RU2571857C2

RU2571857C2 - Стабилизированные по отношению к протеазам ацилированные аналоги инсулина

Info

Publication number: RU2571857C2
Application number: RU2010141481/10A
Authority: RU
Inventors: Петер МАДСЕН; Томас Бёрглум КЬЕЛЬДСЕН; Томас ХОЕГ-ЙЕНСЕН; Палле ЯКОБСЕН; Тина Мёллер ТАГМОСЕ; Тине ГЛЕНДОРФ; Янош Тибор КОДРА; Патрик Уилльям ГЭРИБЭЙ; Якоб Стен ПЕТЕРСЕН
Original assignee: Ново Нордиск А/С
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2015-12-20
Also published as: US9688737B2; HUE032284T2; BRPI0910348A2; JP5749155B2; EP2910571B1; IL250549B; KR20160124929A; US20150210748A1; KR101755434B1; EP2910570B1; DK2910570T3; CN102037008A; US20110105720A1; PT2910570T; EP2254906B1; FIC20240029I1; JP2015147782A; ZA201006126B; BRPI0910348B1; WO2009115469A1

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описан ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин. Представлено применение описанного инсулина для изготовления фармацевтического состава для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета 1 типа. Изобретение позволяет получать устойчивые к протеазам аналоги инсулина. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 184 пр.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым ацилированным аналогам инсулина, демонстрирующим устойчивость к протеазам, к способу изготовления таких аналогов инсулина, к препаратам инсулина, содержащим инсулиновые аналоги изобретения, и к способу лечения сахарного диабета с помощью этих аналогов инсулина.

Уровень техники

Сахарный диабет является нарушением обмена веществ, при котором частично или полностью потеряна способность использовать глюкозу. Примерно 5% всех людей страдают от диабета, и это расстройство приобретает масштабы эпидемии. С момента введения инсулина в 1920-х годах предпринимались непрерывные усилия для улучшения лечения сахарного диабета. Т.к. люди, страдающие от диабета, подвергаются хроническому лечению в течение нескольких десятилетий, то существует острая потребность в безопасных, удобных и улучшающих качество жизни инсулиновых составах.

Пероральный путь на сегодняшний день является наиболее широко используемым путем введения препарата и в целом очень хорошо принимается пациентами, особенно при хронической терапии. Однако введение терапевтических пептидов или белков часто ограничено парентеральным путем, а не предпочтительным пероральным, из-за нескольких барьеров, таких как ферментативное расщепление в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и слизистой оболочке кишечника, системы переноса лекарства, недостаточная и переменная абсорбция из слизистой оболочки кишечника, а также первичный метаболизм при прохождении через печень.

Как правило, инсулиновые составы вводят подкожно. Однако введение другими путями, например перорально или внутрилегочно, может иметь преимущества благодаря комплиентности пациентов, безопасности и удобству. Некоторые из коммерчески доступных инсулиновых составов характеризуются быстрым началом действия, другие составы характеризуются относительно медленным началом, но демонстрируют более или менее длительное действие. Для больных сахарным диабетом очень важно, что на рынке имеется большой ассортимент инсулинов с различной длительностью действия (профилями действий). Говоря кратко, инсулины можно классифицировать на инсулины короткого, среднего и длительного действия.

WO 2008/034881 относится к определенным аналогам инсулина, в которых по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты были заменены гидрофильными аминокислотами, к аналогам инсулина, которые не ацилированы.

ЕР 2008/060733 и ЕР 2008/060733 относятся к определенным ацилированным аналогам инсулина, где аналог инсулина удлинен аминокислотным или пептидным остатком, связанным С-концом с аминокислотой А21.

ЕР 2008/060734 относится к определенным ацилированным инсулинам, в которых к родительскому инсулину присоединена ацильная группировка, и где указанная ацильная группировка состоит из повторяющихся звеньев аминокислот, содержащих алкиленгликоль.

Аспекты данного изобретения

Аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые при пероральном введении могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые при пероральном введении могут обеспечить длительное снижение уровня глюкозы.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении могут обеспечить длительное снижение уровня глюкозы.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении три раза в сутки могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении два раза в сутки могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении один раз в сутки могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые являются гидрофильными.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые являются более гидрофильными, чем человеческий инсулин.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые являются менее гидрофобными, чем человеческий инсулин, в соответствии с относительной гидрофобностью (k'отн), описанной в данном документе.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые являются менее гидрофобными, чем подобные не стабилизированные по отношению к протеазам родительские инсулины, ацилированные такой же ацильной группировкой, в соответствии с относительной гидрофобностью (k'отн), описанной в данном документе.

K'отн аналогов базального инсулина изобретения составляет предпочтительно менее 5, более предпочтительно менее 3, более предпочтительно менее 2, более предпочтительно менее 1, более предпочтительно менее 0,8, более предпочтительно менее 0,6, более предпочтительно менее 0,5, более предпочтительно менее 0,4, более предпочтительно менее 0,3, более предпочтительно менее 0,2, более предпочтительно менее 0,1.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении имеют удовлетворительную биодоступность. По сравнению с биодоступностью аналогичных ацилированных инсулинов без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций, введенных в аналогичных дозах, биодоступность предпочтительных соединений данного изобретения по меньшей мере на 10% выше, предпочтительно на 20% выше, предпочтительно на 25% выше, предпочтительно на 30% выше, предпочтительно на 35% выше, предпочтительно на 40% выше, предпочтительно на 45% выше, предпочтительно на 50% выше, предпочтительно на 55% выше, предпочтительно на 60% выше, предпочтительно на 65% выше, предпочтительно на 70% выше, предпочтительно на 80% выше, предпочтительно на 90% выше, предпочтительно на 100% выше, предпочтительно более чем на 100% выше, чем у не стабилизированного по отношению к протеазам сравниваемого инсулина.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при пероральном введении имеют удовлетворительную биодоступность. Биодоступность предпочтительных соединений данного изобретения (по сравнению с внутривенном введением) составляет по меньшей мере 0,3%, предпочтительно более 0,5%, предпочтительно более 1%, предпочтительно более 1,5%, предпочтительно более 2%, предпочтительно более 2,5%, предпочтительно более 3%, предпочтительно более 3,5%, предпочтительно более 4%, предпочтительно более 5%, предпочтительно более 6%, предпочтительно более 7%, предпочтительно более 8%, предпочтительно более 9%, предпочтительно более 10%.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов базального инсулина, которые при введении путем внутривенной инфузии имеют удовлетворительную активность. По сравнению с активностью человеческого инсулина, активность предпочтительных стабилизированных по отношению к протеазам аналогов инсулина изобретения составляет предпочтительно более 5%, предпочтительно более 10%, предпочтительно более 20%, предпочтительно более 30%, предпочтительно более 40%, предпочтительно более 50%, предпочтительно более 75% и предпочтительно более 100%.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые при внутрилегочном введении могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые при внутрилегочном введении могут обеспечить удовлетворительный контроль уровня глюкозы в крови с относительно медленным началом действия и/или более или менее длительным действием.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые при внутрилегочном введении имеют удовлетворительное длительное действие. По сравнению с подобным ацилированным инсулином без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций, введенным в аналогичных дозах, продолжительность действия предпочтительных соединений данного изобретения по меньшей мере на 10% больше, предпочтительно на 20% больше, предпочтительно на 25% больше, предпочтительно на 30% больше, предпочтительно на 35% больше, предпочтительно на 40% больше, предпочтительно на 45% больше, предпочтительно на 50% больше, предпочтительно на 55% больше, предпочтительно на 60% больше, предпочтительно на 65% больше, предпочтительно на 70% больше, предпочтительно на 80% больше, предпочтительно на 90% больше, предпочтительно на 100% больше, предпочтительно более чем на 100% больше, чем у сравниваемого инсулина. Продолжительность действия может измеряться по времени, в течение которого снижен уровень глюкозы, или по соответствующим фармакокинетическим свойствам, например t_½ или MRT (среднее время удержания препарата в организме).

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, которые имеют удовлетворительную легочную биодоступность. По сравнению с биодоступностью человеческого инсулина или по сравнению с аналогичным ацилированным инсулином без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций, введенным в аналогичных дозах, биодоступность предпочтительных соединений данного изобретения по меньшей мере на 10% выше, предпочтительно на 20% выше, предпочтительно на 25% выше, предпочтительно на 30% выше, предпочтительно на 35% выше, предпочтительно на 40% выше, предпочтительно на 45% выше, предпочтительно на 50% выше, предпочтительно на 55% выше, предпочтительно на 60% выше, предпочтительно на 65% выше, предпочтительно на 70% выше, предпочтительно на 80% выше, предпочтительно на 90% выше, предпочтительно на 100% выше, предпочтительно более чем на 100% выше, чем у сравниваемого инсулина.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, имеющих увеличенную активность, проявляемую in vivo.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению инсулинов длительного действия с пероральной биодоступностью.

Другой аспект данного изобретения относится к предоставлению аналогов инсулина, имеющих увеличенную протеолитическую стабильность по сравнению со стабильностью человеческого инсулина. По сравнению с человеческим инсулином протеолитическая стабильность предпочтительных соединений данного изобретения по меньшей мере в 2 раза выше, предпочтительно в 3 раза выше, предпочтительно в 4 раза выше, предпочтительно в 5 раз выше, предпочтительно в 6 раз выше, предпочтительно в 7 раз выше, предпочтительно в 8 раз выше, предпочтительно в 9 раз выше, предпочтительно в 10 раз выше, предпочтительно в 12 раз выше, предпочтительно в 14 раз выше, предпочтительно в 16 раз выше, предпочтительно в 18 раз выше, предпочтительно в 20 раза выше, предпочтительно в 25 раз выше, предпочтительно более чем 25 раз выше, чем у сравниваемого инсулина. Протеолитическую стабильность можно измерить, подвергая инсулин действию (смеси) протеолитических ферментов, например экстракта кишечных ферментов, описанного в данном документе.

Объектом изобретения является преодоление или уменьшение по меньшей мере одного из недостатков уровня техники или предоставление полезной альтернативы.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В данном документе термин «инсулин» охватывает инсулины природного происхождения, например человеческий инсулин, а также аналоги инсулина. Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, так называемых цепей А и В, которые содержат 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно, и которые соединены между собой двумя цистиновыми дисульфидными мостиками.

В данном документе термин «аминокислотный остаток» охватывает аминокислоты, в которых из аминогруппы был удален атом водорода и/или из карбоксильной группы была удалена гидроксильная группа и/или из меркаптогруппы был удален атом водорода. Неточно аминокислотный остаток может означать аминокислоту.

В данном документе термин «гидрофобные аминокислоты» следует понимать как аминокислоты природного происхождения триптофан (Trp, W), фенилаланин (Phe, F), валин (Val, V), изолейцин (Ile, I), лейцин (Leu, L) и тирозин (Tyr, Y) (с трехбуквенной и однобуквенной аббревиатурой в скобках).

В данном документе термин «гидрофильные аминокислоты» следует понимать как природные аминокислоты, которые не являются гидрофобными аминокислотами в соответствии с определением выше. В одном воплощении гидрофильные кислоты в соответствии с изобретением выбраны из группы, состоящей из: глутаминовой кислоты (Glu, E), аспарагиновой кислоты (Asp, D), гистидина (His, Н), глутамина (Gln, Q), аспарагина (Asn, N), серина (Ser, S), треонина (Thr, Т), пролина (Pro, P), глицина (Gly, G), лизина (Lys, K) и аргинина (Arg, R). В другом воплощении гидрофильные аминокислоты в соответствии с изобретением выбраны из группы, состоящей из: глутаминовой кислоты (Glu, E), аспарагиновой кислоты (Asp, D), гистидина (His, Н), глутамина (Gln, Q), аспарагина (Asn, N), лизина (Lys, K) и аргинина (Arg, R).

В данном документе термин «аналог инсулина» охватывает полипептиды, которые имеют молекулярную структуру, которая формально может быть получена из структуры инсулина природного происхождения, например человеческого инсулина, путем удаления и/или замещения (замены) одного или более аминокислотного остатка, входящего в природный инсулин, и/или путем добавления одного или более аминокислотного остатка. Добавленные и/или замененные аминокислотные остатки могут быть либо кодируемыми аминокислотными остатками, либо другими аминокислотными остатками природного происхождения, либо чисто синтетическими аминокислотными остатками. В предпочтительном воплощении аналог инсулина имеет две или более мутации по сравнению с человеческим инсулином.

В данном документе термин «инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам» обозначает инсулин без присоединенной ацильной группировки. Указанные инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, имеют повышенную устойчивость к деградации протеазами.

В данном документе термин «родительский инсулин» обозначает инсулин без присоединенной ацильной группировки и без мутаций для повышения устойчивости к деградации протеазами. Указанные родительские инсулины возможно имеют мутации по сравнению с человеческим инсулином. Родительские инсулины, таким образом, также являются аналогами инсулина, определенными выше. В данном документе термины «родительский инсулин» и «инсулин, не стабилизированный по отношению к протеазам» обозначают одни и те же соединения.

В данном документе термин «мутация» охватывает любое изменение в аминокислотной последовательности (замены и вставки кодируемых аминокислот, а также делеции).

В данном документе термины «аналоги цепи А» и «аналоги цепи В» человеческого инсулина охватывают соответственно А- и В-цепи человеческого инсулина, имеющие одну или более замену, удаление и/или удлинение (добавление) соответственно в аминокислотных А- и В-цепях по сравнению соответственно с А- и В-цепями человеческого инсулина.

В данном документе такие термины, как «А1», «А2», «A3» и т.д., указывают соответственно позиции 1, 2 и 3 в А-цепи инсулина (считая, с N-конца). Аналогичным образом такие термины, как «В1», «В2», «В3» и т.д., указывают соответственно позиции 1, 2 и 3 в В-цепи инсулина (считая с N-конца). При использовании однобуквенных кодов аминокислот такие термины, как «А21А», «A21G» и «A21Q» обозначают, что аминокислота в позиции А21 представляет собой A, G и Q соответственно. При использовании трехбуквенных кодов аминокислот соответствующие выражения представляют собой AlaA21, GlyA21 и GlnA21 соответственно.

В данном документе термины «А(0)» или «В(0)» указывают позиции N-концевых соседних А1- или В1-позиций соответственно, в А- или В-цепи соответственно. Термины «А(-1)» или «В(-1)» указывают на позиции первых аминокислот с N-конца от А(0) или В(0) соответственно. Таким образом, «А(-2)» и «В(-2)» указывают на N-концевые позиции по отношению к А(-1) и В(-1) соответственно, А(-3) и В(-3) указывают на N-концевые позиции по отношению к А(-2) и В(-2) соответственно и т.д.

В данном документе такие термины, как «desB29» и «desB30», обозначают аналог инсулина, потерявший аминокислотный остаток В29 или В30 соответственно.

В данном документе термин «быстро действующий инсулин» обозначает инсулин, имеющий более быстрое начало действия по сравнению с нормальным или обычным человеческим инсулином.

В данном документе термин «инсулин длительного действия» или термин «базальный инсулин» обозначает инсулин с более длительным действием по сравнению с нормальным или обычным человеческим инсулином. Предпочтительно время действия составляет более 5 или 8 часов, в частности по меньшей мере более 9 часов. Предпочтительно базальный инсулин имеет время действия по меньшей мере 10 часов. Базальный инсулин может, таким образом, иметь время действия в диапазоне от примерно 8 до 24 часов, предпочтительно в диапазоне от примерно 9 до примерно 15 часов.

Нумерация позиций в аналогах инсулина, инсулинах и А- и В-цепях производится таким образом, чтобы родительское соединение представляло собой человеческий инсулин с нумерацией, использованной для него.

В данном документе термин «ацилированный инсулин» обозначает инсулин, модифицированный путем присоединения одной или более ацильных группировок через линкер к стабилизированному по отношению к протеазам инсулину.

Под ацилированным инсулином, имеющим инсулиновую активность, понимается ацилированный инсулин либо со способностью снижать уровень глюкозы в крови млекопитающих, измеренный на подходящей животной модели, которой может быть, например, крыса, кролик или свинья, после подходящего введения, например внутривенного или подкожного, либо со связывающей аффинностью к инсулиновому рецептору.

В данном документе термин «алкил» обозначает насыщенную разветвленную или прямую углеводородную группу.

В данном документе термин «алкокси-» обозначает радикал «алкил-O-». Типичными примерами являются метокси-, этокси-, пропокси- (например, 1-пропокси- и 2-пропокси-), бутокси- (например, 1-бутокси-, 2-бутокси- и 2-метил-2-пропокси-), пентокси- (1-пентокси- и 2-пентокси-), гексокси- (1-гексокси и 3-гексокси) и т.п.

В данном документе термин «алкилен» обозначает насыщенную разветвленную или прямую двухвалентную углеводородную группу, имеющую от 1 до 12 атомов углерода. Типичные примеры включают, не ограничиваясь ими, метилен; 1,2-этилен; 1,3-пропилен; 1,2-пропилен; 1,3-бутилен; 1,4-бутилен; 1,4-пентилен; 1,5-пентилен; 1,5-гексилен; 1,6-гексилен и т.п.

В данном документе термин «нейтральная линейная аминокислота» обозначает. Неограничивающими примерами нейтральных линейных аминокислот являются.

В данном документе термин «циклическая аминокислота» обозначает. Неограничивающими примерами циклических линейных аминокислот являются.

В данном документе термин «кислая аминокислота» обозначает. Неограничивающими примерами кислых линейных аминокислот являются.

В данном документе термин «жирная кислота» обозначает линейные или разветвленные алифатические карбоновые кислоты, имеющие по меньшей мере два атома углерода и являющиеся насыщенными или ненасыщенными. Неограничивающими примерами жирных кислот являются миристиновая кислота, пальмитиновая кислота и стеариновая кислота.

В данном документе термин «жирная двухосновная кислота» обозначает линейные или разветвленные алифатические дикарбоновые кислоты, имеющие по меньшей мере два атома углерода и являющиеся насыщенными или ненасыщенными. Неограничивающими примерами жирных двухосновных кислот являются янтарная кислота, гександиовая кислота, октандиовая кислота, декандиовая кислота, додекандиовая кислота, тетрадекандиовая кислота, гексадекандиовая кислота, гептадекандиовая кислота, октадекандиовая кислота и эйкозандиовая кислота.

В данном документе инсулины называют в соответствии со следующими принципами: названия дают в соответствии с мутациями и модификациями (ацилированием) по сравнению с человеческим инсулином. Ацильной группировке название дают в соответствии с номенклатурой IUPAC, а в других случаях в соответствии с пептидной номенклатурой. Например ацильная группировка:

может быть названа, например, «октадекандиоил-γGlu-OEG-OEG», или «17-карбоксигептадеканоил-γGlu-OEG-OEG», где

OEG представляет собой краткое обозначение для аминокислоты NH₂(СН₂)₂O(СН₂)₂OCH₂CO₂H,

γGlu представляет собой краткое обозначение для гамма-глутаминовой кислоты.

Другими краткими обозначениями для аминокислот являются, например:

ПЭГ3 для NH₂((CH₂)₂O)₄CH₂CH₂CO₂H

ПЭГ7 для NH₂((СН₂)₂O)₈CH₂CH₂CO₂H.

Например, инсулин примера 9 (с последовательностью/структурой, приведенной ниже) называется «А14Е, В25Н, B29K (N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин», что указывает, что аминокислота в позиции A14,Y в человеческом инсулине мутировала в Е, аминокислота в позиции B25,F в человеческом инсулине мутировала в Н, аминокислота в позиции В29,K в человеческом инсулине была модифицирована путем ацилирования эпсилон-азота в остатке лизина В29, обозначенного N^ε, остатком октадекандиоил-γGlu-OEG-OEG, а аминокислота в позиции В30,Т в человеческом инсулине была удалена. Звездочки в приведенной ниже формуле обозначают, что остаток в данном случае отличается (т.е. мутирован) от человеческого инсулина. В данной заявке приведены обе формулы и названия предпочтительных инсулинов изобретения

В данном документе термины «химическая стабильность» и «высокая химическая стабильность» обозначают, что химически инсулины изобретения являются достаточно стабильными в нужном составе. Т.е. это означает, что продукты химической деградации формируются только в таких количествах, которые не подвергают риску срок годности окончательного лекарственного продукта. Продукты химической деградации включают продукты дезамидирования, изоаспартатные структуры, димерные структуры, продукты рацемизации, продукты, полученные в результате процессов дегидратации и пр. Химическую стабильность можно измерить с помощью ВЭЖХ образцов или составов определенного срока хранения.

В данном документе термин «высокая физическая стабильность» обозначает, что тенденция к образованию волокон составляет менее 50% от таковой тенденции человеческого инсулина. Тенденцию к образованию волокон можно описать посредством периода времени, после которого в данных условиях начнется образование волокон.

Полипептид с аффинностью к рецептору инсулина и рецептору IGF-1 представляет собой полипептид, который способен взаимодействовать с рецептором инсулина и рецептором человеческого IGF-1 в соответствующем анализе связывания. Такие анализы рецепторов хорошо известны в данной области и более подробно описаны в примерах. Данный ацилированный инсулин не будет связываться с рецептором IGF-1 или будет иметь довольно низкую аффинность к указанному рецептору. Говоря точнее, ацилированные инсулины данного изобретения будут иметь аффинность к рецептору IGF-1 по существу той же силы или меньшей, чем человеческий инсулин.

Термин «фармацевтически приемлемый», используемый в данном документе, обозначает подходящий в качестве обычных фармацевтических добавок, т.е. не дающий каких-либо серьезных побочных эффектов у пациентов и т.д.

Термин «лечение», используемый в данном документе, обозначает руководство и уход за пациентом с целью борьбы с заболеванием, расстройством или состоянием. Термин включает задержку прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, смягчение или облегчение симптомов и осложнений и/или выздоровление или ликвидацию болезни, расстройства или состояния. Пациент, подвергающийся лечению, является предпочтительно млекопитающим, в частности человеком.

Термин «лечение заболевания», используемый в данном документе, обозначает руководство и уход за пациентом, у которого развивается заболевание, состояние или расстройство. Цель лечения заключается в борьбе с заболеванием, состоянием или расстройством. Лечение включает введение активных соединений для устранения или контроля за заболеванием, состоянием или расстройством, а также для смягчения симптомов или осложнений, связанных с болезнью, состоянием или расстройством.

Термин «профилактика заболевания», используемый в данном документе, обозначает руководство и уход за индивидуумом, имеющим риск развития заболевания, до клинического начала заболевания. Целью профилактики является борьба с развитием заболевания, состояния или расстройства, и включает введение активных соединений для предотвращения или замедления появления симптомов или осложнений и для предотвращения или замедления развития связанных заболеваний, состояний или расстройств.

Термин «эффективное количество», используемый в данном документе, обозначает дозу, достаточную для того, чтобы лечение пациентов было эффективным по сравнению с отсутствием лечения.

«РОТ» обозначает ген триозофосфатизомеразы Schizosaccharomyces pombe, а «TPI1» обозначает ген триозофосфатизомеразы S. cerevisiae.

Под «лидером» понимается аминокислотная последовательность, состоящая из препептида (сигнального пептида) и пропептида.

Термин «сигнальный пептид» используется для обозначения препептида, который присутствует в качестве N-концевой последовательности в предшественнике белка. Функция сигнального пептида состоит в облегчении перемещения гетерогенного белка в эндоплазматическую сеть. Сигнальный пептид обычно отщепляется в ходе этого процесса. Сигнальный пептид может быть гетерологичным или гомологичным дрожжевому организму, продуцирующему белок. Количество сигнальных пептидов, которые могут быть использованы с ДНК-конструкцией данного изобретения, в том числе сигнальный пептид дрожжевой аспарагиновой протеазы 3 (YAP3) или любой функциональный аналог (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6:127-137 и патент США 5726038) и сигнал α-фактора гена MFα1 (Thorner (1981) в The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds., pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY и в патенте США 487000.

В данном документе термин «пропептид» обозначает полипептидную последовательность, функция которой состоит в разрешении экспрессированному полипептиду направиться из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, а затем в секреторные везикулы для секреции в культуральную среду (например, экспорт полипептида через клеточную стенку или по меньшей мере через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Пропептид также может быть дрожжевым α-факторным пропептидом, см. патенты США 4546082 и 4870008. Альтернативно пропептид может быть синтетическим пропептидом, т.е. пропептидом, который не встречается в природе. Подходящие синтетические пропептиды раскрыты в патентах США 5395922; 5795746; 5162498 и WO 98/32867. Пропептид предпочтительно на С-конце будет содержать сайт процессинга для эндопептидазы, такой как последовательность Lys-Arg или любой ее функциональный аналог.

Если явно не указано, то аминокислоты, упомянутые в данном документе, являются L-аминокислотами. Кроме того, левый и правый концы аминокислотной последовательности пептида являются соответственно N- и С-концами, если не указано обратное.

Сущность изобретения

Было обнаружено, что инсулины, стабилизированные по отношению к протеолитической деградации (путем специфических мутаций) и ацилированные на В29-лизине, являются эффективными и длительно действующими и обладают высоким потенциалом в качестве инсулинов длительного действия, которые могут быть введены внутрилегочно или перорально. Ацилирование обеспечивает связывание сывороточного альбумина и, следовательно, замедление действия. Кроме того, ацилированные инсулины изобретения демонстрируют существенное снижение аффинности к рецептору инсулина по сравнению с аналогичными ацилированными инсулинами, которые не стабилизированы по отношению к протеолитической деградации. Это снижение аффинности к инсулиновому рецептору альбумин-связывающих инсулинов изобретения способствует задержке ацилированного инсулина в кровотоке, так как инсулин интернализуется и деградирует при активации рецепторов. Таким образом, клиренс инсулина изобретения снижается. Снижение аффинности инсулинового рецептора, вероятно, не приводит к потере активности, например при измерении в гипергликемическом эугликемическом «клэмп»-тесте, описанном в данном документе. Сочетание высокой связывающей аффинности к альбумину и низкой аффинности к рецептору инсулина, таким образом, полезно для получения длительного действия инсулинов (базальные инсулины). Кроме того, после перорального введения эти ацилированные инсулины имеют более высокую степень биодоступности по сравнению с аналогичными известными ацилированными инсулинами, не стабилизированными по отношению к протеолитической деградации. Таким образом, эти ацилированные аналоги инсулина являются ценными для перорального введения. Аналогичным образом после внутрилегочного введения эти ацилированные инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, демонстрируют более высокую активность и/или биодоступность по сравнению с аналогичными известными ацилированными инсулинами, не стабилизированными по отношению к протеолитической деградации. Кроме того, эти ацилированные инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, демонстрируют увеличенное время действия при внутрилегочном введении у млекопитающих. Таким образом, эти ацилированные аналоги инсулина являются ценными для внутрилегочного введения.

Вышеупомянутые инсулины, стабилизированные по отношению к протеолитической деградации, являются обозначенными в данном документе инсулинами, стабилизированными по отношению к протеазам.

Инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, имеют ограниченное количество аминокислотных остатков природного происхождения, замененных другими аминокислотными остатками по сравнению с человеческим инсулином, как описано в части с подробным описанием.

В одном воплощении данное изобретение относится к ацилированному инсулину, где аналог инсулина, стабилизированный по отношению к протеазам, отличается от человеческого инсулина на одну или более из следующих делеций или замен: Q в позиции А18, A, G и Q в позиции А21, G или Q в позиции В1 или отсутствие аминокислотного остатка в позиции В1, Q, S или Т в позиции В3 или отсутствие аминокислотного остатка в позиции В3, Q в позиции В13, отсутствие аминокислотного остатка в позиции В27, D, Е или R в позиции В28 и отсутствие аминокислотного остатка в позиции В30.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим ацилированный инсулин данного изобретения и подходящие адъюванты и добавки, такие как один или более агент, подходящий для стабилизации, хранения или достижения изотоничности, например ионы цинка, фенол, крезол, парабен, хлорид натрия, глицерин или маннит. Содержание цинка в данных составах может составлять от 0 до примерно 6 атомов цинка на 6 молекул инсулина. Значение рН фармацевтического препарата может находиться в пределах от примерно 4 до примерно 8,5, в пределах от примерно 4 до примерно 5 или в пределах от примерно 6,5 до примерно 7,5.

В другом воплощении данное изобретение относится к применению ацилированного инсулина в качестве фармацевтического средства для снижения уровней глюкозы в крови млекопитающих, в частности для лечения диабета.

В другом аспекте данное изобретение относится к применению ацилированного инсулина для изготовления фармацевтического препарата для снижения уровня глюкозы в крови млекопитающих, в частности для лечения сахарного диабета.

В другом воплощении данное изобретение относится к способу снижения уровня глюкозы в крови млекопитающих путем введения терапевтически активной дозы ацилированного инсулина данного изобретения пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

В другом аспекте данного изобретения ацилированные инсулины вводят в сочетании с одним или более другим активным веществом в любых подходящих соотношениях. Такие другие активные агенты могут быть выбраны среди человеческого инсулина, быстро действующих аналогов инсулина, антидиабетических агентов, антигиперлипидемических агентов, агентов против ожирения, антигипертензивных агентов и агентов для лечения осложнений, возникающих в результате диабета или связанных с ним.

В одном воплощении два активных компонента вводят в виде смешанного фармацевтического препарата. В другом воплощении два компонента вводят раздельно либо одновременно, либо последовательно.

В одном воплощении ацилированные инсулины данного изобретения могут быть введены вместе с быстродействующим человеческим инсулином или с аналогами человеческого инсулина. Такой быстродействующий аналог инсулина может быть таким, в котором аминокислотный остаток в позиции В28 представляет собой Asp, Lys, Leu, Val или Ala, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Lys или Pro, человеческий инсулин des(B28-B30), человеческий инсулин des(B27) или человеческий инсулин des(B30), а также таким аналогом, в котором аминокислотный остаток в позиции В3 представляет собой Lys, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой γGlu или Asp. Ацилированный инсулин данного изобретения и быстродействующий человеческий инсулин или аналог человеческого инсулина могут быть смешаны в соотношении от примерно 90% ацилированного инсулина до примерно 10% быстродействующего человеческого инсулина или аналога человеческого инсулина; предпочтительно от примерно 70% ацилированного инсулина до примерно 30% быстродействующего человеческого инсулина или аналога человеческого инсулина, и даже более предпочтительно от примерно 50% ацилированного инсулина до примерно 50% быстродействующего человеческого инсулина или аналога человеческого инсулина (% является процентом по весу).

Ацилированные инсулины данного изобретения могут быть также использованы для комбинированного лечения вместе с антидиабетическим агентом.

Антидиабетические агенты включают инсулин, GLP-1 (1-37) (глюкагон-подобный пептид-1), описанный в WO 98/08871, WO 99/43706, US 5424286, WO 00/09666, WO 2006/097537, PCT/EP2008/061755 и РСТ/ЕР2008/061830, GLP-2, эксендин-4 (1-39), их инсулинотропные фрагменты, инсулинотропные аналоги и инсулинотропные производные. Инсулинотропные фрагменты GLP-1 (1-37) представляют собой инсулинотропные пептиды, последовательность которых целиком может быть найдена в последовательности GLP-1 (1-37), и в которых хотя бы одна концевая аминокислота удалена.

Ацилированные инсулины данного изобретения также могут быть использованы для комбинированного лечения пероральными антидиабетическими средствами, такими как тиазолидиндион, метформин и другие фармацевтические препараты для перорального введения при диабете 2 типа.

Кроме того, ацилированный инсулин данного изобретения может быть введен в сочетании с одним или более агентом против ожирения или агентом, регулирующим аппетит.

В одном воплощении данное изобретение относится к фармацевтическому препарату для внутрилегочного введения, содержащему ацилированный инсулин данного изобретения и подходящие адъюванты и добавки, такие как один или более агент, подходящий для стабилизации, хранения или достижения изотоничности, например ионы цинка, фенол, крезол, парабен, хлорид натрия, глицерин или маннит.

Следует понимать, что в рамках данного изобретения находится любая подходящая комбинация ацилированных инсулинов с диетой и/или упражнением, одним или более из вышеуказанных соединений и возможно одним или более другим активным веществом.

Описание предпочтительных воплощений

Стабильность и растворимость инсулина являются серьезными основными аспектами имеющейся терапии инсулином. Данное изобретение адресовано к этим вопросам за счет предоставления стабильных ацилированных аналогов инсулина, где ацилирование уменьшает молекулярную пластичность и одновременно сокращает склонность к образованию волокон и ограничивает или изменяет рН-зону преципитации.

Ацилированные инсулины данного изобретения, в частности, предназначены для внутрилегочного или перорального введения в связи с их относительно высокой биодоступностью по сравнению, например, с человеческим инсулином и ацилированным человеческим инсулином. Кроме того, ацилированные инсулины проявляют более долгую инсулиновую активность.

Как упоминалось выше, инсулины, которые стабилизированы по отношению к протеолитической деградации, представляют собой обозначенные в данном документе инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам. Ацилированные инсулины данного изобретения являются указанными инсулинами, стабилизированными по отношению к протеазам, которые были ацилированы, как описано в данном документе.

Указанные стабилизированные по отношению к протеазам инсулины являются производными соединений инсулина, которые в данном документе обозначены как родительские инсулины или инсулины, не стабилизированные по отношению к протеазам.

В одном воплощении родительский инсулин выбран из группы, состоящей из а) человеческого инсулина, б) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В28 представляет собой Pro, Asp, Lys, Leu, Val или Ala, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой Lys или Pro и, возможно, аминокислотный остаток в позиции В30 удален; в) инсулинового аналога, который является человеческим инсулином des(B28-B30), человеческим инсулином des(B27) или человеческим инсулином des(B30); г) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В3 представляет собой Lys, а аминокислотный остаток в позиции В29 представляет собой γGlu или Asp; д) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции А21 представляет собой Gly, и в котором инсулиновый аналог удлинен с С-конца двумя остатками аргинина; е) производного инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В30 заменен метиловым эфиром треонина; и ж) производного инсулина, в котором к N^ε-позиции лизина в позиции В29 человеческого инсулина des(B30) присоединена тетрадеканоильная цепь. Каждая из этих групп является конкретным воплощением.

В другом воплощении родительский инсулин выбран из группы, состоящей из человеческого инсулина; desB30 человеческого инсулина; AspB28 человеческого инсулина; AspB28, DesB30 человеческого инсулина; LysB3, γGluB29 человеческого инсулина; LysB28, ProB29 человеческого инсулина; GlyA21, ArgB31, ArgB32 человеческого инсулина; и desB30, ArgB31, ArgB32 человеческого инсулина.

Более конкретно инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, представляет собой молекулу инсулина с двумя или более мутациями в А- и/или В-цепи по сравнению с родительским инсулином. Удивительно, но оказалось, что при замене двух или более гидрофобных аминокислот в пределах или в непосредственной близости от двух или более протеазных сайтов на инсулине на гидрофильные аминокислоты получается инсулиновый аналог (т.е. инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам), который протеолитически более стабилен, чем родительский инсулин. В широком аспекте инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, представляет собой инсулиновый аналог, в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты заменены гидрофильными аминокислотами по сравнению с родительским инсулином, где замены находятся в пределах или в непосредственной близости от двух или более сайтов расщепления протеазой родительского инсулина, и где такой инсулиновый аналог возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, представляет собой инсулиновый аналог, в котором

- аминокислота в позиции А12 является γGlu или Asp и/или аминокислота в позиции А13 является His, Asn, γGlu или Asp и/или аминокислота в позиции А14 является Asn, Gln, γGlu, Arg, Asp, Gly или His и/или аминокислота в позиции А15 является γGlu или Asp; и

- аминокислота в позиции В24 является His и/или аминокислота в позиции В25 является His и/или аминокислота в позиции В26 является His, Gly, Asp или Thr и/или аминокислота в позиции В27 является His, γGlu, Gly или Arg и/или аминокислота в позиции В28 является His, Gly или Asp; и

который также возможно содержит одну или более дополнительную мутацию.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является аналогом, содержащим мутации В25Н или B25N в сочетании с мутациями в В27, возможно в сочетании с другими мутациями.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является аналогом, содержащим мутации В25Н или B25N в сочетании с мутациями в В27, возможно в сочетании с другими мутациями. Мутации в позиции В27 могут быть, например, γGlu или Asp.

Эти ацилированные аналоги инсулина, стабилизированные по отношению к протеазам, содержащие как В25, так и В27 мутацию, обладают полезными свойствами.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является инсулиновым аналогом, содержащим А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 1:

и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 2:

где

Xaa_A(-2) отсутствует или представляет собой Gly;

Xaa_A(-1) отсутствует или представляет собой Pro;

Xaa_A0 отсутствует или представляет собой Pro;

Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His;

Xaa_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и γGlu;

Xaa_A13 независимо выбран среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu;

Xaa_A14 независимо выбран среди Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu;

Xaa_A15 независимо выбран среди Gln, Asp и γGlu;

Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln;

Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B(-2) отсутствует или представляет собой Gly;

Xaa_B(-1) отсутствует или представляет собой Pro;

Xaa_B0 отсутствует или представляет собой Pro;

Xaa_B1 отсутствует или независимо выбран среди Phe и γGlu;

Xaa_B2 отсутствует или представляет собой Val;

Xaa_B3 отсутствует или независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu;

Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu;

Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gln, His, Arg и γGlu;

Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Xaa_B25 независимо выбран среди Asn, Phe и His;

Xaa_B26 отсутствует или независимо выбран среди Tyr, His, Thr, Gly и Asp;

Xaa_B27 отсутствует или независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu;

Xaa_B28 отсутствует или независимо выбран среди Pro, His, Gly и Asp;

Xaa_B29 отсутствует или независимо выбран среди Lys, Arg и Gln; и предпочтительно Xaa_B29 отсутствует или независимо выбран среди Lys и Gln;

Xaa_B30 отсутствует или представляет собой Thr;

Xaa_B31 отсутствует или представляет собой Leu;

Xaa_B32 отсутствует или представляет собой γGlu;

С-конец возможно может быть получен как амид;

где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи, и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидными мостиками.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, представляет собой инсулиновый аналог, содержащий А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 3:

и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 4:

где

Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His;

Xaa_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и γGlu;

Xaa_A14 независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu;

Xaa_A15 независимо выбран среди Gln, Asp и γGlu;

Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln;

Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B1 независимо выбран среди Phe и γGlu;

Xaa_B3 независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu;

Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu;

Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gln, His, Arg, и γGlu;

Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Xaa_B30 отсутствует или представляет собой Thr;

где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи, и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком.

В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, представляет собой инсулиновый аналог, где

Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His;

Xaa_A12 независимо выбран среди Ser и γGlu;

Xaa_A14 независимо выбран среди Asp, His и γGlu;

Xaa_A15 независимо выбран среди Gln и γGlu;

Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln;

Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B1 независимо выбран среди Phe и γGlu;

Xaa_B3 независимо выбран среди Asn и Gln;

Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu;

Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu;

Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His;

Xaa_B25 независимо выбран среди Phe, Asn и His;

Xaa_B26 независимо выбран среди Tyr, Thr, Gly и Asp;

Xaa_B27 независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg и γGlu;

Xaa_B28 независимо выбран среди Pro, Gly и Asp;

Xaa_B29 независимо выбран среди Lys и Gln;

Xaa_B30 отсутствует или представляет собой Thr;

Другие воплощения инсулинов, стабилизированных по отношению к протеазам, приведены ниже.

«Протеаза» или «фермент протеаза» является пищеварительным ферментом, который разрушает белки и пептиды и который находится в различных тканях человеческого организма, таких как, например, желудок (пепсин), просвет кишечника (химотрипсин, трипсин, эластаза, карбоксипептидазы и др.) или слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта (аминопептидазы, карбоксипептидазы, энтеропептидазы, дипептидил-пептидазы, эндопептидазы и др.), печень (инсулин-разрушающий фермент, катепсин D и др.), и в других тканях.

Протеолитически стабильный аналог инсулина (также обозначенный инсулином, стабилизированным по отношению к протеазам) в данном документе следует понимать как аналог инсулина, который подвергается более медленной деградации одной или более протеазой по сравнению с человеческим инсулином. В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, подвергается более медленной деградации одной или более протеазой по сравнению с родительским инсулином. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является стабилизированным по отношению к деградации одним или более ферментом, выбранным из группы, состоящей из: пепсина (такого как, например, изоформы пепсин А, пепсин В, пепсин С и/или пепсин F), химотрипсина (такого как, например, изоформы химотрипсин А, химотрипсин В и/или химотрипсина С), трипсина, инсулин-разрушающего фермента (IDE), эластазы (такой как, например, изоформы панкреатическая эластаза I и/или II), карбоксипептидазы (например, изоформы карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза А2 и/или карбоксипептидаза В), аминопептидазы, катепсина D и других ферментов, присутствующих в пищеварительных экстрактах, полученных от крысы, свиньи или человека.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является стабилизированным по отношению к деградации одним или более ферментом, выбранным из группы, состоящей из: химотрипсина, трипсина, инсулин-разрушающего фермента (IDE), эластазы, карбоксипептидаз, аминопептидаз и катепсина D. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является стабилизированным по отношению к деградации одним или более ферментом, выбранным из группы, состоящей из: химотрипсина, карбоксипептидаз и IDE. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, является стабилизированным по отношению к деградации одним или более ферментом, выбранным среди химотрипсина и карбоксипептидаз.

Т½ может быть определено, в соответствии с описанием в примерах, как мера протеолитической стабильности стабилизированного по отношению к протеазам инсулина к ферментам протеазам, таким как химотрипсин, пепсин и/или карбоксипептидаза А. В одном воплощении изобретения Т½ увеличено по сравнению с человеческим инсулином. В другом воплощении Т½ увеличено по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т½ увеличено по меньшей мере в два раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т½ увеличено по меньшей мере в 3 раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т½ увеличено по меньшей мере в 4 раза по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т½ увеличено по меньшей мере в 5 раз по сравнению с родительским инсулином. В еще одном воплощении Т½ увеличено по меньшей мере в 10 раз по сравнению с родительским инсулином.

Альтернативным способом измерения протеолитической стабильности является измерение относительной стабильности по отношению к сравниваемому веществу, например человеческому инсулину. Относительная стабильность определяется как Т½/Т½ (сравниваемого вещества), где T½ и T½ (сравниваемого вещества) представляют собой период полужизни аналога и сравниваемого вещества соответственно, измеренный в анализе деградации,. В разделе «примеры» дана относительная стабильность выбранных инсулинов изобретения по отношению к ферментной смеси, выделенной из двенадцатиперстной кишки крыс (по сравнению с человеческим инсулином, а также по сравнению с инсулином, устойчивым по отношению к протеазам без ацилирования).

Сайты расщепления протеазой (также упоминаемые в данном документе как протеазные сайты) следует понимать как аминокислотные остатки, которые распознаются протеазами, и/или как аминокислотные остатки, пептидная связь которых расщепляется протеазами. Сайты расщепления протеазой могут быть выявлены путем определения «горячих точек» расщепления в анализах ВЭЖХ, масс-спектрометрии или ЖХ-МС и/или прогнозированы на основании ферментной специфичности фермента протеазы, для которого был определен сайт расщепления протеазой. Специалисту в данной области известно о том, как определить сайты расщепления протеазой, например на основании особенностей фермента, как описано, например, в Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed., Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F. editors, Elsevier Academic Press 2004. Например, использование химотрипсина прогнозируют для расщепления С-концевых пептидных связей ароматических остатков (Trp, Tyr, Phe или Leu), за которыми не следует Pro. Подобным образом использование трипсина прогнозируют для расщепления С-концевых пептидных связей основных остатков Lys или Arg, за которыми не следует Pro, использование эластазы прогнозируют для отщепления С-концевых остатков Ala, Val, Gly или Ser, а карбоксипептидаза А будет удалять С-концевую аминокислоту, но не Arg, Lys или Pro. Фермент, разрушающий инсулин (IDE), прогнозируют для расщепления в следующих позициях человеческого инсулина: В9-10, В10-11, В13-14, В14-15, В24-25, В25-26, А13-14 и А14-15.

Термин «замена (одной) аминокислоты «в пределах или в непосредственной близости» к сайту расщепления протеазой» используется в данном документе для обозначения замены аминокислоты в пределах или в непосредственной близости от позиции в родительском инсулине, которая была определена как сайт расщепления протеазой. В одном воплощении заменены две или более гидрофобные аминокислоты в пределах или в непосредственной близости к двум или более протеазным сайтам в инсулине, причем указанные гидрофобные аминокислоты заменены гидрофильными аминокислотами. В другом воплощении две или более гидрофобные аминокислоты в пределах двух или более протеазных сайтов инсулина заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные рядом с двумя или более протеазными сайтами инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в двух аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в трех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в четырех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в одной, двух или трех аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные в одной или двух аминокислотах от двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами. В еще одном воплощении две или более гидрофобные аминокислоты, расположенные вблизи или в пределах двух или более протеазных сайтов инсулина, заменены гидрофильными аминокислотами.

Инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может иметь результирующий заряд, который отличается от результирующего заряда родительского инсулина. В одном воплощении результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, является более положительным, чем результирующий заряд родительского инсулина. В одном воплощении результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, является более отрицательным, чем результирующий заряд родительского инсулина. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, измеренный в водном растворе, составляет от 0,5 до 5. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от 1 до 5. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от 1 до 4. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от 1 до 3. В одном воплощении средний положительный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от 2 до 3. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, измеренный в водном растворе, составляет от -0,5 до -5. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от -1 до -5. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от -1 до -4. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от -1 до -3. В одном воплощении средний отрицательный результирующий заряд инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, составляет от -2 до -3.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может иметь повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 3-9. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4-8,5. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4-8. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 4,5-8. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 5-8. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 5,5-8. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 6-8.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с человеческим инсулином при рН 2-4.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может иметь повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином. В другом воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 3-9. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4-8,5. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4-8. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 4,5-8. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 5-8. В еще одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 5,5-8. В другом воплощении аналог инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 6-8.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, имеет повышенную растворимость по сравнению с родительским инсулином при рН 2-4.

При выражении «повышенная растворимость при данном рН» имеется в виду, что большая концентрация инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, растворяется в водном или буферном растворе при данном рН раствора по сравнению с родительским инсулином. Способы определения того, растворяется ли содержащийся в растворе инсулин, известны в данной области.

В одном воплощении раствор может быть подвергнут центрифугированию в течение 20 минут при 30000 g, а затем концентрация инсулина в супернатанте может быть определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Если эта концентрация находится в пределах экспериментальной ошибки первоначальной концентрации инсулина, используемой для получения композиции, то инсулин полностью растворяется в композиции изобретения. В другом воплощении растворимость инсулина в композиции изобретения может быть определена просто при визуальном изучении контейнера, в котором содержится композиция. Инсулин является растворимым, если раствор визуально прозрачен и не содержит твердых частиц, и он не суспендирован и не преципитирован на боковой/нижней части контейнера.

Инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может иметь увеличенную силу и/или биодоступность по сравнению с родительским инсулином по данным измерений.

Стандартные анализы для измерения активности инсулина in vitro известны специалистам в данной области и, в частности, включают (1) радиоспектроанализы инсулина, в которых относительная активность инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимому для вытеснения 50% ¹²⁵I-инсулина, специфично связанного с рецепторами инсулина, представленными на клеточных мембранах, например на фракции плазматической мембраны печени крыс; (2) анализы липогенеза, выполняемые, например, с адипоцитами крыс, в которых относительная сила инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимому для достижения 50% от максимальной конверсии [3-³H]-глюкозы в извлекаемый органическими веществами материал (т.е. в липиды); (3) анализы окисления глюкозы в изолированных жировых клетках, в которых относительная активность аналога инсулина определяется как отношение инсулина к аналогу инсулина, необходимому для достижения 50% от максимальной конверсии глюкозо-1-[¹⁴С] в [¹⁴CO₂]; (4) радиоиммуноанализы инсулина, которые могут определить иммуногенность аналогов инсулина путем измерения эффективности, с которой инсулин или аналог инсулина конкурирует с ¹²⁵I-инсулином в связывании специфических антиинсулиновых антител; и (5) другие анализы, которые измеряют связывание инсулина или аналога инсулина с антителами в образцах плазмы крови животных, такие как ИФА, использующие специфические инсулиновые антитела.

Увеличение кажущейся активности in vivo может быть оценено/визуализировано путем сравнения уровней глюкозы в крови в зависимости от длительности действия при введении одинаковых доз инсулина данного случая и аналогичного инсулина без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций. Инсулин изобретения будет иметь усиленный эффект снижения уровня глюкозы в крови по сравнению со сравниваемым веществом.

Стандартные анализы для измерения биодоступности инсулина известны специалистам в данной области и включают, среди прочего, измерение относительной площади под кривой (AUC) для концентрации инсулина при внутрилегочном и внутривенном (i.v.) введении аналогичных видов. Количественное определение концентрации инсулина в образцах крови (плазмы) можно сделать, используя, например, анализ антител (ИФА) или масс-спектрометрию. Внутрилегочное введение можно выполнить несколькими способами. Например, инсулин можно дозировать крысам путем вливания по каплям, а свиньям путем вдувания сухого порошка.

Инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, возможно может быть проанализирован на предмет наличия других протеазных сайтов, которые могут быть объектами других замен одной или более гидрофобных аминокислот гидрофильными аминокислотами. Инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть аналогом инсулина, который имеет по меньшей мере две гидрофильные кислоты в протеазных сайтах по сравнению с родительским инсулином, первым модифицированным инсулином, и который также имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в новом протеазном сайте первого модифицированного инсулина, в котором по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота была заменена по меньшей мере одной гидрофильной аминокислотой.

Для удобства здесь приведены названия кодируемых природных аминокислот с обычным трехбуквенным кодом и однобуквенным кодом в скобках: глицин (Gly и G), пролин (Pro и Р), аланин (Ala и А), валин (Val и V), лейцин (Leu и L), изолейцин (Ile и I), метионин (Met и М), цистеин (Cys и С), фенилаланин (Phe и F), тирозин (Tyr и Y), триптофан (Trp и W), гистидин (His и Н), лизин (Lys и K), аргинин (Arg и R), глутамин (Gln и Q), аспарагин (Asn и N), глутаминовая кислота (Glu и Е), аспарагиновая кислота (Asp и D), серин (Ser и S) и треонин (Thr и Т). Если из-за опечатки возникают отклонения от наиболее часто используемых кодов, то применяются наиболее часто используемые коды. Аминокислоты, присутствующие в инсулинах данного изобретения, являются предпочтительно аминокислотами, которые могут быть закодированы нуклеиновой кислотой. В одном воплощении аминокислота в инсулине или аналоге инсулина замещается Gly, γGlu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg и/или Pro и/или к инсулину или аналогу инсулина добавляется Gly, γGlu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg и/или Pro. В одном воплощении аминокислота в инсулине или аналоге инсулина замещается γGlu, Asp, His, Gln, Asn, Lys и/или Arg и/или к инсулину или аналогу инсулина добавляется γGlu, Asp, His, Gln, Asn, Lys и/или Arg.

В одном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран из группы, состоящей из следующих соединений: А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B28D, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В1Е, В16Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26D, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B28D, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; A14D, В25Н, desB30 человеческий инсулин; B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В27Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин; В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; В1Е, В25Н, В27Е, desb30 человеческий инсулин; А8Н, В1Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А8Н, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; B25N, B27D, desB30 человеческий инсулин; А8Н, B25N, B27D, desB30 человеческий инсулин; В25Н, B27D, desB309 человеческий инсулин; А8Н, В25Н, B27D, desB30 человеческий инсулин; А(-1)Р, А(0)Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В(-1)Р, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А(-1)Р, А(0)Р, А14Е, В(-1)Р, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, ВЗОТ, B31L, В32Е человеческий инсулин; А14Е, В25Н человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В10Р, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В4Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Н, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Н, В10Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Н, А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В24Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18Q, A21Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18Q, A21Q, B3Q, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Н, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13N, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13N, А14Е, В1Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A(-2)G, A(-1)P, А(0)Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B(-2)G, B(-1)P, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A(-2)G, А(-1)Р, А(0)Р, А14Е, B(-2)G, B(-1)P, В(0)Р, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B27R, B28D, B29K, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27R, B28D, B29K, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В26Т, B27R, B28D, B29K, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18Q, B3Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Е, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А12Е, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А15Е, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А12Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А15Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26D, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27N, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27D, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27Q, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27K, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Р, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27S, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Т, desB30 человеческий инсулин; A13R, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13N, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13D, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13Q, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Е, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13G, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Н, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13K, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Р, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A13S, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А13Т, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B16R, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B16D, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B16Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A14R, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A14N, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A14D, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A14Q, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; A14G, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А8Н, B10D, В25Н человеческий инсулин; и А8Н, А14Е, В10Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин, и это воплощение возможно может содержать А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин; В25Н, desB30 человеческий инсулин; и B25N, desB30 человеческий инсулин.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран из группы, состоящей из следующих соединений: А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; В25Н, desB30 человеческий инсулин и А14Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран среди любых из приведенной выше группы, которые, кроме того, содержат мутацию desB27.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран из группы, состоящей из следующих соединений: А14Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB27, B29R, desB30 человеческий инсулин и В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран среди любых из приведенной выше группы, которые, кроме того, содержат следующие мутации в позиции А21 и/или В3 для повышения химической стабильности: A21G, desA21, B3Q или B3G.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, выбран среди следующих инсулинов, стабилизированных по отношению к протеазам: А14Е, A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин; A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин и A21G, B25N, desB30 человеческий инсулин, и предпочтительно он выбран среди следующих инсулинов, стабилизированных по отношению к протеазам: А14Е, A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В16Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин и A21G, B25N, desB30 человеческий инсулин.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, ацилирован в позиции В29, на эпсилон-азоте в позиции B29K.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, ацилирован в позиции А1, на альфа-азоте в позиции А1.

В предпочтительном воплощении инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, ацилирован в позиции А1, на альфа-азоте в позиции А1, и инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, содержит мутацию B29R.

Инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, продуцируются путем экспрессии последовательности ДНК, кодирующей инсулин данного случая, соответствующей принимающей клеткой (клеткой-хозяином) с помощью хорошо известной методики, раскрытой, например, в патенте США №6500645. Инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, экспрессируется либо непосредственно, либо в виде молекулы предшественника, которая имеет N-концевое удлинение В-цепи. Это N-концевое удлинение может иметь функцию увеличения выхода непосредственно экспрессированного продукта и может содержать до 15 аминокислотных остатков. N-концевое удлинение должно быть отщеплено in vitro после выделения из культуральной жидкости, и поэтому также имеет сайт расщепления рядом с В1. N-концевые удлинения такого типа, которые подходят для данного изобретения, раскрыты в патенте США №5395922, а также в Европейском патенте №765395А.

Полинуклеотидная последовательность, кодирующая соответствующий инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть получена синтетически с помощью установленных стандартных способов, например фосфорамидитным способом, описанным Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, или способом, описанным Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. В соответствии с фосфорамидитным способом олигонуклеотиды синтезируют, например в автоматическом ДНК-синтезаторе, очищают, соединяют в пару и лигируют для формирования синтетической ДНК-конструкции. В настоящее время предпочтительным путем получения ДНК-конструкции является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полинуклеотидные последовательности также могут быть смешанного происхождения: геномного, кДНК и синтетического. Например, геномная или кДНК последовательность, кодирующая лидерный пептид, может быть соединена с геномной или кДНК последовательностью, кодирующей А- и В-цепи, после чего ДНК-последовательность может быть модифицирована в сайте путем вставления синтетических олигонуклеотидов, кодирующих желаемую аминокислотную последовательность для гомологичной рекомбинации, в соответствии с хорошо известными процедурами, или предпочтительно путем образования желаемой последовательности с помощью ПЦР с использованием подходящих олигонуклеотидов.

В рекомбинантном способе обычно используется вектор, который способен к репликации в выбранном микроорганизме или принимающей клетке (клетке-хозяине), и который несет полинуклеотидную последовательность, кодирующую стабилизированный по отношению к протеазам инсулин. Рекомбинантный вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. существующим как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмидой, внехромосомным элементом, мини-хромосомой или искусственной хромосомой. Вектор может содержать какие-либо средства для обеспечения саморепликации. В альтернативном варианте вектор может быть таким, который при введении в принимающую клетку (клетку-хозяина) интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он был интегрирован. Кроме того, в геном принимающей клетки (клетки-хозяина) могут быть введены один вектор или плазмида или два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат тотальную ДНК, либо может быть использован транспозон. Вектор может быть линейной или замкнутой в круг плазмидой и предпочтительно содержит элемент(ы), который делает возможной стабильную интеграцию вектора в геном принимающей клетки или автономные репликации вектора в клетке независимо от генома.

Рекомбинантный вектор экспрессии способен к репликации в дрожжах. Примерами последовательностей, которые позволяют вектору реплицироваться в дрожжах, являются гены репликации REP 1-3 и репликатор (origin of replication) дрожжевой плазмиды 2 мкм.

Вектор может содержать один или более селектируемый маркер, который позволяет легко отбирать трансформированные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает биоцидную или вирусную резистентность, резистентность к тяжелым металлам, прототрофа к ауксотрофам и т.п. Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal от Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые наделяют резистентностью к антибиотикам, такой как резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Селектируемые маркеры для использования в принимающих клетках (клетках-хозяевах) нитчатых грибов включают amdS (ацетамидаза), argB (орнитинкарбамоилтрансфераза), pyrG (оротидин-5'-фосфат-декарбоксилаза) и trpC (антранилатсинтаза). Подходящими маркерами для дрожжевых принимающих клеток являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, МЕТ3, TRP1 и URA3. Хорошо подходящим селектируемым маркером для дрожжей является ген TPI от Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130).

В векторе полинуклеотидная последовательность функционально связана с подходящей промоторной последовательностью. Промотор может быть любой нуклеиновокислотной последовательностью, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной принимающей клетке, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные принимающей клетке.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в бактериальной принимающей клетке являются промоторы, полученные из lac-оперона E.coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA), гена левансукразы Bacillus subtilis (sacB), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) и гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP). Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией в принимающей клетке нитчатого гриба являются промоторы, полученные из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger. В дрожжевых принимающих клетках используют промоторы Ма1, TPI, ADH или PGK от Saccharomyces cerevisiae.

Полинуклеотидная последовательность, кодирующая инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, также обычно функционально связана с подходящим терминатором. В дрожжах подходящим терминатором является TPI-терминатор (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434).

Специалистам в данной области хорошо известны процедуры, которые используются для связывания полинуклеотидной последовательности, кодирующей стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, промотор и терминатор соответственно, и для вставления их в подходящий вектор, содержащий информацию, необходимую для репликации в выбранном хозяине. Необходимо понимать, что вектор может быть построен либо путем получения вначале ДНК-конструкции, содержащей всю последовательность ДНК, кодирующую инсулины данного изобретения, а затем вставления этого фрагмента в подходящий вектор экспрессии, либо путем последовательного вставления фрагментов ДНК, содержащих генетическую информацию об отдельных элементах (таких как сигнальный пептид, пропептид, связывающий пептид, А- и В-цепи), и затем лигирования.

Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, вводят в принимающую клетку так, что он функционирует как хромосомный компонент или как самореплицирующийся внехромосомный вектор. Термин «принимающая клетка (клетка-хозяин)» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, которые произошли во время репликации. Принимающая клетка может быть одноклеточным микроорганизмом, например прокариотом, или неодноклеточным микроорганизмом, например эукариотом. Используемыми одноклеточными организмами являются бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, в т.ч. клетка Bacillus, клетка Streptomyces, или грамотрицательные бактерии, такие как Е.coli и Pseudomonas sp., но не ограничиваются ими. Эукариотические клетки могут быть клетками млекопитающих, насекомых, растений или грибов. В одном воплощении принимающая клетка является дрожжевой клеткой. Дрожжевой организм может быть любым подходящим дрожжевым организмом, который при культивировании продуцирует большое количество одноцепочечного инсулина изобретения. Примерами подходящих дрожжевых организмов являются штаммы, выбранные среди видов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. и Geotrichum fermentans.

Трансформация дрожжевых клеток может осуществляться, например, путем формирования протопластов, а затем трансформации известным способом. Среда, используемая для культивирования клеток, может быть любой обычной средой, подходящей для выращивания дрожжевых организмов. Секретированный инсулин, значительная часть которого будет присутствовать в среде в правильно процессированной форме, может быть извлечен из среды с помощью обычных процедур, включая выделение дрожжевых клеток из среды путем центрифугирования, фильтрации или захвата предшественника инсулина ионообменной матрицей или матрицей абсорбции обратной фазы, осаждения белковых компонентов супернатанта или фильтрации с помощью соли, например сульфата аммония, а затем очищен с помощью различных хроматографических процедур, например с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п.

Предпочтительно ацилированные инсулины данного изобретения являются монозамещенными, имеющими только одну ацилирующую группу, присоединенную к аминокислотному остатку лизину в молекуле инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам.

В одном воплощении ацильная группировка, присоединенная к стабилизированному по отношению к протеазам инсулину, имеет общую формулу:

где n равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 3; m равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 10; p равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 10; Acy представляет собой жирную кислоту или жирную двухосновную кислоту, содержащую от примерно 8 до примерно 24 атомов углерода; АА1 представляет собой остаток нейтральной линейной или циклической аминокислоты; АА2 представляет собой остаток кислой аминокислоты; АА3 представляет собой остаток нейтральной аминокислоты, содержащей алкиленгликоль; порядок, в котором АА1, АА2 и АА3 появляются в формуле, можно менять независимо; АА2 может появляться в формуле несколько раз (например, Acy-АА2-АА3₂-АА2-); АА2 могут появляться в формуле независимо (= быть различными) несколько раз (например, Acy-АА2-АА3₂-АА2-); связи между Acy, АА1, АА2 и/или АА3 являются амидными (пептидными) связями, которые формально могут быть получены путем удаления атома водорода или гидроксильной группы (воды) из каждого Acy, АА1, АА2 и АА3; и присоединение к инсулину, стабилизированному по отношению к протеазам, может происходить с С-конца остатков АА1, АА2 или АА3 в ацильной группировке формулы (I) или со стороны одной из боковых цепей остатка АА2, находящегося в группировке формулы (I).

В другом воплощении ацильная группировка, присоединенная к стабилизированному по отношению к протеазам инсулину, имеет общую формулу:

A c y - A A 1_{n} - A A 2_{m} - A A 3_{p} - (I)

, где АА1 выбирают среди Gly, D- или L-Ala, βAla, 4-аминобутановой кислоты, 5-аминовалериановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты, D- или L-Glu-α-амида, D- или L-Glu-γ-амида, D- или L-Asp-α-амида, D- или L-Asp-β-амида или групп одной из следующих формул:

из которых атом водорода и/или гидроксильная группа были удалены, и где q равно 0, 1, 2, 3 или 4 и, в данном воплощении, АА1 может альтернативно быть 7-аминогептановой кислотой или 8-аминооктановой кислотой.

A c y - A A 1_{n} - A A 2_{m} - A A 3_{p} - (I)

, где АА1 определена выше, а АА2 выбрана среди L- или D-Glu, L- или D-Asp, L- или D-гомоGlu или любого из следующих соединений:

,

и

из которых был удален атом водорода и/или гидроксильная группа, и где стрелки показывают точку присоединения к аминогруппе АА1, АА2, АА3 или к аминогруппе инсулина, стабилизированного по отношению к протеазе.

В одном аспекте остаток нейтральной циклической аминокислоты, обозначенный АА1, представляет собой аминокислоту, содержащую насыщенное шестичленное карбоциклическое кольцо, возможно содержащее гетероатом азота, и предпочтительно кольцо является циклогексановым кольцом или пиперидиновым кольцом. Предпочтительно молекулярная масса этой нейтральной циклической аминокислоты находится в диапазоне от примерно 100 до примерно 200 Да.

Остаток кислой аминокислоты, обозначенный АА2, представляет собой аминокислоту с молекулярной массой до примерно 200 Да, содержащую две карбоксильные группы и одну первичную или вторичную аминогруппу. Альтернативно остаток кислой аминокислоты, обозначенный АА2, представляет собой аминокислоту с молекулярной массой до примерно 250 Да, содержащую одну карбоксильную группу и одну первичную или вторичную сульфаниламидную группу.

Остаток нейтральной аминокислоты, содержащей алкиленгликоль, обозначенный АА3, представляет собой алкиленгликольную группировку, возможно олиго- или полиалкиленгликольную группировку, содержащую функциональность карбоновой кислоты на одном конце и функциональность аминогруппы на другом конце.

В данном документе термин «алкиленгликольная группировка» охватывает моноалкиленгликольные группировки, а также олигоалкиленгликольные группировки. Моно- и олигоалкиленгликоли включают цепи, основанные на моно- и олигоэтиленгликоле, моно- и олигопропиленгликоле и моно- и олигобутиленгликоле, т.е. цепи, основанные на повторяющейся единице -CH₂CH₂O-, -CH₂CH₂CH₂O- или -CH₂CH₂CH₂CH₂O-. Алкиленгликольная группировка является монодисперсной (с хорошо известной длиной/молекулярным весом). Моноалкиленгликольные группировки включают -OCH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂CH₂O- или -OCH₂CH₂CH₂CH₂O-, содержащие различные группы на каждом конце.

Как уже упоминалось в данном документе, порядок, в котором АА1, АА2 и АА3 появляются в ацильной группировке с формулой (I) (Acy-AA1_n n-AA2_m-AA3_p-), может быть изменен независимо. Следовательно, формула Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-также охватывает такие группировки, как, например, формулы Acy-AA2_m-AA1_n-AA3_p-, формулы Acy-АА2-AA3_n-АА2- и формулы Acy-AA3_p-AA2_m-AA1_n-, где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p определены в данном документе.

Как уже упоминалось в данном документе, связи между группировками Acy, АА1, АА2 и/или АА3 формально получены посредством образования амидных связей (пептидных связей) (-CONH-) путем удаления воды из исходных соединений, из которых они формально построены. Это означает, что для того, чтобы получить полную формулу ацильной группировки с формулой (I) (Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-, где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p определены в данном документе), формально нужно взять соединения, данные под названиями Acy, АА1, АА2 и АА3, удалить из них водород и/или гидроксил и формально соединить полученные таким образом строительные блоки на полученных таким образом свободных концах.

Неограничивающими конкретными примерами ацильных группировок формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-, которые могут присутствовать в ацилированных аналогах инсулина данного изобретения, являются следующие:

Любой из вышеперечисленных не ограничивающих конкретных примеров ацильных группировок формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- может быть присоединен к эпсилон-аминогруппе остатка лизина, имеющейся в любом из вышеперечисленных не ограничивающих конкретных примеров аналогов инсулина, давая тем самым другие конкретные примеры ацилированных аналогов инсулина данного изобретения.

Любой из вышеперечисленных не ограничивающих конкретных примеров ацильных группировок формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- может быть присоединен к альфа-аминогруппе остатка А1, имеющейся в любом из вышеперечисленных не ограничивающих конкретных примеров аналогов инсулина, давая тем самым другие конкретные примеры ацилированных аналогов инсулина данного изобретения.

Инсулины, стабилизированные по отношению к протеазам, могут быть преобразованы в ацилированные стабилизированные по отношению к протеазам инсулины данного изобретения путем введением необходимой группы формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- в остаток лизина или в N-концевую позицию аналога инсулина. Необходимая группа формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- может быть введена любым удобным способом, и в данной области описано множество способов проведения таких реакций. В примерах данного документа есть более подробное описание.

В одном воплощении данное изобретение не связано с соединениями, описанными в ЕР 07114387.9, т.е. с ацилированными инсулинами, в которых ацильная группировка присоединена к родительскому инсулину, и где указанная ацильная группировка состоит из повторяющихся звеньев аминокислот, содержащих алкиленгликоль, и где в родительском инсулине есть только один остаток лизина (К & Lys).

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Ацилированные инсулины данного изобретения можно вводить подкожно, назально, перорально или внутрилегочно.

Для подкожного введения ацилированные инсулины данного изобретения составляют аналогично составам известных инсулинов. Кроме того, при подкожном введении ацилированные инсулины данного изобретения вводят аналогично введению известных инсулинов, и обычно врачи знакомы с этой процедурой.

Ацилированные инсулины данного изобретения могут быть введены путем вдыхания дозы, эффективной для увеличения уровня циркулирующего инсулина и/или для снижения уровня циркулирующей глюкозы. Такое введение может быть эффективным для лечения таких расстройств, как диабет или гипергликемия. Достижение эффективных доз инсулина требует введения вдыхаемой дозы более примерно 0,5 мкг/кг до 50 мкг/кг ацилированных инсулинов данного изобретения. Терапевтически эффективное количество может быть определено знающий врачом, который будет принимать во внимание различные факторы, включая уровень инсулина, уровни глюкозы в крови, физическое состояние пациента, легочный статус пациента и т.п.

Ацилированные инсулины данного изобретения могут быть доставлены путем ингаляции для достижения их медленной абсорбции и/или снижения системного клиренса. Различные устройства для ингаляции обычно обеспечивают похожую фармакокинетику при аналогичных размерах частиц и аналогичных уровнях легочной депозиции.

Ацилированные инсулины данного изобретения могут быть доставлены любым из различных устройств для ингаляции, известных в данной области для введения терапевтического агента при вдыхании. К таким устройствам относятся дозирующие ингаляторы, небулайзеры, генераторы сухого порошка, распылители и т.п. Предпочтительно эти ацилированные инсулины доставляют с помощью сухого порошкового ингалятора или распылителя. Существует несколько предпочтительных особенностей ингаляционного устройства для введения ацилированных инсулинов данного изобретения. Например, доставка с помощью ингаляционного устройства является выгодно надежной, воспроизводимой и точной. Ингаляционное устройство должно доставлять мелкие частицы или аэрозоли, т.е. размером менее 10 мкм, например примерно 1-5 мкм, для хорошей вдыхаемости. Некоторыми конкретными примерами коммерчески доступных ингаляционных устройств, подходящими для практического применения данного изобретения, являются Turbohaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), ингалятор Spiros™ (Dura), устройства, продаваемые компанией Inhale Therapeutics, AERx™ (Aradigm), небулайзер UltraVent® (Mallinckrodt), небулайзер Acorn II® (Marquest Medical Products), дозированный ингалятор Ventolin® (Glaxo), порошковый ингалятор Spinhaler® (Fisons) и т.п.

Специалисты в данной области признают, что состав ацилированных инсулинов данного изобретения, количество доставленного состава и продолжительность введения одной дозы зависят от типа используемого ингаляционного устройства. Для некоторых аэрозольных систем доставки, таких как небулайзеры, частота введения и время, в течение которого система активируется, будет зависеть главным образом от концентрации ацилированных инсулинов в аэрозоле. Например, при более высоких концентрациях ацилированных инсулинов в растворе для небулайзера могут быть использованы более короткие периоды введения. Такие устройства, как дозированные ингаляторы, могут производить более высокие концентрации аэрозоля и могут в более короткие сроки доставить необходимое количество ацилированных инсулинов. Такие устройства, как порошковые ингаляторы, доставляют активный агент до тех пор, пока данный заряд агента не будет вытеснен из устройства. В этом типе ингаляторов количество ацилированных инсулинов данного изобретения в данном количестве порошка определяет дозу, доставляемую при одном введении.

Размер частиц ацилированных инсулинов данного изобретения в составе, доставляемом ингаляционным устройством, является критическим для способности инсулина проникать в легкие, и предпочтительно в нижние дыхательные пути или альвеолы. Предпочтительно ацилированные инсулины данного изобретения собраны таким образом, чтобы по меньшей мере примерно 10% доставленного ацилированного инсулина осаждалось в легких, предпочтительно от примерно 10 до примерно 20% или более. Известно, что максимальную эффективность легочной депозиции при дыхании человека через рот получают при размере частиц от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм. Когда размеры частиц составляют более примерно 5 мкм, легочная депозиция существенно уменьшается. Размеры частиц менее примерно 1 мкм являются причиной уменьшения легочной депозиции, и становится трудным доставить частицы достаточной массы, чтобы она была терапевтически эффективной. Таким образом, частицы ацилированных инсулинов, доставляемых при ингаляции, имеют размер предпочтительно менее примерно 10 мкм, более предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм. Состав ацилированных инсулинов выбирают для получения желаемого размера частиц в выбранном ингаляционном устройстве.

Преимущественно для введения в виде сухого порошка ацилированный инсулин данного изобретения получают в дисперсной форме с размером частиц менее примерно 10 мкм, предпочтительно от примерно 1 до примерно 5 мкм. Предпочтительный размер частиц является эффективным для доставки в альвеолы легких пациента. Предпочтительно сухой порошок в основном состоит из частиц, полученных таким образом, что большинство частиц имеет размер в нужном диапазоне. Преимущественно по меньшей мере примерно 50% сухого порошка сделано из частиц диаметром менее примерно 10 мкм. Такие составы могут быть получены путем распылительной сушки, измельчения или конденсации в критической точке раствора, содержащего ацилированный инсулин данного изобретения и другие желаемые ингредиенты. В данной области известны и другие способы, также подходящие для создания частиц, используемых в данном изобретении.

Частицы, как правило, отделяются от сухого порошкового состава в контейнере, а затем переносятся в легкие пациента с помощью несущего воздушного потока. Как правило, в современных сухих порошковых ингаляторах сила для разрушения твердого вещества предоставляется исключительно при вдыхании пациента. В другом типе ингалятора воздушный поток, образованный вдыханием пациента, активирует лопастный двигатель, который вызывает деагломерацию частиц.

Составы ацилированных инсулинов данного изобретения для введения с помощью сухого порошкового ингалятора, как правило, включают мелкодисперсный сухой порошок, содержащий производное, но порошок может также включать наполнитель, носитель, эксципиент, другую добавку и т.п. Добавки могут быть включены в сухой порошковый состав ацилированного инсулина, например, для разбавления порошка, что необходимо для его доставления с помощью некоторых порошковых ингаляторов, для облегчения обработки состава, для придания выгодных свойств порошка составу, для облегчения дисперсии порошка из ингаляционного устройства, для стабилизации состава (например, антиоксиданты или буферы), для придания составу вкуса и т.п. Преимущественно добавка не влияет отрицательно на дыхательные пути пациента. Ацилированный инсулин может быть смешан с добавкой на молекулярном уровне, или твердый состав может включать частицы ацилированного инсулина, смешанные с частицами добавки или покрытые ими. Типичные добавки включают моно-, ди- и полисахариды; сахарные спирты и другие полиолы, такие как, например, лактоза, глюкоза, раффиноза, мелезитоза, лактит, мальтит, трегалоза, сахароза, маннит, крахмал или их комбинации; поверхностно-активные вещества, такие как сорбиты, дифосфатидилхолин, или лецитин; и т.п. Обычно добавка, такая как наполнитель, присутствует в количестве, эффективном для указанных выше целей, часто примерно в количестве от примерно 50% до примерно 90% от веса состава. В состав также могут быть включены дополнительные агенты, известные в данной области для состава с белком, таким как белок аналог инсулина.

Спрей, содержащий ацилированные инсулины данного изобретения, может быть получен путем проталкивания суспензии или раствора ацилированного инсулина через выпускное отверстие под давлением. Для достижения желаемого результата и размеров частиц может быть выбран размер выпускного отверстия и его конфигурация, приложенное давление и скорость подачи жидкости. Электрораспыление может быть получено, например, с помощью электрического поля, связанного с капилляром или выпускным отверстием. Преимущественно частицы конъюгата инсулина, доставляемые спреем, имеют размер менее примерно 10 мкм, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм.

Составы ацилированных инсулинов данного изобретения, подходящие для применения с распылителем, как правило, включают ацилированные инсулины в водном растворе с концентрацией от примерно 1 мг до примерно 500 мг ацилированного инсулина на 1 мл раствора. В зависимости от выбранного ацилированного инсулина и других факторов, известных медицинскому эксперту, верхний предел может быть ниже, например 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100 или 50 мг ацилированного инсулина на 1 мл раствора. Состав может содержать агенты, такие как эксципиент, буфер, изотонический агент, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Состав может также содержать эксципиент или агент для стабилизации ацилированного инсулина, такой как буфер, восстанавливающий агент, белок для увеличения объема или углевод. Белки для увеличения объема, используемые в составлении конъюгатов инсулина, включают альбумин, протамин и т.п. Типичные углеводы, используемые в составлении конъюгатов инсулина, включают сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, глюкозу и т.п. Препарат ацилированных инсулинов может также включать поверхностно-активное вещество, которое может уменьшить или предотвратить поверхностную индуцированную агрегацию конъюгата инсулина, вызванную распылением раствора при формировании аэрозоля. Могут быть использованы различные обычные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтиленовые спирты и эфиры жирных кислот, а также полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирных кислот. Количества находятся, как правило, в диапазоне от примерно 0,001 до примерно 4% от веса состава.

Фармацевтические композиции, содержащие ацилированный инсулин данного изобретения, могут также парентерально быть введены пациентам, нуждающимся в таком лечении. Парентеральное введение может осуществляться путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекций с помощью шприца или возможно с помощью ручки-шприца. Альтернативно парентеральное введение может быть выполнено с помощью инфузионного дозатора.

Инъекционные композиции ацилированных инсулинов данного изобретения могут быть изготовлены с использованием обычных методик фармацевтической промышленности, в которых используется растворение и смешивание ингредиентов по мере необходимости для получения желаемого конечного продукта. Так, в соответствии с одной процедурой ацилированный инсулин растворяют в количестве воды, которое несколько меньше, чем конечный объем композиции, который будет изготовлен. По мере необходимости добавляют цинк, изотонический агент, консервант и/или буфер и при необходимости корректируют значение рН раствора с помощью кислоты, например соляной кислоты, или с помощью основания, например водного раствора гидроксида натрия. В конце объем раствора доводят водой до получения желаемой концентрации ингредиентов.

В другом воплощении данного изобретения буфер выбирают из группы, содержащей ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат, глицилглицин, гистидин, глицин, лизин, аргинин, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, фосфат натрия и трис-(гидроксиметил)аминометан, бицин, трицин, яблочную кислоту, сукцинат, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, аспарагиновую кислоту или их смеси. Каждый из этих конкретных буферов представляет собой альтернативное воплощение данного изобретения.

В другом воплощении данного изобретения состав также содержит фармацевтически приемлемый консервант, который может быть выбран среди фенола, о-крезола, m-крезола, р-крезола, метил-р-гидробензоата, пропил-р-гидробензоата, 2-феноксиэтанола, бутил-р-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, хлорбутанола и тимеросала, бронопола, бензойной кислоты, имидуреи, хлоргексидина, натрия дегидроацетата, хлорокрезола, этил-р-гидроксибензоата, бензетония хлорида, хлорфенезина (3-(4-хлорфенокси)-1,2-пропандиола) или их смесей. В другом воплощении данного изобретения консервант присутствует в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения консервант присутствует в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения консервант присутствует в концентрации от примерно 5 мг/мл до 10 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения консервант присутствует в концентрации от примерно 10 мг/мл до 20 мг/мл. Каждый из этих конкретных консервантов представляет собой альтернативное воплощение данного изобретения. Специалистам хорошо известно применение консервантов в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

В другом воплощении данного изобретения состав также содержит изотонический агент, который может быть выбран среди солей (например, хлорид натрия), сахаров или сахарных спиртов, аминокислот (например, L-глицина, L-гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана или треонина), алдитола (например, глицерола (глицерина), 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола или 1,3-бутандиола), полиэтиленгликоля (например, ПЭГ400) или их смесей. Могут быть использованы любые сахара, такие как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые гликаны, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и натрий-карбоксиметилцеллюлозу. В одном воплощении сахарной добавкой является сахароза. Сахарный спирт определяется как С₄-С₈ углеводород, имеющий по меньшей мере одну ОН-группу, и представляет собой, например, маннит, сорбит, инозит, галактитол, дульцитол, ксилитол и арабитол. В одном воплощении сахароспиртовой добавкой является маннит. Сахара или сахарные спирты, упомянутые выше, могут использоваться по отдельности или в комбинации. Не существует фиксированного предела в их количестве, и они могут добавляться до тех пор, пока сахар или сахарный спирт растворяется в жидком препарате и не оказывает негативного воздействия на стабилизирующий эффект, который достигается использованием способов данного изобретения. В одном воплощении концентрация сахара или сахарного спирта составляет от примерно 1 мг/мл до примерно 150 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от примерно 1 мг/мл до 50 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от примерно 1 мг/мл до 7 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от примерно 8 мг/мл до 24 мг/мл. В другом воплощении данного изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от примерно 25 мг/мл до 50 мг/мл. Каждый из этих конкретных изотонических агентов представляет собой альтернативное воплощение данного изобретения. Специалистам хорошо известно использование изотонического агента в фармацевтических композициях. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^thedition, 1995.

Типичными изотоническими агентами являются хлорид натрия, маннит, диметилсульфон и глицерин, а типичными консервантами являются фенол, m-крезол, метил-р-гидроксибензоат и бензиловый спирт.

Примерами подходящих буферов являются ацетат натрия, глицилглицин, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) и фосфат натрия.

Композиция для назального введения ацилированных инсулинов данного изобретения может быть получена, например, как описано в Европейском патенте №272097.

Пероральные препараты, содержащие ацилированный инсулин данного изобретения, стабилизированный по отношению к протеазам, могут быть получены хорошо известным способом. Одним из способов создания препаратов, содержащих ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин данного изобретения, которые могут быть удобно введены перорально, является использование процедуры, которая аналогична описанной в WO 2008/145728.

Другим способом изготовления пероральных препаратов, содержащих ацилированный инсулин данного изобретения, стабилизированный по отношению к протеазам, является изготовление безводных жидких или полутвердых фармацевтических композиций, содержащих ацилированный инсулин данного изобретения, стабилизированный по отношению к протеазам (а), по меньшей мере один полярный органический растворитель (б) для ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, по меньшей мере один липофильный компонент (в), и возможно поверхностно-активное вещество (г) и/или по меньшей мере один твердый гидрофильный компонент (д). Они могут существовать в форме масляных растворов. Альтернативно по меньшей мере один твердый гидрофильный компонент (д) представляет собой по меньшей мере один твердый гидрофильный полимер. Альтернативно фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один твердый гидрофильный компонент, является свободным от поверхностно-активного вещества, где указанное поверхностно-активное вещество имеет значение HLB (гидрофильно-липофильного баланса) по меньшей мере 8, то есть в композиции нет поверхностно-активного вещества, которое имеет значение HLB по меньшей мере 8.

Например, фармацевтическая композиция, содержащая ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть безводным масляным раствором и/или фармацевтической композицией SEDDS (системой доставки лекарства, самостоятельно переходящей в эмульсию) или SMEDDS (системой доставки лекарства, самостоятельно переходящей в микроэмульсию).

Альтернативно указанная фармацевтическая композиция является системой доставки лекарства, самостоятельно переходящей в эмульсию (далее называемой SEDDS).

Считается, что высокая растворимость ацилированного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина в полярном органическом растворителе фармацевтической композиции, приводящая к сравнительно низкому общему количеству необходимого полярного органического растворителя в указанной фармацевтической композиции, может улучшить совместимость фармацевтической композиции с материалами капсулы.

Фармацевтическая композиция может содержать носитель, который включает липофильный компонент, поверхностно-активное вещество и полярный органический растворитель и возможно твердый гидрофильный компонент (д). Если твердый гидрофильный компонент присутствует, то по меньшей мере один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из липофильного компонента и поверхностно-активного вещества, является жидким и полутвердым. Если присутствует жидкий гидрофильный компонент (д), то и липофильный компонент, и поверхностно-активное вещество могут быть твердыми. Например, поверхностно-активное вещество может быть жидким или полутвердым. В одном аспекте присутствует твердый гидрофильный компонент.

Используемый в данном документе термин «носитель» относится к фармацевтически приемлемому носителю, который транспортирует терапевтически активный водорастворимый полипептид через биологическую мембрану или в биологической жидкости. Носитель включает липофильный компонент, полярный органический растворитель и возможно твердый гидрофильный компонент и/или поверхностно-активное вещество. Носитель способен к спонтанному образованию эмульсии или коллоидных структур, когда он в диспергированном или разведенном состоянии вступает в контакт с водной средой, например с водой, с жидкостями, содержащими воду, или in vivo со средами у млекопитающих, такими как желудочный сок желудочно-кишечного тракта. Коллоидные структуры могут быть твердыми или жидкими частицами, включая домены, капли, мицеллы, смешанные мицеллы, везикулы и наночастицы.

Например, когда фармацевтическая композиция вступает в контакт с водной средой, спонтанно формируется эмульсия, например микроэмульсия. В частности, эмульсия или микроэмульсия формируется в пищеварительном тракте млекопитающего при пероральной системе доставки. В дополнение к вышеупомянутым компонентам спонтанно диспергируемый предконцентрат возможно может также содержать другие эксципиенты, такие как буферы, регуляторы рН, стабилизаторы и другие адъюванты, знакомые специалистам в данной области в качестве подходящих для такого использования в фармацевтических целях.

Термин «безводный», используемый в данном документе, относится к композиции, в которую в процессе изготовления фармацевтической композиции не добавляют воду. Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, и/или один или более эксципиент в фармацевтической композиции может иметь небольшое количество воды, связанной с ним перед изготовлением фармацевтической композиции. Например, безводная фармацевтическая композиция содержит менее 10% (по весу) воды, например менее 5% (по весу) воды, например менее 4% (по весу) воды, например менее 3% (по весу) воды, например менее 2% (по весу) воды, например менее 1% (по весу) воды.

Используемый в данном документе термин «микроэмульсионный предконцентрат» означает композицию, которая спонтанно формирует микроэмульсию, например микроэмульсию масло/вода, в водной среде, например в воде или в желудочно-кишечной жидкости после перорального приема. Композиция самостоятельно эмульгируется при разведении в водной среде, например при разведении 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 и выше.

Благодаря высокой растворимости ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, общее количество полярного органического растворителя в SEDDS может быть низким, что, с одной стороны, улучшает совместимость состава с материалами капсулы, а с другой стороны, дает больше пространства для составления композиции.

Фармацевтическая композиция содержит липофильный компонент, а также органический полярный компонент. Компоненты системы доставки лекарств могут присутствовать в любом относительном количестве. Например, система доставки лекарства может содержать до 40% (по весу) полярного органического компонента от композиции носителя, например менее 30%, 20%, 15% или 10%. В другом аспекте система доставки лекарства содержит от 5% до 40% (по весу) полярного органического растворителя от общей композиции носителя. В другом аспекте система доставки лекарства содержит от 10% до 30% (по весу) полярного органического растворителя от общей композиции носителя.

Фармацевтическая композиция может быть в форме непорошковой композиции, т.е. в полутвердой или жидкой форме.

Используемый в данном документе термин «жидкий» означает компонент или композицию, которая находится в жидком состоянии при комнатной температуре («RT») и имеет температуру плавления, например, ниже 20°С. Используемый здесь термин «комнатная температура (RT)» означает приблизительно 20-25°С.

Используемый в данном документе термин «полутвердый» относится к компоненту или композиции, которая не является жидкой при комнатной температуре, например имеет температуру плавления в диапазоне от комнатной температуры до 40°С. Полутвердое вещество может иметь качества и/или признаки как твердого, так и жидкого состояния вещества. Используемый в данном документе термин «затвердеть» означает стать твердым или полутвердым.

Примерами полутвердых или жидких композиций являются фармацевтические композиции в форме, например, масел, растворов, жидких или полутвердых SMEDDS и жидких или полутвердых SEDDS.

«SMEDDS» (будучи аббревиатурой для систем доставки лекарства, самостоятельно переходящих в микроэмульсию) в данном документе обозначает изотропные смеси гидрофильного компонента, поверхностно-активного вещества, возможно вспомогательного поверхностно-активного вещества и лекарства, которые быстро формируют микроэмульсию масло/вода при взаимодействии с водными средами в условиях легкого перемешивания или пищеварительный моторики, которая может возникнуть в ЖКТ.

«SEDDS» (будучи аббревиатурой для систем доставки лекарства, самостоятельно переходящих в эмульсию) в данном документе обозначает смеси гидрофильного компонента, поверхностно-активного вещества, возможно вспомогательного поверхностно-активного вещества и лекарства, которые спонтанно формируют мелкозернистую эмульсию масло/вода при взаимодействии с водными средами в условиях легкого перемешивания или пищеварительный моторики, которая может возникнуть в ЖКТ.

Используемый в данном документе термин «микроэмульсия» относится к прозрачной или полупрозрачной, слегка мутной, опалесцирующей, не мутной или в значительной степени не мутной коллоидной дисперсии, которая формируется спонтанно или в значительной степени спонтанно, когда ее компоненты вступают в контакт с водной средой.

Используемый в данном документе термин «эмульсия» относится к слегка мутной, опалесцирующей или мутной коллоидной дисперсии, которая формируется спонтанно или в значительной степени спонтанно, когда ее компоненты вступают в контакт с водной средой.

Микроэмульсия является термодинамически стабильной и содержит однородные диспергированные частицы или домены, например в твердом или жидком состоянии (например, жидкие липидные частицы или капли) со средним диаметром менее примерно 500 нм, т.е. менее примерно 400 нм или менее 300 нм, менее 200 нм, менее 100 нм и более примерно 2-4 нм, измеренным с помощью стандартных методик с рассеянным светом, например с использованием MALVERN ZETASIZER Nano ZS. Термин «размер домена», используемый в данном документе, относится к повторяющимся рассеянным единицам, и этот размер может быть измерен, например, с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния. В одном аспекте размер домена составляет менее 400 нм, в другом аспекте менее 300 нм, а в еще одном аспекте менее 200 нм.

Используемый в данном документе термин «спонтанно диспергируемый», когда речь идет о предконцентрате, относится к композиции, которая способна производить коллоидные структуры, такие как микроэмульсии, эмульсии и другие коллоидные системы, при разбавлении водной средой, когда компоненты композиции вступают в контакт с водной средой, например при простом встряхивании руками в течение короткого периода времени, например в течение десяти секунд. В одном аспекте спонтанно диспергируемый концентрат в соответствии с изобретением представляет собой SEDDS или SMEDDS.

Используемый в данном документе термин «липофильный компонент» относится к веществу, материалу или ингредиенту, который является более совместимым с маслом, чем с водой. Материал с липофильными свойствами нерастворим или практически не растворим в воде, но легко растворим в масле или других неполярных растворителях. Термин «липофильный компонент» может подразумевать одно или более липофильное вещество. Множественные липофильные компоненты могут представлять собой липофильную фазу спонтанно диспергируемого предконцентрата и формировать масляную часть, например, в эмульсии масло/вода или в микроэмульсии. При комнатной температуре липофильный компонент и липофильная фаза спонтанно диспергируемого предконцентрата могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими. Например, твердый липофильный компонент может существовать в виде пасты, гранул, порошка или хлопьев. Если более чем один эксципиент содержит липофильный компонент, то липофильный компонент может быть смесью жидкостей, твердых веществ или и тех, и других.

В одном аспекте липофильный компонент присутствует в фармацевтической композиции в количестве по меньшей мере 20% по весу. В другом аспекте липофильный компонент присутствует в количестве по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% по весу. Например, липофильный компонент может присутствовать в количестве от примерно 5% до примерно 90% от веса композиции, например от примерно 15% до примерно 60%, например от примерно 20% до примерно 40%. Примеры твердых липофильных компонентов, т.е. липофильных компонентов, которые являются твердыми или полутвердыми при комнатной температуре, включают, но не ограничиваясь ими, следующие:

1. смеси моно-, ди- и триглицеридов, таких как гидрогенизированные кокоглицериды (температура плавления (m.p.) от примерно 33,5°С до примерно 37°С), коммерчески доступные под названием Witepsol HI5 от Sasol Germany (Виттен, Германия); Примеры триглицеридов жирных кислот, например триглицеридов жирных кислот С₁₀-С₂₂, включают природные и гидрогенизированных масла, такие как растительные масла;

2. сложные эфиры, такие как стеарат пропиленгликоля (ПГ), коммерчески доступный под названием MONOSTEOL (m.p. от примерно 33°С до примерно 36°С) от Gattefosse Corp. (Парамус, Нью-Джерси); пальмитостеарат диэтиленгликоля, коммерчески доступный под названием HYDRINE (m.p. от примерно 44,5°С до примерно 48,5°С) от Gattefosse Corp.;

3. полигликозилированные насыщенные глицериды, такие как ПЭГ-6 сложные эфиры гидрогенизированного пальмового/косточкового пальмового масла (m.p. от примерно 30,5°С до примерно 38°С), коммерчески доступные под названием LABRAFIL M2130 CS от Gattefosse Corp. или Gelucire 33/01;

4. жирные спирты, такие как миристиловый спирт (m.p. примерно 39°С), коммерчески доступный под названием LANETTE 14 от Cognis Corp. (Цинциннати, Огайо); сложные эфиры жирных кислот и жирных спиртов, например цетилпальмитат (m.p. примерно 50°С); изосорбида монолаурат, например коммерчески доступный под торговой маркой ARLAMOL ISML от Uniqema (Нью-Касл, Делавэр), например с температурой плавления примерно 43°С;

5. ПЭГ-эфир жирного спирта, в том числе полиоксиэтилен-2-цетиловый эфир, например коммерчески доступный под названием BRIJ 52 от Uniqema, имеющий температуру плавления примерно 33°С, или полиоксиэтилен-2-стеариловый эфир, например коммерчески доступный под названием Brij 72 от Uniqema с температурой плавления примерно 43°С;

6. сорбитановые сложные эфиры, например сорбитановые эфиры жирных кислот, например сорбитана монопальмитат или сорбитана моностеарат, например коммерчески доступные под названием SPAN 40 или SPAN 60 от Uniqema и имеющие температуру плавления от примерно 43°С до 48°С или от примерно 53°С до 57°С и от 41°С до 54°С соответственно; и

7. глицериновые сложные эфиры моно-С₆-С₁₄-жирных кислот. Их получают путем этерификации глицерина с растительным маслом, а затем молекулярной дистилляции. Моноглицериды включают, не ограничиваясь ими, как симметричные (т.е. β-моноглицериды), так и асимметричные моноглицериды (α-моноглицериды). Они также включают как однородные глицериды (в которых жирнокислотная составляющая состоит в основном из одной жирной кислоты), а также смешанные глицериды (т.е. в которых жирнокислотная составляющая состоит из различных жирных кислот). Жирнокислотная составляющая может включать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи, например, С₈-С₁₄. Особенно подходящими являются глицерина монолаурат, например коммерчески доступный под названием IMWITOR 312 от Sasol North America (Хьюстон, Техас), (m.p. примерно 56°С-60°С); глицерина моно/дикокоат, коммерчески доступный под названием IMWITOR 928 от Sasol (m.p. примерно 33°С-37°С); моноглицерина цитрат, коммерчески доступный под названием IMWITOR 370 (m.p. от примерно 59°С до примерно 63°С); или глицерина моностеарат, например коммерчески доступный под названием IMWITOR 900 от Sasol (m.p. примерно 56°С-61°С); или самостоятельно переходящий в эмульсию глицерина моностеарат, например коммерчески доступный под названием IMWITOR 960 от Sasol (m.p. примерно 56°С-61°С).

Примеры жидких липофильных компонентов, т.е. липофильных компонентов, которые являются жидкими при комнатной температуре, включают, но не ограничиваясь ими, следующие:

1. смеси моно-, ди- и триглицеридов, таких как среднецепочечные моно- и диглицериды, глицерилкаприлат/капрат, коммерчески доступный под названием CAPMUL MCM от Abitec Corp. (Колумбус, Огайо);

2. глицериновый эфир одно- или двухосновной жирной кислоты, например жирных кислот С₆-C₁₈, например C₆-C₁₆, например С₈-С₁₀, например С₈, или его ацетилированные производные, например MYVACET 9-45 или 9-08 от Eastman Chemical (Кингспорт, Теннеси) или IMWITOR 308 или 312 от Sasol;

3. пропиленгликолевый эфир одно- или двухосновной жирной кислоты, например жирных кислот С₈-С₂₀, например C₈-C₁₂, например LAUROGLYCOL 90, SEFSOL 218 или CAPRYOL 90 или CAPMUL PG-8 (то же, что пропиленгликолевый каприлат) от Abitec Corp.;

4. масла, такие как подсолнечное масло, кунжутное масло, миндальное масло, арахисовое масло, пальмовое масло, масло зародышей пшеницы, кукурузное масло, касторовое масло, кокосовое масло, хлопковое масло, соевое масло, оливковое масло и минеральное масло;

5. жирные кислоты или спирты, например С₈-С₂₀, насыщенные или моно- или диненасыщенные, например олеиновая кислота, олеиновый спирт, линолевая кислота, каприновая кислота, каприловая кислота, капроновая кислота, тетрадеканол, додеканол, деканол;

6. триглицериды среднецепочечных жирных кислот, например C₈-C₁₂, например MIGLYOL 812, или триглицериды длинноцепочечных жирных кислот, например растительные масла;

7. трансэтерифицированные этоксилированные растительные масла, например коммерчески доступное под названием LABRAFIL M2125 CS от Gattefosse Corp;

8. этерифицированные соединения жирных кислот и первичных спиртов, например жирных кислот С₈-C₂₀ и спиртов С₂-С₃, например этиллинолеат, например коммерчески доступный под названием NIKKOL VF-E от Nikko Chemicals (Токио, Япония), этилбутират, этилкаприлатолеиновая кислота, этилолеат, изопропилмиристат и этилкаприлат;

9. эфирные масла или любой класс эфирных масел, которые придают растениям их характерные запахи, такие как масло мяты, гвоздичное масло, лимонное масло и масло мяты перечной;

10. фракции или компоненты эфирных масел, такие как ментол, карвакрол и тимол;

11. синтетические масла, такие как триацетин, трибутирин;

12. триэтилцитрат, ацетилтриэтилцитрат, трибутилцитрат, ацетил трибутилцитрат;

13. полиглицериновые эфиры жирных кислот, например диглицерина моноолеат, например DGMO-C, DGMO-90, DGDO от Nikko Chemicals; и

14. сорбитановые сложные эфиры, например сорбитановые эфиры жирных кислот, например сорбитанмонолаурат, например коммерчески доступный под названием SPAN 20 от Uniqema.

15. Фосфолипиды, например алкил-O-фосфолипиды, диацилфосфатидные кислоты, диацилфосфатидилхолины, диацилфосфатидилэтаноламины, диацилфосфатидилглицерины, ди-O-алкилфосфатидные кислоты, L-альфа-лизофосфатидилхолины (LPC), L-альфа-лизофосфатидилэтаноламины (LPE), L-альфа-лизофосфатидилглицерин (LPG), L-альфа-лизофосфатидилинозиты (LPI), L-альфа-фосфатидные кислоты (РА), L-альфа-фосфатидилхолины (PC), L-альфа-фосфатидилэтаноламины (РЕ), L-альфа-фосфатидилглицерины (PG), кардиолипин (CL), L-альфа-фосфатидилинозиты (PI), L-альфа-фосфатидилсерины (PS), лизофосфатидилхолины, лизофосфатидилглицерины, sn-глицерофосфорилхолины, коммерчески доступные от LARODAN, или соевый фосфолипид (Lipoid S100), коммерчески доступный от Lipoid GmbH.

Например, липофильный компонент представляет собой одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из моно-, ди- и триглицеридов. В одном аспекте липофильный компонент является одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из моно- и диглицеридов. В еще одном аспекте липофильный компонент представляет собой Capmul MCM или Capmul PG-8. В еще одном аспекте липофильный компонент представляет собой Capmul PG-8.

Термин «полярный органический растворитель» относится в одном аспекте данного документа к «полярному протонному органическому растворителю», который является гидрофильным, смешиваемым с водой углерод-содержащим растворителем, который содержит ОН- или NH-связи, либо и те, и другие. Полярность отражается в диэлектрической постоянной или дипольном моменте растворителя. Полярность растворителя определяет, какой тип соединений он может растворить и с какими другими растворителями или жидкими соединениями он смешивается. Как правило, полярные органические растворители лучше всего растворяют полярные соединения, а неполярные растворители лучше всего растворяют неполярные соединения: «подобное растворяется в подобном». Сильно полярные соединения, такие как неорганические соли (например, хлорид натрия) растворяются только в сильно полярных растворителях.

Полярные органические растворители могут быть выбраны среди растворителей, в которых ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, демонстрирует лучшую растворимость, чем в других растворителях.

Следовательно, ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть растворен в высокой степени в безводном фармацевтически приемлемом полярном органическом растворителе, таком как пропиленгликоль, глицерин и ПЭГ200. Например, по меньшей мере 20% (по весу) ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, растворяется в безводном фармацевтически приемлемом полярном органическом растворителе, т.е. при добавлении 20% по весу ацилированного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина к полярному органическому растворителю получается прозрачный раствор. В другом аспекте по меньшей мере 25%, 30%, 40% или 50% (по весу) ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, растворяется в безводном фармацевтически приемлемом полярном органическом растворителе.

Полярный органический растворитель может, таким образом, относиться к гидрофильному, смешиваемому с водой углерод-содержащему растворителю, который содержит ОН- или NH-связи, или и те, и другие. Полярность отражается в диэлектрической постоянной или дипольном моменте растворителя. Полярность растворителя определяет, какой тип соединений он может растворить и с какими другими растворителями или жидкими соединениями он смешивается. Как правило, полярные органические растворители лучше всего растворяют полярные соединения, а неполярные растворители лучше всего растворяют неполярные соединения: «подобное растворяется в подобном». Сильно полярные соединения, такие как неорганические соли (например, хлорид натрия) растворяются только в сильно полярных растворителях.

Например, полярный органический растворитель является растворителем с диэлектрической постоянной выше 20, предпочтительно в диапазоне 20-50. Примеры различных полярных органических растворителей приведены в таблице 1 вместе с водой в качестве контроля.

Таблица 1
Диэлектрические постоянные (статической диэлектрической проницаемости) выбранных полярных органических растворителей и воды в качестве контроля (Справочник по химии и физике, CMC Press, диэлектрические постоянные измерены в статическом электрическом поле или на относительно низких частотах, при которых не происходит разрядка)
Растворитель (Температура, кельвины)	Диэлектрическая постоянная, ε*
Вода (293,2)	80,1
Пропантриол [глицерин] (293,2)	46,53
Этандиол [этиленгликоль] (293,2)	41,4
1,3-пропандиол (293,2)	35,1
Метанол (293,2)	33,0
1,4-бутандиол (293,2)	31,9
1,3- бутандиол (293,2)	28,8
1,2-пропандиол [пропиленгликоль] (303,2)	27,5
Этанол (293,2)	25,3
Изопропанол [2-пропанол, изопропиловый спирт] (293,2)	20,18

В данном контексте термины «1,2-пропандиол» и «пропиленгликоль» используются как взаимозаменяемые. В данном контексте термины «пропантриол» и «глицерин» используются как взаимозаменяемые. В данном контексте термины «этандиол» и «этиленгликоль» используются как взаимозаменяемые.

Например, полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из полиолов. Термин «полиол», используемый в данном документе, относится к химическим соединениям, содержащим множественные гидроксильные группы.

В одном аспекте полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из диолов и триолов. Термин «диол», используемый в данном документе, относится к химическим соединениям, содержащим две гидроксильные группы. Термин «триол», используемый в данном документе, относится к химическим соединениям, содержащим три гидроксильные группы.

Например, полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из глицерина (пропантриола), этандиола (этиленгликоля), 1,3-пропандиола, метанола, 1,4-бутандиола, 1,3-бутандиола, пропиленгликола (1,2-пропандиола), этанола и изопропанола или их смесей. В одной альтернативе полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из пропиленгликоля и глицерина. Глицерин является биосовместимым даже в высоких дозах и имеет высокую способность растворять ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам. Альтернативно полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из пропиленгликоля и этиленгликоля. Эти полярные органические растворители обладают низкой вязкостью, являются биосовместимыми в умеренных дозах и имеют очень высокую способность полярного органического растворителя для ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам.

Полярный органический растворитель предпочтительно должен быть высокой чистоты с низким содержанием, например, альдегидов, кетонов и других восстанавливающих примесей для минимизации химической деградации солюбилизированного полипептида в результате, например, реакции Майяра. К составам, содержащим полярные органические растворители, например полиолы, могут быть добавлены молекулы-«мусорщики», такие как глицилглицин и этилендиамин, для уменьшения деградации полипептида, в то время как антиоксиданты можно добавить для снижения темпов образования других восстанавливающих примесей.

В одном аспекте изобретения полярный органический растворитель присутствует в фармацевтической композиции в количестве 1-50% по весу, например 5-40% по весу, например 5-30% по весу. Альтернативно органический полярный растворитель присутствует в количестве 10-30% по весу, например 10-25% по весу, например в количестве примерно 20% по весу или примерно 15% по весу.

Например, полярный органический растворитель является пропиленгликолем и присутствует в фармацевтической композиции в количестве 1-50% по весу, например 5-40% по весу, например 10-30% по весу, например 10-25% по весу, например 10-20% по весу, например примерно 20% по весу или примерно 15% по весу.

Например, полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из глицерина, пропиленгликоля и их смесей.

Твердый гидрофильный компонент может быть добавлен к фармацевтической композиции для того, чтобы перевести или помочь перевести фармацевтическую композицию в твердое или полутвердое состояние при комнатной температуре. Гидрофильный компонент может содержать более одного эксципиента. Если гидрофильных компонент содержит более одного эксципиента, то он может быть смесью жидкостей, твердых веществ или и тех, и других.

Когда присутствует твердый гидрофильный компонент, фармацевтическая композиция может содержать от примерно 1% до примерно 25% по весу твердого гидрофильного компонента, например от примерно 2% до примерно 20%, например от примерно 3% до примерно 15%, например от примерно 4% до примерно 10%.

Примером гидрофильного компонента является ПЭГ, который представляет собой полимер оксида этилена, что обычно соответствует формуле Н(ОСН₂СН₂)_nOH, в которой n коррелирует со средней молекулярной массой полимера.

Типы ПЭГ, используемые в изготовлении фармацевтических композиций, могут быть классифицированы по их состоянию, т.е. находится ли вещество в твердой или жидкой форме при комнатной температуре и давлении. В данном документе термин «твердый ПЭГ» относится к ПЭГ с такой молекулярной массой, что вещество находится в твердом состоянии при комнатной температуре и давлении. Например, ПЭГ с молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 10000 является твердым ПЭГ. Такие ПЭГ включают, но не ограничиваясь ими, ПЭГ 1000, ПЭГ 1550, ПЭГ 2000, ПЭГ 3000, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000 или ПЭГ 8000. Особенно используемыми являются твердые ПЭГ с молекулярной массой между 1450 и 8000. Особенно используемыми в качестве твердых ПЭГ являются ПЭГ 1450, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000, ПЭГ 8000, их производные и смеси. ПЭГ различной молекулярной массы коммерчески доступны из серии CARBOWAX SENTRY от Dow Chemicals (Данбери, штат Коннектикут). Кроме того, также подходят твердые ПЭГ, которые имеют кристаллическую структуру или полимерную матрицу, полиэтиленоксид («ПЭО»), который имеет структуру, идентичную ПЭГ, но по длине цепи и концевым группам. Различные сорта ПЭО коммерчески доступны под названием POLYOX от Dow Chemicals. ПЭО, например, имеет молекулярную массу в диапазоне от примерно 100000 до 7000000. Гидрофильный компонент может содержать ПЭГ, ПЭО и любые комбинации вышеперечисленных веществ.

Гидрофильные компоненты возможно могут содержать низшие спирты, например этанол. Хотя использование этанола не является необходимым, оно может улучшить растворимость полипептида в носителе, улучшить характеристики хранения и/или уменьшить риск осаждения лекарства.

В альтернативном типичном аспекте гидрофильный компонент носителя состоит из одного гидрофильного компонента, например твердого ПЭГ, например ПЭГ 1450, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000 и ПЭГ 8000. В этом типичном аспекте гидрофильная фаза микроэмульсионного компонента состоит из одного гидрофильного вещества. Например, если носитель содержит ПЭГ 3350, он не будет содержать никаких других гидрофильных веществ, например низших спиртов (низших алкилов C₁-C₄), таких как этанол, или воду.

В еще одном альтернативном типичном аспекте гидрофильный компонент носителя состоит из смеси твердых ПЭГ. Например, гидрофильный компонент включает ПЭГ 1450, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000, ПЭГ 8000, их производные и любые комбинации и смеси.

В одном аспекте носитель содержит одно или более поверхностно-активное вещество, т.е. возможно смесь поверхностно-активных веществ; или поверхностно-активные вещества, которые уменьшают поверхностное натяжение. Поверхностно-активное вещество является, например, неионным, ионным или амфотерным. Поверхностно-активные вещества могут быть сложными смесями, содержащими побочные продукты или непрореагировавшие исходные продукты, участвующие в его изготовлении, например поверхностно-активные вещества, сделанные путем полиоксиэтилирования, могут содержать другой побочный продукт, например ПЭГ. Поверхностно-активное вещество или вещества имеют значение гидрофильно-липофильного баланса (HLB) не менее 8. Например, поверхностно-активное вещество может иметь среднее значение HLB 8-30, например 12-30, 12-20 или 13-15. Поверхностно-активные вещества в природе могут быть жидкими, полутвердыми или твердыми.

Термин «поверхностно-активное вещество», используемый в данном документе, относится к любому веществу, в частности к детергенту, которое может адсорбироваться на поверхностях и интерфазах, таких как жидкость/воздух, жидкость/жидкость, жидкость/контейнер или жидкость/любое твердое вещество. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано среди детергентов, таких как этоксилированное касторовое масло, полигликозилированные глицериды, ацетилированные моноглицериды, сорбитановые эфиры жирных кислот, полисорбаты, такие как полисорбат-20, полоксамеры, такие как полоксамер 188 и полоксамер 407, полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, производные полиоксиэтилена, такие как алкилированные и алкоксилированные производные («твины», например Tween-20 или Tween-40), моноглицериды или их этоксилированные производные, диглицериды или их полиоксиэтиленовые производные, глицерин, желчные кислоты или их производные, лецитины, спирты и фосфолипиды, глицерофосфолипиды (лецитины, цефалины, фосфатидилсерин), глицерогликолипиды (галактопиранозид), сфингофосфолипиды (сфингомиелин) и сфингогликолипиды (церамиды, ганглиозиды), DSS (докузат натрия, регистрационный номер CAS [577-11-7]), докузат кальция (регистрационный номер CAS [128-49-4]), докузат калия (регистрационный номер CAS [7491-09-0]), 3D3 (додецилсульфат натрия или лаурилсульфат натрия), дипальмитоилфосфатидная кислота, каприлат натрия, желчные кислоты, их соли и конъюгаты с глицином или таурином, урсодезоксихолевая кислота, холат натрия, дезоксихолат натрия, таурохолат натрия, гликохолат натрия, N-гексадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, анионные (алкил-арил-сульфонатные) моновалентные поверхностно-активные вещества, пальмитоил-лизофосфатидил-L-серин, лизофосфолипиды (например, 1-ацил-sn-глицеро-3-фосфатный эфир этаноламина, холина, серина или треонина), алкил-, алкоксил- (сложный алкиловый эфир), алкокси- (простой алкиловый эфир) производные лизофосфатидил- и фосфатидилхолинов, например лауроиловые и миристоиловые производные лизофосфатидилхолина, дипальмитоил-фосфатидилхолина, и с модификациями в полярных концевых группах, то есть в холине, этаноламине, фосфатидной кислоте, серине, треонине, глицерине, инозите, и положительно заряженные DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилтреонин, цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества (например, N-алкил-N,N-диметиламмонио-1-пропансульфонаты, 3-холамидо-1-пропилдиметиламмонио-1-пропансульфонат, додецилфосфохолин, миристоил-лизофосфатидилхолин, лизолецитин куриных яиц), катионные поверхностно-активные вещества (основания четвертичного аммония) (например, бромид цетилтриметиламмония, хлорид цетилпиридиния), неионные поверхностно-активные вещества (например, алкилгликозиды, такие как додецил-β-D-глюкопиранозид, додецил-β-D-мальтозид, тетрадецил-β-D-глюкопиранозид, децил-β-D-мальтозид, додецил-β-D-мальтозид, тетрадецил-β-D-мальтозид, гексадецил-β-D-мальтозид, децил-β-D-мальтотриозид, додецил-β-D-мальтотриозид, тетрадецил-β-D-мальтотриозид, гексадецил-β-D-мальтотриозид, n-додецил-сахароза, n-децил-сахароза, этоксилаты жирных спиртов (например, эфиры полиоксиэтиленакилов, такие как тридециловый моноэфир октаэтиленгликоля, додециловый моноэфир октаэтиленгликоля, тетрадециловый моноэфир октаэтиленгликоля), блок-сополимеры, такие как блок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида (Pluronics/Tetronics, Тритон Х-100), поверхностно-активные вещества этоксилированные сорбитановые алканоаты (например, Tween-40, Tween-80 и Brij-35), производные фузидиевой кислоты (например, натрия тауродигидрофузидат и т.д.), длинноцепочечные жирные кислоты и их соли С8-С20 (например, олеиновая кислота и каприловая кислота), ацилкарнитины и их производные, N-ацилированные производные лизина, аргинина или гистидина или производные лизина или аргинина с ацилированной боковой цепью, N-ацилированные производные дипептидов, содержащие любую комбинацию лизина, аргинина или гистидина и нейтральной или кислой аминокислоты, N-ацилированные производные трипептида, содержащие любую комбинацию нейтральной аминокислоты и двух заряженных аминокислот, или поверхностно-активное вещество может быть выбрано из группы имидазолиновых производных или их смеси.

Примерами твердых поверхностно-активных веществ являются, не ограничиваясь ими,

1. продукты реакции природного или гидрогенизированного касторового масла и оксида этилена. Природное или гидрогенизированное касторовое масло может реагировать с оксидом этилена в молярном соотношении от примерно 1:35 до примерно 1:60 с возможным удалением ПЭГ-компонента из продуктов. Различные такие поверхностно-активные вещества коммерчески доступны, например из серии CREMOPHOR от BASF Corp. (Маунт Олив, Нью-Джерси), такие как CREMOPHOR RH 40, который является ПЭГ40 гидрогенизированным касторовым маслом, которое имеет тело омыления примерно 50-60, кислотное число меньше примерно одного, содержание воды при титровании по Фишеру менее примерно 2%, n_D ⁶⁰ примерно 1,453-1,457, a HLB примерно 14-16;

2. полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот, которые включают полиоксиэтиленовые эфиры стеариновой кислоты, такие как серия MYRJ от Uniqema, например MYRJ 53 с m.p. примерно 47°С.

Отдельными соединениями из серии MYRJ являются, например, MYRJ 53 с m.p. примерно 47°С и ПЭГ-40-стеарат, доступный под названием MYRJ 52;

3. производные сорбитана, которые включают серию TWEEN от Uniqema, например TWEEN 60;

4. сополимеры и блок-сополимеры или полоксамеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, например Pluronic F127, Pluronic F68 от BASF;

5. эфиры полиоксиэтиленалкилов, например такие как полиоксиэтиленгликолевые эфиры С₁₂-С₁₈-спиртов, например полиоксил-10- или 20-цетиловый эфир, или полиоксил-23-лауриловый эфир, или 20-олеиловый эфир, или полиоксил-10-, 20- или 100-стеариловый эфир, известный и коммерчески доступный под серией BRIJ от Uniqema. В частности, используемыми продуктами из серии BRIJ являются BRIJ 58; BRIJ 76; BRIJ 78; BRIJ 35, т.е. полиоксил-23-лауриловый эфир; и BRIJ 98, т.е. полиоксил-20-олеиловый эфир. Эти продукты имеют m.p. в диапазоне от примерно 32°С до примерно 43°С;

6. водорастворимые токоферил-ПЭГ-эфиры янтарной кислоты, доступные от Eastman Chemical Co., с m.p. примерно 36°С, например TPGS, например витамин Е TPGS.

7. ПЭГ-эфиры стеролов, имеющие, например, 5-35 [СН₂-СН,-O] звеньев, например 20-30 звеньев, например SOLULAN C24 (Choleth-24 и Cetheth-24) от Chemron (Пасо Роблес, Калифорния); аналогичные продукты, которые также могут быть использованы, известны и коммерчески доступны под названием NIKKOL BPS-30 (полиэтоксилированный фитостерол 30) и NIKKOL BPSH-25 (полиэтоксилированный фитостанол 25) от Nikko Chemicals;

8. полиглицериновые эфиры жирных кислот, например имеющие от 4 до 10 глицериновых звеньев, или 4, 6 или 10 глицериновых звеньев. Например, особенно подходящим является дека-/гекса-/тетраглицерилмоностеарат, например DECAGLYN, HEXAGLYN и TETRAGLYN от Nikko Chemicals;

9. простые или сложные эфиры алкиленполиолов, например лауроилмакрогол-32-глицериды и/или стеароилмакрогол-32 глицериды, которые представляют собой GELUCIRE 44/14 и GELUCIRE 50/13 соответственно;

10. полиоксиэтиленовые моноэфиры насыщенных C₁₀-C₂₂, таких как d₁₈, замещенных, например гидрокси-жирных, кислот; например ПЭГ-эфир 12-гидрокси-стеариновой кислоты, например с ПЭГ молекулярной массы примерно 600-900, например 660, Дальтон, например SOLUTOL HS 15 от BASF (Людвигсхафен, 20, Германия). В соответствии с технической листовкой MEF 151E (1986) от BASF, SOLUTOL HS 15 содержит примерно 70% по весу полиэтоксилированного 12-гидроксистеарата и примерно 30% по весу неэтерифицированного полиэтиленгликольного компонента. Его значение гидрирования составляет от 90 до 110, тело омыления от 53 до 63, кислотное число не более 1, а максимальное содержание воды 0,5% по весу;

11. полиоксиэтилен-полиоксипропилен-алкиловые эфиры, например полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые эфиры спиртов C₁₂-C₁₈, например полиоксиэтилен-20-полиоксипропилен-4-цетилэфир, коммерчески доступный под названием NIKKOL PBC 34 от Nikko Chemicals;

12. полиэтоксилированные дистеараты, например коммерчески доступные под торговыми наименованиями ATLAS G 1821 от Uniqema и NIKKOCDS-6000P от Nikko Chemicals; и

13. лецитины, например фосфолипиды сои, например коммерчески доступные под названием LIPOID S75 от Lipoid GmbH (Людвигсхафен, Германия), или яичные фосфолипиды, коммерчески доступные под названием PHOSPHOLIPON 90 от Nattermann Phospholipid (Кельн, Германия).

Примеры жидких поверхностно-активных веществ включают, не ограничиваясь ими, производные сорбитана, такие как TWEEN 20, TWEEN 40 и TWEEN 80, SYNPERONIC L44, и полиоксил-10-олеиловый эфир, все они коммерчески доступны от Uniqema, и полиоксиэтилен-содержащие поверхностно-активные вещества, например ПЭГ-8 глицериды каприловой/каприновой кислоты (например, Labrasol, доступный от Gattefosse).

Композиция изобретения может содержать от примерно 0% до примерно 95% по весу поверхностно-активного вещества, например от примерно 5% до примерно 80% по весу, например от примерно 10% до примерно 70% по весу, например от примерно 20% до примерно 60% по весу, например от примерно 30% до примерно 50%.

В одном аспекте поверхностно-активные вещества являются сополимерами и блок-сополимерами или полоксамерами полиоксиэтилена и полиоксипропилена, например Pluronic F127, Pluronic F68 от BASF.

В одном аспекте поверхностно-активное вещество является полоксамером. В другом аспекте поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полоксамера 188, полоксамера 407 и смеси полоксамера 407 и полоксамера 188.

В одном аспекте поверхностно-активное вещество является поверхностно-активным веществом, содержащим полиоксиэтилен, например ПЭГ-8-глицеридом каприловой/каприновой кислоты (например, Labrasol, доступный от Gattefosse).

В одном аспекте поверхностно-активное вещество является лауроилполиоксиглицеридом (например, Gelucire 44/14, доступным от Gattefosse).

В одном аспекте поверхностно-активное вещество представляет собой Cremophor RH40 от BASF.

В некоторых аспектах фармацевтическая композиция может содержать дополнительные эксципиенты, обычно встречающиеся в фармацевтических композициях, примеры таких эксципиентов включают, но не ограничиваясь ими, антиоксиданты, антимикробные агенты, ингибиторы ферментов, стабилизаторы, консерванты, ароматизаторы, подсластители и другие компоненты, описанные в руководстве Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., Eds., 4'h Edition, Pharmaceutical Press (2003), которое включено в данный документ посредством ссылки.

Эти дополнительные эксципиенты могут находиться в количестве примерно 0,05-5% от веса всей фармацевтической композиции. На антиоксиданты, антимикробные агенты, ингибиторы ферментов, стабилизаторы или консерванты обычно приходится примерно до 0,05-1% от веса всей фармацевтической композиции. На подсластители или ароматизаторы обычно приходится примерно до 2,5% или до 5% от веса всей фармацевтической композиции.

Примеры антиоксидантов включают, но не ограничиваясь ими, аскорбиновую кислоту и ее производные, токоферол и его производные, бутилгидроксианизол и бутилгидрокситолуен.

В одном аспекте композиция содержит буфер. Термин «буфер», используемый в данном документе, относится к химическому соединению в фармацевтической композиции, которое снижает склонность рН композиции меняться с течением времени, что происходит в противном случае в результате химических реакций. Буферы содержат химические вещества, такие как фосфат натрия, TRIS, глицин и цитрат натрия.

Термин «консервант», используемый в данном документе, относится к химическому соединению, которое добавляют к фармацевтической композиции для предотвращения или задержки микробной активности (роста и метаболизма). Примерами фармацевтически приемлемых консервантов являются фенол, m-крезол и смесь фенола и m-крезола.

Термин «стабилизатор», используемый в данном документе, относится к химическим веществам, которые добавляют к пептид-содержащим фармацевтическим композициям для стабилизации пептида, т.е. для увеличения срока хранения и/или времени использования таких композиций. Примерами стабилизаторов, используемых в фармацевтических составах, являются L-глицин, L-гистидин, аргинин, глицилглицин, этилендиамин, цитрат, ЭДТА, цинк, натрия хлорид, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза и поверхностно-активные вещества и антиоксиданты, такие как альфа-токоферол и L-аскорбиновая кислота.

В другом аспекте процесс изготовления фармацевтической композиции, содержащей ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, включает этапы приведения лекарства и носителя, содержащего полярный органический растворитель, липофильный компонент и возможно поверхностно-активное вещество и/или гидрофильный компонент, в однородную смесь. Например, ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин и носитель могут быть сжижены, например путем нагревания до примерно 20-80°С, а затем переведены в твердое состояние путем охлаждения до комнатной температуры.

Носитель может быть изготовлен отдельно до приведения носителя, содержащего полярный органический растворитель, липофильный компонент и возможно поверхностно-активное вещество и/или гидрофильный компонент, в однородную смесь с пептидом - производным инсулина. Альтернативно один, два или более компонентов носителя могут быть смешаны с полипептидом.

Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть растворен в полярном органическом растворителе, а затем смешан с липидным компонентом и, возможно, с поверхностно-активным веществом.

Альтернативно процесс изготовления фармацевтической композиции, такой как SEDDS или SMEDDS (которой можно заполнить капсулы, например капсулы с энтеропокрытием, мягкие капсулы, мягкие энтеральные капсулы), содержащей ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, включает следующие этапы:

(а) растворение пептида - производного инсулина - в полярном органическом растворителе и

(б) смешивание с липофильным компонентом, поверхностно-активным веществом и возможно гидрофильным компонентом.

Например, процесс изготовления фармацевтической композиции осуществляется при низкой температуре (например, при комнатной температуре или при температуре ниже комнатной).

При изготовлении фармацевтической композиции ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может быть, например, растворен в полярном органическом растворителе с помощью следующих способов:

а) предоставление водного раствора ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, возможно содержащего эксципиенты,

б) подведение рН до целевого значения рН, которое на 1, альтернативно на 2 и альтернативно на 2,5 единицы выше или ниже pl ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам,

в) удаление воды (дегидратация) из ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, путем обычных высушивающих технологий, таких как лиофилизация (сушка замораживанием) и сушка распылением, и

г) смешивание и растворение ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, в указанном полярном неводном растворителе, например путем взбалтывания, переворачивания или с помощью других способов перемешивания,

д) возможно фильтрация или центрифугирование неводного раствора ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, для удаления нерастворенных неорганических солей,

е) возможно удаление остаточного количества воды с помощью, например, добавления твердых влагопоглотителей или путем вакуумной сушки.

Например, инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, растворяют в полярном органическом растворителе следующим способом:

а) предоставление водного раствора ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, возможно содержащего стабилизаторы, такие как цинк и глицилглицин,

б) подведение рН до целевого значения рН, которое на 1, альтернативно на 2 и альтернативно на 2,5 единицы выше или ниже pl полипептида, например путем добавления к раствору нелетучего основания или кислоты, такого как соляная кислота или гидроксид натрия,

в) удаление воды (дегидратация) из ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, путем обычных высушивающих технологий, таких как лиофилизация (сушка замораживанием) и сушка распылением,

Под «летучим основанием» понимается основание, которое в некоторой степени будет испаряться при нагревании и/или при понижении давления, например основание, давление пара которого выше 65 Па при комнатной температуре, или водная азеотропная смесь, содержащая основание с давлением пара выше 65 Па при комнатной температуре. Примерами летучих оснований являются гидроксиды аммония, гидроксиды тетраалкиламмония, вторичные амины, третичные амины, ариламины, алифатические амины или бикарбонат аммония или их комбинация. Например, летучее основание может быть бикарбонатом, карбонатом, аммиаком, гидразином или органическим основанием, таким как низшие алифатические амины, например триметиламин, триэтиламин, диэтаноламины, триэтаноламин и их соли. Кроме того, летучее основание может быть гидроксидом аммония, этиламином или метиламином или их комбинацией.

Под «летучей кислотой» понимается кислота, которая в некоторой степени будет испаряться при нагревании и/или при понижении давления, например кислота, давление пара которой выше 65 Па при комнатной температуре, или водная азеотропная смесь, содержащая кислоту с давлением пара выше 65 Па при комнатной температуре. Примерами летучих кислот являются угольная кислота, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота.

Под «нелетучим основанием», упомянутым в данном документе, понимается основание, которое не испаряется или лишь частично испаряется при нагревании, например основание с давлением пара ниже 65 Па при комнатной температуре. Нелетучее основание может быть выбрано из группы, состоящей из солей щелочных металлов, гидроксидов щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов, гидроксидов щелочноземельных металлов и аминокислот или их комбинации. Примерами нелетучих оснований являются гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция и оксид кальция.

Под «нелетучей кислотой», упомянутой в данном документе, понимается кислота, которая не испаряется или лишь частично испаряется при нагревании, например кислота с давлением пара ниже 65 Па при комнатной температуре. Примерами нелетучих кислот являются соляная кислота, фосфорная кислота и серная кислота.

Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, может присутствовать в количестве до примерно 40%, таком как до примерно 20% от веса композиции, или от примерно 0,01%, таком как от примерно 0,1%, альтернативно от примерно 0,01% до примерно 20%, альтернативно от примерно 1% до 20% или от примерно 1% до 10% от веса композиции. Планируется, тем не менее, что выбор того или иного уровня полипептида будет производиться в соответствии с факторами, хорошо известными в фармацевтической области, включая растворимость полипептида в полярном органическом растворителе или возможно используемый гидрофильный компонент или поверхностно-активное вещество или их смесь, способ введения, размеры и состояние пациента.

Например, фармацевтическая композиция содержит ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, в концентрации от 0,1% по весу до 30% по весу.

Каждая единичная доза будет соответственно содержать от 0,1 мг до 300 мг полипептида - ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам - например, примерно 0,1 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг, 25 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, например в диапазоне от 5 мг до 300 мг ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам. Например, каждая единичная доза содержит от 10 мг до 300 мг, например от 10 мг до 100 мг или от 20 мг до 300 мг, например от 20 мг до 100 мг ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам. Такие единичные лекарственные формы подходят для введения 1-5 раз в день в зависимости от той или иной цели терапии.

Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, перед растворением в полярном органическом растворителе рН-оптимизируют для улучшения растворимости в полярном органическом растворителе.

При использовании термина «рН-оптимизированный» подразумевают, что ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, был дегидратирован до целевого рН, который по меньшей мере на 1 рН единицу отличается от pl ацилированного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина в водном растворе. Таким образом, целевой рН более чем на 1 рН единицу выше изоэлектрической точки ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам. Альтернативно целевой рН более чем на 1 рН единицу ниже изоэлектрической точки ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам. Следовательно, целевой рН может быть более чем на 1,5 рН единицы выше или ниже pl, например на 2,0 или больше рН единицы выше или ниже pl, например на 2,5 или больше рН единицы выше или ниже pl ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам.

Термин «дегидратированный», используемый здесь в связи с ацилированным инсулином, стабилизированным по отношению к протеазам, относится к производному ацилированному инсулину, стабилизированному по отношению к протеазам, который был высушен из водного раствора. Термин «целевой рН», используемый в данном документе, относится к водному рН, который будет установлен, когда дегидратированный ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, регидратируют в чистой воде до концентрации примерно 40 мг/мл или более. Целевой рН, как правило, будет совпадать с рН водного раствора ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, из которого ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, был выделен путем сушки. Тем не менее, рН раствора ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, не будет совпадать с целевым рН, если раствор содержит летучие кислоты или основания. Было установлено, что рН-история ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, будет определяющей для количества ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, которое может быть растворено в полярном органическом растворителе.

Термин «pl полипептида», используемый в данном документе, относится к изоэлектрической точке полипептида.

Термин «изоэлектрическая точка», используемый в данном документе, обозначает рН, где суммарный заряд макромолекулы, такой как пептид, равен нулю. В пептидах может быть несколько заряженных групп, и изоэлектрическая сумма всех этих зарядов равна нулю. При рН выше изоэлектрической точки суммарный заряд пептида будет отрицательным, тогда как при значениях рН ниже изоэлектрической точки общий суммарный заряд пептида будет положительным.

pl белка может быть определена экспериментально с помощью методик электрофореза, таких как электрофокусирование:

Градиент рН устанавливают в антиконвекционной среде, такой как полиакриламидный гель. Когда белок вводят в систему, он перемещается под действием электрического поля, приложенного через гель. Положительно заряженные белки мигрируют к катоду. В конце концов, мигрирующий белок достигает точки градиента рН, в которой суммарный электрический заряд равен нулю и считается сфокусированным. Это изоэлектрический рН (pl) белка. Белок затем фиксируют на геле и окрашивают pl белка можно определить путем сравнения положения белка на геле относительно маркерных молекул с известными значениями pl.

Суммарный заряд белка при данном значении рН специалист в данной области может оценить теоретически обычными способами. В сущности, суммарный заряд белка эквивалентен сумме дробных зарядов заряженных аминокислот в белке: аспартата (β-карбоксильная группа), глутамата (δ-карбоксильная группа), цистеина (тиоловая группа), тирозина (феноловая группа), гистидина (имидазольные боковые цепи), лизина (ε-аммонийная группа) и аргинина (гуанидиновая группа). Кроме того, следует также принимать во внимание заряд белковых концевых групп (α-NH₂ и α-СООН). Дробный заряд ионизируемых групп можно рассчитать из известных значений рКа.

Сушка, т.е. дегидратация ацилированного инсулина, стабилизированного по отношению к протеазам, может быть выполнена любым известным способом сушки, например путем сушки распылением, замораживанием, вакуумной, открытой и контактной сушки. Например, ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, высушивают распылением, чтобы получить содержание воды примерно на 10% ниже, например примерно на 8% ниже, примерно на 6% ниже, примерно на 5% ниже, примерно на 4% ниже, примерно на 3% ниже, примерно на 2% ниже или примерно на 1% ниже, рассчитанное/измеренное как потеря при испытании высушиванием (гравиметрическом), как указано в экспериментальной части.

Например, ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, получен путем сушки распылением или замораживанием.

Композиции, содержащие ацилированные инсулины данного изобретения, стабилизированные по отношению к протеазам, могут быть использованы в лечении состояний, чувствительных к инсулину. Таким образом, они могут быть использованы в лечении сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа и гипергликемии, например иногда наблюдаемой у серьезно пострадавших лиц и лиц, перенесших серьезную операцию. Оптимальная доза для любого пациента будет зависеть от ряда факторов, включая эффективность используемого конкретного инсулинового производного, возраст, массу тела, физическую активность и диету пациента, от возможной комбинации с другими лекарствами и от тяжести состояния, от которого лечат. Специалист в данной области для каждого конкретного пациента определяет рекомендуемую суточную дозу ацилированного инсулина данного изобретения таким же образом, как для известных инсулиновых композиций.

Предпочтительные особенности данного изобретения

Особенностями данного изобретения являются следующие:

1. Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулин формально состоит из не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), в котором по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота была заменена гидрофильными аминокислотами, и где указанная замена находится в пределах или в непосредственной близости к одному или более сайтам для расщепления протеазой не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), и где такой инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию при условии, что в стабилизированном инсулине есть только один остаток лизина, и где ацильная группировка присоединена к остатку лизина или в N-концевую позицию в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине.

2. Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулин формально состоит из не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты были заменены гидрофильными аминокислотами, и где указанные замены находятся в пределах или в непосредственной близости к двум или более сайтам для расщепления протеазой не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), и где такой инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию при условии, что в стабилизированном инсулине есть только один остаток лизина, и где ацильная группировка присоединена к остатку лизина в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине.

3. Ацилированный инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулин формально состоит из не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), в котором по меньшей мере две гидрофобные аминокислоты были заменены гидрофильными аминокислотами, и где указанные замены находятся в пределах или в непосредственной близости к двум или более сайтам для расщепления протеазой не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), и где такой инсулин, стабилизированный по отношению к протеазам, возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию при условии, что в стабилизированном инсулине есть только один остаток лизина, и где ацильная группировка присоединена к остатку лизина или в N-концевую позицию в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине.

4. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулин имеет увеличенную растворимость по сравнению с ацилированным родительским инсулином.

5. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором В-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином.

6. Ацилированный инсулин по предыдущему положению в максимально возможной степени, в котором В-цепь инсулина содержит одну, две или три, но не больше, мутаций по сравнению с родительским инсулином.

7. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором А-цепь стабилизированного по отношению к протеазам инсулина идентична А-цепи человеческого инсулина.

8. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором А-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и В-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином.

9. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором А-цепь инсулина содержит по меньшей мере две мутации, а В-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином.

10. Ацилированный инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где инсулин также содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в протеазном сайте впервые модифицированного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина, где указанная по меньшей мере одна аминокислотная замена такова, что по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота заменена по меньшей мере одной гидрофильной аминокислотой.

11. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А12 является γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А13 является His, Asn, γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А14 является Tyr, Asn, Gln, γGlu, Arg, Asp, Gly или His; и/или аминокислота в позиции А15 является γGlu или Asp; и аминокислота в позиции В24 является His; и/или аминокислота в позиции В25 является His или Asn; и/или аминокислота в позиции В26 является His, Gly, Asp или Thr; и/или аминокислота в позиции В27 является His, γGlu, Asp, Gly или Arg; и/или аминокислота в позиции В28 является His, Gly, γGlu или Asp; и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию.

12. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А12 является γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А13 является His, Asn, γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А14 является Tyr, Asn, Gln, γGlu, Arg, Asp, Gly или His; и/или аминокислота в позиции А15 является γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции В16 является Tyr, His или γGlu; и/или аминокислота в позиции В24 является His; и/или аминокислота в позиции В25 является His или Asn; и/или аминокислота в позиции В26 является His, Gly, Asp или Thr; и/или аминокислота в позиции В27 является His, γGlu, Asp, Gly, Lys, Arg или удалена; и/или аминокислота в позиции В28 является His, Gly, γGlu, Asp или отсутствует (удалена); и/или аминокислота в позиции В29 является Lys, Arg или отсутствует (удалена); и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию, и предпочтительно стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, в котором аминокислота в позиции А12 является γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А13 является His, Asn, γGlu или Asp; и/или аминокислота в позиции А14 является Tyr, Asn, Gln, γGlu, Arg, Asp, Gly или His; и/или аминокислота в позиции А15 является γGlu или Asp; и аминокислота в позиции В24 является His; и/или аминокислота в позиции В25 является His или Asn; и/или аминокислота в позиции В26 является His, Gly, Asp или Thr; и/или аминокислота в позиции В27 является His, γGlu, Asp, Gly, Lys или Arg; и/или аминокислота в позиции В28 является His, Gly, γGlu или Asp; и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию.

13. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu, Asp или His, аминокислота в позиции В25 является His или Asn, и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию.

14. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu, Asp или His, аминокислота в позиции В25 является His или Asn, а аминокислота в позиции В30 удалена.

15. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu, Asp или His, аминокислота в позиции В16 является His или γGlu, аминокислота в позиции В25 является His, а аминокислота в позиции В30 удалена.

16. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu, Asp или His, аминокислота в позиции В25 является His, а аминокислота в позиции В30 удалена.

17. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu или Asp, аминокислота в позиции В28 является γGlu или Asp, и возможно в позиции В30 нет аминокислотного остатка.

18. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором одна или более дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из: A8His, A18Gln, A21Gln, A21Gly, B1Glu, B1Gln, B3Gln, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu и desB30.

19. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором дополнительной мутацией является desB30.

20. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором А14 является γGlu.

21. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором В25 является Asn.

22. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором В25 является His.

23. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором В25 является Asn, a B27 является γGlu или Asp.

24. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором В25 является Asn, a B27 является γGlu.

25. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который демонстрирует повышенную устойчивость к одному или более ферментам протеазам по сравнению с родительским белком.

26. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который демонстрирует повышенную устойчивость к двум или более ферментам протеазам по сравнению с родительским белком.

27. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где родительский инсулин выбран из группы, состоящей из а) человеческого инсулина; б) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции В28 является Pro, Asp, Lys, Leu, Val или Ala, а аминокислотный остаток в позиции В29 является Lys или Pro, и возможно аминокислотный остаток в позиции В30 удален; в) des(B26-B30) человеческого инсулина, des(B27-B30) человеческого инсулина, des(B28-B30) человеческого инсулина, des(B29-В30) человеческого инсулина, des(B27) человеческого инсулина или des(B30) человеческого инсулина; г) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции ВЗ является Lys, а аминокислотный остаток в позиции В29 является γGlu или Asp; д) инсулинового аналога человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в позиции А21 является Gly, и в котором инсулиновый аналог также удлинен с С-конца двумя остатками Arg; е) инсулинового производного, в котором аминокислотный остаток в позиции В30 заменен метиловым эфиром треонина, и ж) инсулинового производного, в котором к Nε-позиции лизина в позиции В29 des(B30)человеческом инсулине присоединена тетрадеканоильная цепь.

28. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где одна или более дополнительная мутация выбрана для повышения химической стабильности инсулина.

29. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где одна или более дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из A18Gln, A21Gln, A21Gly и B3Gln.

30. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, содержащий А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 1, т.е.: Xaa_A(-2)-Xaa_A(-1)-Xaa_A0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa_A8-Ser-Ile-Cys-Xaa_A12-Xaa_A13-Xaa_A14-Xaa_A15-Leu-Glu-Xaa_A18-Tyr-Cys-Xaa_A21 (SEQ ID №:1), и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 2, т.е.: Xaa_B(-2)-Xaa_B(-1)-Xaa_B0-Xaa_B1-Xaa_B2-Xaa_B3-Xaa_B4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa_B10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa_B16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa_B24-Xaa_B25-Xaa_B26-Xaa_B27-Xaa_B28-Xaa_B29-Xaa_B30-Xaa_B31-Xaa_B32 (SEQ ID №:2), где Xaa_A(-2) отсутствует или является Gly; Xaa_A(-1) отсутствует или является Pro; Xaa_A0 отсутствует или является Pro; Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His; Xaa_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и γGlu; Xaa_A13 независимо выбран среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_A14 независимо выбран среди Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_A15 независимо выбран среди Gln, Asp и γGlu; Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln; Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B(-2) отсутствует или является Gly; Xaa_B(-1) отсутствует или является Pro; Xaa_B0 отсутствует или является Pro; Xaa_B1 отсутствует или независимо выбран среди Phe и γGlu; Xaa_B2 отсутствует или является Val; Xaa_B3 отсутствует или независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu; Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu; Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gln, His, Arg, и γGlu; Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His; Xaa_B25 независимо выбран среди Phe, Asn и His; Xaa_B26 отсутствует или независимо выбран среди Tyr, His, Thr, Gly и Asp; Xaa_B27 отсутствует или независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_B28 отсутствует или независимо выбран среди Pro, His, Gly и Asp; Xaa_B29 отсутствует или независимо выбран среди Lys и Gln; Xaa_B30 отсутствует или является Thr; Xaa_B31 отсутствует или является Leu; Xaa_B32 отсутствует или является γGlu; С-конец возможно может быть получен в виде амида; где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи, и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком; где возможно N-концевая А-цепочечная аминокислотная последовательность связана с C-концевой B-цепочечной аминокислотной последовательностью посредством аминокислотной последовательности, содержащей 3-7 аминокислот, для формирования одноцепочечной инсулиновой молекулы, где возможно N-конец В-цепи удлинен 1-10 аминокислотами; где если Xaa_A8 является Thr, и Xaa_A12 является Ser, и Xaa_A13 является Leu, и Xaa_A14 является Tyr, то Xaa_A15 является γGlu или Asp; и где если Xaa_B24 является Phe, и Xaa_B25 является Phe, и Xaa_B26 является Tyr, и Xaa_B27 является Thr, и Xaa_B28 является Pro, то Xaa_B29 является Gln.

31. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, содержащий А-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 3, т.е.: Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa_A8-Ser-Ile-Cys-Xaa_A12-Xaa_A13-Xaa_A14-Xaa_A15-Leu-Glu-Xaa_A18-Tyr-Cys-Xaa_A21 (SEQ ID №:3), и В-цепочечную аминокислотную последовательность формулы 4, т.е.: Xaa_B1-Val-Xaa_B3-Xaa_B4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa_B10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa_B16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa_B24-His-Xaa_B26-Xaa_B27-Xaa_B28-Xaa_B29-Xaa_B30 (SEQ ID №:4), где Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His; Xaa_A12 независимо выбран среди Ser, Asp и γGlu; Xaa_A13 независимо выбран среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_A14 независимо выбран среди Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_A15 независимо выбран среди Gln, Asp и γGlu; Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln; Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B1 независимо выбран среди Phe и γGlu; Xaa_B3 независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu; Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu; Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gln, His, Arg и γGlu; Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His; Xaa_B25 независимо выбран среди Phe, Asn и His; Xaa_B26 отсутствует или независимо выбран среди Tyr, His, Thr, Gly и Asp; Xaa_B27 отсутствует или независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_B28 отсутствует или независимо выбран среди Pro, His, Gly и Asp; Xaa_B29 отсутствует или независимо выбран среди Lys и Gln; Xaa_B30 отсутствует или является Thr; С-конец возможно может быть получен в виде амида; где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи, и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком.

32. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где Xaa_A8 независимо выбран среди Thr и His; Xaa_A12 независимо выбран среди Ser и γGlu; Xaa_A13 независимо выбран среди Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и γGlu; Xaa_A14 независимо выбран среди Tyr, Asp, His и γGlu; Xaa_A15 независимо выбран среди Gln и γGlu; Xaa_A18 независимо выбран среди Asn, Lys и Gln; Xaa_A21 независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B1 независимо выбран среди Phe и γGlu; Xaa_B3 независимо выбран среди Asn и Gln; Xaa_B4 независимо выбран среди Gln и γGlu; Xaa_B10 независимо выбран среди His, Asp, Pro и γGlu; Xaa_B16 независимо выбран среди Tyr, Asp, Gln, His, Arg и γGlu; Xaa_B24 независимо выбран среди Phe и His; Xaa_B25 независимо выбран среди Phe, Asn и His; Xaa_B26 независимо выбран среди Tyr, Thr, Gly и Asp; Xaa_B27 независимо выбран среди Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg и γGlu; Xaa_B28 независимо выбран среди Pro, Gly и Asp; Xaa_B29 независимо выбран среди Lys и Gln; Xaa_B30 отсутствует или является Thr; С-конец возможно может быть получен в виде амида; где А-цепочечная аминокислотная последовательность и В-цепочечная аминокислотная последовательность связаны дисульфидными мостиками между цистеинами в позиции 7 А-цепи и цистеином в позиции 7 В-цепи, а также между цистеином в позиции 20 А-цепи и цистеином в позиции 19 В-цепи, и где цистеины в позиции 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидным мостиком.

33. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, в котором аминокислота в позиции А14 является γGlu или His (т.е. Е или Н в соответствии с однобуквенным кодом), аминокислота в позиции В25 является His, и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию, и где ацильная группировка присоединена к ε-аминогруппе в остатке лизина в позиции В29.

34. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, в котором аминокислота в позиции В25 является His или Asn, аминокислота в позиции В27 является γGlu или Asp, и который возможно также содержит одну или более из следующих дополнительных мутаций: А8Н, A14E/D, B1E/D, B28E/D и desB30, и где ацильная группировка присоединена к ε-аминогруппе в остатке лизина в позиции В29.

35. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, в котором аминокислота в позиции А14 является Tyr, γGlu или His (т.е. Y, Е или Н в соответствии с однобуквенным кодом), аминокислота в позиции В25 является Asn, аминокислота в позиции В27 является γGlu или Asp, и который возможно также содержит одну или более дополнительную мутацию, и где ацильная группировка присоединена к ε-аминогруппе в остатке лизина в позиции В29.

36. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который содержит мутацию А14Е.

37. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором, кроме мутации в позиции В25, есть только мутация в позиции А14, упомянутая в предыдущем положении.

38. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который содержит мутацию А14Н.

39. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулиновый аналог содержит мутацию desB30.

40. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором одна или более дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из: (-1)Р, А(0)Р, А8Н, A21G, В(-1)Р, В(0)Р, В1Е, B1Q, В16Е, B26D, В27Е, B28D, desB30, B31L и В32Е.

41. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который, кроме мутаций в позициях А14 и В25, содержит только одну из мутаций, упомянутых в предыдущих положениях.

42. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений кроме последнего (т.е. за исключением положения 41) в максимально возможной степени, который, кроме мутаций в позициях А14 и В25, имеет ровно две мутации, упомянутые двумя положениями ранее (т.е. указанные в положении 40).

43. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений кроме последних двух (т.е. за исключением положений 41 и 42) в максимально возможной степени, который, кроме мутаций в позициях А14 и В25, имеет ровно три мутации, упомянутые двумя положениями ранее (т.е. указанные в положении 40).

44. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений кроме последних двух (т.е. за исключением положений 41 и 42) в максимально возможной степени, который, кроме мутаций в позициях А14 и В25, имеет только одну дополнительную мутацию desB30.

45. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, в котором C-концевой аминокислотный остаток в А-цепи стабилизированного по отношению к протеазам инсулина является аминокислотным остатком А21.

46. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, который выбран из группы, содержащей А8Н, B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A18L, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В1Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В27Е, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, B28D, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин; B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин; В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, В16Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, B27K, desB28, desB29, desB30 человеческий инсулин; А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин; А14Е, desB30 человеческий инсулин и A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин.

47. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где ацильная группировка, присоединенная к стабилизированному по отношению к протеазам инсулину, имеет общую формулу

A c y - A A 1_{n} - A A 2_{m} - A A 3_{p} - (I)

, где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p определены выше.

48. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где Асу является жирной кислотой, предпочтительно миристиновой кислотой, или стерической кислотой, более предпочтительно миристиновой кислотой.

49. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений, за исключением последнего, в максимально возможной степени, где Acy является жирной двухосновной кислотой, предпочтительно жирной (α,ω)-двухосновной кислотой, более предпочтительно гептадекандиовой кислотой, гексадекандиовой кислотой, октадекандиовой кислотой, нонадекандиовой кислотой, докозандиовой кислотой, эйкозандиовой кислотой.

50. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений, за исключением последнего, в максимально возможной степени, где Acy представляет собой ω-(тетразол-5-ил)-жирную кислоту, предпочтительно 15-(1Н-тетразол-5-ил)пентадекановую кислоту, 16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадекановую кислоту, 17-(1Н-тетразол-5-ил)гептадекановую кислоту, 18-(1Н-тетразол-5-ил)октадекановую кислоту или 19-(1Н-тетразол-5-ил)нонадекановую кислоту.

51. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА1 является транексамовой кислотой или глицином.

52. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА1 является транексамовой кислотой.

53. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где n равно 0 или 1.

54. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где n равно 0.

55. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где n равно 1.

56. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА2 является γGlu, αGlu, βAsp, αAsp, γ-D-Glu, α-D-Glu, β-D-Asp, α-D-Asp или аминокислотой следующей формулы:

,

и

, где стрелки указывают точки присоединения к аминогруппе АА1, АА2, АА3 или к ε-аминогруппе остатка лизина В29 или к N-концевой позиции стабилизированного по отношению к протеазам инсулина.

57. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА2 является γGlu, βAsp, γ-D-Glu, β-D-Asp или аминокислотой следующей формулы:

и

где стрелки указывают точки присоединения к аминогруппе АА1, АА2, АА3 или к ε-аминогруппе остатка лизина В29 или к N-концевой позиции стабилизированного по отношению к протеазам инсулина.

58. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА2 является γGlu, γ-D-Glu или аминокислотой следующей формулы:

59. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

60. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 0, 1, 2, 3 или 4.

61. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 4.

62. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 3.

63. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 2.

64. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 1.

65. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где m равно 0.

66. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где АА3 выбран среди следующих:

,

и

,

где r равно 1, 2, 3, 5, 7, 11, 23 или 27.

67. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где r равно 1, 3, 5 или 7.

68. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где r равно 1.

69. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где r равно 3.

70. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где r равно 5.

71. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где r равно 7.

72. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10

73. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 0, 1, 2, 3 или 4.

74. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 0, 1 или 2.

75. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 0 или 2.

76. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 0.

77. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 1.

78. Ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений в максимально возможной степени, где p равно 2.

79. Соединение по любому из предыдущих положений продукта, которое является одним из соединений, конкретно упомянутых в этом подробном описании, таких как в конкретных примерах, особенно в любом из примеров 1 и след., приведенных ниже.

80. Соединение по любому из предыдущих положений продукта, которое является одним из конкретных примеров ацильных группировок, конкретно упомянутых в этом подробном описании, присоединенных к любому из стабилизированных по отношению к протеазам инсулинов, конкретно упомянутых в этом подробном описании.

81. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления фармацевтической композиции для лечения сахарного диабета.

82. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления фармацевтической композиции, которая может быть введена внутрилегочно для лечения сахарного диабета.

83. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления фармацевтической композиции, которая может быть введена внутрилегочно для лечения сахарного диабета и которая дает эффект пролонгированного действия.

84. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления порошковой фармацевтической композиции, которая может быть введена внутрилегочно для лечения сахарного диабета.

85. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления жидкой фармацевтической композиции, которая может быть введена внутрилегочно для лечения сахарного диабета.

86. Применение соединения по любому из предыдущих положений продукта для изготовления фармацевтической композиции, которая может быть введена перорально для лечения сахарного диабета.

87. Способ лечения сахарного диабета, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по любому из предыдущих положений продукта.

88. Композиция, содержащая человеческий инсулин, а также ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений.

89. Композиция, содержащая аспартат инсулина, а также ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений.

90. Композиция, содержащая инсулин лизпро, а также ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений.

91. Композиция, содержащая инсулин глулизин, а также ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из предыдущих положений.

92. Фармацевтическая композиция, содержащая биологически активное количество стабилизированного по отношению к протеазам инсулина по любому из предыдущих положений, касающихся аналогов инсулина, и фармацевтически приемлемый носитель.

93. Способ лечения, профилактики или облегчения гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, синдрома Х или дислипидемии у субъекта, включающий введение субъекту стабилизированного по отношению к протеазам инсулина по любому из предыдущих положений, касающихся аналогов инсулина, или фармацевтической композиции по любому из предыдущих положений.

94. Применение терапевтически эффективного количества стабилизированного по отношению к протеазам инсулина по любому из предыдущих положений, касающихся аналогов инсулина, для изготовления фармацевтического состава для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа, ожирения, синдрома Х или дислипидемии.

95. Способ лечения сахарного диабета, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ацилированного инсулина по любому из предыдущих положений продукта.

Сочетание одного или более положений, описанных в данном документе, возможно также с одним или более пунктом формулы изобретения ниже, приводит к другим положениям, и данное изобретение относится ко всем возможным комбинациям указанных положений и пунктов.

Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в данном документе, настоящим включены путем ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была отдельно и конкретно указана, и должны быть включены путем ссылки и изложены целиком в данном документе (в максимальной степени, разрешенной законом).

Все заголовки и подзаголовки используются в данном документе только для удобства и не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение ни в каком случае.

Любые использованные или все примеры или обороты (например, «такой как»), содержащиеся в данном документе, предназначены только для лучшего освещения изобретения и не ставят ограничений в сфере применения изобретения, если не утверждается иное. Никакие обороты в описании не должны толковаться как указывающие на то, что какой-либо элемент, не включенный в формулу изобретения, является необходимым для осуществления изобретения.

Цитирование и вставление в данный документ патентных документов делается только для удобства и не отражает какой-либо связи с обоснованностью, патентоспособностью и/или законной силой этих патентных документов. Упоминание в данном документе ссылок не является признанием, что они составляют уровень техники.

В данном документе слово «содержит» интерпретируется широко, обозначая «включает» или «имеет» (нормативы ЕРО С 4.13).

Данное изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты объектов изобретения, включенных в формулу изобретения в соответствии с разрешением действующего законодательства.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, а не ограничения.

Сокращения, используемые в данном документе, являются следующими: βAla означает бета-аланил, Аос означает 8-аминооктановую кислоту, tBu означает трет-бутил, DCM означает дихлорметан, DIC означает диизопропилкарбодиимид, DIPEA=IDEA означает N,N-диизопропилэтиламин, DMF означает N,N-диметилформамид, DMSO означает диметилсульфоксид, EtOAc означает этилацетат, Fmoc означает 9-флуоренилметилоксикарбонил, γGlu означает гамма-L-глутамил, HCl означает соляную кислоту, HOBt означает 1-гидроксибензотриазол, NMP означает N-метилпирролидон, MeCN означает ацетонитрил, OEG означает [2-(2-аминоэтокси)этокси]этилкарбонил, Su означает сукцинимидил-1-ил = 2,5-диоксо-пирролидин-1-ил, OSu означает сукцинимидил-1-илокси = 2,5-диоксо-пирролидин-1-илокси, RPC означает хроматографию в обращенных фазах, RT означает комнатную температуру, TFA означает трифторуксусную кислоту, THF означает тетрагидрофуран, TNBS означает 2,4,6-тринитробензенсульфоновую кислоту, TRIS означает трис(гидроксиметил)аминометан, a TSTU означает O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилуроний-тетрафтороборат.

Следующие примеры и общие процедуры относятся к промежуточным соединениям и конечным продуктам, указанным в подробном описании и схемах синтеза. Изготовление соединений данного изобретения подробно описано с помощью следующих примеров, но описанные химические реакции раскрыты с точки зрения их общей применимости для получения соединений изобретения. Иногда реакция может быть не применима в соответствии с описанием для каждого соединения, включенного в раскрываемый объем изобретения. Специалисты в данной области легко узнают соединения, для которых это происходит. В этих случаях реакция может быть успешно выполнена путем обычных модификаций, известных специалистам в данной области, путем подходящей защиты мешающих групп, путем замены на другие обычные реагенты или путем обычного изменения условий реакции. Альтернативно в изготовлении соответствующих соединений изобретения будут применяться другие реакции, описанные в данном документе или, в противном случае, обычные реакции. Во всех способах изготовления все исходные материалы известны или могут быть легко получены из известных исходных материалов. Все температуры приведены в градусах Цельсия, если не указано иное, все части и проценты даны по весу, когда речь идет о выходе, и все части даны по объему, когда речь идет о растворителях и элюентах.

Соединения изобретения могут быть очищены путем использования одной или более из следующих процедур, которые являются типичными в данной области. Эти процедуры при необходимости могут быть изменены в связи с градиентами, рН, солями, концентрациями, потоком, колонками и т.д. В зависимости от таких факторов, как распределение примеси, растворимость инсулина в данном случае и т.д., специалист в данной области может легко узнать и произвести эти изменения.

После кислотной ВЭЖХ или обессоливания соединения выделяют путем лиофилизации в чистые фракции.

После нейтральной ВЭЖХ или анионообменной хроматографии соединения обессаливают, осаждают при изоэлектрическом рН или очищают путем кислотной ВЭЖХ.

Типичные процедуры очистки:

Система ВЭЖХ представляет собой систему Gilson, состоящую из: аппарата для работы с жидкими растворами модели 215 Liquid handler, насоса модели 322-Н2 Pump и УФ-детектора модели 155 UV Dector. Детекцию, как правило, производят при 210 нм и 280 нм.

Система Âkta Purifier FPLC (Amersham Biosciences) состоит из: насоса модели Р-900 Pump, УФ-детектора модели UV-900 UV Dector, детектора проводимости и рН модели рН/С-900, коллектора фракций модели Frac-950. УФ-детекцию, как правило, производят при 214 нм, 254 нм и 276 нм.

Кислотная ВЭЖХ:

Колонка:	Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
Поток:	8 мл/мин
Буфер А:	0,1% TFA в ацетонитриле
Буфер В:	0,1% TFA в воде.
Градиент:	0,0-5,0 мин: 10% А
5,00-30,0 мин:	от 10% А до 90% А
30,0-35,0 мин:	90% А
35,0-40,0 мин:	100% А

Нейтральная ВЭЖХ:

Колонка:	Phenomenex, Jupiter, C4 5 мкм 250×10,00 мм, 300 Å
Поток:	6 мл/мин
Буфер А:	5 мМ TRIS, 7,5 мМ (NH₄)₂SO₄, рН=7,3, 20% CH₃CN
Буфер В:	60% CH₃CN, 40% воды
Градиент:	0-5 мин: 10% В
5-35 мин:	10-60% В
35-39 мин:	60% В
39-40 мин:	70% В
40-43,5 мин:	70% В

Анионообменная хроматография:

Колонка:	RessourceQ, 1 мл
Поток:	6 мл/мин
Буфер А:	0,09% NH₄HCO₃, 0,25% NH₄OAc, 42,5% этанола рН 8,4
Буфер В:	0,09% NH₄HCO₃, 2,5% NH₄OAc, 42,5% этанола рН 8,4
Градиент:	от 100% А до 100% B в течение 30 объемов колонки

Обессоливание:

Колонка:	HiPrep 26/10
Поток:	10 мл/мин, 6 объемов колонки
Буфер:	10 мМ NH₄HCO₃

Общая процедура для твердофазного синтеза ацилированных реагентов общей формулы (II):

где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p определены выше, a Act является оставшейся группой активного эфира, такой как N-гидроксисукцинимид (OSu) или 1-гидроксибензотриазол, и где карбоновые кислоты с группировками Acy и АА2 ацильной группировки защищены как трет-бутиловые эфиры.

Соединения общей формулы (II) в соответствии с изобретением могут быть синтезированы на твердой подложке с использованием процедур, хорошо известных специалистам в области твердофазного пептидного синтеза. Эта процедура включает присоединение Fmoc-защищенной аминокислоты к полистирен-2-хлоротритилхлоридной смоле. Присоединение может быть выполнено, например, с использованием свободной N-защищенной аминокислоты в присутствии третичного амина, такого как триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин (см. ссылки ниже). С-конец (который присоединяется к смоле) этой аминокислоты является концом синтетической последовательности, связанным с родительскими инсулинами изобретения. После присоединения Fmoc-аминокислоты к смоле с Fmoc-группы снимают защиту с помощью, например, вторичных аминов, таких как пиперидин или диэтиламин, с последующим связыванием другой (или такой же) Fmoc-защищенной аминокислоты и снятием защиты. Синтетическая последовательность заканчивается связыванием моно-трет-бутил-защищенных жирных (α,ω) двухосновных кислот, таких как моно-трет-бутиловые эфиры гексадекандиовой, гептадекандиовой, октадекандиовой или эйкозандиовой кислот. Отщепление соединений от смолы осуществляется с помощью разбавленных кислот, таких как 0,5-5% TFA/DCM (трифторуксусная кислоты в дихлорметане), уксусная кислота (например, 10% в DCM или НОАс/трифторэтанол/DCM 1:1:8) или гексафтороизопропанол в DCM (См., например, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z.Dörwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N.Sewald & H.-D.Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 или "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, и ссылки в них). Это гарантирует, что трет-бутиловые эфиры, присутствующие в соединениях в качестве защитных групп карбоновых кислот, не снимают защиту. Наконец, C-концевая карбоксигруппа (высвобожденная из смолы) активируется, например как эфир N-гидроксисукцинимида (OSu), и используется либо непосредственно, либо после очистки в качестве связывающего реагента при присоединении к родительскому инсулину изобретения. Эта процедура проиллюстрирована в примере 9.

Альтернативно ацилированные реагенты вышеприведенной общей формулы (II) могут быть изготовлены путем жидкофазного синтеза, описанного ниже.

Моно-трет-бутил-защищенные жирные дикислоты, такие как моно-трет-бутиловые эфиры гексадекандиовой, гептадекандиовой, октадекандиовой или эйкозандиовой кислот, активируют, например как OSu-эфиры, описанные ниже, или как любой другой активированный эфир, известный специалистам в данной области, такой как HOBt- или HOAt-эфир. Этот активный эфир связывается с одной из аминокислот АА1, моно-трет-бутил-защищенной АА2 или АА3 в подходящем растворителе, таком как THF, DMF, NMP (или смеси растворителей) в присутствии подходящего основания, такого как DIPEA или триэтиламин. Промежуточный продукт выделяют, например с помощью процедур выделения или с помощью хроматографических процедур. Полученный промежуточный продукт снова подвергают активации (как описано выше) и связывают с одной из аминокислот АА1, моно-трет-бутил-защищенной АА2 или АА3, как описано выше. Эту процедуру повторяют до получения промежуточного Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-OH, в желаемой степени защищенного. Его, в свою очередь, активируют, получая ацилирующие реагенты общей формулы (II) Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act. Эта процедура проиллюстрирована в примере 21.

Ацилирующие реагенты, полученные любым из вышеперечисленных способов, можно лишить (трет-бутил)-защиты после активации, как сложные эфиры OSu. Это можно сделать путем TFA-обработки Osu-активированного трет-бутил-защищенного ацилирующего реагента. После ацилирования любого стабилизированного по отношению к протеазам инсулина получают незащищенный ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин изобретения. Это проиллюстрировано, например, в примере 16 ниже.

Если реагенты, полученные любым из вышеперечисленных способов, не являются лишенными (трет-бутил)-защиты после активации, как сложные эфиры OSu, то ацилирование любого стабилизированного по отношению к протеазам инсулина дает соответствующий трет-бутил-защищенный ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин изобретения. Для того, чтобы получить незащищенный ацилированный стабилизированный по отношению к протеазам инсулин изобретения, защищенный инсулин лишают защиты. Это может быть сделано путем TFA-обработки для получения незащищенного ацилированного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина изобретения. Это проиллюстрировано, например, в примерах 1 и 2 ниже.

Если требуется ацилирование остатка лизина (в эпсилон-позиции) инсулина, то ацилирование осуществляется в щелочной среде (например, при рН 10, 10,5 или 11). Это проиллюстрировано, например, в примерах 1 и 2 ниже.

Если требуется ацилирование N-концевой позиции (А1) А-цепи инсулина, то ацилирование осуществляется в нейтральной среде (например, при рН 7, 7,5, 8, или 8,5). Это проиллюстрировано, например, в примерах 38 и 44 ниже.

Общая процедура (А) для изготовления ацилированных стабилизированных по отношению к протеазам инсулинов данного изобретения

Общая процедура (А) проиллюстрирована в первом примере.

Пример 1, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε-гексадекандиоил), desB30 человеческий инсулин,

А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин (500 мг) растворяют в 100 мМ водном растворе Na₂CO₃ (5 мл) и доводят рН до 10,5 с помощью 1 N NaOH. N-гидроксисукцинимидный эфир трет-бутилового эфира гексадекандиовой кислоты растворяют в ацетонитриле (10 w/v%), добавляют к раствору инсулина, осторожно нагревают под теплой водой, чтобы избежать осаждения, и оставляют при комнатной температуре на 30 минут. Смесь лиофилизируют. Твердое вещество растворяют в ледяной 95% трифторуксусной кислоте (содержащей 5% воды) и оставляют на льду на 30 минут. Смесь концентрируют в вакууме и вновь выпаривают из дихлорметана. Осадок растворяют в воде, доводят рН до нейтрального (6-7) и смесь лиофилизируют.

Полученный инсулин очищают с помощью ионообменной хроматографии на 21 мл колонке Source 15Q, несколько раз прогоняют, элюируют с градиентом от 15 до 300 мМ ацетата аммония в 15 мМ Tris, 50 v/v % этанола, рН 7,5 (уксусная кислота). Заключительное обессоливание чистых фракций проводят на 3 мл колонке RPC, элюируя изократически с 0,1 v/v % TFA, 50 v/v % этанола. Полученный чистый инсулин лиофилизируют.

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z (отношение массы к заряду) = 1483,2 (М+4)/4. Рассчитанное значение: 1483,5

Пример 1, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин (2 г) растворяют в 100 мМ водном растворе Na₂CO₃ (10 мл), и добавляют DMSO (4 мл). рН доводят до 10,5 с помощью 1 N NaOH. Трет-бутил-октадекандиоил-L-Glu(OSu)-OtBu (изготовленный в соответствии с описанием в WO 2005/012347). Снова добавляют 100 мМ водный раствор Na₂CO₃ (20 мл), а затем THF (20 мл). Через 1,5 часа добавляют несколько капель метиламина и постепенно подкисляют смесь уксусной кислотой. Смесь очищают с помощью подготовительной ВЭЖХ и лиофилизируют для получения названного инсулина в виде ди-трет-бутилового эфира. Его растворяют в дихлорметане и трифторуксусной кислоте 1:1 (50 мл). Смесь оставляют на 2 часа и концентрируют в вакууме. После добавления небольшого количества воды и ацетонитрила смесь очищают с помощью подготовительной ВЭЖХ. Чистые фракции лиофилизируют. Это дает 313 мг названного инсулина.

MALDI-TOF MS: m/z=6089 (М+1). Рассчитанное значение: 6089.

Пример 3, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с эйкозандиовой кислоты через моно-трет-бутиловый эфир эйкозандиовой кислоты и трет-бутил-эйкозандиоил-L-Glu(OSu)-OtBu.

MALDI-TOF MS: m/z=6120 (М+1). Рассчитанное значение: 6117.

Пример 4, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε3-карбокси-5-октадекандиоиламинобензоил), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с моно-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-эфира 5-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)изофталевой кислоты (получен в соответствии с описанием в WO 2006/082204).

ЖХ-МС: 1531 (М+4), Mw 6124 (с деконволюцией). Рассчитанное значение: 1531 (М+4), 6122.

Пример 5, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε-N-октадекандиоил-N-(2-карбоксиэтил)глицил), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с трет-бутил-октадекандиоил-N-(2-(трет-бутоксикарбонил)этил)-Gly-OSu (получен в соответствии с описанием в WO 2005/012347).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 1522,52 (М+4). Рассчитанное значение: 1523.

Пример 6, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε-N-октадекандиоил-N-карбоксиметил)-бета-аланил), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с трет-бутил-октадекандиоил-N-(трет-бутоксикарбонилметил)-βAla-OSu (получен в соответствии с описанием в WO 2005/012347).

MALDI-TOF MS: m/z=6088 (М+1). Рассчитанное значение: 6089.

Пример 7, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-({19-карбоксинонадеканоиламино}метил)транс-циклогексанкарбонил]-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с 5-(2,5-диоксипирролидин-1-ил)-эфира 1-трет-бутилового эфира 2-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)пентандиовой кислоты

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 6260. Рассчитанное значение: 6255.

Изготовление 2-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксипирролидин-1-ил)-эфира:

1. OSu активация трет-бутилэйкозандиовой кислоты

Трет-бутил-эйкозандиовую кислоту (5,0 г) растворяют в THF (50 мл) и DMF (30 мл). Добавляют TSTU (4,53 г) и DIPEA (2,65 мл). Смесь перемешивают в течение 3 дней, а затем концентрируют в вакууме. Твердый осадок рекристаллизуют из ацетонитрила, чтобы получить эйкозандиовой кислоты трет-бутилового эфира N-гидроксисукцинимид-эфир в виде белого кристаллического вещества (5,52 г, 89%).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 440 [М-56 (=tret-Bu)]

2. Взаимодействие с транексамовой кислотой

К раствору эйкозандиовой кислоты трет-бутилового эфира N-гидроксисукцинимид-эфира (5,52 г) в THF (100 мл) добавляют транексамовую кислоту (1,75 г). Получают осадок. Попытки получить раствор, добавив DMF (75 мл), воду (25 мл), DMSO (50 мл) и несколько капель DIPEA, не увенчались успехом. Суспензию перемешивают в течение ночи. Смесь концентрируют в вакууме. К твердому осадку добавляют THF и осадок отфильтровывают. Фильтрат концентрируют и твердый остаток рекристаллизуют в ацетонитриле для получения 4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)-метил]циклогексанкарбоновой кислоты в виде белого кристаллического соединения (5,56 г, 93%)

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 538 (М+1).

3. OSu-активация 4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбоновой кислоты

К раствору 4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбоновой кислоты (5,56 г) в THF (100 мл) добавляют раствор TSTU (3,42 г) в ацетонитриле (25 мл). Смесь концентрируют в вакууме после перемешивания в течение ночи. Твердый осадок рекристаллизуют из ацетонитрила для получения 4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)-метил]циклогексанкарбоновой кислоты 2,5-диоксопирролидин-1-ил эфира (5,76 г, 88%).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 635 (М+1).

4. Взаимодействие с H-Glu-OtBu и OSu-активация.

К раствору 4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбоновой кислоты 2,5-диоксопирролидин-1-ил эфира в THF (150 мл) добавляют раствор H-Glu-OtBu (1,84 г) в воде (25 мл) и несколько капель DIPEA. Смесь перемешивают в течение ночи, а затем концентрируют в вакууме. Осадок растворяют в горячем (60°С) THF и фильтруют. К холодному фильтрату добавляют THF до 150 мл и TSTU (2,98 г), растворенный в ацетонитриле (25 мл). Смесь концентрируют после перемешивания в течение 20 мин. Осадок рекристаллизуют из ацетонитрила для получения белого твердого вещества, 2-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксипирролидин-1-ил)-эфира (6,8 г, 92%).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 820 (М+1).

Пример 8, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εгептадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с гептадекандиовой кислоты через моно-трет-бутиловый эфир гептадекандиовой кислоты и трет-бутил-гептадекандиоил-L-Glu(OSu)-OtBu (получен в соответствии с описанием в WO 2006/082204).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 1519 (М+4). Рассчитанное значение: 1519.

Пример 9, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.2а и фиг.2b ниже.

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с трет-бутилового эфира 17-((S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]-этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)гептадекандиовой кислоты (альтернативное название: трет-бутил-октадекандиоил-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBU).

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 1596 (М+4). Рассчитанное значение: 1596.

Блок конструкции для изготовления этого инсулина получают в соответствии со следующим описанием:

Исходная смола: 2-хлоротритиловая смола, 1,60 ммоль/г

1,0 г смолы помещают на 30 мин в DCM (10 мл) для разбухания.

1. Ацилирование Fmос-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислотой:

0,39 г (0,63 экв, 1,0 ммоль) Fmос-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (Fmoc-OEG-OH) растворяют в DCM (15 мл) и добавляют к смоле. N,N-диизопропилэтиламин (DIEA) (0,44 мл, 2,5 ммоль) добавляют по каплям. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин, а затем добавляют метанол (2 мл) и перемешивают смесь еще в течение 15 мин. Смолу отфильтровывают и промывают в NMP (2×8 мл) и DCM (8×8 мл).

Добавляют 20% пиперидин/NMP (8 мл), оставляют на 10 мин, один раз повторяют. Фильтруют и промывают в NMP (2×8 мл), DCM (3×8 мл) и NMP (5×8 мл). Положительный тест с TNBS дает смолы красного цвета.

2. Ацилирование Fmос-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислотой:

0,78 г (2 экв, 2,0 ммоль) Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты растворяют в NMP/DCM 1:1 (10 мл). Добавляют 0,28 г (2,2 экв, 2,4 ммоль) HOSu, a затем 0,37 мл (2,2 экв, 2,4 ммоль) DIC. Реакционную смесь оставляют на 1 час, а затем добавляют к смоле и, наконец, добавляют 0,407 мл (2,2 экв) DIEA. Смесь перемешивают в течение 16 часов, фильтруют и промывают NMP (2×8 мл), DCM (3×8 мл) и NMP (5×8 мл). Положительный тест с TNBS дает бесцветные смолы.

Добавляют 20% пиперидин/NMP (10 мл), оставляют на 10 мин, один раз повторяют. Фильтруют и промывают в NMP (2×8 мл), DCM (3×8 мл) и NMP (5×8 мл). Положительный тест с TNBS дает смолы красного цвета.

Ацилирование Fmoc-Glu-OtBu:

0,86 г (2 экв, 2,0 ммоль) Fmoc-Glu-OtBu растворяют в NMP/DCM 1:1 (10 мл). Добавляют 0,32 г (2,2 экв, 2,4 ммоль) НОВТ, а затем 0,37 мл (2,2 экв, 2,4 ммоль) DIC. Реакционную смесь оставляют на 20 минут, а затем добавляют к смоле и, наконец, добавляют 0,407 мл (2,2 экв) DIEA. Смесь перемешивают в течение 16 часов, фильтруют и промывают NMP (2×8 мл), DCM (3×8 мл) и NMP (5×8 мл). Положительный тест с TNBS дает бесцветные смолы.

Ацилирование моно-трет-бутиловым эфиром октадекандиовой кислоты:

0,75 г (2 экв, 2,0 ммоль) моно-трет-бутилового эфира октадекандиовой кислоты растворяют в NMP/DCM 1:1 (10 мл). Добавляют 0,32 г (2,2 экв, 2,4 ммоль) НОВТ, а затем 0,37 мл (2,2 экв, 2,4 ммоль) DIC. Реакционную смесь оставляют на 20 минут, а затем добавляют к смоле и, наконец, добавляют 0,41 мл (2,2 экв) DIEA. Смесь перемешивают в течение 16 часов, фильтруют и промывают NMP (2×8 мл), DCM (3×8 мл) и NMP (5×8 мл).

Расщепление с помощью TFA:

8 мл 5% TFA/DCM добавляют к смоле и перемешивают реакционную смесь в течение 2 часов, фильтруют и собирают фильтрат. К смоле опять добавляют 5% TFA/DCM (8 мл) и перемешивают смесь в течение 10 минут, фильтруют и смолу промывают DCM (2×10 мл). Объединенные фильтраты и отмывки доводят до щелочного рН с помощью примерно 800 мкл DIEA. Смесь выпаривают в вакууме, получая масло (3,5 г). Добавляют диэтиловый эфир (30 мл) и нерастворенное масло отделяют путем декантации и выпаривают в вакууме. Это дает 1,1 г трет-бутилового эфира 17-((S)-1-трет-бутокси-карбонил-3-[2-(2-([2-(2-карбоксиметоксиэтокси)этилкарбамоил]метокси)этокси)этилкарбамоил]пропилкарбамоил)гептадекановой кислоты (альтернативное название: трет-бутилоктадекандиоил-Glu(OEG-OEG-ОН)-OtBU) в виде масла.

ЖХ-МС (Sciex100 API): m/z=846,6 (M+1)+.

Osu-активация:

Вышеуказанный трет-бутилоктадекандиоил-Glu(OEG-OEG-ОН)-OtBU (0,63 г) растворяют в THF (35 мл). Добавляют DIEA (0,255 мл, 2 экв.), а затем TSTU (0,45 г, 2 экв.), и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь разделяют между этилацетатом (250 мл) и водным NaHSO₄ (3×100 мл). Органическую фазу высушивают (MgSO₄) и концентрируют в вакууме, получая 0,65 г трет-бутилового эфира 17-((S)-1-трет-бутокси-карбонил-3-[2-(2-([2-(2-карбоксиметоксиэтокси)этилкарбамоил]метокси)этокси)этилкарбамоил]пропилкарбамоил)гептадекановой кислоты (альтернативное название: трет-бутилоктадекандиоил-Glu(OEG-OEG-ОН)-OtBu) в виде масла.

ЖХ-МС: m/z=943,4 (М+1).

Пример 10, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εмиристил), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с 1-тетрадеканоил-пирролидин-2,5-диона.

MALDI-TOF MS: m/z=5873,6. Рассчитанное значение: 5872,9.

Пример 11, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с (S)-2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)бутириламино]пентандиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира.

MALDI-TOF MS: m/z=6242,5. Рассчитанное значение: 6245,2.

Получение (S)-2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)бутириламино]пентандиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира.

1. ((S)-2-[4-трет-бутокси-карбонил-4-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир

К раствору (S)-2-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)-пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5- диоксопирролидин-1-ил) эфира (изготовлен аналогично описанному в WO 2005/012347) (4,1 г) в THF (100 мл) добавляют раствор H-Glu-OtBu (1,47 г) в воде (20 мл). рН доводят до 8 с помощью DIPEA. Смесь концентрируют после перемешивания в течение 1,5 ч. Остаток рекристаллизуют из DCM для получения названного соединения в виде белого твердого вещества (2,81 г, 61%).

ЖХ-MC: m/z=769 (M+1).

(S)-2-[4-трет-бутокси-карбонил-4-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)бутириламино]пентандиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир

К раствору (S)-2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-(19-трет-бутоксикарбонилнона-деканоиламино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира (2,81 г) в ацетонитриле (80 мл) добавляют раствор TSTU (1,32 г) в ацетонитриле (20 мл). рН доводят до 8 с помощью DIPEA. После перемешивания в течение 1,5 ч смесь концентрируют. Осадок рекристаллизуют из ацетонитрила для получения названного соединения (1,7 г, 54%).

ЖХ-MC: m/z=866,4 (М+1).

Пример 12, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-((19-карбоксилнонадеканоиламино)метил)транс-циклогексанкарбонил]-γGlu-γGlu)desB30 человеческий инсулин

Этот инсулин изготавливают аналогично описанному выше, начиная с 2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира.

ЖХ-МС (электрораспыление): m/z: 6386 (М+1). Рассчитанное значение: 6384.

Получение 2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира.

1. 2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир

К раствору (2-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоил-амино)метил]циклогексанкарбонил}амино)]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира (5,0 г) в THF (100 мл) добавляют раствор H-Glu-OtBu (1,36 г) в воде (25 мл). После перемешивания в течение ночи смесь концентрируют в вакууме. Остаток преципитируют из воды, отфильтровывают и сушат в вакууме для получения названного соединения (4,63 г, 84%).

ЖХ-МС: m/z=740 (М-3×56, потеря 3xt-Bu).

(2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир

К раствору (2-[4-трет-бутоксикарбонил-4-({4-[(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира (4,6 г) в THF (150 мл) добавляют раствор TSTU (1,68 г). Добавляют DIPEA (0,97 мл). После перемешивания в течение ночи смесь концентрируют в вакууме. Осадок рекристаллизуют из ацетонитрила для получения названного соединения в виде твердого вещества (4,4 г, 87%).

ЖХ-МС: m/z=837 (М-3×56, потеря 3xt-Bu).

Пример 13, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.7 ниже.

ЖХ-МС: m/z=1555 (М+4)/4.

Пример 14, Общая процедура (А)

А14Е, B28D, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6118

Пример 15, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-ПЭГ7), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6510

Пример 16, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.3 ниже.

MALDI-TOF MS: m/z=6407

Промежуточный ацилирующий реагент для этого примера был изготовлен в соответствии со следующим описанием:

Этап 1: трет-бутиловый эфир 19-{(S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-карбоксиметокси-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты

К раствору 2-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира (2,50 г, (изготовлен аналогично описанию в WO 2005/012347) и [2-(2-(2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]ацетиламино)этокси)этокси]уксусной кислоте (1,47 г, альтернативное название: димер 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты, IRIS Biotech GmbH, кат. № ПЭГ1221) в этаноле (40 мл) добавляют DIPEA (1,26 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрируют в вакууме. К остатку добавляют водный 0,1 N раствор HCl (150 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяют и водный слой экстрагируют этилацетатом (100 мл). Объединенные органические слои промывают водой и раствором соли, высушивают (сульфат магния) и концентрируют в вакууме для получения масла, которое кристаллизуется с течением времени. Выход 96% (3,1 г). ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=874,49.

Этап 2: 19-((S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксимкарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил)метокси)этокси]этилкарбамоил)пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:

К раствору 19-((S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-диоксипирролидин-1-илоксимкарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил)метокси)этокси]этилкарбамоил)пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфира (3,1 г) в ацетонитриле (50 мл) добавляют TSTU (1,39 г) и DIPEA (0,91 мл). Смесь, перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрируют в вакууме. К остатку добавляют водный 0,1 N раствор HCl (100 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяют и водный слой экстрагируют этилацетатом (50 мл). Объединенные органические слои промывают водой и раствором соли, высушивают (сульфат магния) и концентрируют в вакууме для получения масла. Выход 99% (3,4 г). ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=971,8.

Этап 3: 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксимкарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил)метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)нонадекановая кислота:

19-((S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксимкарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил)метокси)этокси]этилкарбамоил)пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир (3,4 г) перемешивают с TFA (75 мл) в течение 45 минут, а затем концентрируют в вакууме. Осадок концентрируют толуолом 3 раза для получения твердого вещества. Осадок кристаллизуют в 2-пропаноле и фильтруют, получая белое кристаллическое соединение. Выход 80% (2,4 г). ЖХ-МС ((электрораспыление): m/z=859,44.

Аналогичный ацилирующий реагент с фрагментом октадекандиовой кислоты (например, используемый в примере 26 и других примерах) может быть получен аналогично.

Пример 17, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1626 (M+4)

Пример 18, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6348

Пример 19, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6062

Пример 20, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εгептадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

ES-MS:m/z=1592 (M+4)

Пример 21, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1620 (M+4)

Промежуточный ацилирующий реагент октадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-Osu (с трет-бутиловыми эфирами в качестве защитных групп на оставшихся карбоновых кислотах) изготовлен в соответствии с описанием ниже:

Октадекандиовой кислоты трет-бутилового эфира 2,5-диоксопирролидин-1-ил эфир

Октадекандиовой кислоты моно-трет-бутиловый эфир (4,2 г, 0,011 моль) растворяют в THF (20 мл), добавляют TSTU (4 г, 0,013 моль) в ацетонитриле (20 мл) и подводят рН раствора до 8 путем добавления DIPEA по каплям. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, затем подкисляют HCl (2М) до рН 3 и выпаривают в вакууме. Оставшееся масло постепенно распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме. Это дает 5,2 г октадекандиовой кислоты трет-бутилового эфира 2,5-диоксопирролидин-1-ил эфира в виде масла, которое может быть использовано в следующем этапе без дополнительной очистки. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=468 (М+1) и 412 (М+1-^tBu).

(S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир.

Октадекандиовой кислоты трет-бутилового эфира 2,5- диоксопирролидин-1-ил эфир (7 г, 0,015 моль) растворяют в THF (80 мл) и добавляют к раствору H-Glu-O^tBu (3,7 г, 0,0165 моль) в Na₂CO₃ (0,1 М, 40 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем подкисляют HCl (2М) до рН 3 и выпаривают в вакууме. Осадок распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме. Добавление ацетонитрила (30 мл) вызывает образование белого осадка, который выделяют путем фильтрации и высушивают, получая 3,75 г (S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=556 (М+1).

При выпаривании фильтрата ацетонитрила также выделяют 2,6 г продукта.

(S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 2,5-диоксопирролидин-1-ил эфир

(S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир (3 г, 0,005 моль) растворяют в THF (100 мл) и добавляют к раствору TSTU (1,78 г, 0,006 моль) в ацетонитриле (30 мл). Подводят рН раствора до 8 путем добавления DIPEA по каплям. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подкисляют HCl (2M) до рН 3 и выпаривают в вакууме. Оставшееся масло постепенно распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме досуха. Это позволяет получить белое твердое вещество (2,75 г) (S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=653 (М+1).

(S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 1 -трет-бутиловый эфир

(S)-2-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир (0,5 г, 0,766 ммоль) растворяют в ацетонитриле (20 мл). Этот раствор добавляют к раствору H-Glu-OtBu (0,171 г, 0,84 ммоль) в воде (30 мл). Подводят рН раствора до 10 с помощью DIPEA. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин, затем подкисляют HCl (2M) до рН 7 и выпаривают в вакууме. Остаток постепенно распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме досуха. Это позволяет получить (S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир в виде масла. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=741 (М+1).

(S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир

(S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир (8 г, 10,79 ммоль) растворяют в ацетонитриле (40 мл) и добавляют раствор TSTU (3,89 г, 12,95 ммоль) в ацетонитриле (40 мл). Подводят рН раствора до 8 путем добавления DIPEA по каплям. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подкисляют HCl (2M) до рН 3 и выпаривают в вакууме. Это позволяет получить масло, которое постепенно распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме досуха. Это позволяет получить 8,2 г (S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира в виде твердого вещества.

(S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир

(S)-2-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]пентадиовой кислоты 5-трет-бутилового эфира 1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир (4 г, 4,77 ммоль) растворяют в ацетонитриле (30 мл) и добавляют к раствору H-Glu-OtBu (1,07 г, 5,25 ммоль) в Na₂CO₃ (0,1 М, 20 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем нейтрализуют с помощью HCl (2M) до рН 7 и выпаривают в вакууме. Оставшееся масло постепенно распределяется между этилацетатом и HCl (0,1 М). Органический слой высушивают (MgSO₄), фильтруют и выпаривают в вакууме досуха. Остаток (4 г) растворяют в ацетонитриле и обрабатывают активированным углем. После фильтрации и выпаривания досуха, а затем высушивания в течение ночи в вакууме, получают 2,8 г (S)-2-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфира в виде кристаллической соли. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=927 (М+1).

(S)-2-((S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}бутириламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир

(S)-2-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир (2,8 г, 3,02 ммоль) активируют с помощью TSTU (1,0 г, 3,325 ммоль), используя способ, описанный выше, получая неочищенный (S)-2-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=1024 (М+1).

1,3 г этого соединения растворяют в ацетонитриле (40 мл) и добавляют к раствору H-Glu-O^tBu (0,28 г, 1,39 ммоль) в воде (30 мл). Подводят рН раствора до 9,3 с помощью DIPEA. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем нейтрализуют с помощью HCl (2M) до рН 7 и выпаривают в вакууме до почти полного высыхания. Остаток обрабатывают водой, получая белый осадок, который фильтруют. После высушивания в вакууме в течение ночи выделяют 1,1 г (S)-2-((S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}бутириламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфира, содержащего незначительные количества начального материала. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=1111,9 (М+1).

(S)-2-((S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}бутириламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфир

(S)-2-((S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-{(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-[(S)-4-трет-бутоксикарбонил-4-(17-трет-бутоксикарбонилгептадеканоиламино)бутириламино]бутириламино}бутириламино)пентадиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир (0,1 г, 0,09 ммоль) активируют с помощью TSTU (29,8 г, 0,099 ммоль) в растворе ацетонитрила при комнатной температуре в течение 1 часа, используя способ активации и изготовления, описанный выше. Это позволяет получить 100 мг неочищенного активированного продукта, который можно использовать как таковой для ацилирования инсулина без дополнительной очистки. ЖХ-МС (электрораспыление): m/z=1208 (М+1).

Пример 22, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6373

Пример 23, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, В27Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6407

Пример 24, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.6 ниже.

MALDI-TOF MS: m/z=6188

Пример 25, Общая процедура (А)

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.4 ниже.

MALDI-TOF MS: m/z=6352

Пример 26, Общая процедура (А)

А14Е, В16Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6345

Пример 27, Общая процедура (А)

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пероральный эффект этого соединения при введении натощак самцам крыс линии Вистар приведен на фиг.5 ниже.

MALDI-TOF MS: m/z=6041

Пример 28, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1598 (M+4)

Пример 29, Общая процедура (А)

А14Е, В16Е, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6028

Пример 30, Общая процедура (А)

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS:m/z=1581 (M+4)

Пример 31, Общая процедура (А)

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1484 (M+4)

Пример 32, Общая процедура (А)

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1548 (M+4)

Пример 33, Общая процедура (А)

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1596 (M+4)

Пример 34, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-OEG-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1592 (M+4)

Пример 35, Общая процедура (А):

А14Е, A18L, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6405

Пример 36, Общая процедура (А):

А14Е, A18L, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6377

Пример 37, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6433

Пример 38, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин

А14Е, В25Н, B29R, desB30 инсулин (500 мг, 88 мкмоль) растворяют в 0,1 М NaHCO₃, рН 8 (5 мл). ω-карбоксигептадеканоил-γ-L-глутамил-OEG-OEG-OSu (65 мг, 88 мкмоль) растворяют в THF/MeCN 1:1 (5 мл) и добавляют к раствору инсулина.Через 30 минут реакцию останавливают путем добавления 2 М водного метиламина (0,5 мл). Растворитель выпаривают в вакууме, а твердый осадок растворяют в минимальном количестве воды/MeCN. Основной пик продукта выделяют с помощью ВЭЖХ на обратной фазе на колонке С18, буфер А: 0,1% TFA в воде, буфер В: 0,1% TFA в MeCN, градиент 30-55% буфера В течение 45 минут. Фракции продукта частично выпаривают в вакууме и лиофилизируют для получения 59 мг препарата (10%). ЖХ-МС анализ: М⁴⁺=1602,7, рассчитан 1602,6. Два этапа стандартного анализа аминокислотной последовательности показывают F-V, подтверждая ацилирование на А1.

Пример 39, Общая процедура (А):

А14Е, B1F(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин

Это соединение выделяют в виде побочного продукта из вышеприведенного примера (пример 38). ЖХ-МС анализ: М⁴⁺=1602,5, рассчитан 1602,6. Два этапа стандартного анализа аминокислотной последовательности показывают G-I, подтверждая ацилирование на В1.

Пример 40, Общая процедура (А):

A1G(N^αгексадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1523 (M+4)

Это соединение изготовлено аналогично А1-ацилированию, описанному выше (пример 38) с использованием ω-карбоксигептадеканоил-γ-L-глутамил(OSu) в качестве ацилирующего агента. Продукт демонстрирует ЖХ-МС: М⁴⁺=1523,2, рассчитанное значение 1523,0. Два этапа стандартного анализа аминокислотной последовательности показывают F-V, подтверждая ацилирование на А1.

Пример 41, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1286 (M+5)

Ацилирующий реагент для этого примера изготовлен по аналогии с реагентом, полученным в примере 9, начиная с присоединения Fmoc-защищенной 4-аминомасляной кислоты к 2-хлортритиловой смоле, а затем путем снятия защиты и последующего присоединения еще 3 единиц 3 Fmoc-защищенной 4-аминомасляной кислоты и, как описано в примере 9, Fmoc-Glu-OtBu и моно-трет-бутилового эфира октадекандиовой кислоты.

Пример 42, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^αэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=5987

Пример 43, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^α4-[16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноил), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1530 (M+4)

Изготовление промежуточного ацилирующего реагента:

4-[16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутановую кислоту (500 мг, полученную в соответствии с описанием в WO 2006/005667) растворяют в этаноле (20 мл), добавляют TSTU (381 мг) и DIPEA (542 мкл) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь концентрируют в вакууме, и остаток перемешивают с 0,25 М HCl. Твердое вещество выделяют путем фильтрации, промывают водой и сушат в вакууме, получая 580 мг (91%) ацилирующего реагента.

Реакция ацилирования:

А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин (500 мг) растворяют в 0,1 М водном растворе карбоната натрия (10 мл) и этаноле (4 мл). рН доводят до 10,8 с помощью 1N NaOH. Указанный выше ацилирующий реагент (101 мг) растворяют в THF (2 мл) и добавляют этанол (2 мл) двумя частями с 10-минутным интервалом. Полученную смесь медленно перемешивают в течение 1 часа и разбавляют водой (50 мл). Полученный инсулин осаждают путем добавления 1N HCl до рН 5,5. Осадок выделяют центрифугированием и очищают с помощью ВЭЖХ. Чистые фракции объединяют и лиофилизируют.

Пример 44, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), А14Е, A21G, В25Н, desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6321

Пример 45, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6130

Пример 46, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B27K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6181

Пример 47, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε(5-эйкозандиоиламиноизофталевая кислота)), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6150

Пример 48, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=5959

Пример 49, Общая процедура (А):

А14Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1598(M+4)

Пример 50, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6216

Пример 51, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1559 (M+4)

Пример 52, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6278

Пример 53, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-Aoc), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6126

Пример 54, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=6055 (с деконволюцией)

Пример 55, Общая процедура (А):

ES-MS: m/z=6220 (с деконволюцией)

Пример 56, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6101

Пример 57, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF-MS: m/z=6277

Пример 58, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, В16Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1516 (M+4)

Пример 59, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1498 (M+4)

Пример 60, Общая процедура (А):

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1523 (M+4)

Пример 61, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B27K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB28, desB29, desB30 человеческий инсулин

MALDI-TOF MS: m/z=6208

Пример 62, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

ES-MS: m/z=1587 (M+4)

Ацилированные инсулины изобретения в следующих примерах могут быть получены аналогичным образом:

Пример 63, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 64, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 65, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 66, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 67, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εдокозандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 68, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εдокозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 69, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 70, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 71, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-эйкозандиоил-N-карбоксиметил)-βAla), desB30 человеческий инсулин

Пример 72, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε3-[2-(2-{2-[2-(17-карбоксигептадеканоиламино)этокси]этокси}этокси)этокси]пропионил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 73, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε3-[2-(2-{2-[2-(19-карбоксинонадеканоиламино)этокси]этокси}этокси)этокси]пропионил-γGlu), desB30 человеческий инсулин

Пример 74, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил), desB30 человеческий инсулин

Пример 75, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 76, Общая процедура (А):

МАЕ, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил), desB30 человеческий инсулин

Пример 77, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-({17-карбоксинонадеканоиламино}метил)транс-циклогексанкарбонил]-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 78, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-({17-карбоксигептадеканоиламино}метил)транс-циклогексанкарбонил]-γ-Glu-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 79, Общая процедура (А):

А14Е, B28D, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 80, Общая процедура (А):

А14Е, B28D, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 81, Общая процедура (А):

А14Е, B28D, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 82, Общая процедура (А):

А14Е, B28D, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 83, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 84, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 85, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 86, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 87, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 88, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 89, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 90, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 91, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 92, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 93, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 94, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 95, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 96, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 97, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 98, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 99, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 100, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 101, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 102, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 103, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 104, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 105, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 106, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 107, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 108, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 109, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 110, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 111, Общая процедура (А):

А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 112, Общая процедура (А):

А14Е, B28D, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 113, Общая процедура (А):

А14Е, В28Е, B29N(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 114, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 115, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 116, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 117, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 118, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 119, Общая процедура (А):

B25N, В27Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 120, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 121, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 122, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 123, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 124, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 125, Общая процедура (А):

А8Н, B25N, В27Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 126, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-эйкозандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 127, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-октадекандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 128, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-гексадекандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 129, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческий инсулин

[(3-{2-[2-(3-минопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]уксусную кислоту можно получить в соответствии с описанием (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) и ввести в реакцию с ω-(трет-бутил-карбокси-гептадеканоил-γ-L-глутамил(OSu)-OtBu. Продукт можно активировать с помощью TSTU и связать с А14Е, В25Н, desB30 человеческим инсулином в 0,1 М Na₂CO₃ при рН 10,5 для получения продукта.

Пример 130, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческий инсулин

[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]уксусную кислоту можно получить в соответствии с описанием (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) и ввести в реакцию с ω-(трет-бутил-карбокси-нонадеканоил-γ-L-глутамил(OSu)-OtBu. Продукт можно активировать с помощью TSTU и связать с А14Е, В25Н, desB30 человеческим инсулином в 0,1 М Na₂CO₃ при рН 10,5 для получения продукта.

Пример 131, Общая процедура (А):

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческий инсулин

[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]уксусную кислоту можно получить в соответствии с описанием (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) и ввести в реакцию с ω-(трет-бутил-карбокси-гептадеканоил-γ-L-глутамил(OSu)-OtBu. Продукт можно активировать с помощью TSTU и связать с А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческим инсулином в 0,1 М Na₂CO₃ при рН 10,5 для получения продукта.

Пример 132, Общая процедура (А):

А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческий инсулин

[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]уксусную кислоту можно получить в соответствии с описанием (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) и ввести в реакцию с ω-(трет-бутил-карбокси-нонадеканоил-γ-L-глутамил(OSu)-OtBu. Продукт можно активировать с помощью TSTU и связать с А14Е, В16Н, В25Н, desB30 человеческим инсулином в 0,1 М Na₂CO₃ при рН 10,5 для получения продукта.

Пример 133, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 134, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 135, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 136, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 137, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 138, Общая процедура (А):

В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 139, Общая процедура (А):

Пример 140, Общая процедура (А):

Пример 141, Общая процедура (А):

Пример 142, Общая процедура (А):

Пример 143, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 144, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 145, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 146, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 147, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 148, Общая процедура (А):

A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 149, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 150, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 151, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 152, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 153, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 154, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 155, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 156, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 157, Общая процедура (А):

Пример 158, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 159, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 160, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 161, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Пример 162, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 163, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 164, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 165, Общая процедура (А):

А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Пример 166, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 167, Общая процедура (А):

Пример 168, Общая процедура (А):

А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γ-Glu), desB30 человеческий инсулин

Пример 169, Общая процедура (А):

Пример 170, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин

Пример 171, Общая процедура (А):

A1G(N^αэйкозандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин

Пример 172, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин

Пример 173, Общая процедура (А):

A1G(N^αэйкозандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин

Пример 174, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин

Пример 175, Общая процедура (А):

A1G(N^αэйкозандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческий инсулин

Пример 176, Общая процедура (А):

A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин

Пример 177, Общая процедура (А):

A1G(N^αэйкозандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческий инсулин

ES-MS:m/z=1592(M+4)

Пример 178, Аффинность к инсулиновому рецептору отдельных инсулиновых производных изобретения:

Аффинность ацилированных аналогов инсулина данного изобретения к человеческому рецептору инсулина определяют в анализе SPA (сцинтилляционного анализа сближения) с помощью антител захвата на микротитровальном планшете. Связанные с антителом бусины («биды») SPA-PVT, антимышиный реагент (Amersham Biosciences, кат. № PRNQ0017) смешивают с 25 мл буфера для связывания (100 мМ HEPES рН 7,8, 100 мМ хлорид натрия, 10 мМ MgSO₄, 0,025% Tween-20). Реакционная смесь для одной планшеты Packard Optiplate (Packard №6005190) включает 2,4 мкл разведенного 1:5000 очищенного рекомбинантного человеческого рецептора к инсулину (с или без экзона 11), количество исходного раствора A14Tyr[¹²⁵I]-человеческого инсулина, соответствующее 5000 имп/мин на 100 мкл реакционной смеси, 12 мкл разведенного 1:1000 антитела F12, 3 мл SPA-бусин и буфер для связывания общим объемом 12 мл. Затем в общей сложности 100 мкл реакционной смеси добавляют в каждую лунку планшеты Packard Optiplate и в планшете производят серию разведений инсулинового производного из соответствующих образцов. Затем образцы инкубируют в течение 16 часов в условиях мягкого встряхивания. Фазы разделяют центрифугированием в течение 1 мин, и платы оценивают с помощью Topcounter. Данные о связывании устанавливают с использованием алгоритма нелинейной регрессии в GraphPad Prism 2.01 (программное обеспечение GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния), и аффинность выражают по отношению (в процентах (%)) к аффинности человеческого инсулина.

Также используется родственный анализ, в котором буфер для связывания также содержит 4,5% HSA для воспроизведения физиологических условий.

Аффинность к инсулиновому рецептору отдельных инсулинов изобретения:

Пример №	Относительная аффинность (0% HSA) (%)	Относительная аффинность (4,5% HSA) (%)
19	3,8	0,30
10	9,5
1	5,0	0,10
1	2,1	0,06
5	2,5
4	3,4
3	2,0
9	1,7	0,20
6	2,6	0,04
7	2,1
8	2,1
12	1,7

Пример №	Относительная аффинность (0% HSA) (%)	Относительная аффинность (4,5% HSA) (%)
11	0,8
17	0,9
13	1,1
15	1,9
20	2,0
22	0,7
16	0,9	0,23
18	2,3
23	1,4
24	7,9	2,23
25	0,4	0,05
26	0,0	0,01
27	0,7	0,06
28	0,3
29	0,2	0,01
30	0,3	0,02
31	16,2	1,11
32	0,3
33	0,5	0,06
21	0,8
34	1,3
35	5,8
36	9,3
37	0,8
40	0,3
38	0,6	0,10
41	1,6	0,31
39	11,2	0,67
Уровень техники 183	10	1,00

Пример №	Относительная аффинность (0% HSA) (%)	Относительная аффинность (4,5% HSA) (%)
46	1,9	0,08
47	1,2	0,10
48	1,3	0,01
49	6,2	0,86
50	4,3	1,21
51	1,7	0,12
52	2,1
53	2,3	0,03
54	3,9	0,91
55	0,3	0,03
56	4,4	0,03
57	2,5
58	0,5
59	0,3

Пример 179, Гидрофобность инсулиновых производных изобретения:

Гидрофобность инсулинового производного определяют с помощью обратнофазовой ВЭЖХ, проведенной в изократических условиях. Время элюции инсулинового производного сравнивают с человеческим инсулином (обозначенным здесь как HI) или другим производным с известной гидрофобностью в тех же условиях. Гидрофобность, k'отн, рассчитывают как: k'отн_{производного}=((t_{производного}-t₀)/(t_{контроля}-t₀))*k'отн_{контроля}. При использовании в качестве контроля HI: k'отн_{контроля}=k'k'отн_HI=1. Нерабочее время системы ВЭЖХ, t₀, определяют путем введения 5 мкл 0,1 мМ NaNO₃. Условия:

Колонка: Lichrosorb RP-C18, 5 мкм, 4×250 мм

Буфер А: 0,1 М натрия фосфат рН 7,3, 10% (по объему) CH₃CN

Буфер В: 50% (по объему) CH₃CN

Вводимый объем: 5 мкл

Время анализа: не более 60 минут.

После прогона начального градиента выбирают изократический уровень для прогона производного и контроля (например, HI), а количество раз элюции производного и контроля в изократических условиях используют в вышеприведенном уравнении для расчета k'отн_{производного}.

Пример №	Относительная гидрофобность, k'отн_{производного}
19	0,07
10	14,60
1	0,33
2	0,25
5	0,23
4	0,48
3	0,77
9	0,31
6	0,19
7	2,78
8	0,14
12	0,94
11	0,19
17	0,57
13	0,10
15	0,43
20	0,15
22	0,20
16	1,15
18	0,10
23	0,16
24	0,26
25	0,22
26	0,21
27	0,05
28	0,42
29	0,05

Пример №	Относительная гидрофобность, k'отн_{производного}
30	0,05
31
32	0,07
33	0,76
21	0,04
34
35	0,84
36	0,24
37	0,56
40	0,09
38
41
46	0,44

Пример 180. Внутрилегочная доставка производных инсулина крысам:

Протокол:

Испытуемое вещество при внутрилегочном введении дозируют путем вливания по каплям. Описывая кратко, самцов крыс линии Вистар (примерно 250 г) анестезируют примерно 60 мл фентанила/дегидродензперидола/-дормикума, введенного в качестве нагрузочной дозы в количестве 6,6 мл/кг подкожно и затем трех поддерживающих доз 3,3 мл/кг подкожно с интервалом 30 мин. Через десять минут после введения в наркоз из хвостовой вены получают базальные образцы (t=-20 мин), затем получают базальные образцы непосредственно перед введением дозы тестируемого вещества (t=0). При t=0 тестируемое вещество вводят эндотрахеально в одно легкое. На шприц, содержащий 200 мкл воздуха и тестируемое вещество (1 мл/кг), устанавливают специальную канюлю с закругленным окончанием. Через отверстие канюлю вводят в трахею и направляют в один из главных бронхов - просто проходя бифуркацию. Во время введения шею пальпируют снаружи, чтобы убедиться в эндотрахеальном положении. Содержимое шприца вводят, затем следует 2-секундная пауза. Затем канюлю медленно вытягивают. Крыс поддерживают в состоянии анестезии в ходе испытания (образцы крови берут в срок до 4 или 8 часов) и умерщвляют после эксперимента.

Фиг.8 и 9 показывают эффект снижения глюкозы в крови и концентрацию инсулина в плазме крови соответственно, при эндотрахеальном введении по каплям инсулина изобретения (пример 9) по сравнению с аналогичным, но не устойчивым по отношению к протеазам, инсулином уровня техники (пример 183).

Пример 181. Внутрилегочная доставка производных инсулина карликовым свиньям:

Протокол:

Свиньям устанавливают центральные венозные катетеры для внутривенных инъекций и забора крови. Свиней не кормят перед легочным экспериментом, т.е. в течение дня до введения, остатки еды от дневного кормления удаляют примерно через час после кормления, и в день введения свиней не кормят. Проходимость катетеров проверяют до эксперимента с помощью физраствора с добавлением 10 МЕ/мл гепарина.

После внутрилегочного введения раствор глюкозы должен быть готов для внутривенного инъекции, чтобы предотвратить гипогликемию, т.е. 4-5 шприцов (20 мл) заполняют стерильной 20% глюкозой, готовой к использованию. Диагноз гипогликемии ставят на основании клинических симптомов и измерения уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра (Glucocard X-meter). Лечение состоит из медленном внутривенном введении 50-100 мл 20% раствора глюкозы (10-20 г глюкозы). Глюкозу дают частями в течение 5-10 минут до достижения эффекта.

Свиней не кормят в течение первой части эксперимента (до 24 ч), но обеспечивают свободным доступом к воде. После получения образцов крови через 16 ч катетеры закрывают с 5000 МЕ/мл гепарина, размещенными в карманах, и свиней освобождают. После получения образцов крови через 24 ч свиней кормят двойной порцией корма и яблок. Свиней не лишают питания в период с 24 ч до 48 ч.

Соединение и внутрилегочное введение

Порошок для внутрилегочного введения

Инсулиновые порошки взвешивают в 8 отдельных порошковых камерах устройства для введения сухого порошка (PennCentury™, модель DP-4, устройство, выполненное на заказ для свиней) в день до эксперимента. Все камеры до дозирования хранят в защищенном от света и влажности месте, держа их на осушающем материале в контейнере, обернутом алюминиевой фольгой, в лаборатории с контролируемой температурой и влажностью.

На основании последнего взвешивания каждого животного, устройство для доставки предварительно устанавливают на ожидаемое удерживание 25 нмоль/кг порошка.

Нагрузочная доза = (вес порошка + (вес устройства и порошка - вес устройства))/2.

Анестезия

Свиньям проводят седацию путем внутривенного введения Domitor® Vet Inj. (медетомидин 1 мг/мл), 0,15 мл/10 кг = 0,4 мл/свинья.

Сразу после этого медленно внутривенно вводят Rapinovet Vet Inj. (пропофол 10 мг/мл) до получения анестезии достаточной глубины. Обычно 2-3 мл/10 кг достаточно, но может потребоваться добавление 1-2 мл до тех пор, пока не станет возможной интубация. Атропин (1 мг/мл) вводят внутримышечно в дозе 0,5 мл/свинья и дают ему подействовать минимум в течение 5 минут перед интубацией.

Для интубации свинью помещают в вентральную позицию с несколько приподнятым передним отделом, на надгортанник наносят спрей с местным анестетиком Xylocaine® (лидокаин 10 мг/доза) и интубируют свиней с помощью ларингоскопа и одноразовых трубок размером 8,0 мм (внутренний диаметр). Две части трубки плотно сжимают вместе.

Расположение устройства во время внутрилегочного введения

Устройство PennCentury™ во время введения должно располагаться в непосредственной близости от наружного конца эндотрахеальной трубки, а ее размер должен быть измерен на устройстве до интубации (помните про L-образный коннектор при этом измерении). Во время введения наконечник устройства PennCentury™ нужно позиционировать в трахее чуть ниже бронха, который идет к правой краниальной доле, что подтверждается с помощью бронхоскопа.

Искусственное дыхание

Устанавливают частоту дыхания до 10/мин и глубину дыхания до 250 мл/вдох. На респиратор устанавливают «детский» мешок для оптимизации времени введения. Анестезиологический аппарат подключают к фильтру, подключенному к эндотрахеальной трубке через L-образный коннектор. Устройство PennCentury™ вводят через L-образный коннектор, который позволяет контролировать глубину и частоту дыхания во время введения препарата.

Методики введения

Устройство PennCentury™ должно быть размещено в соответствии с описанием выше. Свиньям вводят дозу (одну за раз) с помощью устройства PennCentury™ путем ручного введения во время вдоха при помощи регулируемого воздушного насоса PennCentury (модель АР-1). Каждая свинья получает 8 введений спрея (воздушный насос устанавливают на 4 мл) в течение 8 последовательных принудительных ингаляций для того, чтобы вся доза была введена. Камеру осторожно постукивают между введениями спрея, чтобы избежать прилипания порошка к устройству. Для каждой свиньи используют новую подающую трубку. Момент ингаляции очень важен, и спрей нужно вводить в самом начале вдоха (целью является начало на 50 мл ингаляции).

Чтобы нейтрализовать влияние домитора, внутримышечно вводят Antisedan® Vet inj. (атипамезол 5 мг/мл) (0,4 мл/свинья) сразу после введения препарата, а затем свиней возвращают в их клетки и позволяют им выйти из наркоза.

Анализ оставшегося порошка

Испускаемая доза должна составлять все содержимое камеры, после введения препарата устройство взвешивают снова с остаточным порошком, а оставшийся порошок извлекают с помощью экстракционного буфера с 9 мл 0,01 N HCl и 0,05% (w/v) Твин-80 и отправляют на анализ.

Взятие образцов крови

После введения препарата из центрального венозного катетера берут образцы крови в следующие моменты времени:

-10, 0, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240 (4 ч), 300 (5 ч), 360 (6 ч), 8 ч, 10 ч, 12 ч, 14 ч, 16 ч, 24 ч, 32 ч и 48 ч.

Образцы берут с помощью 3-ходового крана; остатки крови вводят животному обратно. Размер образцов: 0,8 мл крови, собранные в трубку, покрытую ЭДТА. После каждого образца крови катетер промывают 5 мл стерильного 0,9% NaCl с 10 МЕ/мл гепарина. Трубку осторожно переворачивают минимум 8 раз, чтобы обеспечить достаточное смешивание крови и антикоагулянта (ЭДТА) и через одну минуту помещают на лед. Трубки центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин и оставляют при 4°С на 1 час после взятия образца. Образцы хранят на льду до пипетирования.

Закрытие катетеров после эксперимента

Ампициллин для однократного внутривенного введения (10 мг/кг = 0,1 мл/кг раствора с концентрацией 100 мг/мл), растворенный в стерильном физрастворе (1 г ампициллина в 10 мл = 100 мг/мл), вводят через катетер, который использовался для забора крови. Оба катетера промывают 4-5 мл стерильного 0,9% NaCl с добавлением гепарина в концентрации 10 МЕ/мл. Катетеры закрывают новым люэровским наконечником с латексной инъекционной мембраной. 4-5 мл стерильного 0,9% NaCl вводят через мембрану. В конце через катетер в качестве блока вводят 0,8 мл гепарина, 5000 МЕ/мл. Требуется соблюдение асептической методики, чтобы избежать роста бактерий в катетере, сопровождающегося повышенным риском тромбообразования.

Анализ образцов крови

10 мкл плазмы пипетируют в 500 мкл буферного раствора EBIO для измерения концентрации глюкозы в плазме в автоанализаторе Biosen.

Образцы плазмы также анализируют путем иммуноанализа на экзогенный инсулин для расчета фармакокинетических параметров.

Внутрилегочное введение инсулина примера 9 карликовым свиньям в соответствии с протоколом выше:

Фиг.10 и 11 показывают фармакокинетический профиль инсулина примера 9 в сравнении с аналогичным инсулином, но без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций А14Е и В25Н (инсулином уровня техники). На фиг.10 показаны данные из того же эксперимента в первые 250 минут, а на фиг.11 из полного 24-часового (1440 минут) курса.

Фармакокинетические данные для инсулина примера 9 сравнены с данными аналогичного инсулина, но без стабилизирующих по отношению к протеазам мутаций А14Е и В25Н (инсулина уровня техники). Данные из этого же эксперимента о времени полужизни (T½) и биодоступности (F_it) по сравнению с внутривенным введением:

Инсулин, пример №	Т½ (минуты)	F_it
уровня техники (см. пример183)	211	4%
9	1127	13%

Пример 182, Деградация аналогов инсулина с использованием ферментов просвета двенадцатиперстной кишки:

Деградация инсулиновых аналогов с использованием ферментов просвета двенадцатиперстной кишки (изготовленных путем фильтрации содержимого просвета двенадцатиперстной кишки) от крыс SPD (Sprague-Dawley). Анализ выполняет автомат в 96-луночном планшете (2 мл) с 16 лунками для инсулиновых аналогов и стандартов. Инсулиновые аналоги в концентрации примерно 15 мкМ инкубируют с ферментами двенадцатиперстной кишки в 100 мМ Hepes, pH=7,4 при 37°С, образцы берут через 1, 15, 30, 60, 120 и 240 мин и останавливают реакцию добавлением TFA. Интактные инсулиновые аналоги в каждой точке определяют с помощью ОФ-ВЭЖХ. Время полураспада определяют путем экспоненциальной подгонки данных и нормирования по времени полураспада, определенному в каждом анализе для контрольных инсулинов, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина или человеческого инсулина. Количество ферментов, добавленных для деградации, является таким, что время полураспада контрольного инсулина составляет от 60 мин до 180 мин. Результат представляют как время полураспада инсулинового аналога в двенадцатиперстной кишке крыс, деленное на время полураспада контрольного инсулина из того же эксперимента (относительная скорость деградации).

Пример №	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с А14Е, В25Н, desВ30 человеческим инсулином	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с человеческим инсулином
19	1,8	21,6
2	1,3	15,6
3	0,7	8,4
9	0,8	9,6
8	1,8	21,6

Пример №	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с А14Е, В25Н, desВ30 человеческим инсулином	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с человеческим инсулином
11	0,9	10,8
13	1,5	18
22	0,9	11
16	0,5	6
18	1,1	13,2
23	1,9	22,8
24	1,2	14,4
25	1,1	13,2
26	1,2	14,4
27	2,9	35
28	0,7	7,2
29	3,1	37
30	2,1	25,2
31	1,6	19,2
32	1,9	22,8
33	0,5	6
21	1,1	13,2
34	1,0	12
35	0,6	7,2
36	0,9	10,8
37	0,8	9,6
40	0,7	8,4
38	0,5	6
41	0,7	8,4
Уровень техники 183	0,1	1,2
46	2,0	24
47	0,6	7
48	0,5	6

Пример №	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с А14Е, В25Н, desB30 человеческим инсулином	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с человеческим инсулином
49	0,1	1,2
50	0,5	6
51	1,0	12

Фармакокинетика у крыс:

Фармакокинетика при внутривенном введении у крыс:

Анестезированным крысам внутривенно вводят инсулиновые аналоги в различных дозах и измеряют в плазме концентрацию используемых соединений с помощью иммунологических анализов или масс-спектрометрии через определенные промежутки времени после приема в течение 4 часов или более. Затем рассчитывают фармакокинетические параметры с помощью WinNonLin Professional (Pharsight Inc, Маунтин-Вью, Калифорния, США).

Используют самцов крыс линии Вистар (Taconic) весом примерно 200 грамм, не лишенных еды.

Измеряют вес тела крыс и затем их анестезируют Hypnorm/Dormicum (каждое соединение разводят отдельно в стерильной воде 1:1, а затем смешивают; готовят свежий раствор в день эксперимента). Анестезию начинают 2 мл/кг смеси Hypnorm/Doricum подкожно, затем вводят две поддерживающие дозы по 1 мл/кг подкожно с интервалами 30 мин и две поддерживающие дозы по 1 мл/кг подкожно с интервалом 45 мин. Если нужно держать крыс под легким наркозом, производят дальнейшие введения 1-2 мл/кг подкожно. Взвешивание и введение в наркоз осуществляют в комнате, в которой крысы содержатся, чтобы избежать у животных стресса, вызванного их перемещением из одной комнаты в другую.

Фармакокинетика при пероральном введении у крыс:

Зонд:

Крысам, находящимся в сознании, перорально вводят инсулиновые аналоги. Концентрации используемых соединений в плазме, а также изменения уровня глюкозы в крови измеряют через определенные промежутки времени в течение 4-6 часов после введения препарата. Фармакокинетические параметры впоследствии рассчитывают с помощью WinNonLin Professional (Pharsight Inc, Маунтин Вью, Калифорния, США).

Самцов крыс линии Sprague-Dawley (Taconic) весом 250-300 г не кормят в течение примерно 18 ч и затем вводят тестируемое соединение или носитель.

Композиция состава, используемого для перорального введения через зонд. является следующей (в % по весу):

45% пропиленгликоля (Merck)

33% Capmul MCM C10 (Abitec)

11% полоксамера 407 (BASF)

11% полиэтиленгликоля 3350 Ultra (Fluka)

Количество добавленного инсулина вычитается в равной степени из Capmul MCM C10, полоксамера 407 и ПЭГ 3350, но не из пропиленгликоля, чтобы сохранить количество вводимого пропиленгликоля постоянным на уровне 45% независимо от препарата.

Нейтральный инсулин (лиофилизированный из раствора с рН 7,4) растворяют в пропиленгликоле при комнатной температуре при легком покачивании. В зависимости от инсулина и количества инсулина его растворение в пропиленгликоле может занять несколько часов. Полученный раствор должен быть прозрачным. Другие добавки, Capmul, полоксамер и ПЭГ 3350, смешивают и подвергают таянию вместе при 58°С, чтобы также получить прозрачный, слегка желтоватый раствор. Затем раствор инсулина в пропиленгликоле нагревают до 35°С и добавляют растаявшие добавки порциями с использованием магнитной мешалки. Полученная смесь должна быть прозрачной и однородной при температуре 35°С и должна образовывать полутвердое тело при хранении в холодильнике. После приготовления композиции SEDDS ее охлаждают до 5°С, чтобы она затвердела.

Образцы крови для определения концентрации глюкозы в цельной крови собирают в гепаринизированные 10 мкл капиллярные трубки путем пункции капиллярных сосудов в кончике хвоста. Концентрации глюкозы в крови измеряют после разведения в 500 мкл аналитического буфера глюкозооксидазным способом с использованием автоанализатора Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Германия). Для каждого соединения определяют средние концентрации глюкозы в крови (среднее значение ± стандартная ошибка среднего).

Собирают образцы для определения концентрации инсулина в плазме. 100 мкл образцов крови втягивают в охлажденные пробирки с ЭДТА. Образцы сохраняют на льду до центрифугирования (7000 об/мин, 4°С, 5 мин), плазму пипетируют в микропробирки и замораживают при -20°С до анализа. Плазменные концентрации инсулиновых аналогов оценивают в Assay and Technology dept. с помощью иммуноанализа, который считается целесообразным или является утвержденным для отдельного аналога.

Образцы крови берут во временные точки t=-10 (только для глюкозы в крови), t=-1 (прямо перед введением препарата) и через определенные промежутки времени в течение 4-6 часов после введения препарата.

Внутрикишечное введение:

Анестезированным крысам вводят внутрикишечно (в тощую кишку) инсулиновые аналоги. Концентрации используемых соединений в плазме, а также изменения уровня глюкозы в крови измеряют через определенные промежутки времени в течение 4 часов после введения препарата. Фармакокинетические параметры впоследствии рассчитывают с помощью WinNonLin Professional (Pharsight Inc, Маунтин Вью, Калифорния, США).

Самцов крыс линии Sprague-Dawley (Taconic) весом 250-300 г, лишенных пищи в течение примерно 18 ч, анестезируют подкожно 2 мл/кг Hypnorm/Dormicum (0,079 мг/мл фентанила цитрата, 2,5 мг/мл флуанизона и 1,25 мг/мл мидазолама) в качестве нагрузочной дозы (до временной точки -60 минут до введения тестируемого вещества), 1 мл/кг через 20 мин, а затем по 1 мл/кг каждые 40 мин.

Инсулины, тестируемые на модели внутрикишечного введения, собраны также, как составы для введения через зонд, описанные выше.

Анестезированных крыс помещают на одеяло с постоянной температурой, стабилизированной на уровне 37°С. 20 см полиэтиленовый катетер устанавливают на 1 мл шприц, заполненный инсулиновым составом или носителем. На брюшной стенке по срединной линии осуществляют разрез длиной 4-5 см. Катетер осторожно вставляют в среднюю часть тощей кишки на расстоянии примерно 50 см от слепой кишки путем проникновения через кишечную стенку. Если присутствует содержимое кишечника, место введения перемещают на ±10 см. Наконечник катетера примерно на 2 см вводят в просвет кишечного сегмента и фиксируют без использования лигатур. Кишечник аккуратно перемещают в брюшную полость, а брюшную стенку и кожу закрывают автоклипсами послойно. В момент времени 0 крысам вводят с помощью катетера 0,4 мл/кг тестируемого соединения или носителя.

Собирают образцы для определения концентрации инсулина в плазме. 100 мкл образцов крови втягивают в охлажденные пробирки с ЭДТА. Образцы сохраняют на льду до центрифугирования (7000 об/мин, 4°С, 5 мин), плазму пипетируют в микропробирки и замораживают при -20°С до анализа. Плазменные концентрации инсулиновых аналогов оценивают в иммуноанализе, который считается целесообразным или является утвержденным для отдельных аналогов.

Образцы крови берут во временные точки t=-10 (только для глюкозы в крови), t=-1 (прямо перед введением препарата) и через определенные промежутки времени после введения препарата в течение 4 часов или более.

Пример №	MRT (мин) (среднее время удержания, зонд)	Fpo, зонд (%)	Fpo, внутрикишечное введение (%)
183 (уровня техники)	97±15	0,005±0,009	0,28±0,14
2	401±82	0,05±0,02
9	345±111	0,10±0,09	1,9±1,0
13	251±47	0,12±0,08
16	416±37	0,06±0,04	1,8±1,9
18	149±29	0,13±0,07
24	194±54	0,06±0,05	1,4±1,1
25	481±108	0,20±0,05	3,3±1,2
26
33

Фармакодинамика у крыс:

Ниже приведены уровни глюкозы в крови в зависимости от времени, прошедшего с момента перорального введения (как описано выше) отдельных ацилированных инсулинов изобретения:

Пример 183

Пероральный эффект у самцов крыс линии Вистар, лишенных еды в течение ночи, инсулина уровня техники, т.е.:

B29K(N^εоктадекандиол-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин приведен на фиг.1 ниже.

Пример 184

Активность ацилированных аналогов инсулина данного изобретения по сравнению с человеческим инсулином

Самцы крыс линии Sprague-Dawley весом в день эксперимента 238-383 г используются для «кламп»-эксперимента (с гиперинсулинемической фиксацией состояния эугликемии). Крысы имеют свободный доступ к корму в контролируемых условиях окружающей среды и лишены корма в течение ночи (с 3 часов ночи) до «кламп»-эксперимента.

Протокол эксперимента:

Крысы акклиматизируются в помещениях для животных как минимум в течение 1 недели до хирургической процедуры. Примерно за 1 неделю до «кламп»-эксперимента под галотановым наркозом вводят катетеры Tygon в яремную вену (для инфузий) и сонную артерию (для забора крови), выводят на поверхность тела и закрепляют на задней части шеи. После хирургического вмешательства крысам дают Streptocilin vet. (Boehringer IngelHeim, 0,15 мл/крыса, внутримышечно) и располагают в помещениях для лечения животных (25°С) на период восстановления. С целью обезболивания во время наркоза вводят анорфин (0,06 мг/крыса, подкожно), а римадил (1,5 мг/кг, подкожно) вводят после полного восстановления от наркоза (2-3 ч) и еще один раз в день в течение 2 дней.

В 7 часов утра в день эксперимента крыс, лишенных корма (с 3 часов ночи предыдущего дня), взвешивают и подсоединяют к шприцам для взятия образцов и к инфузионным системам (шприцевые насосы Harvard 22, Harvard, и стеклянный шприц Perfectum Hypodermic, Aldrich), а затем помещают в отдельные клетки для «кламп»-эксперимента, где они остаются в течение примерно 45 мин до начала эксперимента. Крысы в состоянии свободно передвигаться по своей обычной подстилке в течение всего эксперимента и имеют свободный доступ к питьевой воде. Через 30 мин базального периода, в течение которого уровни глюкозы в плазме измеряют с 10-минутными интервалами, тестируемое инсулиновое производное и человеческий инсулин (один уровень дозы на крысу, n=6-7 на уровень дозы) вводят (внутривенно) с постоянной скоростью в течение 300 мин. Возможно осуществляют первую болюсную инфузию тестируемого инсулинового производного для немедленного достижения устойчивого уровня в плазме. Специалисты по фармакокинетике в данной области могут рассчитать дозу первой болюсной инфузии на основе данных о клиренсе, полученных для фармакокинетики внутривенного болюса. Уровни глюкозы в плазме оценивают через 10-минутные интервалы в течение всего времени и соответственно корректируют инфузию 20% водного раствора глюкозы для поддержания эугликемии. Образцы ресуспендированных эритроцитов от каждой крысы объединяют и возвращают в объеме примерно ½ мл через катетер в сонной артерии.

В каждый день эксперимента образцы растворов отдельных тестируемых производных инсулина и раствор человеческого инсулина берут до и в конце «кламп»-эксперимента и подтверждают концентрации пептидов с помощью ВЭЖХ. Концентрации инсулина и С-пептида в плазме крысы, а также тестируемого инсулинового производного и человеческого инсулина измеряют в соответствующие временные точки до и в конце исследования. Крыс умерщвляют в конце эксперимента путем передозировки пентобарбиталом.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID №5-11 являются последовательностями для А-цепей, присутствующими в соединениях данного изобретения, показанных в конкретных, приведенных выше примерах, a SEQ ID №12-29 являются последовательностями для В-цепей, присутствующими в соединениях данного изобретения, показанных в конкретных, приведенных выше примерах.

Claims

1. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин, содержащий аминокислотную последовательность А-цепи формулы 1, т.е. Xaa_A(-2)-Xaa_A(-1)-Xaa_A0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa_A8-Ser-Ile-Cys-Xaa_A12-Xaa_A13-Xaa_A14-Xaa_A15-Leu-Glu-Xaa_A18-Tyr-Cys-Xaa_A21 (SEQ ID No:1), и аминокислотную последовательность В-цепи формулы 2, т.е. Хаа_В(-2)-Хаа_В(-1)-Xaa_B0-Xaa_B1-Xaa_B2-Xaa_B3-Xaa_B4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa_B10-Leu-Val-Glu-Xaa_B14-Leu-Xaa_B16-Xaa_B17-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa_B24-Xaa_B25-Xaa_B26-Xaa_B27-Xaa_B28-Хаа_В29-Xaa_B30-Xaa_B31-Xaa_B32 (SEQ ID No:2),
где Xaa_A(-2) отсутствует или Gly;
Xaa_A(-1) отсутствует или Pro;
Xaa_A0 отсутствует или Pro;
Xaa_A8 независимо выбрана из Thr и His;
Xaa_A12 независимо выбрана из Ser, Asp и Glu;
Xaa_A13 независимо выбрана из Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_A14 независимо выбрана из Tyr, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_A15 независимо выбрана из Gln, Asp и Glu;
Xaa_A18 независимо выбрана из Asn, Lys, Leu и Gln;
Xaa_A21 независимо выбрана из Asn, Gly и Gln;
Xaa_B(-2) отсутствует или Gly;
Xaa_B(-1) отсутствует или Pro;
Xaa_B0 отсутствует или Pro;
Xaa_B1 отсутствует или независимо выбрана из Phe, Gln и Glu;
Xaa_B2 отсутствует или Val;
Xaa_B3 отсутствует или независимо выбрана из Asn и Gln;
Xaa_B4 независимо выбрана из Gln и Glu;
Xaa_B10 независимо выбрана из His, Asp, Pro и Glu;
Xaa_B14 независимо выбрана из Ala и Thr;
Xaa_B16 независимо выбрана из Tyr, Asp, Gln, His, Arg и Glu;
Xaa_B17 независимо выбрана из Leu и Ser;
Xaa_B24 независимо выбрана из Phe и His;
Xaa_B25 независимо выбрана из Phe, Asn и His;
Xaa_B26 отсутствует или независимо выбрана из Tyr, His, Thr, Gly и Asp;
Xaa_B27 отсутствует или независимо выбрана из Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser и Glu;
Xaa_B28 отсутствует или независимо выбрана из Pro, His, Gly, Glu и Asp;
Xaa_B29 отсутствует или независимо выбрана из Lys, Arg и Gln;
Xaa_B30 отсутствует или Thr;
Xaa_B31 отсутствует или Leu;
Xaa_B32 отсутствует или Glu;
С-конец может быть в качестве опции преобразован в амид;
где аминокислотная последовательность А-цепи и аминокислотная последовательность В-цепи соединены посредством дисульфидных мостиков между цистеином в положении 7 А-цепи и цистеином в положении 7 В-цепи, цистеином в положении 20 А-цепи и цистеином в положении 19 В-цепи, а цистеины в положениях 6 и 11 А-цепи также соединены дисульфидным мостиком;
где N-конец аминокислотной последовательности А-цепи может быть в качестве опции присоединен к С-концу аминокислотной последовательности В-цепи с помощью аминокислотной последовательности, содержащей 3-7 аминокислот, с образованием одноцепочечной молекулы инсулина;
где N-конец В-цепи удлинен на 1-10 аминоксилот;
где при условии что Xaa_A8 представляет собой Thr, Xaa_A12 представляет собой Ser, Xaa_A13 представляет собой Leu и Xaa_A14 представляет собой Tyr, тогда Xaa_A15 представляет собой Glu или Asp;
и где при условии что Xaa_B24 представляет собой Phe, Xaa_B25представляет собой Phe, Xaa_B26 представляет собой Tyr, Xaa_B27 представляет собой Thr и Xaa_B28 представляет собой Pro, тогда Xaa_B29 представляет собой Gln,
где указанный ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин состоит из не стабилизированного по отношению к протеазам инсулина (родительского инсулина), в котором по меньшей мере две аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из триптофана (Trp, W), фенилаланина (Phe, F), валина (Val, V), изолейцина (Ile, I), лейцина (Leu, L) и тирозина (Tyr, Y), были заменены аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из глутаминовой кислоты (Glu, Е), аспарагиновой кислоты (Asp, D), гистидина (His, Н), глутамина (Gln, Q), аспарагина (Asn, N), серина (Ser, S), треонина (Thr, Т), пролина (Pro, Р), глицина (Gly, G), лизина (Lys, K) и аргинина (Arg, R), где А-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию и В-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с родительским инсулином,
и где ацильная группировка присоединена к остатку лизина или в N-концевую позицию в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине и имеет общую формулу

где
n равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 3;
m равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 10;
p равно 0 или целому числу в диапазоне от 1 до 10;
Acy представляет собой жирную кислоту или жирную двухосновную кислоту, содержащую от 8 до 24 атомов углерода;
AA1 представляет собой остаток нейтральной линейной или циклической аминокислоты;
AA2 представляет собой остаток кислой аминокислоты;
AA3 представляет собой остаток нейтральной аминокислоты, содержащей алкиленгликоль;
порядок, в котором AA1, AA2 и AA3 появляются в формуле, можно менять независимо;
AA2 может появляться в формуле несколько раз (например, Acy-AA2-AA3₂-AA2-);
AA2 могут появляться в формуле независимо (=быть различными) несколько раз (например, Acy-AA2-AA3₂-AA2-);
связи между Acy, АА1, AA2 и/или AA3 являются амидными (пептидными) связями, которые формально могут быть получены путем удаления атома водорода или гидроксильной группы (воды) из Acy, AA1, AA2 и AA3;
и присоединение к инсулину, стабилизированному по отношению к протеазам, может происходить с С-конца остатков AA1, AA2 или AA3 в ацильной группировке формулы (I) или со стороны одной из боковых цепей остатка AA2, находящегося в группировке формулы (I).

2. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где ацильная группировка присоединена к остатку лизина в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине.

3. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где ацильная группировка присоединена к аминогруппе N-концевого остатка А-цепи в стабилизированном по отношению к протеазам инсулине.

4. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где Acy представляет собой жирную двухосновную кислоту, предпочтительно жирную (α,ω)-двухосновную кислоту, наиболее предпочтительно гептодекандиовую, гексадекандиовую, октадекандиовую, нонадекандиовую, докозандиовую, эйкозандиовую кислоту.

5. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где АА2 представляет собой γGlu, αGlu, βAsp, αAsp, γ-D-Glu, α-D-Glu, β-D-Asp, α-D-Asp или аминокислоту, выбранную из следующих формул:

где стрелки указывают на точки присоединения аминокислот к аминогруппам AA1, AA2, AA3, или к ε-аминогруппе остатка лизина В29, или к N-концевой позиции в стабилизированном к протеазам инсулине.

6. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где AA3 выбран из одной из следующих формул:

и

где r равно 1, 2, 3, 5, 7, 11, 23 или 27.

7. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где аминокислота в положении A12 представляет собой Glu или Asp; и/или аминокислота в положении A13 представляет собой His, Asn, Glu или Asp; и/или аминокислота в положении A14 представляет собой Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly или His; и/или аминокислота в положении A15 представляет собой Glu или Asp; и аминоксилота в положении B24 представляет собой His; и/или аминокислота в положении B25 представляет собой His или Asn; и/или аминоксилота в положении B26 представляет собой His, Gly, Asp или Thr; и/или аминокислота в положении B27 представляет собой His, Glu, Asp, Gly или Arg; и/или аминокислота в положении B28 представляет собой His, Gly, Glu или Asp.

8. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 7, обладающий одной или более мутацией, выбранной из группы, состоящей из A8His, A18Gln, A21Gln, A21Gly, B1Glu, B1Gln, B3Gln, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu и desB30.

9. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 8, где аминокислота в позиции А14 представляет собой Glu, Asp или His, аминокислота в позиции В25 представляет собой His, а аминокислота в позиции B30 делетирована.

10. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 8, где мутация представляет собой desB30.

11. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 7, где A14 представляет собой Glu.

12. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 7, где B25 представляет собой His.

13. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где С-концевой аминокислотный остаток в цепи А стабилизированного по отношению к протеазам инсулина представляет собой А21 аминокислотный остаток.

14. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, где стабилизированный по отношению к протеазам инсулин выбран из группы, состоящей из A14E, A18L, B25H, desB30 человеческого инсулина; A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 человеческого инсулина; A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30 человеческого инсулина; A14E, B1E, B25H, В28Е, desB30 человеческого инсулина; A14E, B16H, B25H, desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B27E, desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, desB27, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческого инсулина; A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 человеческого инсулина; A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A14E, A21G, B25H, desB30 человеческого инсулина и A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 человеческого инсулина, и где ацильная группировка присоединена к остатку лизина или к N-концевой позиции указанного стабилизированного по отношению к протеазам инсулина.

15. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, который может быть выбран из группы, состоящей из A14E, B25H, B29K(N^ε-гексадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^ε3-карбокси-5-октадекандиоиламинобензоил), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^ε-N-октадекандиоил-N-(2-карбоксиэтил)глицил), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^ε(N-октадекандиоил-N-карбоксиметил)-бета-аланил), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^ε4-([4-({19-карбоксинонадеканоиламино}метил)транс-циклогексан-карбонил]-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εгептадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εмиристил), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^ε4-([4-({19-карбоксинонадеканоиламино}метил)транс-циклогексан-карбонил]-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-PEG7), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εгептадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B29K-(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B27E, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B16H, B25H, B29K-(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A14E, B16E, B25H, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Е, В25Н, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-OEG-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A18L, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A18L, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, В27Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческого инсулина; А14Е, B1F(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), В25Н, B29R, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αгексадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^αэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, В29К(N^α4-[16-(1H-тетразол-5-ил)-гексадеканоилсульфамоил]бутаноил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K-(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εдокозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εдокозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-эйкозандиоил-N-карбоксиметил)-βAla), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε3-[2-(2-{2-[2-(17-карбоксигептадеканоиламино)этокси]-этокси}этокси)этокси]пропионил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε3-[2-(2-{2-[2-(19-карбоксинонадеканоиламино)этокси]этокси}этокси)этокси]пропионил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-({17-карбоксинонадеканоиламино}метил)транс-цикло-гексанкарбонил]-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε4-([4-({17-карбоксигептадеканоиламино}метил)транс-циклогексанкарбонил]-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K-(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εгексадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В1Е, В25Н, В27Е, В28Е, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-эйкозандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-октадекандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε(N-гексадекандиоил-N-карбоксиметил)-βAla-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-аминопропокси)этокси]этокси}пропилкарбамоил)метокси]ацетил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K-(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), А14Е, A21G, В25Н, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B27K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^ε(5-эйкозандиоиламиноизофталевая кислота)), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-Aoc), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, В16Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B29R, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B27K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB28, desB29, desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-γGlu-γGlu), desB30 человеческого инсулина; A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, desB27, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, A21G, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εоктадекандиоил), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu), desB30 человеческого инсулина; А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29K(N^εэйкозандиоил), desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αэйкозандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αэйкозандиоил-γGlu), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αэйкозандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, desB30 человеческого инсулина; A1G(N^αоктадекандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческого инсулина и A1G(N^αэйкозандиоил), А14Е, В25Н, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 человеческого инсулина,
где OEG представляет собой NH₂(CH₂)₂O(CH₂)₂OCH₂CO₂H, a PEG7 представляет собой NH₂((CH₂)₂O)₈CH₂CH₂CO₂H.

16. Ацилированный инсулин по п. 1, где указанный инсулин представляет собой А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин.

17. Ацилированный инсулин по п. 1, где указанный инсулин представляет собой А14Е, В25Н, desB27, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu), desB30 человеческий инсулин.

18. Ацилированный инсулин по п. 1, где указанный инсулин представляет собой А14Е, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин.

19. Ацилированный инсулин по п. 1, где указанный инсулин представляет собой А14Е, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-γGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин.

20. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, имеющий повышенную растворимость в сравнении с ацилированным родительским инсулином.

21. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, который имеет улучшенную стабильность по отношению к одному или более ферменту протеазе в сравнении с родительским инсулином.

22. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по п. 1, который имеет улучшенную стабильность по отношению к двум или более ферментам протеазам в сравнении с родительским инсулином.

23. Ацилированный, стабилизированный по отношению к протеазам инсулин по любому из пп. 1-7 для применения в лечении или профилактике гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета 1 типа.

24. Применение терапевтически эффективного количества стабилизированного по отношению к протеазам инсулина по любому из предыдущих пунктов для изготовления фармацевтического состава для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушенной толерантности к глюкозе и сахарного диабета 1 типа.