RU2524150C2

RU2524150C2 - Аналоги инсулина, устойчивые к протеазам

Info

Publication number: RU2524150C2
Application number: RU2009114324/10A
Authority: RU
Inventors: Петер Крестен НИЛЬСЕН; Франтишек ХУБАЛЕК; Ингер ЛЁУТРУП-ЛАРСЕН; Свенн ЛУДВИГСЕН; Улла РИБЕЛ-Мадсен; Пер БАЛШМИДТ; Пер НЁРГОРД; Свенн ХАВЕЛУНД
Original assignee: Ново Нордиск А/С
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2014-07-27
Also published as: JP5864834B2; IL197609A; CA2663074A1; BRPI0717098B1; PL2074141T3; CN101541830A; WO2008034881A1; MX2009002999A; BRPI0717098B8; KR20090071561A; JP2010504087A; EP2404934A1; KR101699370B1; US9018161B2; EP2074141A1; IL197609A0; TW200829600A; AU2007298919A1; DK2074141T3; KR101729986B1

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым аналогам инсулина, и может быть использовано в медицине. Получают аналог инсулина, в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты заменены гидрофильными аминокислотами по сравнению с родительским инсулином и где A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и B-цепь содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, при этом по меньшей мере одна мутация в А-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из A13-14, A14-15 и A19-20, и по меньшей мере одна мутация в В-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B25-26, и где аминокислота в положении B30 удалена. Аналог инсулина используют в составе фармацевтической композиции для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 1 или 2 типа. Изобретение позволяет получить аналог инсулина с повышенной стабильностью в отношении одного или более протеолитических ферментов по сравнению с родительским инсулином. 6 н. и 38 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новым аналогам инсулина, демонстрирующим устойчивость к протеазам, способу получения таких аналогов инсулина, препаратам инсулина, содержащим аналоги инсулина изобретения и способу лечения сахарного диабета с применением таких аналогов инсулина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Оральный путь на сегодняшний день является наиболее широко используемым путем введения лекарства и обычно очень хорошо воспринимается пациентами, особенно при хронической терапии. Однако введение терапевтических пептидов и белков часто ограничено парентеральными путями, а не предпочтительным оральным введением, в связи с рядом барьеров, таких как ферментативная деградация в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), лекарственные клеточные насосы, недостаточная и переменная абсорбция со слизистой оболочки кишечника, а также первичный метаболизм в печени. Человеческий инсулин деградирует под действием различных пищеварительных ферментов, находящихся в желудке (пепсин), в просвете кишечника (химотрипсин, трипсин, эластаза, карбоксипептидазы и т.д.), а также в слизистой оболочке ЖКТ (аминопептидазы, карбоксипептидазы, энтеропептидазы, дипептидилпептидазы, эндопептидазы и т.д.).

Это является неблагоприятным, т.к. многие пептиды и многие белки оказались клинически эффективными и могли бы иметь более широкое применение, если бы были простыми для введения и приемлемыми для реципиентов.

Сахарный диабет представляет собой нарушение обмена веществ, при котором способность утилизировать глюкозу частично или полностью утрачена. Примерно 5% всех людей страдает от диабета, и это нарушение приобретает масштабы эпидемии. После открытия инсулина в 1920-х гг. для улучшения лечения больных сахарным диабетом прикладывались непрерывные усилия. Поскольку люди, страдающие от диабета, подлежат хроническому лечению на протяжении нескольких десятилетий, то существует сильная потребность в безопасных, удобных и улучшающих качество жизни инсулиновых составах.

В лечении сахарного диабета было предложено и использовалось большое количество различных инсулиновых составов, таких как обычный инсулин, изофан-инсулин (обозначаемый NPH), инсулин-цинк суспензии (такие как Semilente®, Lente® и Ultralente®) и двухфазный изофан-инсулин. Некоторые из коммерчески доступных инсулиновых составов характеризуются быстрым началом действия, а другие составы имеют сравнительно медленное начало действия, но демонстрируют более или менее продолжительное действие. Быстро действующие инсулиновые составы, как правило, представляют собой растворы инсулина, в то время как замедленно действующие инсулиновые составы могут быть суспензиями, содержащими инсулин в кристаллической и/или аморфной форме, осажденный добавлением только солей цинка, либо добавлением протамина, либо их комбинации.

Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, А и В, которые содержат соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков. А- и В-цепи связаны между собой двумя дисульфидными мостиками. Инсулин от большинства других видов похож, но может содержать аминокислотные замены в некоторых позициях. За последние десять лет было разработано большое число аналогов человеческого инсулина. Они предназначены для конкретных видов действия, т.е. быстрого действия или длительного действия. Коммерчески доступные продукты, содержащие такие аналоги инсулина, включают Levemir®, NovoRapid®, Humalog®, Apidra® и Lantus®.

Как правило, инсулиновые составы вводят путем подкожных инъекций.

Тем не менее введение оральным путем может быть выгодно за счет улучшения взаимодействия с пациентом, безопасности и удобства.

Оральное введение белковых препаратов, таких как инсулин, зачастую приводит к очень низкой биодоступности из-за ферментного и абсорбционного барьеров. Общим подходом к доставке пептида и протеина является парентеральное введение, которое является инвазивным и неудобным. Поэтому все чаще исследуются неинвазивные пути, такие как оральная доставка фармацевтических веществ с белковой основой. Недавно разработанные составы для пероральной доставки белка/пептида включают в себя составы, одновременно содержащие ингибиторы протеазы, вещества, увеличивающие проницаемость, системы доставки на основе полимеров и конъюгаты инсулина. Последние включают гексил-инсулин-моноконъюгат-2 (HIM2) (Nobex Cooperation и GSK), аналог человеческого инсулина с ПЭГ 7-гексильной группой, присоединенной к В29. Например, US 7030082, US 6867183 и US 6770625 сообщали, что оральный HIM2 имеет повышенную протеолитическую стабильность и биодоступность по сравнению с инсулином.

Сущность изобретения

В одном воплощении изобретения предложен аналог инсулина с повышенной протеолитической стабильностью и сохраненной биологической инсулиновой активностью.

В другом воплощении изобретения аналог инсулина, предлагаемый в данном документе, имеет по меньшей мере две аминокислотные замены и/или делеции по сравнению с родительской молекулой инсулина.

В еще одном воплощении изобретения в аналоге инсулина, предлагаемом в данном документе, по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты заменены на гидрофильные аминокислоты по сравнению с родительским инсулином, где замены находятся в двух или более сайтах протеазного расщепления родительского инсулина или в непосредственной близости к ним, и где такой аналог инсулина возможно также содержит одну или несколько дополнительных мутаций.

Также в качестве объекта изобретения предлагаются аналоги инсулина в соответствии с изобретением, в которых A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию, и B-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином.

Данное изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют препропептид заявленных аналогов инсулина. В другом воплощении данное изобретение относится к векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот, и к принимающим клеткам (клеткам-хозяевам), содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот или векторы.

Также предусмотрен процесс получения аналога инсулина в соответствии с изобретением и его применение в качестве фармацевтического средства.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1. Протеолитическая устойчивость человеческого инсулина (HI) и аналогов инсулина к химотрипсину, измеренная в процентах интактного инсулина (аналога) при 37°C.

Фиг.2. Протеолитическая устойчивость человеческого инсулина (HI) и аналогов инсулина к пепсину, измеренная в процентах интактного инсулина (аналога) при 25°C.

Фиг.3. Эффект снижения содержания глюкозы в крови для трех аналогов инсулина после перорального введения через желудочный зонд (среднее значение ±SEM). Результаты для человеческого инсулина A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 2,8% от аффинности человеческого инсулина) показаны на верхней панели, для человеческого инсулина A14E, B16E, B25H, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 1,6% от аффинности человеческого инсулина) на средней панели и для человеческого инсулина A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 0,5% от аффинности человеческого инсулина) на нижней панели.

Фиг 4. Эффект снижения содержания глюкозы в крови, вызываемый аналогом инсулина с низкой аффинностью к рецептору (~0,1% от аффинности человеческого инсулина) после в/в введения (среднее значение ±SEM).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аналог инсулина в соответствии с изобретением представляет собой молекулу инсулина, имеющую две или более мутаций в аминокислотной цепи A и/или B по сравнению с родительской молекулой инсулина.

Было установлено, что путем замены двух или более гидрофобных аминокислот в пределах или в непосредственной близости к двум или более протеазным сайтам в инсулине на гидрофильные аминокислоты, получается аналог инсулина, который протеолитически стабилен по сравнению с родительским инсулином.

Ниже приведен неограничивающий перечень воплощений, которые также описаны в других частях данного документа:

Воплощение 1. Аналог инсулина, в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты были заменены на гидрофильные аминокислоты по сравнению с родительским инсулином, где замены находятся или в пределах, или в непосредственной близости к двум или более сайтам протеазного расщепления родительского инсулина и где такой аналог инсулина возможно также содержит одну или более дополнительных мутаций.

Воплощение 2. Аналог инсулина в соответствии с воплощением 1, растворимость которого увеличена по сравнению с родительским инсулином.

Воплощение 3. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-2, в котором A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию, и B-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином.

Воплощение 4. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-3, в котором аналог инсулина также содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в протеазном сайте первого модифицированного аналога инсулина, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена такова, что по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота заменена на по меньшей мере одну гидрофильную аминокислоту.

Воплощение 5. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-4, в котором

- аминокислота в позиции A12 представляет собой Glu или Asp, и/или аминокислота в позиции A13 представляет собой His, Asn, Glu или Asp, и/или аминокислота в позиции A14 представляет собой Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly или His, и/или аминокислота в позиции А15 представляет собой Glu или Asp; и

- аминокислота в позиции B24 представляет собой His, и/или аминокислота в позиции B25 представляет собой His, и/или аминокислота в позиции B26 представляет собой His, Gly, Asp или Thr, и/или аминокислота в позиции B27 представляет собой His, Glu, Lys, Gly или Arg, и/или аминокислота в позиции B28 представляет собой His, Gly или Asp; и

которые возможно также содержат одну или более дополнительных мутаций.

Воплощение 6. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-5, в котором аминокислота в позиции A14 представляет собой Glu, Asp или His, аминокислота в позиции B25 представляет собой His и который, возможно, также содержит одну или более дополнительных мутаций.

Воплощение 7. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-6, в котором аминокислота в позиции A14 представляет собой Glu, Asp или His, аминокислота в позиции B25 представляет собой His, а аминокислота в позиции B30 удалена.

Воплощение 8. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-6, в котором аминокислота в позиции A14 представляет собой Glu, Asp или His, a аминокислота в позиции B25 представляет собой His.

Воплощение 9. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-6, в котором одна или более дополнительных мутаций выбраны из группы, состоящей из: A(-3)Gly, A(-2)Gly, A(-1)Pro, A(0)Pro, A8His, A18Gln, A18Gln, A21Gln, A21Gly, B(-3)Gly, B(-2)Gly, B(-1)Pro, B(0)Pro, B1Glu, B1Gln, ro, B1Glu, B1Gln, B3Gln, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, DesB26, DesB27, B27Glu, B27Glu, B28Asp, desB28,desB29, desB30, B31Leu, B32Glu.

Воплощение 10. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-6 или 9, в котором дополнительная мутация представляет собой desB30.

Воплощение 11. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-10, в котором A14 представляет собой Glu.

Воплощение 12. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-11, который демонстрирует увеличенную устойчивость к одной или нескольким ферментам протеазам по сравнению с родительским белком.

Воплощение 13. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-12, который демонстрирует увеличенную устойчивость к двум или более ферментам протеазам по сравнению с родительским белком.

Воплощение 14. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-13, где родительский инсулин выбран из группы, состоящей из:

- человеческого инсулина;

- инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В28 представляет собой Pro, Asp, Lys, Leu, Val или Ala, a аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Lys или Pro, и аминокислотный остаток в позиции B30 возможно удален;

- человеческого инсулина des(B26-B30), человеческого инсулина des(B27-В30), человеческого инсулина des(B28-B30), человеческого инсулина des(B29-B30), человеческого инсулина des(B27) или человеческого инсулина des(B30);

- инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции ВЗ представляет собой Lys, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Glu или Asp;

- инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции А21 представляет собой Gly и который удлинен на С-конце двумя остатками Аrg;

- производного инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В30 заменен на (сложный) метиловый эфир треонина; и

- производного инсулина, в котором к Nε-позиции лизина в позиции В29 человеческого инсулина des(B30) присоединена цепь тетрадеканоила.

Воплощение 15. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-6, 9 или 11-14, где одну или более дополнительных мутаций выбирают для повышения химической стабильности инсулина.

Воплощение 16. Аналог инсулина в соответствии с воплощением 15, где одну или более дополнительных мутаций выбирают из группы, состоящей из: A18Gln, A21Gln, A21Gly и B3Gln.

Воплощение 17. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-4 или 12-14, содержащий А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 1:

и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 2:

где

Хаа_A(-2) отсутствует или представляет собой Gly;

Хаа_A(-1) отсутствует или представляет собой Pro;

Хаа_A0 отсутствует или представляет собой Pro;

Хаа_A8 независимо выбран среди Thr и His;

Хаа_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и Glu;

Хаа_A13 независимо выбран среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;

Хаа_A14 независимо выбран среди Тyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;

Хаа_A15 независимо выбран среди Gin, Asp и Glu;

Хаа_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gin;

Хаа_A21 независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_A22 отсутствует или представляет собой Lys;

Хаа_B(-2) отсутствует или представляет собой Gly;

Хаа_B(-1) отсутствует или представляет собой Pro;

Хаа_B0 отсутствует или представляет собой Pro;

Хаа_B1 отсутствует или независимо выбран среди Phe и Glu;

Хаа_B2 отсутствует или представляет собой Val;

Хаа_B3 отсутствует или независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_B4 независимо выбран среди Gin и Glu;

Хаа_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и Glu;

Хаа_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gin, His, Arg и Glu;

Хаа_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Хаа_B25 независимо выбран среди Phe и His;

Хаа_B26 отсутствует или независимо выбран среди Tyr, His, Thr, Gly и Asp;

Хаа_B27 отсутствует или независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;

Хаа_B28 отсутствует или независимо выбран среди Pro, His, Gly и Asp;

Хаа_B29 отсутствует или независимо выбран среди Lys и Gin;

Хаа_B30 отсутствует или представляет собой Thr;

Хаа_B31 отсутствует или представляет собой Leu;

Хаа_B32 отсутствует или представляет собой Glu;

С-конец, возможно, может быть дериватизирован как амид;

где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком;

где N-конец А-цепочечной аминокислотной последовательности, возможно, связан с С-концом В-цепочечной аминокислотной последовательности с помощью аминокислотной последовательности, содержащей 3-7 аминокислот, для формирования одноцепочечной молекулы инсулина, где N-конец В-цепи возможно удлинен на 1-10 аминокислот;

где если Хаа_A8 представляет собой Тhr, Хаа_A12 представляет собой Ser, Хаа_A13 представляет собой Leu и Хаа_A14 представляет собой Тyr, то Xaa_A15 представляет собой Glu или Asp; и

где если Хаа_B24 представляет собой Рhe, Хаа_B25 представляет собой Рhr, Хаа_B26 представляет собой Туr, Хаа_B27 представляет собой ТhR и Хаа_B28 представляет собой Pro, то Хаа_B29 представляет собой Gln.

Воплощение 18. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-4 или 12-14, содержащий А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 3:

и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 4:

где

Хаз_А8 независимо выбран среди Thr и His;

Хаа_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и Glu;

Хаа_A14 независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;

Хаа_A15 независимо выбран среди Gin, Asp и Glu;

Хаа_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gin;

Хаа_A21 независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_B1 независимо выбран среди Phe и Glu;

Хаа_B3 независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_B4 независимо выбран среди Gin и Glu;

Хаа_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и Glu;

Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gin, His, Arg и Glu;

Хаа_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Хаа_B30 отсутствует или Thr;

Воплощение 19. Аналог инсулина в соответствии с воплощением 18, где

Хаа_A8 независимо выбран среди Thr и His;

Хаа_A12 независимо выбран среди Ser и Glu;

Хаа_A14 независимо выбран среди Asp, His и Glu;

Хаа_A15 независимо выбран среди Gin и Glu;

Хаа_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gin;

Хаа_A21 независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_B1 независимо выбран среди Phe и Glu;

Хаа_B3 независимо выбран среди Asn и Gin;

Хаа_B4 независимо выбран среди Gin и Glu;

Хаа_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и Glu;

Хаа_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gin, His, Arg, и Glu;

Хаа_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Хаа_B26 независимо выбран среди Tyr, Thr, Gly и Asp;

Хаа_B27 независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg и Glu;

Хаа_B28 независимо выбран среди Pro, Gly и Asp;

Хаа_B29 независимо выбран среди Lys и Gin;

где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком.

Воплощение 20. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-16, в котором С-конец В-цепи связан с N-концом А-цепи с помощью 3-15 аминокислот или 3-7 аминокислот, для формирования одноцепочечной молекулы инсулина, где N-конец В-цепи, возможно, удлинен 1-10 аминокислотами.

Воплощение 21. Фармацевтическая композиция, содержащая биологически активное количество аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.

Воплощение 22. Фармацевтическая композиция, содержащая два или более аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20, где каждый аналог определен как имеющий по меньшей мере одну мутацию, которая отсутствует по меньшей мере в одном из других вариантов.

Воплощение 23. Фармацевтическая композиция в соответствии с любым из воплощений 11-20, которая также содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель и, возможно, адъювант.

Воплощение 24. Способ лечения сахарного диабета у субъекта, содержащий введение субъекту аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 или фармацевтической композиции в соответствии с любым из воплощений 21-23.

Воплощение 25. Способ снижения уровня глюкозы в крови у млекопитающих путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически активной дозы аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 или фармацевтической композиции в соответствии с любым из воплощений 21-23.

Воплощение 26. Способ в соответствии с воплощением 24 или 25 с оральным введением.

Воплощение 27. Способ в соответствии с воплощением 24 или 25 с парентеральным введением.

Воплощение 28. Способ в соответствии с воплощением 24 или 25 с интратрахеальным введением.

Воплощение 29. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 для применения в качестве фармацевтического вещества в лечении и профилактике гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, синдрома Х и дислипидемии.

Воплощение 30. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 для применения в качестве фармацевтического вещества для задержки или предотвращения прогрессирования заболевания сахарного диабета 2 типа.

Воплощение 31. Аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 для применения в качестве фармацевтического вещества для уменьшении потребления пищи, уменьшения апоптоза (3-клеток, увеличения β-клеточной функции и β-клеточной массы и/или для восстановления чувствительности β-клеток к глюкозе.

Воплощение 32. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20, его производное, часть его последовательности, его вырожденную последовательность или последовательность, которая гибридизируется с ним в жестких условиях.

Воплощение 33. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая предшественник аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20, его производное, часть его последовательности, его вырожденную последовательность или последовательность, которая гибридизируется с ним в жестких условиях.

Воплощение 34. Вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с воплощением 32 или 33.

Воплощение 35. Принимающая клетка (клетка-хозяин), содержащая вектор экспрессии в соответствии с воплощением 34.

Воплощение 36. Способ получения аналога инсулина, содержащий этап культивирования принимающей клетки (клетки-хозяина) воплощения 35.

Воплощение 37. Способ получения аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20, где замена аминокислот осуществляется путем сайт-специфического мутагенеза.

Воплощение 38. Процесс получения фармацевтической композиции в соответствии с любым из воплощений 21-23, содержащий смешивание аналога инсулина в соответствии с любым из воплощений 1-20 с фармацевтически приемлемыми веществами и/или эксципиентами.

Воплощение 39. Фармацевтическая композиция, полученная в процессе в соответствии с воплощением 38.

Инсулин является полипептидным гормоном, секретируемым р-клетками поджелудочной железы. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, А и В, которые соединены двумя межцепочечными дисульфидными мостиками. Кроме того А-цепь характеризуется наличием одного внутрицепочечного дисульфидного мостика.

Гормон синтезируется в виде одноцепочечного предшественника проинсулина (препроинсулина), состоящего из препептида из 24 аминокислот, расположенного за проинсулином, содержащим 86 аминокислот, в конфигурации:

препептид-В-Аrg Аrg-C-Lys Аrg-А, где С является связывающим пептидом из 31 аминокислоты. Аrg-Аrg и Lys-Аrg являются сайтами расщепления для отщепления связывающего пептида от А- и В-цепей.

Аналоги инсулина в соответствии с изобретением могут также содержать мутации. Мутации в молекуле инсулина могут быть в форме замены, делеции или вставки аминокислотного остатка в А- и/или В-цепь естественно полученной молекулы инсулина.

Термины "desB30" или "В(1-29)" обозначают, что в В-цепи природного инсулина отсутствует аминокислотный остаток В30, а "А(1-21)" обозначает природную инсулиновую А-цепь. Мини-С-пептид и его аминокислотная последовательность обозначены трехбуквенным аминокислотным кодом.

Термины данного документа, такие как А1, А2, A3 и т.д., обозначают соответственно позиции 1, 2 и 3 в А-цепи инсулина (считая с N-конца). Аналогичным образом, такие термины как В1, В2, В3 т.д., обозначают соответственно позиции 1, 2 и 3 в В-цепи инсулина (считая с N-конца). Использование однобуквенного кода для аминокислот в терминах, таких как А21А, A21G и A21Q, обозначает, что аминокислотные в позиции А21 представляет собой A, G и Q соответственно. С использованием трехбуквенного кода соответствующие аминокислоты выражаются как А21А1а, A21Gly и А21 Gin соответственно.

Термины данного документа А(0) или В(0) обозначают позиции аминокислот, соседних с N-концевыми А1 или В1 соответственно. Термины А(-1) и В(-1) обозначают позиции первых аминокислот, находящихся с М-конца от А(0) или В(0) соответственно. Таким образом, А(-2) и В(-2) обозначают М-концевые позиции по отношению к А(-1) и В(-1) соответственно, А(-3) и В(-3) обозначают N-концевых позиции по отношению к А(-2) и В(-2) соответственно и т.д.

Термин «связывающий пептид» охватывает пептидную цепь, которая может связывать С-концевой аминокислотный остаток В-цепи с N-концевым аминокислотым остатком А-цепи в инсулине.

Термин «пропептид» обозначает полипептидную последовательность, функция которой заключается в том, чтобы направить экспрессированный полипептид из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и далее в секреторные везикулы для секреции в культуральную среду (т.е. экспортировать полипептид через клеточную стенку или по меньшей мере через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Пропептид может быть пропептидом дрожжевого α-фактора, см. US 4546082 и 4870008. В альтернативном варианте пропептид может быть синтетическим, т.е. пропептидом, который не встречается в природе. Подходящие синтетические пропептиды раскрыты в US 5395922; 5795746; 5162498 и WO 98/32867. Пропептид предпочтительно будет содержать сайт эндопептидазы процессинга на С-конце, такой как последовательность Lys-Arg или ее любой функциональный аналог.

Термин "сахарный диабет" включает сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа и другие состояния, которые вызывают гипергликемию.

Термин "лечение" заболевания включает лечение, профилактику или облегчение заболевания.

В одном воплощении изобретения аналог инсулина является, в частности, подходящим для орального введения.

Гидрофобные аминокислоты в данном документе следует понимать как природные аминокислоты триптофан (Trp, W), фенилаланин (Phe, F), валин (Val, V), изолейцин (IIe, I), лейцин (Leu, L) и тирозин (Туr, Y) (с трехбуквенной и однобуквенной аббревиатурой в скобках).

Гидрофильные аминокислоты в данном документе следует понимать как природные аминокислоты, которые не являются гидрофобными аминокислотами в соответствии с определением выше. В одном воплощении гидрофильные аминокислоты в соответствии с изобретением выбирают из группы, состоящей из:

глутаминовой кислоты (Glu, Е), аспарагиновой кислоты (Asp, D), гистидина (His, Н), глутамина (Gin, Q), аспарагина (Asn, N), серина (Ser, S), треонина (Тhr, Т), пролина (Pro, Р), глицина (Gly, G), лизина (Lys, К) и аргинина (Arg, R). В другом воплощении гидрофильные аминокислоты в соответствии с изобретением выбирают из группы, состоящей из: глутаминовой кислоты (Glu, Е), аспарагиновой кислоты (Asp, D), гистидина (His, Н), глутамина (Gin, Q), аспарагина (Asn, N), лизина (Lys, К) и аргинина (Arg, R).

"Инсулин" в соответствии с изобретением в данном документе следует понимать как человеческий инсулин, аналог инсулина или производное инсулина.

Термин "родительский инсулин", используемый в данном документе, применяется для обозначения инсулина до какой-либо мутации, которая в соответствии с изобретением была к нему применена. Неограничивающими примерами родительских инсулинов являются, например, инсулин дикого типа, такой как человеческий инсулин или свиной инсулин, аналог человеческого инсулина или производное человеческого инсулина или аналога инсулина, такое как пегилированный или ацилированный человеческий инсулин или аналог инсулина.

В одном воплощении родительский инсулин в соответствии с изобретением выбирают из группы, состоящей из:

человеческого инсулина,

инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В28 представляет собой Pro, Asp, Lys, Leu, Val или Ala, аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Lys или Pro, a аминокислотный остаток в позиции В30, возможно, удален,

инсулинового аналога, который представляет собой человеческий инсулин des(B28-B30), человеческий инсулин des(B27) или человеческий инсулин des(B30), инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В3 представляет собой Lys, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Glu или Asp,

инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции А21 представляет собой Gly и который также удлинен на С-конце двумя остатками аргинина,

производного инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции B30 заменен (сложным) метиловым эфиром треонина, и

производного инсулина, в котором к Nε-позиции лизина в позиции В29 человеческого инсулина des(B30) присоединена цепь тетрадеканоила.

человеческого инсулина;

DesB30 человеческого инсулина;

AspB28 человеческого инсулина;

AspB28, DesB30 человеческого инсулина;

LysB3, GluB29 человеческого инсулина;

LysB28, ProB29 человеческого инсулина;

GlyA21, ArgB31, АrgВ32 человеческого инсулина; и

DesB30, ArgB31, АrgВ32 человеческого инсулина.

Термин "аналог инсулина", используемый в данном документе, обозначает модифицированный инсулин, в котором один или более аминокислотных остатков инсулина были заменены другими аминокислотными остатками, и/или в котором один или более аминокислотных остатков были удалены из инсулина, и/или в котором один или более аминокислотных остатков были присоединены к инсулину.

В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 8 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 7 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 6 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 5 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 4 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 3 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином. В одном воплощении аналог инсулина содержит менее 2 модификаций (замен, делеций, добавок) по сравнению с родительским инсулином.

Термин "производное инсулина", используемый в данном документе, обозначает химически модифицированный родительский инсулин или его аналог, в котором по меньшей мере одна замена не представлена в родительском белке или его аналоге, т.е. в родительском белке, который был ковалентно модифицирован. Типичными модификациями являются амиды, углеводы, алкильные группы, ацильные группы, сложные эфиры, пегилирование и т.п. Примерами производных человеческого инсулина в соответствии с изобретением являются метиловый эфир треонина B30 человеческий инсулин, Nε-B29 тетрадеканоил des(В30) человеческий инсулин, Nε-В29-тетрадеканоил GlnB3 des(B30) человеческий инсулин, Nε-B29-тридеканоил человеческий инсулин, Ме-В29-тридеканоил человеческий инсулин, Nε-В29-деканоил человеческий инсулин и Nε-В29-додеканоил человеческий инсулин.

Термин "человеческий инсулин", используемый в данном документе, обозначает человеческий гормон, структура и свойства которого хорошо известны. Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками между цистеиновыми остатками, которые называются А-цепью и В-цепью. А-цепь представляет собой пептид из 21 аминокислот, а В-цепь представляет собой пептид из 30 аминокислот; две цепи связаны тремя дисульфидными мостиками: один между цистеинами в позиции 6 и 11 А-цепи, второй между цистеином в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а третий между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи.

Мутации в молекуле инсулина обозначаются указанием цепи (А или В), позицией и трехбуквенным кодом для аминокислотной замены природной аминокислоты. Под "desB30" понимается В-цепь природного инсулина или ее аналог, в котором отсутствует аминокислота B30. Таким образом, человеческий инсулин A21Gly, B28Asp, desB30 является аналогом человеческого инсулина, в котором позиция 21 в А-цепи мутировала в глицин, позиция 28 в В-цепи мутировала в аспарагиновую кислоту, а позиция 30 в В-цепи удалена.

"Протеаза" или "фермент протеаза" является пищеварительным ферментом, который разрушает белки и пептиды и который находится в различных тканях человеческого организма, таких как, например, желудок (пепсин), просвет кишечника (химотрипсин, трипсин, эластаза, карбоксипептидазы и т.д.) или слизистая оболочка ЖКТ (аминопептидазы, карбоксипептидазы, энтеропептидазы, дипептидилпептидазы, эндопептидазы и т.д.), печень (фермент, разрушающий инсулин, катепсин D и т.д.) и другие.

Под протеолитически стабильным аналогом инсулина в данном документе следует понимать аналог инсулина, который медленнее подвергается деградации одной или более протеазами по сравнению с человеческим инсулином. В одном воплощении протеолитически стабильный аналог инсулина в соответствии с изобретением подвергается деградации одной или более протеазами по сравнению с родительским инсулином. В другом воплощении изобретения аналог инсулина в соответствии с изобретением стабилизирован против деградации одним или более ферментами, выбранными из группы, состоящей из пепсина (такого как, например, изоформы пепсин А, пепсин В, пепсин С и/или пепсин F), химотрипсина (такого как, например, изоформы химотрипсин А, химотрипсин В и/или химотрипсин С), трипсина, фермента, разрушающего инсулин (IDE), эластазы (такой как, например, изоформы панкреатическая эластаза I и/или II), карбоксипептидазы (например изоформы карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза А2 и/или карбоксипептидаза В), аминопептидазы, катепсина D и других ферментов, находящихся в желудочно-кишечном тракте, полученных от крысы, свиньи или человека.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением стабилизирован против деградации одним или более ферментами, выбранными из группы, состоящей из: химотрипсина, трипсина, фермента, разрушающего инсулин (IDE), эластазы, карбоксипептидаз, аминопептидаз и катепсина D. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением стабилизирован против деградации одним или более ферментами, выбранными из группы, состоящей из химотрипсина, карбоксипептидаз и IDE. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением стабилизирован против деградации одним или более ферментами, выбранными среди химотрипсина и карбоксипептидаз.

Т ¹/₂ может быть определен в соответствии с описанием в разделе Примеры как мера протеолитической устойчивости аналога инсулина в соответствии с изобретением к ферментам протеазам, таким как химотрипсин, пепсин и/или карбоксипептидаза А. В одном воплощении изобретения Т ¹/₂ увеличен по сравнению с человеческим инсулином. В другом воплощении Т ¹/₂ увеличен по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т ¹/₂ увеличен по меньшей мере в 2 раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т ¹/₂ увеличен по меньшей мере в 3 раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т ¹/₂ увеличен по меньшей мере в 4 раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т ¹/₂ увеличен по меньшей мере в 5 раз по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т ¹/₂ увеличен по меньшей мере в 10 раз по сравнению с родительским инсулином.

Сайты протеазного расщепления (также упоминаемые в данном документе как протеазные сайты) следует понимать как аминокислотные остатки, которые распознаются протеазами, и/или аминокислотные остатки, пептидная связь которых расщепляется протеазами. Сайты протеазного расщепления могут быть выявлены путем определения "горячих точек" расщепления при анализах ВЭЖХ, масс-спектрометрии или ЖХ-МС и/или прогнозированы на основании ферментной специфичности фермента протеазы, для которого был определен сайт протеазного расщепления. Специалисту в данной области известно о том, как определить сайты протеазного расщепления, например на основании особенностей фермента, как описано например в Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed., Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F. editors, Elsevier Academic Press 2004. Например, использование химотрипсина прогнозируют для расщепления С-концевых пептидных связей ароматических остатков (Тrр, Туr, Phe или Leu), за которыми не следует Pro. Подобным образом, использование трипсина прогнозируют для расщепления С-концевых пептидных связей основных остатков Lys или Arg, за которыми не следует Pro, использование эластазы прогнозируют для отщепления С-концевых остатков Ala, Val, Gly или Ser, а карбоксипептидаза А удаляет С-концевую аминокислоту, но не Arg, Lys или Pro. Фермент, разрушающий инсулин (IDE), прогнозируют для расщепления в следующих позициях человеческого инсулина: В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25, В25-26, А13-14 и А14-15.

Термин "замена (одной) аминокислоты "в пределах или в непосредственной близости" к сайту протеазного расщепления используется в данном документе для обозначения замены аминокислоты в пределах или в непосредственной близости от позиции в родительском инсулине, которая была определена как сайт протеазного расщепления. В одном воплощении заменены две или более гидрофобные аминокислоты в пределах или в непосредственной близости к двум или более протеазным сайтам в инсулине, причем указанные гидрофобные аминокислоты заменены гидрофильными аминокислотами. В другом воплощении две или более гидрофобные аминокислоты в пределах двух или более протеазных сайтов инсулина заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные вблизи к двум или более протеазным сайтам инсулина заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в двух аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в трех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в четырех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в одной, двух или трех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в одной или двух аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные вблизи или в пределах двух или более сайтов протеазы на инсулин заменены гидрофильными аминокислотами.

Аналог инсулина в соответствии с изобретением может иметь результирующий заряд, который отличается от результирующего заряда родительского инсулина. В одном воплощении результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением является более положительным, чем результирующий заряд родительского инсулина. В одном воплощении результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением является более отрицательным, чем результирующий заряд родительского инсулина. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением, измеренный в водном растворе, находится между 0,5 и 5. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между 1 и 5. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между 1 и 4. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между 1 и 3. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между 2 и 3. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением, измеренный в водном растворе, находится между -0.5 и -5. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между -1 и -5. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между -1 и -4. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между -1 и -3. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд аналога инсулина в соответствии с изобретением находится между -2 и -3.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением может иметь повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением может иметь повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 3-9. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4-8,5. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4-8. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4,5-8. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 5-8. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 5,5-8. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 6-8.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 2-4.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 3-9. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4-8,5. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4-8. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4,5-8. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 5-8. В еще одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 5,5-8. В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 6-8.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 2-4.

Под "повышенной растворимостью при данном рН" имеется в виду, что большая концентрация аналога инсулина изобретения растворяется в водном или буферном растворе при рН раствора по сравнению с инсулином, с которым проводится сравнение, например с человеческим инсулином или родительским инсулином. Способы определения, растворяется ли инсулин, содержащийся в растворе, известны в данной области.

В одном воплощении раствор может быть подвергнут центрифугированию в течение 20 минут при 30000 g, а затем концентрация инсулина в супернатанте может быть определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Если эта концентрация находится в пределах экспериментальной ошибки первоначальной концентрации инсулина, используемой для получения композиции, то инсулин полностью растворяется в композиции изобретения.

В другом воплощении растворимость инсулина в композиции изобретения может быть просто определена при визуальном изучении контейнера, в котором содержится композиция. Инсулин является растворимым, если раствор визуально прозрачен и в нем нет твердых частиц и он не суспендирован и не преципитирован на боковой/нижней части контейнера.

Аналог инсулина в соответствии с изобретением может иметь увеличенную силу и/или биодоступность по сравнению с родительским инсулином по данным измерений.

Стандартные анализы для измерения силы или биодоступности инсулина известны специалистам в данной области и, в частности, включают (1) радиоспектроанализы инсулина, в которых относительная сила инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимого для вытеснения 50% ¹²⁵I-инсулина, специфично связывающегося с рецепторами инсулина, представленными на клеточных мембранах, например на фракции плазматической мембраны печени крыс (2) анализы липогенеза, выполняемые, например, с адипоцитами крыс, в которых относительная сила инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимого для достижения 50% от максимальной конверсии [3-³H]-глюкозы в органически извлекаемый материал (т.е. липиды); (3) анализы окисления глюкозы в изолированных жировых клетках, в которых относительная сила аналога инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимого для достижения 50% от максимальной конверсии глюкозо-1-[¹⁴С] в [¹⁴CO₂]; (4) радиоиммуноанализы инсулина, которые могут определить иммуногенность аналогов инсулина путем измерения эффективности, с которой инсулин или аналог инсулина конкурирует с ²⁵I-инсулином в связывании со специфическими антиинсулиновыми антителами, и (5) другие анализы, которые измеряют связывание инсулина или аналога инсулина с антителами в образцах плазмы крови животных, такие как анализы ELISA, использующие специфические инсулиновые антитела.

Аналоги инсулина в соответствии с изобретением, возможно, могут быть проанализированы на другие протеазные сайты, которые могут быть предметом дальнейшей замены одной или более гидрофобных аминокислот гидрофильными аминокислотами. Аналог инсулина в соответствии с изобретением может быть аналогом инсулина, который имеет по меньшей мере две гидрофильные аминокислоты в протеазных сайтах по сравнению с родительским инсулином, первым модифицированным инсулином, и который имеет также по меньшей мере одну аминокислотную замену в новом протеазном сайте первого модифицированного инсулина, в котором по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота была заменена по меньшей мере одной гидрофильной аминокислотой.

В одном воплощении предложен аналог инсулина, в котором С-конец В-цепи соединен с N-концом А-цепи 3-15 аминокислотами. Такой аналог инсулина в данном документе обозначается как "одноцепочечный инсулин" или "SCI" и имеет общую структуру В-С-А, где В представляет собой В-цепь человеческого инсулина или его аналога или производного, А представляет собой А-цепь человеческого инсулина или его аналога или производного, а С является связывающей пептидной цепью из 3-15 аминокислотных остатков, соединяющей, как правило, В30 с А1. Если В-цепь представляет собой цепь desВ30, то связывающий пептид будет связывать В29 с А1. Одноцепочечный инсулин, как человеческий инсулин, будет содержать правильно расположенные дисульфидные мостики (три), находящиеся между CysA7 и CysB7 и между CysA20 и CysB19, и внутренний дисульфидный мостик между СysА6 и CysA11. В одном воплощении предложен аналог инсулина, в котором С-конец В-цепи связан с N-концом А-цепи 3-7 аминокислотами.

Данное изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют заявленные аналоги инсулина. В другом воплощении данное изобретение относится к векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот, и к принимающим клеткам, содержащим такие последовательности нуклеиновых кислот или векторы.

В еще одном воплощении изобретение относится к процессу изготовления аналога инсулина, содержащему (i) культивирование принимающей клетки (клетки-хозяина), которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую предшественник инсулина; (ii) выделение предшественника инсулина из культуральной среды и (iii) преобразование предшественника инсулина в аналог инсулина изобретения путем ферментативной конверсии in vitro.

В еще одном воплощении изобретение относится к процессу изготовления аналога инсулина, содержащему (i) культивирование принимающей клетки, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую предшественник инсулина; (ii) выделение предшественника инсулина из культуральной среды и (iii) преобразование предшественника инсулина в аналог инсулина изобретения.

В одном воплощении данного изобретения принимающая клетка (клетка-хозяин) является дрожжевой принимающей клеткой, и в другом воплощении дрожжевую принимающую клетку выбирают из рода Saccharomyces. В другом воплощении дрожжевую принимающую клетку выбирают из вида Saccharomyces cerevisiae.

Под термином "аналог инсулина", используемом в данном документе, понимают полипептид, полученный из первичной структуры природного инсулина, например из человеческого инсулина, путем делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, происходящего из природного инсулина, и/или путем добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка. Дополнительные и/или заменяемые аминокислотные остатки могут быть кодируемыми аминокислотными остатками или другими природными аминокислотными остатками.

Аналоги инсулина в соответствии с данным изобретением могут быть человеческим инсулином или его аналогом, мутированным по одной или более позициям. В одном воплощении аналоги инсулина сконструированы для увеличения устойчивости к протеазам на основе выявленных сайтов протеазного расщепления.

В одном воплощении по меньшей мере один сайт расщепления подвергается мутации в позиции, выбранной из группы, состоящей из человеческих инсулинов В2-3, В6-7, В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В16-17, В22-23, В24-25, В25-26, А13-14, А14-15 и А19-20.

В одном воплощении по меньшей мере один сайт расщепления подвергается мутации в позиции, выбранной из группы, состоящей из человеческих инсулинов В2-3, В6-7, В16-17, В22-23, В24-25 и/или А19-20.

В одном воплощении по меньшей мере один сайт расщепления подвергается мутации в позиции В22-23.

В одном воплощении по меньшей мере один сайт расщепления подвергается мутации в позиции, выбранной из группы, состоящей из В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25, В25-26, А13-14, А14-15.

В одном воплощении сайты расщепления, которые подвергаются мутации, находятся в двух или более позициях, выбранных из группы, состоящей из человеческих инсулинов В2-3, В6-7, В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В16-17, В22-23, В24-25, В25-26, А13-14, А14-15 и А19-20.

В одном воплощении сайты расщепления, которые подвергаются мутации, находятся в двух или более позициях, выбранных из группы, состоящей из человеческих инсулинов В2-3, В6-7, В16-17, В22-23, В24-25 и/или А19-20.

В одном воплощении сайты расщепления, которые подвергаются мутации, находятся в двух или более позициях, выбранных из группы, состоящей из В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25, В25-26, А13-14, А14-15.

В одном воплощении получен аналог инсулина в соответствии с изобретением, в котором А-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и В-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, где по меньшей мере одна мутация в А-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из А13-14, А14-15 и А19-20, и по меньшей мере одна мутация в В-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из: В2-3, В6-7, В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В16-17, В22-23, В24-25 и В25-26.

В одном воплощении получен аналог инсулина в соответствии с изобретением, в котором А-цепь аналога инсулина содержит одну мутацию и В-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, где одна мутация в А-цепи находится в сайте расщепления А19-20, и по меньшей мере одна мутация в В-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из В2-3, В6-7, В16-17, В22-23 и В24-25.

В одном воплощении получен аналог инсулина в соответствии с изобретением, в котором А-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и В-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, где по меньшей мере одна мутация в А-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из А13-14 и А14-15, а по меньшей мере одна мутация в В-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25 и В25-26.

Аминокислотные остатки, подходящие для замены, выбирают с целью удаления сайтов расщепления. В одном воплощении аминокислоты выбирают с дополнительной целью увеличения растворимости. В другом воплощении увеличенная растворимость наблюдается при рН в диапазоне 3-9. В еще одном воплощении увеличенная растворимость наблюдается при рН в диапазоне 4-8. Инсулин или аналог инсулина может быть замещен в одной или более позициях какой-либо природной аминокислотой, или какая-либо природная аминокислота может быть добавлена к родительскому инсулину или аналогу родительского инсулина. Для удобства здесь приведены названия кодируемых природных аминокислот с обычным трехбуквенным кодом и однобуквенным кодом в скобках:

глицин (Gly и G), пролин (Pro и Р), аланин (Аlа и А), валин (Val и V), лейцин (Leu и L), изолейцин (Не и I), метионин (Met и М), цистеин (Cys и С), фенилаланин (Рhе и F), тирозин (Туr и Y), триптофан (Тrр и W), гистидин (His и Н), лизин (Lys и К), аргинин (Аrg и R), глутамин (Gin и Q), аспарагин (Asn и N), глутаминовая кислота (Glu и Е), аспарагиновая кислота (Asp и D), серин (Ser и S) и треонин (Тhr и Т). Если из-за опечатки возникают отклонения от наиболее часто используемых кодонов, то применяются наиболее часто используемые кодоны. Аминокислоты, присутствующие в инсулинах данного изобретения, являются предпочтительно аминокислотами, которые могут быть закодированы нуклеиновой кислотой. В одном воплощении инсулин или аналог инсулина замещается Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Аrg? и/или Pro и/или к инсулину или аналогу инсулина добавляется Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg и/или Pro. В одном воплощении инсулин или аналог инсулина замещается Glu, Asp Его, Gin, Asn, Lys и/или Arg и/или к инсулину или аналогу инсулина добавляется Glu, Asp Его, Gin, Asn, Lys и/или Arg.

Аналоги инсулина могут быть такими, в которых природный остаток Phe в позиции 25 В-цепи может быть заменен на His в сочетании с заменой природного Tyr в позиции А14 на Glu, Asp или His. Одна или более дополнительных мутаций могут включать desB30, и аналоги инсулина также могут быть модифицированы путем N-концевого удлинения или С-концевого удлинения А-цепи и/или В-цепи, такое как, например, удлинение М-конца А- и/или В-цепи аналога инсулина посредством GGP, GGPP, GP или GPP. Другие примеры включают, но не ограничиваются дополнительными мутациями, в которой один или два остатка Pro могут быть добавлены в позиции АО и/или ВО, Leu может быть добавлен в позицию В31 и/или Glu может быть добавлен в позицию В32. Одна или более дополнительных мутаций могут быть выбраны среди позиции А8, модифицированной на His, позиции А21 на Gly, позиции В1 на Glu или Gin, позиции В16 на Glu, позиции В26 на Asp, позиции В27 на Glu и/или позиции В28 на Asp.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением выбирают из группы, состоящей из:

А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B28D, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B26D, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В1Е, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B28D, desB30 человеческого инсулина;

A14D, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А(-1)Р, А(0)Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В(-1)Р, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А(-1)Р, А(0)Р, А14Е, В(-1)Р, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В30Т, B31L, В32Е человеческого инсулина;

А14Е, В25Н человеческого инсулина;

А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В10Р, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В4Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Н, В16Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Н, В10Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А13Н, А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, A18Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В24Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, B10D, В25Н, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, А14Е, B10D, B25H-amide, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H-amide, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, A18Q, A21Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, A18Q, A21Q, B3Q, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, A18Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13N, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13N, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A(-2)G, A(-1)P, А(0)Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B(-2)G, B(-1)P, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A(-2)G, A(-1)P, А(0)Р, А14Е, B(-2)G, B(-1)P, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B27R, B28D, В29К, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B27R, B28D, В29К, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В26Т, B27R, B28D, В29К, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, А18К, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, А22К, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, А22К, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, desB1, desB2, desB3, B25H-amide, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, desB1, desB2, desB3, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, desB1, desB2, desB3, В16Н, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, B27R, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, В27Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, B27R, desB28-B30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, В27Н, desB28-B30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, В27Е, desB28-B30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, В27К, desB28-B30 человеческого инсулина;

А14Е, В27К, desB28-B30 человеческого инсулина;

А14Е, A18Q, B3Q, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А13Е, А14Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А12Е, А14Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А15Е, А14Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А13Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А12Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А15Е, B25H, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, desB27, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, B26D, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

ЕЕАЕАЕАРК-В(1-29)-В25Н-ААК-А(1-21)-А14Е человеческого инсулина;

EEAEPK-B(1-29)-B25H-DGK-A(1-21)-A14E человеческого инсулина;

В(1-29)-В25Н-ААК-А(1-21)-А14Е человеческого инсулина;

В(1-29)-В1Е, В25Н-ААК-А(1-21)-А14Е человеческого инсулина;

В(1-29)-В25Н, В27Е-ААК-А(1-21)-А8Н, А14Е человеческого инсулина;

В(1-29)-В1Е, B25H, В27Е-ААК-А(1-21)-А8Н, А14Е человеческого инсулина;

ЕЕАЕАЕАРК-В(1-29)-В16Е, В25Н-ААК-А(1-21)-А8Н, А14Е человеческого инсулина;

В(1-29)-В25Н, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E человеческого инсулина;

В(1-29)-В16Е, B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E человеческого инсулина;

В(1-29)-В25Н, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A8H, А14Е человеческого инсулина А14Е, B25H, B27R, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B25H, B27N, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B27D, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B27Q, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B27G, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27К, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27Р, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, B27S, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, В27Т, desB30 человеческого инсулина;

A13R, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13N, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13D, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13Q, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Е, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13G, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13К, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A13S, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А13Т, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B16R, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B16D, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, B16Q, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A14R, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A14N, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A14D, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A14Q, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

A14G, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А14Н, В25Н, desB30 человеческого инсулина;

А8Н, B10D, В25Н человеческого инсулина; и

А8Н, А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина.

Инсулин является полипептидным гормоном, секретируемым (3-клетками поджелудочной железы, состоящим из двух полипептидных цепей, А и В, которые соединены двумя межцепочечными дисульфидными мостиками. Кроме того, А-цепь характеризуется наличием одного внутрицепочечного дисульфидного мостика.

препептид-В-Аrg Аrg-C-Lys Аrg-А, где С является связывающим пептидом из 31 аминокислоты. Аrg-Аrg и Lys-Аrg являются сайтами расщепления для отщепления связывающего пептида от А- и В-цепи.

Для получения человеческого инсулина в микроорганизмах было использовано три основных способа. В два из них вовлекают Eschehchia соli, либо с экспрессией большого гибридного белка в цитоплазме (Frank et al. (1981) в Peptides: Proceedings of the 7^th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, III. pp 729-739), либо с использованием сигнального пептида для запуска секреции в периплазматическое пространство (Chan et al. (1981) PNAS 78:5401-5404). Третий способ использует Saccharomyces cerevisiae для секреции предшественника инсулина в среду (Thim et al. (1986) PNAS 83:6766-6770). Прежний уровень техники раскрывает большое количество инсулиновых предшественников, которые экспрессируются или в Е соli, или в Saccharomyces cerevisiae, см. патент США №5962267, WO 95/16708, ЕР 0055945, ЕР 0163529, ЕР 0347845 и ЕР 0741188.

Аналоги инсулина продуцируются путем экспрессии последовательности ДНК, кодирующей аналог инсулина, соответствующей принимающей клеткой (клеткой-хозяином) с помощью хорошо известной методики, раскрытой, например, в патенте США №6500645. Аналог инсулина экспрессируется либо непосредственно, либо в виде молекулы предшественника, которая имеет N-концевое удлинение В-цепи. Это N-концевое удлинение может иметь функцию увеличения выхода непосредственно экспрессированного продукта и может быть длиной до 15 аминокислотных остатков. N-концевое удлинение должно быть отщеплено in vitro после выделения из культуральной жидкости, и поэтому также имеет сайт расщепления рядом с В1. N-концевые удлинения такого типа, который подходит для данного изобретения, раскрыты в патенте США №5395922, а также в Европейском патенте №765395А.

Изолированный аналог инсулина может быть ацилирован в желаемой позиции хорошо известными способами ацилирования, и примеры таких аналогов инсулина описаны, например, в Европейских патентных заявках, имеющих публикации №№ЕР 214826, ЕР 375437 и ЕР 383472.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая соответствующий полипептид аналога инсулина, может быть получена синтетически с помощью установленных стандартных способов, например фосфорамидитным способом, описанным Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, или способом, описанным Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. В соответствии с фосфорамидитным способом олигонуклеотиды синтезируют, например в автоматическом ДНК-синтезаторе, очищают, соединяют в пару и лигируют для формирования синтетической ДНК-конструкции. В настоящее время предпочтительным путем получения ДНК-конструкции является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Последовательности нуклеиновых кислот также могут быть смешанного происхождения: геномного, кДНК и синтетического. Например, геномная или кДНК последовательность, кодирующая лидерный пептид, может быть соединена с геномной или кДНК последовательностью, кодирующей А- или В-цепь, после чего ДНК последовательность может быть модифицирована в сайте путем вставления синтетических олигонуклеотидов, кодирующих желаемую аминокислотную последовательность для гомологичной рекомбинации, в соответствии с хорошо известными процедурами, или предпочтительно путем образования желаемой последовательности с помощью ПЦР с использованием подходящих олигонуклеотидов.

Рекомбинантный вектор, способный к репликации в выбранном микроорганизме или принимающей клетке (клетке-хозяине), и который несет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид аналога инсулина, может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. существующим как внехромосомный элемент, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмидой, внехромосомным элементом, мини-хромосомой или искусственной хромосомой. Вектор может содержать какие-либо средства для обеспечения саморепликации. В альтернативном варианте вектор может быть таким, который при введении в принимающую клетку (клетку-хозяина) интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он был интегрирован. Кроме того, один вектор или плазмида или два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат тотальную ДНК, вводят в геном принимающей клетки (клетки-хозяина), либо может быть использован транспозон. Вектор может быть линейной или замкнутой в круг плазмидой и предпочтительно содержит элемент(ы), который делает возможной стабильную интеграцию вектора в геном принимающей клетки или автономные репликации вектора в клетке в зависимости от генома.

В одном воплощении рекомбинантный вектор экспрессии способен к репликации в дрожжах. Примерами последовательностей, которые позволяют вектору реплицироватья в дрожжах, являются гены репликации REP 1-3 и репликатор (origin of replication) дрожжевой плазмиды 2µm.

Векторы могут содержать один или более селектируемых маркеров, которые позволяют легко отбирать трансформированные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает биоцидную или вирусную резистентность, резистентность к тяжелым металлам, прототрофа к ауксотрофам и т.п. Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены с/а/ от Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые наделяют резистентностью к антибиотикам, такой как резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Селектируемые маркеры для использования в принимающих клетках (клетках-хозяевах) нитчатых грибов включают amdS (ацетамидаза), argВ (орнитинкарбамоилтрансфераза), pyrG (оротидин-5'-фосфат-декарбоксилаза) и trpC (антранилатсинтаза). Подходящими маркерами для дрожжевых принимающих клеток являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, МЕТЗ, TRP1 и URA3. Хорошо подходящим селектируемым маркером для дрожжей является ген TPI от Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130).

В векторе последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с подходящей промоторной последовательностью. Промотор может быть любой нуклеиновокислотной последовательностью, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной принимающей клетке, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные принимающей клетке.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в бактериальной принимающей клетке являются промоторы, полученные из lас-оперона E. соli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансукразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyi), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus {amyM}, гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) и гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (реnР). Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в принимающей клетке нитчатого гриба являются промоторы, полученные из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger. В дрожжевых принимающих клетках используют промоторы Ма1, TPI, ADH или PGK от Saccharomyces cerevisiae.

Конструкция нуклеиновой кислоты также обычно функционально связана с подходящим терминатором. В дрожжах подходящим терминатором является TPI-терминатор (Alberet al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434).

Специалистам в данной области хорошо известны процедуры, которые используются для связывания отдельных последовательностей нуклеиновых кислот, содержащихся в векторе экспрессии, таких как ДНК, кодирующей полипептид требуемого аналога инсулина, промотор и терминатор соответственно, и для вставления их в подходящий вектор, содержащий информацию, необходимую для репликации в выбранном хозяине. Необходимо понимать, что вектор может быть построен либо путем получения вначале ДНК-конструкции, содержащей всю последовательность ДНК, кодирующую полипептиды аналога инсулина данного изобретения, а затем вставления этого фрагмента в подходящий вектор экспрессии, либо путем последовательного вставления фрагментов ДНК, содержащих генетическую информацию об отдельных элементах (таких как сигнальный, пропептид, связывающий пептид, А- и В-цепи), а затем лигирования.

Вектор, содержащий такую нуклеиновокислотную последовательность, вводят в принимающую клетку так, что он функционирует как хромосомный интегрант (компонент) или как самореплицирующийся внехромосомный вектор, описанный выше. Термин "принимающая клетка (клетка-хозяин)" охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, которые произошли во время репликации. Принимающая клетка может быть одноклеточным микроорганизмом, например прокариотом, или неодноклеточным микроорганизмом, например эукариотом. Используемыми одноклеточными клетками являются бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, в т.ч. клетка Bacillus, клетка Streptomyces или грамотрицательные бактерии, такие как E. соli и Pseudomonas sp., но не ограничиваются ими. Эукариотические клетки могут быть клетками млекопитающих, насекомых, растений или грибов. В предпочтительном воплощении принимающая клетка является дрожжевой клеткой. Дрожжевой организм, используемый в процессе изобретения, может быть любым подходящим дрожжевым организмом, который при культивировании продуцирует большое количество одноцепочечного инсулина изобретения. Примерами подходящих дрожжевых организмов являются штаммы, выбранные среди видов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastohs, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. и Geotrichum fermentans.

Трансформация дрожжевых клеток может осуществляться, например, путем формирования протопластов, а затем трансформации известным способом. Среда, используемая для культивирования клеток, может быть любой обычной средой, подходящей для выращивания дрожжевых организмов. Секретированный полипептид аналога инсулина, значительная часть которого будет присутствовать в среде в правильно процессированной форме, может быть извлечен из среды с помощью обычных процедур, включая выделение дрожжевых клеток из среды путем центрифугирования, фильтрацию или захват предшественника инсулина ионообменной матрицей или матрицей абсорбции обратной фазы, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрацию с помощью соли, например сульфата аммония, а затем очищен с помощью различных хроматографических процедур, например с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Другим объектом данного изобретения является создание фармацевтического состава, содержащего аналог инсулина в соответствии с данным изобретением, который находится в концентрации от 0,1 мг/мл до 500 мг/мл и где указанный состав имеет рН от 2,0 до 10,0. Состав может также содержать ингибитор(ы) протеазы, буферную систему, консервант(ы), агент(ы), влияющий(ие) на тоничность, хелатирующий(ие) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно активные вещества. В одном воплощении изобретения фармацевтический состав является водным составом, т.е. составом, содержащим воду. Такой состав обычно является раствором или суспензией. В другом воплощении изобретения фармацевтический состав является водным раствором. Термин "водный состав" применяется для обозначения состава, содержащего по меньшей мере 50% (по массе) воды. Аналогично, термин "водный раствор" применяется для обозначения раствора, содержащего по меньшей мере 50% (по массе) воды, а термин "водная суспензия" применяется для обозначения суспензии, содержащей по меньшей мере 50% (по массе) воды.

В другом воплощении фармацевтический состав является лиофилизированным составом, в который перед использованием врач или пациент добавляет растворители или разбавители.

В другом воплощении фармацевтический состав является высушенным составом (например, лиофилизированным или полученным путем распылительной сушки), готовым для использования без какого-либо предварительного растворения.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему водный раствор аналога инсулина данного изобретения, а также буфер, где указанный аналог инсулина присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл и выше и где указанный состав имеет рН от примерно 2,0 до примерно 10,0.

Составы, предназначенные для орального применения, могут быть получены в соответствии с любым известным способом, и такие составы могут содержать один или более агентов, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих агентов, ароматизирующих агентов, красителей и консервантов, для того чтобы предоставить фармацевтически приятные и приемлемые препараты. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые пригодны для изготовления таблеток. Этими эксципиентами могут быть, например, инертные разбавители, такие как маннитол, мальтодекстрин, каолин, карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция и фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, например кукурузный крахмал; связующие агенты, например крахмал, желатин, полимеры или гуммиарабик; и смазочные агенты, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми, либо с помощью известных методик они могут быть покрыты для задержки распада или высвобождения терапевтически активного полипептида.

Составы данного изобретения, подходящие для орального введения, могут быть изготовлены и введены с помощью способов, хорошо известных в фармацевтической химии, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed. (A. Osol ed., 1985).

В одном воплощении изобретения фармацевтические композиции данного изобретения могут быть введены в виде твердых дозированных форм, таких как таблетки и капсулы. Таблетки могут быть изготовлены путем влажного гранулирования, сухого гранулирования, прямого прессования или гранулирования из расплава.

Таблетки данного изобретения могут быть получены с использованием обычных методик таблетирования. Общий способ изготовления предполагает сочетание аналога инсулина, водорастворимого разбавителя, гидрофильного связующего вещества и, возможно, части дезинтегрирующего вещества. Эту смесь затем гранулируют с помощью водного раствора гидрофильного связующего вещества или водного раствора гидрофильного связующего вещества и поверхностно-активного вещества и при необходимости измельчают. Гранулы сушат и уменьшают до подходящего размера. К гранулам добавляют и смешивают с ними любые другие ингредиенты, такие как смазочные агенты (например стеарат магния) и дополнительные дезинтегранты. Затем эту смесь сжимают до подходящего размера и формы с помощью обычных таблетирующих машин, таких как ротационный таблеточный пресс. Таблетка может быть покрыта пленкой с помощью хорошо известных в данной области методик.

Составы для орального применения могут быть представлены в виде твердых или мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например таким как маннит, мальтодекстрин, карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, каолин, фосфат кальция или фосфат натрия, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Капсулы для данного изобретения могут быть изготовлены с использованием обычных способов. Обычный способ изготовления предполагает сочетание терапевтически активного пептида, альгината, водорастворимого разбавителя, гидрофильного связующего вещества и, возможно, части дезинтегрирующего вещества. Эту смесь затем гранулируют с помощью водного раствора гидрофильного связующего вещества или водного раствора гидрофильного связующего вещества и поверхностно-активного вещества и при необходимости измельчают. Гранулы сушат и уменьшают до подходящего размера. К гранулам добавляют и смешивают с ними любые другие ингредиенты, такие как смазочные агенты. Полученной смесью затем заполняют твердые желатиновые капсулы подходящего размера, используя обычные капсулонаполнительные машины.

В другом воплощении изобретения буфер выбирают из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия, трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов представляет собой альтернативное воплощение изобретения.

В другом воплощении изобретения состав также содержит фармацевтически приемлемый консервант. Консервант присутствует в количестве, достаточном для получения консервирующего эффекта. Количество консерванта в фармацевтическом составе хорошо известно специалистам и может быть определено, например, по литературе из данной области и/или по известному количеству консерванта, например, в коммерческих продуктах. Каждый из этих конкретных консервантов представляет собой альтернативное воплощение изобретения. Специалистам хорошо известно использование консерванта в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В другом воплощении изобретения состав также содержит хелатирующий агент. Специалистам хорошо известно использование хелатирующего агента в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В другом воплощении изобретения состав также содержит стабилизатор. Термин "стабилизатор", используемый в данном документе, относится к химическим веществам, добавленным к содержащим полипептид фармацевтическим составам для того, чтобы стабилизировать пептид, т.е. для увеличения срока хранения и/или времени использования таких составов. Специалистам хорошо известно использование стабилизатора в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В другом воплощении изобретения состав также содержит поверхностно активное вещество. Термин "поверхностно активное вещество", используемый в данном документе, относится к любым молекулам или ионам, которые состоят из водорастворимой (гидрофильной) части, головки, и жирорастворимого (липофильного) сегмента. Поверхностно активные вещества накапливаются предпочтительно на поверхностях раздела, причем их гидрофильная часть ориентирована по направлению к воде (гидрофильной фазе), а липофильная часть по направлению к масляной или гидрофобной фазе (т.е. стеклу, воздуху, маслу и т.д.). Концентрация, при которой поверхностно активные вещества начинают формировать мицеллы, известна как критическая концентрация мицеллообразования, или CMC (critical micelle concentration). Кроме того, поверхностно активные вещества снижают поверхностное натяжение жидкости. Поверхностно активные вещества также известны как амфифильные соединения. Термин "детергент" является синонимом, обычно использующимся для поверхностно-активных веществ. Специалистам хорошо известно использование поверхностно-активного вещества в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

В другом воплощении изобретения состав также содержит ингибиторы протеазы.

В фармацевтическом составе аналога инсулина данного изобретения возможно также присутствие и других составляющих. Такие дополнительные составляющие могут включать смачивающие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, агенты, увеличивающие объем фармацевтической формы, агенты, изменяющие тоничность, хелатирующие агенты, ионы металлов, маслянистые связующие вещества, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или другие белки) и цвиттер-ионы (например, аминокислоты, такие как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Разумеется, такие дополнительные составляющие не должны отрицательно влиять на общую стабильность фармацевтического состава данного изобретения.

Фармацевтические композиции, содержащие аналог инсулина в соответствии с данным изобретением, можно вводить пациентам, нуждающимся в таком лечении, в несколько различных областей, например в наиболее актуальные области, такие как кожа и слизистая оболочка, в области, обходящие адсорбцию, например в артерию, в вену, в сердце, и в области, включающие адсорбцию, например в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшинную полость.

Введение фармацевтических композиций в соответствии с изобретением пациентам, нуждающимся в таком лечении, можно проводить несколькими путями, например на язык, под язык, буккально, в рот, орально, внутрижелудочно и внутрикишечно, через нос, внутрилегочно, например через бронхиолы и альвеолы, или комбинируя их, эпидермально, дермально, трансдермально, вагинально, ректально, окулярно, например через конъюнктиву, уретрально и парентерально.

Композиции данного изобретения могут быть введены в нескольких дозированных формах, например в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, множественных эмульсий, пен, бальзамов, паст, пластырей, мазей, таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, ополаскивателей, капсул, например твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, свечей, ректальных капсул, драже, гелей, спреев, порошков, аэрозолей, ингалянтов, глазных капель, глазных мазей, глазных ополаскивателей, вагинальных пессариев, вагинальных колец, вагинальных мазей, инъекционных растворов, растворов, трансформирующихся in situ, например загустевающих in situ, фиксирующихся in situ, осаждающихся in situ, кристаллизующихся in situ, инфузионных растворов, а также имплантатов.

Композиции изобретения могут быть также усложнены или дополнены с помощью хорошо известных специалистам в данной области способов, например посредством ковалентных, гидрофобных и электростатических взаимодействий, лекарственного носителя, системы доставки лекарства и улучшенной системы доставки лекарства в целях еще большего увеличения стабильности соединения аналога инсулина, увеличения биодоступности, увеличения растворимости, уменьшения неблагоприятных последствий, обеспечения хронотерапии, а также улучшения взаимодействия с пациентом или любых их сочетаний.

Композиции данного изобретения используют в форме твердых веществ, полутвердых веществ, порошков и растворов для легочного введения аналога инсулина, например с помощью дозирующего ингалятора, сухопорошкового ингалятора и небулайзера; все эти устройства хорошо известны специалистам в данной области.

Композиции данного изобретения могут использоваться в форме систем доставки лекарств с контролируемым, постепенным, удлиненным, запаздывающим и замедленным высвобождением. Для большей специфичности композиции используют в форме хорошо известных специалистам в данной области систем доставки лекарств с парентеральным контролируемым высвобождением и постепенным высвобождением (обе эти системы ведут к многократному сокращению числа введений), но не ограничиваются этим. Еще более предпочтительными являются системы доставки лекарств с подкожным контролируемым и постепенным высвобождением. Без ограничения сферы применения изобретения примерами используемых контролируемых систем доставки и композиций являются гидрогели, масляные гели, жидкие кристаллы, полимерные мицеллы, микросферы, наночастицы.

Способы получения систем контролируемого высвобождения, используемых для композиций данного изобретения, включают кристаллизацию, конденсацию, сокристаллизацию, преципитацию, копреципитацию, эмульгирование, диспергирование, гомогенизацию под высоким давлением, инкапсуляцию, распылительную сушку, микроинкапсуляцию, коацервацию, фазовое расслоение, испарение растворителя для получения микросфер, экструзию и процессы со сверхкритическими флюидами, но не ограничиваются ими. Общие ссылки сделаны на Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L, ed. Marcel Dekker, New York, 2000) и Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).

Парентеральное введение может быть осуществлено путем подкожных, внутримышечных, интраперитонеальных или внутривенных инъекций с помощью шприца, возможно ручки-шприца. В альтернативном варианте парентеральное введение может быть выполнено с помощью инфузионного дозатора. Другой возможностью является использование композиции в виде раствора или суспензии для введения соединения аналога инсулина в форме назального или пульмонального спрея. В качестве другой возможности фармацевтические композиции, содержащие соединение аналога инсулина изобретения, могут быть адаптированы для чрескожного введения, например с помощью безыгольных инъекций или трансдермальных пластырей, возможно, способом ионтофореза или введением через слизистую оболочку, например буккальную.

Аналог инсулина в соответствии с изобретением можно вводить через легочные пути в носителе в виде раствора, суспензии или сухого порошка, используя любой из известных типов устройств, пригодных для внутрилегочного введения лекарств. Примерами их являются три общих типа систем для внутрилегочного введения лекарств, образующих аэрозоль, и могут включать струйный или ультразвуковой небулайзеры, дозирующие ингаляторы или сухопорошковые ингаляторы, но не ограничиваются ими (См. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

В другом воплощении состав может быть переведен в аэрозоль какой-либо известной методикой аэрозолирования, такой как небулизация, для достижения MMAD аэрозольных частиц менее 10 мкм, более предпочтительно 1-5 мкм и наиболее предпочтительно 1-3 мкм. Предпочтительный размер частиц основан на наиболее эффективном размере для доставки лекарства глубоко в легкие, где белок оптимально абсорбируется (см. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).

Глубокую легочную депозицию пульмональных составов, содержащих соединение аналога инсулина, возможно, можно также оптимизировать путем модификации ингаляционных методик, например используя медленный ингаляционный поток (например 30 л/мин), задерживая дыхание, изменяя время срабатывания, но не ограничиваясь ими.

Термин "стабилизированный состав" относится к составу с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью.

Термин "физическая стабильность" белкового состава, используемый в данном документе, подразумевает склонность белка к формированию биологически неактивных и/или нерастворимых агрегатов белка в результате воздействия на белок термомеханических нагрузок и/или в результате взаимодействия с дестабилизирующими внутренними или внешними поверхностями, например гидрофобными поверхностями. Физическую стабильность водных составов белка оценивают путем визуального осмотра и/или измерения мутности после экспонирования состава в соответствующем контейнере (например в картридже или флаконе) в условиях механической/физической нагрузки (например, взбалтывания) при различных температурах в течение различных периодов времени. Визуальный осмотр составов выполняют в резком фокусированном свете на темном фоне. Мутность состава характеризуется визуальной оценкой степени мутности по классификации, например по шкале от 0 до 3 (состав, показывающий отсутствие мутности, соответствует визуальной оценке 0, а состав, показывающий визуальную мутность в дневном свете, соответствует визуальной оценке 3). Состав классифицируют как физически нестабильный в связи с белковой агрегацией, если он показывает визуальную мутность в дневном свете. Кроме того, мутность состава может быть оценена простыми способами измерения мутности, хорошо известными специалистам. Физическая стабильность водных белковых составов также может быть оценена с помощью спектроскопического агента или зонда конформационного состояния белка. Зондом предпочтительно является небольшая молекула, которая предпочтительно связывается с ненативным конформером белка. Одним примером небольшого молекулярного спектроскопического зонда белковой структуры является тиофлавин Т. Тиофлавин Т представляет собой флюоресцентный краситель, который широко используется для выявления амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл и, возможно, также и других белковых конфигураций тиофлавин Т дает новый максимум возбуждения при примерно 450 нм и усиливает эмиссию при примерно 482 нм, когда связывается с белковыми фибриллами. Несвязанный тиофлавин Т в основном не флюоресцирует при этих длинах волн.

Другие небольшие молекулы могут быть использованы в качестве зондов для выявления изменений в нативной структуре белка по сравнению с ненативными формами. Например, зонды "гидрофобные патчи" избирательно связываются для выявления гидрофобных участков белка. Гидрофобные участки обычно скрыты в третичной структуре белка в его нативном состоянии, но становятся открытыми для воздействия, когда белок начинает разворачиваться или денатурировать. Примерами таких малых молекулярных спектроскопических зондов являются ароматические гидрофобные красители, такие как антрацин, акридин, фенантролин и т.п. Другие спектроскопические зонды представляют собой аминокислотные металлокомплексы, например кобальтовые металлокомплексы гидрофобных аминокислот, таких как фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин и т.п.

Термин "химическая стабильность" белкового состава, используемый в данном документе, относится к химическим ковалентным изменениям в структуре белка, ведущим к формированию продуктов химической деградации с потенциальной потерей биологической активности и/или потенциальным увеличением иммуногенных свойств по сравнению с нативной структурой белка. В зависимости от типа и природы нативного белка и среды, в которой он находится, могут формироваться различные продукты химической деградации. Наиболее вероятно, что химической деградации полностью избежать невозможно, и во время хранения и использования белкового состава часто наблюдается увеличение количества продуктов химической деградации, что хорошо известно специалистам в данной области. Большинство белков подвержено дезамидированию, процессу, в котором амидная группа боковой цепи в остатках глутамина или аспарагина гидролизуется с формированием свободной карбоновой кислоты. Другие пути деградации включают формирование высокомолекулярных продуктов трансформации, в которых две или более белковые молекулы ковалентно связаны друг с другом путем трансамидирования и/или дисульфидного взаимодействия, что ведет к формированию ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов деградации (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Окисление (например, остатков метионина) может быть упомянуто в качестве еще одного варианта химической деградации. Химическая стабильность белкового состава может быть оценена путем измерения количества продуктов химической деградации в различные временные точки после воздействия различных условий окружающей среды (образование продуктов деградации часто может быть ускорено, например, повышением температуры). Количество каждого отдельного продукта деградации часто определяют путем разделения продуктов деградации в зависимости от размера молекулы и/или заряда с использованием различных методик хроматографии (например SEC-HPLC и/или RP-HPLC).

Таким образом, как указано выше, "стабилизированный состав" относится к составу с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью. Как правило, состав должен быть стабильным в течение времени использования и хранения (при соответствии с рекомендуемыми условиями использования и хранения) до истечения срока действия.

В одном воплощении изобретения фармацевтический состав, содержащий соединение аналога инсулина, является стабильным при применении более 6 недель и при хранении более 3 лет.

В другом воплощении изобретения фармацевтический состав, содержащий соединение аналога инсулина, является стабильным при применении более 4 недель и при хранении более 3 лет.

В другом воплощении изобретения фармацевтический состав, содержащий соединение аналога инсулина, является стабильным при применении более 4 недель и при хранении более 2 лет.

В еще одном воплощении изобретения фармацевтический состав, содержащий соединение аналога инсулина, является стабильным при применении более 2 недель и при хранении более 2 лет.

Водные суспензии могут содержать активные соединения в смеси с эксципиентами подходящими для изготовления водных суспензий.

Масляные суспензии можно получить путем суспендирования активного ингредиента в растительном масле, например арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для получения приемлемого орального препарата могут быть добавлены подслащивающие агенты, такие как те, которые изложены выше, и ароматизирующие агенты. Эти составы могут быть сохранены путем добавления антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота.

Дисперсные порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии путем добавления воды, образуют активное соединение при смешении с диспергирующим или смачивающим агентом, суспендирующим агентом и одним или более консервантами. Примерами подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов являются те, которые уже упоминались выше. Также могут присутствовать дополнительные эксципиенты, например подслащивающие, ароматизирующие и окрашивающие агенты.

Фармацевтические составы, содержащие соединение для применения в соответствии с данным изобретением, могут также находится в форме масляно-водных эмульсий. Масляной фазой может быть или растительное масло, например оливковое или арахисовое, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смесь. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть смолы природного происхождения, например аравийская камедь и трагакантовая камедь, фосфатиды природного происхождения, например соевых бобов, лецитин, а также сложные эфиры или части сложных эфиров, полученные из жирных кислот и гекситол-ангидридов, например сорбитан моноолеат, и продукты конденсации указанных частей сложных эфиров с оксидом этилена, например полиоксиэтиленсорбитан моноолеат. Эмульсии также могут содержать подслащивающие и ароматизирующие агенты.

Сиропы и эликсиры могут содержать подслащивающие агенты, например глицерин, пропиленгликоль, сорбитол или сахарозу. Такие составы также могут содержать смягчающие вещества, консерванты и ароматизирующие и окрашивающие агенты.

В другом воплощении изобретения состав также содержит вещество, увеличивающее проницаемость. Желчные соли и жирные кислоты наиболее часто употребляются для увеличения оральной проницаемости билипидных мембран эпителиальных клеток, выстилающих ЖКТ. Как правило, вещества, увеличивающие проницаемость, увеличивают параклеточный и трансклеточный транспорт макромолекул путем обратимого изменения целостности мембраны. Желчные соли выбирают из группы, состоящей из холата, дезоксихолата, таурохолата, гликохолата, тауродезоксихолата, урсадезоксихолата, тауроурсодезоксихолата и хенодезоксихолата. Жирные кислоты выбирают из группы коротко-, средне- и длинноцепочечных жирных кислот, таких как каприловая кислота, капроновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и т.д. Другие вещества, увеличивающие проницаемость, могут быть поверхностно-активными веществами, такими как моноглицериды, сложные эфиры полиоксиэтилена, поверхностно-активные вещества из сорбитана (неионные) и сульфаты (анионные).

В другом воплощении изобретения состав также содержит мукоадгезивный полимер. При использовании такого мукоадгезивного полимера может быть достигнут близкий контакт системы доставки лекарства со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта. Близкий контакт дозирующей формы с мембраной представляется преимуществом, так как можно избежать ферментативной деградации терапевтически активного полипептида на пути между системой доставки и абсорбирующей мембраной. Кроме того, может быть предусмотрен шаг градиента концентрации на абсорбирующей мембране, который является движущей силой для пассивного поглощения лекарства.

В другом воплощении изобретения для того, чтобы также обойти ферментный барьер и обеспечить доставку терапевтически активного полипептида, состав также содержит ингибитор протеолитического(их) фермента(ов), такой как ингибитор аминопептидазы, амастатин, бестатин, боролейцин и пуромицин. Примерами ингибиторов протеазы являются гликолат натрия, камостат мезилат, бацитрацин, соевый ингибитор трипсина и апротинин.

Захват и инкапсуляция является методикой, используемой в системах доставки лекарств для терапевтически активных полипептидов для оптимизации качеств доставки, включая защиту от ферментативной деградации. Захват или инкапсуляция может быть в форме полимерных систем доставки лекарств, таких как гидрогели и нанокапсулы/микросферы, и липидных систем доставки лекарств, таких как липосомы и микроэмульсии.

Составы данного изобретения могут быть введены в нескольких дозированных формах, например в виде растворов, суспензий, микро- и наносуспензий, эмульсий, микроэмульсий, множественных эмульсий, пен, бальзамов, паст, мазей, таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, шипучих таблеток, подъязычных таблеток, буккальных таблеток, капсул, например твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, порошка, гранул, растворов, трансформирующихся in situ, например загустевающих in situ, фиксирующихся in situ, осаждающихся in situ, кристаллизующихся in situ, форм, плавающих в желудке, таких как плавающая суспензия, плавающая таблетка и т.п.

В другом воплощении данное изобретение относится к аналогу инсулина в соответствии с изобретением для применения его в качестве медикамента.

В одном воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением применяют для получения медикамента для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, гипертонии, синдрома X, дислипидемии, когнитивных расстройств, атеросклероза, инфаркта миокарда, инсульта, ишемической болезни сердца и других сердечно-сосудистых заболеваний, синдрома воспаленного кишечника, диспепсии и язв желудка.

В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением применяют в качестве медикамента для задержки или предупреждения прогрессирования заболевания диабета 2 типа.

В другом воплощении аналог инсулина в соответствии с изобретением применяют в качестве медикамента для уменьшения потребления пищи, уменьшения β-клеточного апоптоза, увеличения β-клеточной функции и β-клеточной массы и/или для восстановления чувствительности β-клеток к глюкозе.

В одном воплощении изобретения предложено производное в соответствии с изобретением, которое применяют в качестве медикамента для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, гипертонии, синдрома X, дислипидемии, когнитивных расстройств, атеросклероза, инфаркта миокарда, инсульта, ишемической болезни сердца и других сердечно-сосудистых заболеваний, синдрома воспаленного кишечника, диспепсии и язв желудка, или для задержки или предупреждения прогрессирования заболевания диабета 2 типа, или для уменьшения потребления пищи, уменьшения β-клеточного апоптоза, увеличения β-клеточной функции и β-клеточной массы и/или для восстановления чувствительности β-клеток к глюкозе.

В другом воплощении изобретения предложен способ лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, гипертонии, синдрома X, дислипидемии, когнитивных расстройств, атеросклероза, инфаркта миокарда, инсульта, ишемической болезни сердца и других сердечно-сосудистых заболеваний, синдрома воспаленного кишечника, диспепсии и язв желудка, или для задержки или предупреждения прогрессирования заболевания диабета 2 типа, или для уменьшения потребления пищи, уменьшения β-клеточного апоптоза, увеличения β-клеточной функции и β-клеточной массы и/или для восстановления чувствительности β-клеток к глюкозе, содержащий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту аналога инсулина в соответствии с изобретением в количестве, эффективном для такого лечения.

Лечение аналогом инсулина в соответствии с данным изобретением можно также комбинировать со вторым или более фармакологически активными веществами, выбранными, например, среди антидиабетических агентов, агентов против ожирения, агентов, регулирующих аппетит, антигипертензивных агентов, агентов для лечения и/или профилактики осложнений, возникающих в результате или связанных с диабетом, и агентов для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, возникающих в результате или связанных с ожирением. Примерами этих фармакологически активных субстанций являются: ГПП-1 (глюкагон-подобный пептид-1; GLP-1) и производные и аналоги ГПП-1, ГПП-2 (глюкагон-подобный пептид-2; GLP-2) и производные и аналоги ГПП-2, эксендин-4 и производные и аналоги эксендина-4, амилин и производные и аналоги амилина, производные сульфанилмочевины, бигуанидины, меглитиниды, ингибиторы глюкозидазы, антагонисты глюкагона, ингибиторы дипептидилпептидазы-IV (DPP-IV), ингибиторы печеночных ферментов, участвующих в стимуляции глюконеогенеза и/или гликогенолиза, модуляторы поглощения глюкозы, соединения, модифицирующие липидный метаболизм, такие как антигиперлипидемические агенты как ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), соединения, снижающие потребление пищи, агонисты RXR и агенты, действующие на АТФ-зависимый калиевый канал β-клеток; холестирамин, колестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол, декстротироксин, натеглинид, репаглинид; β-блокаторы, такие как алпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропанолол и метопролол, ингибиторы АПФ (ангиотензин-превращающего фермента, АСЕ), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, хинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин, фелодипин, никардипин, израдипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, и α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин; агонисты CART (кокаин/амфетамин-регулируемого транскрипта), антагонисты NPY (нейропептида Y), агонисты МС4 (меланокортина-4), антагонистов орексина, агонисты ФНО (фактора некроза опухолей), агонисты CRF (кортикотропного релизинг-фактора), антагонисты CRF ВР (белка, связывающего кортикотропный релизинг-фактор), агонисты урокортина, β3-агонисты, агонисты MSH (меланоцит-стимулирующего гормона), антагонисты МСН (меланин-концентрирующего гормона), агонисты ССК (холецистокинина), ингибиторы обратного захвата серотонина, ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанные соединения серотонина и норадреналина, агонисты 5НТ (серотонина), агонисты бомбезина, антагонисты галанина, гормон роста, соединения, высвобождающие гормон роста, агонисты TRH (тиреотропин-релизинг гормона), модуляторы UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонисты лептина, агонисты дофамина (бромокриптин, допрексин), ингибиторы липазы/амилазы, модуляторы RXR (ретиноидного Х рецептора), агонисты TR-β; антагонисты Н3-гистаминового рецептора, гастрин и аналоги и производные гастрина.

Необходимо понимать, что любая подходящая комбинация производных в соответствии с изобретением с одним или более из вышеупомянутых соединений и, возможно, одним или более другими фармакологически активными веществами считается входящей в сферу применения данного изобретения.

Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в данном документе, настоящим включены путем ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была отдельно и конкретно указана, и должны быть включены путем ссылки и изложены здесь полностью (до максимальной степени, разрешенной законом).

Все заголовки и подзаголовки используются здесь только для удобства и не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение ни в каком случае.

Любые использованные или все примеры или обороты, указывающие на наличие примера (например, "такие как"), содержащиеся в данном документе, предназначены только для лучшего освещения изобретения и не ставят ограничений в сфере применения изобретения, если не утверждается иное. Никакие обороты в описании не должны толковаться как указывающие на то, что какой-либо элемент, не включенный в формулу изобретения, является необходимым для осуществления изобретения.

Цитирование и использование здесь патентных документов делается только для удобства и не отражает какой-либо связи с обоснованностью, патентоспособностью и/или законной силой этих патентных документов.

Это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты объектов изобретения, включенных в формулу изобретения в соответствии с разрешением действующего законодательства.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Сравнение протеолитической устойчивости (полужизни) В25Н, А14Е, А14Е_В25Н и человеческого инсулина к пепсину, химотрипсину и карбоксипептидазе А.

Протеолитическую устойчивость человеческого инсулина и аналогов инсулина (0,06 мМ, 10 мкл) к химотрипсину или пепсину (0,34-3,4 мкг) измеряли после инкубации в 100 мМ NH₄HCO₃, pH 8,1 или в 10 мМ HCl, рН 2,0 соответственно при 25°С с конечным объемом 100 мкл. Через различные промежутки времени (0, 5, 15, 30 и 60 мин) образцы гасили равным объемом 0,5% TFA (трифторуксусной кислоты) или 0,1 М TrisHCI, pH 8.0 (конечный рН 7,7) и переносили в 5°С. Человеческий инсулин и аналоги инсулина немедленно анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ на 214 нм и определяли площадь под пиком, соответствующую интактному белку.

Устойчивость человеческого инсулина и аналогов инсулина (0,06 мМ, 13,9 мкг) к карбоксипептидазе А (6,8 мкл рабочего раствора, 20 мг/мл, 53 единицы/мг, Sigma С-9268) измеряли после инкубации в 5 мМ NaP, 140 мМ NaCl, 70 ppm Tween20, pH 7,4 при 37°С в конечном объеме 400 мкл. Через различные промежутки времени (5, 15, 30, 60 мин) образцы гасили равным объемом 0,2% TFA и переносили в 5°С. Контрольные образцы (0 мин) готовили без добавления ферментов. Человеческий инсулин и аналоги немедленно анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ на 214 нм и определяли площадь под пиком, соответствующую интактному белку. Соблюдалась одинаковая продолжительность пребывания для человеческого инсулина и desВ30. Из кривых было получено время полужизни (Т_1/2) и рассчитана кратность его увеличения/уменьшения по сравнению с человеческим инсулином (относительная стабильность). Аналогично время полужизни было определено для человеческого инсулина, T_1/2=6,9 мин, и для человеческого инсулина desB30, T_1/2=6, 7.

Таблица 1
Сайт(ы) мутации в человеческом инсулине	Т_1/2 [мин] (Отн. стабильность) Пепсин	T_1/2 [мин] (Отн. стабильность) Химотрипсин	T_1/2 [мин] (Отн. стабильность) Карбоксипептидаза
В25Н	17,8 (16,2)	25,7 (5,1)	25,7 (2,1)
Нет мутаций	1,1 (1,0)	5,0 (1,0)	6,9 (1,0)
А14Е, DESB30	3,7 (3,4)	33,2 (6,6)	15,7 (2,3)
Нет мутаций	1,1 (1,0)	5,0 (1,0)	6,9 (1,0)
А14Е, В25Н, DESB30	42,4 (38,5)	62,4 (12,5)	61,9 (9,0)
Нет мутаций	1,1 (1,0)	5,0 (1,0)	6,9 (1,0)

ПРИМЕР 2

Определение сайтов протеазного расщепления в инсулине с помощью MS-анализа и ферментной специфичности

Определение сайтов протеазного расщепления проводили во время курса анализа ограниченного протеолиза инсулина и аналогов инсулина различными ферментами (пепсином, химотрипсином, карбоксипептидазой А) с помощью LC-MS (жидкостного хроматомасс-спектрометра). Сгенерированные пептидные фрагменты идентифицировали с помощью MS или MS/MS и подсчитывали при 214 нм для того, чтобы выявить минорные и мажорные сайты расщепления (горячие точки). В человеческом инсулине были выявлены следующие горячие точки для пепсина (В24-25, В25-26, В26-27) и химотрипсина (В16-17, В24-25, В25-26, В26-27, А14-15 и А19-20). Интересно, что горячие точки совпадают с инсулин-разрушающим ферментом (IDE), см. ниже, и катепсином D (Hanne Refsgaard, Novo NordiskA/S, личное сообщение).

Сайты расщепления в последовательности инсулина были также предсказаны на основании ферментной специфичности химотрипсина, трипсина и инсулин-разрушающего фермента (IDE), как показано ниже в примере 3. В нескольких руководствах по биохимии описаны прогнозируемые сайты расщепления для трипсина (основные остатки, С-концевые Lys, Arg), эластазы (алифатические остатки, С-концевые Ala, Val, Gly, Ser), карбоксипептидазы А (широкая специфичность, но не Arg, Lys и Pro), пепсина А (ароматические остатки, N-концевые Trp, Tyr, Phe и Leu и различные другие остатки) и химотрипсина (ароматические остатки, С-концевые Тrp, Tyr, Phe и Leu, но не Ххх-Pro). Недавно были опубликованы сайты расщепления в инсулине для IDE: B9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25, В25-26, А13-14, А14-15 (Duckworth et al., 2006) и показаны следующие замены IDE, ингибирующие деградацию инсулина: B10D и B4E_B16Q_B17F (Bennett et al., 2003).

ПРИМЕР 3

Повторные циклы идентификации горячих точек в человеческом инсулине А14Е, В25Н, desB30

Мажорные горячие точки для расщепления химотрипсином (В16-17, В24-25, А19-20) и минорные сайты расщепления (В 1-2, В6-7) были выявлены в человеческом инсулине А14Е, В25Н, desB30 в соответствии со способом, описанным в примере 2. Аналоги инсулина были разработаны на основании выявленных сайтов расщепления и предсказанных сайтов расщепления из данных ферментной специфичности. Аминокислотные остатки для замены были выбраны для того, чтобы удалить сайты расщепления и увеличить растворимость.

Химотрипсин, аналог, конструирование на основании горячих точек, выявленных с помощью LC-MS, из обзора человеческого инсулина А14Е, В25Н,desB30:

А14Х1 В25Н desB30X12 HI В1Х2 В6ХЗ В16Х6 В24Х8 А19Х11

X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P

X2=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

X3=E/D/H/Q/N/S/Т/М/Р/природная аминокислота

6=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х8=E/D/H/Q/N/S/Т/М/Р/природная аминокислота

Х11=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х12=desВ30/природная аминокислота

Примечание: замена В24 и/или А19 в человеческом инсулине, вероятно, значительно сокращает рецепторную аффинность.

А14Х1 В25Р desB30X12 HI В1Х2 В6ХЗ В16Х6 В24Х8 А19Х11

X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P

Х2=Е/О/Н/Q/N/S/Т/М/Р/природная аминокислота

Х3=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х6=E/D/H/Q/N/S/Т/М/Р/природная аминокислота

Х8=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х11=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х12=desB30/пpиpoднaя аминокислота

Химотрипсин, конструирование на основании выявленных и прогнозируемых горячих точек:

А14Х1 В25Н desB30X12 HI В1Х2 В6Х3 В11Х4 В15Х5 В16Х6 В17Х7 В24Х8 А13Х9 А16Х10 А19Х11

X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P

Х2=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х3=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х4=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х5=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х6=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х7=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

8=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х9=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х10=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х11=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х12=desВ30/природная аминокислота

Примечание: замена В11, В15, В24, А13, А16 и/или А19 в человеческом инсулине, вероятно, значительно сокращает рецепторную аффинность.

Химотрипсин+трипсин, конструирование на основании выявленных и прогнозируемых горячих точек:

А14Х1 В25Н desB30X12 HI В1Х2 В6ХЗ В11Х4 В15Х5 В16Х6 В17Х7 В24Х8 А13Х9 А16Х10А19Х11 В22Х13

X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P

Х2=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х3=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х4=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х5=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х6=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х7=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

8=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х9=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х10=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х11=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х12=desВ30/природная аминокислота

Х13=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Химотрипсин+трипсин+инсулин-разрушающий фермент (IDE), конструирование на основании выявленных и прогнозируемых горячих точек:

А14Х1 В25Н desB30X12 HI В1Х2 В6ХЗ В11Х4 В15Х5 В16Х6 В17Х7 В24Х8 А13Х9 А16Х10 А19Х11 В22Х13 В4Х14 В9Х15 В10Х16 В13Х17 В14Х18

X1=E/D/H/Q/N/S/T/M/P

Х2=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х3=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х4=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х5=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х6=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х7=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

8=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х9=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х10=E/D/H/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х11=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х12=desВ30/природная аминокислота

Х13=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х14=Е/D/Н/Q/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х15=Е/D/Н/Q/N/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х16=Е/D/Н/Q/S/T/М/Р/природная аминокислота

Х17=E/D/H/Q/N/S/T/M/P/пpиpoднaя аминокислота

Х18=Е/D/Н/Q/S/T/М/Р/природная аминокислота

ПРИМЕР 4

Протеолитическая устойчивость (время полужизни) аналогов инсулина к химотрипсину

Аналоги инсулина были протестированы в анализах стабильности, и у аналогов, демонстрирующих увеличенную устойчивость к протеолитическому расщеплению, было выявлено увеличенное время полужизни в соответствии со способами, описанными в примере 1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности дальнейшего улучшения аналогов инсулина в плане увеличения биодоступности благодаря повышению устойчивости к протеолитической деградации и повышению растворимости.

Была протестирована устойчивость к химотрипсину следующих аналогов инсулина относительно человеческого инсулина:

Таблица 2
Аналоги инсулина	Расщепление химотрипсином [увеличение стабильности по отношению к человеческому инсулину]
А14Е, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30 человеческий инсулин	43,8
А8Н, А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	38,9
ЕЕАЕАЕАРК-В(1 -29)-В25Н-ААК-А(1 -21)-А14Е человеческий инсулин	33,2
А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	22,8
А14Е, В25Н, B28D, desB30 человеческий инсулин	17,4
А14Е, В25Н, B26D, desB30 человеческий инсулин	16,6
А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	14,1
А8Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	13,3
A8H,A14E,B10E,B25H,desB30 человеческий инсулин	12,6
А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	12,5
А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	11,9
А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	10,2
А8Н, А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	8,3
A14D, В25Н, desB30 человеческий инсулин	7,9
А14Е, В27Е, desB30 человеческий инсулин	7,7
А14Е, B28D, desB30 человеческий инсулин	7,5
А8Н, B10D, В25Н человеческий инсулин	7,4
А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин	5,5
А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	4,8
А14Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин	4,5
А14Е, В25Н человеческий инсулин	4,1
А14Е, В1Е, В27Е, desB30 человеческий инсулин	3,9
А8Н, А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	2,3
А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин	2,1
человеческий инсулин (контроль)	1

ПРИМЕР 5

Протеолитическая устойчивость аналогов инсулина к экстрактам из кишечника крыс (просвета двенадцатиперстной кишки)

Аналоги инсулина были протестированы на их устойчивость к протеолитической деградации кишечными экстрактами. Экстракты были приготовлены путем промывания кишечного содержимого тестируемых животных. Аналоги инсулина инкубировали с разведенными экстрактами при 37°С и рН=7,4 и через 20 часов инкубации концентрацию интактного соединения определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Сопоставили относительные количества интактных аналогов инсулина и интактного человеческого инсулина. Была выявлена примерно 5-10-кратная разница в стабильности между человеческим инсулином и аналогом А14Е В25Н desB30 человеческого инсулина.

Пример 6

В исследованиях с применением эугликемического глюкозного клэмп-теста на свиньях показано, что низкоаффинные аналоги инсулина (приблизительно с 20%-ной рецепторной аффинностью) оказывают суммарный эффект на утилизациию глюкозы, эквивалентный эффекту высокоаффинных аналогов, подтверждая тот факт, что биологическая активность инсулина одинакова как у низкоаффинных, так и высокоаффинных аналогов. Однако низкоаффинные аналоги оказывают свое действие в течение более длительного периода времени по сравнению с высокоаффинными аналогами (см., например, Ribel, U., et. al. Equivalent in vivo biological activity of insulin analogues and human insulin despite different in vitro potencies. Diabetes 39, 1033-1039 (1990), реферат прилагается).

На молекулярном уровне это можно объяснить одним и тем же количеством молекул глюкозы, переносимых в клетку каждой молекулой инсулина, связанной с инсулиновым рецептором, например тем, что активация рецептора и последующая передача сигнала идентичны как у высокоаффинных, так и низкоаффинных аналогов. В принципе это справедливо независимо от того, насколько низка аффинность в отношении инсулинового рецептора, и ограничения продиктованы только неспецифическим клиренсом (то есть, всеми процессами, приводящими к удалению инсулина из кровотока, за исключением опосредованного рецептором клиренса.

Получение стабильных к протеолизу низкоаффинных аналогов инсулина и тем самым минимизация неспецифического клиренса после ферментативного расщепления дают преимущество. Результаты авторов изобретения показывают снижение содержания глюкозы в крови в крысиной модели после перорального введения аналогов инсулина с аффинностью к инсулиновому рецептору, сниженной до 0,5%. Результаты для трех стабилизированных к действию протеаз аналогов инсулина по изобретению, обладающих наименьшим связыванием in vitro с инсулиновым рецептором, описаны в Примере 9 и показаны на Фиг.A.

Кроме этого, в целях иллюстрации авторы изобретения приводят результаты по снижению содержания глюкозы в крови (Пример 10, Фиг.B) для аналога инсулина (одноцепочечного аналога инсулина, в котором B1-B29 соединены с A1-A21 посредством С-пептида из трех аминокислот, Ala-Ala-Lys, не стабилизированного к действию протеаз), обладающего аффинностью связывания с инсулиновым рецептором ~0,1% по сравнению с человеческим инсулином (HI) (Kjeldsen, T.B., et. al. Journal of Biological Chemistry 277, 18245-18248, 2002, прилагается), дополнительно иллюстрирующие, что аналоги инсулина с относительно низкой аффинностью к инсулиновому рецептору (хотя по-прежнему в диапазоне ~нМ) являются функциональными in vivo.

Пример 7

Эффект снижения содержания глюкозы в крови для трех стабилизированных к действию протеаз аналогов инсулина после перорального введения через желудочный зонд (среднее значение±SEM (стандартная ошибка средней величины))

Отбирали кровь из хвоста не подвергнутых анестезии, голодавших в течение ночи самцов крыс Sprague Dawley в моменты времени -30, 0, 30, 60, 90, 120, 180 и 240 минут. Сразу же после отбора образца крови в момент времени "0" вводили перорально, используя желудочный зонд, разбавитель (отрицательный контроль) или аналог инсулина Х (9600 нмоль/кг массы тела) (10 мл/кг массы тела, n=5 на одну группу). Концентрацию глюкозы в крови определяют, используя стандартные методики (автоматический анализатор глюкозы BIOSEN).

Результаты для человеческого инсулина A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 2,8% от аффинности человеческого инсулина), для человеческого инсулина A14E, B16E, B25H, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 1,6% от аффинности человеческого инсулина) и для человеческого инсулина A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 (аффинность к инсулиновому рецептору 0,5% от аффинности человеческого инсулина) показаны на Фиг.3.

Пример 8

Эффект снижения содержания глюкозы в крови для аналога инсулина с низкой аффинностью к рецептору (~0,1% от аффинности человеческого инсулина) после в/в (внутривенного) введения (среднее значение ±SEM)

Накормленных самцов крыс Wistar (250-300 г) подвергали анестезии, используя Hypnorm-Dormicum (фентанилцитрат (0,081 мг/мл) и мидазолам (1,25 мг/мл)):2 мл/кг в качестве примирующей дозы (время = -35 мин) и дополнительно 1 мл/кг в момент времени = -5 мин перед введением тестируемого соединения, а затем 1 мл/кг каждые 45 минут (4 раза).

Крыс распределяли на 4 группы, по 4 крысы в каждой группе, предназначенные для введения человеческого инсулина (5 нмоль/кг) или аналога инсулина (0, 50, 200 нмоль/кг). Животным посредством внутривенной инъекции в хвостовую вену (1 мл/кг) вводили либо разбавитель (5 мМ фосфатный буфер, 140 мМ NaCl, полисорбат 20 (70 мкг/мл), pH 7,4), либо образцы инсулина. Образцы крови для определения концентрации глюкозы в цельной крови отбирали в гепаринизированные (10 мкл) стеклянные пробирки посредством пункции капиллярных сосудов на кончике хвоста для моментов времени до введения и после введения дозы. Концентрацию глюкозы в крови измеряли после разведения в буфере для анализа (500 мкл), применяя метод с иммобилизованной глюкозооксидазой с использованием автоматического анализатора Biosen (EKF Diagnostic, Germany).

Результаты показаны на Фиг.4.

ПРИМЕР 9 (продолжение ПРИМЕРА 4)

Таблица 3
Устойчивость к химотрипсину.
Замены в последовательности аналогов инсулина по отношению к человеческому инсулину	Расщепление химотрипсином [увеличение стабильности по отношению к человеческому инсулину]
A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30	22,1
A14E, B25H, B28G, desB30	21,5
A14E, В25Н, B27G, B28G, desB30	16,5
A14E, B25H, desB27, desB30	14,9
A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30	11,5
A14E, A15E, B25H, desB30	10,5
A14E, A18L, B25H, desB30	9,8
A14E, B25H, B26E, B27E, desB30	8,4
A8H, A14E, A22K, В25Н, B29R, desB30	7,6
A14E, B25H, B29R, desB30	6,4
A14E, A21G, B3Q, B25H, desB30	6,4
A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30	5,7
A14E, B10E, B25H, desB30	4,4
A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30	4,2
A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30	3,6
A14E, B25H, B26G, B27G, B28K, desB30	3,3
A14E, B16H, B25H, desB30	1,3
A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30	1,2
A14E, B10P, B25H, desB30	1,0
A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30	0,9
A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30	0,8

ПРИМЕР 10

Афинность аналогов инсулина по отношению к инсулиновому рецептору

Афинность аналогов инсулина по изобретению к человеческому инсулиновому рецептору была определена с помощью сцинтилляционного анализа сближения (SPA) анализа детектирования антител пластиной микротитратора. Поливинил-толуоловые антитела - связывающие бусины для SPA, анти-мышиные реагенты (Amersham Biosciences, Cat № PRNQ0017) смешивались с 25 мл связывающего буфера (100 мМ HEPES pH 7.8; 100 мМ хлорида натрия, 10 мМ MgSO₄, 0.025% Tween-20). Смесь реагентов для одиночного луночного планшета Packard Optiplate (Packard №6005190) была дополнена 2,4 мкл разбавленного в соотношении 1:5000 чистого рекомбинантного человеческого инсулинового рецепора (либо с, либо без экзона 11), количеством основного раствора A14Tyr[¹²⁵I]-человеческого инсулина в соотношении 5000 промилле на 100 мкл смеси реагентов, 12 мкл разбавленного в соотношении 1:1000 антитела F12, 3 мл SPA-бусин и связывающим буфером до полного объема в 12 мл. Общий объем 100 мкл смеси реагентов затем добавляли в каждую лунку Packard Optiplate и серия разбавлений производным инсулина проводилась на луночном планшете из соответствующего образца. Образцы затем инкубировались в течение 16 часов при аккуратном перемешивании. Фазы затем разделялись центрифугированием в течение 1 минуты, и слои регистрировались в Topcounter. Результаты связывания аппроксимировались с использованием алгоритма нелинейной регрессии в GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Афинность выражалось относительно (в процентах %) афинности человеческого инсулина.

Таблица 4
Афинность инсулинового рецептора
Замены в последовательности аналогов инсулина по отношению к человеческому инсулину		Относительная афинность связывания с инсулиновым рецептором (%)
A14E, B10E B25H, B26G, B27G, B28G, desB30		144
A8H, A14E, B10E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30		136
A8H, A14E, B10E, B25H, desB30		113
A14E, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30		88
A14E, B27R, B28D, desB30		82
A8H, A14E, B22K, B25H, B29R, desB30		81
A14E, B27K, desB28, desB29, desB30		79
A14E, B28D, desB30		78
A8H, A14E, B25H, desB30			77
A14E, B25H, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30			70
A8H, A14E, A22K, B25H, B29R, desB30			67
A14E, B1E, B27E, desB30			64
A14E, A18L, B25H, desB30			63
A8H, A14E, B1E, B25H, desB30			61
A14E, B22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30			61
A14E, A22K, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30			59
A8H, A14E, B25H, B27E, desB30			56
A14H, B10E, B25H, desB30			53
A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30			50
A14E, B27E, desB30			50
A14E, B10E, B25H, desB30			50
A14E, B26P, B27K, desB28, desB29, desB30			48
A14E, B-3G, B-2P, B-1P, B25H, desB30			47
A14E, A21G, B25H, desB27, desB30			46
A14E, B1E, B25H, desB30			30
A14E, A21G, desB1, desB2, desB3, desB4, B25H, desB30			28
A8H, A14H, B16H, B25H, desB30			27
A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 (C-term NH2)			26
A14E, B25H, B29R, desB30			26
A14E, A18Q, A21G, B3Q, B25H, B27E, desB30			25
A14H, B25H, desB30			25
A14E, B25H, desB30			25
A14E, A22K, B25H, B27E, B29R, desB30			25
A14E, A22K, B25H, B29R, desB30			25
A8H, A14E, B16H, B25H, desB30			24
A14E, A15E, B25H, desB30			23
A14E, B25H, B26G, B27E, B28G, desB30			23
A14E, B25H, B26D, desB30			22
A14E, B25H, B28D, desB30			21
A14E, A22K, B25H, desB30			21
A14E, B25H, B27R, B28D, desB30			21
A14E, B1E, B25H, B27E, desB30			20
A14E, B25H			20
A14E, B25H, desB27, desB30			19
A12E, A14E, B25H, desB30			19
A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30			19
A14E, B25H, B28G, desB30			18
A14E, A21G, B3Q, B25H, desB30			18
A14E, B25H, B26E, B27E, desB30			17
A14E, B25H, B31L, B32E			17
A14E, B25H, B27R, desB30			17
A14E, B25H, B27G, B28G, desB30			16
A14E, B25H, B27E, desB30			15
A8H, A14E, B16E, B25H, desB30			13
A14E, B4E, B25H, desB30	13
A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30	12
A14E, B10P, B25H, desB30	12
A13E, A14E, B25H, desB30	10
A-2P, A-1P, A14E, B25H, desB30	10
A14E, A21G, B16H, B25H, desB27, desB30	9
A13H, A14E, B25H, desB30	9
A13N, A14E, B25H, desB30	8
A14E, A22K, B16H, B25H, B29R, desB30	8
A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, desB30	8
A14H, B16H, B25H, desB30	7
A-3G, A-2P, A-1P, A14E, B25H, desB30	5
A14E, B16H, B25H, desB30	5
A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30	3
A14E, B16E, B25H, desB30	2
A14E, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30	2
A14H, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30	2
A14E, A22K, B16E, B25H, B29R, desB30	1
A14E, B16E, B22K, B25H, B29R, desB30	1
A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30	0.5
A14E, B24G, B25H, desB30	0.2

ПРИМЕР 11

Деградация аналогов инсулина ферментами полости двенадцатиперстной кишки

Деградация аналогов инсулина исследовалась с помощью ферментов полости двенадцатиперстной кишки (выделялись путем фильтрации СПД (схемы последовательного детектирования) содержимого полости двенадцатиперстной кишки крысы). Анализ проводился роботом на 96-луночном планшете (2 мл) с 16 лунками, доступными для аналогов инсулина и эталонов. Аналоги инсулина, ~15 мкл, инкубировались с ферментами двенадцатиперстной кишки 100 мМ Hepes, pH=7.4 при 37°C, образцы брались после 1, 15, 30, 60, 120 и 240 минут и реакция гасилась добавлением ТФА (трифторацетилацетона). Неповрежденные аналоги инсулина в каждой точке определялись с помощью ОФ-ВЭЖХ. Время полудеградации определялось экспонициальным аппроксимированием данных и нормализировалось ко времени полудеградации, определенного для человеческого инсулина, в каждом из анализов. Количество ферментов, необходимое для расщепления, было таким, что время полудеградации эталонного инсулина было между 7 и 14 минутами. Результат представлен как время полудеградации аналога инсулина в двенадцатиперстной кишке крысы, поделенное на время полудеградации эталонного инсулина из того же самого эксперимента (относительная скорость деградации).

Таблица 5
Протеолитическая стабильность
Замены в последовательности аналогов инсулина по отношению к человеческому инсулину		Стабильность к деградации в двенадцатиперстной кишке, отнесенная к стабильности человеческого инсулина
А8Н, А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30		51,9
А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30		39,6
А14Е, В25Н, desB27, desB30		30,8
А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30		29,3
А14Е, В10Е, В25Н, desB30		27,5
А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30		24,8
А8Н, А14Е, В25Н, В27Е, desB30		24,4
А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30		22,7
А14Е, А22К, В25Н, В27Е, B29R, desB30		20,9
А14Е, A21G, В16Н, В25Н, desB27, desB30		17,9
А14Е, A18Q, A21G, B3Q, В25Н, В27Е, desB30		17,6
А14Е, А15Е, В25Н, desB30		17,6
А14Е, В25Н		17,6
А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30		16,5
А14Е, А22К, В25Н, В27Р, B28R, desB29, desB30		16,0
А14Е, В16Е, B22K, В25Н, B29R, desB30		15,8
А14Е, В25Н, В27Е, desB30		15,5
А8Н, А14Е, В10Е, В25Н, desB30		15,4
А14Е, B-3G, B-2P, B-1P, В25Н, desB30		15,4
А14Е, A18L, В25Н, desB30		15,4
А8Н, А14Е, В10Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30		14,9
А14Е, В16Е, В25Н, desB30		14,3
А14Е, В25Н, B28D, desB30		14,1
А8Н, А14Е, В16Е, В25Н, desB30		12,1
А14Е, В25Н, B26E, В27Е, desB30		11,6
A8H, А14Е, В16Н, В25Н, desB30		11,6
А14Е, В25Н, desB30		11,0
A-3G, A-2P, A-1P, А14Е, В25Н, desB30		11,0
А14Е, В25Н, B27G, B28G, desB30		11,0
А14Е, B4E, В25Н, desB30		10,3
А14Е, В16Н, В25Н, desB30		9,9
А14Е, В25Н, B29R, desB30		9,9
А8Н, А14Е, B22K, В25Н, B29R, desB30		9,9
А14Е, А22К, В25Н, desB30		9,6
А14Е, В25Н, B31L, B32E		9,4
A14H, В10Е, В25Н, desB30		9,1
А14Е, B25H, B26G, В27Е, B28G, desB30		8,3
А14Е, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30 (C-term NH2)	8,3
А14Е, A22K, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30	8,3
A13E, А14Е, В25Н, desB30	8,3
А14Е, B10E, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30	8,1
А14Е, A22K, В25Н, B29R, desB30	7,7
А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28K, desB29, desB30	7,7
A13H, А14Е, В25Н, desB30	7,7
А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30	7,2
A8H, А14Е, A22K, В25Н, B29R, desB30	7,2
А14Е, A22K, B16E, В25Н, B29R, desB30	7,2
A13N, А14Е, В25Н, desB30	6,6
А14Е, A22K, B16H, В25Н, B29R, desB30	6,6
A14D, В25Н, desB30	6,2
А14Е, В25Н, B28G, desB30	6,1
А14Е, A21G, B3Q, В25Н, desB30	6,1
А14Е, B1E, В25Н, desB30	5,7
А14Е, В25Н, B27R, desB30	5,5
А14Е, В25Н, B27R, B28D, desB30	5,3
А14Е, В25Н, B26D, desB30	5,1
A12E, А14Е, В25Н, desB30	5,0
A8H, А14Е, В25Н, desB30	4,7
А14Е, B22K, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30	4,4
А14Е, B26P, B27K, desB28, desB29, desB30	3,4
А14Е, A21G, desB1, desB2, desB3, desB4, В25Н, desB30	3,3
A14H, В25Н, desB30	3,3
А14Е, B27E, desB30	3,3
А14Е, B10P, В25Н, desB30	3,3
А14Е, B27K, desB28, desB29, desB30	3,3
A8H, A14H, B16H, В25Н, desB30	3,3
А14Е, B27K, desB30	2,8
A14H, B16H, В25Н, desB30	2,8
А14Е, B1E, B27E, desB30	2,4
А14Е, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30	2,2
А14Е, B24G, В25Н, desB30	2,2
А14Е, В25Н, B26T, B27R, B28D, desB30	2,0
А14Е, В25Н, B27K, desB28, desB29, desB30	1,1
А14Е, B27R, B28D, desB30	1,1
А14Е, B16H, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30	0,9
A14H, B16H, В25Н, desB27, desB28, desB29, desB30	0,9
A-2P, A-1P, А14Е, В25Н, desB30	0,4
А14Е, B28D, desB30	0,0

Claims

1. Аналог инсулина, который демонстрирует повышенную стабильность в отношении одного или более протеолитических ферментов по сравнению с родительским инсулином, в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты заменены гидрофильными аминокислотами по сравнению с родительским инсулином и где A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и B-цепь содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, при этом по меньшей мере одна мутация в А-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из A13-14, A14-15 и A19-20, и по меньшей мере одна мутация в В-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B25-26, и где аминокислота в положении B30 удалена.

2. Аналог инсулина по п.1, в котором A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и B-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, где по меньшей мере одна мутация в A-цепи находится в одном или более сайтов расщепления, выбранных из группы, состоящей из A13-14 и A14-15, и по меньшей мере одна мутация в B-цепи находится в одном или более сайтов расщепления, выбранных из группы, состоящей из B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25 и B25-26, и где аминокислота в положении B30 удалена.

3. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, где аминокислота в положении A14 является Glu, Asp или His, аминокислота в положении B25 является His, a аминокислота в положении B30 удалена.

4. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, где аминокислота в положении A14 является Glu.

5. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, который показывает повышенную стабильность по отношению к одному или более протеолитическому ферменту в сравнении с родительским инсулином.

6. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, который показывает повышенную стабильность по отношению к двум или более протеолитическим ферментам в сравнении с родительским инсулином.

7. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по сравнению с человеческим инсулином.

8. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого Т1/2 увеличен по сравнению с родительским инсулином.

9. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 2 раза по сравнению с родительским инсулином.

10. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 3 раза по сравнению с родительским инсулином.

11. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 4 раза по сравнению с родительским инсулином.

12. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 5 раз по сравнению с родительским инсулином.

13. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 10 раз по сравнению с родительским инсулином.

14. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов человеческого инсулина.

15. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов родительского инсулина.

16. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью человеческого инсулина в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов, выбранных из группы, состоящей из: пепсина, химотрипсина, инсулин-расщепляющего фермента, эластазы, карбоксипептидазы, катепсина D и других ферментов, присутствующих в экстрактах кишечника крысы, свиньи и человека.

17. Аналог инсулина по любому из пп.1-2, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью родительского инсулина в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов, выбранных из группы, состоящей из: пепсина, химотрипсина, инсулин-расщепляющего фермента, эластазы, карбоксипептидазы, катепсина D и других ферментов, присутствующих в экстрактах кишечника крысы, свиньи и человека.

18. Аналог инсулина по любому из пп.1-2 для применения в качестве фармацевтического средства в лечении или профилактике гипергликемии, сахарного диабета 2 типа или сахарного диабета 1 типа.

19. Аналог инсулина по любому из пп.1-2 для применения в качестве фармацевтического средства для задержки или предотвращения прогрессирования заболевания сахарного диабета 2 типа.

20. Аналог инсулина, который демонстрирует повышенную стабильность в отношении одного или более протеолитических ферментов по сравнению с родительским инсулином, содержащий аминокислотную последовательность A-цепи формулы 1:

и аминокислотную последовательность B-цепи формулы 2:

где
Хаа_А(-2) отсутствует или представляет собой Gly;
Xaa_A(-1) отсутствует или представляет собой Pro;
Xaa_A0 отсутствует или представляет собой Pro;
Xaa_A8 независимо выбирают среди Thr и His;
Xaa_A12 независимо выбирают среди Ser, Asp и Glu;
Xaa_A13 независимо выбирают среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_A14 независимо выбирают среди Тyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_A15 независимо выбирают среди Gln, Asp и Glu;
Xaa_A18 независимо выбирают среди Asn, Lys и Gln;
Xaa_A21 независимо выбирают среди Asn и Gln;
Xaa_A22 отсутствует или представляет собой Lys;
Xaa_B(-2) отсутствует или представляет собой Gly;
Xaa_B(-1) отсутствует или представляет собой Pro;
Xaa_B0 отсутствует или представляет собой Pro;
Xaa_B1 отсутствует или независимо выбирается среди Phe и Glu;
Xaa_B2 отсутствует или представляет собой Val;
Xaa_B3 отсутствует или независимо выбирается среди Asn и Gln;
Xaa_B4 независимо выбирают среди Gln и Glu;
Xaa_B10 независимо выбирают среди His, Asp, Pro и Glu;
Xaa_B16 независимо выбирают среди Тyr, Asp, Gln, His, Arg и Glu;
Xaa_B24 независимо выбирают среди Phe и His;
Xaa_B25 независимо выбирают среди Phe и His;
Xaa_B26 отсутствует или независимо выбирается среди Tyr, His, Thr, Gly и Asp;
Xaa_B27 отсутствует или независимо выбирается среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_B28 отсутствует или независимо выбирается среди Pro, His, Gly и Asp;
Xaa_B29 отсутствует или независимо выбирается среди Lys и Gln;
Xaa_B30 отсутствует или представляет собой Thr;
Xaa_B31 отсутствует или представляет собой Leu;
Xaa_B32 отсутствует или представляет собой Glu;
C-конец возможно может быть дериватизирован как амид;
где аминокислотная последовательность A-цепи и аминокислотная последовательность B-цепи связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в положении 7 A-цепи и цистеином в положении 7 B-цепи, а также между цистеином в положении 20 A-цепи и цистеином в положении 19 B-цепи и где цистеины в положении 6 и 11 A-цепи соединены дисульфидным мостиком;
где N-конец аминокислотной последовательности A-цепи возможно связан с C-концом аминокислотной последовательности B-цепи с помощью аминокислотной последовательности, содержащей 3-7 аминокислот, для формирования одноцепочечной молекулы инсулина, где N-конец B-цепи возможно удлинен 1-10 аминокислотами;
где по меньшей мере два гидрофобных аминокислотных остатка заменены на гидрофильные аминокислотные остатки по сравнению с родительским инсулином и A-цепь аналога инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и B-цепь содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином, при этом по меньшей мере одна мутация в A-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из A13-14, A14-15 и A19-20, и по меньшей мере одна мутация в B-цепи находится в одном или более сайтах расщепления, выбранных из группы, состоящей из B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B25-26;
где если Xaa_A8 представляет собой Thr, Xaa_A12 представляет собой Ser, Xaa_A13 представляет собой Leu и Xaa_A14 представляет собой Tyr, то Xaa_A15представляет собой Glu или Asp; и
где если Xaa_B24 представляет собой Phe, Xaa_B25 представляет собой Phe, Xaa_B26 представляет собой Tyr, Xaa_B27 представляет собой Thr и Xaa_B28представляет собой Pro, то Xaa_B29 представляет собой Gln.

21. Аналог инсулина по п.20, где Хаа_А14 является Glu, Asp или His, Xaa_B25является His, а Xaa_B30 отсутствует.

22. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, где Хаа_А14 является Glu, Asp или His, a Xaa_B25 является His.

23. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, где Хаа_В30отсутствует.

24. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, где Хаа_А14 является Glu.

25. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, который показывает повышенную стабильность по отношению к одному или более протеолитическому ферменту в сравнении с родительским инсулином.

26. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, который показывает повышенную стабильность по отношению к двум или более протеолитическим ферментам в сравнении с родительским инсулином.

27. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по сравнению с человеческим инсулином.

28. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по сравнению с родительским инсулином.

29. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 2 раза по сравнению с родительским инсулином.

30. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 3 раза по сравнению с родительским инсулином.

31. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 4 раза по сравнению с родительским инсулином.

32. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 5 раз по сравнению с родительским инсулином.

33. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, для которого T1/2 увеличен по меньшей мере в 10 раз по сравнению с родительским инсулином.

34. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов человеческого инсулина.

35. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов родительского инсулина.

36. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью человеческого инсулина в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов, выбранных из группы, состоящей из: пепсина, химотрипсина, инсулин-расщепляющего фермента, эластазы, карбоксипептидазы, катепсина D и других ферментов, присутствующих в экстрактах кишечника крысы, свиньи и человека.

37. Аналог инсулина по любому из пп.20-21, обладающий повышенной протеолитической стабильностью в отношении деградации под действием одного или более ферментов по сравнению с протеолитической стабильностью родительского инсулина в отношении деградации под действием одного или более протеолитических ферментов, выбранных из группы, состоящей из: пепсина, химотрипсина, инсулин-расщепляющего фермента, эластазы, карбоксипептидазы, катепсина D и других ферментов, присутствующих в экстрактах кишечника крысы, свиньи и человека.

38. Аналог инсулина по любому из пп.20-21 для применения в качестве фармацевтического средства в лечении или профилактике гипергликемии, сахарного диабета 2 типа или сахарного диабета 1 типа.

39. Аналог инсулина по любому из пп.20-21 для применения в качестве фармацевтического средства для задержки или предотвращения прогрессирования заболевания сахарного диабета 2 типа.

40. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, имеющая нуклеотидную последовательность, определяющую аминокислотную последовательность аналога инсулина по любому из пп.1-39.

41. Фармацевтическая композиция, обладающая биологической активностью инсулина, содержащая биологически активное количество аналога инсулина по любому из пп.1-39 и фармацевтически приемлемый носитель.

42. Способ изготовления фармацевтической композиции по п.41, включающий смешивание аналога инсулина по любому из пп.1-39 с фармацевтически приемлемыми веществами и/или эксципиентами.

43. Способ лечения или профилактики у субъекта гипергликемии, сахарного диабета 2 типа или сахарного диабета 1 типа, включающий введение этому субъекту аналога инсулина по любому из пп.1-39 или фармацевтической композиции по п.41.

44. Способ по п.43, при котором указанный аналог инсулина вводят перорально.