. 적합한 효과기 기의 예는 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)이다. 다른 적합한 기는 독소, 치료기 또는 화학치료기를 포함한다. 적합한 기의 예는 칼리케아미신, 오리스타틴, 겔다나마이신 및 메이탄신을 포함한다. 일부 실시태양에서, 효과기 기는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다.
일반적으로, 표지는 이들이 검출되는 분석에 따라 다음과 같이 다양한 종류로 분류된다: a) 방사성 또는 중 동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자성 표지 (예를 들어, 자성 입자); c) 레독스 활성 모이어티; d) 광학 염료; 효소기 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); e) 비오티닐화기; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 실시태양에서, 표지기는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
특이적 표지는 발색단, 인광체 및 형광단을 포함하지만 이로 제한되지 않는 광학 염료를 포함하고, 많은 경우에 형광단이 특이적이다. 형광단은 "소분자" 형광물질, 또는 단백질성 형광물질일 수 있다.
"형광 표지"는 그의 고유한 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 파이렌, 말라카이트 그린 (Malacite green), 스틸벤, 루시퍼 옐로우 (Lucifer Yellow), 케스케이드 블루제이 (Cascade BlueJ), 텍사스 레드 (Texas Red), IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, 오레곤 (Oregon) 그린, 알렉사 플루오르 (Alexa-Fluor) 염료 (알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 케스케이드 블루, 케스케이드 옐로우 및 R-피코에리트린 (PE) (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진)), FITC, 로다민, 및 텍사스 레드 (피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드)), Cy5, Cy5.5, Cy7 (아머샴 라이프 사이언스 (Amersham Life Science, 미국 펜실베니아주 피츠버그))을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 형광단을 포함한 적합한 광학 염료는 문헌 [Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Richard P. Haugland, Molecular Probes, 1992]에 기재되어 있다.
또한, 적합한 단백질성 형광 표지는 초록 형광 단백질, 예를 들어 레닐라 (Renilla), 틸로사르쿠스 (Ptilosarcus), 또는 애쿠오레아 (Aequorea) 종의 GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰), Genbank 기탁 번호 U55762), 청색 형광 단백질 (BFP, 퀀텀 바이오테크놀로지스, 인크. (Quantum Biotechnologies, Inc., 캐나다 퀘벡); [Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471]; [Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182]), 향상된 황색 형광 단백질 (EYFP, 클론테크), 루시퍼라제 (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다제 (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라 (PCT 특허 출원 WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, 미국 특허 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
C. GM - CSF 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산
항체의 사슬 중 하나 또는 둘 모두, 또는 그의 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 변이체를 코딩하는 핵산, 중쇄 가변 구역 또는 CDR만을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인, 분석, 돌연변이 또는 증폭시키기 위해 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열결정 프라이머로서 사용하기 위해 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위한 안티-센스 핵산, 및 상기한 것의 상보성 서열을 포함하는, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질, 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 또한 제공한다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000개 이상의 뉴클레오티드 길이 (이들 수치 사이의 모든 값을 포함함)일 수 있고/있거나 하나 이상의 추가의 서열, 예를 들어, 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나 보다 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드 및 그의 인공 변이체 (예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다.
특정 항원 결합 단백질, 또는 그의 일부 (예를 들어, 전장 항체, 중쇄 또는 경쇄, 가변 도메인, 또는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3)를 코딩하는 핵산은 GM-CSF 또는 그의 면역원성 단편으로 면역화시킨 마우스의 B-세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 통상적인 절차에 의해 단리될 수 있다. 파지 디스플레이는 공지의 기술의 또다른 예로서, 이에 의해 항체 및 다른 항원 결합 단백질의 유도체가 제조될 수 있다. 한 방안에서, 관심있는 항원 결합 단백질의 성분인 폴리펩티드는 임의의 적합한 재조합 발현 시스템 내에서 발현되고, 발현된 폴리펩티드들은 조립되어 항원 결합 단백질 분자를 형성하도록 허용될 수 있다.
유전자 코드의 다의성 (degeneracy)으로 인해, 표 1-4에 나열되거나 본원에서 달리 제시된 각각의 폴리펩티드 서열은 또한 제시된 것을 제외한 다수의 다른 핵산 서열에 의해 코딩된다. 따라서, 당업자는 본원이 각각의 항원 결합 단백질을 코딩하는 각각의 다의성 뉴클레오티드 서열에 대한 적합한 설명 및 실행 방안을 제시하고 있음을 이해할 것이다.
한 측면은 특정 혼성화 조건 하에 다른 핵산에 혼성화하는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산을 혼성화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조한다. 본원에 정의한 바와 같이, 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건은 5x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 0.5％ SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)을 함유하는 예비세척 용액, 약 50％ 포름아미드, 6x SSC의 혼성화 버퍼, 및 55℃의 혼성화 온도 (또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예를 들어 약 50％ 포름아미드를 함유하는 용액, 및 42℃의 혼성화 온도), 및 0.5x SSC, 0.1％ SDS 내의 60℃의 세척 조건을 사용한다. 엄격한 혼성화 조건은 6x SSC 내에서 45℃에서 혼성화한 후, 0.1 x SSC, 0.2％ SDS 내에서 68℃에서 1회 이상 세척한다. 또한, 당업자는 일반적으로 서로 적어도 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％ (그 사이의 모든 값 포함) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 서로 혼성화되도록 혼성화의 엄격도를 증가 또는 감소시키기 위해 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 미치는 기본 파라미터 및 적합한 조건을 고안하기 위한 지침은 예를 들어 문헌 ([Sambrook, Fritsch, and Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)])에 제시되어 있고, 예를 들어, 핵산의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
변화는 핵산 내로 돌연변이를 도입하고, 이에 의해 그가 코딩하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열에 변화를 일으킴으로써 도입될 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 도입될 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 특정 아미노산 잔기가 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 프로토콜을 이용하여 변화된다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 무작위로 선택된 잔기가 예를 들어 무작위 돌연변이 유발 프로토콜을 이용하여 변화된다. 그러나, 돌연변이체 폴리펩티드는 발현되고 목적하는 특성에 대해 스크리닝될 수 있다.
돌연변이는 그가 코딩하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환을 이룰 수 있다. 별법으로, 그가 코딩하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 선택적으로 변화시키는 하나 이상의 돌연변이가 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적인 변화의 예는 활성을 증가, 감소 또는 제거하는 것을 포함한다. 정성적인 변화의 예는 항체의 항원 특이성을 변화시키는 것을 포함한다.
또다른 측면에서는 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용하기 위해 적합한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 전장 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 일부만, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편, 또는 폴리펩티드의 활성 부분 (예를 들어, GM-CSF 결합 부분)을 코딩하는 단편을 포함할 수 있다.
핵산의 서열에 기초한 프로브는 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 전사체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 프로브는 표지기, 예를 들어, 방사선 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 그러한 프로브는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
또다른 측면에서는 본원에서 설명되는 폴리펩티드 또는 그의 일부 (예를 들어, 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 구역 도메인을 함유하는 단편)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 재조합 발현 벡터는 핵산을 숙주 세포 내에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 발현을 위해 사용할 숙주 세포에 기초하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 상기 조절 서열은 발현시킬 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열은 많은 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 (예를 들어, SV40 조기 유전자 인핸서, 라우스 (Rous) 육종 바이러스 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 프로모터), 특정 숙주 세포 내에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열, [Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11;287], [Maniatis et al., 1987, Science 236:1237] 참조), 및 특정 처리 또는 조건에 반응하여 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것 (예를 들어, 포유동물 세포에서의 메탈로티오닌 프로모터, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 모두에서의 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터 (상기 문헌 참조))을 포함한다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 결정될 수 있음을 알 것이다. 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 본원에서 설명되는 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드 (융합 단백질 또는 펩티드 포함)를 생산할 수 있다.
또다른 측면에서는 재조합 발현 벡터가 그 내부에 도입된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 세포 (예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵생물 세포 (예를 들어, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내에 도입될 수 있다. 포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라, 세포의 단지 작은 분획만이 외래 DNA를 그들의 게놈 내로 통합시킬 수 있음이 알려져 있다. 이들 통합체 (integrant)를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능한 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대해)를 코딩하는 유전자가 숙주 세포 내로 관심있는 유전자와 함께 일반적으로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커는 약물, 예를 들어 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것이다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 다른 방법들 중에서도 약물 선택에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선택가능한 마커 유전자를 포함한 세포는 생존할 것이지만, 다른 세포는 죽는다).
D. 항원 결합 단백질의 제조
완전 인간 항체는 인간 면역글로불린 로커스를 함유하는 트랜스제닉 동물을 면역화함으로써 또는 인간 항체의 레퍼토리를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 상기 설명된 바와 같이 제조할 수 있다.
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 별법으로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어, B-림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 사용할 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 하나의 적합한 동물 시스템은 뮤린 시스템이고, 이것은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 상기 절차를 위해, 면역화된 마우스로부터의 B 세포를 적합한 불멸화된 융합 파트너, 예를 들어 뮤린 골수종 세포주와 융합시킨다. 경우에 따라, 마우스 대신에 래트 또는 그 외의 다른 포유동물을 면역화시킬 수 있고, 상기 동물로부터의 B 세포를 뮤린 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 형성할 수 있다. 별법으로, 마우스 이외의 공급원으로부터 골수종 세포주를 사용할 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 융합 절차도 또한 잘 공지되어 있다.
제공되는 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (Fv 구역) 단편을 아미노산 다리 (짧은 펩티드 링커)를 통해 연결시켜, 단일 폴리펩티드 사슬을 생성함으로써 형성될 수 있다. 상기 단일쇄 Fv (scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩티드 (VL 및 VH)를 코딩하는 DNA들 사이에 펩티드 링커를 코딩하는 DNA를 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 생성되는 폴리펩티드는 접혀서 항원 결합 단량체를 형성할 수 있거나, 2개의 가변 도메인들 사이의 가요성 링커의 길이에 따라 다량체 (예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다 ([Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423]; [Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108]). 상이한 VL 및 VH-포함 폴리펩티드를 조합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체 scFv를 형성할 수 있다 (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). 단일쇄 항체 생산을 위해 개발된 기술은 미국 특허 4,946,778; 문헌 ([Bird, 1988, Science 242:423]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879]; [Ward et al., 1989, Nature 334:544]; [de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387])에 기재되어 있는 것을 포함한다. 본원에서 제공되는 항체로부터 유래되는 단일쇄 항체는 표 1에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 구역들의 가변 도메인 조합, 또는 표 2 및 3에 제시된 임의의 CDR에 그라프팅된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 조합을 포함하는 scFv를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
하나의 하위클래스에 속하는 본원에서 제공되는 항체는 하위클래스 스위칭 방법을 이용하여 상이한 하위클래스의 항체로 변화시킬 수 있다. 따라서, IgG 항체는 예를 들어 IgM 항체로부터 유도될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 그러한 기술에 의해 제시된 항체 (모 항체)의 항원 결합 특성을 갖지만, 또한 모 항체와 상이한 이소형 또는 하위클래스의 항체와 연관된 생물학적 특성을 보이는 새로운 항체를 제조할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드를 코딩하는 클로닝된 DNA, 예를 들어, 목적하는 이소형의 항체의 불변 도메인을 코딩하는 DNA를 상기 절차에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316]을 참조한다. 따라서, 제공되는 항체는 예를 들어, 목적하는 이소형 (예를 들어, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE1 및 IgD)을 갖는 상기 설명되는 가변 도메인 조합을 포함하는 항체 및 그의 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 또한, IgG4가 요망되면, IgG4 항체에 불균질성을 일으킬 수 있는 H 사슬내 디술피드 결합을 형성하는 경향을 완화하기 위해 문헌 [Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407]에서 설명된 바와 같이 힌지 구역에 점 돌연변이 (CPSCP→CPPCP)를 도입하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
또한, 상이한 특성을 갖는 항체 (즉, 그들이 결합하는 항원에 대한 친화도가 변하는 항체)를 유도하기 위한 기술이 또한 공지되어 있다. 하나의 그러한 기술 (사슬 셔플링 (shuffling)으로 칭함)은 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리를 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이하는 것을 포함한다 (종종 파지 디스플레이로서 칭함). 사슬 셔플링은 문헌 [Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779]에 설명된 바와 같이 합텐 2-페닐옥사졸-5-온에 대한 고친화도 항체를 제조하기 위해 사용되었다.
기능적 및 생화학적 특징을 갖는 GM-CSF 항원 결합 단백질을 생산하기 위해 표 1에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변 구역, 또는 표 2 및 3에 기재된 CDR에 대해 보존적 변형 (및 코딩 핵산에 대해 상응하는 변형)이 이루어질 수 있다. 그러한 변형을 달성하는 방법은 상기 설명되어 있다.
GM-CSF 항원 결합 단백질은 다양한 방식으로 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 치료 목적으로 사용되어야 하는 경우에, 이들은 혈청 반감기를 연장시키거나 단백질 전달을 향상하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 (peg화)로 컨쥬게이팅시킬 수 있다. 별법으로, 대상 항체 또는 그의 단편의 V 구역을 상이한 항체 분자의 Fc 구역과 융합시킬 수 있다. 상기 목적을 위해 사용되는 Fc 구역은 보체에 결합하지 않도록 변형될 수 있어서, 융합 단백질이 치료제로서 사용될 때 환자에서 세포 용해를 유발할 가능성을 감소시킬 수 있다. 또한, 대상 항체 또는 그의 기능적 단편은 항체 또는 그의 단편의 혈청 반감기를 향상시키기 위해 인간 혈청 알부민과 컨쥬게이팅될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편에 대한 또다른 유용한 융합 파트너는 트랜스싸이레틴 (TTR)이다. TTR은 사량체를 형성하는 능력을 갖고, 따라서, 항체-TTR 융합 단백질은 다가 항체를 형성할 수 있고, 이는 그의 결합력을 증가시킬 수 있다.
별법으로, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 기능적 및/또는 생화학적 특징의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서 분자 백본의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는데 대한 그들의 효과가 유의하게 상이한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에서의 치환을 생성함으로써 달성할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향이 거의 또는 전혀 없는 비천연 잔기를 사용하는 천연 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다 (표 5 참조). 또한, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 대해 이전에 설명된 바와 같이 알라닌으로 치환될 수 있다.
대상 항체의 아미노산 치환 (보존적이든 비-보존적이든)은 일상적인 기술을 적용하여 당업자가 실시할 수 있다. 아미노산 치환은 본원에서 제공되는 항체의 중요한 잔기를 확인하기 위해, 또는 인간 GM-CSF에 대한 이들 항체의 친화도를 증가 또는 감소시키기 위해, 또는 본원에서 설명되는 다른 항원 결합 단백질의 결합 친화도를 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
E. 항원 결합 단백질의 발현 방법
적어도 하나의 상기 설명되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 (cassette) 형태의 발현 시스템 및 구성체, 및 또한 상기 발현 시스템 또는 구성체를 포함하는 숙주 세포를 또한 본원에서 제공한다.
본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 항원 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하는 재조합 발현 시스템에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980)]; 및 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)]을 참조한다.
항원 결합 단백질은 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 특히 항체는 하이브리도마에서 발현될 수 있다) 또는 하이브리도마 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 항체를 코딩하는 발현 구성체를 사용하여 포유동물, 곤충 또는 미생물 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환은 예를 들어 바이러스 또는 박테리오파지 내로 폴리뉴클레오티드의 패키징 (packaging) 및 미국 특허 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461; 4,959,455에 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 형질감염 절차에 의한 구성체를 사용한 숙주 세포의 형질도입을 포함하는, 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 사용되는 최적 형질전환 절차는 형질전환시킬 숙주 세포의 종류에 따라 결정될 것이다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀 내 봉입 (encapsulation), 핵산과 양 전하를 띈 지질의 혼합, 및 핵 내로 DNA의 직접 미세주사를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
재조합 발현 구성체는 대개 다음 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다: 본원에서 제공되는 하나 이상의 CDR; 경쇄 불변 구역; 경쇄 가변 구역; 중쇄 불변 구역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3); 및/또는 GM-CSF 항원 결합 단백질의 다른 스캐폴드 (scaffold) 부분. 이들 핵산 서열은 표준 라이게이션 (ligation) 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 한 실시태양에서, 중쇄 또는 경쇄 불변 구역은 항-GM-CSF-특이적 중쇄 또는 경쇄 가변 구역의 C-말단에 첨부되고, 발현 벡터 내로 라이게이팅된다. 벡터는 일반적으로 사용되는 특정 숙주 세포 내에서 기능성이 되도록 선택된다 (즉, 벡터는 숙주 세포 기구에 적합성이어서, 유전자의 증폭 및/또는 발현이 일어날 수 있도록 허용한다). 일부 실시태양에서, 단백질 리포터, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제를 사용하는 단백질-단편 상보성 분석을 이용하는 벡터가 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 6,270,964 참조). 적합한 발현 벡터는 예를 들어 인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (Invitrogen Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스바드)) 또는 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산호세)로부터 구입할 수 있다. 항체 및 단편을 클로닝하고 발현하기 위한 다른 유용한 벡터는 문헌 [Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44]에 기재되어 있는 것을 포함한다. 추가의 적합한 발현 벡터는 예를 들어 문헌 [Methods Enzymol., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press]에 논의되어 있다.
일반적으로, 임의의 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지를 위한 및 외인성 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유할 것이다. 특정 실시태양에서, 상기 서열 ("측면에 위치하는 (flanking) 서열"로서 총칭함)은 일반적으로 다음 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여 및 수용 스플라이스 부위를 함유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩티드 분비를 위한 리더 서열을 코딩하는 서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현시킬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 구역, 및 선택가능한 마커 요소.
임의로, 벡터는 "태그 (tag)"-코딩 서열, 즉, GM-CSF 항원 결합 단백질 코딩 서열의 5' 또는 3'에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자; 폴리His (예를 들어 헥사His)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열, 또는 또다른 "태그", 예를 들어 FLAG®, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 myc (그에 대한 상업상 이용가능한 항체가 존재한다)를 함유할 수 있다. 상기 태그는 폴리펩티드의 발현 시에 일반적으로 폴리펩티드에 융합되고, 숙주 세포로부터 GM-CSF 항원 결합 단백질의 친화도 정제 또는 검출을 위한 수단으로서 역할을 할 수 있다. 친화도 정제는 예를 들어, 친화도 매트릭스로서 태그에 대한 항체를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 달성할 수 있다. 임의로, 태그는 정제된 GM-CSF 항원 결합 단백질로부터 절단을 위해 특정 펩티다제를 사용하는 것과 같은 다양한 수단에 의해 후속적으로 제거될 수 있다.
측면에 위치하는 서열은 상동성 (즉, 숙주 세포로서 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종성 (즉, 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터), 하이브리드 (즉, 하나 초과의 공급원으로부터의 측면에 위치하는 서열들의 조합물), 합성 또는 천연일 수 있다. 따라서, 측면에 위치하는 서열의 공급원은 측면에 위치하는 서열이 숙주 세포 기구 내에서 기능성이고 그에 의해 활성화될 수 있다면 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있다.
벡터에서 유용한 측면에 위치하는 서열은 당업계에 잘 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 얻을 수 있다. 일반적으로, 본원에서 유용한 측면에 위치하는 서열은 이전에 매핑 (mapping)에 의해 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 확인되었고, 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적합한 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에, 측면에 위치하는 서열의 전체 뉴클레오티드 서열은 알려질 수 있다. 여기서, 측면에 위치하는 서열은 핵산 합성 또는 클로닝에 대해 본원에서 설명되는 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
측면에 위치하는 서열의 전부가 알려져 있거나 그 일부만이 알려져 있거나 상관없이, 서열은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용함으로써, 및/또는 동일한 또는 다른 종으로부터의 올리고뉴클레오티드 및/또는 측면에 위치하는 서열 단편과 같은 적합한 프로브를 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 측면에 위치하는 서열이 알려져 있지 않으면, 측면에 위치하는 서열을 함유하는 DNA의 단편은 예를 들어, 코딩 서열 또는 심지어 다른 유전자(들)을 함유할 수 있는 보다 큰 조각의 DNA로부터 단리될 수 있다. 단리는 적합한 DNA 단편을 생산하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 소화에 이어, 아가로스 겔 정제, Qiagen® 컬럼 크로마토그래피 (퀴아젠 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 채스워쓰)), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하는 단리에 의해 달성할 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위해 적합한 효소의 선택은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
복제 기점은 일반적으로 상업적으로 구입한 원핵생물 발현 벡터의 일부이고, 숙주 세포 내에서 벡터의 증폭을 돕는다. 선택되는 벡터가 복제 기점 부위를 함유하지 않으면, 공지의 서열에 기초하여 합성하여 벡터 내로 라이게이팅할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점 (뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 베벌리))이 대부분의 그람-음성 세균에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 유두종 바이러스, 예를 들어 HPV 또는 BPV)이 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 요구되지 않는다 (예를 들어, SV40 기점이 또한 바이러스 조기 프로모터를 함유하기 때문에 종종 사용된다).
전사 종결 서열은 대개 폴리펩티드 코딩 구역의 3' 단부에 위치하고, 전사를 종결시키는 역할을 한다. 대체로, 원핵생물 세포에서 전사 종결 서열은 G-C 풍부 단편에 이어진 폴리-T 서열이다. 서열은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되지만, 또한 본원에서 설명되는 방법과 같은 핵산 합성 방법을 이용하여 쉽게 합성될 수 있다.
선택가능한 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장하는 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵생물 숙주 세포에 대해 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나; (c) 복합 또는 규정된 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다. 특이적 선택가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 네오마이신 내성 유전자가 또한 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포 모두에서 선택을 위해 사용될 수 있다.
다른 선택가능한 유전자가 발현될 유전자를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존을 위해 중요한 단백질의 생산을 위해 요구되는 유전자가 재조합 세포의 후속 세대의 염색체 내에서 직렬로 (in tandem) 반복되는 과정이다. 포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 프로모터 미함유 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 단지 형질전환체가 벡터 내에 존재하는 선택가능한 유전자로 인해 생존하도록 특유하게 적응되는 선택 압력 하에 놓인다. 선택 압력은 형질전환된 세포를 배지 내의 선택제의 농도를 연속적으로 증가시켜, 선택가능한 유전자, 및 다른 유전자, 예를 들어 GM-CSF 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 단백질을 코딩하는 DNA 둘 모두의 증폭을 일으키는 조건 하에 배양함으로써 부여된다. 그 결과, 증폭된 DNA로부터 증가하는 양의 폴리펩티드, 예를 들어 항원 결합 단백질이 합성된다.
리보좀-결합 부위는 대체로 rnRNA의 번역 개시에 필요하고, 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 (원핵생물) 또는 코작 (Kozak) 서열 (진핵생물)을 특징으로 한다. 상기 요소는 대개 프로모터에 대해 3' 및 발현시킬 폴리펩티드의 코딩 서열에 대해 5'에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포 발현 시스템에서 글리코실화가 요망되는 경우와 같은 일부 경우에, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프레 (pre)- 또는 프로 (pro)-서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩티드의 펩티다제 절단 부위를 변경하거나, 프로서열을 부가할 수 있고, 이는 또한 글리코실화에 영향을 미칠 수 있다. 최종 단백질 생성물은 -1 위치 (성숙 단백질의 제1 아미노산에 비해)에서 발현에 부수적인 하나 이상의 추가의 아미노산을 가질 수 있고, 이는 완전히 제거되지 않을 수 있다. 예를 들어, 최종 단백질 생성물은 아미노-말단에 부착된, 펩티다제 절단 부위에서 발견되는 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 별법으로, 일부 효소 절단 부위를 사용하여, 효소가 성숙 폴리펩티드 내에서 상기 영역에서 절단하면 약간 말단절단된 형태의 목적하는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
발현 및 클로닝은 대개 숙주 유기체에 의해 인식되고 GM-CSF 항원 결합 단백질을 코딩하는 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 제어하는, 구조 유전자의 출발 코돈에 대해 상류 (즉, 5')에 위치하는 비전사된 서열이다 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 범위 내). 프로모터는 통상적으로 2개의 클래스, 즉, 유도가능 프로모터 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들어 영양물질의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 그 반면에, 구성적 프로모터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자를 균일하게 전사하고, 즉, 유전자 발현에 대한 제어가 거의 또는 전혀 없다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 공지되어 있다. 적합한 프로모터는 프로모터를 공급원 DNA로부터 제한 효소 소화에 의해 제거하고 목적하는 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써, GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다. 포유동물 숙주 세포에 사용하기 적합한 프로모터는 잘 공지되어 있고, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 열 충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
중요할 수 있는 추가의 프로모터는 SV40 조기 프로모터 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310): CMV 프로모터 (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체 내에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 메탈로티오닌 유전자의 프로모터 및 조절 서열 (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 원핵생물 프로모터, 예를 들어 베타-락타마제 프로모터 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 조직 특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 이용되는, 다음 동물 전사 제어 구역이 또한 중요하다: 췌장 선방 (acinar) 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 구역 ([Swift et al., 1984, Cell 38:639-646]; [Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409]; [MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515]); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 구역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 구역 ([Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658]; [Adames et al., 1985, Nature 318:533-538]: [Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444]); 고환, 유방, 림프양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 구역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 구역 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 구역 ([Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648]; [Hammer et al., 1987, Science 253:53-58]); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 구역 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 구역 ([Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340]: [Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94]); 뇌의 희소돌기아교 세포에서 활성인 미엘린 염기 단백질 유전자 제어 구역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 구역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 제어 구역 (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
보다 고등한 진핵생물에 의한 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터 내로 삽입될 수 있다. 인핸서는 DNA의 전사를 증가시키도록 프로모터에 대해 작용하는 대체로 약 10-300 bp 길이의 시스 작용 (cis-acting) 요소이다. 인핸서는 전사 단위에 대해 5' 및 3' 모두의 위치에서 발견된, 비교적 배향 및 위치 비의존적이다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 몇몇 인핸서 서열이 공지되어 있다 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 대개, 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 당업계에 공지된 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 증진 요소이다. 인핸서는 벡터 내에 코딩 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있지만, 대개 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다. 적절한 천연 또는 이종성 신호 서열 (리더 서열 또는 신호 펩티드)을 코딩하는 서열이 항체의 세포외 분비를 촉진하기 위해 발현 벡터 내로 포함될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 항체를 생산시킬 숙주 세포의 종류에 따라 결정되고, 이종성 신호 서열은 천연 신호 서열을 교체할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 기능성인 신호 펩티드의 예는 다음의 것을 포함한다: 미국 특허 4,965,195에 기재된 인터류킨-7 (IL-7)에 대한 신호 서열; 문헌 [Cosman et al., 1984, Nature 312:768]에 기재된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 0367 566에 기재된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; 미국 특허 4,968,607에 기재된 타입 I 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; EP 특허 0 460 846에 기재된 타입 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드.
제공되는 발현 벡터는 상업상 이용가능한 벡터와 같은 출발 벡터로부터 구성될 수 있다. 그러한 벡터는 목적하는 측면에 위치하는 서열을 모두 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 하나 이상의 본원에서 설명되는 측면에 위치하는 서열이 벡터 내에 이미 존재하지 않는 경우에, 이들을 개별적으로 수득하여 벡터 내로 라이게이팅할 수 있다. 각각의 측면에 위치하는 서열을 수득하기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
벡터를 구성하고, GM-CSF 항원 결합 서열을 포함하는 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터의 적합한 부위 내로 삽입한 후, 완성된 벡터를 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적합한 숙주 세포 내에 삽입할 수 있다. 선택된 숙주 세포 내로 항원 결합 단백질을 위한 발현 벡터를 형질전환시키는 것은 형질감염, 감염, 인산칼슘 동시-침전, 전기천공, 미세주사, 리포펙션 (lipofection), DEAE-덱스트란 매개 형질감염을 포함하는 잘 공지된 방법 또는 다른 공지의 기술에 의해 달성할 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용할 숙주 세포의 종류의 함수일 것이다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법이 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2001, 상기 문헌]에 기재되어 있다.
숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양될 때 항원 결합 단백질을 합성하고, 이는 후속적으로 배양 배지로부터 (숙주 세포가 이를 배지 내로 분비하는 경우) 또는 그를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 (분비되지 않는 경우) 수집할 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 목적하는 발현 수준, 활성을 위해 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형 (예를 들어 글리코실화 또는 인산화), 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩의 용이함과 같은 다양한 인자에 따라 좌우될 것이다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 공지되어 있고, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 많은 다른 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 이용가능한 불멸화 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 세포주는 어떠한 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 GM-CSF 결합 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 구성적으로 생산하는지 결정하여 선택될 수 있다. 다른 실시태양에서, 그 자신의 항체를 제조하지 않지만 이종성 항체를 제조하고 분비하는 능력이 있는 B 세포 계열로부터의 세포주를 선택할 수 있다.
F. 진단 및 치료 목적을 위한 인간 GM - CSF 항원 결합 단백질의 용도
항원 결합 단백질은 생물학적 샘플 내에서 GM-CSF를 검출하기 위해, 및 GM-CSF를 생산하는 세포 또는 조직을 확인하기 위해 유용하다. GM-CSF에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 치료를 필요로 하는 환자에서 GM-CSF에 관련된 질병의 치료에 사용될 수 있다. 일례로서, GM-CSF 항원 결합 단백질은 진단 분석, 예를 들어, 조직 또는 세포 내에서 발현된 GM-CSF를 검출하고/하거나 정량하기 위해 결합 분석에서 사용될 수 있다. 또한, GM-CSF 항원 결합 단백질은 GM-CSF가 그의 수용체와 복합체를 형성하는 것을 억제하여, 세포 또는 조직 내에서 GM-CSF의 생물학적 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, GM-CSF에 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 결합 화합물과의 상호작용을 조정하고/하거나 차단할 수 있고, 따라서 GM-CSF에 관련된 질병을 개선하는데 있어서 치료 용도를 가질 수 있다.
1. 적응증
본 발명은 또한 본원에서 개시되는 각각의 의학적 질환의 예방 또는 치료적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서 GM-CSF 억제제 (개시되는), 예를 들어 GM-CSF 항체의 용도에 관한 것이다. GM-CSF 억제제는 과도한 GM-CSF가 근원적인 질병 또는 질환에 기여하는데 일정 역할을 하거나 달리 부정적인 증상에 기여하는 다양한 병태를 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 실시태양은 다양한 류마티스 질환을 치료 또는 예방하기 위해 개시된 GM-CSF 억제제, 특히 GM-CSF 항체, 조성물 또는 조합 요법을 사용하는 방법을 포함한다. 이들 질환은 성인 및 연소성 류마티스 관절염; 공피증; 전신 홍반성 루푸스; 통풍; 골관절염; 류마티스성 다발성 근육통; 혈청 음성 척추 병변, 예를 들어 강직 척추염, 및 라이터 (Reiter) 질병을 포함한다. 본 발명의 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 건선성 관절염 및 만성 라임 (Lyme) 관절염을 치료하기 위해 또한 사용된다. 스틸 (Still) 병 및 류마티스 관절염과 연관된 포도막염이 또한 이들 화합물, 조성물 및 조합 요법으로 치료가능하거나 예방가능하다. 또한, 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법은 수의근 및 다른 근육의 염증, 예를 들어 피부근육염, 봉입체 근육염, 다발근육염, 및 림프관평활근종증을 일으키는 질환의 치료에 사용된다.
본 발명은 뼈 및 관절의 비-관절염성 의학적 병태의 치료를 위한 GM-CSF 억제제, 예를 들어 GM-CSF 항체, 조성물 및 조합 요법 (예를 들어 GM-CSF 억제제 및 TNF 억제제, 예를 들어 ENBREL® (에타네르셉트) 또는 다른 활성 물질)을 제공한다. 이는 뼈 손실을 일으키는 파골세포 질환, 예를 들어 비제한적으로 골다공증, 예를 들어 폐경후 골다공증, 골관절염, 치아의 느슨함 또는 손실을 일으키는 치주염, 및 관절 치환술 후의 보철물 해리 (prosthesis loosening) (일반적으로 마모분 (wear debris)에 대한 염증 반응과 연관됨)를 포함한다. 후자의 병태는 "정형외과용 삽입물에 의한 골용해 (orthopedic implant osteolysis)"로도 불린다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법으로 치료가능한 다른 병태는 측두하악관절 장애 (TMJ)이다.
개시된 GM-CSF 억제제 조성물 및 조합 요법으로 치료가능한 다양한 다른 의학적 질환은 다발 경화증; 베체트 (Behcet) 증후군; 쇼그렌 (Sjogren) 증후군; 자가면역성 용혈 빈혈; 베타 지중해빈혈 (thalassemia); 근위축성 측삭 경화증 (루 게릭 (Lou Gehrig) 병); 파킨슨 (Parkinson) 병; 및 원인 불명의 건초염 (tenosynovitis)뿐만 아니라, x-염색체 연관 정신 지체를 포함한, 유전성 결핍증과 연관된 다양한 자가면역 질환 또는 질병을 포함한다.
내분비계의 다양한 질환을 치료하기 위해 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법을 사용하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, TNF 억제제 (예를 들어, ENBREL) 또는 상기 기재되는 다른 활성 물질을 사용하거나 사용하지 않는 GM-CSF 억제제 조성물 또는 다른 GM-CSF 억제제 조성물은 소아 발병 당뇨병 (자가면역 당뇨병 및 인슐린-의존형 당뇨병 포함)을 치료하기 위해 및 또한 성인 발병 당뇨병 (인슐린 비의존성 및 비만-매개 당뇨병 포함)을 치료하기 위해 사용하기에 적합하다. 또한, 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법은 당뇨병과 연관된 2차 병태, 예를 들어 당뇨 망막병증, 당뇨 환자에서 신장 이식 거부, 비만-매개 인슐린 내성, 및 그 자체가 단백뇨 및 고혈압과 연관될 수 있는 신부전증을 치료하기 위해 사용된다. 다낭성 난소 질병, X-염색체 연관 부신백질이영양증, 갑상선기능저하증 및 갑상선염, 예를 들어 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염 (즉, 자가면역성 갑상선염)을 포함하는 다른 내분비 질환이 또한 이들 화합물, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능하다. 또한, GM-CSF 억제제를 단독으로 또는 다른 시토킨, 예를 들어 ENBREL과 같은 TNF 억제제와 조합으로 포함한 GM-CSF 억제제가 정상갑상선기능 질환 증후군을 포함한 갑상선 세포 기능이상과 연관된 의학적 병태를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
복강 질병을 포함하는 위장관계의 병태가 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능하거나 예방가능하다. 예를 들어, TNF 억제제 (예를 들어, ENBREL) 또는 상기 기재되는 다른 활성 물질을 사용하거나 사용하지 않는 GM-CSF 억제제 조성물은 복강 질병을 치료 또는 예방하기 위해 적합하다. 또한, 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법은 크론 (Crohn) 병; 궤양성 대장염; 특발성 위마비; 췌장염, 예를 들어 만성 췌장염; 급성 췌장염, 염증성 장 질병 및 궤양, 예를 들어 위 및 십이지장 궤양의 치료 또는 예방에 적합하다.
위비뇨기계의 질환을 치료하기 위해 본 발명의 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법을 사용하는 방법이 또한 포함된다. 예를 들어, GM-CSF 억제제 조성물은 단독으로 또는 IL-1 (예를 들어, Kineret® (아나킨라)) 또는 TNF 억제제 (예를 들어, ENBREL) 또는 상기 설명되는 다른 활성 물질과 조합으로 사구체신염, 예를 들어 자가면역 사구체신염, 독소에의 노출로 인한 사구체신염, 또는 용혈성 연쇄구균 또는 다른 감염성 물질에의 감염에 2차적인 사구체신염을 치료 또는 예방하기 위해 적합하다. 요독 증후군 및 그의 임상 합병증 (예를 들어, 신부전증, 빈혈, 및 비대 심근병증), 예를 들어 환경 독소, 약물 또는 다른 원인에의 노출과 연관된 요독 증후군이 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법으로 또한 치료가능하다. GM-CSF 억제제, 특히 GM-CSF 항체는 단독으로 또는 TNF 억제제, 특히 ENBREL과의 조합으로 흡수 기능의 변경을 일으키는 담낭벽의 염증에서 기인하는 합병증을 치료하고 예방하는데 유용하다. 그러한 합병증에는 담석증 (담석) 및 총담관결석증 (담관결석), 및 담석증 및 총담관결석증의 재발이 포함된다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법으로 치료가능한 추가의 병태에는 혈액투석의 합병증; 전립선 병태, 예를 들어 양성 전립선 비대, 비세균성 전립선염 및 만성 전립선염; 및 혈액투석의 합병증이 있다.
다양한 혈액 및 종양 질환을 치료하기 위해 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법을 사용하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 예를 들어, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 GM-CSF 억제제, TNF 억제제 (예를 들어, ENBREL) 또는 상기 설명된 바와 같은 다른 활성 물질과 조합으로 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스-양성 비인두 암종, 신경아교종, 결장암, 위암, 전립선암, 신장 세포암, 자궁경부암 및 난소암, 폐암 (SCLC 및 NSCLC), 예를 들어 암-연관 악액질, 피로, 무력증, 악액질의 부신생물 증후군 및 고칼슘혈증을 포함한 다양한 형태의 암과 연관된 증상을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능한 추가의 질병에는 고형 종양, 예를 들어 육종, 골육종, 및 암종, 예를 들어 선암종 (예를 들어, 유방암) 및 편평 세포 암종이 있다. 또한, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 조합 요법은 식도암, 위암, 담낭 암종, 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 만성 또는 급성 림프모구성 백혈병 및 모발상 세포 백혈병을 치료하기 위해 유용하다. 침습성 전이 가능성이 있는 다른 악성 종양, 예를 들어 다발 골수종은 본 발명의 화합물, 조성물 및 조합 요법, 및 특히 GM-CSF 억제제 및 가용형 TNF 수용체 (예를 들어, ENBREL)를 포함하는 조합 요법으로 치료할 수 있다. 또한, 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 빈혈 및 혈액 질환, 예를 들어 만성 특발성 호중구감소증, 만성 질병의 빈혈, 재생불량 빈혈, 예를 들어 판코니 (Fanconi) 재생불량 빈혈; 특발성 혈소판감소 자색반 (ITP); 혈전성 혈소판감소 자색반, 골수이형성 증후군 (예를 들어, 불응성 빈혈, 환상 철모구 불응성 빈혈, 과다 모세포 불응성 빈혈, 변형 중 과다 모세포 불응성 빈혈); 골수섬유증/골수성 화생; 및 겸상적혈구성 혈관폐색 위기를 치료하기 위해 사용할 수 있다.
다양한 림프세포 증식성 질환이 또한 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능하다. GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 TNF 억제제, 예를 들어 ENBREL, 또는 다른 활성 물질과 조합으로 자가면역 림프세포 증식 증후군 (ALPS), 만성 림프모구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 말초 T-세포 림프종, 소림프구성 림프종, 외투세포 림프종, 소포 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종, 엡스타인-바 바이러스-양성 T 세포 림프종, 조직구 림프종, 호지킨 (Hodgkin) 병, 미만성 고등급 림프종, 급성 림프성 백혈병, T 감마 림프세포 증식 질병, 피부 B 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종 (즉, 균상 식육종) 및 세자리 (Sezary) 증후군을 치료 또는 예방하기 위해 유용하다.
또한, 본 발명의 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 유전성 병태를 치료하기 위해 사용된다. 특히, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 TNF 억제제, 예를 들어 ENBREL과 조합으로 고셔 (Gaucher) 병, 헌팅턴 (Huntington) 병, 선상 IgA 질병, 및 근위축증과 같은 질병을 치료하기 위해 유용하다.
개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법에 의해 치료가능하거나 예방가능한 다른 병태는 두부 외상으로 인한 경막하혈종을 포함한, 두부 또는 척수 손상에서 발생하는 병태를 포함한다. 예를 들어, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 TNF 억제제, 예를 들어 ENBREL과 조합으로 두부 손상 및 척수 손상을 치료하는데 유용하다. 상기 요법과 연관하여, 설명되는 조성물 및 조합물은 두개 신경계 손상을 예방하고 경추성 두통을 예방 및 치료하기 위해 적합하다. 설명되는 조성물 및 조합물은 뇌 방사선 조사와 연관된 신경계 부작용을 치료하기 위해 추가로 적합하다.
개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 간 질환을 치료하기 위해 추가로 사용된다. 예를 들어, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 TNF 억제제, 예를 들어 ENBREL 또는 다른 활성 물질과 조합으로 간염, 예를 들어 급성 알콜성 간염, 급성 약물-유도성 또는 바이러스성 A형, B형 및 C형 간염, 경화성 담관염 및 원인 불명의 간염을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 간염과 연관하여, GM-CSF 억제제는 간 동모양혈관 상피의 치료에도 유용하다.
또한, 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 난청을 수반하고 비정상적 IL-1 발현과 연관되는 다양한 질환을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들어, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 TNF 억제제와 조합으로 자가면역 과정에서 기인하는 것으로 생각되는 달팽이 신경-연관 난청, 즉, 자가면역 난청을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 상기 병태는 현재 스테로이드, 메토트렉세이트 및/또는 시클로포스파미드로 치료되고 있다. 또한, 메니에르 (Meniere) 증후군 및 진주종, 종종 난청과 관련된 중이 질환도 또한 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법으로 치료가능하거나 예방가능하다.
또한, 이식과 연관된 질환이 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능하거나 예방가능하다. 그러한 질환은 이식편 대 숙주 질병, 및 고형 장기 이식, 예를 들어 심장, 간, 피부, 신장, 폐 (폐 이식물 기도 폐색) 또는 다른 이식물, 예를 들어 골수 이식물에 기인하는 합병증을 포함한다.
열공성 망막 박리, 및 염증성 눈병, 예를 들어 흡연과 연관된 염증성 눈병 및 황반 변성을 포함하는 안 질환도 또한 개시된 GM-CSF 억제제, 특히 GM-CSF 항체, 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능하거나 예방가능하다.
GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 또한 여성 생식계에 영향을 미치는 질환의 치료에도 유용하다. 그 예는 다발성 임플란트 실패/불임증; 태아 손실 증후군 또는 IV 배아 손실 (자연 유산); 자간전 임신 또는 자간증; 자궁내막증, 만성 자궁경관염, 및 조기 진통을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또한, 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 좌골신경통, 노화 증상, 극심한 약물 반응 (예를 들어, 11-2 독성 또는 블레오마이신-유도된 폐병증 및 섬유증)을 치료 또는 예방하기 위해, 또는 심장 수술 또는 다른 수술에서 동종이형 적혈구의 주입 전, 동안 또는 후에 염증 반응을 억제하기 위해, 또는 사지 또는 관절에 대한 외상성 손상, 예를 들어 외상성 무릎 손상을 치료하는데 유용하다.
개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 중추 신경계에서 염증의 자극 동안 방출되는 신경독성 신경전달물질의 효과를 포함한 중추 신경계 (CNS) 손상을 치료하기 위해, 및 중추 신경계 손상의 부위에서 신경교 반흔의 발달을 억제 또는 예방하기 위해 유용하다. 중추 신경계 의학 병태와 연관하여, GM-CSF 억제제는 측두엽 간질의 치료에 유용하다. 간질 및 발작의 치료, 재발성 발작의 심도 및 수의 감소, 및 발작의 유해한 효과의 심도 감소와 연관하여, GM-CSF 억제제는 단독으로 또는 본원에서 설명되는 물질과 조합으로 뉴런 손실, 뉴런 퇴행, 및 발작과 연관된 신경교증을 감소시키기 위해 유용하다.
또한, 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 위독한 병 다발 신경병증 및 근병증 (CIPNM) 급성 다발 신경병증; 신경성 식욕부진; 벨 (Bell) 마비; 만성 피로 증후군; 전파성 치매, 예를 들어 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Jacob) 병; 탈수초성 신경병증; 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군; 추간판 질환; 걸프전 (Gulf war) 증후군; 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증, 중증 근무력증; 무증상성 뇌 허혈; 수면 질환, 예를 들어 기면증 및 수면 무호흡; 만성 뉴런 퇴행; 및 뇌졸중, 예를 들어 뇌 허혈 질병을 치료하기 위해 유용하다.
GM-CSF 억제제를 단독으로 또는 본원에 설명되는 활성 물질과 단독으로 투여하여 치료 또는 예방할 수 있는 다른 질병 및 의학적 병태는 식욕부진 및/또는 무식욕 병태, 복막염, 내독소혈증 및 패혈성 쇼크, 육아종 형성, 열사병, 척-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군, 결핵 및 나병과 같은 급성 감염 후의 만성 염증, 전신 경화증 및 비대 흉터형성을 포함한다. 또한, GM-CSF 억제제는 IL-1 억제제, TNF 억제제, IFN-알파, -베타 또는 -감마 및/또는 IL-4 억제제와 조합으로 비대 흉터형성의 치료에 적합하다.
본원에서 개시되는 GM-CSF 억제제는 항체 요법, 화학요법, 방사선 요법 및 다른 세포자멸 유도 물질, 예를 들어 TRAIL 및 TRADE의 효과와 연관된 독성을 감소시키기 위해 유용하다.
인간 환자에게 치료 유효량의 GM-CSF 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 건선성 병변을 치료 또는 예방하는 방법을 본원에서 제공한다. 치료는 보통 건선 또는 건선성 관절염의 환자에서 발생하는 건선성 병변에 효과적이다.
GM-CSF 억제제에 의해 효과적으로 치료되는 병태는 염증 반응에서 일정 역할을 한다. 폐 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐병, 폐포 단백증, 블레오마이신-유도된 폐병증 및 섬유증, 방사선 조사-유도된 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 폐 내의 콜라겐 축적, 및 ARDS를 포함한다. GM-CSF 억제제는 다양한 피부 질환, 예를 들어 비제한적으로 피부염, 포진상 피부염 (듀링 (Duhring)병), 아토피 피부염, 접촉 피부염, 두드러기 (만성 특발성 두드러기 포함), 및 자가면역 수포성 질병, 예를 들어 심상성 천포창 및 수포성 유천포창에 걸린 환자의 치료에 유용하다. GM-CSF 억제제의 조합물로 치료가능한 다른 질병은 중증 근무력증, 사르코이드증, 예를 들어 폐 사르코이드증, 공피증, 반응성 관절염, 고IgE 증후군, 다발 경화증 및 특발성 과다호산구 증후군을 포함한다. 본 발명의 치료제는 의약에 대한 알레르기 반응을 치료하기 위해 및 알레르기 면역요법에 어주번트로서 또한 유용하다.
한 실시태양에서, GM-CSF 억제제 조성물은 신경계의 퇴행성 병태, 예를 들어 다발 경화증, 재발 완화형 다발 경화증, 진행-재발 다발 경화증, 1차 및 2차-진행 다발 경화증의 치료에 유용하다. GM-CSF를 표적화하는 것은 다발 경화증의 전임상 모델에서 효과적이고, 다발 경화증에서 GM-CSF 경로에서 치료적 개입은 적응 면역을 아끼면서 단핵구, 대식세포 및 가지 세포에 대한 직접 효과를 통해 CNS 염증을 감소시킬 수 있다. GM-CSF 녹 아웃 (knock out) 마우스는 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 유도에 내성이다 (McQualter, et al., 2001, J. Exp. Med. 194:873-881). GM-CSF를 발현하는, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 T 세포의 입양 전이는 악화된 EAE를 유도한다 (Marusic et al., 2002, Neurosci. Lett. 332:185-9). GM-CSF 녹 아웃 T 세포의 입양 전이는 EAE를 유도하지 못한다 (Ponomarev et al., 2007, J. Immunol., 178:39-48). 본 발명자들은 재발 완화형 다발 경화증의 SJL-PLP139 -151 EAE 모델에서 항-뮤린 GM-CSF 항체를 사용하는 예방적 처치가 이소형 대조 모노클로날 항체를 사용한 처치에 비해 발병을 유의하게 지연시키고, 질병의 발생률을 감소시키고, 체중 손실 및 평균 임상 스코어를 모두 감소시켰음을 보여주었다 (도 1 및 2 참조). 항-mGM-CSF 모노클로날 항체를 사용한 SJL/PLP125-151 EAE의 치료적 치료는 질병 심도 및 CNS 염증을 유의하게 감소시키고, 회복을 가속시켰다. SJL-PLP139-151 AT-EAE에서 항-mGM-CSF 모노클로날 항체를 사용한 예방적 및 치료적 처치는 이소형 대조 모노클로날 항체를 사용한 처치에 비해 평균 임상 스코어를 감소시켰다 (도 2 참조). GM-CSF 억제제 조성물은 단독으로 또는 다른 약물, 예를 들어 인터페론 β-1a (AVONEX®; 바이오젠-아이덱 (Biogen-Idec) 및 REBIF® (이디엠 세레노, 인크. (EDM Serono, Inc.), 화이자, 인크. (Pfizer, Inc.)), 인터페론 β-1b (BETASERON®; 바이엘 헬쓰 케어 (Bayer Health Care)), 글라티라머 아세테이트 (COPAXONE®; 테바 파마슈티칼스 (Teva Pharmaceuticals)) 및/또는 항-VLA4 mAb (TYSABRI®, 바이오젠-아이덱, 엘란 (Elan))과 조합으로 사용할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, GM-CSF 억제제 (예를 들어, GM-CSF 항체)로 치료가능한 것으로 본원에 개시되는 다양한 의학적 질환은 다른 시토킨 또는 시토킨 억제제와 조합으로 치료된다. 예를 들어, GM-CSF 억제제는 다른 염증성 시토킨과 그들의 수용체의 상호작용을 억제하는 화합물을 또한 함유하는 조성물로 투여할 수 있다. GM-CSF 억제제 및 다른 시토킨 억제제는 별개의 조성물로서 투여될 수 있고, 동일하거나 상이한 경로로 투여될 수 있다. GM-CSF 억제제와 조합으로 사용되는 시토킨 억제제의 예는 예를 들어, TGF-베타, IFN-감마, IL-6 또는 IL-8 및 TNF, 특히 TNF-알파를 길항하는 것을 포함한다. GM-CSF 억제제 및 IL-6의 조합은 GABA-A 수용체 길항작용에 의해 유도된 발작, EEG 발작 에피소드와 연관된 발작, 및 간질 지속상태 동안 일어나는 운동성 변연 발작을 포함한 발작의 재발을 치료 및 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, GM-CSF 억제제 및 IFN-감마-1b 및/또는 c-Kit 억제제의 조합은 특발성 폐 섬유증 및 낭성 섬유증의 치료에 유용하다. 질병 치료를 위한 다른 조합은 GM-CSF 억제제를, RANK 및 RANK-리간드의 결합을 저해하는 화합물, 예를 들어 RANK-리간드 억제제, 또는 가용형 형태의 RANK, 예를 들어 RANK:Fc와 함께 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, GM-CSF 억제제 및 RANK:Fc의 조합은 다양한 류마티스 질환, 골다공증, 다발 골수종 또는 뼈 변성을 일으키는 다른 악성 종양, 또는 뼈로 전이를 방지하는 것을 목표로 하는 항-종양 요법, 또는 보철물 마모분 또는 치주염과 연관된 뼈 파괴를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 상황에서 뼈 파괴의 예방을 위해 유용하다.
본원에서 설명되는 개시된 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 세균, 바이러스 또는 원충 감염으로부터 발생하는 부작용 및/또는 합병증의 치료용 의약에서 유용하다. 상기 실시태양에 따르면, 감염이 면역계의 과다 자극을 촉발시켜 GM-CSF의 생산 및/또는 활성이 환자에게 부정적인 효과를 일으키면, 감염된 환자에서 GM-CSF 억제제를 사용한 치료는 감염, 또는 감염을 치료하기 위해 사용된 치료제와 연관된 이들 부작용 및/또는 합병증을 개선하기 위해 유용하다. 그러한 감염성 물질 및 감염의 비제한적인 예는 미코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumonia), AIDS 및 AIDS와 연관되고/되거나 AIDS에 관련된 병태, 예를 들어 AIDS 치매 복합증, AIDS 연관 소모, 항레트로바이러스 요법으로 인한 지방이영양증; CMV (사이토메갈로바이러스), 카포시 (Kaposi) 육종; 원충성 질병, 예를 들어 말라리아 및 주혈흡충증; 나병 결절 홍반; 세균성 또는 바이러스성 수막염; 결핵, 예를 들어 폐 결핵; 및 세균 또는 바이러스 감염에 2차적인 폐렴; 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis)에 의해 유발된 것과 같은 이 (louse)-매개성 재귀열; 헤르페스 바이러스, 예를 들어 헤르페스성 간질 각막염, 각막 병변; 및 바이러스-유도된 각막 질환; 인간 유두종 바이러스 감염; 인플루엔자 감염 및 감염성 단핵구증이다.
심혈관 질환 및 손상이 개시된 GM-CSF 억제제, 제약 조성물 또는 조합 요법으로 치료가능 및/또는 예방가능하다. 특히 심혈관 질환이 GM-CSF 억제제 조성물을 단독으로 또는 TNF 억제제 (예를 들어 ENBREL) 및/또는 상기 설명되는 다른 물질과 조합으로 사용하여 치료가능하다. 따라서, 치료가능한 심혈관 질환은 대동맥류; 예를 들어 복부 대동맥류, 급성 관상동맥 증후군, 동맥염; 혈관 폐쇄, 예를 들어 뇌 동맥 폐쇄; 관상동맥 우회로 (bypass) 수술의 합병증; 허혈/재관류 손상; 심장 질병, 예를 들어 죽상동맥경화성 심장 질병, 심근염, 예를 들어 만성 자가면역 심근염 및 바이러스성 심근염; 심부전증, 예를 들어 만성 심부전증, 울혈성 심부전증, 심부전증의 악액질; 심근 경색; 심장 수술 후 또는 목 동맥 풍선 혈관형성 절차 후 재협착 및/또는 죽상동맥경화증; 무증상 심근 허혈증; 좌심실 펌프 기능부전, 좌심실 보조 장치의 이식후 합병증; 레이노 (Raynaud) 현상; 혈전성 정맥염; 맥관염, 예를 들어 가와사끼 (Kawasaki) 맥관염; 정맥폐쇄병, 거대세포 동맥염, 베게너 (Wegener) 육아종증; 심폐 우회로 수술 후 정신착란, 및 쉔라인-헤노호 (Schoenlein-Henoch) 자반증을 포함한다. GM-CSF 억제제, TNF 억제제 및 혈관신생 억제제 (예를 들어 항-VEGF)의 조합은 대동맥류 및 종양과 같은 특정 심혈관 질병의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 GM-CSF 억제제, 조성물 및 조합 요법은 만성 통증 병태, 예를 들어 만성 골반 통증, 예를 들어 만성 전립선염/골반 통증 증후군을 치료하기 위해 사용된다. 추가의 예로서, 본 발명의 GM-CSF 억제제 및 조성물 및 조합 요법은 포진후 (post-herpetic) 통증을 치료하기 위해 사용된다.
인간 환자에 추가로, GM-CSF 억제제는 비-인간 동물, 예를 들어 애완동물 (개, 고양이, 새, 영장류 등), 가축 동물 (말, 소, 양, 새 등), 또는 IL-1-매개된 염증성 또는 관절염 병태에 걸린 임의의 동물의 치료에 유용하다. 그러한 경우에, 적절한 용량은 동물의 체중에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 0.2-1 mg/kg의 용량을 사용할 수 있다. 별법으로, 용량은 동물의 표면적에 따라 결정되고, 여기서 예시적인 용량은 0.1-20 mg/m2, 또는 보다 바람직하게는 5-12 mg/m2이다. 작은 동물, 예를 들어 개 또는 고양이의 경우에, 적합한 용량은 0.4 mg/kg이다. GM-CSF 억제제 (바람직하게는 수여체 종으로부터 유래된 유전자로부터 구성된), 또는 다른 가용성 IL-1 수용체 모방체는 동물의 병태가 개선될 때까지 주사 또는 다른 적합한 경로에 의해 매주 1회 이상 투여되거나, 무기한 투여될 수 있다.
2. 진단 방법
설명되는 항원 결합 단백질은 GM-CSF와 연관된 질병 및/또는 병태를 검출, 진단, 또는 모니터링하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다. 개시 내용은 당업자에게 공지된 전통적인 면역조직학적 방법을 이용하는 샘플 내의 GM-CSF의 존재의 검출을 제공한다 (예를 들어, [Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam)]; [Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.)]; [Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985]; [Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096]). GM-CSF의 검출은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행할 수 있다.
본원에서 제공되는 진단 용도는 GM-CSF의 발현 및 GM-CSF에 대한 리간드의 결합을 검출하기 위한 항원 결합 단백질의 사용을 포함한다. GM-CSF의 존재의 검출에서 유용한 방법의 예는 면역분석, 예를 들어 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA) 및 방사성 면역분석 (RIA)을 포함한다.
진단 용도를 위해, 항원 결합 단백질은 일반적으로 검출가능한 표지기로 표지될 것이다. 적합한 표지기는 다음의 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광기 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소기 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광기, 비오티닐기, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시태양에서, 표지기는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다.
개시된 한 측면은 GM-CSF를 발현하는 세포(들)을 확인하기 위한 것이다. 특정한 실시태양에서, 항원 결합 단백질을 표지기로 표지하고, GM-CSF에 대한 표지된 항원 결합 단백질의 결합을 검출한다. 추가의 특정 실시태양에서, GM-CSF에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 생체 내에서 검출한다. 추가의 특정한 실시태양에서, GM-CSF 항원 결합 단백질을 단리하고 당업계에 공지된 기술을 이용하여 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements)]; [John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons] 참조).
개시된 또다른 측면은 GM-CSF에 결합하기 위해 제공되는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 시험 분자의 존재를 검출하기 위한 것이다. 하나의 그러한 분석의 예는 시험 분자의 존재 또는 부재 하에 일정량의 GM-CSF를 함유하는 용액 내에서 유리 항원 결합 단백질의 양을 검출하는 것을 포함할 것이다. 유리 항원 결합 단백질 (즉, GM-CSF에 결합되지 않은 항원 결합 단백질)의 양 증가는 시험 분자가 GM-CSF 결합에 대해 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있음을 나타낼 것이다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질을 표지기로 표지한다. 별법으로, 시험 분자를 표지하고, 유리 시험 분자의 양을 항원 결합 단백질의 존재 및 부재 하에 모니터링한다.
3. 치료 방법: 제약 제형, 투여 경로
항원 결합 단백질의 사용 방법을 또한 제공한다. 일부 방법에서, 항원 결합 단백질을 환자에게 제공한다. 항원 결합 단백질은 인간 GM-CSF에 대한 GM-CSFR의 결합을 억제한다. 일부 방법에서 항원 결합 단백질의 투여는 또한 인간 GM-CSF에 대한 GM-CSFR의 결합을 억제함으로써 인간 GM-CSF의 자동인산화를 또한 억제할 수 있다. 또한, 특정 방법에서, 유효량의 적어도 하나의 항원 결합 단백질을 환자에게 투여함으로써 단핵구 화학주성이 감소된다. 일부 방법에서, 유효량의 항원 결합 단백질을 투여함으로써 종양 내로 단핵구 이동이 억제된다. 또한, 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질을 투여함으로써 종양 내의 종양 연관 대식세포의 축적이 억제될 수 있다.
치료 유효량의 하나 또는 다수의 항원 결합 단백질 및 제약상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제, 및/또는 어주번트를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 또한, 그러한 제약 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 용어 "환자"는 인간 환자를 포함한다.
허용되는 제형화 물질은 사용된 용량 및 농도에서 수여자에 대해 무독성이다. 특정 실시태양에서, 치료 유효량의 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시태양에서, 허용되는 제형화 물질은 바람직하게는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에 대해 무독성이다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투질 농도 (osmolarity), 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 해리 또는 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위해 제형화 물질을 함유할 수 있다. 그러한 실시태양에서, 적합한 제형화 물질은 아미노산 (예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제 (예를 들어 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 버퍼 (예를 들어 보레이트, 비카르보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산); 증량제 (예를 들어 만니톨 또는 글라이신); 킬레이팅제 (예를 들어 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (예를 들어 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 다른 탄수화물 (예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 저 분자량 폴리펩티드; 염 형성 반대 이온 (예를 들어 나트륨); 보존제 (예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예를 들어 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예를 들어 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (예를 들어 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제 (예를 들어 수크로스 또는 소르비톨); 긴장성 (tonicity) 향상제 (예를 들어 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 제약상 보조제를 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1995, Mack Publishing Company] 참조).
특정 실시태양에서, 최적 제약 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 방식 및 목적하는 용량에 따라 당업자가 결정할 것이다 (예를 들어, [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 문헌] 참조). 특정 실시태양에서, 그러한 조성물은 개시된 항원 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출율 및 생체 내 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물 내의 1차 비히클 또는 담체는 성질이 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 통상적인 다른 물질을 보충한 주사용수, 생리학적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 Tris 버퍼, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 버퍼를 포함하고, 이는 소르비톨 또는 그에 대한 적합한 대체물을 더 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질 조성물은 목적하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적인 제형화 물질 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)과 동결건조 케이크 (cake) 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조할 수 있다. 또한, 특정 실시태양에서, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
제약 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 별법으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한 전달, 예를 들어 경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 그러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 당업자의 능력 내에 있다.
제형화 성분은 바람직하게는 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 버퍼는 조성물을 생리학적 pH 또는 근소하게 더 낮은 pH에서, 대개 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하기 위해 사용된다.
비경구 투여가 고려될 때, 치료 조성물은 목적하는 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질을 제약상 허용되는 비히클 내에 포함하는, 발열원 (pyrogen)이 없는 비경구로 허용되는 수용액 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사를 위해 특히 적합한 비히클은 멸균 증류수이고, 여기서 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질은 적합하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제형화된다. 특정 실시태양에서, 제제는 데포 (depot) 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는, 주사가능한 미세구, 생체분해성 입자, 중합체성 화합물 (예를 들어 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 물질을 갖는 목적하는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 히알루론산이 또한 사용될 수 있고; 이는 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 갖는다. 특정 실시태양에서, 이식가능한 약물 전달 장치가 목적하는 항원 결합 단백질을 도입하기 위해 사용될 수 있다.
특정 제약 조성물은 흡입을 위해 제형화된다. 일부 실시태양에서, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질은 건조 흡입 분말로서 제형화된다. 특정 실시태양에서, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제를 사용하여 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 용액은 분무될 수 있다. 따라서, 폐 투여 및 제형화 방법은 PCT 공개 WO94/20069에 추가로 설명되어 있고, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명한다. 일부 제형은 경구로 투여될 수 있다. 상기 방식으로 투여되는 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여형의 조제에서 관습적으로 사용되는 담체를 사용하거나 사용하지 않고 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 전신 도입전 파괴가 최소화되는 위장관 내의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질의 흡수를 용이하게 하기 위해 추가의 물질이 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
몇몇 제약 조성물은 유효량의 하나 또는 복수의 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질을 정제의 제조에 적합한 무독성 부형제와의 혼합물로 포함한다. 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액을 단위 투여 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 활택제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
인간 GM-CSF 항원 결합 단백질을 지속- 또는 제어-전달 제형 내에 포함하는 제형을 포함한 추가의 제약 조성물이 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예를 들어 리포좀 담체, 생체-분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 제약 조성물의 전달을 위한 다공성 중합성 미세입자의 제어 방출을 설명하는 PCT 공개 WO 93/15722를 참조한다. 지속-방출 제제는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919 및 유럽 특허 출원 공개 EP 058481에 개시된 바와 같이), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) ([Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277] 및 [Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., 1981, 상기 문헌) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 출원 공개 EP 133,988)을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조할 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692]; 유럽 특허 출원 공개 EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949를 참조한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제약 조성물은 대개 멸균 제제로서 제공된다. 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물을 동결건조할 때, 상기 방법을 이용한 멸균을 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 수행할 수 있다. 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태 또는 용액으로 저장할 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트 (access port)가 있는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼 (stopper)가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣어진다.
일단 제약 조성물이 제형화되면, 이를 멸균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 결정으로서 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 저장할 수 있다. 그러한 제형은 바로 사용되는 (ready-to-use) 형태로 또는 투여 전에 재구성되는 형태 (예를 들어, 동결건조 형태)로 저장할 수 있다. 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 또한 제공한다. 특정 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단일 및 다수-챔버의 예비-충전된 시린지 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지 (lyosyringe))를 포함하는 키트를 제공한다.
사용할 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질-함유 제약 조성물의 치료 유효량은 예를 들어 치료 환경 및 목표에 따라 결정될 것이다. 당업자는 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 부분적으로 전달되는 분자, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질이 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체격 (체중, 체표면적 또는 장기 크기) 및/또는 상태 (연령 및 전반적인 건강)에 따라 변할 것임을 알 것이다. 특정 실시태양에서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다.
전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg 이상일 수 있다. 특정 실시태양에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg, 임의로 1 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg, 임의로 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 임의로 약 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 또는 임의로 약 0.3 mg/kg 내지 3 mg/kg일 수 있다.
투여 빈도는 사용된 제형 내의 특정 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질의 약동학 파라미터에 따를 것이다. 대개, 임상의는 목적하는 효과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지 조성물을 투여한다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 또는 시간 경과에 따라 2회 이상 용량 (동일한 양의 목적하는 분자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이타의 사용을 통해 확인할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 연장된 기간 내내 환자에게 투여될 수 있다. 항원 결합 단백질의 만성 투여는 완전 인간이 아닌 항원 결합 단백질, 예를 들어 비-인간 동물 내에서 인간 항원에 대해 생산된 항체, 예를 들어, 비-인간 종에서 생산된 비-완전 인간 항체 또는 비-인간 항체와 일반적으로 연관되는 불리한 면역 또는 알레르기 반응을 최소화시킨다.
제약 조성물의 투여 경로는 공지의 방법에 따르고, 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 눈내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해; 지속 방출 시스템 또는 이식 장치에 의한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 볼러스 (bolus) 주사에 의해, 또는 주입에 의해 연속적으로 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 또한 목적하는 분자가 그 위해 흡수되거나 봉입된 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이식 장치가 사용되는 경우에, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 장기 내로 이식될 수 있고, 목적하는 분자의 전달은 확산, 시한 (timed)-방출 볼러스 또는 연속 투여를 통할 수 있다.
본 발명에 따른 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질 제약 조성물을 생체 외에서 사용하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 상기 경우에, 환자로부터 제거된 세포, 조직 또는 장기를 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질 제약 조성물에 노출시키고, 그 후 세포, 조직 및/또는 장기를 후속적으로 환자에게 다시 이식한다.
특히, 인간 GM-CSF 항원 결합 단백질은 폴리펩티드를 발현하고 분비하도록 본원에서 설명되는 것과 같은 방법을 사용하여 유전공학 처리된 특정 세포를 이식함으로써 전달될 수 있다. 특정 실시태양에서, 그러한 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 자가성, 이종성 또는 이종발생성일 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포는 불멸화될 수 있다. 다른 실시태양에서, 면역학적 반응 기회를 감소시키기 위해, 세포는 둘러싸는 조직의 침윤을 피하도록 봉입될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 봉입 물질은 단백질 생성물(들)의 방출을 허용하지만, 환자의 면역계에 의한 또는 둘러싸는 조직으로부터의 다른 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 방지하는, 대개 생체적합성의 반투과성 중합성 인클로져 (enclosure) 또는 막이다.
확인되는 모든 특허 및 다른 공개문헌은 예를 들어 설명된 방법과 관련하여 사용될 수 있는, 상기 공개문헌에서 설명되는 방법을 설명하고 개시하기 위해 명백하게 본원에 참조로 포함시킨다. 이들 공개문헌은 단지 본원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유 때문에 상기 개시내용의 실시 시기를 앞당길 권리가 본 발명자들에게 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 날짜에 대한 모든 언급 또는 이들 문서의 내용에 대한 표현은 출원인이 이용가능한 정보를 기초로 한 것으로서, 날짜 또는 이들 문서의 내용의 정확성을 인정하는 것이 아니다.
수행한 실험과 달성한 결과를 포함한 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 첨부된 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 항- GM - CSF 모노클로날 항체의 생성, 선택 및 특성결정에 사용되는 GM -CSF 및 다른 분자에 대한 설명
몇몇 상이한 재조합 및 천연 GM-CSF 분자를 항-GM-CSF 하이브리도마 및 모노클로날 항체의 생성, 선택 및 특성결정을 위해 사용하였다.
인간 GM - CSF
위치 117에서의 단일 아미노산이 상이한, 인간 GM-CSF의 2개의 천연 발생 대립유전자 변이체가 존재한다. 아미노산 위치 117에 트레오닌 (rhGM-CSF-Thr, 서열 146) 또는 이소류신 (GM-CSF-Ile, 서열 145)을 갖는 재조합 인간 GM-CSF 분자를 일시적으로 형질감염된 CHO 또는 COS 세포로부터 생산하고, 친화도-정제하였다. 천연 인간 GM-CSF (nhGM-CSF)는 PMA (0.01 ㎍/ml), 이오노마이신 (0.5 ㎍/ml) 및 EGF (0.02 ㎍/ml)로 자극한 후에 A431 세포의 상등액으로부터, 48시간 동안 37℃에서 PMA (10 ng/mL) 및 이오노마이신 (500 ng/mL)으로 자극한 후에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 상등액으로부터, 또는 TNFα (25 ng/ml) 및 IL-1 (10 ng/ml)로 자극된 인간 소기도 상피 세포 (SAEC)의 상등액으로부터 친화도 정제하였다. 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF는 R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입하였다. 아미노산 위치 23에서 아르기닌 대신 류신이 치환된 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®)는 벌렉스, 인크. (Berlex, Inc., 미국 뉴저지주 몽트빌)로부터 구입하였다. 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L은 아미노산 위치 23에서 아르기닌 대신 류신이 치환된 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF이다. 효모-유래 rhGM-CSF nhGM-CSF (Leukine®), 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF 및 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L은 TF-1 STAT5 인산화 분석에서 동등한 GM-CSF 활성을 보여주었다.
사이노몰거스 짧은꼬리 원숭이 GM - CSF
재조합 사이노몰거스 GM-CSF (rcynoGM-CSF, 서열 53)는 형질감염된 이. 콜라이로부터 생산시켰다. 천연 사이노몰거스 GM-CSF (nCynoGM-CSF)는 TNFα (25 ng/ml) 및 IL-1 (10 ng/ml)로 자극한 후에 잘게 다진 폐 조직의 상등액으로부터, 또는 48시간 동안 37℃에서 PMA (10 ng/mL) 및 이오노마이신 (500 ng/ml)로 자극한 후에 사이노몰거스 PBMC의 상등액으로부터 친화도 정제하였다.
개 GM - CSF
개 GM-CSF (서열 54)는 형질전환된 이. 콜라이로부터 생산하고, 표준 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 봉입체로부터 정제하였다.
토끼 GM - CSF
His 태그를 갖는 재조합 토끼 GM-CSF (서열 82)는 2936E 세포로부터 생산시키고, 5 mM 이미다졸, 20 mM NaPO4, 300 mM NaCl (pH 7.2)로 세척하고, 이미다졸 구배 (10 mM 내지 300 mM)로 용출함으로써 Talon 코발트 IMAC에 의해 정제하였다.
마우스 GM - CSF
재조합 마우스 GM-CSF (서열 58)는 형질전환된 효모 세포로부터 생성시키고, 다음의 3단계 컬럼 크로마토그래피 단계로 정제하였다: SP-세파로스 (포획), C18 (역상 정제) 및 SP-세파로스 (버퍼 교환).
래트 GM - CSF
재조합 래트 GM-CSF는 R&D 시스템즈로부터 구입하였다.
친화도 정제
자극된 세포의 상등액으로부터 GM-CSF의 친화도 정제는 상등액을 항-GM-CSF mAb (M8) 친화도 수지 위로 순환시키고, Na시트레이트 (pH 6.0)로 세척하고, Na시트레이트 (pH 4.5)로 용출함으로써 수행하였다. 관련 분획을 모으고, 버퍼를 PBS로 교환하였다. 재조합 GM-CSF의 농도는 OD280에 의해 결정하고, 천연 GM-CSF의 농도는 ELISA에 의해 결정하였다.
항- GM - CSF mAb 의 특성결정에 사용된 비- GM - CSF 시약
재조합 인간 CSF-1은 R&D 시스템즈로부터 구입하였다. 재조합 hIL-15는 형질감염된 CHO 세포로부터 생성시키고, 2-컬럼 단계 정제 과정을 사용하여 정제하였다. 음이온 교환 정제를 10 mg/ml 수지 (pH 7.5)를 로딩한 Fractogel TMAE 650M을 사용하여 수행한 후, 20 mM Hepes (pH 7.5), 이어서 20 mM MES (pH 6.5), 이어서 100 mM NaCl, 20 mM MES로 세척하였다. 재조합 hIL-15를 200 mM NaCl, 20 mM MES (pH 6.5)로 용출하였다. 단백질을 10 mM NaHPO4 (pH 2.0)에서 1시간 동안 유지한 (바이러스 불활성화 단계) 후, 10 mM NaHPO4 (pH 2.0)에서 20 mg/ml 수지를 로딩한 Fractogel EMD SO3-650(M)을 사용하는 양이온 교환 정제 단계로 처리하고, 10 mM Na시트레이트, 10 mM Na아세테이트, 10 mM MES (pH 4.0)으로 세척하고, 구배 용출 10 mM Na시트레이트, 10 mM Na아세테이트, 10 mM MES (pH 6.0)로 용출하고, 버퍼를 PBS로 교환하였다.
실시예 2. 중화 인간 항- GM - CSF 항체의 생성 및 선택
2.1 GM - CSF -결합 하이브리도마의 면역화 및 선택
인간 GM-CSF에 대해 작용하는 완전 인간 모노클로날 항체의 개발은 XenoMouse® 기술을 이용하여 얻었다. 10 KL Xenomice의 2개의 별개의 코호트 (cohort)를 각각 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF로, 또는 포유동물 세포-유래 rhGM-CSF-Ile 및 rhGM-CSF-Thr의 교대 주사로 7주 동안 3-4일마다 면역화하였다 (총 16회 주사). 혈청 역가는 7차 및 11차 추가접종 (boost) 후에 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 모니터링하고, 최고 역가를 보이는 마우스로부터 비장 세포를 16차 추가접종 4일 후에 파트너 세포주에 융합시켜 하이브리도마를 생성하였다. 생성되는 폴리클로날 하이브리도마 상등액을, GM-CSF에의 결합에 대해 ELISA에 의해 및 인간 중쇄 및 카파 및/또는 람다 경쇄의 존재에 대해 Alpha 스크린에 의해 스크리닝하였다. 면역화 처리를 통해 인간 중쇄 및 경쇄를 발현하는, GM-CSF-결합 활성을 갖는 499개의 세포주를 수득하였다.
2.2 hGM - CSF -의존성 세포-기반 생물학적 분석을 사용하여 GM - CSF 중화 활성을 갖는 하이브리도마의 확인.
499개의 하이브리도마 상등액을 2개의 세포-기반 생물학적 분석, 즉 TF-1 세포에서 GM-CSF 유도된 STAT5 인산화 (2.2.1) 및 AML-5 세포의 GM-CSF-유도된 증식 (2.2.2)을 사용하여 GM-CSF 중화 활성에 대해 추가로 특성 결정하였다. 이들 결과로부터, 14개의 하이브리도마를 클로닝을 위해 선택하였다.
2.2.1 TF-1 세포에서 GM-CSF-유도된 STAT-5 인산화의 억제.
TF-1 세포를 37℃ 및 10％ CO2에서 5％ FBS, 10 mM Hepes, 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 55 μM 베타-머캅토에탄올, 및 10 ng/mL 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF를 보충한 IMDM 내에서 번식시켰다. 분석 1일 전에, TF-1 세포를 350xg에서 6분 동안 원심분리에 의해 수확하고, PBS 중에 3회 세척하였다. 세포를 1x106/mL로 재현탁시키고 GM-CSF가 없이 IMDM + 0.5％ FBS 내에서 37℃ 및 10％ CO2에서 철야 배양하였다. 분석은 2 mL 96-웰 환저 플레이트 내에서 100 ㎕ 총 부피로 수행하였다. 하이브리도마 상등액을 1:4 최종 희석액으로 이중으로 플레이팅하고, rhGM-CSF-Ile (0.4 ng/mL 최종 농도)와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 혈청- 및 GM-CSF-제한 TF-1 세포를 수확하고, PBS 중에 세척하고, 0.5％ FBS가 존재하는 IMDM 내에 6x106 세포/mL로 재현탁하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 첨가하고 (3x105 세포/웰), 플레이트를 15분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세포를 고정하기 위해서, 25 ㎕의 PBS 중 10％ 파라포름알데히드를 2％ 파라포름알데히드의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 15분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 200 ㎕ IMDM + 0.5％ FBS를 웰에 첨가하여 고정을 중지시키고, 플레이트를 350xg에서 7분 동안 원심분리하였다. 세포 상등액을 제거하고, 400 ㎕의 90％ MeOH를 세포를 격렬하게 혼합하면서 서서히 첨가하였다. -20℃에서 철야 인큐베이션 후에, 플레이트를 원심분리하고, 400 ㎕ PBS/2％ FCS로 세척하고, 항-포스포STAT5-Alexa488 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 612598))의 1:5 희석액 (2％ FBS가 존재하는 PBS 중에) 50 ㎕과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 2％ FBS가 존재하는 PBS 중에 재현탁하고, MultiWell FACScalibur (벡톤 디킨슨)를 사용하는 유동 세포측정 분석을 위해 환저 미량역가 플레이트로 옮겼다. STAT5+ 세포의 비율은 FlowJo FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 하이브리도마 상등액에 의한 STAT5 인산화의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
100-({[A의 ％STAT5+ - B의 ％STAT5+]/[C의 ％STAT5+ - B의 ％STAT5+]}*100)
여기서, A = 세포 + 하이브리도마 상등액 + rhGM-CSF, B = 세포 단독, C = 세포 + rhGM-CSF.
각각의 분석에 대해 결정된 역치값보다 더 큰 GM-CSF-의존성 STAT5 인산화를 억제한 하이브리도마 상등액을 IL-3-유도된 STAT5 인산화를 이용하여 특이성에 대해, 및 TF-1 phosflow 생물학적 분석 및 AML-5 세포주 GM-CSF-유도된 증식 생물학적 분석 (2.2.2)을 이용하여 nhGM-CSF 및 rcynoGM-CSF에 대한 효력에 대해 추가로 특성 결정하였다. GM-CSF-의존성 포스포-STAT5 반응, 및 0.4 ng/mL rhGM-CSF-Ile에 의해 유도된 STAT5 인산화를 억제하는 항-hGM-CSF 항체 (MAB215, R&D 시스템즈)의 능력을 보여주는 대표적인 실험을 도 3에 나타낸다. 도 4는 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF로 면역화시킨 코호트로부터의 하이브리도마 상등액에 의한 rhGM-CSF-Ile-유도된 STAT5 인산화 억제 비율의 막대그래프를 보여준다.
2.2.2 하이브리도마 상등액에 의한 AML-5 세포의 GM-CSF-의존성 증식 억제.
AML-5 세포를 37℃ 및 10％ CO2에서 5％ FBS, 10 mM Hepes, 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 55 μM 베타-머캅토에탄올, 및 10 ng/mL 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF를 보충한 IMDM 내에서 번식시켰다. 실험일에, AML-5 세포를 350xg에서 5 min 동안 원심분리하고, PBS 중에 4회 세척하여 잔류 GM-CSF를 제거하였다. AML-5 세포의 GM-CSF- 또는 CSF-1-유도된 증식의 억제에 대해 시험하기 위해, 폴리클로날 하이브리도마 상등액을 96-웰 평저 미량역가 플레이트 내에 1:10 및/또는 1:30 및/또는 1:90 최종 희석으로 이중으로 플레이팅하고, 시토킨을 다음과 같은 소정의 EC90 값으로 첨가하였다: A431 세포-유래 nhGM-CSF 및 rcynoGM-CSF는 0.05 ng/mL; rhGM-CSF-Ile 및 rhGM-CSF-Thr은 0.15 ng/mL; 및 rhCSF-1은 10 ng/mL. 항체/시토킨 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 50 ㎕ AML-5 세포를 5x104 세포/mL로 100 ㎕의 총 부피 (2.5 x 103 세포/웰)로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 10％ CO2에서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. AML-5 세포 증식을 검출하기 위해서, 플레이트를 1 마이크로퀴리의 삼중수소화 티미딘으로 펄싱 (pulsing)하고, 6시간 후 수확하고, 액체 섬광 계수기 상에서 판독하였다. 하이브리도마 상등액에 의한 AML-5 증식의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
100-({A의 CPM/B의 CPM}*100)
여기서, A = 세포+ 하이브리도마 상등액 + 시토킨, B = 세포 + 시토킨.
1:30 희석에서 인간 및 사이노몰거스 GM-CSF-유도된 AML-5 세포 증식을 모두 강하게 억제하지만 인간 CSF-1-유도된 AML-5 세포 증식을 억제하지 않는 하이브리도마 상등액을 모노클로날 항-GM-CSF 하이브리도마를 생성하도록 클로닝하기 위해 선택하였다. GM-CSF-의존성 증식 반응, 및 0.15 ng/mL rhGM-CSF-Ile에 의해 유도된 AML-5 세포 증식을 억제하는 항-hGM-CSF 항체 (MAB215, R&D 시스템즈)의 능력을 보여주는 대표적인 실험을 도 5에서 보여준다.
2.3 모노클로날 하이브리도마 세포주의 생성
생물학적 분석 스크린으로부터의 결과에 기초하여, 14개의 폴리클로날 하이브리도마 주를 제한 희석에 의해 모노클론성으로 클로닝하기 위해 선택하였다. 폴리클로날 하이브리도마 플레이트로부터의 세포를 계수하고, 48 세포/mL로 재현탁하고, 24 세포/mL, 4.8 세포/mL 및 2.4 세포/mL로 20 mL 배지 내에 희석하였다. 세포를 200 ㎕/웰로 플레이팅하여, 각각의 클로닝된 주에 대해 4개의 상이한 밀도 (10 세포/웰, 5 세포/웰, 1 세포/웰, 및 0.5 세포/웰)의 플레이트를 생성하였다. 클로닝의 2주 내에, 플레이트를 현미경 하에 시각적으로 관찰하고, 상등액을 1 세포/웰 및 0.5 세포/웰 클로닝 플레이트로부터의 웰로부터 수확하였고, 여기서 단일 콜로니만이 검출되었다. 상등액을 ELISA에 의해 항원 특이성에 대해 스크리닝하고, 항원 양성 상등액을 중쇄 및 경쇄 종 및 이소형 조성에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 웰에서 단일 콜로니 성장, 항원 특이적 면역반응성, 및 인간 람다 또는 카파 및 IgG 조합을 나타낸 각각의 주로부터의 1 내지 3개의 딸 (daughter) 클론만을 유지하고 동결시켰다. 모노클론성은 각각의 딸 클론의 서열 분석에 의해 확인하였다.
2.4 모노클로날 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 항- GM - CSF 항체에 의한 GM -CSF 중화 활성의 특성결정
2.4.1 하이브리도마 상등액으로부터 IgG의 정제
IgG를 Protein A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 모노클로날 하이브리도마 상등액으로부터 친화도 정제하고, A280에서 NanoDrop ND-1000 UV-Vis 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지스 (Nanodrop Technologies, 미국 델라웨어주 윌밍턴))를 사용하여 정량하였다.
2.4.2 모노클로날 항체에 의한 AML-5 세포의 GM-CSF-의존성 증식의 억제.
AML-5 세포를 증식시키고, 실시예 2.2.2에 설명되는 바와 같이 분석을 위해 준비하였다. AML-5 세포의 GM-CSF- 또는 CSF-1-유도된 증식을 억제하는, 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체의 능력을 평가하기 위해, 항체를 96-웰 평저 플레이트에서 각각 이중으로 적정하였다 (5 ㎍/mL에서 출발하여 8배 연속 희석). 시토킨은 다음과 같은 소정의 EC90 값으로 첨가하였다: nhGM-CSF (A431 또는 인간 PBMC-유래)는 0.1 ng/mL; rhGM-CSF-Ile는 0.3 ng/mL; rhGM-CSF-Thr은 0.8 ng/mL; rcynoGM-CSF는 0.05 ng/mL; 및 rhCSF-1은 3 ng/mL. 각각의 실험에서, GM-CSF 및 CSF-1을 또한 2배 연속 희석으로 적정하여, 그 실험에서 EC90 값을 계산하였다. 시토킨 및 항체를 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, AML-5 세포를 2.5x104 세포/mL로 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 10％ CO2에서 인큐베이팅하였다. 3일 후에, 플레이트를 1 마이크로퀴리의 삼중수소화 티미딘으로 펄싱하고, 6시간 후 수확하고, 액체 섬광 계수기 상에서 판독하였다. 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb에 의한 AML-5 증식의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
([A의 CPM - B의 CPM]/[A의 CPM - C의 CPM])*100
여기서, A = 세포 + 시토킨, B = 세포 + mAb + 시토킨, C = 세포 단독.
비선형 회귀 분석 및 50％ 증식 억제 (IC50) 값 계산은 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel; 미국 와싱턴주 레드몬드)을 이용하여 생성하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 사용하여 모노클로날 하이브리도마 항체의 평균 IC50 값을 계산하였다 (표 5). 동일한 mAb의 하나 이상의 클론을 사용하는 실험 (서열에 의해 확인됨)을 평균에 포함시켰다.
Figure pct00007
도 6 및 표 5에 제시된 바와 같이, 하이브리도마 상등액으로부터의 몇몇 모노클로날 항체는 GM-CSF-유도된 AML-5 세포 증식을 용량-의존 방식으로 억제하지만, CSF-1-유도된 AML-5 세포 증식을 억제하지 않았다. 최대 증식 억제의 중간값에 대해 피팅함으로써, 모노클로날 항체는 상기 분석에서 시험된 GM-CSF의 형태에 대해 IC50 값이 <1 nM이었다.
2.4.3 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 항-GM-CSF 모노클로날 항체에 의한, TF-1 세포에서 GM-CSF-의존성 STAT-5 인산화의 억제.
TF-1 세포를 번식시키고 실시예 2.2.1에 설명된 바와 같이 분석을 위해 준비하였다. TF-1 세포의 GM-CSF- 또는 rhIL-3-유도된 STAT5 인산화의 억제를 평가하기 위해, 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체를 96-웰 환저 깊은 웰 플레이트에서 각각 이중으로 적정하였다 (2 ㎍/mL에서 출발하여 5배 연속 희석). 시토킨을 다음과 같은 소정의 EC90 값으로 첨가하였다: nhGM-CSF (A431) 및 rcynoGM-CSF는 0.3 ng/mL; rhGM-CSF-Ile 및 rhGM-CSF-Thr은 0.9 ng/mL; 및 rhIL-3은 30 ng/mL. 각각의 분석에서, GM-CSF 및 IL-3을 또한 2배 연속 희석으로 적정하여, 각각의 분석에서 EC90 값을 계산하였다. 시토킨 및 항체를 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 3x105 세포/mL 혈청 및 GM-CSF 제한 TF-1 세포를 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 세포를 15분 동안 37℃에서 자극한 후 고정시키고, 투과시키고, 실시예 2.2.1에 설명된 바와 같이 STAT5 인산화에 대해 분석하였다. 클로날 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb에 의한 Stat5 인산화의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
([A의 ％Stat5+ - B의 ％Stat5+]/[A의 ％Stat5+ - C의 ％Stat5+])*100
여기서, A = 세포 + 시토킨, B = 세포 + mAb + 시토킨, C = 세포 단독.
비선형 회귀 분석 및 최대 증식 억제 중간값 (IC50hm)은 GraphPad Prism 4.01을 이용하여 계산하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 사용하여 모노클로날 항체의 평균 IC50 값을 계산하였다 (표 5).
도 7 및 표 5에 제시된 바와 같이, 몇몇 모노클로날 항체는 TF-1 세포에서 GM-CSF-유도된 STAT5 인산화를 용량-의존 방식으로 억제하지만, rhIL-3-유도된 STAT5 인산화를 억제하지 않았다. 모노클로날 항체는 IC50hm 값이 본 분석에서 시험된 GM-CSF의 형태에 대해 <0.3 nM이었다.
실시예 3. 형질감염된 세포주로부터 재조합 모노클로날 항체 ( mAb )의 클로닝 및 발현
항체 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 인간 IgG2 프레임워크 내로 서브클로닝하고, 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시키고, COS (일시적 형질감염) 또는 CHO (안정한 형질감염) 세포에서 발현시켰다. COS 세포에서 일시적 형질감염에 의해 발현된 항체를 TBS (pH 7.4) 내에서 2.2x10cm MabSelectSure rProtein A 결합을 이용하여 상등액으로부터 정제하고, 50 mM 시트레이트 (pH 3.4+/-0.2)로 용출하였다. 용출액을 1M Tris 염기 원액 (pH 8.0)을 이용하여 pH 6.0으로 맞추고, 버퍼를 투석을 이용하여 10 mM 아세테이트, 9％ 수크로스 (pH 5.2)로 교환하였다. 하나의 클론을 10 mM KP, 161mM L-Arg (pH 7.6)을 갖는 버퍼 내로 계속 투석한 후, 20 mg/mL로 농축하였다.
안정한 CHO 세포주로부터 발현된 항체를 TBS (pH 7.4) 내에서 1.1x10cm MabSelectSure rProtein A 결합을 이용하여 상등액으로부터 정제하고, 100 mM 아세테이트 (pH 3.6)로 용출하였다. 용출액을 GE 탈염 컬럼을 이용하여 5 mg를 10 mM 아세테이트, 9％ 수크로스 (pH 5.2) 내로 버퍼 교환하였다. 이어서, 20-30 mg의 물질을 GE 탈염 컬럼을 이용하여 Cellgro PBS (pH 7.2) 내로 버퍼 교환하였다. 풀 (pool)을 0.2 미크론 여과하였다. 제2 안정한 세포 형질감염으로부터의 물질을 재차 정제하고 10 mM 아세테이트, 9％ 수크로스 (pH 5.2) 버퍼 내에 유지하였다.
실시예 4. 표면 플라즈몬 공명에 의한, rhGM - CSF - Ile 에 대한 재조합 mAb 의 운동학적 결합 분석
항-GM-CSF 재조합 모노클로날 항체의 운동학적 결합 분석은 CM4 센서 칩이 장착된 Biacore 3000 기기 (비아코아 아베 (Biacore AB, 스웨덴 웁살라))를 사용하여 25℃에서 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 수행하였다. 염소 항-인간 IgG 포획 항체는 전개 버퍼로서 HBS-EP를 사용하여 표준 아민-커플링 화학을 이용하여 칩에 공유 방식으로 고정시켰다. 간단히 설명하면, 각각의 유동 세포를 0.1 M NHS 및 0.4 M EDC의 1:1 (v/v) 혼합물로 5 ㎕/min의 유속으로 7분 동안 활성화시켰다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5) 중 30 ㎍/mL의 염소 항-인간 IgG를 약 3200 RU의 밀도로 2개의 유동 세포 상에 고정시켰다. 잔류 반응성 표면은 1 M 에탄올아민을 5 ㎕/min로 7-분 주입하여 탈활성화시켰다. 50 ㎕의 10 mM 글라이신 HCl (pH 1.5)을 100 ㎕/min으로 각각의 유동 세포 위로 3회 주입하여, 임의의 남아있는 비공유 결합된 포획 항체를 제거하고 각각의 표면을 조건화하였다. 모든 나머지 단계에 대해 전개 버퍼를 0.1 mg/mL BSA 및 2 mg/mL CM-덱스트란을 함유하는 HBS-EP로 교체하였다.
재조합 항-GM-CSF mAb를 0.5 ㎍/mL로 하나의 염소 항-인간 IgG 표면 위로 1.5분 동안 10 ㎕/min으로 주입하여 약 111 RU의 표면 밀도를 얻었다. 남아있는 염소 항-인간 IgG 표면은 참조군으로서 변형시키지 않고 두었다. 5 사이클의 버퍼 블랭크 (blank)를 초기에 전개하여 칩 표면을 조건화하였다. 재조합 hGM-CSF-Ile 샘플은 300, 100, 33.3, 11.1, 3.70, 및 1.23 nM의 농도로 삼중으로 제조하고, 6 버퍼 블랭크와 함께 100 ㎕/min로 포획된 재조합 항-GM-CSF IgG 및 참조 표면 위로 모두 무작위 순서로 주입하였다. 각각의 복합물을 2.5분 동안 결합시키고, 2.5분 동안 해리시켰다. 또한, 보다 많은 해리상 데이타를 수집하기 위해 100 nM rhGM-CSF-Ile 및 버퍼 블랭크의 삼중 샘플을 두 표면 위로 100 ㎕/min로 교대로 주입하고, 2.5분 동안 결합시키고 90분 동안 해리시켰다. 표면은 각각의 rhGM-CSF-Ile 또는 버퍼 주입 후에, 10 mM 글라이신 HCl (pH 1.5)의 100 ㎕/min의 30-초 펄스에 이어 버퍼의 30초 주입으로 재생하였다.
데이타를 벌크 굴절률 변화를 제거하기 위해 참조 표면 반응을 공제한 후, 실험적 유동 세포로부터 체계적 인공물을 제거하기 위해 평균 버퍼 블랭크 반응을 공제함으로써 이중 참조하였다. 데이타는 곡률이 결여되고 농도는 약 6000x KD이므로, 300 nM 곡선으로부터 수집한 데이타를 운동학 정보의 결여에 대한 분석으로부터 삭제하였다. 데이타를 처리하고, Scrubber (버전 2.0a, 바이오로직 소프트웨어 (BioLogic Software, 호주 캠벨))를 이용하여 1:1 상호작용 모델에 전반적으로 피팅하여, 운동 속도 상수 kd 및 ka, 및 평형 결합 상수 KD를 얻었다. 결과를 표 6에 제시한다.
Figure pct00008
실시예 5. ELISA 에 의해 측정될 때 다른 종으로부터의 GM- CSF 에 대한 항-GM- CSF 항체의 교차-반응성
상기로부터의 하이브리도마 mAb 클론 및 재조합 mAb를 마우스, 래트, 토끼, 개 및 사이노몰거스 중 하나 이상의 종로부터의 rhGM-CSF-Ile, rhGM-CSF-Thr, 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®), 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF, nhGM-CSF 및/또는 재조합 GM-CSF에 결합하는 능력에 대해 평가하였다 (도 8A 및 8B). 96-웰 플레이트의 개별 웰을 50 ㎕의 1 ㎍/mL 용액의 GM-CSF 또는 대조군 단백질로 코팅하고, 4℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 4회 세척한 후, 선도 (lead) 항-GM-CSF mAb (또는 대조 항체)를 2 ㎍/ml로 각각의 GM-CSF 단백질이 있는 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하고, PBS/Tween로 4회 세척하였다. HRP-컨쥬게이팅된 항-인간 IgG를 1:8000로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 플레이트를 PBS/Tween으로 4회 세척하였다. TMB 현상제를 첨가하고, 10분 동안 인큐베이팅하고, 플레이트를 플레이트 판독기 상에서 650 nm에서 판독하였다. 항-GM-CSF mAb 클론 및 재조합 mAb는 rhGM-CSF-Ile, rhGM-CSF-Thr, 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF 및 재조합 cynoGM-CSF에 결합하지만, 마우스, 래트 또는 개 GM-CSF에는 결합하지 않았다. 전부는 아니지만 일부의 클론이 또한 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®)에 결합하였다 (도 8A). 별개의 분석에서, 하이브리도마 상등액 및 제2 안정한 세포주 (SCL) 형질감염으로부터 하나의 항-GM-CSF mAb 클론은 PBMC-유래 nhGM-CSF, rhGM-CSF-Ile, 및 rcynoGM-CSF에 결합하지만, 마우스, 래트, 토끼 또는 개 GM-CSF에 결합하지 않았다 (도 8B)
실시예 6. 다수의 GM - CSF 분자를 사용하는 세포-기반 생물학적 분석 및 인간 전혈에서 재조합 항- GM - CSF mAb 에 대한 IC50 값의 결정
상기 설명된 바와 같이, 완전 인간 재조합 항-hGM-CSF 항체를 일시적으로 형질감염된 세포 및 안정한 형질감염된 세포주 모두로부터 발현시켰다. 물질은 2개의 독립적인 일시적 형질감염으로부터 정제하고 (제1 TT 및 제2 TT), 2개의 별개의 수확물을 안정한 세포주로부터 얻었다 (제1 SCL 및 제2 SCL). 다음 실험은 상이한 형태의 인간 및 사이노몰거스 GM-CSF에 대한 6개의 재조합 항체 클론에 대한 IC50 값의 결정을 설명한다 (표 7-9).
6.1 재조합 항-GM-CSF mAb에 의한 AML-5 세포의 GM-CSF-의존성 증식 억제.
AML-5 증식 분석은 10 ㎍/mL에서 출발하여 mAb의 9배 연속 희석, 및 시토킨을 소정의 EC90 농도에서 사용하여 실시예 2.4.2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 제2 TT 및 제1 SCL 물질을 사용하는 실험에 대해 (도 9), 시토킨을 다음 농도로 첨가하였다: PBMC-유래 nhGM-CSF를 0.2 ng/mL; rhGM-CSF-Ile를 0.4 ng/mL; 및 rCynoGM-CSF를 0.1 ng/mL. 다른 분석을 위해, 상기 시토킨 이외에, rhGM-CSF-Thr (0.4 ng/mL) 및 폐 조직-유래 ncynoGM-CSF (3 ng/mL)를 시험하였다. 각각의 실험에서, 사용된 시토킨을 또한 2배 연속 희석을 이용하여 적정함으로서 그 실험에 대한 EC90 값을 계산하였다. 시토킨 및 항체를 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 2.5x104 AML-5 세포/mL을 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 37℃ 및 10％ CO2에서 72시간 후에, 웰 당 1 마이크로퀴리의 삼중수소화 티미딘을 첨가하였다. 세포 배양액을 6시간 후에 수확하고, 포함된 삼중수소화 티미딘을 액체 섬광 계수에 의해 측정하였다. 재조합 mAb에 의한 AML-5 증식의 억제 비율을 실시예 2.4.2에서와 같이 계산하였다. 비선형 회귀 분석 및 50％ 증식 억제 (IC50) 값 계산은 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 생성하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 사용하여 각각의 mAb에 대한 평균 IC50 값을 계산하였다.
모든 일시적- 및 안정한 세포주-생성된 재조합 항체는 GM-CSF-유도된 AML-5 세포 증식을 용량-의존 방식으로 억제하였다. 일시적 형질감염으로부터의 6개의 모든 선도 항체가 인간 GM-CSF를 IC50 값 <0.8 nM으로 및 사이노몰거스 GM-CSF를 IC50 값 <3.5 nM로 억제하였다. 6개의 모든 안정한 세포주 선도 항체는 인간 GM-CSF를 IC50 값 <1.5 nM으로 및 사이노몰거스 GM-CSF를 IC50 값 <3.5 nM로 억제하였다. 3개의 항체에 대한 결과를 도 9에 제시한다. AML-5 증식 분석에서 시험된 모든 항체 및 시토킨에 대한 IC50 값의 요약을 표 7에 제시한다.
Figure pct00009
6.2 재조합 항-GM-CSF mAb에 의한, TF-1 세포에서 GM-CSF-의존성 STAT5 인산화의 억제
TF-1 STAT5 인산화 분석을 2 ㎍/mL에서 출발한 mAb의 6배 연속 희석, 및 시토킨을 소정의 EC90 농도로 이용하여 실시예 2.4.3에 설명된 바와 같이 수행하였다. 제2 TT 및 제2 SCL 물질을 사용하는 실험에 대해 (도 10), 시토킨을 다음 농도로 첨가하였다: PBMC-유래 nhGM-CSF 및 rhGM-CSF-Ile를 0.6 ng/mL; rcynoGM-CSF를 0.1 ng/mL. 제1 TT 물질을 사용하는 실험에 대해 (도 11), 자극된 인간 소기도 상피 세포 (SAEC) 배양액으로부터의 상등액 (0.2 ng/mL의 최종 nhGM-CSF 농도) 및 자극된 사이노몰거스 폐 배양액으로부터의 상등액 (0.1 ng/mL의 최종 ncynoGM-CSF 농도)을 사용하였다. 도 12에서, 자극된 사이노몰거스 PBMC 배양액으로부터의 상등액 (1 ng/mL의 최종 GM-CSF 농도)을 제2 SCL로부터의 GM-CSF mAb에 첨가하였다. 다른 분석을 위해, rhGM-CSF-Thr을 0.75 ng/mL에서 상기한 시토킨에 추가로 시험하였다. 각각의 실험에서, 사용된 시토킨을 또한 2배 연속 희석으로 적정하여 그 실험에 대한 EC90 값을 계산하였다. 15분 후, 세포를 고정시키고 투과시키고, 실시예 2.2.1 및 2.4.3에서 상기 설명된 바와 같은 항-포스포-STAT5 항체를 이용하여 STAT5 인산화의 양을 검출하였다. 재조합 mAb에 의한 Stat5 인산화의 억제 비율은 실시예 2.4.3에서와 같이 계산하였다. 비선형 회귀 분석 및 최대 증식 억제 중간값 (IC50hm)은 GraphPad Prism 4.01을 이용하여 계산하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 사용하여 모노클로날 항체의 평균 IC50 값을 계산하였다
6.3 재조합 항-GM-CSF mAb에 의한, 1차 인간 단핵구의 GM-CSF-의존성 활성화의 억제.
mAb를 인간 단핵구에서 GM-CSF-유도된 대사 활성을 중화시키는 그들의 능력에 대해 평가하기 위해, 단핵구 단리 키트 II (밀텐이 바이오테크 (Miltenyi Biotech))를 사용하여 백혈구 성분 채집술 팩 (leukapheresis pack) (Amgen Washington Blood Donor Program)으로부터 1차 단핵구를 단리하였다. 음성으로 선택된 세포는 유동 세포측정에 의해 평가할 때 90％-95％ CD14+ 세포였다 (데이타를 제시하지 않음). PBMC-유래 nhGM-CSF 또는 rhGM-CSF-Ile (0.05 ng/mL)을 30분 동안 20 ㎍/mL에서 출발하는 mAb의 6배 연속 희석액과 함께 96-웰 평저 플레이트 내에서 인큐베이팅하였다. CD14+ 세포 (150,000/mL)를 100 ㎕ 총 배지 (10％ FCS, 10 mM Hepes, 2mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 55 μM 베타-머캅토에탄올을 보충한 RPMI) 내에서 플레이트에 첨가하고, 5일 동안 37℃ 및 5％ CO2에서 인큐베이팅하였다. GM-CSF-유도된 대사 활성은 Alamar Blue (바이오소스 (BioSource), DAL1025, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 배지의 1:1 혼합물 20 ㎕을 첨가하고, 4-8시간 후 570-600 nm에서 흡광도를 계산하여 평가하였다. 재조합 mAb에 의한 인간 CD14+ 단핵구 활성의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
([A의 OD570 -600 - B의 OD570 -600]/[A의 OD570 -600 - C의 OD570 -600])*100
여기서, A = 세포 + 시토킨, B = 세포 + mAb + 시토킨, C = 세포 단독.
비선형 회귀 분석 및 50％ 증식 억제 (IC50) 값 계산은 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 생성하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 사용하여 각각의 mAb에 대한 평균 IC50 값을 계산하였다 (표 8). 일시적- 및 안정한 세포주-생성된 재조합 항체는 GM-CSF-유도된 AML-5 세포 증식을 용량-의존 방식으로 억제하였다. 항체는 인간 GM-CSF를 IC50hm 값 <0.13 nM으로 및 사이노몰거스 GM-CSF를 IC50hm 값<0.31 nM으로 억제하였다.
Figure pct00010
일시적- 및 안정한 세포주-생성된 재조합 항체는 GM-CSF-유도된 인간 단핵구 활성을 용량-의존 방식으로 억제하였다. 선도 항체는 발현 방법에 무관하게 천연 및 재조합 hGM-CSF 모두를 IC50 값 <0.55 nM으로 억제하였다. 제1 TT 물질에 대한 결과를 도 13에 제시한다. 인간 단핵구 분석에서 시험된 모든 항체에 대한 IC50 값의 요약을 표 9에 제시한다.
Figure pct00011
6.4 안정한 CHO 세포주로부터 생산된 재조합 항-GM-CSF에 의한, 인간 전혈에서 GM-CSF-유도된 ENA-78 또는 MIP-1 베타 생산의 억제
재조합 hGM-CSF-Ile (최종 농도 2 ng/mL)를 10％ 보통 인간 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 25 mM Hepes를 보충한 RPMI 내에서 제조하고, 96-웰 평저 플레이트 내에서 100 ㎍/mL에서 출발하여 안정한 CHO 세포주로부터의 재조합 mAb의 6배 연속 희석액에 첨가하였다. 인간 IgG2 이소형-매칭된 모노클로날 항체 (항-KLH)를 모든 웰에 100 ㎍/mL의 총 IgG 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 시토킨을 4배 연속 희석 +/- 100 ㎍/mL 이소형-매칭된 인간 IgG2 으로 적정하여 그 실험에 대한 EC90 값을 계산하였다. 인간 전혈은 Amgen Whole Blood Donor Program에 의해 Na-헤파린 Vacutainer 튜브 (벡톤 디킨슨) 내로 수집하고, 228 ㎕ (285 ㎕ 총 부피) 혈액을 웰에 첨가하고, 부드럽게 피펫팅하면서 혼합하였다. 37℃ 및 5％ CO2에서 40 hr 인큐베이션 후에, 플레이트를 5분 동안 730xg에서 원심분리하고, 55 ㎕ 혈장을 조심스럽게 수집하고 새로운 96웰 플레이트에 옮기고 동결시켰다. 혈장을 해동하고, 이중 웰을 모은 후, hENA78 및 hMIP-1b DuoSets (R&D 시스템즈)로부터의 시약 및 프로토콜을 사용하여 ELISA에 의해 ENA78 및 MIP-1b에 대해 분석하였다. 비선형 회귀 분석 및 최대 증식 억제 중간값 (IC50hm) 값은 GraphPad Prism 4.01을 이용하여 계산하였다.
상기 인간 전혈 분석에서, 재조합 인간 GM-CSF mAb는 ENA78 및 MIP-1b의 GM-CSF-유도된 생산을 억제하는 것으로 나타났다. IC50hm 값은 ENA78 생산에 대해 0.155 nM 및 MIP-1b 생산에 대해 0.299 nM인 것으로 결정되었다 (도 14).
실시예 7. GM - CSF -유도된 AML -5 증식 분석, 인간 단핵구 생물학적 분석 및 TF -1 세포 분석에서의 GM - CSF -유도된 TF -1 STAT -5 인산화에서 효모-유래 rhGM - CSF (Leukine®), A431-유래 nhGM - CSF , 이. 콜라이 -유래 rhGM - CSF 및 이. 콜라이 -유래 rhGM-CSF-R23L의 중화
AML-5 증식 분석은 5 ㎍/mL에서 출발하여 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 GM-CSF mAb의 9배 연속 희석액, 및 시토킨을 소정의 EC90 농도 (이. 콜라이-유래 rhGM-CSF를 0.1 ng/mL, 효모-유래 rhGM-CSF를 0.05 ng/mL)로 사용하여 실시예 2.4.2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 사용된 시토킨을 또한 2배 연속 희석을 이용하여 적정하여, 그 실험에 대한 EC90 값을 계산하였다. 시토킨 및 항체를 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 2.5x104 AML-5 세포/mL을 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 37℃ 및 10％ CO2에서 72시간 후에, 웰 당 1 마이크로퀴리의 삼중수소화 티미딘을 첨가하였다. 세포 배양액을 6시간 후에 수확하고, 포함된 삼중수소화 티미딘을 액체 섬광 계수에 의해 측정하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 4개의 mAb는 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF의 활성을 중화할 수 있지만, 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®)의 활성을 중화하지 않았다.
인간 단핵구 분석은 12 ㎍/mL에서 출발하여 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 mAb의 3배 희석액, 및 시토킨을 소정의 EC90 농도 (A431 세포-유래 nhGM-CSF 및 효모-유래 rhGM-CSF를 0.04 ng/mL)로 사용하여 실시예 6.3에 설명된 바와 같이 수행하였다. 사용된 시토킨을 또한 2배 연속 희석을 이용하여 적정하여, 그 실험에 대한 EC90 값을 계산하였다. 시토킨 및 항체를 30분 동안 37℃에서 함께 인큐베이팅한 후, 1.5x105 인간 CD14+ 세포/mL을 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 플레이트를 5일 동안 37℃에서 5％ CO2 내에서 인큐베이팅하고, Alamar Blue의 환원을 측정함으로써 GM-CSF-유도된 대사 활성을 평가하였다. 두 분석에 대해, 비선형 회귀 분석 및 50％ 증식 억제 (IC50) 값 계산은 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 생성하였다. 세포를 자극하기 위해 사용된 시토킨의 양이 그의 EC90 값의 2배 내에 있는 실험을 분석에 포함시켰다. 도 15b에 도시된 바와 같이, 4개의 mAb는 A431 세포-유래 rhGM-CSF의 활성을 중화할 수 있지만, 효모-유래 rhGM-CSF (Leukine®)의 활성을 중화하지 않았다.
TF-1 STAT5 인산화 분석은 재조합 항-GM-CSF mAb를 사용하여 실시예 2.2.1에 설명된 바와 같이 수행하였다. 96웰 플레이트의 이중 웰 내로, 2 ㎍/mL에서 출발하여 항-GM-CSF mAb의 6배 연속 희석액, 및 시토킨을 소정의 EC90 농도 (이. 콜라이-유래 rhGM-CSF 및 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L을 0.5 ng/mL, 효모-유래 rhGM-CSF-R23L (Leukine®)을 0.2 ng/mL)로 첨가하였다. 30분 인큐베이션 후에, 3x105 TF-1 세포/ml을 100 ㎕의 총 부피로 첨가하였다. 플레이트를 15분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세포를 고정시키기 위해서, 25 ㎕의 PBS 중 10％ 파라포름알데히드를 2％ 파라포름알데히드의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 200 ㎕ IMDM + 0.5％ FBS, 10 mM Hepes, 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 55 μM 베타-머캅토에탄올을 웰에 첨가하여 고정을 중지시키고, 플레이트를 350xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 상등액을 제거하고, 400 ㎕의 90％ MeOH를, 세포를 격렬하게 혼합하면서 서서히 첨가하였다. -20℃에서 철야 인큐베이션 후에, 플레이트를 원심분리하고, 600 ㎕ PBS/2％ FCS로 세척하고, 항-포스포STAT5-Alexa488 (벡톤 디킨슨)의 1:5 희석액 (2％ FBS를 함유하는 PBS 중) 50 ㎕과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 2％ FBS를 함유하는 PBS 내에 재현탁시키고, MultiWell FACScalibur (벡톤 디킨슨)를 사용하는 유동 세포측정 분석을 위해 환저 미량역가 플레이트로 옮겼다. STAT5+ 세포의 비율을 FlowJo FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 하이브리도마 상등액에 의한 STAT5 인산화의 억제 비율을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
100-({[A의 ％STAT5+ - B의 ％STAT5+]/[C의 ％STAT5+ - B의 ％STAT5+]}*100)
여기서, A = 세포 + 하이브리도마 상등액 + rhGM-CSF, B = 세포 단독, C = 세포 + rhGM-CSF.
GM-CSF-유도된 TF-1 세포 pSTAT5 분석에서, 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L은 효모-유래 rhGM-CSF-R23L (Leukine®) (0.130 ng/mL) 및 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF (0.298 ng/mL)에 대등한 EC90 (0.384 ng/mL)을 보였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 항-GM-CSF mAb는 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF를 중화시켰지만, 효모-유래 (Leukine®) 또는 비글리코실화된 이. 콜라이-유래 rhGM-CSF-R23L을 중화시키지 않았다. 이것은 상기 구별을 위한 기초가 효모 발현으로 인한 글리코실화 차이보다는, 천연 GM-CSF에 비해 효모-유래 rhGM-CSF-R23L (Leukine®) 및 이. 콜라이 rhGM-CSF-R23L의 1차 서열에서 동일한 단일 아미노산 차이 (위치 23에서 류신 대 아르기닌)로 인한 것임을 제안한다.
실시예 8. 결합 경쟁에 의한 선도 6개의 항- GM - CSF 모노클로날 항체의 에피토프 비닝 ( binning )
에피토프 비닝은 결합 경쟁 분석을 이용하여 수행하였고, 여기서 하나의 표지된 mAb는 rhGM-CSF-Ile에 대한 결합을 위해 과량의 다른 비표지된 mAb와 경쟁하였다. 서로 경쟁하는 항체는 동일한 빈 (bin)에 배정하였다. 6개의 선도 항-GM-CSF mAb 중 5개가 rhGM-CSF에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하였지만, 하나는 경쟁하지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> KIRCHNER, Jacqueline A BRASEL, Kenneth A OLSON, Kara ESCOBAR, Jose Carlos BARONE, Dauphine <120> Human GM-CSF Antigen Binding Proteins <130> A-1292-WO-PCT <140> to be assigned <141> 2008-09-18 <150> 60/994,343 <151> 2007-09-18 <150> 61/087,551 <151> 2008-08-08 <160> 147 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 1 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Leu Tyr Ser Ser Ser Asn Glu Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Ser Val Phe Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Arg Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 2 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 2 atggtgctgc agacccaggt gtttattagc ctgctgctgt ggattagcgg cgcgtatggc 60 gacatcgtgc tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120 atcaactgca agtccagcca gagtatttta tacagctcca gcaatgagaa cttcttaact 180 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 240 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagcc tgcagcctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttagtgtt 360 tttcggacgt tcggccaagg gaccagggtg gaaatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Glu Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Val Phe Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Ser Asn Glu Asn Phe Leu 1 5 10 15 Thr <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Phe Ser Val Phe Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 7 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 8 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 8 atggattgga cctggcgtat tctgtttctg gtggcggcgg cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactctgca 240 cagaagtttc ggggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgcg agagggtgga 360 tacagctatg gttactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 10 Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 11 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 12 Glu Gly Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 13 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Asp Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 14 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 14 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga cagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agcagctact ttgcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatttat ggtgcatcca gtagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgata ggtcacctcg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 17 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 18 Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 19 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 19 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Trp Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 20 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 20 atggattgga cctggcgtat tctgtttctg gtggcggcgg cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgtaagtctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagttta agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agataagtgg 360 ctggacggct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Lys Trp Leu Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 22 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 23 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 24 Asp Lys Trp Leu Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 25 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 25 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Asp Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 26 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 26 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tcgcctggta ccaacagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccgtcag cagactggag 300 cctgaggatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgata ggtcacctcg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Lys, Arg or Gln <400> 28 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Xaa Ala Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 29 Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Val, Ile or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ser or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Ser, Thr or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Phe or Leu <400> 30 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence sequence <220> <223> heavy chain <400> 31 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Ser Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 32 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 32 atggattgga cctggcgtat tctgtttctg gtggcggcgg cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagttgg tgcagtctgg ggctgcggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 caaaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctccatg 300 gaactgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtttatt tctgtgcgag agatcggtgg 360 ctggatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc tgctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Ser 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ala or Thr <400> 34 Gly Xaa Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 35 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 36 Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 37 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 37 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr 35 40 45 Ile Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ala Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 38 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 38 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gtatattagc aacacctatt tagcctggtt ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcagcca ccagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactt tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 360 caagggacca cggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ala Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 40 Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Asn Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 41 Gly Ala Ala Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 42 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 43 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 43 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Arg Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Tyr Asp Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 44 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 44 atggattgga cctggcgtat tctgtttctg gtggcggcgg cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagttgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaggtttc ggggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gaactgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agccccgtat 360 gactggacct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Tyr Asp Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Tyr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Phe, Gly or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser, Thr or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Val, Ser or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Phe or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Arg, Trp, or Ile <400> 46 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 47 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 48 Ala Pro Tyr Asp Trp Thr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 49 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Cys Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Asp Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 50 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 50 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaagttgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagcgtttgc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctgaccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcgtcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgata ggtcacctcg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggagat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705 <210> 51 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 51 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Cys Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 52 Arg Ala Ser Gln Ser Val Cys Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 144 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 53 Met Trp Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 54 <211> 144 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 54 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Thr Leu Val Thr Arg Pro Ser Gln His 20 25 30 Val Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp 35 40 45 Val Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val Lys Val Val Ser Glu Val Phe 50 55 60 Asp Pro Glu Gly Pro Thr Cys Leu Glu Thr Arg Leu Gln Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Glu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Lys Asn Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Ser Pro 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Asn Ile Asn Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Lys Lys 130 135 140 <210> 55 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 55 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Arg Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Glu Ile Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 56 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 56 atggattgga cctggcgtat tctgtttctg gtggcggcgg cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcag aaactatgca 240 cagaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaccggtgg 360 ctggatgctt ttgagatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 57 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Arg Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 81 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Ile Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln 65 70 75 80 Lys <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 59 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Arg Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 60 Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Glu Ile 1 5 <210> 61 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 61 Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Trp Ala Asn Phe Met Leu Ala Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser 20 25 30 Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Ile Arg Thr Ser Gly Ser Ile 35 40 45 Ala Ser Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro 50 55 60 Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 100 105 110 Cys Asp Ile Ser Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 165 170 175 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 62 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 62 atggcgtggg cgccgctgct gctgaccctg ctggcgcatt gcaccggcag ctgggcgaat 60 tttatgctgg ctcagcccca ctctgtgtcg gagtctccgg ggaagacggt aaccatctcc 120 tgtattcgca ccagtggcag cattgccagc aactatgtac agtggtatca gcagcgcccg 180 ggcagttccc ccaccactgt gatctatgag gatgaccaaa gaccctctgg ggtccctgat 240 cgattctctg gctccatcga cagctcctcc aattctgcct ccctcaccat ctctggactg 300 aagactgagg acgaggctga ctactactgt cagtcttgtg atatcagcaa tgtggtattc 360 ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggc caaccgaaag cggcgccctc ggtcactctg 420 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480 gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 600 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 660 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 705 <210> 63 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 63 Asn Phe Met Leu Ala Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Ile Arg Thr Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Cys Asp Ile 85 90 95 Ser Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 64 Ile Arg Thr Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 65 Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 66 Gln Ser Cys Asp Ile Ser Asn Val Val 1 5 <210> 67 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 67 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Gln 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Ala Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Arg Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 68 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 68 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagcagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcgaggctt ctggttacac cttcaccagc tatggtatca gctgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc agcgcttaca atggtaacac agactatgca 240 cagaagctcc agggcagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcgc agcctacatg 300 gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag acaacggtat 360 tactacagta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Arg Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 70 Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 71 Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 72 Gln Arg Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val 1 5 <210> 73 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 73 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr 100 105 110 Asp Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 74 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 74 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ttcccaggct cctcatctat ggtacatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccgtcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtctc cagtatgata ggtcacctcg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705 <210> 75 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 127 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 76 Ala Pro Thr Arg Ser Pro Asn Pro Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val 1 5 10 15 Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asp Met Arg Ala Leu 20 25 30 Glu Asn Glu Lys Asn Glu Asp Val Asp Ile Ile Ser Asn Glu Phe Ser 35 40 45 Ile Gln Arg Pro Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Asn Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ala Leu Thr Met Ile 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Gln Thr Asn Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys 85 90 95 Glu Ile Glu Val Thr Thr Phe Glu Asp Phe Ile Lys Asn Leu Lys Gly 100 105 110 Phe Leu Phe Asp Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Gln Lys 115 120 125 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 77 Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 78 Leu Gln Tyr Asp Arg Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 79 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 79 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Trp Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 80 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 80 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagct ggctgagatc tgacgacacg gccgtatatt actgtgcgag agaccggtgg 360 ctggatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctctgc tagcaccaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720 gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaa 1386 <210> 81 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Trp Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Trp Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser 115 <210> 82 <211> 144 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 82 Met Trp Leu Gln Asn Leu Phe Leu Leu Gly Ser Val Val Cys Thr Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr His Gln Pro Asn Thr Val Ser Gln Pro Leu Lys His 20 25 30 Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Arg Ile Ile Leu Ser Arg Ser Asn Asp 35 40 45 Ser Ala Ala Val Pro Gly Glu Met Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Pro Gln Lys Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Glu Arg Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln Asn Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Glu Thr Glu Phe Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Cys Phe Leu Phe Val Ile Pro Phe Asn Cys Trp Glu Pro Val Gln Lys 130 135 140 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Glu or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Pro, Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Tyr, Trp, Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser, Trp, Phe or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Thr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Tyr or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa iis Met, Thr or Val <400> 83 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gln or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Gln or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp, Gly or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Arg, Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Phe or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Arg or Trp <400> 84 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 85 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 85 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Leu Gly Glu Arg Ala Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Ser Ser Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Ala Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 86 <211> 704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 86 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctctagggga aagagccatc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtcttagc agcatctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccggtct cctcatctat ggtgcttcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag tagtctggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgcta cctcaccgtg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaagt caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtg 704 <210> 87 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 87 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gly Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Thr Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 88 Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Trp or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Gly, Trp or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Val, Leu or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Val or no amino acid residue <400> 89 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser Ser Asn Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 90 Gln Gln Tyr Ala Thr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 91 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 91 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Gly Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Pro Trp Glu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 92 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 92 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggattcac cttcagcggc tactatatgt actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cggaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtatatt actgtgcgag gagaccgtgg 360 gagcttccct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 93 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 93 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Trp Glu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 94 Gly Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 95 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 96 Arg Pro Trp Glu Leu Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 97 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 97 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe 100 105 110 Ser Phe Pro Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 98 <211> 701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 98 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 180 gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 aggttcagtg gcagaggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 300 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agtttcagtt tcccaatcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt g 701 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 100 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 101 Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 102 Gln Gln Ser Phe Ser Phe Pro Ile Thr 1 5 <210> 103 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 103 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala His Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Asn Gly Asp Tyr Val Phe Thr Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 104 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 104 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagttta agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcccacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgtgag aaacggtgac 360 tatgttttta cctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395 <210> 105 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 105 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asn Gly Asp Tyr Val Phe Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Trp or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ile or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asn, Ser or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Pro, Ala, Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Thr or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Tyr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Gln or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Phe or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gln, Lys or Arg <400> 106 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Glu or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Try or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Thr or Ala <400> 107 Lys Ser Ser Gln Ser Xaa Leu Tyr Ser Ser Xaa Asn Xaa Asn Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 108 Asn Gly Asp Tyr Val Phe Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 109 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 109 Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val 35 40 45 Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Gly Arg Pro Ser Gly Val Ser 65 70 75 80 Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe 100 105 110 Thr Gly Ser Ser Thr Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 165 170 175 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 110 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 110 atggcgtggg cgccgctgct gctgaccctg ctggcgcatt gcaccggcag ctgggcgcag 60 tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gacagtcgat caccatctcc 120 tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccagcagcac 180 ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagtg gtcggccctc aggggtttct 240 aatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tggactccag 300 gctgaggacg aggctgatta ttactgcagc tcttttacag gcagcagcac ttggttattc 360 ggcggaggga ccaaactgac cgtcctaggc caaccgaaag cggcgccctc ggtcactctg 420 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480 gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 600 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 660 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 705 <210> 111 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 111 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Gly Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Gly Ser 85 90 95 Ser Thr Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 112 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 112 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 113 Glu Val Ser Gly Arg Pro Ser 1 5 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 114 Ser Ser Phe Thr Gly Ser Ser Thr Trp Leu 1 5 10 <210> 115 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 115 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Gly Tyr Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 225 230 235 240 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 116 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 116 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcaactgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aatcctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagtttc ggggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag atttggatat 360 tttggctact actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagctagc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aa 1392 <210> 117 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 117 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Tyr Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gln or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Val, Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ser or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Ser, Ile, Thr or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Phe or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ala or Asn <400> 118 Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa 1 5 10 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 119 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 120 Phe Gly Tyr Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 121 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 121 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Trp Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 122 <211> 704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 122 atggaaaccc cggcgcagct gctgtttctg ctgctgctgt ggctgccgga taccaccggc 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtcc gagtgttagc agcagctact ttgcctggta ccagcaaaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggtt ggtcacctcg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtg 704 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable domain <400> 123 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Trp Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 124 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 124 Arg Ala Ser Pro Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala 1 5 10 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ile, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Arg or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Arg or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser, His or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Ala or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Gly or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Tyr or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is Gln, Asn or Ser <400> 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Val Xaa 1 5 10 15 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 126 Gln Gln Tyr Gly Trp Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 127 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 127 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Val Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 128 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 128 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtacaactgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaattatgca 240 cagaagtttc ggggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacgtg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtatatt actgtgcgag agacccgtat 360 accagtggct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 129 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable <400> 129 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gly, Thr or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Arg or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Thr or Ser <400> 130 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Glu or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asp, Val or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asp, Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gln, Gly or His <400> 131 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Ser 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 132 Asp Pro Tyr Thr Ser Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 133 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 133 Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr 20 25 30 Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser His Ile 35 40 45 Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 85 90 95 Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp 100 105 110 Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 115 120 125 Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser 165 170 175 Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn 180 185 190 Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp 195 200 205 Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 134 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 134 atggcgtggg cgccgctgct gctgaccctg ctggcgcatt gcaccggcag ctgggcgcag 60 tctgtgctga ctcagccacc ctcagcgtct gggacccccg ggcagagggt caccatctct 120 tgttctggaa gccgctccca catcggaagt aatactgtaa actggtacca gcacctccca 180 ggaacggccc ccaaactcct catctatagt aataatcatc ggccctcagg ggtccctgac 240 cgattctctg gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gctccagtct 300 gaggatgagg ctgattatta ctgtgcagca tgggatgaca gcctgaatgg tccggtattc 360 ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggc caaccgaaag cggcgccctc ggtcactctg 420 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480 gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 600 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 660 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 705 <210> 135 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <400> 135 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser His Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 136 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 136 Ser Gly Ser Arg Ser His Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 137 Ser Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 138 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 1 5 10 <210> 139 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 139 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Arg Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Thr Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 140 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 140 atggattgga cctggagcat tctgtttctg gtggcggcgc cgaccggcgc gcatagccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagaagt ggtggttact actggagctg gatccgccag 180 cacccaggga agggcctgga gtggattggg tatatctatt acagtgggag cacctactac 240 aacccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga actctgtgac tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggat 360 acagctatgg actactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395 <210> 141 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <400> 141 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Asp Thr Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 142 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 143 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 144 Glu Asp Thr Ala Met Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 145 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF-Ile <400> 145 Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Met Asn Glu Glu Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 146 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Arg Gln Pro Trp Glu His Val 1 5 10 15 Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp 35 40 45 Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met 65 70 75 80 Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp 100 105 110 Phe Leu Leu Val Thr Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly 115 120 125 <210> 147 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gly or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Gly or no amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Thr, Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is Tyr or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ile or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is His or Ser <400> 147 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (37)

  1. A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1;
    (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2;
    (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및
    (iv) 4개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH
    로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH);
    B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1;
    (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2;
    (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및
    (iv) 4개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL
    로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL); 또는
    C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL
    을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, A)의 적어도 하나의 CDRH 및 B)의 적어도 하나의 CDRL을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, A)의 적어도 2개의 CDRH 및 B)의 적어도 2개의 CDRL을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 A)의 CDRH가
    (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1;
    (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2;
    (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3; 및
    (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH
    로 이루어지는 군 중에서 선택되거나;
    상기 B)의 CDRL이
    (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1;
    (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2;
    (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3; 및
    (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL
    로 이루어지는 군 중에서 선택되거나; 또는
    C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함하는
    단리된 항원 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1;
    (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2;
    (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH;
    B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1;
    (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2;
    (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL; 또는
    C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL
    을 포함하는, 단리된 항원 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, A) 서열 10, 22, 70 및 142의 CDRH1, 서열 11, 23, 35, 47, 59, 71, 95 및 143의 CDRH2, 및 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108, 120, 132 및 144의 CDRH3, 및 B) 서열 4, 16, 40, 52, 64, 88, 100, 112, 124 및 136의 CDRL1, 서열 5, 17, 29, 41, 65, 77, 89, 101, 113 및 137의 CDRL2, 및 서열 6, 18, 42, 66, 78, 126 및 138의 CDRL3을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역 (VH), 및/또는 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 구역 (VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, VH가 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖고/갖거나 VL이 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 항원 결합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, VH가 서열 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129 및 141로 이루어지는 군 중에서 선택되고/되거나 VL이 서열 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123 및 135로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 단리된 항원 결합 단백질.
  11. A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1;
    (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2;
    (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR (CDRH);
    B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1;
    (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2;
    (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR (CDRL); 또는
    C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL
    을 포함하는, GM-CSF에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    A) (i) 서열 10, 22, 70, 94 및 142로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1;
    (ii) 서열 11, 23, 28, 35, 47, 59, 71, 95, 106, 119 및 143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2;
    (iii) 서열 12, 24, 36, 48, 60, 72, 83, 96, 108, 120, 132 및 144로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 CDRH;
    B) (i) 서열 4, 16, 30, 40, 52, 64, 88, 100, 107, 112, 118, 124, 125 및 136으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1;
    (ii) 서열 5, 17, 29, 34, 41, 65, 77, 101, 113, 130, 131 및 137로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2;
    (iii) 서열 6, 18, 42, 46, 66, 78, 84, 89, 90, 102, 114, 126 및 138로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3
    으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 CDRL; 또는
    C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL
    을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이들의 항체 단편인 단리된 항원 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디 또는 단일쇄 항체 분자인 단리된 항원 결합 단백질.
  15. 제13항에 있어서, 인간 항체인 단리된 항원 결합 단백질.
  16. 제13항에 있어서, 모노클로날 항체인 단리된 항원 결합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, IgG1-, IgG2-, IgG3- 또는 IgG4-형인 단리된 항원 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, IgG1- 또는 IgG2-형인 단리된 항원 결합 단백질.
  19. 제1항에 있어서, 표지기에 커플링되는 단리된 항원 결합 단백질.
  20. 제1항에 있어서, 인간 GM-CSF의 세포외 부분에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하는 단리된 항원 결합 단백질.
  21. 제1항에 따른 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 핵산 분자.
  23. 제21항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제22항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  25. 제22항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제24항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제1항에 따른 항원 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 상기 항원 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 항원 결합 단백질을 제조하는 방법.
  28. 적어도 하나의 제1항에 따른 항원 결합 단백질, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 추가의 활성 물질을 더 포함하는 제약 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 추가의 활성 물질이 방사선 동위원소, 방사선 핵종, 독소, 또는 치료기 및 화학치료기로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  31. 환자에게 유효량의 적어도 하나의 제1항에 따른 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 GM-CSF와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 병태가 류마티스 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 질환, 종양학적 질환, 염증성 질환, 신경계의 퇴행성 병태, 위장관, 위비뇨기 질환 및 내분비 질환으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 병태가 다발 경화증, 류마티스 관절염, 천식, 건선, 아토피 피부염 및 사르코이드증 (sarcoidosis)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 단리된 항원 결합 단백질을 단독으로 또는 조합 요법으로 투여하는 방법.
  35. 유효량의 적어도 하나의 제1항에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 GM-CSFR의 세포외 부분에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하는 방법.
  36. 유효량의 적어도 하나의 제1항에 따른 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 GM-CSF 활성을 억제하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, GM-CSF 활성이 골수 계열 세포의 분화, 생존, 증식 및 활성화로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
KR1020107008307A 2007-09-18 2008-09-18 인간 ｇｍ－ｃｓｆ 항원 결합 단백질 KR101274356B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99434307P 2007-09-18 2007-09-18
US60/994,343 2007-09-18
US8755108P 2008-08-08 2008-08-08
US61/087,551 2008-08-08
PCT/US2008/010888 WO2009038760A2 (en) 2007-09-18 2008-09-18 Human gm-csf antigen binding proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100059985A true KR20100059985A (ko) 2010-06-04
KR101274356B1 KR101274356B1 (ko) 2013-06-25

Family

ID=40210593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107008307A KR101274356B1 (ko) 2007-09-18 2008-09-18 인간 ｇｍ－ｃｓｆ 항원 결합 단백질

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8268311B2 (ko)
EP (2) EP2205636A2 (ko)
JP (1) JP2010538676A (ko)
KR (1) KR101274356B1 (ko)
CN (1) CN101861336A (ko)
AR (1) AR066164A1 (ko)
AU (1) AU2008302747B2 (ko)
BR (1) BRPI0817007A2 (ko)
CA (1) CA2698667C (ko)
CL (1) CL2008002750A1 (ko)
CR (1) CR11374A (ko)
EA (1) EA201000490A1 (ko)
MX (1) MX2010002968A (ko)
NZ (1) NZ583787A (ko)
PE (1) PE20091193A1 (ko)
TW (1) TW200918553A (ko)
WO (1) WO2009038760A2 (ko)
ZA (1) ZA201002160B (ko)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008253608A1 (en) * 2007-05-23 2008-11-27 Crc For Asthma And Airways Ltd Neutralizing antibodies
EP2217626A4 (en) * 2007-11-12 2011-06-22 Crc For Asthma And Airways Ltd EPITOP FOR NEUTRALIZING ANTIBODIES
DK2215119T3 (da) 2007-11-13 2013-02-04 Evec Inc Monoklonale antistoffer der binder til HGM-CSF og medicinske sammensætninger omfattende de samme.
NZ588850A (en) 2008-04-28 2012-12-21 Kalobios Pharmaceuticals Inc Antibodies to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
CN108014335A (zh) 2008-12-22 2018-05-11 墨尔本大学 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的拮抗剂的用途
CN102271705A (zh) * 2008-12-22 2011-12-07 墨尔本大学 骨关节炎治疗
WO2010124163A2 (en) * 2009-04-23 2010-10-28 Theraclone Sciences, Inc. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gm-csf) neutralizing antibodies
KR20140064943A (ko) * 2009-05-05 2014-05-28 모르포시스 아게 다발성 경화증의 치료
US9567398B2 (en) 2010-11-18 2017-02-14 Merck Serono S.A. Antibody with specificity for GM-CSF (II)
US9567397B2 (en) 2010-11-18 2017-02-14 Merck Serono S.A. Antibody with specificity for GM-CSF (I)
BR112013033944A2 (pt) 2011-07-06 2017-12-19 Morphosys Ag combinação sinérgica
WO2013090989A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Csl Limited Method of treating inflammatory bowel disease
MA37946B1 (fr) 2012-09-20 2018-09-28 Morphosys Ag Utilisation d’un anticorps anti-gm-csf pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde
AR093297A1 (es) 2012-10-31 2015-05-27 Amgen Res (Munich) Gmbh Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf
US9833410B2 (en) 2012-10-31 2017-12-05 Takeda Gmbh Lyophilized formulation comprising GM-CSF neutralizing compound
ES2860480T3 (es) 2013-08-30 2021-10-05 Takeda Gmbh Anticuerpos neutralizantes de GM-CSF para su uso en el tratamiento de la artritis reumatoide o como analgésicos
WO2015066262A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 Trustees Of Dartmouth College Methods for preventing toxicity of adoptive cell therapy
US11173208B2 (en) 2014-05-07 2021-11-16 Takeda Gmbh Liquid formulation comprising GM-CSF neutralizing compound
US11554181B2 (en) 2014-09-05 2023-01-17 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibody conjugates and uses therefor
JP6729911B2 (ja) * 2014-09-26 2020-07-29 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール Ｔｈ−ｇｍ細胞の機能を調節するための方法および組成物
CA3005158A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
WO2016079276A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist and an anti-ccr2 antagonist in the treatment of an infectious disease
WO2016079277A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist in the treatment of an infectious disease
EP3288975A1 (en) * 2015-04-29 2018-03-07 Institute for Research in Biomedicine Ultra-potent neutralization of cytokines by multispecific antibodies and uses thereof
EP3324996A4 (en) * 2015-07-22 2019-04-17 Scholar Rock, Inc. GDF11 BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
ES2881642T3 (es) 2015-09-15 2021-11-30 Scholar Rock Inc Anticuerpos anti-pro-miostatina/miostatina latente y usos de los mismos
MX2018008369A (es) 2016-01-08 2019-05-15 Scholar Rock Inc Anticuerpos de anti-miostatina pro/latente y metodo de uso de los mismos.
ES2830440T3 (es) 2016-06-13 2021-06-03 Scholar Rock Inc Uso de inhibidores de miostatina y terapias combinadas
SG11201900200XA (en) * 2016-07-14 2019-02-27 Scholar Rock Inc Tgfb antibodies, methods, and uses
JP7256116B2 (ja) 2016-09-19 2023-04-11 アイ－エムエービー バイオファーマ （ハンジョウ） カンパニー リミテッド 抗ｇｍ－ｃｓｆ抗体およびその使用
CN107840885B (zh) * 2016-09-19 2020-11-10 天境生物科技(上海)有限公司 Gm-csf抗体及其用途
HRP20230308T1 (hr) 2017-01-06 2023-05-12 Scholar Rock, Inc. Liječenje metaboličkih bolesti putem inhibiranja aktivacije miostatina
JOP20190248A1 (ar) * 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
WO2019055618A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University METHODS OF CLASSIFYING RESPONSES TO ANTICANCER IMMUNOTHERAPY
EP3623382A1 (en) 2018-09-14 2020-03-18 Universität Zürich Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct
US11655293B2 (en) 2018-02-22 2023-05-23 Universitat Zurich Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT
CN113194715B (zh) * 2018-10-31 2024-03-19 赫曼尼根公司 用于治疗癌症的材料和方法
WO2021045728A1 (en) * 2019-09-03 2021-03-11 The University Of North Carolina At Charlotte Tumor specific antibody conjugates and uses therefor
WO2021067550A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions for identifying neoantigens for use in treating and preventing cancer
US20230147852A1 (en) * 2020-04-03 2023-05-11 Sorrento Therapeutics, Inc. Engineered Antibodies That Bind LAG3
JP2020162622A (ja) * 2020-06-25 2020-10-08 インスティテュート フォー リサーチ イン バイオメディシン 多重特異性抗体によるサイトカインの非常に強力な中和およびその利用
WO2022125822A1 (en) * 2020-12-10 2022-06-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Canine cancer vaccine
WO2023200873A2 (en) * 2022-04-12 2023-10-19 Washington University Chimeric antigen receptor compositions and methods of using the same
CN117126277B (zh) * 2023-10-26 2024-01-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
GB8624899D0 (en) 1986-10-17 1986-11-19 Sandoz Ltd Monoclonal antibodies
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5070013A (en) 1988-05-31 1991-12-03 Schering Corporation Immunochemical assay for human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU630496B2 (en) * 1989-07-14 1992-10-29 Schering Corporation Antagonists of gm-csf derived from the carboxyl terminus
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2060741A1 (en) * 1991-02-11 1992-08-12 Robert S. Greenfield Gm-csf inhibiting oligopeptides
JP3126980B2 (ja) 1991-03-11 2001-01-22 ザ・ユニバーシテイ・オブ・ジヨージア・リサーチ・フアウンデーシヨン・インコーポレーテツド レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのクローニング及び発現
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
CA2111348A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 John S. Logan Production of human hemoglobin in transgenic pigs
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
AU678787B2 (en) 1992-10-23 1997-06-12 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
EP0759170B1 (en) 1993-09-10 2008-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
AUPN780096A0 (en) 1996-01-30 1996-02-22 Medvet Science Pty. Ltd. Cytokine antagonists and agonists
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
PT1500329E (pt) 1996-12-03 2012-06-18 Amgen Fremont Inc Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano
IL129767A0 (en) 1996-12-12 2000-02-29 Prolume Ltd Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US6232107B1 (en) 1998-03-27 2001-05-15 Bruce J. Bryan Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7108852B2 (en) 2000-03-20 2006-09-19 Warner-Lambert Company Llc Methods of treating inflammation using antibodies to M-CSF
US7455836B2 (en) 2000-05-08 2008-11-25 The University Of Melbourne Method of treatment and agents useful for same
ATE444308T1 (de) 2002-02-13 2009-10-15 Ludwig Inst Cancer Res Fusionsproteine humanisierter g250-spezifischer antikörper sowie verwendungen davon
EP1631315B1 (en) * 2003-09-24 2014-07-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies which bind human cxcr3
WO2005034733A2 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods and compositions for diagnosis and treatment of b cell chronic lymphocytic leukemia
EP1593690B1 (en) 2004-05-05 2009-07-01 Micromet AG Preparation of ScFv antibody fragments
EA013162B1 (ru) * 2005-04-18 2010-02-26 Микромет Аг Антитела-нейтрализаторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека
RU2447085C2 (ru) * 2005-05-18 2012-04-10 МорфоСис АГ Анти-gm-csf антитела и их применение
JP4736037B2 (ja) 2005-10-26 2011-07-27 株式会社イーベック ヒトｇｍ−ｃｓｆに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分
JP5714212B2 (ja) * 2005-12-08 2015-05-07 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＭｅｄａｒｅｘ， Ｌ．Ｌ．Ｃ． Ｏ８ｅに対するヒトモノクローナル抗体
JP5210889B2 (ja) 2006-02-08 2013-06-12 モルフォテック、インク． 抗原性ｇｍ−ｃｓｆペプチドおよび抗ｇｍ−ｃｓｆ抗体
EP2101780B1 (en) * 2006-11-21 2013-10-09 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating chronic inflammatory diseases using a gm-csf antagonist
NZ588850A (en) 2008-04-28 2012-12-21 Kalobios Pharmaceuticals Inc Antibodies to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

Also Published As

Publication number Publication date
EA201000490A1 (ru) 2010-10-29
NZ583787A (en) 2012-05-25
CA2698667C (en) 2013-12-24
KR101274356B1 (ko) 2013-06-25
US8268311B2 (en) 2012-09-18
US20130259799A1 (en) 2013-10-03
WO2009038760A2 (en) 2009-03-26
US8481704B2 (en) 2013-07-09
CA2698667A1 (en) 2009-03-26
CR11374A (es) 2010-05-19
US20110189082A1 (en) 2011-08-04
MX2010002968A (es) 2010-06-15
BRPI0817007A2 (pt) 2015-03-24
CN101861336A (zh) 2010-10-13
PE20091193A1 (es) 2009-09-06
CL2008002750A1 (es) 2009-02-06
US20130071923A1 (en) 2013-03-21
WO2009038760A3 (en) 2009-08-20
TW200918553A (en) 2009-05-01
AU2008302747B2 (en) 2012-02-02
JP2010538676A (ja) 2010-12-16
ZA201002160B (en) 2011-06-29
EP2205636A2 (en) 2010-07-14
EP2236519A1 (en) 2010-10-06
AU2008302747A1 (en) 2009-03-26
AR066164A1 (es) 2009-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100059985A (ko) 인간 ｇｍ－ｃｓｆ 항원 결합 단백질
KR102161460B1 (ko) St2 항원 결합 단백질
US8101184B2 (en) Treatment methods using Dkk-1 antibodies
CA2497884C (en) Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
KR100899213B1 (ko) Ｍ-ｃｓｆ에 대한 항체
CA2479927C (en) Human monoclonal antibodies to interleukin-5 and methods and compositions comprising same
US7718776B2 (en) Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
KR101950306B1 (ko) Ｉｌ-17ａ 및 ｉｌ-17ｆ에 결합하는 항체 분자
AU2012201043A1 (en) Human GM-CSF antigen binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee