SE504671C2 - Hemoglobinmultipelemulsion samt förfarande för framställning av densamma - Google Patents

Description

504 671 för människor, och det bör uppvisa histokompatibilitet och icke ge några antigena verkningar. Vidare bör det ha en lämplig livslängd i cirkulationssystemet för att kunna tillhandahålla syre under önskad tid, det bör uppvisa relativt snabb meta- bolism eller utsöndring av kemiska medel, och det bör ha lämp- lig lagringsbeständighet. Hittills har inget blodersättnings- medel godkänts för användning i USA.

Man har försökt att åstadkomma blodersättningsmedel genom användning av medier med hög passiv syrelöslighet, huvud- sakligen perfluorkolemulsioner, men dessa har visat sig vara instabila, ha otillräcklig syrebärande förmåga och vara giftiga för människor. Ett problem med många perfluorkolemulsioner har varit de höga syrekoncentrationer som erfordras på grund av att fluorkolemulsionen uppbär syre genom passiv löslighet, och dessutom har det varit nödvändigt att förvara emulsionen i fryst tillstånd för att den skall förbli stabil.

De mest lovande försöken har omfattat användning av kemiskt hemoglobin i olika former. Även om stromafria hemoglo- binlösningar har lämplig syrebärande kapacitet, så har de en hög syreaffinitet och ett högt kolloidalt osmotiskt tryck.

Dessutom är de eventuellt giftiga, och de avlägsnas alltför snabbt ur det kardiovaskulära cirkulationssystemet. Ett problem med stromafria hemoglobinlösningar har varit att de har en mycket högre syreaffinitet än normalt hemoglobin i röda blod- celler, och därför frigöres syre företrädesvis från det cellu- lära hemoglobinet. Seghal, L.R., Gould, S.A., Rosen, A.L.

Moss, 6.5.: Appraisal of Red Cell Substitutesz Hemoglobin Solu- tion and Perfluorochemical Emulsions, Laboratory Medicine, 14:5A5, 1983; Gould, S.A., Rosen, A.L., Sehgal, L.R., Moss, G.S.: Red Cell Substitutes: Hemoglobin Solution or Fluorocarbon?, J. Trauma, 22:736, 1982; Gould, S.A., Rosen, A.L., Sehgal, L.R.

Moss, G.S.: Hemoglobin Solutions as Red Cell Substitutes; Trans. Am. Soc. Art. Int. Organs, 26:35Û, 1980. Pyridoxylering och efterföljande polymerisation av stromafria hemoglobinlös- ningar har minskat många av de ovan angivna problemen förutom den höga syreaffiniteten och den eventuella giftigheten. Denna process medför också bildning av en del methemoglobin, som är en form av hemoglobin som icke kan överföra syre. Seghal, L.R., 504 671 Rosen, A.L., Gould, S.A., Moss, G.S.: Polymerized Pyrodoxylated Hemoglobin: A Red Cell Substitute with Normal Ûxygen Capacity, Surgery, 95:433, 1984: Keipert, P.E., Chang, T.M.S.: Prepara- tion and In-vitro Characteristics of Pyridoxylated Polyhemo- globin as Blood Substitutes, Appl. Biochem. Biotechnol. 1Ü:133, 1984.

Man har också försökt att inkapsla en hemoglobinlösning i en syntetisk cell. Sålunda har hemoglobinlösningar inkapslats i nylonmembran, tvärbundna proteinmembran och polyhemoglobin- membran samt i liposomer som inkapslar hemoglobin i fosfolipid- vesikler. Miller, I., Synthetic Blood Substitutes: Where Are We and Where Do We Go From Here? CRC, Crit. Rev. BioEng., 149-178, Dec. 1978. Inkapsling av små droppar av hemoglobinlösning i ett polymeriserat hemoglobin-inkapslmuæ membran med användning av glutaraldehyd såsom tvärbindningsmedel beskrives i "Artificial Red Cells with Crosslinked Hemoglobin Membranes, Thomas A.

Davis, William J. Asher och Herbert W. Wallace, Applied Bio- chemistry and Biotechnology, Vol. 10, pp. 123-132 (1984). Även om många av problemen med andra blodersättningsmedel kan över- vinnas genom användning av liposom-inkapslat hemoglobin, så frigöres en dylik produkt alltför snabbt ur cirkulationssyste- met, den har begränsad syrebärande kapacitet, och den har låg inkapslingseffekt, av storleksordningen 10-20%. Några av de ovan angivna problemen övervinnes genom den produktion av liposom-inkapslat hemoglobin i större skala som beskrives i den godkända amerikanska patentansökan 901 710 (ingiven 29 augusti 1986).

I "An Attempt at Preparing Water-in-Oil-in-Water Multiple Phase Emulsions", av Sachio Matsumoto, Yashiko Kita och Daizo Yonezawa, Journal of Colloid and Interface Science, vol. 57, nr 2, pp. 353-361 (1976) beskrives framställning av multipelemulsioner av vatten i olja i vatten med användning av nonjoniska emulgeringsmedel, avjoniserat destillerat vatten och flytande paraffin. Härvid bildas först en emulsion av vatten i olja genom blandning, varefter denna emulsion homogeniseras till bildning av en emulsion av olja 1 vatten. Emuisioner av vatten i olivolja i vatten har framställts med användning av en blandning av sojalecitin och emulgeringsmedlet Span 80, som 504 671 samverkar under bildning av en viskoelastisk film vid gränsytan mellan olja och vatten, och en sackaros-fettsyraester i den yttre vattenfasen. Se "Preparation of Water-In Ûlive Ûil Multiple-Phase Emulsions in an Eatable Form", Sachio Matsumoto, Yoshiro Ueda, Yoshiko Kito och Daizo Yonezawa, Agric. Biol.

Chem., 42, nr 4, pp. 739-743 (1978).

Föreliggande uppfinning avser en flytande dubbelemul- sion av en vattenlösning av ett syrebärande material, såsom hemoglobin, i olja i en yttre vattenfas. Den flytande dubbel- emulsionen enligt föreliggande uppfinning innehåller ett pri- märt emulgeringsmedel som underlättar bildning och vidmakt- hållande av prímäremulsionen av vattenlösning av hemoglobin i olja. Ett sekundärt emulgeringsmedel användes för bildning och vidmakthållande av sekundäremulsionen, som består av primär- emulsionen i en yttre vattenfas. Primäremulsionen kan sålunda bestå av små droppar, som var och en innefattar individuella små droppar eller ett flertal individuella små droppar av vattenlösning av hemoglobin i oljefasen, och sekundäremulsionen består av små droppar, som var och en innehåller individuella små droppar eller ett flertal individuella små droppar av pri- märemulsionen suspenderad i den yttre vattenfasen. Detta visas schematiskt i fig 1. Ûljefasen kan innehålla mineralolja eller vegetabilisk olja som ger tillfredsställande emulsionsstabilitet. Såsom exempel på lämpliga vegetabiliska oljor kan man nämna olivolja, safflorolja, sesamolja och sojaolja. Mineraloljor föredrages, särskilt teknisk vit olja nr 40, tunn olja Carnation och tunn olja Klearol. Blandningar av dessa oljor kan användas.

För framställning av multipelemulsionen enligt före- liggande uppfinning är det nödvändigt att först framställa pri- märemulsionen och sedan i en separat process framställa sekun- däremulsionen. Man har funnit att det vid framställning av pri- märemulsionen är nödvändigt att först blanda komponenterna med användning av en omrörare, såsom en magnetomrörare, varefter blandningen ledes genom en mikrofluidiseringsanordning som åstadkommer stor skjuvpåverkan och kavitation. Sekundäremulsio- nen framställes separat genom omrörning, t.ex. medelst en magnetomrörare, varefter den önskade lilla partikelstorleken 504 671 åstadkommas genom filtrering. Man har funnit att blandning med stor skjuvpåverkan icke är lämplig för bildning av sekundär- emulsionen.

Multipelemulsionerna enligt föreliggande uppfinning har följande egenskaper.

Största acceptabla intervall Föredraget intervall Viskositet 3-9 cP 3-5 cP Primäremulsionens droppstorlek upp till 5 um upp till 3 um Sekundäremulaionens droppstorlek efter filtrering upp till 10 pm upp till 8 um Utbyte 85-99 % 95-99 % Syrebärande kapacitet 7-20 volym-% 10-20 volym-% Primäremulsionen och sekundäremulsionen har företrädesvis så liten droppstorlek som är förenlig med god stabilitet. Üver 50% av den nyframställda primäremulsionens små droppar är mindre än 0,5 um, och över 50% av den nyframställda sekundäremulsionens små droppar är mindre än 4 um. Emulsionerna enligt föreliggande uppfinning kan vara makroemulsioner eller mikroemulsioner.

Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning till den bifogade ritningen, på vilken fig 1 schematiskt visar en flytande dubbelemulsion enligt uppfinningen, bestående av en vattenlösning av hemoglobin i olja i en yttre vattenfas; fig 2 är ett förenklat diagram visande de steg som ingår i ett fram- ställningsförfarande enligt uppfinningen; fig 3 är ett diagram som visar syredissociationen i dels helblod och dels en flytan- de multipelemulsion enligt föreliggande uppfinning, bestående av en vattenlösning av hemoglobin i olja i en yttre vattenfas; och fig 4 är ett diagram som visar halveringstiden för en flyt- ande dubbelemulsion enligt uppfinningen injicerad till möss.

I primäremulsionsdelen av multipelemulsionen enligt föreliggande uppfinning kan man använda en vattenlösning av 504 671 vilket som helst syrebärande material. Såsom exempel på lämp- liga syrebärande material kan man nämna hemoglobin från human- blod eller från nötkreaturskällor eller modifierat hemoglobin, såsom pyridoxylerat polyhemoglobin. Hela processen genomföras företrädesvis under kylning, t.ex. vid en temperatur av ca 4-8°C, för minskning av bildningen syre-inaktivt methemoglobin.

Processen bör också genomföras under aseptiska betingelser, när multipelemulsionen skall användas såsom blodersättningsmedel.

Alla lösningar som användes vid framställning av multipelemul- sionen filtreras genom ett steriliserande filter under fram- ställning av en multipelemulsion avsedd att användas såsom blodersättningsmedel. Detta gäller även vid tillsättning av antibiotika. Hemoglobinet kan isoleras från röda blodceller en- ligt vilken som helst lämplig, välkänd metod, och man kan fram- ställa en relativt stromafri vattenlösning av hemoglobin inne- hållande ca 1-35 g hemoglobin per 100 ml, företrädesvis ca 5-35 g hemoglobin per 100 ml. När vattenlösningen av hemoglobin skall användas såsom blodersättningsmedel, kan den dialyseras mot en fosfatbuffrad saltlösning, och den kan innehålla anti- biotika, albumin, glukos, pyridoxol-5-fosfat (vitamin A) och kolsyraanhydras.

Mineraloljor eller vegetabiliska oljor användes lämp- ligen för framställning av primäremulsionen. De föredragna mineraloljorna är teknisk vit olja nr 40, som har en viskosi- tet av 4-5 cSt vid A0", ett SG-värde av 0,804-0,820 vid 25°C, en lägsta flyttemperatur av 2°C och en lägsta flampunkt av 135°C; tunn mineralolja Carnation, som har en viskositet av 11-14 c5t vid &0°C, ett SG-värde av 0,837-0,953 vid 25°C, en lägsta flyttemperatur av -7°C och en lägsta flampunkt av 177°C; och tunn mineralolja Klearol, som har en viskositet av 7-10 cSt vid 40°C, ett SG-värde av 0,822-0,833, en lägsta flyttemperatur av -7°C och en lägsta flampunkt av 138°C. Alla dessa oljor kan erhållas från Witco Chemical Corp. De föredragna vegetabiliska oljorna är sesamolja, olivolja och safflorolja, som erhålles från Croda Inc., New York, N.Y. Emulgeringsmedlet för primär- emulsionen kan vara polyoxyetylenalkohol, såsom Brij 93, eller sorbitan-monooleat, såsom Spa 80, som båda kan erhållas från ICI America Inc. Detta emulgeringsmedel löses i oljefasen i en 504 671 mängd av 2-30 volym-%, företrädesvis 5-15 volym-%, räknat på primäremulsionens totala volym.

För framställning av en primäremulsion med användning av mineralolja blandas en vattenlösning av hemoglobin i en mängd av ca 40-90 volym-%, företrädesvis 60-70 volym-%, mine- ralolja i en mängd av ca 8-58 volym-%, företrädesvis ca 14-25 volym-%, och primärt emulgeringsmedel i en mängd av ca 2-30 volym-%, företrädesvis ca 5-15 volym-%. För framställning av en primäremulsion med användning av vegetabilisk olja blandas en vattenlösning av hemoglobin i en mängd av ca 40-90 volym-%, företrädesvis ca 40-60 volym-%, vegetabilisk olja i en mängd av ca 5-30 volym-%, företrädesvis ca 20-30 volym-%, och primärt emulgeringsmedel i en mängd av ca 5-30 volym-%, företrädesvis ca 20-30 volym-%. Vattenlösningen av hemoglobin sättas före- trädesvis långsamt till den snabbt omrörda oljefasen, och blandningen genomröres med exempelvis en magnetomrörare under en tid av ca 15-60 min, företrädesvis ca 25-35 min. Den blanda- de primäremulsionen underkastas sedan emulgering under kraftig skjuvpåverkan som ger skjuvningsgrader av ca 100 ÜML5 0mJ000 s_1, företrädesvis ca 500 000-1 000 000 sJ. Härvid användes en mikrofluidi seringsanordning med ett tryckfall av ca 6,9-20,7 MPa, före- trädesvis ca 12,4-13,8 MPa. Mera fullständiga uppgifter om mikrofluidiseringsanordningar återfinnes i den amerikanska patentskriften 4 533 254. Primäremulsionen filtreras, t.ex. med användning av ett filter av hydrofil polyvinylidendifluorid med en porositet av 5 um (Duropore, Millipore Corp.). Före emulge- ringen kan albumin sättas till hemoglobinlösningen i en mängd av ca 1-5 g/100 ml, företrädesvis ca 2-3 g/100 ml.

Den primäremulsion av vattenlösning av hemoglobin i mineralolja eller vegetabilisk olja som är lämplig för fram- ställning av den flytande multipelemulsionen enligt föreliggan- de uppfinning bör bestå av små droppar med en diameter som är mindre än 5 um, företrädesvis mindre än 3 um.

Den yttre vattenfasen i multipelemulsionen kan bestå av vilken som helst vattenhaltig vätska beroende på det avsedda användningsområdet för multipelemulsionen. Dm multipelemulsio- nen skall användas såsom blodersättningsmedel, utgöres den yttre vattenfasen företrädesvis av en isoton fosfatbuffrad 504 671 saltlösning med ett pH-värde av ca 7,4. Emulgeringsmedlet för sekundäremulsionen kan utgöras av polyoxyetylenfettsyraestrar, såsom Tween 40, Tween 60 och Tween 80 (ICI America lnc.), eller etylenoxidpolymerer, såsom Pluronic<:)F68 (BASF Wyandotte Corp.), företrädesvis Tween 60 eller Pluronic F68. Detta emulgeringsmedel löses i den yttre vattenfasen i en mängd av 0,25-2 vikt-%, företrädesvis 0,25-0,75 vikt-%, räknat på den yttre vattenfasens totala vikt.

Primäremulsionen, det sekundära emulgeringsmedlet och den yttre vattenfasen blandas till bildning av en sekundär emulsion. En likformig dispersion åstadkommas genom omrörning med exempelvis en magnetomrörare under en tid av ca 15-60 min, företrädesvis ca 25-35 min. För bildning av sekundäremulsionen föredrager man att sätta primäremulsionen till den yttre vattenfasen. Den slutliga multipelemulsionen innehåller lämp- ligen ca 10-90 volym-%, företrädesvis ca 35-50 volym-%, primär- emulsion och ca 10-90 volym-%, företrädesvis ca 50-65 volym-%, yttre vattenfas. Sekundäremulsionen kan filtreras enligt vilken som helst känd metod för bildning av en slutlig sekundäremul- sionsprodukt med önskad droppstorlek, både maximal droppstorlek och genomsnittlig droppstorlek. Före en dylik filtrering har sekundäremulsionens små droppar en maximal storlek av ca 20- 50 um och en medeldiameter av ca 10-20 um. Genom filtrering kan man lätt minska den maximala droppstorleken till mindre än 10 um och den genomsnittliga droppstorleken till mindre än 5 um. En multipelemulsion lämplig att använda såsom blodersätt- ningsmedel kan erhållas genom att emulsionen upp till tre gånger får passera genom ett filter, såsom ett filter av hydrofil polyvinylidendiofluorid med en porositet av 5 um.

Vilka som helst önskade vattenlösliga additiv kan sättas till den yttre vattenfasen, såsom albumin i en mängd av 0,5-1,5 g/100 ml och dextran i en mängd av 0,5-1,0 g/100 ml.

Dessa additiv har visat sig göra partikelstorleksfördelningen snävare och stabilisera multipelemulsionen. Likaså kan man tillsätta önskade antibiotika, såsom ovan har angivits för hemoglobinlösningen.

De enligt föreliggande uppfinning framställda multipel- emulsionerna har visat sig vara mycket stabila. Med termen "ut- 504 671 byte" avses den ursprungliga mängden hemoglobin i primäremul- sionen jämfört med den mängd hemoglobin som har trängt ut i den yttre vattenfasen. Efter framställningen har multipelemulsio- nerna visat sig ha ett utbyte av ca 99% före filtrering, och efter tre passager genom ett filter med porositeten 5 pm har utbytet minskat till ca 97%. Utbytet minskar under lagring men har visat sig vara över 85% efter 23 dygns lagring i kyla.

Multipelemulsionens droppstorlek ökar vid lagring i kallt till- stånd, t.ex. från en ursprunglig medelstorlek av 3,5 pm till ca 10 pm efter 16 dygn och 15 pm efter 23 dygn. Ungefär samma partikelstorleksfördelning som i en nyframställd dubbelemulsion kan erhållas genom 1-3 filtreringar genom ett sådant filter med porositeten 5 um som användes vid den ursprungliga framställ- ningen. Multipelemulsionens syrebärande kapacitet ger en syre- halt av ca 1& mlflb per 100 ml multipelemulsion, och denna halt minskar till ca 10 ml 02 efter 23 dygns lagring. Även om multipelemulsionerna enligt föreliggande upp- finning kan användas i olika system för tillförsel av syre, är de särskilt lämpliga att använda såsom blodersättningsmedel.

Multipelemulsionen har sådan droppstorlek att den är lämplig att wwäfidêi.Bttkadiovaskulärt system. Multipelemulsionens kon- stanta skjuvningsviskositet inom det skjuvningsintervall som kan förväntas i det kardiovaskulära systemet är ungefär den- samma som för helblod, och när multipelemulsionen exponeras för de ovan angivna skjuvningsgraderna erhålles en försumbar för- ändring av utbytet, dvs. ett försumbart frigörande av hemoglo- binlösning till multipelemulsionens yttre fas. Multipelemulsio- nen enligt föreliggandeLmpfh¶ung har ungefär samma syrebärande kapacitet som blod. På grund av dessa egenskaper och den fysio- logiska kombinerbarheten hos den yttre vattenfasen av fosfat- buffrad saltlösning kan man förvänta att multipelemulsionerna är lämpliga att använda såsom blodersättningsmedel. Såsom visas i de specifika utföringsexemplen uppvisar multipelemulsionerna enligt uppfinningen icke någon akut giftighet när de injiceras till möss såsom blodersättningsmedel. De hemoglobinhaltiga mul- tipelemulsionerna enligt föreliggande uppfinning kan också vara användbara vid oxygenerande konservering av donerade kropps- organ, de kan användas såsom syreutbytesvätska i anordningar 504 671 10 för syresättning av blod, och de kan användas för tillförsel av syre till kulturer av däggdjursceller.

Uppfinningen illustreras av följande, icke begränsande exempel.

Exempel 1 En dubbelemulsion innehållande hemoglobin framställdes genom att man först framställde en primäremulsion av hemoglobin i teknisk vit mineralolja nr 40 och därefter framställde en sekundäremulsion av primäremulsionen i en vattenhaltig fosfat- buffrad saltlösning. Det använda förfarandet illustreras i fig 2.

En saltlösning av hemoglobin framställdes genom att röda blodceller tvättades med avjoniserat vatten innehållande 1,0 vikt-% natriumklorid. Volymförhållandet mellan röda blod- celler och natriumkloridlösning var 1:1. Efter försiktig bland- ning centrifugerades det hela vid &000 x g under 10 min i en kyld centrifug. Efter centrifugeringen avlägsnades den gula hinnan och den överstående vätskan, och tvättningsproceduren upprepades till dess att den överstående vätskan var klar, vilket vanligen krävde 1-3 behandlingar. Efter tvättningen ly- serades de packade röda blodcellerna genom utspädning med 4-5 volymer avjoniserat vatten, och den resulterande blandningen omrördes med en magnetomrörare i ett kylskåp under tolv timmar.

Stromat, huvudsakligen membranfragment av röda blodceller, av- lägsnades genom centrifugering vid 30 000 x g under 30 min. Den överstående hemoglobinlösningen avlägsnades och koncentrerades i ett Minitan ultrafiltreringssystem med tvärflöde (Millipore Corp., Bedford, Ma.), varvid man använde åtta filterenheter av polysulfon med en nominell molekylvikt av 30 000. Lösningen hölls i ett isbad under hela koncentrationsprocessen för minsk- ning av bildningen av methemoglobin. Koncentrationsproceduren fortsattes tills dess att strömningshastigheten genom filtret minskade kraftigt. Man tillsåg härvid att det maximalt rekom- menderade mottrycket i ultrafiltreringssystemet icke över- skreds. Efter koncentreringen hade hemoglobinlösningen en kon- centration av upp till 35 g hemoglobin per 100 ml lösning. 504 671 11 Hemoglobinkoncentratet dialyserades mot saltlösning innehållan- de 30 mM Fosfatbuffert för att man skulle erhålla den önskade osmotiska jämvikten med den yttre vattenfasen. Fosfatbuffertens pH-värde ändrades vid behov från 7,4 till 8,0 För säkerställan- de av att den dialyserade hemoglobinlösningen hade ett pH-värde av ca 7,&. Den dialyserade hemoglobinlösningen centrifugerades vid 30 000 x g under 10 min och filtrerades sedan med använd- ning av ett steriliserande filter med porositeten 0,20 um (Fisher Chemical Co.) För avlägsnande av eventullt stromamate- rial utfällt till Följd av pH-regleringen. Antibiotika sattes till hemoglobinlösningen i sådana mängder att denna kom att innehålla 5000 enheter penicillin per liter, â0 mg gentamicin per liter, 2500 enheter polymyxin per liter och 50 mg strepto- mycin per liter. Dessutom tillsattes humanalbumin i en mängd av 2,5 g per 100 ml och glukos i en mängd av 3,5 g per 100 ml.

Primäremulsionen av hemoglobinlösning i olja framställ- des med användning av en magnetomrörare, varvid man långsamt satte den ovan framställda hemoglobinlösningen till kraftigt omrörd teknisk vit olja nr 40 (Witco Chemical Corp.) inne- hållande 15 vikt-% av det ytaktiva ämnet Brij 93 (ICI America Inc.), som är en polyoxyetylenalkohol. Genom långsam tillsätt- ning av hemoglobinlösningen till den kraftigt omrörda oljefasen uppnåddes ett kraftigt införande av vattenfas, nämligen 60 volym-% hemoglobinlösning i oljefasen. Blandningen av hemoglo- binlösning och olja underkastades högenergiemulgering under kylning med användning av en M 110 Microfluidizer modell B04 med D-20-insatser (Microfluidics Corp.). För åstadkommande av en liten droppstorlek och För ökning av primäremulsionens sta- bilitet genomfördes emulgeringen med ett tryckfall av 13,8 MPa -1 . H .

. Primaremulsionen och en skjuvningsgrad av ca 1 x 106 s Filtrerades sedan genom ett filter av hydrofil polyvinylidendi- Fluorid med porositeten 5 um (Duropore, Millipore Corp.).

Multipelemulsionens yttre vattenfas utgjordes av isoton Fosfatbuffrad saltlösning med pH-värdet 7,4. Denna vattenfas valdes på grund av sin fysiologiska kombinerbarhet. Till denna vattenfas sattes det ytaktiva ämnet Tween 60 (ICI America Inc.), som är en polyoxyetylenFettsyraester, i en mängd av 0,5 g per 100 ml, albumin i en mängd av 1 g per 100 ml och 504 671 12 dextran (molekylvikt 62 400; Sigma Chemical Co.) i en mängd av 0,5 g per 100 ml.

Den ovan framställda primäremulsionen av hemoglobin- lösning i olja dispergerades sedan i den framställda yttre vattenfasen i ett volymförhållande av 1:1. Dispergeringen åstadkoms genom blandning med en magnetomrörare under 30 min.

Den resulterande multipelemulsionen filtrerades tre gånger för minskning av den maximala droppstorleken till under 10 um och minskningen av den genomsnittliga droppstorleken till under 5 um. Härvid användes ett filter av hydrofil polyvinyliden- difluorid med porositeten 5 um (Duropore, Millipore Corp.), och filtratet uppsamlades i en kolv. Filtreringen genomfördes under ett svagt vakuum av 25 kPa, åstadkommet medelst en vattensug, och detta vakuum gav en filtreringshastighet av ca 5 ml/min.

När multipelemulsionen var avsedd att användas såsom blod- ersättningsmedel, steriliserades alla lösningar som användes vid framställningen av multipelemulsionen genom att de filtre- rades genom ett filter med porositeten 0,2 um.

När tryckfallet i mikrofluidiseringsanordningen varie- rades mellan 6,9 och 20,7 MPa vid framställningen av primär- emulsionen, erhölls utbyten som var större än 85%, varvid topp- värdet 98% erhölls vid ett tryckfall av 12,4-13,8 MPa.

Exempel 2 En dubbelemulsion innehållande hemoglobin framställdes på samma sätt som i exempel 1 förutom att en vegetabilisk olja, nämligen sesamolja, användes i primäremulsionen. Vattenlösning- en av hemoglobin innehållande 35 g hemoglobin och 3 g human- albumin per 100 ml sattes långsamt (1 ml/min) till den snabbt omrörda oljefasen, som innehöll 50 vikt-% Span 80, räknat på oljefasen. Blandningsförhållandet var 40 volym-% hemoglobin- lösning och 60 volym-% sesamolja. Efter blandning under ca 40 min underkastades blandningen högenergiemulgering på samma sätt som beskrivits i exempel 1. Primäremulsionen av vattenlös- ning av hemoglobin i sesamolja dispergerades sedan i den yttre vattenfasen av isoton fosfatbuffert saltlösning, som innehöll 1,0 vikt-% humanalbumin, 0,5 vikt-% dextran och 0,5 vikt-% Plu- 504 671 13 ronicC>F68. Volymförhållandet mellan primäremulsionen och den yttre vattenfasen var 1:1, och blandningen genomfördes genom omrörning med låg hastighet under ca 5 min. Multipelemulsionen filtrerades sedan tre gånger genom ett filter med porositeten 5 um för minskning av den maximala droppstorleken till mindre än 10 um och minskning av den genomsnittliga droppstorleken till mindre än 4 um.

Exempel 3 Prover av nyframställd multipelemulsion (framställd på samma sätt som beskrivits i exempel 1) utspäddes med yttre vattenfas och placerades i en Howard-cell (Rascher å Betzold Inc., Chicago, Ill.) samt fotograferades genom ett faskontrast- mikroskop Micromaster (Fisher Scientific Inc.) med användning av en kamera Olympus ÛM1. Droppstorlekarna uppmättes på nega- tiven med användning av halvautomatisk bildanalysator MUP-3 (Carl Zeiss Inc.). Primäremulsionens små droppar hade en maxi- mal diameter som var mindre än 1,5 um och en medeldiameter som var mindre än 0,5 um. Efter lagring vid 4°C under fem dygn hade dropparna en maximal diameter av 2,5 um och en medeldiameter av 0,5 um. Storleksfördelningen för primäremulsionens små droppar kunde göras snävare och stabiliseras genom tillsättning av albumin.

Nyframställd multipelemulsion hade en maximal dropp- storlek av ca 7 um och en genomsnittlig droppstorlek av ca 3,8 um. En fyra dygn gammal emulsion hade en maximal droppstor- lek av 10 um och en genomsnittlig droppstorlek av 4,8 um, en femton dygn gammal emulsion hade en maximal droppstorlek av 15 um och en genomsnittlig droppstorlek av 10 um, och en 23 dygn gammal emulsion hade en maximal droppstorlek av 20 um och en genomsnittlig droppstorlek av 15 um. Alla bestämningarna genomfördes efter lagring av emulsionerna vid 5°C. Det albumin som sattes till den yttre vattenfasen resulterade i en minskad droppstorlek och en signifikant minskad tillväxt av droppstor- leken under lagring. Man fann också att antalet passager genom filtret med porositeten 5 um var viktigt. En andra passage genom filtret resulterade i en minskning av den maximala dropp- 504 671 14 storleken från ca 35 till ca 15 um, och en tredje passage genom filtret minskade den maximala droppstorleken till ca 7 um.

Exempel 4 För den i exempel 1 framställda multipelemulsionen be- stämdes utbytet, uttryckt såsom mängden hemoglobin inkapslad i primäremulsionen jämfört med den mängd som har trängt ut i den yttre fasen. Filtrering genom filtret med porositeten 5 um minskade utbytet från något under 99% före filtreringen till över 97% efter tre passager genom filtret. Multipelemulsionens utbyte minskar under lagring, men efter sju dygns lagring vid5OC uppmättes ett utbyte av över 91%, och efter 23 dygns lagring vid 5°C uppmättes ett utbyte av över 85%.

Exempel 5 Den i exempel 1 framställda multipelemulsionens visko- sitet mättes med en Wells-Brookfield Syncro-Lectric Microvisco- meter, modell LVT, försedd med en Û,8° kon, modell CP-40 (Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Stoughton, Mass.), och med en Weissenberg Rheogoniometer, modell R16/R19, försedd med en 10 cm 0,3” kon och en platta. Multipelemulsionens kon- stanta skjuvningsviskositet varierade från ca 5 cP vid en 1 till 3,5 cP vid en skjuvningsgrad av skjuvningsgrad av 50 s- 5D0 s-1. Detta motsvarar ungefär skjuvningsgraden för helblod i ett kardiovaskulärt system. Vid dylika skjuvningsgrader förblev utbytet ungefär konstant, och skjuvningsgraden hade liten in- verkan på storleksfördelningen hos multipelemulsionens små droppar vid skjuvningsgrader mellan A5 och 450 s_1.

Den i exempel 2 framställda multipelemulsionen hade en konstant skjuvningsviskositet av 3 cP.

Exempel 6 Den i exempel 1 framställda multipelemulsionens syre- bärande kapacitet, dvs. syrehalt, mättes enligt en modifikation av Nevilles biotonometrimetod (Neville, J.R., J. Applied Phy- 504 671 15 siology, }7:967, 1974)i mïwarberg-manometer (Fisher Scientific, Itasca, Ill.). En nyframställd multipelemulsion visade sig innehålla ca 1A ml 02/100 ml, och denna halt minskade till ca 10 ml 02/100 ml efter 23 dygns lagring vid 5°C.

Den nyframställda multipelemulsionen i exempel 2 hade en syrehalt av 10 ml 02/100 ml emulsion.

Exempel 7 En multipelemulsion framställdes på samma sätt som be- skrivits i exempel 1 för användning såsom blodersättningmedel, varvid dock primäremulsionen även innehöll pyridoxol-5-fosfat P-5-P (Sigma Chemical Co.) i ett molförhållande av 2:1 i för- hållande till hemoglobin. P-5-P minskade syreaffiniteten till ett P50-värde av 20 mm Hg jämfört med ett uppmätt P50-värde av 26 mm Hg för helblod. Mätningarna gjordes vid ett pH-värde av 7,35, ett CO-tryck av Ü mm Hg och en temperatur av 37°C. Dis- sociationskurvan för oxyhemoglobin bestämdes med användning av den modifierade biotonometrimetoden, och de erhållna resultaten visas i fig 3. Av resultaten framgår att multipelemulsionen enligt uppfinningen uppför sig på ungefär samma sätt som hel- blod.

Exempel 8 En multipelemulsion framställdes på samma sätt som be- skrivits i exempel 1 förutom att primäremulsionen innehöll hemoglobinlösning med koncentrationen 32,8 g/100 ml. Primär- emulsionen innehöll dessutom vit mineralolja Carnation, och den utgjorde 30% av multipelemulsionens volym. 0,55 cm3 av denna multipelemulsion injicerades till fyra möss. Alla djuren över- levde och uppvisade ett friskt beteende under flera dygn efter injektionen.

En annan multipelemulsion framställdes på liknande sätt. Denna multipelemulsion, som innehöll 35 volym-% primär- emulsion, administrerades i en volym av 1,0 cm3 till tre möss.

Alla försöksdjuren överlevde och uppvisade ett friskt beteende under flera dygn efter injektionen. 504 671 16 Ytterligare en multipelemulsion framställdes på samma sätt, och denna emulsion innehöll 50 volym-% primäremulsion.

Denna multipelemulsion injicerades till fem möss i en mängd av 0,5 cm). ende under flera dygn efter injektionen.

Alla djuren överlevde och uppvisade ett friskt bete- Dessa försök visar att multipelemulsioner innehållande hemoglobin och mineralolja icke var akut giftiga för möss.

Exempel 9 En multipelemulsion framställdes på samma sätt som be- skrivits i exempel 8, förutom att sesamolja enligt exempel 2 användes i stället för mineralolja. Primäremulsionen innehöll en hemoglobinlösning med koncentrationen 35 g/100 ml. Multipel- emulsionen innehöll 50 volym-% primäremulsion och 50 volym-% yttre vattenfas. 0,5 cm3 och 1,0 cm; av denna multipelemulsion injicerades till två möss, vilka båda överlevde och uppvisade ett friskt beteende under flera dygn.

Dessa försök visar att multipelemulsioner innehållande hemoglobin och sesamolja icke är akut giftiga för möss.

Exempel 10 En multipelemulsion framställdes på samma som beskri- vits i exempel 8. Multipelemulsionen innehöll 35 volym-% pri- märemulsion och var avsedd att användas såsomblodersättnings- medel. Multipelemulsionen injicerades till fyra möss. Ümedel- bart efter injektionen uppsamlades ett blodprov i ett mikro- hematokritrör. Efter centrifugering under 10 min fann man att multipelemulsionen utgjorde 5% av djurets totala blodvolym.

Såsom framgår av fig h minskade halten multipelemulsion till % av djurets totala blodvolym efter 80 timmars cirkulation i djuret. Multipelemulsionens halveringstid hos möss bestämdes till ca 70 timmar.

Exempel 11 En multipelemulsion avsedd att användas såsom bloder-

Claims (36)

504 671 17 sättningsmedel framställdes på samma sätt som beskrivits i exempel 8. Denna multipelemulsion innehöll 50 volym-% primär- emulsion. Vid blandning med ett på blodplättar rikt plasma kunde ingen minskning av halten blodplättar observeras. Även om föredragna utföringsformer av uppfinningen har beskrivits ovan, är det uppenbart för fackmannen att många modifieringar kan göras inom ramen för uppfinningen såsom den definieras i patentkraven. P a t e n t k r a v

1. Syrebärande multipelemulsion, k ä n n e t e c k n a d a v att den innefattar en primäremulsion, som innehåller en vattenlösning av syrebärande material i mineralolja, vegetabi- lisk olja eller en blandning därav och är emulgerad med ett primärt emulgeringsmedel, varvid storleken av primäremulsionens små droppar är upp till ca 5 pm, och en sekundäremulsion, som innehåller nämnda primäremulsion emulgerad in en yttre vatten- fas medelst ett sekundärt emulgeringsmedel, varvid storleken av sekundäremulsionens små droppar är upp till ca 10 um, och att multipelemulsionen har en viskositet av ca 3-9 cP, ett utbyte av ca 85-99% och en syrebärande kapacitet av ca 7-20 volym-%.

2. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att det syrebärande materialet är hemoglobin.

3. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att oljan är mineralolja.

4. Multipelemulsion enligt krav 3, k ä n n e t e c k - n a d a v att primäremulsionen innehåller ca QÛ-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 8-58 volym-% olja och ca 2-30 volym-% primärt emulgeringsmedel.

5. Multipelemulsion enligt krav 3, k ä n n e t e c k - n a d a v att primäremulsionen innehåller ca 60-70 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 1A-25 volym-% olja och ca 5-15 volym-% primärt emulgeringsmedel. 504 671 18

6. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att oljan är en vegetabilisk olja.

7. Multipelemulsion enligt krav 6, k ä n n e t e c k - n a d a v att primäremulsionen innehåller ca 40-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 5-30 volym-% olja och ca 5-30 volym-% primärt emulgeringsmedel.

8. Multipelemulsion enligt krav 6, k ä n n e t e c k - n a d a v att primäremulsionen innehåller ca 40-60 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 20-30 volym-% olja och ca 20-30 volym-% primärt emulgeringsmedel.

9. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxy- etylenalkohol eller sorbitanmonooleat.

10. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att storleken av primäremulsionens små droppar är upp till ca 3 um.

11. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxy- etylenfetæyraester eller en etyloxidpolymer.

12. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att storleken av sekundäremulsionens små droppar är upp till ca 8 pm.

13. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att den innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vattenfas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulgeringsmedel. 1Q.

14. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att det syrebärande materialet är hemoglobin, att oljan är mineralolja, att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenalkohol eller sorbitanmonooleat, att primäremul- sionen innehåller ca 40-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 8-58 volym-% mineralolja och ca 2-30 volym-% primärt emulge- ringsmedel, att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxy- etylenfefisyraester eller en etylenoxidpolymer, att multipel- emulsionen innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vattenfas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulge- ringsmedel, att utbytet är ca 95-99%, och att den syrebärande kapaciteten är ca 10-20 volym-%. 504 671 19

15. Multipelemulsion enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d a v att det syrebärande materialet är hemoglobin, att oljan är en vegetabilisk olja vald bland olivolja, safflorolja, sesamolja, sojaolja och blandningar därav, att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenalkohol eller sorbitan- monooleat, att primäremulsionen innehåller ca 40-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 5-30 volym-% vegetabilisk olja och ca 5-30 volym-% primärt emulgeringsmedel, att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenfettsyraester eller en etylenoxidpolymer, att multipelemulsionen innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vattenfas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulgeringsmedel, att utbytet är ca 95-99%, och att den syrebärande kapaciteten är ca 10-20 volym- -%.

16. Blodersättningsmedel, k ä n n e t e c k n a t a v att det innefattar en steril, syrebärande multipelemulsion innefattande en primäremulsion, som innehåller en vattenlösning av syrebärande material i mineralolja, vegetabilisk olja eller en blandning därav och är emulgerad med ett primärt emulge- ringsmedel, varvid storleken av primäremulsionens små droppar är upp till ca 5 um, och en sekundäremulsion, som innehåller nämnda primäremulsion emulgerad i en yttre vattenfas med hjälp av ett sekundärt emulgeringsmedel, varvid storleken av sekun- däremulsionens små droppar är upp till ca 10 um, och varvid multipelemulsionen har en viskositet av ca 3-9 cP, ett utbyte av ca 85-99% och en syrebärande kapacitet av ca 7-20 volym-%.

17. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att det syrebärande materialet är hemoglo bin.

18. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att oljan är mineralolja.

19. Blodersättningsmedel enligt krav 18, k ä n n e - t e c k n a t a v att primäremulsionen innehåller ca 40-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 8-58 volym-% olja och ca 2-30 volym-% primärt emulgeringsmedel.

20. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att oljan är en vegetabilisk olja vald bland olivolja, safflorolja, sesamolja, sojaolja och blandning- ar därav. 504 671 20

21. Blodersättningsmedel enligt krav 20, k ä n n e - t e c k n a t a v att primäremulsionen innehåller ca 40- 90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 5-30 volym-% olja och ca 5-30 volym-% primärt emulgeringsmedel.

22. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenalkohol eller sorbitanmonooleat.

23. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att storleken av primäremulsionens små droppar är upp till ca 3 um.

24. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenFettsyraester eller en etylenoxidpolymer.

25. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att multipelemulsionen innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vattenfas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulgeringsmedel.

26. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att det syrebärande materialet är hemoglo- bin, att oljan är mineralolja, att det primära emulgerings- medlet är en polyoxyetylenalkohol eller sorbitanmonooleat, att primäremulsionen innehåller ca 40-90 volym-% vattenlösning av hemoglobin, ca 8-58 volym-% mineralolja och ca 2-30 volym-% primärt emulgeringsmedel, att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenfettsyraester eller en etyhmoxidpolymer, att multipelemulsionen innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vattenfas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulgeringsmedel, att utbytet är ca 95-99%, och att den syre- bärande kapaciteten är ca 10-20 volym-%.

27. Blodersättningsmedel enligt krav 16, k ä n n e - t e c k n a t a v att det syrebärande materialet är hemoglo- bin, att oljan är en vegetabilisk olja vald bland olivolja, safflorolja, sesamolja, sojaolja och blandningar därav, att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenalkohol eller sor- bitanmonooleat, att primäremulsionen innehåller ca 40-90 volym- -% vattenlösning av hemoglobin, ca 5-30 volym-% vegetabilisk olja och ca 5-30 volym-% primärt emulgeringsmedel, att det sekundära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenfettsyraester 504 671 21 eller en etylenoxidpolymer, att multipelemulsionen innehåller ca 10-90 volym-% primäremulsion, ca 10-90 volym-% yttre vatten- fas och ca 0,25-2 vikt-% sekundärt emulgeringsmedel, att ut- bytet är ca 95-99%, och att den syrebärande kapaciteten är ca 10-20 volym-%.

28. Förfarande För framställning av en multipelemulsion av en vattenlösning av syrebärande material i olja i en yttre vattenfas, k ä n n e t e c k n a t a v att det innefattar följande steg: en primäremulsion bildas genom att man under omrörning blandar en vattenlösning av syrebärande material i en mängd av ca 40-90 volym-%, en mineralolja, en vegetabilisk olja eller en blandning därav i en mängd av ca 8-58 volym-% vid användning av mineralolja och ca 5-30 volym-% vid användning av vegetabilisk olja, och ett primärt emulgeringsmedel i en mängd av ca 2-30 volym-% vid användning av mineralolja och ca 5-30 volym-% vid användning av vegetabilisk olja; den blandade primäremulsionen underkastas en skjuv- ningsgrad av 100 000-s 000 000 s” emulsion; för bildning av en primär- primäremulsionen filtreras så att maximistorleken av de små dropparna blir mindre än ca 5 um; en sekundäremulsion bildas genom att man under omrör- ning blandar den framställda primäremulsionen med en maximal droppstorlek av mindre än ca 5 pm i en mängd av ca 10-90 volym- -%, en yttre vattenfas i en mängd av ca 10-90 volym-% och ett sekundärt emulgeringsmedel i en mängd av ca 0,2-2,0 vikt-%, räknat på vikten av den yttre vattenfasen, varvid man erhåller en likformig dispersion av primäremulsionen i den yttre vatten- Fasen; och sekundäremulsionen filtreras till bildning av en mul- tipelemulsion med en maximal droppstorlek av högst ca 10 um.

29. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att vattenlösningen av syrebärande material är en hemoglo- binlösning innehållande ca 1-35 g hemoglobin per 100 ml.

30. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att det genomföres vid en temperatur av ca A-8°E.

31. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t 504 671 22 a v att skjuvningsgraden är 500 000-1 ÛÛÛ 000 s_1, och att skjuvningsbehandlingen genomföras i en mikrofluidiseringsanord- ning arbetande med ett tryckfall av 6,9-2Û,7MPa.

32. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att både primäremulsionen och sekundäremulsionen filtreras genom ett filter av hydrofil polyvinylidendifluorid med porosi- teten 5 pm.

33. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att primäremulsionen sättes till den yttre vattenfasen under omrörning, och att omrörningen fortsättes under ca 15-60 min.

34. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att man till den yttre vattenfasen sätter albumin i en mängd av ca 0,5-1,0 g per 100 ml.

35. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att man till den yttre vattenfasen sätter dextran i en mängd av ca 0,5-1,0 g per 100 ml.

36. Förfarande enligt krav 28, k ä n n e t e c k n a t a v att det primära emulgeringsmedlet är en polyoxyetylenalko- hol eller sorbitanmonooleat, och att det sekundära emulgerings- medlet är en polyoxyetylenfettsyraester eller en etylenoxid- polymer.