RU2390780C1

RU2390780C1 - Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления

Info

Publication number: RU2390780C1
Application number: RU2008149453/15A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Анатольевна Анедченко (RU); Екатерина Анатольевна Анедченко; Татьяна Викторовна Виноградова (RU); Татьяна Викторовна Виноградова; Ирина Борисовна Зборовская (RU); Ирина Борисовна Зборовская; Марина Валерьевна Зиновьева (RU); Марина Валерьевна Зиновьева; Лев Львович Киселев (RU); Лев Львович Киселев; Татьяна Тихоновна Кондратьева (RU); Татьяна Тихоновна Кондратьева; Евгений Павлович Копанцев (RU); Евгений Павлович Копанцев; Ольга Викторовна Сахарова (RU); Ольга Викторовна Сахарова; Евгений Давидович Свердлов (RU); Евгений Давидович Свердлов; Вера Николаевна Сенченко (RU); Вера Николаевна Сенченко
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН)
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2010-05-27

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и касается способа диагностики немелкоклеточного рака легкого и набора для его осуществления. Сущность изобретения включает способ диагностики немелкоклеточного рака легких гена NPRL2, основанный на измерении содержания мРНК методом ПЦР в режиме реального времени и набор для его осуществления. Сниженное содержание мРНК в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легкого. Преимущество изобретения заключается в разработке способа, позволяющего с высокой достоверностью диагностировать немелкоклеточный рак легкого, в первую очередь плоскоклеточный рак, в том числе на самой ранней стадии прогрессии опухолевой трансформации. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), в первую очередь плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ).

Уровень техники

Рак легкого (РЛ) остается одной из основных причин смерти онкологических больных в мире. Смертность от этого заболевания превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых [Jemal A., Siegel R., Ward Е., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. 2006. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 56, 6-30]. В России показатели смертности от рака легкого у мужчин 68,2 случая на 100 тысяч населения, у женщин - 6,8 случая [Заридзе Д.Г. 2004. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований, стр.29-85 - в кн. Канцерогенез / под ред. Д.Г.Заридзе. - М.: Медицина]. Различают два основных вида РЛ: мелкоклеточный (МРЛ) и немелкоклеточный (НМРЛ), составляющих 15-20 и 75-80% соответственно. К НМРЛ относят плоскоклеточный рак легкого (ПКРЛ), аденокарциному легкого (АК) и крупноклеточный рак. Среди разных форм РЛ по частоте встречаемости ПКРЛ занимает первое место, АК - второе.

Диагноз в половине случаев НМРЛ устанавливают на далеко зашедшей стадии опухолевого процесса, что делает малоэффективным радикальное излечение. Современные методы лечения повышают среднюю пятилетнюю продолжительность жизни больных НМРЛ не более чем на 15%. Этот показатель может быть существенно улучшен с помощью разработки методов ранней диагностики.

Основными методами диагностики РЛ служат инструментальные - рентгеновские и эндоскопические. Используют также анализ мокроты на атипичные клетки, биопсию тканей легких, компьютерную томографию, флуоресцентную фиброскопию. Иммунологические методы диагностики находят пока ограниченное клиническое применение. Практическую значимость имеет определение опухолевых маркеров: СЕА - раково-эмбриональный антиген - онкомаркер рака прямой кишки, но может использоваться в оценке РЛ; NSE - нейрон-специфическая энолаза - в ряде случаев используют в оценке состояния пациентов с РЛ; тканевой полипептидный антиген (ТРА) - фрагмент цитокератина, более специфичный маркер РЛ. Эти маркеры применяют для контроля лечения, выявления рецидивов, но не для диагностики РЛ на ранней стадии. Для диагностики НМРЛ широко используют маркеры SCCA или SCC -антиген плоскоклеточной карциномы (SCC - squamous cell carcinoma) и фрагмент цитокератина 19 (CYFRA 21.1 - cytokeratin fragment) [Pastor A., Menendez R., Cremades M.J., Pastor V., Llopis R., Aznar J. 1997. Diagnostic value of SCC, CEA and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Bayesian analysis. Eur Respir J. 10, 603-609; Buccheri G., Torchio P., Ferrigno D. 2003. Clinical Equivalence of Two Cytokeratin Markers in Non-small Cell Lung Cancer. A Study of Tissue Polypeptide Antigen and Cytokeratin 19 Fragments. Chest. 124, 622-632], которые, однако, малопригодны для ранней диагностики РЛ.

Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить также изменения генома в опухолевых клетках - точечные мутации в кодирующих и регуляторных участках генов, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, изменение содержания мРНК генов, метилирование промоторных участков генов и др., а также изменения функциональной активности многих генов. В отличие от белковых, молекулярно-генетические маркеры обладают значительно большей чувствительностью. В числе перспективных потенциальных маркерных генов, вовлеченных в канцерогенез разных форм РЛ, рассматривают новые гены, потенциальные супрессоры опухолевого роста (TSG, tumor suppressor genes) на коротком плече хромосомы 3 человека [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2002. Tumor Suppressor Genes on Chromosome 3p Involved in the Pathogenesis of Lung and Other Cancers. Oncogene. 21, 6915-6935; Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. 2005. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина. 3, 17-28]. Цитогенетический район 3р21 по сравнению с другими обогащен белок-кодирующими генами [Bertone P., Stole V., Royce T.E., Rozowsky J.S., Urban A.E., Zhu X., Rinn J.L., Tongprasit W., Samanta M., Weissman S., Gerstein M., Snyder M. 2004. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 24, 2242-46]. С целью идентификации новых TSG проведено детальное картирование геми- и гомозиготных делеций на 3p при мелкоклеточном и немелкоклеточном РЛ и других карциномах человека с использованием различных методов [Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. 2004. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 38, 145-154]. Полученные данные подтвердили существенную роль генов из района 3р21 в канцерогенезе, как и предполагали ранее [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2002. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 21, 6915-35]. В критичной области LUCA (3р21.3), для которой характерна высокая частота делеций в вышеперечисленных опухолях, картирован участок гомозиготных делеций, содержащий 17 генов [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2005. Chromosome 3 abnormalities in lung cancer. In: Lung Cancer: Principles and Practice. Third Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadephia. 118-134]. В число этих генов входит ген NPRL2 (PubMed ID: 11085536. другие обозначения: tumor suppressor candidate 4 - TUSC4, NPR2, NPR2L, G21) протяженностью 3.3 т.п.н., содержащий 11 экзонов и кодирующий основной транскрипт длиной 18 т.п.н. с множественными сплайсированными изоформами, которые экспрессируются во всех нормальных тканях, включая ткани легкого [Lerman M.I. and Minna J.D. 2000. The International Lung Cancer Chromosome 3р21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome 3р21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. Cancer Res. 60: 6116-6133; Li J., Wang F., Haraldson K., Protopopov A., Duh F.M., Geil L., Kuzmin I., Minna J.D., Stanbridge E., Braga E., Kashuba V.I., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. 2004. Functional characterization of the candidate tumor suppressor gene NPRL2 located in 3p21.3C. Cancer Res. 64(18): 6438-43]. Главный продукт, кодируемый геном NPRL2, - растворимый белок ядерной локализации, состоящий из белок-связывающего домена, имеющего сходство с коровым доменом белка MutS и домена, регулирующего пермеазу азота, осуществляющую транспорт азота через клеточные мембраны. Белок NPRL2 может быть вовлечен в процесс репарации неспаренных оснований в ДНК, регуляции клеточного цикла и активации путей апоптоза [Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. 2005. Chromosome 3 abnormalities in lung cancer. In: Lung Cancer: Principles and Practice. Third Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadephia. 118-134].

Эти функции относят к ключевым для нормального функционирования клетки и ее нарушение, несомненно, важное звено в канцерогенезе.

Для выявления супрессорной активности белковых продуктов TSG, т.е. способности к частичному или полному подавлению роста опухолевых клеток, существует несколько методов [Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. 2004. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 38, 145-154; Ito I., Ji L., Tanaka F., Saito Y., Gopalan B., Branch C.D., Xu K., Atkinson E.N., Bekele B.N., Stephens L.C., Minna J.D., Roth J.A., Ramesh R. 2004. Liposomal vector mediated delivery of the 3p FUS 1 gene demonstrates potent antitumor activity against human lung cancer in vivo. Cancer Gene Therapy. 11, 733-739]. Сравнительно новый функциональный тест GIT (Gene Inactivation Test) основан на инактивации TSG в опухолевых клетках in vivo и in vitro. Инактивация TSG осуществляется с помощью эукариотических векторов с регулируемой экспрессией, при этом тестируемые гены подвергаются мутациям или делециям в экспериментальных опухолях у иммуннодефицитных SCID-мышей или в опухолевых клеточных линиях. Потеря способности к подавлению роста опухолевых клеток мутантными трансгенами может служить свидетельством принадлежности гена к TSG. «Супрессорная» активность гена NPRL2 показана in vivo и in vitro по отношению к клеткам мелкоклеточного и немелкоклеточного рака различными методами, в том числе с помощью GIT [Li J., Wang F., Haraldson К., Protopopov A., Duh F.M., Geil L., Kuzmin I., Minna J.D., Stanbridge E., Braga E., Kashuba V.I., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. 2004. Functional characterization of the candidate tumor suppressor gene NPRL2 located in 3p21.3C. Cancer Res. 64(18): 6438-43].

Данные по количественной оценке содержания мРНК гена NPRL2 при развитии НМРЛ и в том числе ПКРЛ практически отсутствуют. Таким образом, до последнего времени детальное сравнение содержания мРНК этого гена в опухолях легкого и нормальных тканях легкого не проводилось.

Согласно данным литературы снижение содержания мРНК показано для нескольких генов при НМРЛ. В работе [Terauchi К., Shimada J., Uekawa N., Yaoi Т., Maruyama M., Fushiki S. 2006. Cancer-associated loss of TARSH gene expression in human primary lung cancer. J. Cancer Res. din. Oncol. 132, 28-34] выявлено уменьшение транскрипции гена TARSH, одного из генов, связанных со старением клеток, в опухолевых клеточных линиях и образцах НМРЛ по сравнению с нормой. На основе полученных результатов авторы выдвинули предположение о возможном использовании этого гена в качестве биомаркера для диагностики НМРЛ. Однако в данной работе проведен анализ только 8 образцов ПКРЛ - наиболее распространенной формы РЛ, и необходимы дальнейшие исследования.

Изобретение, предлагающее способ диагностики различных карцином человека, в том числе РЛ, а также лимфом и лейкемий, основано на выявлении цитогенетических изменений и аллельных потерь для 10 генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в критичной области LUCA хромосомы 3, в том числе и NPRL2 [Ji L., Minna J., Roth J., Lerman M. Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors. 2002. Международные патенты № WO 0204511, № US 2004016006].

Изобретение, относящееся к способу диагностики рака молочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, основано на обнаружении повышения содержания мРНК множественных сплайсированных форм гена поверхностного гликопротеина CD44 в опухолевых тканях, соответствующих метастазах и биоптатах по сравнению с нормальными тканями, предполагает проведение ПЦР с радиоактивно меченными праймерами [Tarin D., Matsumura Y. Diagnostic method. 1994. Международный патент № WO 94/02633].

Изобретение, предлагающее способ диагностики лимфом, основано на сравнении относительного содержания мРНК генов легких λ- и κ- иммуноглобулинов, вовлеченных в развитие лимфом, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) [Stalberg A., Kubista M. Method to measure gene expression ratio of key genes. 2002. Патент №20004100112 РФ, международный патент № WO 02/099135 A1].

В работе [Cheng M., Chen Y., Yu X., Tian Z., and Wei H. 2008. Diagnostic utility of LunXmRNA in peripheral blood and pleural fluid in patients with primary non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 8, 156] методом ПЦР в реальном времени (с использованием абсолютных измерений по стандартной кривой) оценили уровень mRNA генов LunX, СК19, СЕА, VEGF-C and hnRNP A2/B1 в периферической крови и плевральной жидкости у больных с диагнозом НМРЛ, рак пищевода, молочной железы и у здоровых добровольцев. В крови мРНК гена LunX обнаружили в 75.0% (33/44) больных только с НМРЛ. Помимо этого мРНК всех других генов обнаружили как у всех исследованных больных, так и здоровых людей. Содержание мРНК гена LunX уменьшалось у больных после лечения. Сделан вывод, что уровень мРНК гена LunX - специфический маркер для рака легкого, который может иметь применение для диагностики НМРЛ. Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.

В указанных выше, а также других изобретениях не использовали снижение содержания мРНК гена NPRL2, в том числе с использованием метода ПЦР-РВ, для диагностики рака легкого.

Для оценки содержания мРНК генов используют различные методы. Современный высокочувствительный метод ПЦР-РВ отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl.4, 357-362]. Метод широко используют в мире, как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности, обычно проводят 96 реакций в одном опыте и в последних моделях приборов - 384 реакции. В отличие от обычной ПЦР, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой TaqДHK-полимеразой, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. Обычно реакция продолжается около 2 часов (40 циклов), в приборах нового поколения - всего 40 мин. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения реакции. На мировом рынке представлены различные модели приборов для ПЦР-РВ, разработанные известными фирмами-изготовителями - Applied Biosystems, Bio-Rad, Invitrogene, Eppendorf и др., а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm).

Несмотря на широкое использование ПЦР-РВ, основного метода количественной оценки содержания мРНК генов на сегодняшний день, в России этот метод еще не получил достаточного распространения как в фундаментальных исследованиях, так и в клинике. Основная причина, ограничивающая его использование, - относительно высокая стоимость приборов и реактивов. Обнадеживает появление на отечественном рынке недорогих приборов, разработанных российскими фирмами, а также недорогих отечественных наборов реактивов («Синтол», «ДНК-Технологии», «Изоген» и др.), сравнимых по эффективности с зарубежными наборами [Манзенюк О.Ю., Малахо С.Г., Пехов В.М., Косорукова И.С., Полтараус А.Б. Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени. Опыт использования в молекулярной онкодиагностике. 2006. Молекулярная биология. 40, 349-356].

Методики и протоколы, описанные в данном изобретении, предполагают, в основном, использование отечественных наборов и, хотя выполнены на приборе ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, США), могут быть адаптированы для отечественных приборов. Сочетание недорогих приборов и отечественных наборов реактивов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных научных и клинических лабораторий.

Из изложенного ясно, что изменение содержания мРНК в качестве молекулярного маркера для диагностики эпителиальных опухолей, и в частности РЛ, пока не нашло широкого практического применения в клиниках. В данной области существует настоятельная потребность в поиске новых диагностических маркеров РЛ, позволяющих достоверно и уже на ранних стадиях диагностировать заболевание, а также в разработке на их основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РЛ, в частности НМРЛ.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа содержания мРНК гена NPRL2 в различных опухолевых тканях легкого на разных этапах злокачественного перерождения и открытия того факта, что уже ранние стадии развития злокачественной трансформации сопровождаются значительным снижением содержания мРНК гена NPRL2.

Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), который представляет собой изменение содержания мРНК гена NPRL2. Снижение содержания мРНК гена в предположительно пораженных раком тканях легкого человека по сравнению с его содержанием в нормальных/здоровых тканях служит диагностическим маркером различных типов НМРЛ, в первую очередь плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ).

В одном из воплощений рак легкого, маркером которого является снижение содержания мРНК гена NPRL2, является немелкоклеточным раком легкого.

В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению изменения содержания мРНК гена NPRL2 в качестве маркера для диагностики немелкоклеточного рака легкого человека.

В одном из воплощений рак легкого, в отношении которого изменение содержания мРНК гена NPRL2 служит в качестве диагностического маркера, является плоскоклеточным раком легкого.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики немелкоклеточного рака легкого, в первую очередь плоскоклеточного рака легкого. Данный способ включает следующие стадии:

а) получение исходной пары образцов тканей от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженных раком тканей, а второй получен из прилегающих гистологически нормальных (условно-нормальных) тканей;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;

в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;

г) нормирование концентрации кДНК NPRL2 по контрольному гену, содержание мРНК которого относительно постоянно в норме и опухоли;

д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена NPRL2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зонда (в случае ПЦР-РВ);

е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК NPRL2 в образце, полученном из предположительно пораженных раком тканей легкого, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК в образце, полученном из нормальных тканей, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают содержание мРНК гена NPRL2, причем его уменьшение служит диагностическим маркером рака легкого.

В одном из воплощений заявленный способ предназначен для диагностики плоскоклеточного рака легкого.

В одном из воплощений способа изобретения на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров, или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.

В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров и зонда представлена SEQ ID NO: 1, 2 и 3.

В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена NPRL2 представляет собой ПНР в реальном времени или ОТ-ПЦР.

В одном воплощении заявленного способа на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров и зонда для осуществления полимеразной цепной реакции с целью определения содержания мРНК гена NPRL2, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3.

Перечень чертежей

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и чертежи, где

Фиг.1. Электрофоретическое разделение в 2%-ном агарозном геле продукта ПЦР-РВ - транскрипта гена NPRL2 (размер 135 п.н.). 1-я и 2-я дорожки транскрипт гена NPRL2 ожидаемого размера в норме и опухоли, 3-я дорожка - М50, маркер молекулярных масс ДНК от 50 до 500 п.н. («Лаборатория Изоген»).

Фиг.2. Изменение порогового цикла C_t, отражающего начальное содержание мРНК контрольного гена GAPDH в норме (N) и опухоли (Т). Рассчитанные значения величины R (относительного содержания мРНК с учетом полученных C_t, см. формулу) для гена GAPDH не превышало 1.5-2 раз (Р<0.05) как в опухоли, так и норме, что свидетельствует о незначительной вариабельности содержания мРНК и приемлемости этого гена для нормирования данных ПЦР-РВ.

Фиг.3. Относительное содержание мРНК гена NPRL23 (R) в различных гистологических типах РЛ (см. формулу). Значение R, равное 1, соответствует отсутствию изменений содержания мРНК исследуемого гена в опухоли по сравнению с нормой, нормированных относительно данных для контрольного гена GAPDH. Пунктиром показана вариабельность содержания мРНК для гена GAPDH. Значения R, равные 0.1 и 0.01, соответствуют снижению содержания мРНК в 10 и 100 раз соответственно. Как видно, снижение содержания мРНК гена RBSP3 обнаружено в большинстве исследованных образцов.

Фиг.4. Относительное содержание мРНК гена NPRL2 (R) в образцах тканей легкого центральной и периферической локализаций от здоровых доноров: NCL(10-14), NPL(10-14) и пула NPL, рассчитанное относительно усредненной условной нормы Ncp от 14 пациентов с диагнозом НМРЛ (левая часть чертежа), а также относительно пула NPL (правая часть чертежа). Как видно из чертежа, содержание мРНК гена в нормальных тканях варьировало не значительно, что показывает приемлемость использования условных норм в качестве образцов сравнения при количественных изменениях методом ПЦР-РВ, а также дополнительных образцов сравнения от здоровых доноров и/или их пулов.

Осуществление изобретения

В данном изобретении предложен способ диагностики немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) методом ПЦР в режиме реального времени, в первую очередь плоскоклеточного рака легкого (ПКРЛ), основанный на измерении содержания мРНК гена NPRL2, а также набор для осуществления этого способа. Это простой и надежный способ диагностики ПКРЛ, а также других типов НМРЛ на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверно обнаруживаемое различие в содержании мРНК гена NPRL2 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения рака легкого.

Образцы тканей легких для анализа

В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при бронхоскопии с прямой биопсией (центральный рак легкого) и трансторакальной (чрезкожной) пункции опухоли (периферический рак).

Выделение РНК из образцов тканей легких

Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков тканей можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК ферментами РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.

Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт - Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например, QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.

Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов тканей легких, перевод в двуцепочечную форму

Реакция обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет перейти от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам ДНК. Дальнейшая ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне нескольких нанограмм), а следовательно, и количества исследуемых легочных тканей, из которых выделяют РНК.

Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С.Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn²⁺.

Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:

1) Олиго(dT)_n-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;

2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;

3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоdT-содержащими праймерами;

4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.

Анализ транскрипции генов можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. В продаже имеются наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также SMART- метод (switching mechanism at the 5' end of RNA templates of reverse transcriptase), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на 3'-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC. Эта олиго(dC)-последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную олиго(dG)-последовательность на 3'-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи [Schmidt W.M., Mueller M.W. 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью 3'-праймера с олиго(dT) на 3'-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптеру. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на 3'-конце. Затем первую цепь амплифицируют в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части 3'-праймера и адаптера. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двуцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным 3'- концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного SMART-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более, чем в 10⁵ раз, что позволяет работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нанограмма), а следовательно, и с небольшим количеством исследуемых тканей [Zhu Y.Y., Machleder Е.М., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897]. Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например, Евроген, Россия (набор MINT), Clontech, США и т.п.

Выбор специфических праймеров и зондов

Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com). Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др. Высокая специфичность ПЦР-РВ обеспечивается за счет использования зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (в данном случае, FAM - 6-carboxy-fluoroscein), а на 3'-конце - т.н. гаситель (в данном случае - DABCYL - 4-(dimethylammoazo)benzene-4-carboxylic acid). В процессе ПЦР взаимодействие FAM и DABCYL нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой, благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции, регистрируемая прибором. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода (протоколы фирмы Applied Biosystems, http://docs.appliedbiosystems.com).

В предпочтительном воплощении используют праймеры и зонд:

NPRL2_F (SEQ ID NO: 1) 5'-GGACCTCACTACACAACAAATCCTG-3';

NPRL2_R (SEQ ID NO: 2) 5'-GTCACAACGCCGTAGTACAGCA-3';

NPRL2_Z (SEQ ID NO: 3) 5'-[FAM]-ACATCCAGAAGATTTCAGCAGAG-

GCAGAT-[Dabcyl]-3'.

Анализ содержания мРНК гена NPRL2 методом ПЦР-РВ

Количественная оценка содержания мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами. В качестве внутреннего контроля, относительно которого проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемого гена NPRL2, выбран «ген домашнего хозяйства» - GAPDH, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов необходимо выбрать контрольный ген, имеющий незначительную вариабельность содержания мРНК в опухолевых и нормальных тканях легкого по сравнению вариабельностью содержания мРНК исследуемых генов. Выбору подходящего контрольного гена для нормирования количественных данных посвящено много обзоров [Radonic A., Thuike S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862; Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. 2005. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6. 279-284; Wong M.L, Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 39, 1-11]. Чаще всего в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным содержанием мРНК в исследуемых образцах. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного на самом деле зависит от степени выбранной/требуемой точности. В настоящем изобретении выбран традиционный и часто используемый контрольный ген GAPDH. Согласно данным литературы этот ген наиболее приемлем в качестве контрольного для образцов НМРЛ и нормальных тканей легкого [D.W.Liu, S.T.Chen, H.P.Liu. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall lung cancer. 2005. Eur. Respir.J. 26, 1002-1008]. Однако вариабельность содержания мРНК необходимо проверять для каждой исследуемой выборки образцов данного типа тканей.

Оценка содержания мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод стандартной кривой) и метод относительных измерений (ΔΔCt - метод, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов в качестве основного метода измерений выбран второй из них. Этот метод позволяет проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требует выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например ОТ-ПЦР.

Выбор образцов сравнения

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае условных норм. «Условной нормой» принято считать образец ткани легкого с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста. При «непригодности» образца условно-нормальной ткани (т.е. в случаях, когда при микроскопии обнаруживали опухолевые клетки, или материал был трудно интерпретируемый) использовали дополнительные образцы сравнения, полученные от «здоровых» доноров (доноры, не страдавшие при жизни раком легкого) или усредненные нормы нескольких имеющихся условных норм.

Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные условные нормы, расчеты относительного содержания мРНК гена NPRL2 (R_кДНК) проводили, используя разные образцы сравнения - парные условные нормы, если они были, и усредненные условные нормы от нескольких больных, если парных норм не было. В качестве дополнительных образцов сравнения использовали по 5 образцов от здоровых доноров центральной и периферической локализации, для которых усредняли значение ΔCt=Ct(NPRL2)-Ct(GAPDH) и далее проводили расчеты R_кДНК.

Учет эффективностей реакций

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов необходимо учитывать эффективности проводимых реакций, которые могут оказать значительное влияние на конечный результат. Для этого разработана программа математической обработки экспериментальных данных ПЦР-РВ, позволяющая рассчитывать эффективность реакций. Программа совместима с файлами экспериментальных данных (Ct, ΔRn и др.) из программного обеспечения Applied Biosystems (ABI Prism SDS Software) и также позволяет проводить статистическую оценку достоверности измеряемых изменений и оценку пригодности выбранного контрольного гена.

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.

Пример 1. Образцы тканей легкого

Образцы тканей различных гистологических типов РЛ (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани легких центральной (NCL) и периферической локализации (NPL) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников НИИ КО ГУ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при фибробронхоскопии, трансторакальных пункциях) и операционного материала. Образцы тканей легкого (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец делили примерно на 3 равные части и хранили в жидком азоте. Общая коллекция опухолевых образцов, подлежащих исследованию, составила 52 (31+21) образца различных гистологических типов рака легкого, из которых 38 - плоскоклеточный рак, 11 - аденокарцинома легкого (3 - бронхиоло-альвеолярная аденокарцинома легкого, 1 - мелкоклеточный рак легкого, 1 - крупноклеточный рак легкого, 1 - карциноид), а также 50 образцов условной нормы. Кроме того, использовали ткани легких, полученные постмортально от 10 человек, не имевших в анамнезе заболеваний раком (норма): пять образцов, взятых в центральных областях легких, и пять - в периферических областях. «Морфологически нормальной» принято считать ткань, в которой при микроскопическом исследовании не определялись признаки клеточной атипии, ткань могла быть представленной клетками мерцательного эпителия, кубического эпителия, альвеолярными макрофагами, лимфоидными элементами. Средний возраст пациентов, среди которых 45 мужчин, 6 женщин, для 1 пациента - нет данных относительно пола и возраста, составляет около 60 лет (диапазон 31-76 лет). Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т₀-Т₄ - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N₀-N₃ - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; М (metastasis) - M₀-M₁ - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.

Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей

Ниже представленные методики использованы различными группами исследователей.

Методика 1.

Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей. Образцы тканей гомогенизировали на приборе Micro-Dismembrator U («Sartorius», Германия). Очистку РНК проводили стандартным методом с использованием гуанидинизотиоцианата и фенола с последующим осаждением этиловым спиртом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. 1984. Молекулярное клонирование. Москва, «Мир» 186-196]. Для удаления примесей гликопротеидов, которыми богаты ткани легких, использовали дополнительное осаждение РНК солевым раствором [Chomczynski P., Mackey К. 1995. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 19, 942-945]. После солевого осаждения все препараты РНК очищали с помощью набора RNeasy Mini kit («Qiagen», Германия) согласно прилагаемому изготовителем протоколу. Такая трехэтапная процедура очистки РНК позволила эффективно избавиться не только от трудно растворимых осадков гликопротеидов, но и от низкомолекулярных РНК. Качество препарата РНК проверяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Nanodrop («Nanodrop», США).

Методика 2.

РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген», Москва). Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол; 2) добавление смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1 и центрифугирование 5 минут при 14000 об/мин (4°С); 3) повторную депротеинизацию водной фазы, содержащей РНК, фенолом и центрифугирование в течение 5 минут при 14000 об/мин (4°С); 4) осаждение РНК равным объемом изопропанола из водной фазы, образующейся после центрифугирования. Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывали водным 75% этиловым спиртом, высушивали и растворяли в стабилизирующем реагенте ЭкстраГен Е («Лаборатория Изоген»). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).

Методика 3.

РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу. Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микро-десмембратора («Sartorius» Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем буфере RLT в расчете 600 мкл на 30 мкг ткани. 2) центрифугирование 3 минуты при 14000 об/мин (4°С); 2) добавление равного объема водного 70% этилового спирта к супернатанту; 3) нанесение на колонку; 4) промывание колонки после сорбции РНК один раз буфером RW1 объемом 700 мкл и дважды буфером RPE объемом 500 мкл; 5) элюцию РНК водой, свободной от РНКаз. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрчески («Nanodrop», США) при длине волны 260 нм. Качество выделенной РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).

Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer («Applied Biosystems», США). Секвенирование проводили отдельно с 5' и 3'-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit («Amersham», Великобритания). Все праймеры и зонды были специфичны в условиях ПЦР-РВ, ампликоны имели ожидаемые нуклеотидные последовательности и размер.

Пример 3. Реакция обратной транскрипции

Синтез первой цепи кДНК выполнен двумя различными группами исследователей.

Методика 1.

На матрице РНК, выделенной, как описано в Примере 2, синтезировали одноцепочечную кДНК. Для получения кДНК использовали модифицированный SMART-метод [Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897], 2 нг -1 мкг суммарной РНК, праймеры:

SMART (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG-3') и

CDS(5'-AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀N_-1N-3'),

и обратную транскриптазу PowerScript (Clontech, США).

Условия реакции:

Состав реакционной смеси (10 мкл):

РНК (1 мкг/мкл)	1,0 мкл
праймер SMART (6 мкМ)	2,0 мкл
праймер CDS (10 мкМ)	1,0 мкл
стерильная деионизованная вода	1,0 мкл

Прогревали пробу при 72°С, 3 мин и помещали в лед. Добавляли 5 мкл смеси:

буфер (Clontech) для построения 1 цепи (5х)	2,0 мкл
dNTP (10 мМ)	1,0 мкл
DTT (20 мМ)	1,0 мкл
обратная транскриптаза PowerScript (Clontech)	1,0 мкл

Инкубировали при 42°С, 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 65°С, 5 мин, добавляли 2 мкл 60 мМ ЭДТА и доводили объем пробы до 20 мкл.

Методика 2.

Для проведения реакции обратной транскрипции брали по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген») или реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Invitrogene), 100 нг гексануклеотидных праймеров, 1 мМ dNTP, lx реакционный буфер («Fermentas», Литва), содержащий 250 мМ Tris-HCl (рН 8.3, 25°С), 250 мМ KCl, 20 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas», Литва). Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 50°С - 10 мин, 70°С - 10 мин.

Пример 4. Синтез второй цепи кДНК

Для синтеза второй цепи кДНК и амплификации брали 1/10 часть от объема реакционной смеси, полученной в Примере 3. Синтез проводили с помощью Advantage2 DNA Polymerase с праймером 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' согласно протоколу «Advantage 2 PCR kit» («Clontech», Германия).

Условия проведения ПЦР:

Состав реакционной смеси (50 мкл):

ПНР-буфер Advantage 2 (Clontech) (10x)	5,0 мкл
dNTP (2,5 мМ)	5,0 мкл
праймер 10 мкМ	1,0 мкл
кДНК (одноцепочечная)	1,0 мкл
Advantage 2 ДНК-полимераза (Clontech)	1,0 мкл
стерильная деионизованная вода	37,0 мкл

Условия амплификации:

95°С, 1,5 мин 1 цикл

95°С, 20 с; 65°С, 20 с; 72°С, 3 мин 14-17-20-23 цикла

Для каждого образца подбирали количество циклов, позволяющих получать одинаковое количество амплифицированного материала.

Пример 5. Подбор условий определения содержания мРНК гена NPRL2 в образцах тканей легких

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ использовали одинаковые специфичные праймеры NPRL2_F (SEQ ID NO: 1) и NPRL2_R (SEQ ID NO: 2), которые были подобраны к разным экзонам гена NPRL2, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами.

Для ПЦР-РВ дополнительно к праймерам использовали зонд NPRL2_R (SEQ ID NO: 3). Размер ампликона - 135 п.н.

Последовательности выбранных праймеров и зондов для контрольного гена:

Прямой GAPDH-F 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3'

Обратный GAPDH-R 5'-TGGGTGGAATCATATTGGAACAT-3'....

Зонд GAPDH-Z - 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGGTTTACAT-3'

Размер ампликона - 141 п.н.

Для проведения ПЦР-РВ подобраны оптимальные концентрации праймеров и зондов исследуемого и контрольного генов. Концентрации праймеров варьировали в диапазоне 250-400 нМ при постоянной концентрации зондов равной 100 нМ, затем концентрацию зондов варьировали при подобранной оптимальной концентрации праймеров в диапазоне 150-250 нМ. Для NPRL2 оптимальные концентрации праймеров составили 350 нМ и зонда 150 нМ, для GAPDH концентрация праймеров - 300 нМ, зонда - 150 нМ.

Пример 6. Количественная оценка содержания мРНК гена NPRL2

Для количественных измерений использовали прибор ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, США.

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ

1. Готовили реакционные смеси для генов NPRL2 и GAPDH, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), праймеры и зонд в оптимальных концентрациях, из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.

Состав реакционной смеси для гена GAPDH:

Реагент	Концентрация исходных растворов (мМ)	Объем в расчете на одну реакцию (мкл)	Конечные концентрации в реакции (мМ)
ПЦР буфер	10Х	2.5	1X
dNTPs	2.5	2.5	0.250
MgCl₂	2.5	4	4
Прямой праймер	1.0·10^-5	0.75	3·10^-4
Обратный праймер	1.0·10^-5	0.75	3·10^-4
Зонд	5·10^-6	0.5	1.5·10^-4
кДНК		5	1
ТаqДНК-полимераза	5 ед/мкл	0.5	0.1 ед/мкл
Н₂О		8.5

Состав реакционной смеси для гена NPRL2:

Реагент	Концентрация исходных растворов (мМ)	Объем в расчете на одну реакцию (мкл)	Конечные концентрации в реакции (мМ)
ПЦР буфер	10Х	2.5	1X
dNTPs	2.5	2.5	250 µМ
MgCl₂	25	4	4 mM
Прямой праймер	1.0·10^-5	0.875	5.0·10^-4;
Обратный праймер	1.0·10^-5	0.875	5.0·10^-4
Зонд	5·10^-6	0.5	3.0·10^-4
кДНК		5
TaqДНК-полимераза	5 ед/мкл	0.5	0.1 ед/мкл
H₂O		8.25

2. В 96-луночный планшет добавляли по 20 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.

3. Вносили по 5 мкл матрицы, плотно закрывали планшет пленкой.

4. Помещали планшет в приборное отделение, задавали названия ячеек, температурный режим для 40 циклов: 95°С - 10 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 15 сек - денатурация, 60°С - 1 мин - отжиг зонда и полимеризация.

5. Реакции проводили в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение RQ (Relative Quantification, Applied Biosystems, США).

6. После завершения реакции амплификации сохраняли данные на CD-диске.

7. Анализ продуктов реакции проводили с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирали 1-4 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносили образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (М50, «Изоген»).

8. Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer («Applied Biosystems», США). Секвенирование проводили отдельно с 5' и 3'-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit («Amersham», Великобритания).

9. Проводили математическую обработку данных ПЦР-РВ и представляли результаты в графическом и/или табличном виде.

Пример 7. Математическая обработка данных ПЦР-РВ

Данные ПЦР-РВ переносили в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводили математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК - R_кДНК (далее R), представляющее отношение количества копий исследуемой последовательности кДНК к количеству копий контрольной последовательности кДНК в опухоли (Т) по сравнению с нормой (N), связана с основными параметрами ПЦР-РВ пороговым циклом Ct и эффективностью реакции Е общим выражением (Бюллетень 2, Applied Biosystems):

Интервал крайних значений R вычисляли с учетом рассчитанных отклонений е для значений Ct:

где

i=1, 2, …, n, где n - число повторов реакции (в нашем случае n=3). При суммировании величин отклонения вычисляют по формуле:

j=1, 2, …, k, где k - число суммируемых величин.

Эффективность ПЦР-РВ (Е) для генов GAPDH и NPRL2 рассчитывалась с помощью оригинальной программы, разработанной в лаборатории (Программа «Анализ Транскрипции Генов», свидетельство о регистрации №2008612585, 2008, Роспатент, РФ). В данной программе эффективность реакции рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой, которая аппроксимирует кинетическую кривую на ее линейном участке с помощью метода наименьших квадратов. При дальнейшей обработке данных учитывали полученные значения эффективностей, которые составили для гена NPRL2

Е_{опухоль}=Е_норма=(78±8)%, для гена GAPDH Е_{опухоль}=Е_норма=(91±6)%. Достоверность наблюдаемых изменений оценивали исходя из нормального распределения данных.

Данные считали достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных.

Результаты оценки содержания мРНК гена NPRL2

Оценку содержания мРНК гена NPRL2 выполнили на образцах кДНК двух групп, полученных исследователями различными методами в разных институтах (группа 1 - образцы с клиническими номерами от 1, 2…497, ИБХ РАН, группа 2 - образцы с номерами 1006, … 1086, ИМБ РАН), при этом использованы как зарубежные, так и отечественные наборы реактивов. Характеристика всех образцов тканей НМРЛ, из которых получены РНК и кДНК, приведена в таблице 1.

Таблица 1
Характеристика образцов различных гистологических типов рака легкого
Гистологический тип рака	Локализация	Клиническая стадия	Метастазы в лимфоузлы	Клинический номер образцов
Группа 1
ПКРЛ	центральный рак	Стадия I	Без метастазов	9, 80/05, 98/05
ПКРЛ	периферический	Стадия I	Без метастазов	2, 4, 475
ПКРЛ	центральный	Стадия II	Без метастазов	6, 21, 26, 497, 300/05, 5, 7, 13, 15, 77/05
ПКРЛ	периферический	Стадия II	Без метастазов	451, 452, 476
ПКРЛ	центральный	Стадия II	С метастазами	90/05
ПКРЛ	центральный	Стадия III	С метастазами	228/05, 14, 466, 290/05
ПКРЛ	периферический	Стадия III	С метастазами	1, 301/05
АК, БААК	периферический	Стадия II	Без метастазов С метастазами	304/05, 406, 477; 311/05
МРЛ	периферический	Стадия III	С метастазами	229/05
Группа 2
ПКРЛ	центральный	Стадия I	Без метастазов	1007, 1032
ПКРЛ	нет данных	Стадия I	Без метастазов	1022, 1073
ПКРЛ	центральный	Стадия II	С метастазами	1023
ПКРЛ	периферический	Стадия II	С метастазами	1085
ПКРЛ	нет данных	Стадия II	С метастазами	1026, 1031
ПКРЛ	центральный	Стадия III	С метастазами	1025, 1021; 1082
ПКРЛ	периферический	Стадия III	С метастазами	1086
АК, БААК	периферический	Стадия I	Без метастазов	1006, 1010, 1044, 1053
АК	периферический	Стадия III	Без метастазов С метастазами	1043 1078
АК	центральный	Стадия III	С метастазами	1059
ККРЛ	периферический	Стадия I	Без метастазов	1030
К	центральный	Стадия I	Без метастазов	1011
Примечания: ПКРЛ - плоскоклеточный рак, АК - аденокарцинома легкого, БААК - бронхиоло-альвеолярная аденокарцинома легкого, МРЛ - мелкоклеточный рак легкого, ККРЛ крупноклеточный рак легкого, К - карциноид

Сравнение содержания мРНК гена NPRL2 в опухолевых образцах относительно различных образцов сравнения - норм (условная норма, усредненная условная норма и усредненная норма от здоровых доноров, не имевших онкозаболеваний) показало близкие значения R с перекрывающимися интервалами, рассчитанными с учетом отклонений, независимо от использования различных методов выделения РНК и получения кДНК. Кроме того, получены близкие значения относительного содержания мРНК (R) на образцах кДНК одних и тех же опухолей, полученных двумя разными способами.

Частота снижений содержания мРНКгена NPRL2 в двух группах образцов.

В каждой группе образцов выявлено снижение содержания мРНК гена NPRL2 в опухоли по сравнению с нормой в большинстве образцов - около 80% (табл.2).

Таблица 2
Изменение содержания мРНК (R) гена NPRL2 в образцах разных гистологических типов рака легкого по сравнению с нормой
№ п/п	Клинический номер образца	Гистологический тип	Стадия по классификации ТНМ	Клиническая стадия	R Интервал снижений (разы)
1	2	ПКРЛ	T₂N₀M₀	IB	4-5,3
2	4	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	13-22
3	9	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	7-11
4	80/05	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	отсутствует
5	98/05	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	5-6
6	475	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	8-9
7	1006	АК	T₁N₀M₀	IA	2-3
8	1007	ПКРЛ	T₂N₀M₀	IB	3-4
9	1010	АК	T₁N₀M₀	IA	1,4-2,4
10	1011	К	N₀M₀	IB	2,3-3,6↑
11	1022	ПКРЛ	T₁N₀M₀	IA	7-11
12	1030	ККРЛ	T₂N₀M₀	IB	сохранение
13	1032	ПКРЛ	T₂N₀M₀	IB	2-3
14	1044	БААК	T₁N₀M₀	IA	2,1-3,9↑
15	1053	АК	T₁N₀M₀	IA	2-2,5
16	1073	ПКРЛ	T₂N₀M₀	IB	4-6
17	5	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	отсутствует
18	6	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	5-7
19	7	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	отсутствует
20	13	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	4-5
21	15	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	сохранение
22	21	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	сохранение
23	26	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	отсутствует
24	77/05	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	сохранение
25	90/05	ПКРЛ	T₂N₁M₀	IIB	сохранение
26	300/05	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	3-4
27	304/05	АК	T₃N₀M₀	IIB	1,6-2
28	311/05	БААК	T₂N₁M₀	IIB	сохранение
29	406	АК	T₃N₀M₀	IIB	7-9
30	451	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	14-20
31	452	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	2-3
32	476	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	1,6-2,5
33	477	БААК	T₃N₀M₀	IIB	сохранение
34	497	ПКРЛ	T₃N₀M₀	IIB	13-17
35	1023	ПКРЛ	T₂N₁M₀	IIB	3-4
36	1026	ПКРЛ	T₂N₁M₀	IIB	сохранение
37	1031	ПКРЛ	T₂N₁M₀	IIB	4-6
38	1085	ПКРЛ	T₂N₁M₀	IIB	2-3
39	1	ПКРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	14-20
40	14	ПКРЛ	T₃N₂M₀	IIIA	сохранение
41	228/05	ПКРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	отсутствует
42	229/05	МРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	6-11
43	290/05	ПКРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	10-16
44	301/05	ПКРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	3-6
45	466	ПКРЛ	T₂N₂M₀	IIIA	2-3
46	1021	ПКРЛ	T₃N₁M₀	IIIA	7,5-13
47	1025	ПКРЛ	T₃N₂M₀	IIIA	5-7
48	1043	АК	T₄N₀M₀	IIIB	2,5-4
49	1059	АК	T₃N₂M₀	IIIA	2,1-2,3
50	1078	АК	T₂N₂M₀	IIIA	2-4
51	1082	ПКРЛ	T₃N₂M₀	IIIA	17-25
52	1086	ПКРЛ	T₁N₂M₁	IIIA	2-3
Примечания: 1) группу 1 составили образцы с номерами 1, 2 … до 497, группу 2 - образцы с номерами 1006, 1007, …… до 1086. 2) Для второй группы известен анамнез курения для 16 пациентов, из которых только 5 из них не курили в прошлом и настоящем, а все остальные (69%) - злостные курильщики со стажем курения от 15 до 50 лет

Результаты ПЦР-РВ для всей выборки исследованных образцов представлены на фиг.3. Как видно из фиг.3 и фиг.4 изменения содержания мРНК (R) гена в опухолевых образцах гораздо более значительны по сравнению с образцами различных норм. Уровень снижения и частота снижения мРНК гена NPRL2 по стадиям и типам РЛ. Как видно из таблицы 2 и фиг.3, и содержание мРНК гена NPRL2 снижается в образцах ПКРЛ в основном от 2 до 10 раз. Однако в некоторых образцах наблюдали более значительные снижения при увеличении степени распространенности опухолевого заболевания, в 5 образцах содержание мРНК в отличие от нормы в опухоли не детектировали. Анализ данных показал, что снижение содержания мРНК гена NPRL2 происходит в 79% (41/52, Р<0.05) образцов НМРЛ, в 84% (32/38, Р<0.05) образцов ПКРЛ и 64% (9/14, Р<0.05) образцов различных типов рака легкого отличных от ПКРЛ (таблица 3). Следует отметить, что на I стадии ПКРЛ происходит снижение содержания мРНК гена NPRL2 в 100% образцов (10/10, Р<0.05), на II и III стадиях - в 72% (13/18, Р<0.05) и 90% (9/10, Р<0.05) образцов соответственно. Корреляция между различными характеристиками и снижением содержания мРНК гена NPRL2. В таблице 3 приведена частота снижения содержания мРНК гена NPRL2 для образцов (НМРЛ, ПКРЛ и других, отличных от ПКРЛ видов) при наличии и отсутствии метастазов в региональные лимфатические узлы (категория N).

Таблица 3
Суммарные данные по частоте снижений содержания мРНК гена NPRL2 в образцах ПКРЛ и других типов рака легкого
Стадии	Частота снижений содержания мРНК, %
Стадии	в образцах разных видов НМРЛ	в образцах ПКРЛ	в образцах РЛ, кроме ПКРЛ
I	81 (13/16) Р<0.05	100 (10/10) Р<0.05	50 (3/6)
II	68 (15/22) Р<0.05	72 (13/18) Р<0.05	50 (2/4)
III	93 (13/14) Р<0.05	90 (9/10) Р<0.05	100 (4/4)
I + II + III без метастазов	79 (26/33) Р<0.05	87 (20/23) Р<0.05	60 (6/10) Р<0.05
II + III с метастазами	79 (15/19) Р<0.05	80 (12/15) Р<0.05	75 (3/4)
Всего:	Общее число снижений в 79% (41/52) образцов Р<0.05	Общее число снижений в 84% (32/38) Р<0.05	Общее число снижений в 64% (9/14) Р<0.05
Примечание: Первая цифра - %, отношение количества образцов со сниженным содержанием мРНК к общему количеству образцов, указано в скобках

Во всех трех случаях при наличии и отсутствии метастазов частоты снижений практически одинаковы. Уровень и частота снижения содержания мРНК практически не зависели от места локализации первичной опухоли (центральной или периферической), поскольку расчеты относительно усредненной нормы (т.н. пулы NCL и NPL) от 5 образцов из тканей легкого здоровых доноров той или иной локализации давали также близкие значения R.

Корреляции между уровнем и частотой снижения содержания мРНК гена и такими характеристиками как возраст и пол пациента, локализация и размер первичной опухоли, клиническая стадия, длительностью и интенсивностью курения также выявлено не было.

Таким образом, основной результат - уже на ранних стадиях НМРЛ снижение содержания мРНК гена NPRL2 происходит в большинстве образцов (около 80%), в первую очередь ПКРЛ, для которого частота снижений достигает 100%.

Настоящим изобретением также предусмотрено, что определение содержания мРНК гена NPRL2 будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способом настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Повышение содержания мРНК гена NPRL2 по ходу или по завершении курса лечения может свидетельствовать о восстановлении активности гена-супрессора опухолевого роста NPRL2, что может говорить о положительных сдвигах при лечении. Дальнейшее снижение содержания мРНК гена NPRL2 может указывать на отсутствие эффективности лечения.

Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на чертежи, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Claims

1. Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого методом ПЦР в режиме реального времени, включающий следующие стадии:
а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;
б) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
в) нормирование концентрации кДНК NPRL2 по контрольному гену, содержание мРНК которого относительно постоянно в норме и при раке легкого;
г) проведение количественной амплификации или фрагмента гена NPRL2 с использованием кДНК, полученной на стадии б), в качестве матрицы, пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и зонда с последовательностью SEQ ID NO: 3;
д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК NPRL2 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают содержание мРНК гена NPRL2, причем уменьшение содержания мРНК гена NPRL2 служит диагностическим признаком рака легкого.

2. Способ по п.1, в котором диагностируют плоскоклеточный рак легкого.

3. Способ по п.1 или 2, в котором на стадии б) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также праймеров, специфичных к гену NPRL2.

4. Способ по п.1 или 2, в котором на стадии г) количественная реакция амплификации фрагмента гена NPRL2 представляет собой ПЦР в режиме реального времени, сопряженную с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

5. Способ по п.1 или 2, в котором на стадии в) в качестве контрольного гена используют ген GAPDH, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу.

6. Набор для диагностики немелкоклеточного рака легкого по п.1 и 2, соответственно, позволяющий определить содержание мРНК гена NPRL2 методом ПЦР в режиме реального времени и включающий праймеры с последовательностью SEQ ID NO: 1 и 2, а также олигонуклеотидный зонд с последовательностью SEQ ID NO: 3.

7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют первые цепи или амплификаты первых цепей кДНК.